DE19903519A1

DE19903519A1 - Investigating toxic effects of substances on growth of phototropic organisms

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Publication number: DE19903519A1
Application number: DE19903519A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Prof Dr Rer Nat Dott; Adolf Dr Ing Eisentraeger; Uta Dipl Biol Hempel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-01-31
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 1999-08-05

Abstract

Measurements are carried out in a microtitre plate (7) An Independent claim is also included for a suitably equipped incubator (1), to carry out the method.

Description

Die Erfindung betrifft ein biologisches Testverfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie eine Vorrichtung zu dessen Durchführung.The invention relates to a biological test method according to the preamble of claim 1 and a device its implementation.

Biologische Testverfahren gewinnen in der humantoxikologi schen und ökotoxikologischen Bewertung von Schadstoffen in Umweltproben zunehmend an Bedeutung, da sie im Gegensatz zur chemischen Analyse nicht die Stoffkonzentration, sondern die toxischen Wirkungen der Testsubstanz in den Mittelpunkt der Untersuchung stellen. Zur Bestimmung der toxischen Wirkung einer Testsubstanz auf das Wachstum eines phototrophen Testorganismus existieren genormte biologische Testverfahren (DIN 38 412 L33, 1991 sowie EN 28 629 L9, 1993) mit plankto nischen Süßwasseralgen, nämlich der Scenedesmus supspicatus oder der Selenastrum capricornutum als stellvertretende Testorganismen für die Primärproduzenten im Plankton des Süß wassers.Biological test methods gain in human toxicology and ecotoxicological assessment of pollutants in Environmental samples are becoming increasingly important, as opposed to chemical analysis not the substance concentration, but the toxic effects of the test substance at the center of the Make an investigation. To determine the toxic effect a test substance for the growth of a phototrophic Test organisms exist standardized biological test procedures (DIN 38 412 L33, 1991 and EN 28 629 L9, 1993) with plankto African freshwater algae, namely the Scenedesmus supspicatus or the Selenastrum capricornutum as a representative Test organisms for primary producers in sweet plankton water.

Der Wachstumshemmtest nach der EN 28 692 dient zur Bestimmung der toxischen Wirkungen chemischer Verbindungen, insbesondere in Abwasserproben, Bodenproben und Abfällen (Testsubstanz), auf das Wachstum von planktonischen Süßwasseralgen. Hierzu werden die Zellen der Süßwasseralgen während eines 72 Stunden dauernden Tests über mehrere Generationen in einem definier ten Medium kultiviert und die Zellzahl nach 24, 48 und 72 Stunden gemessen. Als Ergebnis erhält man eine Aussage über den Einfluß des Volumenanteils der Testsubstanz in den Testansätzen auf das Wachstum des Testorganismus.The growth inhibition test according to EN 28 692 is used for the determination the toxic effects of chemical compounds, in particular in wastewater samples, soil samples and waste (test substance), on the growth of planktonic freshwater algae. For this the cells of the freshwater algae are kept for 72 hours continuous tests over several generations in one defin medium and the number of cells after 24, 48 and 72 Hours measured. The result is a statement about the influence of the volume fraction of the test substance in the Test approaches to the growth of the test organism.

Als Rahmenbedingung für den Wachstumshemmtest werden kon stante Temperaturen, homogene Lichtbedingungen sowie eine gleichmäßig suspendierte Lösung des Testorganismus vorausge setzt. As a framework for the growth inhibition test, con constant temperatures, homogeneous lighting conditions and a evenly suspended solution of the test organism puts.

Der in der DIN 38 412 L33 beschriebene Scenedesmus-Chloro phyll-Fluoreszenztest dient der Bestimmung, der nicht gifti gen Wirkung von Abwasser (Testsubstanz) gegenüber Grünalgen über Verdünnungsstufen. Aus dem Vergleich der Zellvermehrung in einem insgesamt 72 Stunden dauernden Test unter definier ten Versuchsbedingungen mit und ohne Einwirkung der Testsub stanz ergibt sich die Hemmwirkung. Sie ist ein Maß für die toxische Wirkung der Testsubstanz gegenüber dem Testorganis mus.The Scenedesmus chloro described in DIN 38 412 L33 phyll fluorescence test is used to determine the non-poisonous effect of wastewater (test substance) against green algae about dilution levels. From the comparison of cell proliferation in a 72-hour test under defined test conditions with and without the influence of the test sub punching results in the inhibitory effect. It is a measure of that toxic effect of the test substance on the test organis mus.

Nach 72-stündiger Inkubation der Testalgen in mehreren Testansätzen mit unterschiedlichen Volumenanteilen der Test substanz wird die Algenbiomasseproduktion der Testalgen unter Einwirkung des Abwassers mit der Produktion in einer Mischung, die kein Abwasser enthält, verglichen. Die Rahmen bedingungen für dieses Testverfahren entsprechen denen nach der EN 28 692.After 72 hours of incubation of the test algae in several Test approaches with different volume proportions of the test Substance is the algae biomass production of the test algae under Impact of wastewater with production in one Mixture containing no waste water compared. The frames Conditions for this test procedure correspond to those after of EN 28 692.

Apparativ werden die vorerwähnten biologischen Testverfahren in einem thermostatisierten Raum mit gleichmäßiger Beleuch tung durchgeführt, in dem auf einem Schüttler etwa 40 250-ml fassende Erlenmeyerkolben als Testgefäße angeordnet sind. Das Gesamtvolumen jedes Testansatzes in allen Testgefäßen beträgt 100 ml. Zur Messung der Zellzahl während der Dauer eines Tests wird vorzugsweise ein Partikelzählgerät oder ein Mikroskop mit Zählkammer verwendet. Alternativ kann die Zellzahl des Testorganismus, hier der Algen, durch indirekte Verfahren be stimmt werden, in dem Photometer, Turbidimeter oder Fluorime ter verwendet werden, die empfindlich genug sind, und deren Meßwerte ausreichend eng mit der Zellzahl korrelieren.The above-mentioned biological test methods become apparatus in a thermostatted room with even lighting tion carried out in which on a shaker about 40 250 ml Erlenmeyer flasks are arranged as test vessels. The The total volume of each test batch in all test vessels is 100 ml. For measuring the number of cells during the duration of a test is preferably a particle counter or a microscope used with counting chamber. Alternatively, the cell count of the Test organism, here the algae, by indirect methods be true in the photometer, turbidimeter or fluorime are used that are sensitive enough, and their Correlate measured values sufficiently closely with the cell number.

Verwendet man als thermostatisierten Raum mit homogener Be leuchtung einen handelsüblichen Schüttelschrank, ist die maximale Anzahl der Testansätze mit unterschiedlichen Volu menanteilen an Testsubstanz (Verdünnungsstufen) je Schüttel schrank relativ gering. Geht man von 6-8 Verdünnungsstufen und von 2-3 Parallelansätzen für jede Verdünnungsstufe so wie 3 identischen Kontrollansätzen ohne Testsubstanz (Nährlö sung, deionisiertes Wasser und Algenzellen) und einem Null wert (Nährlösung und deionisiertes Wasser) aus, lassen sich maximal 3 Tests in einem handelsüblichen Schüttelschrank gleichzeitig durchführen.Is used as a thermostated room with homogeneous loading lighting a commercial shaker, is the maximum number of test runs with different volu Proportion of test substance (dilution levels) per shaker closet relatively small. Assuming 6-8 levels of dilution and from 2-3 parallel runs for each dilution step like this as 3 identical control batches without test substance (nutrient solution solution, deionized water and algae cells) and a zero worth (nutrient solution and deionized water) A maximum of 3 tests in a standard shaker perform at the same time.

Sowohl bei dem Fluoreszenztest als auch dem Wachstumshemmtest erfolgen die Messungen manuell. Beim Fluoreszenztest wird zu Beginn und nach 72 Stunden von allen Test- und Kontrollan sätzen die Fluoreszenz bei λ = 685 nm mit einem Fluoreszenz-Spek trophotometer gemessen. Hierzu wird aus allen Kulturgefä ßen eine Probe von ca. 1 ml entnommen. Beim Wachstumshemmtest gestaltet sich die Messung aufwendiger. Mindestens alle 24 Stunden wird die Zellzahl gemessen. Diese Messungen werden an kleinen Volumina, laut der EN 28 692 beispielsweise 5 ml, durchgeführt. Die den Testansätzen entnommenen Volumina wer den wie bei dem Fluoreszenztest nicht ersetzt. Darüber hinaus ist es beim Wachstumshemmtest erforderlich, daß von einem Test- oder Parallelansatz jeder Verdünnungsstufe sowie den Kontrollansätzen die PH-Werte gemessen werden.Both in the fluorescence test and in the growth inhibition test the measurements are carried out manually. The fluorescence test is too Start and after 72 hours of all test and control set the fluorescence at λ = 685 nm with a fluorescence spec trophotometer measured. For this purpose, all cultural vessels Take a sample of approx. 1 ml. During the growth inhibition test the measurement is more complex. At least every 24 The cell number is measured for hours. These measurements are on small volumes, according to EN 28 692 for example 5 ml, carried out. The volumes taken from the test batches as in the fluorescence test not replaced. Furthermore it is necessary in the growth inhibition test that from one Test or parallel approach of each dilution level and the Control approaches the pH values are measured.

Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein biologisches Testverfahren zur Be stimmung von toxischen Wirkungen einer Testsubstanz vorzu schlagen, daß den gleichzeitigen Test einer höheren Anzahl Testansätze auf engerem Raum ermöglicht, bei dem ein ge ringeres Gesamtvolumen an Testsubstanz benötigt wird, um ar beits- und umwelthygienische Nachteile der Tests mit toxi schen Testsubstanzen zu reduzieren und weniger Chemikalien für die Herstellung der Testansätze benötigt. Schließlich liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens vorzuschlagen.The invention is based on this prior art based on the task of a biological test procedure for loading coordination of toxic effects of a test substance suggest that the simultaneous test of a higher number Test approaches in a confined space, where a ge lower total volume of test substance is required to ar occupational and environmental hygiene disadvantages of the tests with toxi test substances and fewer chemicals needed for the preparation of the test batches. Finally the invention has for its object a device to propose to carry out the procedure.

Die Lösung basiert auf dem Gedanken, daß bisher für derartige biologische Testverfahren übliche Gesamtvolumen der Testan sätze in jedem Testgefäß von 100 ml auf etwa 2 ml zu ver ringern. Im einzelnen wird die Aufgabe bei einem Verfahren der eingangs erwähnten Art dadurch gelöst, daß als Testgefäße die Kavitäten mindestens einer Mikrotitrationsplatte verwen det werden.The solution is based on the idea that for such biological test procedures usual total volume of testan sets in each test tube from 100 ml to approximately 2 ml wrestle. In detail, the task in a process of the type mentioned in that solved as test vessels use the cavities of at least one microtitration plate be det.

Überraschend hat sich herausgestellt, daß die Repräsentativi tät an der Reduktion des Gesamtvolumens der Testansätze in jedem Testgefäß von 100 ml auf etwa 2 ml nicht leidet. Insbe sondere wenn die in den eingangs genannten Normen vorgese henen Testorganismen eingesetzt werden, ist sichergestellt daß Zellen des Testorganismus in ausreichender Zahl in den einzelnen Kavitäten der Mikrotitrationsplatten vorhanden sind.It has surprisingly been found that the representativi the reduction in the total volume of the test batches in each test tube from 100 ml to about 2 ml does not suffer. In particular especially if the provisions mentioned in the standards mentioned above the test organisms used is ensured that cells of the test organism are present in sufficient numbers in the individual cavities of the microtitration plates are.

Schließlich liegen die Testsubstanzen bei normgerechter Durchführung des Verfahrens entweder vollständig in Wasser gelöst vor oder sind zumindest durch Filtration von ihren gröberen Bestandteilen befreit, so daß insoweit durch die Übertragung auf den Mikrotitrationsmaßstab keine Probleme entstehen.After all, the test substances are in compliance with the standards Perform the procedure either completely in water solved before or at least by filtration of their coarser components freed, so that to that extent by the Transfer to the microtitration scale no problems arise.

Durch die Übertragung des Testverfahrens auf den Mikrotitra tionsplattenmaßstab wird das Gesamtvolumen an Testsubstanz sowie der Verbrauch an Chemikalien erheblich reduziert. Schließlich wird durch diese einfache Maßnahme das bisher in erster Linie manuell durchgeführte Testverfahren automati sierbar.By transferring the test procedure to the Mikrotitra tion plate scale is the total volume of test substance as well as the consumption of chemicals significantly reduced. After all, this simple measure will make it so far in primarily manual test procedures automatically sizable.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung wird der Testor ganismus durch Schütteln mit veränderlichen Schüttelinter vallen und/oder veränderlichen Schüttelfrequenzen in Suspen sion gehalten. Die Schüttelamplitude besitzt einen Gesamthub, auch Orbit genannt, von etwa 1-2 mm gegenüber einer Schüttelamplitude von etwa 5 cm, wie sie bei herkömmlichen Schüttelschränken üblich ist. Die Schüttelfrequenz beträgt 500 1/min bis 1350 1/min. Das Schütteln kann im Dauerbetrieb, jedoch auch mit in der Dauer veränderlichen Pausen erfolgen. Während des Tests sind definierte Temperatur- und Lichtbe dingungen erforderlich. Die Test- und Kontrollansätze werden normgerecht bei 23 ±2°C unter Dauerbeleuchtung inkubiert, wobei die Temperaturabweichungen während des Tests nicht mehr als ±1°C betragen sollen. Richtwert für die Beleuchtung ist eine photosynthetisch wirksame Photonenraumbestrahlung von 0,72 × 10²⁰ Photonen je (m².s).In an advantageous embodiment of the invention, the testor mechanism is kept in suspension by shaking with variable shaking intervals and / or changing shaking frequencies. The shaking amplitude has a total stroke, also called orbit, of about 1-2 mm compared to a shaking amplitude of about 5 cm, as is common in conventional shaking cabinets. The shaking frequency is 500 1 / min to 1350 1 / min. The shaking can take place in continuous operation, but also with pauses that vary in duration. Defined temperature and light conditions are required during the test. The test and control approaches are incubated according to standards at 23 ± 2 ° C under permanent lighting, whereby the temperature deviations during the test should not be more than ± 1 ° C. The guideline value for the lighting is a photosynthetically effective photon space irradiation of 0.72 × 10 ²⁰ photons each (m ² .s).

Um die Temperatur mittels eines Reglers auf der eingestellten Temperatur zu halten, kommt beispielsweise ein thermostati sierter Raum zur Durchführung des Tests in Frage. Die Be leuchtung kann dann durch eine oder mehrere Leuchtstofflampen nach DIN EN 60081, Lichtfarbe universal weiß, gewährleistet werden. Alternativ können die Temperatur- und Lichtbe dingungen durch ein Lichtthermostat sichergestellt werden.To set the temperature using a controller on the Keeping temperature comes, for example, with a thermostat space to conduct the test. The Be lighting can then be provided by one or more fluorescent lamps according to DIN EN 60081, light color universal white, guaranteed become. Alternatively, the temperature and light conditions conditions are ensured by a light thermostat.

Um die Aussagekraft der Testverfahren zu verbessern, insbe sondere Wachstumskinetiken bzw. -verläufe des Testorganismus zu erfassen, wird die Zellzahl in den Testgefäßen in regelmä ßigen Abständen, mindestens jedoch 10 mal während eines üb licherweise 72 Stunden dauernden Tests gemessen.In order to improve the informative value of the test procedures, esp special growth kinetics or courses of the test organism the cell number in the test vessels is recorded regularly intervals, but at least 10 times during an exercise measured 72 hours long tests.

Um das Testverfahren zu automatisieren, ist es in einer Aus gestaltung der Erfindung vorgesehen, daß die Zellzahl mit Hilfe indirekter Verfahren bestimmt wird, in dem Photometer, Turbidimeter oder Fluorimeter in an sich bekannter Weise ver wendet werden, deren Meßwerte ausreichend eng mit der Zellzahl korrelieren.To automate the test procedure, it is off Design of the invention provided that the cell count with Using indirect methods is determined in the photometer, Ver turbidimeter or fluorimeter in a conventional manner are used, the measured values of which are sufficiently close to the Correlate cell number.

Da aufgrund der Mikrotitrationsplatten alle Testansätze le diglich mit einem Gesamtvolumen zwischen 0,2 ml bis 2,5 ml, insbesondere von 2 ml befüllt werden müssen, reduziert sich nicht nur das Gesamtvolumen an Testsubstanz sowie der Ver brauch an Chemikalien, sondern auch der personelle Aufwand für die Durchführung der Tests.Since all test batches le diglich with a total volume between 0.2 ml to 2.5 ml, need to be filled, in particular by 2 ml, is reduced not only the total volume of test substance as well as the ver need chemicals, but also the manpower for performing the tests.

Eine Möglichkeit die Testgefäße der Mikrotitrationsplatten während der Inkubation so abzudecken, daß die Testorganismen Kohlenstoffdioxid aus der Umgebungsluft entnehmen und Sauer stoff abgeben können, jedoch gleichzeitig die Verdunstung der Testansätze reduziert wird, besteht darin, die Mikrotitra tionsplatten mit mindestens einem an seinem Auflagerand einen gasdurchlässigen Kunststoff, z. B. aus geschäumtem Silikon-Kaut schuk, aufweisenden Deckel abzudecken und auf jeden Deckel ein geringen Anpreßdruck auszuüben. Bei manueller Durchführung des Verfahrens ist es auch möglich, Deckel auf die Mikrotitrationsplatten aufzusetzen und die Platte mit aufgesetztem Deckel mit einer gasdurchlässigen Folie, z. B. mit Folie aus einem Polyoliphen-Paraffinwachs-Gemisch zu um wickeln.One possibility is the test tubes of the microtitration plates cover during incubation so that the test organisms Take carbon dioxide from the ambient air and acid can release material, but at the same time the evaporation of Test approaches is reduced, the microtitra tion plates with at least one on its support edge gas permeable plastic, e.g. B. from foamed silicone chewing schuk, covering lid and on everyone Apply a slight pressure to the cover. With manual Carrying out the procedure, it is also possible to cover it place the microtitration plates and the plate with attached lid with a gas-permeable film, e.g. B. with film made from a polyoliphene-paraffin wax mixture wrap.

Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Ver fahrens weist einen temperierten und beleuchteten Inkuba tionsschrank mit mindestens einer Schütteleinrichtung für Mi krotitrationsplatten auf, die in dem Inkubationsschrank auf Halterungen angeordnet sind.A device for performing the Ver fahrens has a tempered and illuminated Inkuba tion cabinet with at least one shaker for Mi crotitration plates on in the incubation cabinet Brackets are arranged.

Die Schütteleinrichtung ist so ausgebildet, daß sie die oben genannten Bereiche für die Schüttelamplitude und Schüttelfre quenz abdecken kann. In einer Ausgestaltung der Erfindung er folgt die Temperierung des Inkubationsschrankes über die Schütteleinrichtung, beispielsweise mit Peltier-Elementen.The shaker is designed so that it the above mentioned ranges for the shaking amplitude and shaking frequency quenz can cover. In one embodiment of the invention, he the incubation cabinet is tempered via the Shaking device, for example with Peltier elements.

Mit sogenannten Gewebekulturplatten aus Polystyrol werden die DIN-Kriterien für die Referenztestsubstanzen Kaliumdichromat und Dichlorphenol im Mikrotitrationsmaßstab problemlos einge halten. Alternativ können Mikrotitrationsplatten aus Quarz glas eingesetzt werden, die allerdings wesentlich teurer sind, als die Gewebekulturplatten aus Polystyrol.With so-called tissue culture plates made of polystyrene, the DIN criteria for the reference test substances potassium dichromate and dichlorophenol on the microtitration scale hold. Alternatively, quartz microtitration plates can be used glass are used, but much more expensive are than the tissue culture plates made of polystyrene.

Um die Testansätze indirekt auch von unten zu beleuchten, ist es in einer Ausgestaltung der Erfindung vorgesehen, daß jede Schütteleinrichtung, insbesondere deren Tablar, mit einer spiegelnden Fläche versehen ist, und auf jeder Fläche min destens eine transparente Halterung, beispielsweise aus Plexiglas, für Mikrotitrationsplatten angeordnet ist. Der Ab stand zwischen den Mikrotitrationsplatten und der spiegelnden Fläche beträgt etwa 2 cm.In order to illuminate the test approaches indirectly from below, too it is provided in an embodiment of the invention that each Shaking device, in particular its tray, with a reflecting surface is provided, and min at least a transparent holder, for example Plexiglass, is arranged for microtitration plates. The Ab stood between the microtitration plates and the reflecting one The area is about 2 cm.

Die Bestimmung der Zellzahl erfolgt indirekt mittels Photome ter, Turbidimeter oder Fluorimeter, wobei die Vorrichtung in einer Ausgestaltung der Erfindung eine Transporteinrichtung aufweist, um die Mikrotitrationsplatten zwischen dem Inkuba tionsschrank und einer Meßkammer zu transportieren, die diese Meßgeräte enthält. Die Auswertung der Signale der Meßgeräte erfolgt vorzugsweise rechnergestützt.The cell number is determined indirectly using photomes ter, turbidimeter or fluorimeter, the device in an embodiment of the invention, a transport device to the microtitration plates between the Incuba tion cabinet and a measuring chamber to transport this Contains measuring devices. The evaluation of the signals from the measuring devices is preferably computer-based.

Da zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Schütteln in Intervallen genügt, ist es in einer Ausgestal tung der Erfindung möglich, daß die Transporteinrichtung zu gleich als Schütteleinrichtung dient und auf weitere Schütteleinrichtungen, die unmittelbar auf die Halterungen für die Mikrotitrationsplatten wirken, verzichtet wird.Since to carry out the method according to the invention Shaking in intervals is enough, it is in a shape device of the invention possible that the transport device serves as a shaker and others Shaker directly on the brackets act for the microtitration plates, is dispensed with.

Um die Testansätze maschinell zu erstellen, kann die Vorrich tung einen automatischen Dispenser zum Befüllen und/oder Pi pettieren der Kavitäten der Mikrotitrationsplatten aufweisen. Der Dispenser kann beispielsweise an einem Roboterarm ange ordnet sein.In order to create the test batches automatically, the Vorrich automatic dispenser for filling and / or pi have the cavities of the microtitration plates. The dispenser can be attached to a robot arm, for example to be in order.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispie len des näheren erläutert. The invention is described below with reference to exemplary embodiments len explained in more detail.

Es zeigenShow it

Fig. 1 eine Vorderansicht eines beleuchteten Inkuba tionsschrankes gem. der Erfindung, Fig. 1 is a front view of an illuminated Incubations cabinet. the invention,

Fig. 2 Mikrotitrationsplattenhalterungen auf einem Tablar für einen Inkubationsschrank nach Fig. 1 sowie Fig. 2 microtitration plate holders on a tray for an incubation cabinet according to Fig. 1 and

Fig. 3 Mikrotitrationsplattenhalterungen auf einem Tablar mit einer Transporteinrichtung für einen Inkuba tionsschrank nach Fig. 1 sowie eine Darstellung einer Meßkammer. Fig. 3 microtitration plate holders on a tray with a transport device for an incubation cabinet according to Fig. 1 and a representation of a measuring chamber.

Der insgesamt mit 1 bezeichnete Inkubationsschrank umfaßt eine Bedieneinheit 2, eine Schütteleinrichtung 3 für Mikro titrationsplatten 7 und eine Beleuchtungseinheit 4. Über die Bedieneinheit 2 wird die Temperatur im Inkubationsschrank 1 und die Schüttelfrequenz, Amplitude sowie die Intervalldauer der Schütteleinrichtung 3 eingestellt. Auf einer spiegelnd ausgebildeten Oberfläche 5 der als Tablar ausgebildeten Schütteleinrichtung 3 sind Plexiglashalterungen 6 zur Auf nahme der in Fig. 1 nicht gezeigten Mikrotitrationsplatten 7 angeordnet. Die Plexiglashalterungen 6 fixieren die Mikro titrationsplatten 7 in einem Abstand von etwa 2 cm von der spiegelnden Oberfläche 5.The incubation cabinet designated overall by 1 comprises an operating unit 2 , a shaking device 3 for micro titration plates 7 and a lighting unit 4 . The temperature in the incubation cabinet 1 and the shaking frequency, amplitude and the interval duration of the shaking device 3 are set via the control unit 2 . On a mirror-like surface 5 of the shaking device 3 designed as a tray, plexiglass holders 6 for receiving the microtitration plates 7 , not shown in FIG. 1, are arranged. The plexiglass holders 6 fix the micro titration plates 7 at a distance of about 2 cm from the reflecting surface 5 .

Die Beleuchtungseinheit 4 besteht abhängig von der Größe des Inkubationsschranks 1 aus einer oder mehreren Leuchtstofflam pen nach DIN EN 60 081, die eine Lichtmenge von 120 µmol Quanten/s m² im Inneren des Inkubationsschrankes 1 gewährlei sten. Um eine unerwünschte Aufheizung des Innenraums des In kubationsschrankes 1 zu vermeiden, sind die Drosseln 8 der Leuchtstofflampen außen am Inkubationsschrank 1 angebracht.Depending on the size of the incubation cabinet 1, the lighting unit 4 consists of one or more fluorescent lamps according to DIN EN 60 081, which guarantee a light quantity of 120 µmol quanta / sm ² inside the incubation cabinet 1 . To an undesirable heating of the interior to prevent the in incubation cabinet 1, the throttles 8 of the fluorescent lamps mounted outside the incubator. 1

Aus Fig. 2 ist die Schütteleinrichtung 3 mit in den Plexi glashalterungen 6 eingesetzten Mikrotitrationsplatten 7 er kennbar. Fig. 2 verdeutlicht, daß anstelle der bisher üb lichen 40 Testansätze mühelos die dreifache Menge an Testan sätzen in einem gleich großen Inkubationsschrank unterge bracht werden können.From Fig. 2, the shaking device 3 with microtitration plates 7 used in the plexi glass holders 6 , he can be seen. Fig. 2 shows that instead of the previously usual 40 test batches triple the amount of test batches can be accommodated in an incubator of the same size.

Fig. 3 schließlich zeigt ein für einen vollautomatischen Be trieb ausgebildetes Tablar 11, das allerdings keine Schüttel einrichtung aufweist. Die Mikrotitrationsplatten 7 befinden sich übereinstimmend auf Halterungen und werden über einen in Fig. 3 nicht dargestellten Fördermechanismus in Richtung der Pfeile 12 auf ein Transportband 13 geschoben. Das Transport band 13 dient sowohl dem Abtransport der Mikrotitrations platten 7, als auch als Schütteleinrichtung. Die Programmie rung und Bedienung des Transportbandes 13 erfolgt ebenfalls über die Bedieneinheit 2. Das Transportband 13 führt über eine Schleuse 14 aus dem Inkubationsschrank 1 hinaus und reicht bis an eine Meßeinheit 16 nach Art einer Brücke 17 heran. Ein nur schematisch dargestellter Greifarm 18 der Meßeinheit 16 transportiert die Mikrotitrationsplatten 7 wei ter in eine Meßkammer 19 der Meßeinheit 16, in der ein nicht dargestelltes Fluori- und Photometer zur Bestimmung der Zellzahl angeordnet sind. Weiter befindet sich in der Meßein heit 16 eine nicht dargestellte Recheneinheit mit der erfor derlichen Datenaufnahme- und Auswertungssoftware für die Meß daten des Fluori- und Photometers. Fig. 3 finally shows a tray 11 designed for a fully automatic operation, which, however, has no shaking device. The microtitration plates 7 are coincident on brackets and are pushed onto a conveyor belt 13 in the direction of the arrows 12 via a conveyor mechanism (not shown in FIG. 3). The transport belt 13 serves both the removal of the microtitration plates 7 , and as a shaking device. The programming and operation of the conveyor belt 13 is also carried out via the control unit 2nd The conveyor belt 13 leads out of the incubation cabinet 1 via a lock 14 and reaches up to a measuring unit 16 in the manner of a bridge 17 . An only schematically shown gripper arm 18 of the measuring unit 16 transports the microtitration plates 7 ter into a measuring chamber 19 of the measuring unit 16 , in which a fluorometer and photometer (not shown) are arranged for determining the number of cells. Next is in the measuring unit 16, a computing unit, not shown, with the necessary data acquisition and evaluation software for the measurement data of the fluorometer and photometer.

Das Hochfahren der Schütteleinrichtung auf die Mindest schüttelfrequenz von 500 1/min muß langsam erfolgen, um ein Überschwappen der Testansätze zwischen den einzelnen Kavitä ten zu verhindern.Raising the shaker to the minimum Shaking frequency of 500 1 / min must be done slowly in order to Spill over of the test batches between the individual cavities to prevent.

Schließlich kann die Schütteleinrichtung in einer definierten Position anhalten, um das Zusammenspiel mit dem automatisch arbeitenden Greifarm, dem Fördermechanismus und einen ggf. vorhandenen automatischen Dispenser problemlos zu ermög lichen.Finally, the shaker can be in a defined Stop position to interact with the automatically working gripper arm, the conveyor mechanism and a possibly existing automatic dispenser easily possible lichen.

Claims

1. Biological test method for determining the toxic effects of a test substance on the growth of a phototrophic test organism in several test batches with different volume fractions of test substance, the total volume of the test batches being the same in all test vessels, in which the test batches last for a minimum period under a defined temperature - and light conditions are incubated, the test organism being kept in suspension during the duration of a test and the cell count in each test vessel being determined at least two times, characterized in that the cavities of at least one microtitration plate ( 7 ) are used as test vessels.

2. Biological test method according to claim 1, characterized ge indicates that the test organism by shaking with changing shaking intervals and / or changing Lichen shaking frequencies is kept in suspension.

3. Biological test method according to claim 1 or 2, because characterized in that the Temperatur- and Lichtbe conditions are adjustable and at least the temperature by means of a controller at the set temperature is held.

4. Biological test method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the cell count in the test vessels at regular intervals, at least ten times is measured during a test.

5. Biological test method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the cell number with the help of direct method is determined in the photometer, Tur bidimeter or fluorimeter are used, the measuring correlate values sufficiently closely with the cell number.

6. Biological test method according to one of claims 1 to 5, characterized in that all test approaches with a Total volume between 0.2 ml to 2.5 ml, in particular filled with 2 ml.

7. Biological test method according to one of claims 3 to 6, characterized in that the lighting conditions are set such that illumination of each micro titration plate with a quantity of light of at least 120 µmol quantum / sm ^{2 is} guaranteed.

8. Biological test method according to one of claims 1 to 7, characterized in that the test vessels of the micro titration plates covered during the incubation be that the test organisms carbon dioxide from the Take ambient air and release oxygen, however at the same time the evaporation of the test batches reduced is decorated.

9. Apparatus for carrying out the method according to claim 1, characterized in that a temperature-controlled and illuminated incubation cabinet ( 1 ) has at least one shaking device ( 3 , 13 ) for microtitration plates which are arranged in the incubation cabinet ( 1 ) on stanchions ( 6 ) are.

10. The device according to claim 9, characterized in that each shaking device ( 3 ) is provided with a reflecting surface ( 5 ) and at least one transparent holder ( 6 ) for microtitration plates ( 7 ) is arranged on each surface.

11. The device according to claim 9 or 10, characterized in that it has a transport device ( 13 ) to transport microtitration plates ( 7 ) between the incubation cabinet ( 1 ) and a measuring chamber ( 16 ), which is a photometer and / or turbidimeter and / or contains fluoride meters.

12. The apparatus according to claim 11, characterized in that the transport device ( 13 ) also serves as a Schüttelein direction.

13. Device according to one of claims 9 to 11, characterized in that each holder ( 6 ) for Mikrotitra tion plates ( 7 ) is assigned an individually controllable Schüttelein direction.

14. Device according to one of claims 9 to 13, characterized in that the device has an automatic dispenser for filling and / or pipetting the cavities of the microtitration plates ( 7 ).