EP1381667A1 - Dispositif de culture cellulaire et tissulaire a regulation thermique - Google Patents

Dispositif de culture cellulaire et tissulaire a regulation thermique

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Publication number
EP1381667A1
EP1381667A1 EP02735512A EP02735512A EP1381667A1 EP 1381667 A1 EP1381667 A1 EP 1381667A1 EP 02735512 A EP02735512 A EP 02735512A EP 02735512 A EP02735512 A EP 02735512A EP 1381667 A1 EP1381667 A1 EP 1381667A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fluid
wells
well
culture
pressurization
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02735512A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Farzin Sarem
Leila-Ouassila Sarem Damerdji
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nouvelle Cell Tissue Progress Ste
Original Assignee
Nouvelle Cell Tissue Progress Ste
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nouvelle Cell Tissue Progress Ste filed Critical Nouvelle Cell Tissue Progress Ste
Publication of EP1381667A1 publication Critical patent/EP1381667A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/14—Pressurized fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C12M41/18—Heat exchange systems, e.g. heat jackets or outer envelopes
    • C12M41/22—Heat exchange systems, e.g. heat jackets or outer envelopes in contact with the bioreactor walls

Definitions

  • the invention relates to the field of dynamic culture of cells and tissues using a culture fluid, or nutrient medium set in motion.
  • cell and tissue culture devices comprising i) one or more culture wells which define chambers intended to receive cells or tissues to be cultured, ii) first and second reservoirs which each house at least one pocket flexible, at least one of which can receive a culture fluid, iii) connection means coupled to the well (s) and to the pockets to allow the circulation of the culture fluid from one reservoir to the other via the (s) ) well, and iv) pressurization means making it possible to apply to the pockets of the first and second reservoirs respectively a first and / or a second sequence of external pressures which are defined by one or more control modules and are intended to manage the circulation culture fluid in the well (s).
  • the invention aims to provide an original solution to all or part of the aforementioned drawbacks.
  • a device of the type described in the introduction in which thermal regulation means controlled by the control module are provided and intended to maintain a first chosen temperature, or a first chosen temperature cycle, at inside the well (s) and / or to be placed under a second chosen temperature, or a second chosen temperature cycle, the culture fluid which emerges from at least one of the first and second reservoirs in order to supply the ( s) well.
  • the thermal regulation within the device can be carried out either exclusively at the level of the wells, or exclusively at the level of the culture fluid which feeds these wells, or even simultaneously at the level of the wells and the culture fluid to minimize thermal disturbances. during the exchange between the culture fluid and the cells.
  • the first and second temperatures are chosen according to the type of culture. They (they) can therefore be substantially identical, or different if the culture requires it.
  • the second temperatures (or the second cycles) can also vary from one tank to another if necessary. You can also vary the temperatures (or cycles) during cultivation.
  • the temperature evolution parameters can be programmed, for example by integration into the program setting the external pressure sequences imposed by the control module. Such programming can be carried out using an input interface, or directly by transferring predefined programs into a memory of the device, coupled (or integrated) to the control module, then selection of one of these programs (this memory possibly being rewritable via the aforementioned interface).
  • the thermal regulation means comprise a fluidic heating circuit comprising either a first part integrated in the walls delimiting the well (s) (these may be circulation channels formed at the periphery of the chambers, or of spaces for circulation of fluid provided in the walls of the wells, connected to first connection means), that is to say second and third parts respectively integrated in the walls delimiting the first and second reservoirs and arranged to allow the circulation of a heat transfer fluid (it may be 'spaces provided between an internal shell and an external shell which, once assembled, delimit the first and second tanks), that is to say a combination of the first, second and third parts.
  • a fluidic heating circuit comprising either a first part integrated in the walls delimiting the well (s) (these may be circulation channels formed at the periphery of the chambers, or of spaces for circulation of fluid provided in the walls of the wells, connected to first connection means), that is to say second and third parts respectively integrated in the walls delimiting the first and second reservoirs and arranged to allow the circulation of a heat transfer fluid (it may be
  • the second part of the fluid circuit is preferably arranged to supply heat transfer fluid (liquid or gas) to the first part while the third part is arranged to collect the heat transfer fluid which has circulated in the first part.
  • the second and third parts of the fluidic circuit to comprise second and third connection means opening into the inter-shell space and which can each be connected to the first connection means and to a fourth (main) part of the circuit. fluidics intended for the supply and collection of heat transfer fluid.
  • the fluidic heating circuit preferably comprises a pump coupled to a main container containing part of the heat transfer fluid (liquid or gas) and electrical heating means (such as for example heating resistors) intended to heat the heat transfer fluid in a controlled manner before it supplies the first, second and third parts.
  • the heat transfer fluid liquid or gas
  • electrical heating means such as for example heating resistors
  • the thermal regulation means comprise either first electrical heating elements intended to provide at least part of the controlled heating of the well (these are for example heating resistors placed against , or integrated in, the walls of the wells), or second electric heating elements intended to provide at least part of the controlled heating of the first and second tanks (these are for example heating resistors placed against, or integrated in, the walls of the tanks), i.e. a combination of first and second elements electric heating.
  • thermo regulation means comprise both a fluid circuit (as in the first embodiment) and electric heating elements (as in the second embodiment).
  • the device according to the invention may include additional characteristics taken separately and in combination, and in particular: * the first and second tanks may each include an upper part and a lower part which are connected together by a narrow intermediate part and which each house a flexible pocket, the upper and lower flexible pockets communicating with each other via the intermediate part, the connecting means communicating with the lower pockets, the upper and lower parts each further comprising a sealed inlet.
  • the pressurization means can comprise a fluid pump for supplying high-pressure pressurization fluid, via a first (main) portion of the pressurization circuit, a second portion of the pressurization circuit connected to regulation valves.
  • the first portion of the pressurization circuit to include a sub-portion immersed in the heat transfer fluid (liquid or gas), which is housed in the main container, so as to supply the second portion of the circuit of pressurization in heated pressurizing fluid. This in fact makes it possible to minimize the thermal disturbances of the culture fluid.
  • an auxiliary container housed in the main container in contact with the heat-transfer fluid ("water bath"), containing a humidification fluid and supplied with pressurization fluid by the under- part of the first portion of the pressurization circuit, so as to supply the second portion of the pressurization circuit with a pressurization fluid having a selected degree of humidity.
  • water bath heat-transfer fluid
  • the thermal regulation means can comprise at least one temperature sensor for delivering to the control module measurements representative of the temperature inside a well, or in the immediate vicinity thereof;
  • a cover may be provided to isolate the wells from the outside, as well as possibly the reservoirs, or even the entire device.
  • the invention further relates to a cell and tissue culture installation comprising at least two devices of the type described above, placed in parallel, and comprising a single control unit jointly controlling the control units of these devices, or alternatively grouping together their functionality.
  • This installation may include a main fluid circuit supplying the wells and / or reservoirs of each device in parallel.
  • the main control unit controls the means thermal regulation of each device so that they independently maintain a first chosen temperature, or a first chosen temperature cycle, inside the wells of their device and / or place, independently of each other, under a second chosen temperature, or a second chosen temperature cycle, the culture fluid which emerges from at least one of the first and second reservoirs of their device, to supply its wells.
  • the installation may include a main cover intended to isolate from the outside, simultaneously, the wells of each device, as well as possibly their reservoirs, or even all of the devices.
  • FIG. 1 schematically illustrates, in a partial cross-sectional view, a culture device according to the invention, with several chambers,
  • FIG. 2A and 2B illustrate perspective views of the two internal half-shells of the tanks of Figure 1, respectively before and after assembly
  • - Figure 3 illustrates in a perspective view the two internal half-shells of Figure 2 before their assembly with two external half-shells of the tanks
  • FIGS. 4A and 4B illustrate in perspective views the positioning of an internal half-shell in the corresponding external half-shell, respectively before and after assembly
  • FIG. 5 is a schematic perspective view of a culture installation consisting of four culture devices placed in parallel
  • FIG. 5 is a perspective view of an assembly of four double-shell tanks for an installation of the type of that illustrated in FIG. 5,
  • FIG. 7 schematically illustrates a sequence of eight successive phases of a round trip of the culture fluid in a laminar type circulation mode
  • FIG. 8 schematically illustrates a sequence of four successive phases of a round trip of the culture fluid in a turbulent type of circulation mode
  • FIG. 9 is a variant of the turbulent mode illustrated in FIG. 8.
  • FIGS. 1 to 4 describe a cell and tissue culture device, in one embodiment, without limitation.
  • the device 1 illustrated in FIG. 1 comprises first of all a first tank 2 comprising an upper part 3 coupled to a lower part 4 by an intermediate part 5.
  • This tank 2 is delimited by rigid walls 15 which give it a constant volume and which we will come back to later.
  • the upper part 3 of the reservoir houses an upper flexible pocket 6.
  • the lower part 4 houses a lower flexible pocket 7 which is connected to the upper pocket 6 by a conduit 8 housed in the intermediate part 5 , tightly, so that the upper 3 and lower 4 parts of the first tank 2 are isolated from each other.
  • the upper pocket 6 has an inlet / outlet 9 adapted so as to be able to cooperate, in a sealed manner, with an upper opening 10 formed in one of the partitions of the upper part 3 of the first tank 2.
  • the upper pocket 6 can be connected to upper access control means 11, themselves connected to a gas or culture fluid supply module, or, as illustrated, to a container 14 of nutrient (or culture fluid), preferably pressurized.
  • the nutrient container 14 is placed under the upper part 3 of the tank 2, but it could be placed elsewhere.
  • the lower pocket 7 has an inlet / outlet 12 adapted so as to cooperate with a sealed opening formed in the wall of the lower part 4 of the first tank 2, or else, as illustrated in FIG. 1, so to cooperate with access control means 13, here housed outside the lower part 4 of the tank 2.
  • the lower pocket 7 may comprise two substantially rigid membranes preventing it from being completely crushed when it is subjected to very high pressures. high, which would interfere with the good circulation of the culture fluid.
  • the first reservoir 2 comprises, in the intermediate part 5, another opening allowing the injection, or the extraction, manual or automatic, of a liquid or a gas inside the conduit 8. It will preferably be an opening equipped with a septum, particularly suitable when the injection or extraction device is a syringe fitted with a needle. Preferably, a septum is also provided in each of the upper and lower parts of the tanks.
  • the upper 6 and lower 7 pockets are made of a porous material, at least in the direction going from the outside to the inside. They may be silicone bags, or polydimethylsiloxane (PDSM), or even polytetrafluorethylene (PTFE), or even polymers dimethyl and methylvinyl siloxanes. This allows, in fact, gas exchange between the culture fluid which is housed inside the flexible bags and the gas which is trapped inside the upper 3 and lower 4 parts of the first tank 2.
  • These pockets can be made of different materials so as to ensure different functionalities, especially in terms of exchanges with the fluid (generally the pressurization gas (es) on which we will return later) which is contained inside the tanks.
  • the pockets of the same tank can have different shapes and volumes.
  • the lower pocket 7 communicates with culture wells 18-1 to 18-3, via the access control means 13 and the lower opening formed in the wall of the tank.
  • the access control means 13 are preferably of the so-called “pinch” type. They have a hollow end into which is introduced one end of a connecting means 20, produced in the form of a conduit (or tube), and the opposite end of which opens into the culture chamber 19-1 of the first well. 18-1.
  • This first culture chamber 19-1 communicates with the second culture chamber 19-1 housed in the second well 18-2 via another connecting means 21, also produced in the form of a conduit (or tube).
  • the second culture chamber 19-2 communicates with the third culture chamber 19-3 housed in the third well 18-3 by means of another connecting means 21 produced in the form of a conduit ( or tube).
  • a last connecting means 20 ensures communication between the third culture chamber 19-3 and a second tank 25, which will now be described.
  • This second tank 25 is preferably substantially identical to the first tank 2 which has been described previously with reference to FIGS. 1 to 4. It therefore comprises, in this example, an upper part 26 in which is housed a flexible pocket upper 27, a lower part 28 in which is housed a lower flexible pocket 29 and a narrow intermediate portion 23 which houses an intermediate duct 24 coupling the upper pocket 27 to the lower pocket 29.
  • This duct 24 is also housed, narrowly , in the intermediate part 23, so that the upper part 26 is isolated, on the plane gas tightness, lower part 28.
  • the upper pocket 27 has a suitable inlet / outlet 30, connected to access control means 31, which, like the access control means 11, can be connected to a fluid or gas supply device 32 , or to an extractor.
  • the lower pocket 29 has an inlet / outlet 33 which, in the example illustrated, is connected to access control means 34, housed here, outside the lower part 28 of the second tank 25 .
  • the second reservoir 25 also comprises, in its upper 26, intermediate 23 and lower 28, openings allowing injection, or extraction, manual or automatic, of a liquid or a gas at the inside the pockets or the intermediate duct 31. It will preferably be openings equipped with a septum.
  • the access control means 34 are also preferably of the so-called "pinch-on" type, and therefore have a hollow end to which the end of the connecting duct 20 is connected.
  • the device includes thermal regulation means intended to ensure temperature regulation either inside the culture well (s), or of the culture fluid which feeds the wells, or again, and preferably, in the wells and at the level of the culture fluid, as illustrated in FIGS. 1 to 4.
  • the temperature of the culture fluid is regulated at the level of the two reservoirs 2 and 25, by circulation of a heat transfer fluid (liquid or gas) in their rigid walls 15. More specifically, the walls 15 which delimit the upper and lower parts of the tanks 2 and 25 comprise spaces 35 for fluid circulation, integrated, which constitute a part of a fluidic heating circuit. It is advantageous, as illustrated in FIGS. 2 to 4, that this circulation space 35 is delimited by the assembly of an internal shell 16 and an external shell 17 housing the internal shell 16.
  • the internal shell 16 is preferably formed by assembling two half-shells 16a and 16b which delimit the upper, intermediate and lower internal parts of each tank 2 and 25.
  • the external shell 17 is also preferably constituted by assembling two half-shells shells 17a and 17b which comprise first immobilization means 36 (here orifices) intended to cooperate with second immobilization means 37 (here studs) formed on the external surface of the internal shell 16. It further comprises, in its upper part, an inlet 42 equipped with a first connector 43 (suitable for being connected to the main "external" part of the fluidic heating circuit, and, in its lower part, an outlet 44 provided with a second connector 45 suitable for being connected to a third or fourth connector 46 equipping the end wells 18-1 and 18-3.
  • the heat transfer fluid can circulate inside the p arois 15 of reservoirs 2 and 25 and ensure effective thermal regulation of the culture fluid which circulates in the pockets.
  • channels 47 are provided forming another part of the heating fluid circuit.
  • the channels 47 are formed by recess of said block 48, at the periphery of the zones delimiting the wells and, if possible, also below.
  • the latter may include channels 47 intended to allow the circulation of part of the heat transfer fluid under the wells 18.
  • the channels 47 are connected on one side to the third connector 46 intended to be connected to the second connector 45 of the first tank 2 and on the side opposite to the fourth connector 46 intended to be connected to the first connector 43 of the second reservoir 25.
  • the heat transfer fluid circulates in the main part of the fluidic heating circuit and thus reaches the walls 15 of the first tank 2 through its first connector 43, circulates in the intercoques space 35, then arrives at its second connector 45. It penetrates then in the channels 47 of the wells 18 by the third connector 46 and arrives at their fourth connector 46. It then enters the walls of the second reservoir 25 by its second connector 45, circulates in the inter-shell space, then reaches at its first connector 43 from which it returns to the main part of the fluidic heating circuit.
  • the main part of the fluid circuit firstly comprises a main container 49 in which is housed part of the heat transfer fluid and comprising electric heating means 51, for example adjustable heating resistors, an inlet 52 connected via a conduit 53 to the first connector 43 of the second reservoir 25, and an outlet 54 connected to a pump (not shown) which supplies via another conduit 55 the first connector 43 of the first reservoir 2.
  • This other conduit 55 is preferably equipped with two solenoid valves (or pneumatic valves) for regulation 56 and 57 mounted in parallel and with a pressure sensor 58 (or pressure switch).
  • the temperature of the heat transfer fluid in the main container 49 is chosen so as to ensure that the culture fluid, at the outlet 12 of the lower pocket 7 housed in the first tank 2, a temperature suitable for cultivation.
  • the temperature inside the wells can be different from, or substantially identical to, that of the culture fluid leaving the first tank, as required.
  • the two tanks 2 and 25 and the wells 18 can be supplied in parallel by the same heat transfer fluid or by heat transfer fluids from two or three independent heating fluid circuits. It is also possible to provide a fluid heating circuit for each part of the tank. It is thus possible to provide reservoirs containing culture media placed at different temperatures, on either side of the culture chamber, so as to create temperature profiles or temperature cycles.
  • the reserves (or nutrient container) 14 and / or the fluid or gas supply devices (or the waste tanks) 32 can also have their own thermostat control circuits so as to maintain their respective contents at selected temperatures, possibly different. Thermostatization may consist of heating as well as cooling. It is generally preferable to keep them at temperatures between about 3 ° C and about 12 ° C to ensure stability of the culture medium.
  • the temperature regulation means comprise electric heating means, such as heating resistors or PTC elements.
  • Such means can be placed in selected locations on, or in, the walls which delimit the reservoirs and / or the wells.
  • the power of the electrical heating means and / or the flow of heat transfer fluid are controlled by a control unit 50, so as to manage the temperature of the heat transfer fluid.
  • one (or more) selected location (s) may be provided with one (or more) temperature sensor (s). delivering measurements to the control unit.
  • the device according to the invention comprises pressurization means which will now be described with reference to FIG. 1.
  • pressurization means common to the two reservoirs 2 and 25 are used, housed in an external housing 105 (such as that shown in dotted lines in FIG. 1), together with most of the thermal regulation means. .
  • each tank could have its own pressurization means housed in boxes placed, for example, below the upper parts of the tanks.
  • the pressurization means comprise a pressurization circuit 59, high pressure, comprising a booster (or pump) 60, supplied with ambient air 61 and supplying a pressurized reserve 62, preferably coupled to a pressure sensor (or pressure switch) 63
  • the reserve 62 feeds a main conduit 64 equipped with a pressure regulator 65, then with a first flow regulator 66 and a particle filter 67 (for example a grid of 0.01 microns).
  • an auxiliary conduit 68 is provided supplied with auxiliary fluid (s) 69 (for example carbon dioxide ), comprising a second pressure regulator 70 followed by a second flow regulator 71, and supplying the main conduit 64 between the first flow regulator 65 and the filter 67.
  • auxiliary fluid (s) 69 for example carbon dioxide
  • the main conduit 64 is intended to supply pressurized fluid to the two reservoirs 2 and 25, as well as the culture fluid container 14. In order to minimize the thermal disturbances that the pressurizing fluid could induce, when it enters the upper and lower parts of the tanks 2 and 25, it is heated using the heat transfer fluid which is housed in the main container 49. To do this, a part 73 of the main duct 64 is housed in the main container 49, preferably having a “serpentine” shape there, or any other shape favoring heat exchanges.
  • an auxiliary container 74 partially filled with a liquid. humidification, and into which opens the part 73 of the main conduit which is immersed in the heat transfer fluid.
  • the part 75 of the main conduit 65 which opens out from the auxiliary container 74 supplies, preferably via a thermo-hygrometer 76, on the one hand, a first high pressure channel 77 (for example of about 45 mbar) which is equipped with four valves 78, 79, 80 and 81 mounted in parallel, on the second hand, a second high pressure channel 82 (for example around 45 mbar) which opens into the culture fluid container 14, on the third hand, a third low pressure channel 83 (for example around 10 mbar) which is equipped with four valves 84, 85, 86 and 87 mounted in parallel as well as, preferably, a fourth flow regulator 88 placed upstream of the valves , and on the other hand, a fourth channel 89 of intermediate pressure (for example around 30 mbar) which is preferably equipped with a fifth flow regulator 90, followed by a solenoid valve (or pneumatic valve) 91 and of a pressurized reserve 92, and supplies pa the four valves 78, 79, 80 and 81
  • the different solenoid valves are all of the three-way type (two inputs and one output), the outputs of the solenoid valves (or pneumatic valves) 78- 81 respectively supplying one of the inputs of the solenoid valves (or pneumatic valves) 84 -87, the outputs of which supply respectively, via connectors 93-96 connected to the connectors 39, 41 installed at the level of the watertight inputs 38, 40, the interior of the upper 3 and lower 4 parts of the first tank 2 and the interior of the parts upper 26 and lower 28 of the second reservoir 25, so as to manage the volumes of the flexible pockets that they house.
  • solenoid valves or pneumatic valves
  • These solenoid valves can also be used to manage the state of the access control means 11, 13, 31 and 34 of the wells 18 and flexible bags, which, as mentioned previously, are preferably of the type known as " pinch ”and are for example described in the document FR 0000548. But this is only one example of embodiment among others, switches or valves that can also be used.
  • All the solenoid valves and the pressurizing fluid pump are controlled by the electronic control unit 50 which for this purpose comprises microprocessors (or a microcontroller) mounted on a card which is preferably connected to a link interface 97 (for example RS232 type) to allow remote control by a processing computer.
  • the electronic control unit 50 which for this purpose comprises microprocessors (or a microcontroller) mounted on a card which is preferably connected to a link interface 97 (for example RS232 type) to allow remote control by a processing computer.
  • the microcontroller 50 once programmed, controls the solenoid valves (or pneumatic valves) so that are applied to the bags, using the pressurizing fluid, sequences of low and / or high pressures, as required, in the upper 3 and lower 4 parts of reservoirs 2 and 25.
  • the microcontroller 50 may include a memory 98, preferably rewritable, in which a multiplicity of culture programs is stored, each program defining first and second pressure sequences for manage the respective volumes of the various flexible bags, as well as the temperatures regulation of wells and / or heat transfer fluid.
  • this same microcontroller could be used to manage two at least partially independent pressurization circuits, for example installed under the upper parts of the tanks.
  • the device comprises a cover intended to isolate the well (s), as well as possibly the reservoirs, from the external environment.
  • This not only makes it possible to avoid exchanges occurring at the level of the different septa, but also to limit thermal disturbances.
  • This also makes it possible to install a “mechanical” protective barrier around the wells.
  • the cover can also encompass the entire device by forming a kind of enclosure defining a biological barrier, useful in particular when said device is no longer placed under a laminar flow hood.
  • the shape of the cover and the material in which it is made can be chosen so as to allow observation under a microscope, or any other suitable optical means, of the cells and tissues contained in the wells, during culture.
  • the cover is preferably made of an unbreakable material, transparent at the level of the wells.
  • an outlet for atmospheric pressure can be provided at the upper and lower parts of each tank 2, equipped with a solenoid valve (or pneumatic valve) 99-102 controlled by the control unit 50.
  • the inlet 9, 30 of the upper flexible pockets 6, 27 is preferably placed in a rigid duct 103 delimited by the rigid walls of the internal half-shells 16a and 16b and provided with '' an upper cavity 104 equipped with purging means (not shown) so as to evacuate any micro-bubbles of air which could form during operation in the flexible pockets of tanks 2 and 25.
  • the device according to the invention can be considered as a control unit coupled to elements of the "consumable" type (tanks and / or wells), possibly for single use. Indeed, it suffices to do this, on the one hand, the external control, pressurization and regulation unit 105 with first 93-96 and second 106 connection means connected respectively to the pressurization and thermal regulation circuits, and d on the other hand, the two tanks 2 and 25 of each third device 39, 41 and fourth 43 connection means respectively connected to the upper and lower internal parts of the tanks and to the inter-shell space 35, then to connect the first means of connection 93-96 to the third connection means 39, 41 and the second connection means 106 to the fourth connection means 43.
  • FIGS. 5 and 6 it is possible to arrange in parallel a multiplicity of devices 1, so as to constitute an installation for the cultivation of cells and tissues, ie at high yield (in the case of identical cultures) , or with high differentiation (case of different cultures).
  • the reservoirs with circulation space for heat-transfer fluid are assembled to one another, for example by fitting studs 37 of the internal half-shells 16b into suitable housings 108 formed on the external half-shells 17a and 17b (see FIG. 6).
  • These devices can be completely independent of each other.
  • they can include either a control unit municipality which controls independent pressurization and thermal regulation circuits, that is to say independent control units which each control a pressurization circuit and a thermal regulation circuit.
  • the regulation temperatures and / or the pressurizing fluids can vary from one device to another.
  • these devices can also be dependent on each other due to communications between some of their wells.
  • the external control, pressurization and regulation unit 105 with first 93-96 and second 106 connection means connected respectively to the pressurization and thermal regulation circuits, and d on the other hand, the two tanks 2 and 25 of each third device 39, 41 and fourth 43 connection means respectively connected to the upper and lower internal parts of the tanks and to the inter-shell space 35, then to connect the first connection means 93-96 to the third connection means 39, 41 and the second connection means 106 to the fourth connection means 43.
  • the number of devices assembled in parallel may vary as required.
  • the culture wells 18-j can be mounted in series on a support plate 107, as illustrated in FIG. 5, or else directly formed by recess d '' a thick solid block 48 (as illustrated in the figure
  • This support plate 107 may also include channels or conduits intended for the circulation of part of the pressurizing fluid.
  • the culture wells of the devices can be produced in independent solid blocks, or else in a single block. Details on embodiments of wells, which can be used in a device according to the invention, are given in the document FR 0000548.
  • a “laminar” mode consists in raising the culture fluid into the upper pocket of one of the two reservoirs so as to introduce a height difference between this upper pocket and the pockets lower of the two tanks, then to let flow, by gravity, the culture fluid from the upper tank to the lower tanks, and to make the culture fluid rise to the upper pocket of the other tank.
  • return direction the same operations to make a cycle (or "round trip") between the two tanks, via the well.
  • the number of cycles is chosen according to the type of culture carried out inside the wells 18.
  • the four stages of a round-trip cycle of the laminar mode are grouped in FIG. 7.
  • the number of successive cycles is chosen according to the type of culture carried out.
  • a “turbulent” mode consists in applying a high pressure permanently to the lower pockets 7 and 29 of the first 2 and second 25 tanks.
  • the first and second upper sequences of the upper pockets of the first and second reservoirs consist of a succession of four periods of low pressure.
  • This mode comprises only two stages which are grouped together in the form of a “round trip” cycle in FIG. 8. The number of successive cycles is chosen according to the type of culture carried out.
  • This mode can be the subject, in particular, of a first variant (FIG. 9) in which the high pressure is no longer constantly maintained on the two lower pockets 7 and 29, but on the two upper pockets 6 and 27.
  • the first sequence applied to each pocket of the first tank consists of alternating first periods of high pressure and second periods of low pressure
  • the second sequence applied to each pocket of the second tank consists of alternating first periods of low pressure and second periods of high pressure.
  • the invention applies to very many types of cells and tissues, such as in particular:
  • - intestinal cells Intestine 407, Caco-2, Colo 205, T84, SW 1116, WiDr, HT 29, HT 115, HT 55;
  • HAOSMC from the acronym Human Aortic Smooth Muscle Cells
  • NHEK-Neopooled Human Epidermal
  • - cancer cells HeLa, CHO-K1;
  • thermo regulation circuit in which a heat transfer fluid circulates intended to supply calories with a view to heating.
  • auxiliary thermal regulation circuit in which a coolant fluid circulates intended to provide frigories with a view to cooling certain environments, such as for example reserves.
  • the device according to the invention must be equipped with means for cooling controlled by the control module.
  • the thermal regulation means can be arranged so as to induce a thermal shock inside the chamber and / or the wells. This can be particularly advantageous when it is necessary to modify the state of cell membranes. This thermal shock can be combined with a pressure variation by controlling the flow rate of the fluid and / or the internal pressure of the chamber.

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Abstract

Un dispositif de culture de cellules et tissus comprend au moins un puits de culture (18-i), de premier (2) et second (25) réservoirs logeant chacun au moins une poche souple (6,7; 27, 29) dont l'une au moins peut recevoir un fluide de culture, des moyens de liaison (20, 21) couplés au puits et aux poches pour la circulation du fluide de culture d'un réservoir à l'autre via le puits, des moyens de pressurisation (60-92) pour appliquer aux poches des premier (2) et second (25) réservoirs respectivement une première et/ou une seconde séquences de pressions externes définies par un module de commande (50) et destinées à gérer la circulation du fluide de culture dans le puits, et des moyens de régulation thermique (49, 51-58) pilotés par le module de commande et agencés pour maintenir une première température choisie à l'intérieur du puits et placer sous une seconde température choisie le fluide de culture qui débouche des premier et second réservoirs pour alimenter le puits.

Description

DISPOSITIF DE CULTURE CELLULAIRE ET TISSULAIRE A REGULATION THERMIQUE
L'invention concerne le domaine de la culture dynamique de cellules et de tissus à l'aide d'un fluide de culture, ou milieu nutritif mis en mouvement.
Elle concerne plus précisément les dispositifs de culture de cellules et tissus comprenant i) un ou plusieurs puits de culture qui définissent des chambres destinées à recevoir des cellules ou des tissus à cultiver, ii) des premier et second réservoirs qui logent chacun au moins une poche souple, dont l'une au moins peut recevoir un fluide de culture, iii) des moyens de liaison couplés au(x) puits et aux poches pour permettre la circulation du fluide de culture d'un réservoir à l'autre via le(s) puits, et iv) des moyens de pressurisation permettant d'appliquer aux poches des premier et second réservoirs respectivement une première et/ou une seconde séquences de pressions externes qui sont définies par un ou plusieurs modules de commande et sont destinées à gérer la circulation du fluide de culture dans le(s) puits.
Ce type de dispositif, qui est décrit dans la demande de brevet FR 0000548, permet de maintenir des conditions de circulation adéquates pendant toute la durée de la culture. Cependant, lorsque la culture requiert un environnement thermiquement contrôlé, les dispositifs de ce type doivent être placés à l'intérieur d'un incubateur adapté, ce qui augmente les risques biologiques liés aux déplacements, les coûts, les manipulations, l'encombrement, et interdit l'observation de l'évolution de la culture à l'aide d'un microscope pendant l'incubation. De plus, les transferts entraînent des ruptures thermiques qui peuvent engendrer des conséquences biologiques néfastes.
L'invention a pour but d'apporter une solution originale à tout ou partie des inconvénients précités. Elle propose à cet effet un dispositif du type décrit dans l'introduction, dans lequel on prévoit des moyens de régulation thermique pilotés par le module de commande et destinés à maintenir une première température choisie, ou un premier cycle de température choisi, à l'intérieur du (ou des) puits et/ou à placer sous une seconde température choisie, ou un second cycle de température choisi, le fluide de culture qui débouche de l'un au moins des premier et second réservoirs en vue d'alimenter le(s) puits. Ainsi, la régulation thermique au sein du dispositif peut s'effectuer soit exclusivement au niveau des puits, soit exclusivement au niveau du fluide de culture qui alimente ces puits, soit encore simultanément au niveau des puits et du fluide de culture pour minimiser les perturbations thermiques lors de l'échange entre le fluide de culture et les cellules.
Les première et seconde températures (ou les premier et second cycles de température) sont choisi(e)s en fonction du type de culture. Elles (ils) peuvent donc être sensiblement identiques, ou bien différentes si la culture le requiert. Les secondes températures (ou les seconds cycles) peuvent également varier d'un réservoir à l'autre si cela s'avère nécessaire. On peut également faire varier les températures (ou les cycles) en cours de culture. Pour ce faire, les paramètres d'évolution des températures peuvent être programmés, par exemple par intégration dans le programme fixant les séquences de pressions externes imposées par le module de commande. Une telle programmation peut s'effectuer à l'aide d'une interface de saisie, ou bien directement par transfert de programmes prédéfinis dans une mémoire du dispositif, couplée (ou intégrée) au module de commande, puis sélection de l'un de ces programmes (cette mémoire étant éventuellement réinscriptible par l'intermédiaire de l'interface précitée).
Dans un premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention, les moyens de régulation thermique comprennent un circuit fluidique de chauffage comportant soit une première partie intégrée dans les parois délimitant le(s) puits (il pourra s'agir de canaux de circulation formés à la périphérie des chambres, ou d'espaces de circulation de fluide ménagés dans les parois des puits, raccordés à des premiers moyens de connexion), soit des seconde et troisième parties respectivement intégrées dans les parois délimitant les premier et second réservoirs et agencées pour permettre la circulation d'un fluide caloporteur (il pourra s'agir d'espaces ménagés entre une coque interne et une coque externe qui, une fois assemblées, délimitent les premier et second réservoirs), soit encore une combinaison des première, seconde et troisième parties. Dans ce dernier cas, la seconde partie du circuit fluidique est préférentiellement agencée pour alimenter en fluide caloporteur (liquide ou gaz) la première partie tandis que la troisième partie est agencée pour collecter le fluide caloporteur qui a circulé dans la première partie. Il est alors particulièrement avantageux que les seconde et troisième parties du circuit fluidique comprennent des seconds et troisièmes moyens de connexion débouchant dans l'espace inter-coques et pouvant être chacun raccordés aux premiers moyens de connexion et à une quatrième partie (principale) du circuit fluidique destinée à l'alimentation et la collection de fluide caloporteur.
Dans ce premier mode de réalisation, le circuit fluidique de chauffage comporte de préférence une pompe couplée à un conteneur principal contenant une partie du fluide caloporteur (liquide ou gaz) et des moyens de chauffage électrique (comme par exemple des résistances chauffantes) destinées à chauffer le fluide caloporteur de façon contrôlée avant qu'il n'alimente les première, seconde et troisième parties.
Dans un second mode de réalisation du dispositif selon l'invention, les moyens de régulation thermique comprennent soit des premiers éléments de chauffage électrique destinés à assurer une partie au moins du chauffage contrôlé du puits (il s'agit par exemple de résistances chauffantes placées contre, ou intégrées dans, les parois des puits), soit des seconds éléments de chauffage électrique destinés à assurer une partie au moins du chauffage contrôlé des premier et second réservoirs (il s'agit par exemple de résistances chauffantes placées contre, ou intégrées dans, les parois des réservoirs), soit encore une combinaison de premiers et seconds éléments de chauffage électrique.
Bien entendu, on peut envisager un troisième mode de réalisation du dispositif selon l'invention, dans lequel les moyens de régulation thermique comprennent à la fois un circuit fluidique (comme dans le premier mode de réalisation) et des éléments de chauffage électrique (comme dans le second mode de réalisation).
Le dispositif selon l'invention peut comporter des caractéristiques additionnelles prises séparément et en combinaison, et notamment : * les premier et second réservoirs peuvent comprendre chacun une partie supérieure et une partie inférieure qui sont reliées entre elles par une partie intermédiaire étroite et qui logent chacune une poche souple, les poches souples supérieure et inférieure communiquant entre elles via la partie intermédiaire, les moyens de liaison communiquant avec les poches inférieures, les parties supérieure et inférieure comportant en outre chacune une entrée étanche. Dans le même temps, les moyens de pressurisation peuvent comprendre une pompe à fluide pour alimenter en fluide de pressurisation haute pression, via une première portion (principale) de circuit de pressurisation, une seconde portion de circuit de pressurisation raccordée à des vannes de régulation de pression, supérieures et inférieures, pilotées par le module de commande et destinées à alimenter chaque partie supérieure et inférieure de réservoir, via les entrées étanches, en fluide de pressurisation haute pression ou basse pression ou encore pression intermédiaire. Dans ce cas, il est particulièrement avantageux que la première portion de circuit de pressurisation comprenne une sous-partie immergée dans le fluide caloporteur (liquide ou gaz), qui se trouve logé dans le conteneur principal, de manière à alimenter la seconde portion de circuit de pressurisation en fluide de pressurisation réchauffé. Cela permet en effet de minimiser les perturbations thermiques du fluide de culture. Par ailleurs, on peut également prévoir un conteneur auxiliaire, logé dans le conteneur principal au contact du fluide caloporteur (« bain-marie »), contenant un fluide d'humidification et alimenté en fluide de pressurisation par la sous- partie de la première portion de circuit de pressurisation, de manière à alimenter la seconde portion de circuit de pressurisation avec un fluide de pressurisation présentant un degré d'humidité choisi. Cela est notamment important lorsque les poches souples sont semi-perméables ; * au moins deux puits, et de préférence trois, ou quatre, peuvent être placés en série et communiquer entre eux par des moyens de liaison, un premier puits étant raccordé au premier réservoir tandis qu'un puits opposé au premier est raccordé au second réservoir ;
* les moyens de régulation thermique peuvent comprendre au moins un capteur de température pour délivrer au module de commande des mesures représentatives de la température à l'intérieur d'un puits, ou au voisinage immédiat de celui-ci ;
* un capot peut être prévu pour isoler de l'extérieur les puits, ainsi qu'éventuellement les réservoirs, voire même l'intégralité du dispositif. L'invention concerne en outre une installation de culture de cellules et tissus comprenant au moins deux dispositifs du type décrit ci-avant, placés en parallèle, et comportant une unique unité de commande pilotant conjointement les unités de commande de ces dispositifs, ou bien regroupant leurs fonctionnalités. Cette installation peut comporter un circuit fluidique principal alimentant en parallèle les puits et/ou réservoirs de chaque dispositif. Dans ce cas, il est particulièrement avantageux de prévoir des moyens de régulation thermique centrale pilotés par l'unité de commande principale et destinés à maintenir une même première température choisie, ou un même premier cycle de température choisi, à l'intérieur des puits de chaque dispositif et/ou à placer sous une même seconde température choisie, ou un même second cycle de température choisi, le fluide de culture qui débouche de l'un au moins desdits premier et second réservoirs de chaque dispositif pour alimenter ses puits. Dans une variante, l'unité de commande principale pilote les moyens de régulation thermique de chaque dispositif de sorte qu'ils maintiennent indépendamment les uns des autres une première température choisie, ou un premier cycle de température choisi, à l'intérieur des puits de leur dispositif et/ou placent, indépendamment les uns des autres, sous une seconde température choisie, ou un second cycle de température choisi, le fluide de culture qui débouche de l'un au moins des premier et second réservoirs de leur dispositif, pour alimenter ses puits.
Par ailleurs, l'installation peut comporter un capot principal destiné à isoler de l'extérieur, simultanément, les puits de chaque dispositif, ainsi qu'éventuellement leurs réservoirs, voire même l'intégralité des dispositifs.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à l'examen de la description détaillée ci-après, et des dessins annexés, sur lesquels :
- la figure 1 illustre de façon schématique, dans une vue en coupe transversale, partielle, un dispositif de culture selon l'invention, à plusieurs chambres,
- les figures 2A et 2B illustrent des vues en perspective des deux demi- coques internes des réservoirs de la figure 1 , respectivement avant et après assemblage, - la figure 3 illustre dans une vue en perspective les deux demi-coques internes de la figure 2 avant leur assemblage avec deux demi-coques externes des réservoirs,
- les figures 4A et 4B illustrent dans des vues en perspective le positionnement d'une demi-coque interne dans la demi-coque externe correspondante, respectivement avant et après assemblage,
- la figure 5 est une vue schématique en perspective d'une installation de culture constituée de quatre dispositifs de culture placés en parallèle,
- la figure 6 est une vue en perspective d'un assemblage de quatre réservoirs à double coque pour une installation du type de celle illustrée sur la figure 5,
- la figure 7 illustre schématiquement un enchaînement de huit phases successives d'un aller-retour du fluide de culture dans un mode de circulation de type laminaire, - la figure 8 illustre schématiquement un enchaînement de quatre phases successives d'un aller-retour du fluide de culture dans un mode de circulation de type turbulent, et
- la figure 9 est une variante du mode turbulent illustré sur la figure 8.
Les dessins annexés sont, pour l'essentiel, de caractère certain. En conséquence, ils pourront non seulement servir à compléter l'invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.
On se réfère tout d'abord aux figures 1 à 4 pour décrire un dispositif de culture de cellules et tissus, dans un mode de réalisation, non limitatif.
Le dispositif 1 illustré sur la figure 1 comprend tout d'abord un premier réservoir 2 comportant une partie supérieure 3 couplée à une partie inférieure 4 par une partie intermédiaire 5. Ce réservoir 2 est délimité par des parois rigides 15 qui lui confèrent un volume constant et sur lesquelles on reviendra plus loin.
Dans l'exemple illustré, la partie supérieure 3 du réservoir loge une poche souple supérieure 6. De même, la partie inférieure 4 loge une poche souple inférieure 7 qui est raccordée à la poche supérieure 6 par un conduit 8 logé dans la partie intermédiaire 5, étroitement, de sorte que les parties supérieure 3 et inférieure 4 du premier réservoir 2 soient isolées l'une de l'autre. La poche supérieure 6 comporte une entrée/sortie 9 adaptée de manière à pouvoir coopérer, de façon étanche, avec une ouverture supérieure 10 formée dans l'une des cloisons de la partie supérieure 3 du premier réservoir 2. Ainsi, la poche supérieure 6 peut être raccordée à des moyens de contrôle d'accès supérieurs 11 , eux-mêmes raccordés à un module d'alimentation en gaz ou en fluide de culture, ou, comme illustré, à un conteneur 14 de nutriment (ou fluide de culture), de préférence pressurisé. Pour des raisons de compacité, le conteneur de nutriment 14 est placé sous la partie supérieure 3 du réservoir 2, mais il pourrait être placé ailleurs. De même, la poche inférieure 7 comporte une entrée/sortie 12 adaptée de manière à coopérer avec une ouverture étanche formée dans la paroi de la partie inférieure 4 du premier réservoir 2, ou bien, comme cela est illustré sur la figure 1 , de manière à coopérer avec des moyens de contrôle d'accès 13, ici logés à l'extérieur de la partie inférieure 4 du réservoir 2. La poche inférieure 7 peut comporter deux membranes sensiblement rigides évitant son écrasement complet lorsqu'elle est soumise à des pressions très élevées, ce qui nuirait à la bonne circulation du fluide de culture.
Egalement de préférence, le premier réservoir 2 comporte, dans la partie intermédiaire 5, une autre ouverture permettant l'injection, ou l'extraction, manuelle ou automatique, d'un liquide ou d'un gaz à l'intérieur du conduit 8. Il s'agira, de préférence, d'une ouverture équipée d'un septum, particulièrement approprié lorsque le dispositif d'injection ou d'extraction est une seringue munie d'une aiguille. On prévoit également, de préférence, un septum dans chacune des parties supérieure et inférieure des réservoirs.
Egalement de préférence, les poches supérieure 6 et inférieure 7 sont réalisées dans un matériau poreux, au moins dans le sens allant de l'extérieur vers l'intérieur. Il pourra s'agir de poches en silicone, ou en polydimethylsiloxane (PDSM), ou encore en polytetrafluorethylène (PTFE), ou encore en polymères dimethyl et methylvinyl siloxanes. Cela permet, en effet, des échanges gazeux entre le fluide de culture qui se trouve logé à l'intérieur des poches souples et le gaz qui se trouve piégé à l'intérieur des parties supérieure 3 et inférieure 4 du premier réservoir 2. Ces poches peuvent être réalisées dans des matériaux différents de manière à assurer des fonctionnalités différentes, notamment au niveau des échanges avec le fluide (généralement le(s) gaz de pressurisation sur le(s)quel(s) on reviendra plus loin) qui se trouve contenu à l'intérieur des réservoirs. En outre, les poches d'un même réservoir peuvent présenter des formes et volumes différents. Dans l'exemple illustré sur la figure 1 , la poche inférieure 7 communique avec des puits de culture 18-1 à 18-3, via les moyens de contrôle d'accès 13 et l'ouverture inférieure formée dans la paroi du réservoir.
Les moyens de contrôle d'accès 13 sont de préférence du type dit « à pincement ». Elles comportent une extrémité creuse dans laquelle est introduite une extrémité d'un moyen de liaison 20, réalisé sous la forme d'un conduit (ou tube), et dont l'extrémité opposée débouche dans la chambre de culture 19-1 du premier puits 18-1. Cette première chambre de culture 19-1 communique avec la seconde chambre de culture 19-1 logée dans le second puits 18-2 par l'intermédiaire d'un autre moyen de liaison 21 , également réalisé sous la forme d'un conduit (ou tube). De même, la seconde chambre de culture 19-2 communique avec la troisième chambre de culture 19-3 logée dans le troisième puits 18-3 par l'intermédiaire d'un autre moyen de liaison 21 réalisé sous la forme d'un conduit (ou tube). Enfin, dans cet exemple, un dernier moyen de liaison 20 assure la communication entre la troisième chambre de culture 19-3 et un second réservoir 25, qui va être décrit maintenant.
Ce second réservoir 25 est, de préférence, sensiblement identique au premier réservoir 2 qui a été décrit précédemment en référence aux figures 1 à 4. Il comporte, par conséquent, dans cet exemple, une partie supérieure 26 dans laquelle se trouve logée une poche souple supérieure 27, une partie inférieure 28 dans laquelle se trouve logée une poche souple inférieure 29 et une partie intermédiaire 23 étroite qui loge un conduit intermédiaire 24 couplant la poche supérieure 27 à la poche inférieure 29. Ce conduit 24 est également logé, de façon étroite, dans la partie intermédiaire 23, de sorte que la partie supérieure 26 soit isolée, sur le plan de l'étanchéité au gaz, de la partie inférieure 28.
La poche supérieure 27 comporte une entrée/sortie 30 adaptée, raccordée à des moyens de contrôle d'accès 31 , lesquels, tout comme les moyens de contrôle d'accès 11 , peuvent être raccordés à un dispositif d'alimentation en fluide ou gaz 32, ou à un extracteur. De même, la poche inférieure 29 comporte une entrée/sortie 33 qui, dans l'exemple illustré, est raccordée à des moyens de contrôle d'accès 34, logés, ici, à l'extérieur de la partie inférieure 28 du second réservoir 25.
De préférence, le second réservoir 25 comporte également, dans ses parties supérieure 26, intermédiaire 23 et inférieure 28, des ouvertures permettant l'injection, ou l'extraction, manuelle ou automatique, d'un liquide ou d'un gaz à l'intérieur des poches ou du conduit intermédiaire 31. Il s'agira, de préférence, d'ouvertures équipées d'un septum.
Dans cet exemple, les moyens de contrôle d'accès 34 sont également, de préférence, du type dit « à pincement », et comportent de ce fait une extrémité creuse à laquelle est raccordée l'extrémité du conduit de liaison 20.
Un circuit est ainsi créé entre la poche supérieure 6 du premier réservoir 2 et la poche supérieure 27 du second réservoir 25, via les chambres de culture 19-i (i = 1 à 3, dans cet exemple) et via les moyens de liaison 20 et 21.
Afin de permettre une culture contrôlée thermiquement, le dispositif comporte des moyens de régulation thermique destinés à assurer une régulation de température soit à l'intérieur du (ou des) puits de culture, soit du fluide de culture qui alimente les puits, soit encore, et de façon préférentielle, dans les puits et au niveau du fluide de culture, comme illustré sur les figures 1 à 4.
Dans le mode de réalisation illustré sur ces figures, la régulation de la température du fluide de culture s'effectue au niveau des deux réservoirs 2 et 25, par circulation d'un fluide caloporteur (liquide ou gaz) dans leurs parois rigides 15. Plus précisément, les parois 15 qui délimitent les parties supérieure et inférieure des réservoirs 2 et 25 comprennent des espaces 35 de circulation de fluide, intégrés, qui constituent une partie d'un circuit fluidique de chauffage. Il est avantageux, comme illustré sur les figures 2 à 4 que cet espace de circulation 35 soit délimité par l'assemblage d'une coque interne 16 et d'une coque externe 17 logeant la coque interne 16.
La coque interne 16 est constituée de préférence par assemblage de deux demi-coques 16a et 16b qui délimitent les parties internes supérieure, intermédiaire et inférieure de chaque réservoir 2 et 25. La coque externe 17 est également constituée de préférence par assemblage de deux demi-coques 17a et 17b qui comportent des premiers moyens d'immobilisation 36 (ici des orifices) destinés à coopérer avec des seconds moyens d'immobilisation 37 (ici des plots) formés sur la surface externe de la coque interne 16. Elle comporte en outre, dans sa partie supérieure, une entrée 42 équipée d'un premier connecteur 43 (propre à être raccordé à la partie principale « externe » du circuit fluidique de chauffage, et, dans sa partie inférieure, une sortie 44 munie d'un second connecteur 45 propre à être raccordé à un troisième ou quatrième connecteur 46 équipant les puits d'extrémité 18-1 et 18-3. De la sorte, le fluide caloporteur peut circuler à l'intérieur des parois 15 des réservoirs 2 et 25 et assurer une régulation thermique efficace du fluide de culture qui circule dans les poches.
Pour assurer la régulation de température dans les puits, on prévoit des canaux 47 formant une autre partie du circuit fluidique de chauffage. De préférence, lorsque les puits 18 sont réalisés dans un bloc massif épais 48, les canaux 47 sont formés par évidement dudit bloc 48, à la périphérie des zones délimitant les puits et, si possible, également au dessous. En variante, lorsque les réservoirs et les puits sont installés sur une plaque support, celle- ci peut comporter des canaux 47 destinés à permettre la circulation d'une partie du fluide caloporteur sous les puits 18. Les canaux 47 sont connectés d'un côté au troisième connecteur 46 destiné à être raccordé au second connecteur 45 du premier réservoir 2 et du côté opposé au quatrième connecteur 46 destiné à être raccordé au premier connecteur 43 du second réservoir 25.
Le fluide caloporteur circule dans la partie principale du circuit fluidique de chauffage et parvient ainsi dans les parois 15 du premier réservoir 2 par son premier connecteur 43, circule dans l'espace intercoques 35, puis parvient au niveau de son second connecteur 45. Il pénètre alors dans les canaux 47 des puits 18 par le troisième connecteur 46 et parvient au niveau de leur quatrième connecteur 46. Il pénètre ensuite dans les parois du second réservoir 25 par son second connecteur 45, circule dans l'espace inter-coques, puis parvient au niveau de son premier connecteur 43 d'où il regagne la partie principale du circuit fluidique de chauffage.
Afin de permettre cette circulation du fluide caloporteur, la partie principale du circuit fluidique comporte tout d'abord un conteneur principal 49 dans lequel se trouve logé une partie du fluide caloporteur et comportant des moyens de chauffage électrique 51 , par exemple des résistances chauffantes réglables, une entrée 52 raccordée via un conduit 53 au premier connecteur 43 du second réservoir 25, et une sortie 54 raccordée à une pompe (non représentée) qui alimente via un autre conduit 55 le premier connecteur 43 du premier réservoir 2. Cet autre conduit 55 est équipé, de préférence, de deux électrovannes (ou vannes pneumatiques) de régulation 56 et 57 montées en parallèle et d'un capteur de pression 58 (ou mano- contact). La température du fluide caloporteur dans le conteneur principal 49 est choisie de manière à assurer au fluide de culture, au niveau de la sortie 12 de la poche inférieure 7 logée dans le premier réservoir 2, une température adaptée à la culture.
Bien entendu, la température à l'intérieur des puits peut être différente de, ou sensiblement identique à, celle du fluide de culture en sortie du premier réservoir, selon les besoins. Dans une variante de réalisation, les deux réservoirs 2 et 25 et les puits 18 peuvent être alimentés en parallèle par un même fluide caloporteur ou bien par des fluides caloporteurs provenant de deux ou trois circuits fluidiques de chauffage indépendants. On peut également prévoir un circuit fluidique de chauffage pour chaque partie de réservoir. On peut ainsi prévoir des réservoirs contenant des milieux de culture placés sous des températures différentes, de part et d'autre de la chambre de culture, de manière à créer des profils de température ou des cycles de température.
Les réserves (ou conteneur de nutriment) 14 et/ou les dispositifs d'alimentation en fluide ou gaz (ou les cuves à déchets) 32 peuvent également posséder leurs propres circuits de thermostatisation de manière à maintenir leurs contenus respectifs à des températures choisies, éventuellement différentes. La thermostatisation pourra consister en un réchauffement comme en un refroidissement. Il est généralement préférable de les maintenir à des températures comprises entre environ 3°C et environ 12°C pour assurer une stabilité du milieu de culture.
Dans une autre variante, radicalement différente, les moyens de régulation de température comportent des moyens de chauffage électrique, tels que des résistances chauffantes ou des éléments CTP. De tels moyens peuvent être placés en des endroits choisis sur, ou dans, les parois qui délimitent les réservoirs et/ou les puits.
On peut également envisager de combiner des résistances chauffantes et un circuit fluidique de chauffage.
La puissance des moyens de chauffage électrique et/ou le débit de fluide caloporteur sont pilotés par une unité de commande 50, de manière à gérer la température du fluide caloporteur.
Par ailleurs, afin d'améliorer le contrôle de la température dans les puits et/ou dans les réservoirs, on peut prévoir en un (ou des) endroit(s) choisi(s) un (ou plusieurs) capteur(s) de température délivrant des mesures à l'unité de commande. Pour gérer les volumes internes des poches supérieures 6 et 27 et des poches inférieures 7 et 29, le dispositif selon l'invention comporte des moyens de pressurisation qui vont être décrits maintenant en référence à la figure 1.
Dans le mode de réalisation illustré, on utilise des moyens de pressurisation communs aux deux réservoirs 2 et 25, logés dans un boîtier externe 105 (tel que celui matérialisé en pointillés sur la figure 1), conjointement avec la majeure partie des moyens de régulation thermique. Mais, en variante, chaque réservoir pourrait comporter ses propres moyens de pressurisation logés dans des boîtiers placés, par exemple, en dessous des parties supérieures des réservoirs.
Les moyens de pressurisation comportent un circuit de pressurisation 59, haute pression, comprenant un surpresseur (ou pompe) 60, alimenté en air ambiant 61 et alimentant une réserve pressurisée 62, de préférence couplée à un capteur de pression (ou mano-contact) 63. La réserve 62 alimente un conduit principal 64 équipé d'un régulateur de pression 65, puis d'un premier régulateur de débit 66 et d'un filtre de particules 67 (par exemple une grille de 0,01 microns). Lorsque le dispositif est destiné à utiliser plusieurs fluides de pressurisation différents (par exemple de l'air et du dioxyde de carbone), on prévoit un conduit auxiliaire 68 alimenté en fluide(s) auxiliaire(s) 69 (par exemple du dioxyde de carbone), comportant un second régulateur de pression 70 suivi d'un second régulateur de débit 71 , et alimentant le conduit principal 64 entre le premier régulateur de débit 65 et le filtre 67. Dans ce cas, il est avantageux de prévoir un troisième régulateur de débit 72, entre le point de raccordement du conduit auxiliaire 68 et le filtre 67.
Le conduit principal 64 est destiné à alimenter en fluide pressurisé les deux réservoirs 2 et 25, ainsi que le conteneur de fluide de culture 14. Afin de limiter au maximum les perturbations thermiques que pourrait induire le fluide de pressurisation, lorsqu'il pénètre dans les parties supérieure et inférieure des réservoirs 2 et 25, on le réchauffe à l'aide du fluide caloporteur qui se trouve logé dans le conteneur principal 49. Pour ce faire, une partie 73 du conduit principal 64 est logée dans le conteneur principal 49, en y présentant de préférence une forme « en serpentin », ou toute autre forme favorisant les échanges thermiques.
De plus, afin de pouvoir contrôler le degré d'humidité du fluide de pressurisation avant qu'il ne pénètre dans les réservoirs 2 et 25, on prévoit, de préférence dans le conteneur principal 49, un conteneur auxiliaire 74 partiellement rempli d'un liquide d'humidification, et dans lequel débouche la partie 73 du conduit principal qui est immergée dans le fluide caloporteur.
La partie 75 du conduit principal 65 qui débouche du conteneur auxiliaire 74 alimente, de préférence via un thermo-hygromètre 76, d'une première part, une première voie 77 haute pression (par exemple d'environ 45 mbar) qui est équipée de quatre vannes 78, 79, 80 et 81 montées en parallèles, d'une seconde part, une seconde voie 82 haute pression (par exemple d'environ 45 mbar) qui débouche dans le conteneur de fluide de culture 14, d'une troisième part, une troisième voie 83 basse pression (par exemple d'environ 10 mbar) qui est équipée de quatre vannes 84, 85, 86 et 87 montées en parallèles ainsi que, de préférence, d'un quatrième régulateur de débit 88 placé en amont des vannes, et d'une quatrième part, une quatrième voie 89 de pression intermédiaire (par exemple d'environ 30 mbar) qui est équipée de préférence d'un cinquième régulateur de débit 90, suivi d'une électrovanne (ou vanne pneumatique) 91 et d'une réserve pressurisée 92, et alimente en parallèle les quatre vannes 78, 79, 80 et 81 , qui sont de préférence des électrovannes ou des vannes pneumatiques.
Dans une variante, on peut prévoir des circuits fluidiques de pressurisation différents pour gérer les volumes des poches logées dans les parties supérieure et inférieure d'un même réservoir. Cela peut en effet permettre d'utiliser des fluides de pressurisation différents au sein d'un même réservoir, de sorte que les poches assurent des fonctionnalités différentes, par exemple dans le but d'effectuer des tests comparatifs. Préférentiellement, les différentes électrovannes (ou vannes pneumatiques) 78-81 et 84-87 sont toutes de type trois voies (deux entrées et une sortie), les sorties des électrovannes (ou vannes pneumatiques) 78- 81 alimentant respectivement l'une des entrées des électrovannes (ou vannes pneumatiques) 84-87 dont les sorties alimentent respectivement, via des connecteurs 93-96 raccordés aux connecteurs 39, 41 installés au niveau des entrées étanches 38, 40, l'intérieur des parties supérieure 3 et inférieure 4 du premier réservoir 2 et l'intérieur des parties supérieure 26 et inférieure 28 du second réservoir 25, de manière à gérer les volumes des poches souples qu'elles logent. Ces électrovannes (ou vannes pneumatiques) peuvent être également utilisées pour gérer l'état des moyens de contrôle d'accès 11 , 13, 31 et 34 des puits 18 et poches souples, qui, comme mentionné précédemment, sont de préférence du type dit « à pincement » et sont par exemple décrits dans le document FR 0000548. Mais il ne s'agit que d'un exemple de réalisation parmi d'autres, des commutateurs ou des vannes pouvant être également utilisés.
Toutes les électrovannes et la pompe à fluide de pressurisation sont contrôlées par l'unité de commande électronique 50 qui comporte à cet effet des microprocesseurs (ou un microcontrôleur) monté sur une carte qui est, de préférence, connectée à une interface de liaison 97 (par exemple de type RS232) pour permettre son contrôle à distance par un ordinateur de traitement.
Le microcontrôleur 50, une fois programmé, pilote les électrovannes (ou vannes pneumatiques) de sorte que soient appliquées sur les poches, à l'aide du fluide de pressurisation, des séquences de basses et/ou hautes pressions, selon les besoins, dans les parties supérieures 3 et inférieures 4 des réservoirs 2 et 25. Bien entendu, le microcontrôleur 50 peut comporter une mémoire 98, de préférence réinscriptible, dans laquelle est stockée une multiplicité de programmes de culture, chaque programme définissant des premières et secondes séquences de pressions pour gérer les volumes respectifs des différentes poches souples, ainsi que les températures de régulation des puits et/ou du fluide caloporteur.
Comme mentionné précédemment, au lieu d'utiliser un microcontrôleur pour gérer un unique circuit de pressurisation, on pourrait utiliser ce même microcontrôleur pour gérer deux circuits de pressurisation au moins partiellement indépendants, par exemple installés sous les parties supérieures des réservoirs. Dans une autre variante, on pourrait utiliser deux microcontrôleurs indépendants, mais préalablement synchronisés, pour piloter deux circuits de pressurisation indépendants.
Préférentiellement, le dispositif comporte un capot destiné à isoler le(s) puits, ainsi qu'éventuellement les réservoirs, du milieu extérieur. Cela permet non seulement d'éviter que des échanges ne se produisent au niveau des différents septa, mais également de limiter les perturbations thermiques. Cela permet en outre d'instaurer une barrière de protection « mécanique » autour des puits. Le capot peut également englober tout le dispositif en formant une espèce d'enceinte définissant une barrière biologique, utile notamment lorsque ledit dispositif n'est plus placé sous une hotte à flux laminaire. La forme du capot et le matériau dans lequel il est réalisé peuvent être choisis de manière à permettre une observation sous microscope, ou tout autre moyen optique approprié, des cellules et tissus contenus dans les puits, en cours de culture. A cet effet, le capot est de préférence réalisé dans un matériau incassable, transparent au niveau des puits.
Par ailleurs, on peut prévoir au niveau des parties supérieure et inférieure de chaque réservoir 2, 25 une sortie de mise à la pression atmosphérique, équipée d'une électrovanne (ou vanne pneumatique) 99-102 pilotée par l'unité de commande 50. En outre, comme illustré sur les figures 2 à 4, l'entrée 9, 30 des poches souples supérieures 6, 27 est de préférence placée dans un conduit rigide 103 délimité par les parois rigides des demi- coques internes 16a et 16b et muni d'une cavité supérieure 104 équipée de moyens de purge (non représentés) de manière à évacuer d'éventuelles micro-bulles d'air qui pourraient se former en fonctionnement dans les poches souples des réservoirs 2 et 25.
Le dispositif selon l'invention peut être considéré comme un boîtier de commande couplé à des éléments de type « consommable » « réservoirs et/ou puits), éventuellement à usage unique. En effet, il suffit pour ce faire de munir, d'une part, le boîtier externe de commande, pressurisation et régulation 105 de premiers 93-96 et seconds 106 moyens de connexion raccordés respectivement aux circuits de pressurisation et de régulation thermique, et d'autre part, les deux réservoirs 2 et 25 de chaque dispositif de troisièmes 39, 41 et quatrième 43 moyens de connexion respectivement raccordés aux parties intérieures supérieure et inférieure des réservoirs et à l'espace inter-coques 35, puis de connecter les premiers moyens de connexion 93-96 aux troisièmes moyens de connexion 39, 41 et les seconds moyens de connexion 106 aux quatrièmes moyens de connexion 43.
Pour procéder à une nouvelle culture on déconnecte les consommables usagés (réservoirs et/ou puits) pour les remplacer par de nouveaux consommables que l'on connecte au boîtier externe de commande.
Comme cela est illustré, schématiquement, sur les figures 5 et 6, il est possible de disposer en parallèle une multiplicité de dispositifs 1 , de manière à constituer une installation de culture de cellules et tissus, soit à grand rendement (cas de cultures identiques), soit à différenciation élevée (cas de cultures différentes). Dans cet exemple, l'installation comporte quatre dispositifs parallèles 1-1 à 1-4, chaque dispositif 1-i (ici i = 1 à 4) comportant trois puits de culture 18-j (ici j = 1 à 3) montés en série. Les réservoirs à espace de circulation de fluide caloporteur sont assemblés les uns aux autres par exemple par emboîtement des plots 37 des demi-coques internes 16b dans des logements 108 adaptés formés sur les demi-coques externes 17a et 17b (voir figure 6).
Ces dispositifs peuvent être complètement indépendants les uns des autres. Dans ce cas, ils peuvent comporter soit une unité de commande commune qui pilote des circuits de pressurisation et de régulation thermique indépendants les uns des autres, soit des unités de commande indépendantes qui pilotent chacune un circuit de pressurisation et un circuit de régulation thermique. Dans ces cas, les températures de régulation et/ou les fluides de pressurisation peuvent varier d'un dispositif à l'autre. Mais, ces dispositifs peuvent être également dépendants les uns des autres du fait de communications entre certains de leurs puits.
On peut également envisager une installation dans laquelle les dispositifs ont des puits indépendants les uns des autres, et partagent un même circuit de pressurisation et un même circuit de régulation thermique pilotés par une unité de commande commune (ou principale). Dans ce cas, la plus grande partie des moyens de pressurisation et des moyens de régulation thermique, ainsi que l'unité de commande principale sont logées dans un boîtier externe 105 (tel que celui matérialisé en pointillés sur la figure 1). De la sorte, on peut former une installation dans laquelle les dispositifs constituent des éléments modulaires de type « consommable », éventuellement à usage unique. En effet, il suffit pour ce faire de munir, d'une part, le boîtier externe de commande, pressurisation et régulation 105 de premiers 93-96 et seconds 106 moyens de connexion raccordés respectivement aux circuits de pressurisation et de régulation thermique, et d'autre part, les deux réservoirs 2 et 25 de chaque dispositif de troisièmes 39, 41 et quatrième 43 moyens de connexion respectivement raccordés aux parties intérieures supérieure et inférieure des réservoirs et à l'espace intercoques 35, puis de connecter les premiers moyens de connexion 93-96 aux troisièmes moyens de connexion 39, 41 et les seconds moyens de connexion 106 aux quatrièmes moyens de connexion 43.
Pour procéder à de nouvelles cultures on retire les consommables usagés (réservoirs et/ou puits) pour les remplacer par de nouveaux consommables dans les puits desquels ont été éventuellement inoculées des cellules.
Dans une telle installation, le nombre de dispositifs assemblés en parallèle pourra varier selon les besoins.
Dans une installation selon l'invention, tout comme dans un dispositif selon l'invention, les puits de culture 18-j peuvent être montés en série sur une plaque support 107, comme illustré sur la figure 5, ou bien directement formés par évidement d'un bloc massif épais 48 (comme illustré sur la figure
1 ).
Dans le premier exemple (figure 5), la plaque support 107 pourra comporter des logements pour recevoir chaque puits 18-i-j (ici i = 1 à 4, et j = 1 à 3) et des canaux 47 pour la circulation d'une partie du fluide caloporteur à la périphérie des puits. Cette plaque support 107 pourra également comporter des canaux ou conduits destinés à la circulation d'une partie du fluide de pressurisation. Dans le second exemple de réalisation, les puits de culture des dispositifs pourront être réalisés dans des blocs massifs indépendants, ou bien dans un bloc unique. Des détails sur des modes de réalisation de puits, pouvant être utilisés dans un dispositif selon l'invention, sont donnés dans le document FR 0000548.
Comme mentionné précédemment dans la description du dispositif 1 , il est avantageux de prévoir un capot principal de manière à isoler de l'extérieur les puits ainsi qu'éventuellement les deux réservoirs de chaque dispositif de l'installation, voire même l'intégralité des dispositifs. Cela permet d'éviter d'utiliser un capot pour chaque dispositif.
Des exemples de modes de fonctionnement (ou en d'autres termes de premières et secondes séquences de pressions destinées à gérer les volumes des poches des réservoirs) du dispositif et de l'installation selon l'invention sont donnés dans le document FR 0000548. Il est simplement rappelé ici que l'installation et le dispositif peuvent fonctionner selon différents modes mentionnés ci-après.
Un mode « laminaire » consiste à faire remonter le fluide de culture dans la poche supérieure de l'un des deux réservoirs de manière à instaurer une différence de hauteur entre cette poche supérieure et les poches inférieures des deux réservoirs, puis à laisser s'écouler, par gravitation, le fluide de culture du réservoir supérieur vers les réservoirs inférieurs, et à faire remonter le fluide de culture vers la poche supérieure de l'autre réservoir. On recommence, dans l'autre sens ("sens retour"), les mêmes opérations pour faire un cycle (ou "aller-retour") entre les deux réservoirs, via le puits. Le nombre de cycles est choisi en fonction du type de culture effectuée à l'intérieur des puits 18. Les quatre étapes d'un cycle aller-retour du mode laminaire sont regroupées sur la figure 7. Le nombre de cycles successifs est choisi en fonction du type de culture effectué. Un mode « turbulent » consiste à appliquer une haute pression en permanence sur les poches inférieures 7 et 29 des premier 2 et second 25 réservoirs. En d'autres termes, les première et seconde séquences supérieures des poches supérieures des premier et second réservoirs sont constituées d'une succession de quatre périodes de basse pression. Ce mode ne comprend que deux étapes qui sont regroupées sous la forme d'un cycle « aller-retour » sur la figure 8. Le nombre de cycles successifs est choisi en fonction du type de culture effectué. Ce mode peut faire l'objet, notamment, d'une première variante (figure 9) dans laquelle la haute pression n'est plus maintenue constamment sur les deux poches inférieures 7 et 29, mais sur les deux poches supérieures 6 et 27. Cela permet d'obtenir une circulation du fluide de culture très rapide entre les deux poches inférieures 7 et 29, étant donné que ledit fluide ne peut pas remonter, du fait des hautes pressions dans les poches supérieures 6 et 27. Dans une seconde variante (non illustrée), la première séquence appliquée à chaque poche du premier réservoir consiste en une alternance de premières périodes de haute pression et de secondes périodes de basse pression, et la seconde séquence appliquée à chaque poche du second réservoir consiste en une alternance de premières périodes de basse pression et de secondes périodes de haute pression. Les deux modes de fonctionnement, laminaire et turbulent, qui viennent d'être décrits, ainsi que la variante, ne sont que quelques-uns des nombreux exemples qui peuvent être envisagés. Ainsi, il serait possible de combiner des cycles de fonctionnement turbulent avec des cycles de fonctionnement laminaire.
L'invention s'applique à de très nombreux types de cellules et tissus, tels que notamment :
- les cellules intestines : Intestine 407, Caco-2, Colo 205, T84, SW 1116, WiDr, HT 29, HT 115, HT 55 ;
- les cellules endothéliales : HAOSMC (de l'acronyme anglais Human Aortic Smooth Muscle Cells) ; - les cellules épidermales : NHEK-Neopooled (Human Epidermal
Keratinocyte Neonatal), Equine Dermis ;
- les cellules cancéreuses : HeLa, CHO-K1 ;
- les cellules fibroblastiques de type intestinales : CCD-18Co
- les cellules fibroblastiques de type MRC-5, 3T3, Wi-38 ; - les myélomes : SP2O-Ag14, P3X63 Ag8 653, MPC11 ;
- les hybridomes ;
- les cellules d'insectes : SF9.
Cette liste n'est en aucun cas exhaustive ; il ne s'agit que d'exemples. L'invention ne se limite pas aux modes de réalisation de dispositif et d'installation décrits ci-avant, seulement à titre d'exemple, mais elle englobe toutes les variantes que pourra envisager l'homme de l'art dans le cadre des revendications ci-après.
Ainsi, dans ce qui précède il a été question d'un circuit de régulation thermique dans lequel circule un fluide caloporteur destiné à apporter des calories en vue de réchauffer. Mais, on peut envisager d'utiliser en complément un circuit de régulation thermique auxiliaire dans lequel circule un fluide frigoporteur destiné à apporter des frigories en vue de refroidir certains milieux, comme par exemple des réserves. Bien entendu, dans ce cas le dispositif selon l'invention doit être équipé de moyens de refroidissement contrôlés par le module de commande.
Par ailleurs, dans ce qui précède il a été question de placer les puits sous des premières températures choisies et/ou le(s) fluide(s) sous une
(des) seconde(s) température(s) choisies. Mais, on peut envisager de placer le(s) puits sous un (des) premier(s) profil(s) ou cycle(s) de température et/ou le(s) fluide(s) sous un (des) second(s) profil(s) ou cycle(s) de température.
En outre, il est également possible d'effectuer une régulation de la section d'entrée de chaque réservoir et de la chambre, notamment lorsqu'ils sont alimentés par le même circuit caloporteur, de manière à contrôler leurs températures respectives, indépendamment.
Enfin, les moyens de régulation thermique peuvent être agencés de manière à induire un choc thermique à l'intérieur de la chambre et/ou des puits. Cela peut être particulièrement avantageux lorsqu'il faut modifier l'état des membranes cellulaires. Ce choc thermique peut être combiné à une variation de pression par un contrôle du débit du fluide et/ou de la pression interne de la chambre.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de culture de cellules et tissus du type comprenant au moins un puits de culture (18-i) agencé pour définir une chambre (19-i) propre à recevoir des cellules ou des tissus à cultiver, de premier (2) et second (25) réservoirs logeant chacun au moins une poche souple (6,7 ;27,29), l'une au moins des poches de ces réservoirs étant propre à recevoir un fluide de culture, des moyens de liaison (20,21) couplés audit puits et auxdites poches pour permettre la circulation du fluide de culture d'un réservoir à l'autre via ledit puits, des moyens de pressurisation (60-92) agencés pour appliquer aux poches des premier (2) et second (25) réservoirs respectivement une première et/ou une seconde séquences de pressions externes définies par au moins un module de commande (50) et destinées à gérer la circulation du fluide de culture dans ledit puits, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de régulation thermique (35,47,49,51-58) pilotés par ledit module de commande et agencés pour maintenir une première température choisie, ou un premier cycle de température choisi, à l'intérieur dudit puits (18-i) et/ou pour placer sous une seconde température choisie, ou un second cycle de température choisi, le fluide de culture qui débouche de l'un au moins desdits premier (2) et second (25) réservoirs pour alimenter ledit puits.
2. Dispositif selon la revendication 1 , caractérisé en ce que lesdits moyens de régulation thermique comprennent un circuit fluidique comportant une première partie intégrée (47) dans les parois délimitant ledit puits (18-i) et agencée pour permettre la circulation d'un fluide caloporteur.
3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que la première partie du circuit fluidique comprend des premiers moyens de connexion (46) qui débouchent dans des canaux (47) de circulation de fluide caloporteur intégrés dans les parois du puits (18-i).
4. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdits moyens de régulation thermique comprennent un circuit fluidique comportant des seconde et troisième parties (35) respectivement intégrées dans des parois (15) délimitant les premier (2) et second (25) réservoirs et agencés pour permettre la circulation d'un fluide caloporteur.
5. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que les premier (2) et second (25) réservoirs sont chacun réalisés par assemblage d'une coque interne (16) et d'une coque externe (17) logeant la coque interne en ménageant un espace inter-coques (35) destiné à la circulation du fluide caloporteur.
6. Dispositif selon l'une des revendications 2 et 3 combinée à l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que la seconde partie (35) du circuit fluidique est agencée pour alimenter en fluide caloporteur la première partie (47) et la troisième partie dudit circuit fluidique (35) est agencée pour collecter le fluide caloporteur ayant circulé dans la première partie (47).
7. Dispositif selon la combinaison des revendications 3, 5 et 6, caractérisé en ce que les seconde et troisième parties (35) du circuit fluidique comprennent des seconds (43) et troisièmes (45) moyens de connexion (45) débouchant dans l'espace inter-coques (35) et propres à être raccordés pour une première sous-partie aux premiers moyens de connexion (46) et pour une seconde sous-partie à une quatrième partie (53,55) du circuit fluidique destinée à l'alimentation et la collection de fluide caloporteur.
8. Dispositif selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que ledit circuit fluidique comporte une pompe couplée à un conteneur principal (49) contenant une partie du fluide caloporteur et des moyens de chauffage électrique (51 ) pour chauffer de façon contrôlée ledit fluide caloporteur avant qu'il n'alimente les première (47), seconde (35) et troisième (35) parties.
9. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que lesdits moyens de régulation thermique comprennent des premiers éléments de chauffage électrique destinés à assurer une partie au moins du chauffage contrôlé du puits.
10. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que lesdits moyens de régulation thermique comprennent des seconds éléments de chauffage électrique destinés à assurer une partie au moins du chauffage contrôlé des premier et second réservoirs.
11. Dispositif selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que lesdits éléments de chauffage électrique comprennent des résistances chauffantes solidaires des parois délimitant les réservoirs et/ou puits.
12. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que les premier (2) et second (25) réservoirs comprennent chacun une partie supérieure (3,26) et une partie inférieure (4,28) reliées entre elles par une partie intermédiaire étroite (5,23), chaque partie supérieure et inférieure des premier et second réservoirs logeant une poche souple, lesdites poches souples supérieure (6,27) et inférieure (7,29) communiquant entre elles via la partie intermédiaire (5,23), et lesdits moyens de liaison (20,21) communiquant avec les poches inférieures (6,29), les parties supérieure (3,26) et inférieure (4,28) des premier (2) et second (25) réservoirs comportant en outre chacune une entrée étanche (38,40), et en ce que les moyens de pressurisation comprennent une pompe à fluide (60) propre alimenter en fluide de pressurisation haute pression, via une première portion de circuit de pressurisation (64), une seconde portion de circuit de pressurisation (77,82,82,89) raccordée à des vannes supérieures (78,81 ,84,87) et inférieures (79,80,85,86) pilotées par le module de commande (50) et propres à alimenter chaque partie supérieure (3,26) et inférieure (4,28) des premier et second réservoirs, via lesdites entrées étanches (38,40), en fluide de pressurisation haute pression ou basse pression, ou pression intermédiaire.
13. Dispositif selon la combinaison des revendications 8 et 12, caractérisé en ce que la première portion de circuit de pressurisation (64,65) comprend une sous-partie (73) immergée dans le fluide caloporteur contenu dans le conteneur principal (49) de manière à alimenter la seconde portion de circuit de pressurisation (77,82,82,89) en fluide de pressurisation réchauffé.
14. Dispositif selon la revendication 13, caractérisé en ce que lesdits moyens de pressurisation comprennent un conteneur auxiliaire (74), placé dans ledit conteneur principal (49) au contact du fluide caloporteur, contenant un fluide d'humidification et alimenté en fluide de pressurisation par la sous-partie (74) de la première portion de circuit de pressurisation, de sorte que le fluide de pressurisation qui alimente la seconde portion de circuit de pressurisation (65) présente un degré d'humidité choisi.
15. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux puits (18-i) placés en série et communiquant entre eux par lesdits moyens de liaison (21 ), l'un des puits (18-1 ) étant raccordé audit premier réservoir (2) et l'autre puits (18-3) étant raccordé audit second réservoir (25).
16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend un troisième puits (18-3) placé en série entre les deux autres puits et communiquant avec eux par lesdits moyens de liaison (23).
17. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le module de commande (50) comprend une mémoire (98) de type réinscriptible propre à stocker lesdites séquences de pression et lesdites première et seconde températures choisies, ou les premier et second cycles de température choisis.
18. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que ledit module de commande (50) est agencé pour piloter les sections d'entrée de chaque réservoir et de la chambre, lorsqu'ils sont alimentés par le même circuit caloporteur, de manière à contrôler leurs températures respectives, indépendamment.
19. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un conteneur de nutriment (14) et des dispositifs d'alimentation en fluide ou gaz (32) raccordés à des circuits de thermostatisation, et en ce que ledit module de commande (50) est agencé pour contrôler lesdits circuits de thermostatisation de manière à maintenir les contenus respectifs du conteneur de nutriment (14) et/ou des dispositifs d'alimentation en gaz (32) à des températures choisies.
20. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que chaque partie de réservoir est raccordée à un circuit fluidique de chauffage, de sorte que des parties appartenant à des réservoirs placés de part et d'autre de la chambre puissent être placées sous des températures différentes, de manière à créer des profils ou cycles de température dans lesdits puits.
21. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que lesdits moyens de régulation sont agencés pour induire un choc thermique à l'intérieur de la chambre et/ou des puits.
22. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 21 , caractérisé en ce que les moyens de régulation thermique comprennent au moins un capteur de température propre à délivrer au module de commande des mesures représentatives de la température à l'intérieur d'un puits.
23. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 22, caractérisé en ce qu'il comprend un capot destiné à isoler de l'extérieur au moins les puits.
24. Dispositif selon la revendication 23, caractérisé en ce que ledit capot est destiné à isoler de l'extérieur les puits et les réservoirs.
25. Installation de culture de cellules et tissus, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux dispositifs (1-i) selon l'une des revendications 1 à 24, placés en parallèle, et une unité de commande principale (50) assurant le pilotage conjoint desdits dispositifs.
26. Installation selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'elle comprend un circuit fluidique principal alimentant en parallèle les puits et/ou réservoirs de chaque dispositif.
27. Installation selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'elle comprend des moyens de régulation thermique centrale pilotés par ladite unité de commande principale (50) et agencés pour maintenir une même première température choisie, ou un même premier cycle de température choisi, à l'intérieur des puits de chaque dispositif et/ou pour placer sous une même seconde température choisie, ou un même second cycle de température choisi, le fluide de culture qui débouche de l'un au moins desdits premier et second réservoirs de chaque dispositif pour alimenter ses puits.
28. Installation selon la revendication 27, caractérisée en ce que ladite unité de commande principale (50) pilote les moyens de régulation thermique de chaque dispositif de sorte qu'ils maintiennent indépendamment les uns des autres une première température choisie, ou un premier cycle de température choisi, à l'intérieur des puits de leur dispositif et/ou placent indépendamment les uns des autres sous une seconde température choisie, ou un premier cycle de température choisi, le fluide de culture qui débouche de l'un au moins desdits premier et second réservoirs de leur dispositif pour alimenter ses puits.
29. Installation selon l'une des revendications 25 à 28, caractérisée en ce qu'elle comprend un capot principal destiné à isoler de l'extérieur, simultanément, au moins les puits de chaque dispositif.
30. Installation selon la revendication 29, caractérisée en ce que ledit capot principal est destiné à isoler de l'extérieur, simultanément, les puits et les réservoirs de chaque dispositif.
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