EP1385971A2 - UMSETZUNG VON (Di)AMINEN IN GEGENWART EINER LYSINOXIDASE UND EINES REDUKTIONSMITTELS - Google Patents

UMSETZUNG VON (Di)AMINEN IN GEGENWART EINER LYSINOXIDASE UND EINES REDUKTIONSMITTELS

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EP1385971A2
EP1385971A2 EP02732574A EP02732574A EP1385971A2 EP 1385971 A2 EP1385971 A2 EP 1385971A2 EP 02732574 A EP02732574 A EP 02732574A EP 02732574 A EP02732574 A EP 02732574A EP 1385971 A2 EP1385971 A2 EP 1385971A2
Authority
EP
European Patent Office
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general formula
alkyl
linear
reducing agent
lysine oxidase
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02732574A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Friedrich
Norbert Zimmermann
Rainer STÜRMER
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/14—Nitrogen or oxygen as hetero atom and at least one other diverse hetero ring atom in the same ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric

Definitions

  • the invention relates to processes for reacting (di) amines as substrates in the presence of a lysine oxidase and a reducing agent. Depending on the substrate, alcohols, diols or cyclic secondary amines are obtained.
  • Another object of the invention is the use of a lysine oxidase in the methods mentioned.
  • Proline derivatives are important intermediates for thrombin inhibitors (WO 95/35309, WO 98/06740, WO94 / 29336), piperazine-2-carboxylic acid derivatives are used in
  • HIV protease inhibitors The representation of such cyclic secondary amines as
  • Piperazine-2-carboxylic acid, piperidine-2-carboxylic acid and proline derivatives often require a great deal of synthetic effort, as described by D. Askin et al. in Tetrahedron Lett. 1994
  • a relatively simple method of preparation for partially unsaturated piperidine-2-carboxylic acid derivatives is based on L-lysine. Its ⁇ -amino group is oxidized to the keto group in the presence of oxygen and with the formation of H2O2 and NH3, and 2-oxo-6-aminohexanoic acid is formed, as described in J. Basic Microbiol. 1994, 34 (4), 265-276. Find this reaction in
  • the resulting 2-oxo-6-aminohexanoic acid is cyclized to 1,2-didehydropiperidine-2-carboxylic acid.
  • 1,2-didehydropiperidine-2-carboxylic acid would have to be reduced in an additional process step after purification.
  • the object of the invention is to find a further process for the preparation of cyclic secondary amines which is also suitable for the synthesis of piperidine-2-carboxylic acid and proline derivatives.
  • R 1 NR 5 or a - optionally with CO2H, CO2R 6 , OH, SH and / or N (R 5 substituted and / or non-adjacent O, S and / or N atoms containing - linear bivalent C2-C6 Hydrocarbon radical is wwoobbeeii RR for HH ooddeerr lliinneeaarreess CC ⁇ i - CC6ö - alkyl and R stand for linear Ci-C ⁇ -alkyl or branched C3-C6-alkyl or Ce-Cio-aryl,
  • R 2 is H, CO2H, CO2R 6 or CN
  • R a optionally with linear Ci-Cö-alkyl or branched C3-C ⁇ -alkyl, C6-C10-
  • Aryl, C4-C ⁇ o-heteroaryl and / or CO2R substituted and / or non-adjacent O, S and / or N atoms containing - bivalent Co-Ci- or Cs-Cis-hydrocarbon radical, and
  • R stands for a linear C 1 -C 2 -hydrocarbon radical, optionally substituted with functional groups such as CO2H and / or CO2R and / or containing non-adjacent O, S and or N atoms.
  • step b) of the process according to the invention the cyclization to enamine or imine, takes place spontaneously, in contrast to the known process, without addition of catalase.
  • step a) of the method according to the invention a
  • Amino group of the L- and D-lysine is oxidized. For the subsequent steps, it is irrelevant which amino group has been oxidized or whether there is an aldehyde or ketone.
  • the carbonyl group generated in step a) then reacts spontaneously in step b) with the second - unreacted - amino group to form a Schiff base (an imine) 5 or an enamine. Since this reaction takes place intramolecularly, a cyclic enamine or imine is formed. This can also be isolated.
  • step c) the process is characterized in that isolation before step c) is not necessary, since steps a) to c) are carried out as a one-pot process.
  • step c) the cyclic enamine or imine is then reduced to a cyclic secondary amine of the general formula (II) by a reducing agent present in the substrate solution.
  • Reductant reduced to a hydroxymethyl group to form a primary
  • R is NR or a linear bivalent hydrocarbon radical having 2 to 6 C atoms, which is optionally substituted with functional groups such as CO2H, CO2R, OH, SH and / or N (R) 2 and / or contains non-adjacent heteroatoms such as O, S, N, where R is H or linear C 1 -C 6 -alkyl and R is linear C 1 -C 6 -alkyl or
  • 2 6 are branched C3-Cö-alkyl or C ⁇ -Cio-aryl, and R is H, CO2H, CO2R or CN,
  • radical R When defining the radical R are also from the term "hydrocarbon radical"
  • suitable diamines of the general formula (Ia) are basic amino acids such as D- and L-lysine and D- and L-ornithine, 2,6-diamino-4-azahexanoic acid and 1,6 ° diaminohexane.
  • L-lysine and L-ornithine are preferably used.
  • Piperidine-2-carboxylic acid is formed when L-lysine is used and proline is formed when L-ornithine is used.
  • the process is carried out as a one-pot process, lysine oxidase and reducing agent are present side by side and
  • R a optionally with linear Ci-C ⁇ -alkyl or branched C3-C6-alkyl, C ⁇ -oo-aryl, C4-C ⁇ o-heteroaryl and / or CO2R substituted and or non-adjacent O-, S- and / or N -Atoms containing - bivalent C0-C1 or Cs-Cis hydrocarbon radical.
  • divalent hydrocarbon radical also includes aryl, alkylaryl, (alkyl) cycloalkyl and optionally partially unsaturated (alkyl) heterocycloalkyl groups.
  • heteroaryl includes partially or completely unsaturated cycles which are 4 to 10 C. -Atoms and one or more non-adjacent O, N or S atoms or N (H) groups.
  • R is a linear bivalent Co-Ci or Cs-Cis - optionally containing CO2R-substituted and / or non-adjacent O, S and / or N atoms - Is hydrocarbon residue.
  • Suitable diamines of the general formula (Ib) are ethylenediamine, 1,4-diaminobutane, 1,8-diaminooctane and spermine.
  • the process is carried out as a one-pot process, lysine oxidase and reducing agent are present side by side and
  • linear hydrocarbon residue also includes linear (alkyl) aryl groups, linear (alkyl) cycloalkyl groups and linear (alkyl) heterocycloalkyl groups.
  • Suitable amines R -CH2-NH2 are n-butylamine, ethanolamine, glycine ethyl ester, 3-aminomethylpyridine and benzylamine.
  • the invention also relates to the use of a lysine oxidase in processes for converting (di) amines to cyclic secondary amines, diols or alcohols in the presence of a reducing agent.
  • Lysine oxidases catalyze the oxidation of the ⁇ -amino group of lysine to aldehydes in vivo and thus initiate the stabilization of collagen and elastin fibers by the formation of covalent cross-links (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1991, 5, 206-210).
  • Lysine oxidases (E.C. class 1.4.3) of microbial origin are generally used for the processes according to the invention, i.e. from eukaryotes like mushrooms or
  • Yeast or prokaryotes such as gram-positive or gram-negative bacteria or
  • Lysine oxidases from the genera and species Candida nagoyaensis, Candida nemodendra, Candida boidinii, Candida lipolytica, Candida steatolytica, Candida tropicalis, Candida utilis, Hansenula minuta, Hansenula polymorpha are particularly preferred.
  • Pichia pinus Pichia pastoris, Sporobolomyces alborubescens, Sporopachydermia cereana or Trigonopsis variabilis. Very particularly preferred for the invention
  • the process is lysine oxidase from the genus and type Pichia pastoris.
  • Both unpurified raw enzymes and purified enzymes can be used.
  • Whole organisms or cells can also be used for the method according to the invention, provided the enzymes are secreted into the extracellular environment or the cells have been permeabilized.
  • the process according to the invention is preferably carried out with purified enzymes.
  • lysine oxidases can be obtained on a large scale via fermentation processes.
  • lysine oxidases are obtained from yeasts by fermenting the yeast which secretes the desired lysine oxidase in a nutrient medium containing yeast extract, soybean oil and conventional additives such as mineral salts and trace elements and, if appropriate, buffer substances.
  • the lysine oxidases are released via a cell disruption which is carried out according to conventional methods known to the person skilled in the art.
  • the supernatant solution is purified by ion exchange chromatography followed by molecular sieve chromatography and subsequent ion exchange chromatography.
  • hereby lysine oxidases with a purity of more than 90%, preferably more than 95%, particularly preferably more than 99% can be prepared.
  • purification can also be carried out using hydrophobic chromatography and precipitation methods.
  • the lysine oxidase is generally used in a concentration of 2 to 20 units per mmol of substrate. 1 unit is defined as the amount of enzyme that catalyzes the formation of 1 ⁇ mol H2O2 per minute at 30 ° C.
  • Reducing agents which allow the reaction to be carried out in an aqueous medium are generally used as reducing agents.
  • these are the alkali metal and alkaline earth metal borohydrides, triacetoxyborohydrides, cyanoborohydrides and dithionites.
  • the transition metal salts of transition metals such as zinc, iron, manganese can also be used.
  • the reducing agent is generally used in a concentration of ⁇ 1% by weight, preferably in a concentration of ⁇ 0.5% by weight, based on the total amount of reaction medium.
  • the total amount of reaction medium includes the solution in which the reaction is carried out and any buffer substances, substrate, lysine oxidase and reducing agent contained therein.
  • Suitable buffer substances are all those buffer substances which buffer a pH range from 6.5 to 7.4, preferably a pH range from 6.8 to 7.2.
  • Organic buffer substances known as so-called Good buffers and phosphate-diphosphate buffers come into consideration as buffer substances. Buffer substances containing amino groups and (potassium / sodium) phosphate / diphosphate are preferred, and trishydroxymethylaminomethane (so-called TRIS buffer) is particularly preferred.
  • TRIS buffer trishydroxymethylaminomethane
  • the reaction is carried out by adding the (di) amine to the aqueous buffer solution containing lysine oxidase and reducing agent, with stirring.
  • (Di) amine submitted and the lysine oxidase and the reducing agent are added simultaneously with stirring.
  • the reducing agents mentioned are usually commercially available or dissolved in organic solvents such as glyme (glycol ether), lower alcohols or dioxane and are used in this form. However, aqueous solutions of the reducing agents can also be used.
  • the reactants can be added either continuously or batchwise, preferably batchwise.
  • the lysine oxidase can be recovered, e.g. by ultrafiltration and chromatography.
  • the process according to the invention can be carried out at temperatures between 0 and 60 ° C., preferably between 10 and 40 ° C., particularly preferably between 20 and 30 ° C.
  • the process can be carried out either under normal pressure or under increased pressure of up to 2 bar, but it is preferably carried out under normal pressure.
  • Example 1 Production of lysine oxidase from Pichia pastoris
  • the medium components bl) to b3) were combined after the sterilization.
  • the preculture prepared according to l.b) was transferred to a 10 1 fermenter and mixed with
  • Diluted water The pH was adjusted to about 7.0 by adding 50% by volume aqueous n-butylamine solution.
  • the fermentation was carried out at a temperature of 28 ° C. and an aeration of 5 l / min at 400 revolutions per minute for approx. 28 to 30 hours carried out.
  • the OD 600 of the fermenter samples was measured against air as a reference and should be 0.9 to 1.0.
  • the supernatant solution was removed and the residue was washed with 250 ml of 50 mmolar potassium phosphate-potassium diphosphate buffer solution and centrifuged again.
  • the supernatant solution was removed again and the cell mass remaining in the residue was stored at -15 ° C. in the freezer.
  • Example 2 Purification of the lysine oxidase from Pichia pastoris
  • the removed supernatant was brought to pH 7.0 with NaOH and applied to a Q-Sepharose Fast Flow column from Pharmacia with a diameter of 5 cm, a height of 13 cm and a volume of 250 ml. After the application, the column was washed with 600 ml of solution A.
  • Solution A contains sodium phosphate in a concentration of 20 mmol / 1 and ethanolamine in a concentration of 1 mmol / 1.
  • Solution B contains sodium phosphate in a concentration of 20 mmol / 1, ethanolamine in a concentration of 1 mmol / 1 and NaCl in a concentration of 1 mol / 1. Elution was carried out with a linear gradient of 11 solution A and 11 solution B. The active fractions were collected. 5 2.b) Molecular sieve chromatography
  • the active fractions were filtered through a 10 kDa omega filter (ultrafiltration) and separated over a preparative Superdex column from Pharmacia with a diameter 5 of 2.6 cm, a length of 60 cm and a volume of 320 ml.
  • the eluent was passed over the column at a rate of 3 ml / min.
  • the active fractions were determined and combined using the method described under 2.d).
  • the active fractions obtained and combined under 2.b) were again purified by 5 chromatography on a Mono-Q-HR5 / 5 column from Pharmacia. A mixture of solution A and solution B was used as the eluent. This was passed over the column at a rate of 1 ml / min and 100 fractions of 1 ml each were collected. The active fractions were also determined and combined using the method described under 2.d). The lysine oxidase eluted as the main active protein. The protein had a molecular weight of approximately 121,000 Da in the SDS gel under reducing conditions, for example by adding ⁇ -mercaptoethanol or dithiothreitol.
  • the amount of benzaldehyde formed was determined using a calibration curve (100 ⁇ mol).
  • Example 3 Determination of the enzymatic activity in the presence and absence of reducing agent
  • L-lysine monohydrochloride for biochemical purposes, 99% from Merck
  • ethanolamine from BASF AG glycine ethyl ester
  • 1,8-diaminooctane from Aldrich 1,8-diaminooctane from Aldrich
  • n-butylamine from BASF AG 1,4-diaminobutane were used as substrates from BASF AG, ethylenediamine from BASF AG, spermine from Aldrich, 3-aminomethylpyridine from Aldrich, benzylamine from Aldrich, L - (+) - ornithine hydrochloride (99% from Aldrich) and 1,6-diaminohexane from BASF AG.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umsetzung von Aminen der allgemeinen Formel (I) mit A- in der Bedeutung von (i) zu Verbindungen der allgemeinen Formel (II) oder (III) mit B- in der Bedeutung von HO-CH2-R<3>- oder R-<4>- enthaltend die folgenden Schritte: a) Oxidation mindestens einer (ii -Gruppe eines Amins der allgemeinen Formel (I) zu einer Carbonylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator; b) gegebenenfalls Reaktion der zweiten NH2-Gruppe eines Amins der allgemeinen Formel (I) mit (iii) mit der gemäss Schritt a) entstandenen Carbonylgruppe unter Cyclisierung zu einem Enamin oder Imin; c) Reduktion der nach a) entstandenen Carbonylgruppe(n) bzw. des nach b) gegebenenfalls entstandenen Enamins oder Imins mit einem Reduktionsmittel zu Hydroxymethylgruppen bzw. zu einem cyclischen sekundären Amin der allgemeinen Formel (II); wobei R<1> NR<5> oder ein - gegebenenfalls mit CO2H, CO2R<6>, OH, SH und/oder N(R<5>)2 substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - linearer bivalenter C2-C6-Kohlenwasserstoffrest ist, wobei R<5> für H oder lineares C1-C6-Alkyl und R<6> für lineares C1-C6-Alkyl der verzweigtes C3-C6-Alkyl oder C6-C10-Aryl stehen, und R<2> = H, CO2H, CO2R<6> oder CN ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren als Eintopfverfahren durchgeführt wird, Lysinoxidase und reduktionsmittel nebeneinander vorliegen und in der Definition von A in der allgemeinen Formel (I) R<3> ein - gegebenenfalls mit linearem C1-C6-Alkyl oder verzweigtem C3-C6-Alkyl, C6-C10-Aryl, C4-C10-Heteroaryl und/oder CO2R<6> substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome entahltender - bivalenter C0-C1- oder C5-C18-Kohlenwasserstoffrest ist, und R<4> für einen - gegebenenfalls mit funtionellen Gruppen wie CO2H und/oder CO2R<6> substituierten und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltenden - linearen C1-C20-Kohlenwasserstoffrest steht.

Description

Umsetzung von (Di)Aminen in Gegenwart einer Lysinoxidase und eines Reduktionsmittels
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Umsetzung von (Di)Aminen als Substrate in Gegenwart einer Lysinoxidase und eines Reduktionsmittels. Je nach Substrat werden hierbei Alkohole, Diole oder cyclische sekundäre Amine erhalten.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer Lysinoxidase in den genannten Verfahren.
Prolinderivate sind wichtige Zwischenprodukte für Thrombininhibitoren (WO 95/35309, WO 98/06740, WO94/29336), Piperazin-2-carbonsäurederivate finden Anwendung in
HlV-Proteasehemmern. Die Darstellung solcher cyclischen sekundären Amine wie
Piperazin-2-carbonsäure-, Piperidin-2-carbonsäure- und Prolin-derivaten erfordert häufig einen großen synthetischen Aufwand, wie von D. Askin et al. in Tetrahedron Lett. 1994,
35(5), 673-676 und in WO 98/04523 beschrieben. Eine im Vergleich dazu recht einfache Darstellungsmethode für teilweise ungesättigte Piperidin-2-carbonsäurederivate geht aus von L-Lysin. Dessen α-Aminogruppe wird in Gegenwart von Sauerstoff und unter Bildung von H2O2 und NH3 zur Ketogruppe oxidiert und es entsteht 2-Oxo-6-aminohexansäure, wie in J. Basic Microbiol. 1994, 34(4), 265-276 beschrieben. Findet diese Reaktion in
Anwesenheit von Catalase statt, so wird die entstandene 2-Oxo-6-aminohexansäure zu 1,2- Didehydropiperidin-2-carbonsäure cyclisiert. Um daraus Piperidin-2-carbonsäure herzustellen, müßte die l,2-Didehydropiperidin-2-carbonsäure nach Aufreinigung in einem zusätzlichen Verfahrensschritt reduziert werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein weiteres Verfahren zur Herstellung von cyclischen sekundären Aminen zu finden, welches auch für die Synthese von Piperidin-2- carbonsäure- und Prolin-derivaten geeignet ist.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Umsetzung von Aminen der allgemeinen Formel (I) (I)
mit A- in der Bedeutung von
zu Verbindungen der allgemeinen Formel (II) oder (III)
(II) (HI)
3 4 mit B- in der Bedeutung von HO-CH2-R - oder R -
enthaltend die folgenden Schritte:
a) Oxidation mindestens einer -C-NH2-Gruppe eines Amins der allgemeinen
Formel (I) zu einer Carbonylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator;
b) gegebenenfalls Reaktion der zweiten Ntfe-Gruppe eines Amins der allgemeinen Formel (I) mit
mit der nach a) entstandenen Carbonylgruppe unter Cyclisierung zu einem
Enamin oder Imin; c) Reduktion der nach a) entstandenen Carbonylgruppe(n) bzw. des nach b) gegebenenfalls entstandenen Enamins oder Imins mit einem Reduktionsmittel zu Hydroxymethylgruppen bzw. zu einem cyclischen sekundären Amin der allgemeinen Formel (II),
wobei R1 NR5 oder ein - gegebenenfalls mit CO2H, CO2R6, OH, SH und/oder N(R5 substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - linearer bivalenter C2-C6-Kohlenwasserstoffrest ist. wwoobbeeii RR ffüürr HH ooddeerr lliinneeaarreess CCιi--CC6ö--Alkyl und R für lineares Ci-Cβ-Alkyl oder verzweigtes C3-C6-Alkyl oder Ce-Cio-Aryl stehen,
und R2 H, CO2H, CO2R6 oder CN ist,
dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Eintopf erfahren durchgeführt wird, Lysinoxidase und Reduktionsmittel nebeneinander vorliegen und
in der Definition von A in der allgemeinen Formel (I)
3 R ein - gegebenenfalls mit linearem Ci-Cö-Alkyl oder verzweigtem C3-Cδ-Alkyl, C6-C10-
Aryl, C4-Cιo-Heteroaryl und/oder CO2R substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - bivalenter Co-Ci- oder Cs-Cis-Kohlenwasserstoffrest ist, und
4 6
R für einen - gegebenenfalls mit funktionellen Gruppen wie CO2H und/oder CO2R substituierten und/oder nicht-benachbarte O-, S- und oder N-Atome enthaltenden - linearen Cι-C20-Kohlenwasserstoffrest steht.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Eintopfverfahren ist umso erstaunlicher, da nicht zu erwarten war, daß Lysinoxidasen ihre Aktivität in Gegenwart eines Reduktionsmittels beibehalten. Eine Aufreinigung der nach b) entstandenen cyclischen Enamine, lmine oder der nach a) entstandenen Verbindungen mit mindestens einer Carbonylgruppe vor Reduktion zu cyclischen sekundären Aminen der allgemeinen Formel (II) oder Alkoholen der allgemeinen Formel (III) ist also nicht nötig. Zudem findet Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens, die Cyclisierung zum Enamin oder Imin, im Gegensatz zum bekannten Verfahren spontan auch ohne Zusatz von Catalase statt.
Je nach der Struktur des Amins der allgemeinen Formel (I), dem Substrat, laufen die einzelnen Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens im Detail folgendermaßen ab: 1) Wird ein Amin der allgemeinen Formel (I) mit
5
1 2 eingesetzt, wobei R und R die obengenannte Bedeutung haben, so handelt es sich bei dem Substrat um ein Diamin. In Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine
I der beiden -C-NH2-Gruppen dieses Dia ms zu einer Carbonylgruppe unter Katalyse einer Lysinoxidase oxidiert. Es konnte beobachtet werden, daß bei Einsatz der ° Lysinoxidase aus Pichia pastoris ausschließlich die ε-Aminogruppe und nicht die α-
Aminogruppe des L- und D-Lysins oxidiert wird. Für die Folgeschritte ist es jedoch unerheblich, welche Aminogruppe oxidiert wurde bzw. ob ein Aldehyd oder Keton vorliegt. Die in Schritt a) erzeugte Carbonylgruppe reagiert dann spontan in Schritt b) mit der zweiten — nicht umgesetzten - Aminogruppe zu einer Schiffschen Base (einem Imin) 5 oder einem Enamin. Da diese Reaktion intramolekular abläuft, entsteht dabei ein cyclisches Enamin oder Imin. Dieses kann auch isoliert werden. Das erfindungsgemäße
Verfahren ist jedoch dadurch gekennzeichnet, daß eine Isolierung vor Schritt c) nicht nötig ist, da die Schritte a) bis c) als Eintopfverfahren durchgeführt werden. In Schritt c) wird dann das cyclische Enamin oder Imin durch ein in der Substratlösung vorhandenes 0 Reduktionsmittel zu einem cyclischen sekundären Amin der allgemeinen Formel (II) reduziert.
3
2) Wird ein Amin der allgemeinen Formel (I) mit A- = H2N-CH2-R - eingesetzt, wobei 3
R die obengenannte Bedeutung hat, so handelt es sich bei dem Substrat um ein Diamin 5 mit zwei Aminomethylgruppen. Beide Aminomethylgruppen werden in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator zu Formylgruppen oxidiert. Eine intramolekulare Reaktion ist im Gegensatz zu 1) nicht möglich oder nicht begünstigt und findet daher auch nicht statt. Beide Formylgruppen werden anschließend gemäß Schritt c) mit einem Reduktionsmittel zu 0 Hydroxymethylgruppen reduziert unter Bildung eines Alkohols der allgemeinen Formel (III) mit B- = HO-CH2-R3-.
4 4
3) Wird als Substrat ein Amin der allgemeinen Formel (I) mit A = R eingesetzt, wobei R die oben angegebene Bedeutung hat, so wird dessen Aminomethylgruppe zu einer Formylgruppe oxidiert. Diese Formylgruppe wird anschließend gemäß Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens durch das in der Substratlösung vorhandene
Reduktionsmittel zu einer Hydroxymethylgruppe reduziert unter Bildung eines primären
4 Alkohols der allgemeinen Formel (III) mit B = R .
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich detailliert wie folgt beschreiben:
1) Verfahren zur Herstellung von cyclischen sekundären Aminen der allgemeinen Formel (II) aus Diaminen der allgemeinen Formel (Ia)
(Ia) (II) wobei R für NR oder einen linearen bivalenten Kohlenwasserstoffrest mit 2 bis 6 C- Atomen steht, der gegebenenfalls mit funktionellen Gruppen wie CO2H, CO2R , OH, SH und/oder N(R )2 substituiert ist und/oder nicht-benachbarte Heteroatome wie O, S, N enthält, wobei R für H oder lineares Ci-Cβ-Alkyl und R für lineares Cι-C6-Alkyl oder
2 6 verzweigtes C3-Cö-Alkyl oder Cδ-Cio-Aryl stehen, und R H, CO2H, CO2R oder CN ist,
enthaltend die folgenden Schritte:
a) Oxidation einer der beiden -C-NH2-Gruppen eines Diamins der allgemeinen Formel (Ia) zu einer Carbonylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator; b) Reaktion der zweiten NH2-Gruppe des Diamins der allgemeinen Formel (Ia) mit der gemäß Schritt a) entstandenen Carbonylgruppe unter Cyclisierung zu einem Enamin oder Imin; c) Reduktion des nach b) entstandenen Enamins oder Imins mit einem Reduktionsmittel zu einem cyclischen sekundären Amin der allgemeinen Formel (II); dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Eintopfverfahren durchgeführt wird und Lysinoxidase und Reduktionsmittel nebeneinander vorliegen.
Bei der Definition des Restes R sind von dem Begriff "Kohlenwasserstoffrest" auch
5 (teilweise) ungesättigte Kohlenwasserstoffreste umfaßt, wobei die Doppelbindungen cis- ständig vorliegen.
Beispiele für geeignete Diamine der allgemeinen Formel (Ia) sind basische Aminosäuren wie D- und L-Lysin und D- und L-Ornithin, 2,6-Diamino-4-azahexansäure sowie 1,6- ° Diaminohexan. Bevorzugt werden L-Lysin und L-Ornithin eingesetzt. Beim Einsatz von L- Lysin entsteht Piperidin-2-carbonsäure und beim Einsatz von L-Ornithin entsteht Prolin.
2) Verfahren zur Herstellung von Diolen der allgemeinen Formel (Illa) aus Diaminen der allgemeinen Formel (Ib) 5
(Ib) (lila)
enthaltend die folgenden Schritte:
0 a) Oxidation der beiden Aminomethylgruppen eines Diamins der allgemeinen
Formel (Ib) zu Formylgruppen in Gegenwart einer Lysinoxidase als
Katalysator; b) Reduktion der nach a) entstandenen Formylgruppen mit einem
Reduktionsmittel zu Hydroxymethylgruppen unter Bildung eines Diols der 5 allgemeinen Formel (lila);
dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Eintopfverfahren durchgeführt wird, Lysinoxidase und Reduktionsmittel nebeneinander vorliegen und
0 R ein - gegebenenfalls mit linearem Ci-Cβ-Alkyl oder verzweigtem C3-C6-Alkyl, Cβ-Oo- Aryl, C4-Cιo-Heteroaryl und/oder CO2R substituierter und oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - bivalenter C0-C1- oder Cs-Cis-Kohlenwasserstoffrest ist. Von dem Begriff „bivalenter Kohlenwasserstoffrest" sind hier auch Aryl-, Alkylaryl-, (Alkyl)Cycloalkyl- sowie gegebenenfalls teilweise ungesättigte (Alkyl)HeterocycIoalkyl- gruppen umfaßt. Der Begriff "Heteroaryl" umfaßt teilweise oder vollständig ungesättigte Cyclen, welche 4 bis 10 C-Atome und ein oder mehrere nicht-benachbarte O-, N- oder S- Atome oder N(H)-Gruppierungen enthalten.
Bevorzugt werden Verbindungen der allgemeinen Formel (Ib) eingesetzt, in denen R ein - gegebenenfalls mit CO2R substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N- Atome enthaltender - linearer bivalenter Co-Ci- oder Cs-Cis-Kohlenwasserstoffrest ist.
Beispiele für geeignete Diamine der allgemeinen Formel (Ib) sind Ethylendiamin, 1,4- Diaminobutan, 1,8-Diaminooctan und Spermin.
3) Verfahren zur Herstellung von primären Alkoholen R -CH2-OH aus Aminen 4 R -CH2-NH2 enthaltend die folgenden Schritte:
4 a) Oxidation der Ammomethylgruppe eines Amins R -CH2-NH2 zu einer
Formylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator; b) Reduktion der nach a) entstandenen Formylgruppe mit einem Reduktionsmittel zu einer Hydroxymethylgruppe unter Bildung eines
4 primären Alkohols R -CH2-OH;
dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Eintopfverfahren durchgeführt wird, Lysinoxidase und Reduktionsmittel nebeneinander vorliegen und
4 6
R für einen - gegebenenfalls mit funktionellen Gruppen wie CO2H und oder CO2R (mit R = lineares Ci-Cβ-Alkyl oder verzweigtes C3-C6-Alkyl oder Cö-Cio-Aryl) substituierten und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltenden - linearen C1-C20- Kohlenwasserstoffrest steht.
Der Begriff „linearer Kohlenwasserstoffrest" umfaßt auch lineare (Alkyl)Arylgruppen, lineare (Alkyl)Cycloalkylgruppen und lineare (Alkyl)Heterocycloalkylgruppen.
4 Beispiele für geeignete Amine R -CH2-NH2 sind n-Butylamin, Ethanolamin, Glycinethylester, 3-Aminomethylpyridin sowie Benzylamin. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung einer Lysinoxidase in Verfahren zur Umsetzung von (Di)Aminen zu cyclischen sekundären Aminen, Diolen oder Alkoholen in Gegenwart eines Reduktionsmittels.
Lysinoxidasen katalysieren in vivo die Oxidation der ε-Aminogruppe des Lysins zu Aldehyden und initiieren so die Stabilisierung von Kollagen- und Elastinfasern durch die Bildung kovalenter Quervernetzungen (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1991, 5, 206-210).
Für die erfindungsgemäßen Verfahren werden im Allgemeinen Lysinoxidasen (E.C.- Klasse 1.4.3) mikrobiellen Ursprungs eingesetzt, d.h. aus Eukaryonten wie Pilzen oder
Hefen oder Prokaryonten wie gram-positiven oder gram-negativen Bakterien oder
Archaebakterien. Bevorzugt werden die Lysinoxidasen aus Hefen der Gattungen Candida,
Hansenula, Pichia, Sporobolomyces, Sporopachydermia oder Trigonopsis verwendet.
Besonders bevorzugt sind Lysinoxidasen aus den Gattungen und Arten Candida nagoyaensis, Candida nemodendra, Candida boidinii, Candida lipolytica, Candida steatolytica, Candida tropicalis, Candida utilis, Hansenula minuta, Hansenula polymorpha,
Pichia pinus, Pichia pastoris, Sporobolomyces alborubescens, Sporopachydermia cereana oder Trigonopsis variabilis. Ganz besonders bevorzugt für das erfindungsgemäße
Verfahren ist die Lysinoxidase aus der Gattung und Art Pichia pastoris.
Es können sowohl unaufgereinigte Rohenzyme als auch gereinigte Enzyme eingesetzt werden. Auch ganze Organismen oder Zellen können für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, soweit die Enzyme ins extrazelluläre Milieu sezerniert werden oder die Zellen permeabilisiert wurden. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren mit gereinigten Enzymen durchgeführt.
Vorteilhaft ist, daß Lysinoxidasen über Fermentationsprozesse in großem Maßstab gewonnen werden können. Beispielsweise werden Lysinoxidasen aus Hefen dadurch gewonnen, daß die Hefe, die die gewünschte Lysinoxidase sezerniert, in einem Nährmedium enthaltend Hefe-Extrakt, Sojaöl und übliche Zusatzstoffe wie Mineralsalze und Spurenelemente sowie gegebenenfalls Puffersubstanzen fermentiert wird. Nach dem Fermentationsprozeß werden die Lysinoxidasen über einen Zellaufschluß freigesetzt, der nach dem Fachmann bekannten, üblichen Methoden durchgeführt wird. Nach anschließender Zentrifugation wird die überstehende Lösung durch eine lonenaustauschchromatographie mit anschließender Molekularsiebchromatographie und nachfolgender nochmaliger lonenaustauschchromatographie aufgereinigt. Hierdurch können Lysinoxidasen mit einer Reinheit von über 90%, bevorzugt von über 95%, besonders bevorzugt von über 99% dargestellt werden. Anstelle von lonenaustauschchromatographie und Molekularsiebchromatographie kann eine Reinigung auch durch hydrophobe Chromatographie und Fällungsmethoden erfolgen.
Zur Umsetzung der (Di)Amine in den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Lysinoxidase im allgemeinen in einer Konzentration von 2 bis 20 Units pro mmol Substrat eingesetzt. 1 Unit wird definiert als die Menge an Enzym, die die Bildung von 1 μmol H2O2 pro Minute bei 30 °C katalysiert.
Als Reduktionsmittel werden im allgemeinen solche Reduktionsmittel eingesetzt, die eine Durchführung der Reaktion im wäßrigen Medium erlauben. Beispiele hierfür sind die Alkalimetall- und Erdalkalimetall-borhydride, -triacetoxyborhydride, -cyanoborhydride und -dithionite. Anstelle der (Erd)Alkalimetallsalze können auch die Übergangs- metallsalze von Übergangsmetallen wie Zink, Eisen, Mangan eingesetzt werden. Bevorzugt ist der Einsatz von Alkalimetallsalzen, insbesondere von NaBH4. Das Reduktionsmittel wird im allgemeinen in einer Konzentration < 1 Gew.-%, bevorzugt in einer Konzentration < 0,5 Gew.-% - bezogen auf die Gesamtmenge an Reaktionsmedium eingesetzt. Die Gesamtmenge an Reaktionsmedium beinhaltet die Lösung, in der die Reaktion durchgeführt wird, und gegebenenfalls darin enthaltene Puffersubstanzen, Substrat, Lysinoxidase und Reduktionsmittel.
Die Reaktion wird im allgemeinen in wäßrigen Lösungen enthaltend Puffersubstanzen durchgeführt. Als Puffersubstanzen kommen alle diejenigen Puffersubstanzen in Frage, die einen pH-Bereich von 6,5 bis 7,4, bevorzugt einen pH-Bereich von 6,8 bis 7,2, puffern. Als Puffersubstanzen kommen als sog. Good'schen Puffer bekannte organische Puffersubstanzen in Betracht sowie Phosphat-Diphosphat-Puffer. Bevorzugt sind Puffersubstanzen, die Amino-Gruppen enthalten, sowie (Kalium-/Natrium-)Phos- phat/Diphosphat, besonders bevorzugt ist Trishydroxymethylaminomethan (sog. TRIS- Puffer). Weitere geeignete Puffersubstanzen, die in dem Bereich zwischen pH 6,5 und pH 7,4 puffern, können den Standard-Nachschlagewerken entnommen werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Reaktionsdurchfuhrung durch Zugabe des (Di)Amins zu der Lysinoxidase und Reduktionsmittel enthaltenden wäßrigen Pufferlösung unter Rühren. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das (Di)Amin vorgelegt und die Lysinoxidase und das Reduktionsmittel werden gleichzeitig unter Rühren zugeben.
Die erwähnten Reduktionsmittel sind meist gelöst oder suspendiert in organischen Lösungsmitteln wie Glyme (Glykolether), niederen Alkoholen oder Dioxan kommerziell erhältlich und werden in dieser Form eingesetzt. Es können jedoch auch wäßrige Lösungen der Reduktionsmittel eingesetzt werden.
Die Zugabe der Reaktanden kann sowohl kontinuierlich als auch diskontinuierlich erfolgen, bevorzugt erfolgt sie diskontinuierlich.
Die Lysinoxidase kann zurückgewonnen werden, z.B. durch Ultrafiltration und Chromatographie.
Im allgemeinen ist das erfindungsgemäße Verfahren bei Temperaturen zwischen 0 und 60°C durchführbar, bevorzugt zwischen 10 und 40°C, besonders bevorzugt zwischen 20 und 30°C.
Das Verfahren kann sowohl bei Normaldruck als auch bei erhöhtem Druck von bis zu 2 bar durchgeführt werden, bevorzugt wird es j edoch bei Normaldruck durchgeführt.
Die Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen zusätzlich näher erläutert.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Herstellung der Lysinoxidase aus Pichia pastoris
a) Herstellung der Hefekultur
3 g/1 Malt Extract der Firma Difco,
5 g/1 Pepton der Firma Difco,
3 g/1 Yeast Extract der Firma Difco und 20 g/1 Agar der Firma Difco
wurden auf YM-Agarplatten kultiviert. Die Platten wurden hierfür bei 28°C für 48 Stunden bebrütet und sind danach bei 4 bis 5°C für mindestens 4 Wochen haltbar.
l.b) Herstellung der Vorkultur und des Fermentationsmediums
bl) 10 g/1 Glucose wurden 30 Minuten bei 121°C autoklaviert.
0,2 ml 1 einer Salzlösung nach Vishniac & Santer enthaltend 50 g/1 Titriplex III, 22 g/1 ZnSθ4-7H2θ, 5,54 g/1 CaCh, 5,06 g/1 MnCl2-4H2θ, 4,99 g/1 FeSθ4-7H2θ, 1,1 g/1 Ammoniumheptamolybdat-4H2θ, 1,57 g/1 CuSθ4-5H2θ, 1,61 g/1 CoCb-6H2θ und mit KOH auf pH 6,0 eingestellt, wurden 30 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert.
b3) 10 ml/1 einer Vitaminlösung nach Lodder enthaltend 20 μg/1 Biotin, 20 mg/1 Calciumpantothenat, 2 μg/1 Folsäure, 10 mg/1 Inositol, 200 μg/1 p- Aminobenzoesäure, 400 μg/1 Nicotinsäure, 400 μg/1 Pyridoxinhydrochlorid, 200 μg/1 Riboflavin und 400 μg/1 Thiaminhydrochlorid wurden steril filtriert.
Die Mediumsbestandteile bl) bis b3) wurden nach der Sterilisation vereinigt.
500 ml dieses Fermentationsmediums wurden in einen 1 1 Erle meyerkolben überführt. Aus 3 bis 4 Agarplatten enthaltend die Hefekultur aus Pichia pastoris (siehe La)), wurde mit der Impföse Zellmaterial abgekratzt und in den Erlenmeyerkolben überführt. Es wurde 24 Stunden bei 28 °C und 200 Umdrehungen pro Minute inkubiert.
l.c) Herstellung der Hauptkultur
Die nach l.b) hergestellte Vorkultur wurde in einen 10 1 Fermenter überführt und mit
Wasser verdünnt. Durch Zugabe von 50 Vol.-%iger wäßriger n-Butylaminlösung wurde der pH auf ca. 7,0 eingestellt. Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 28°C und einer Belüftung von 5 1/min bei 400 Umdrehungen pro Minute für ca. 28 bis 30 Stunden durchgeführt. Der Zeitpunkt des Fermentationsendes wurde über die Bestimmung der Absorption bei 600 nm (OD 600; OD = optical density) festgelegt. Der OD 600 der Fermenterproben wurde gegen Luft als Referenz gemessen und sollte bei 0,9 bis 1,0 liegen.
5 Zur Aufarbeitung wurde der Fermenterinhalt bei 45°C und 5000 Umdrehungen pro Minute (ca. 9500 g; g = Erdbeschleunigung) für 20 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde abgenommen und der Rückstand mit 250 ml 50 mmolarer Kaliumphosphat- Kaliumdiphosphat-Pufferlösung gewaschen und erneut zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde erneut abgenommen und die im Rückstand verbleibende Zellmasse bei - ° 15°C im Tiefkühlschrank gelagert.
l.d) Zellaufschluß und Homogenisierung
18 ml der bei -20°C gelagerten und aufgetauten Zellmasse von Pichia pastoris wurden mit 5 einer Pufferlösung enthaltend 20 mmol/1 Natriumphosphat und lmmol 1 Ethanolamin (pH 7,0) auf 50 ml verdünnt. Zu dieser Lösung wurden 50 ml Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,5 mm zugegeben und das Ganze wurde 30 Minuten bei 5000 Umdrehungen pro Minute und 0°C homogenisiert. Das Homogenisat wurde über Gaze filtriert. Das Filtrat wurde 10 Minuten bei 8000 Umdrehungen pro Minute und 4°C 0 zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen.
Beispiel 2: Reinigung der Lysinoxidase aus Pichia pastoris
2.a) lonenaustauschchromatographie 5
Der abgenommene Überstand wurde mit NaOH auf pH 7,0 gebracht und auf eine Q- Sepharose-Fast-Flow-Säule der Firma Pharmacia mit einem Durchmesser von 5 cm, einer Höhe von 13 cm und einem Volumen von 250 ml aufgetragen. Nach dem Auftrag wurde die Säule mit 600 ml der Lösung A gewaschen. Lösung A enthält Natriumphosphat in 0 einer Konzentration von 20 mmol/1 und Ethanolamin in einer Konzentration von 1 mmol/1. Lösung B enthält Natriumphosphat in einer Konzentration von 20 mmol/1, Ethanolamin in einer Konzentration von 1 mmol/1 und NaCl in einer Konzentration von 1 mol/1. Eluiert wurde mit einem linearen Gradienten von 11 Lösung A und 11 Lösung B. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt. 5 2.b) Molekularsiebchromatographie
Die aktiven Fraktionen wurden über einen 10 kDa-Omega-Filter filtriert (Ultrafiltration) und über eine präparative Superdex-Säule der Firma Pharmacia mit einem Durchmesser 5 von 2,6 cm, einer Länge von 60 cm und einem Volumen von 320 ml getrennt. Als Laufmittel wurde eine Lösung, enthaltend 20 mmol/1 Natriumphosphat- Natrium- diphosphat-Puffer, 150 mmol/l NaCl und lmmol/l Ethanolamin mit einem pH von 7,5 verwendet. Das Laufmittel wurde in einer Geschwindigkeit von 3 ml/min über die Säule gegeben. Die aktiven Fraktionen wurden mit dem unter 2.d) beschriebenen Verfahren ° bestimmt und vereinigt.
2.c) lonenaustauschchromatographie
Die unter 2.b) erhaltenen und vereinigten aktiven Fraktionen wurden erneut durch 5 Chromatographie an einer Mono-Q-HR5/5-Säule der Firma Pharmacia gereinigt. Als Laufmittel diente ein Gemisch aus Lösung A und Lösung B. Dieses wurde mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min über die Säule gegeben und es wurden 100 Fraktionen zu je 1 ml gesammelt. Die aktiven Fraktionen wurden ebenfalls mit dem unter 2.d) beschriebenen Verfahren bestimmt und vereinigt. Die Lysinoxidase eluierte als aktives 0 Hauptprotein. Das Protein hatte im SDS-Gel unter reduzierenden Bedingungen, beispielsweise durch Zugabe von ß-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol, ein Molekulargewicht von ca. 121000 Da.
2.d) Bestimmung der Aktivität der Lysinoxidase 5
Zur Bestimmung der aktiven Fraktionen, also der Aktivität der Lysinoxidase, wurde die Umsetzung von Benzylamin zu Benzaldehyd in Gegenwart von Lysinoxidase ausgenutzt. Benzaldehyd ist UV-aktiv und läßt sich bei 250 nm detektieren. Ein Aliquot der unter 2.a) bis 2.c) gesammelten Fraktionen wurde jeweils mit 3 mmol Benzylamin in einem 0 Phosphat-Dihydrogenphosphat-Puffer für 1 bis 5 Stunden inkubiert. Die so erhaltene Lösung wurde unter Verwendung einer Li-Chrosorb 5RP C18-Chromatographiesäule der Fa. Merck in einer HPLC-Anlage analysiert. Als Laufmittel A wurde Wasser enthaltend 0,1 Vol.-% Trifluoressigsäure und als Laufinittel B Acetonitril enthaltend 0,1 Vol.-% Tri- fluoressigsäure verwendet. 5 Tabelle 1 : HPLC-Programm
Die Menge an entstandenem Benzaldehyd wurde über eine Eichkurve (1-lOOμmol) ermittelt.
2.e) Bestimmung der Aminosäuresequenz
Beim Edman-Abbau der Lysinoxidase aus Pichia pastoris wurde eine aminoterminale Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO 1 (s. Sequenzprotokoll) erhalten. Durch proteoly- tischen Abbau der Lysinoxidase aus Pichia pastoris mit Trypsin wurden Teilsequenzen SEQ ID NO 2 bis 12 (s. Sequenzprotokoll) erhalten.
Beispiel 3: Bestimmung der enzymatischen Aktivität in Gegenwart und Abwesenheit von Reduktionsmittel
3.a) Testen verschiedener Substrate
Als Substrate wurden L-Lysin-Monohydrochlorid (für biochemische Zwecke, 99% der Firma Merck), Ethanolamin der Firma BASF AG, Glycinethylester, 1,8-Diaminooctan der Firma Aldrich, n-Butylamin der Firma BASF AG, 1,4-Diaminobutan der Firma BASF AG, Ethylendiamin der Firma BASF AG, Spermin der Firma Aldrich, 3-Aminomethylpyridin der Firma Aldrich, Benzylamin der Firma Aldrich, L-(+)-Ornithin-Hydrochlorid (99% der Firma Aldrich) sowie 1,6-Diaminohexan der Firma BASF AG eingesetzt.
In einer Mikrotiterplatte wurden jeweils Meßreihen mit einer Konzentration von 1200, 600, 300, 150, 75, 37,5 und 18,75 μmol (Di)Amin pro 1 1 Wasser durchgeführt. Es wurden jeweils 2 Meßreihen durchgeführt: eine mit Enzym und eine ohne Enzym als Referenz. Es wurden jeweils 100 μl der verdünnten Lösungen genommen. Zu dieser Lösung wurden 25 μl Lysinoxidase sowie 40 μl 35 mmolarer Phenollösung in 200 mmolarer Kaliumphosphat-Kaliumdiphosphat-Lösung mit einem pH von 7,5, 40 μl einer 2 mmolaren wäßrigen 4-Aminoantipyrin-Lösung und 40 μl einer Lösung von 0,35 mg Peroxidase (Horseradish der Firma Sigma) in 1 ml Wasser gegeben.
In der Referenz-Meßreihe wurden die 25 μl Lysinoxidase durch 25 μl Wasser ersetzt. Durch den bei der Umsetzung der Substrate entstandenen Ammoniak wurde ein violetter Farbstoff gebildet, dessen Absorption im UV bei 500 nm gemessen wurde (T. Uwajima, O. Terada, Methods in Enzymology 1982, 89, 243 ff).
Die relativen Umsatzgeschwindigkeiten der Substrate im Vergleich zu L-Lysin sind Tabelle 1 zu entnehmen.
Tabelle 1:
Es zeigte sich, daß sich sowohl (un)substituierte aliphatische Amine und Diamine als auch Aminosäuren und deren Derivate in Gegenwart von Lysinoxidase umsetzen lassen. Erstaunlicherweise ist bei einigen Substraten die Umsatzgeschwindigkeit gegenüber L- Lysin erhöht. Der Einsatz von Derivaten des Lysins und Orrüthins ist besonders im Hinblick auf die Darstellung von Piperidin-2-carbonsäure- und Prolin-derivaten interessant.
3.b) Test verschiedener Konzentrationen an Reduktionsmittel
Um die Toleranz der Lysinoxidasen gegenüber Reduktionsmittel zu testen, wurde beispielhaft die Meßreihe mit L-Lysin unter Verwendung der Lysinoxidase aus Pichia pastoris in Gegenwart von 0,001 Gew.-%, 0,01 Gew.-%, 0,1 Gew.-%, 0,5 Gew.-% und 1 Gew.-% NaBH4 - bezogen auf die Gesamtmenge der Substratlösung - wiederholt. Die Ergebnisse sind Tabelle 2 zu entnehmen.
Tabelle 2:
Es zeigte sich, daß die Aktivität der Lysinoxidase bis zu einer Konzentration von 0,1 Gew.-% NaBH4 nahezu unverändert blieb. Bei Konzentrationen von > 0,5 Gew.-% NaBH4 nahm die Aktivität aufgrund der Erhöhung des pH-Wertes ab. Relativ gute Umsätze wurden noch bis zu einer NaBH4-Konzentration von 1 Gew.-% erzielt. In den weiteren Versuchen wurden daher jeweils 1 Gew.-% NaBH4 - bezogen auf die Gesamtmenge der Substratlösung - eingesetzt. 3.c) Aufarbeitung der Proben
50 ml einer - in Gegenwart von Lysinoxidase umgesetzten - 1,2 mmolaren L-Lysinlösung wurde zur Trockene eingeengt, in der fünffachen Menge Ethanol aufgenommen, mit 1 Tropfen konzentrierter Schwefelsäure versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach AbdestiUieren des Ethanols im Vakuum wurde der Rückstand mit einem Überschuß an Triethylamin und Chlorameisensäurebenzylester versetzt und 3 h bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach Zugabe von Wasser wurden die N-Benzyl- oxycarbonylderivate mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde per Massenspektrometrie und NMR charakterisiert. Die erhaltenen Spektren entsprachen denen authentischer Proben von Piperidin-2-carbonsäure.
Die anderen Substratlösungen wurden analog aufgearbeitet.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Umsetzung von Aminen der allgemeinen Formel (I)
(I)
mit A- in der Bedeutung von
R
H-jN— CH— R— ^ H^N— CH2— R— oder R4—
zu Verbindungen der allgemeinen Formel (II) oder (III)
2 /
R2°- /CH2 B-CFL — OH
^N 2 H
3 4 mit B- in der Bedeutung von HO-CH2-R - oder R -
enthaltend die folgenden Schritte:
a) Oxidation mindestens einer -C-NH2-Gruppe eines Amins der allgemeinen
Formel (I) zu einer Carbonylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator;
b) gegebenenfalls Reaktion der zweiten NH2-Gruppe eines Amins der allgemeinen Formel (I) mit
mit der nach a) entstandenen Carbonylgruppe unter Cyclisierung zu einem Enamin oder Imin;
c) Reduktion der nach a) entstandenen Carbonylgruppe(n) bzw. des nach b) gegebenenfalls entstandenen Enamins oder Imins mit einem Reduktionsmittel zu Hydroxymethylgruppen bzw. zu einem cyclischen sekundären Amin der allgemeinen Formel (II),
1 fv wobei R NR oder ein - gegebenenfalls mit CO2H, CO2R , OH, SH und/oder N(R )2 substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - linearer bivalenter C2-C6-Kohlenwasserstoffrest ist, wwoobbeeii RR ffüürr HH ooddeerr lliinneeaarreess CCιι--CC66--AAllkkyyll uunndd I R für lineares Cι-C6-Alkyl oder verzweigtes C3-C6-Alkyl oder Ce-Cio-Aryl stehen,
und R2 = H, CO2H, CO2R6 oder CN ist,
dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Eintopfverfahren durchgeführt wird, Lysinoxidase und Reduktionsmittel nebeneinander vorliegen und
in der Definition von A in der allgemeinen Formel (I) R ein - gegebenenfalls mit linearem Ci-Cβ-Alkyl oder verzweigtem C3-C<5-Alkyl,
Gs-Cio-Aryl, Gt-Cio-Heteroaryl und/oder CO2R substituierter und oder nichtbenachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - bivalenter Co-Ci- oder C5- C 18-Kohlenwasserstoffrest ist und
4 R für einen - gegebenenfalls mit funktioneilen Gruppen wie CO2H und/oder
CO2R substituierten und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltenden - linearen Cι-C2ö-Kohlenwasserstoffrest steht.
Verfahren zur Herstellung von cyclischen sekundären Aminen der allgemeinen Formel (II) aus Diaminen der allgemeinen Formel der allgemeinen Formel (Ia)
(Ia) (II)
wobei R NR oder ein - gegebenenfalls mit CO2H, CO2R , OH, SH und/oder N(R )2 substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S- und oder N-Atome enthaltender - linearer bivalenter C2-C6-Kohlenwasserstoffrest ist, wwoobbeeii RR ffüürr HH ooddeerr lliinneeaarreess CCii--CCöö--AAllkkyyll uunndd P R für lineares Ci-Cö-Alkyl oder verzweigtes C3-C6-Alkyl oder C6-Cιo-Aryl stehen,
und R2 = H, CO2H, CO2R6 oder CN ist,
enthaltend die folgenden Schritte:
a) Oxidation einer der beiden -C-NH2-Gruppen eines Diamins der allgemeinen Formel (Ia) zu einer Carbonylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator; b) Reaktion der zweiten NFb-Gruppe des Diamins der allgemeinen Formel (Ia) mit der gemäß Schritt a) entstandenen Carbonylgruppe unter Cyclisierung zu einem Enamin oder Imin; c) Reduktion des nach b) entstandenen Enamins oder Imins mit einem Reduktionsmittel zu einem cyclischen sekundären Amin der allgemeinen Formel (II);
dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Eintopfverfahren durchgeführt wird und Lysinoxidase und Reduktionsmittel nebeneinander vorliegen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Diamin der allgemeinen Formel (Ia) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Ornithin und 1,6-Diaminohexan.
4. Verfahren zur Herstellung von Diolen der allgemeinen Formel (lila) aus Diaminen der allgemeinen Formel (Ib)
(Ib) (lila)
5 enthaltend die folgenden Schritte:
a) Oxidation der beiden Aminomethylgruppen eines Diamins der allgemeinen Formel (Ib) zu Formylgruppen in Gegenwart einer Lysinoxidase als ° Katalysator; b) Reduktion der nach a) entstandenen Formylgruppen mit einem Reduktionsmittel zu Hydroxymethylgruppen unter Bildung eines Diols der allgemeinen Formel (lila);
5 dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Eintopfverfahren durchgeführt wird, Lysinoxidase und Reduktionsmittel nebeneinander vorliegen, und
3
R ein - gegebenenfalls mit linearem Ci-Cβ-Alkyl oder verzweigtem C3-Cδ-Alkyl, C6-Oö-Aryl, Gi-Cio-Heteroaryl und/oder CO2R substituierter und/oder nicht- 0 benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - bivalenter Co-Ci- oder Cs-
Ci8-Kohlenwasser Stoffrest ist.
5. Verfahren zur Herstellung von primären Alkoholen R -CH2-OH aus Aminen R -CH2-NH2 enthaltend die folgenden Schritte: 5
4 a) Oxidation der Aminomethylgruppe eines Amins R -CH2-NH2 zu einer
Formylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator; b) Reduktion der nach a) entstandenen Formylgruppe mit einem Reduktionsmittel zu einer Hydroxymethylgruppe unter Bildung eines 0 primären Alkohols R4-CH2-OH;
dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Eintopfverfahren durchgeführt wird, Lysinoxidase und Reduktionsmittel nebeneinander vorliegen und R für einen - gegebenenfalls mit funktionellen Gruppen wie CO2H und/oder CO2R substituierten und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltenden - linearen Cι-C20-Kohlenwasserstoffrest steht.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lysinoxidase aus einer Hefe eingesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lysinoxidase aus Pichia pastoris eingesetzt wird.
8. Verwendung einer Lysinoxidase in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
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