EP1381454A1 - Dispersions d'hydroxyapatite comprenant un acide amine en tant qu'agent stabilisant, et leur procede de preparation - Google Patents

Dispersions d'hydroxyapatite comprenant un acide amine en tant qu'agent stabilisant, et leur procede de preparation

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Publication number
EP1381454A1
EP1381454A1 EP02726280A EP02726280A EP1381454A1 EP 1381454 A1 EP1381454 A1 EP 1381454A1 EP 02726280 A EP02726280 A EP 02726280A EP 02726280 A EP02726280 A EP 02726280A EP 1381454 A1 EP1381454 A1 EP 1381454A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
colloids
stabilizing agent
colloidal dispersion
source
calcium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02726280A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Yves Chane-Ching
Claude Magnier
Emmanuel Vignaud
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rhodia Chimie SAS
Original Assignee
Rhodia Chimie SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhodia Chimie SAS filed Critical Rhodia Chimie SAS
Publication of EP1381454A1 publication Critical patent/EP1381454A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/0004—Preparation of sols
    • B01J13/0008—Sols of inorganic materials in water
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K6/00—Preparations for dentistry
    • A61K6/15—Compositions characterised by their physical properties
    • A61K6/17—Particle size
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K6/00—Preparations for dentistry
    • A61K6/80—Preparations for artificial teeth, for filling teeth or for capping teeth
    • A61K6/831—Preparations for artificial teeth, for filling teeth or for capping teeth comprising non-metallic elements or compounds thereof, e.g. carbon
    • A61K6/838—Phosphorus compounds, e.g. apatite
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B25/00—Phosphorus; Compounds thereof
    • C01B25/16—Oxyacids of phosphorus; Salts thereof
    • C01B25/26—Phosphates
    • C01B25/32—Phosphates of magnesium, calcium, strontium, or barium

Definitions

  • Hydroxyapatite dispersions comprising an amino acid as a stabilizing agent, and process for their preparation
  • the present invention relates to stable aqueous colloidal dispersions of colloids with apatitic structure in which the colloids, of oblong or spherical shape, have nanometric dimensions.
  • These dispersions are stabilized by stabilizers of the amino acid type, optionally in ionized form, in interaction with the surface of the colloids.
  • These oblong colloids are in more or less aggregated form, and have an average length (in number) generally between 20 and 250 nm and an equivalent aspect ratio (ratio of average length (in number) to diameter equivalent) between 1 and 300.
  • the colloids of spherical shape have a diameter between 10 and 100 nm, preferably between 10 and 60 nm, for example between 10 and 40 nm.
  • aqueous colloidal dispersion is generally meant a system consisting of a continuous aqueous phase in which are dispersed fine solid particles of colloidal dimensions, said fine particles defining colloids at the surface of which molecules of an agent can be bound or adsorbed stabilizer or various ionic species present in the continuous aqueous phase.
  • colloids with apatitic structure is meant according to the invention colloids of general formula:
  • J is chosen from OH “ , F “ , CO 3 2 " and or CI " and in which certain phosphate ions (PO 4 3 “ ) or hydrogen phosphate (HPO 4 2” ) can be replaced by carbonate ions (CO 3 2 " ), and in which certain Ca 2+ cations can be replaced by metal cations M n + of alkali, alkaline earth metals or of lanthanides where n represents 1, 2 or 3, it being understood that the molar ratio of the cation M n + , when present, to Ca 2+ , varies between 0.01: 0.99 and 0.25: 0.75, and that the substitution of ions HPO 4 2 " or of PO 4 3 ' ions with CO 3 2 ions " , the incorporation of CO 3 2 ions " as J and the substitution of Ca 2+ cations by metal cations is carried out so as to satisfy the electronic balance, in particular with the creation of gaps.
  • Ca 2+ when Ca 2+ is replaced by an alkali metal cation, this is Na + .
  • Ca 2+ when Ca 2+ is replaced by an alkaline earth metal cation, this is Sr 2 *.
  • Ca 2+ is replaced by a lanthanide cation, the latter is preferably Eu 3+ , Eu 2+ , Dy 3+ or Tb 3+ .
  • lanthanide is understood to mean the elements of the group constituted by yttrium and by the elements of the periodic classification with atomic number included inclusively between 57 and 71.
  • the periodic classification of the elements to which reference is made in the present description is that published in the supplement to the bulletin of the departments Chimique de France No. 1 (January 1966).
  • the colloids are colloids of hydroxyapatite.
  • colloids with apatitic structure also includes colloids obtained by hydrolysis of the colloids of formula I above.
  • octocalcium phosphate a colloid of formula Ca 8 (HPO 4 ) 2 , 5 (PO 4 ) 3 , 5 OH 0 , 5 is obtained after hydrolysis.
  • M n + a metal cation M n + .
  • the M ⁇ + / Ca 2+ molar ratio varies between 0.02 / 0.98 and 0.15 / 0.85.
  • Colloids with an apatite structure are generally obtained by contacting, in aqueous solution, a source of Ca 2+ and a source of PO 3 " in an appropriate pH range.
  • colloids with an apatite structure are obtained, the growth of which is difficult to control and limit.
  • the particle formation kinetics are often very high, so that it is difficult to stop the mineral polycondensation at the nanometric particle stage.
  • particles of too large size are generally obtained in fine with a strong tendency to decantation.
  • the invention provides, according to a first of its aspects, a method making it possible to control the growth of colloids with apatitic structure and leading to stable colloidal dispersions consisting of colloids of nanometric dimensions.
  • the invention relates to stable, aqueous colloidal dispersions of colloids with apatitic structure, formed of relatively fine colloids, of oblong shape, of an average length (in number) between 20 and 250 nm and an equivalent aspect ratio (ratio of the average length (in number) to the equivalent diameter) of between 1 and 300, or else of spherical shape having a diameter of between 10 and 100 nm.
  • These dispersions are generally formed from weakly aggregated colloids. In the case of colloids with small dimensions and weakly aggregated, the dispersions of the invention are transparent to the naked eye.
  • weakly aggregated colloids is meant a percentage by number of perfectly individualized objects greater than 80%, preferably greater than 90%, advantageously greater than 95%.
  • the invention relates to a stable aqueous colloidal dispersion of colloids with apatitic structure, having a pH between 5 and 10, consisting of colloids of oblong shape with an average length (in number) between 20 and 250 nm and of an equivalent aspect ratio (ratio of the average length (in number) to the equivalent diameter) of between 1 and 300, or else of spherical shape having a diameter of between 10 and 100 nm, and comprising one or more acids amines optionally in ionized form as a stabilizing agent; said colloids having an apatite structure having the formula: Ca ⁇ 0- x (HPO 4 ) x (PO 4 ) 6- x (J) 2-x (IV) in which: x is chosen from 0, 1 or 2;
  • J is chosen from OH “ , F “ , CO 3 2 “ or CI “ ; and in which certain phosphate ions (PO 4 3 “ ) or hydrogen phosphate
  • HPO 4 2 " can be replaced by carbonate ions (CO 3 2" ); and in which certain Ca 2+ can be replaced by metallic cations M ⁇ + of alkali metals, alkaline earth metals or lanthanides where n represents 1, 2 or 3, it being understood that the molar ratio of the cation M ⁇ + , when it is present, at Ca 2+ , varies between 0.01: 0.99 and 0.25: 0.75, and that the substitution of HPO 4 2 " ions or PO 3" ions with CO 3 ions 2 " , the incorporation of CO 3 2" ions as J and the substitution of Ca 2+ cations by metal cations is carried out so as to satisfy the electronic balance, in particular with creation of vacancies.
  • colloids of oblong shape are understood to mean colloids of parallelepipedal shape (for example in the shape of a stick) or of acicular shape.
  • the equivalent diameter is the diameter that would have the colloid of corresponding acicular shape with the same average volume and the same average length.
  • the equivalent diameter assigned to the cross section of the acicular colloid corresponds to the diameter of an average cross section.
  • the oblong-shaped colloids are formed from colloids with a weakly aggregated apatitic structure. In general, oblong colloids have an average length (in number) of between 20 and
  • colloids in the form of needle-like fibers, the average length of which generally varies between 20 and 250 nm and the equivalent diameter is between 0.5 and 5 nm; and rod-shaped colloids whose average length generally varies between 20 and 250 nm and the equivalent diameter is between 5 and 20 nm.
  • Spherical colloids have a diameter generally between 10 and 100 nm, preferably between 10 and 60 nm, better still between 10 and 40 nm.
  • the dispersions of the invention are either uniformly formed of oblong-shaped colloids, or uniformly formed of spherical colloids, or still formed from a mixture of colloids of oblong shape and spherical shape.
  • J represents OH “ or / and F " . Not all OH ions “need to be replaced by F “ ions, but only part of the OH ions " can be replaced by F " ions.
  • J is chosen from OH “ , F “ , CO 3 2 “ and CI " , it is not necessary for all the Js to be identical to each other.
  • Stabilization of the colloidal dispersion is obtained by the action of a stabilizing agent.
  • the stabilizing agent contributes not only to ensure the stabilization of the dispersion but also to control the growth of the colloids with apatitic structure during the preparation of the aqueous dispersion.
  • the stabilizing agent is a natural or synthetic amino acid, optionally in ionized form or a mixture of these compounds.
  • the ⁇ -amino acids include a carbon atom carrying an amino group, a carboxyl group, a hydrogen atom and a side group which may be a hydrogen atom (in the case of glycine) or any other monovalent organic group.
  • the side groups can be in particular alkyl groups (case of alanine, valine, leucine, isoleucine and praline), substituted alkyl groups (case of threonine, serine, methionine, cysteine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, arginine and lysine), arylalkyl groups (case of phenylalanine and tryptophan), substituted arylalkyl groups (case of tyrosine ), heteroalkyl groups (case of histidine).
  • alkyl groups case of alanine, valine, leucine, isoleucine and praline
  • substituted alkyl groups case of threonine, serine, methionine, cysteine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, arginine and lysine
  • arylalkyl groups case of phenylalanine and tryptophan
  • the expression amino acid also includes ⁇ -, ⁇ -, ⁇ - and ⁇ -amino acids.
  • synthetic ⁇ -amino acid is meant an ⁇ -amino acid which is not incorporated into a protein under the control of mRNA such as for example a fluorinated ⁇ -amino acid such as fluoroalanine, trimethylsilylalanine or an ⁇ -amino acid such than :
  • ni is an integer from 1 to 6 and n 2 is an integer from 1 to 12.
  • amino acids which can be used as stabilizers are either in their L form, or in their D form, or else in the form of a racemic mixture.
  • ⁇ -amino acid More generally, a preferred group of ⁇ -amino acid consists of the compounds of formula:
  • L represents an alkyl group optionally interrupted by an oxygen atom and / or a sulfur atom and / or a nitrogen atom, said nitrogen atom carrying a hydrogen atom or an alkyl radical, aryl, arylalkyl, alkylaryl, heteroaryl or heteroarylalkyl, and said alkyl group being optionally substituted by one or more radicals chosen from -OH, -NH 2 , guanidino, carboxy, carbamoyl, thiol, aryl (itself optionally substituted by one or more radicals T, identical or different, as defined below), heteroaryl (itself optionally substituted by one or more radicals T, identical or different as defined below);
  • W represents a hydrogen atom or L and W together represent an optionally substituted alkylene chain
  • T represents hydroxy, amino, guanidino, carboxy, thiol, alkylthio, alkylamino, carbamoyl, dialkylamino, aryl, arylalkyl, alkylaryl, heteroaryl, alkyl heteroaryl or heteroarylalkyl.
  • alkylene is meant an aliphatic, linear or branched hydrocarbon chain.
  • alkyl is generally meant a branched or linear aliphatic hydrocarbon chain comprising from 1 to 18 carbon atoms, preferably from 1 to 10 carbon atoms and in particular from 1 to 6 carbon atoms.
  • alkyl radicals are methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, 2-methylbutyl, 1-ethylpropyl, hexyl, isohexyl, neohexyl, 1-methylpentyl, 3- methylpentyle, 1, 1-dimethylbutyl, 1, 3-dimethylbutyl, 2-ethylbutyl, 1-methyl-1- ethylpropyl, heptyle, 1-methylhexyl, 1-propylbutyl, 4,4-dimethylpentyl, octyl, 1 -methylheptyl, 2- ethylhexyl, 5,5-dimethylhexyl, nonyl, decyl, 1-methylnonyl, 3,7-dimethyloctyl and 7,7
  • alkyl represents methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, t-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, 2-methylbutyl, 1 - ethylpropyl, hexyl, isohexyl, neohexyl, 1-methyl pentyl, 3-methylpentyl, 1, 1-dimethylbutyl, 1, 3-dimethylbutyl, 2-ethylbutyl and 1 -methyl-1 -ethylpropyl.
  • Aryl generally denotes an aromatic carbocyclic radical containing from 6 to 18 carbon atoms, preferably from 6 to 10 carbon atoms.
  • Aryle is mono- or polycyclic and preferably mono-, bi- or tricyclic.
  • the carbocyclic radical comprises more than one cyclic nucleus
  • the cyclic nuclei can be condensed two by two or attached two by two by ⁇ bonds.
  • heteroaryl generally means heterocyclic radicals comprising one or more heteroatoms chosen from O, S and N.
  • Heteroaryl radicals include mono- and polycyclic radicals; preferably mono-, bi- or tricyclic radicals.
  • each unicycle comprises from 3 to 8 links, better still from 5 to 7.
  • each of the monocycles constituting the heterocycle comprises from 1 to 4 heteroatoms, better still from 1 to 3 heteroatoms.
  • heteroaryls chosen from pyridine, furan, thiophene, pyrrole, pyrrazole, imidazole, thiazole, isoxazole, isothiazole, furazane, pyridazine, pyrimidine, pyrazine, thiazines, oxazole, pyrazole, oxadiazole, triazole and thiadiazole;
  • each unicycle comprises from 5 to 7 vertices, such as for example chosen from indolizine, indole, isoindole, benzofuran, benzothiophene, indazole, benzimidazole, benzothiazole, benzofurazane, benzothiofurazane, purine, quinoline, isoquinoline, cinnoline , quinazoline, quinoxaline, naphthyridines, pyrazolotriazine (such as pyrazolo-1, 3,4-triazine), pyrazolopyrimidine and pteridine; and
  • each unicycle comprises from 5 to 7 vertices such as, for example, acridine, phenazine or carbazole.
  • the expression "possibly interrupted by O and / or S and / or N" means that any carbon atom in the hydrocarbon chain can be replaced by an oxygen and / or sulfur and / or nitrogen atom, this carbon atom can not be located at one end of said chain hydrocarbon.
  • the hydrocarbon chain which may be alkyl may comprise several oxygen and / or sulfur and / or nitrogen atoms, preferably the heteroatoms being separated from each other by at least one carbon atom, better still by at least two carbon atoms.
  • the alkylene chain is interrupted by a nitrogen atom, it is preferred that the latter bear a hydrogen atom or an alkyl group.
  • the stabilizing agent used is chosen from lysine, glycine, asparagine, creatine, arginine, aspartic acid, glutamic acid, serine, alanine, valine, leucine, their salts with acids or bases, and mixtures thereof.
  • the stabilizing agent is chosen from lysine, creatine, glycine, alanine, asparagine, serine, their salts with acids or bases, and mixtures thereof.
  • the stabilizing agent can also be the salt of an amino acid with a base or an acid, preferably with an inorganic acid or base.
  • an inorganic acid mention may be made of nitric, phosphoric, phosphinic, phosphonic, hydrochloric, sulfonic and sulfuric acids.
  • an inorganic base mention may be made of bases of the alkali metal or alkaline earth metal hydroxide and ammonium hydroxide type.
  • the stabilizing agent can consist of one or more amino acids, optionally in ionized form.
  • the stabilizing agent is generally either present in free form in the continuous medium of the colloidal dispersion, or adsorbed or bound to the surface of the colloids, or in interaction with Ca 2+ ions present in the continuous phase of the dispersion.
  • the colloidal phase is predominantly of apatitic structure as defined above.
  • the apatite structure represents more than 50% by weight of the colloidal phase, preferably more than 75% by weight, better still more than 80%, for example more than 85% by weight.
  • the colloidal phase can also comprise other structures, such as Ca (H 2 PO 4 ) 2 ; CaHPO 4 ; CaHPO 4 , 2H 2 O or other amorphous phase based on calcium and PO 3 " , HPO 4 2" or H 2 PO 4 ' and OH " .
  • the molar ratio of the total calcium present in the colloids to the total phosphorus present in the colloids varies between 1, 3 and 1, 7, better still between 1, 5 and 1, 67.
  • the molar ratio of the total stabilizing agent present in the colloids or on the surface of the colloids to the total calcium present in the colloids or on the surface of the colloids it varies between 0.001 and 1.0, preferably between 0.01 and 0, 5, advantageously between 0.01 and 0.1.
  • the colloidal phase contains from 60 to 100% of the total calcium, preferably from 80 to 100%, for example from 90 to 100%, better still from 95 to 100%.
  • the colloidal phase contains from 80 to 100% of total phosphorus (PO 3 ' ions, HPO 4 2 “ and H 2 PO 4 " total), preferably from 90 to 100%, better still from 95 to 100%. weight.
  • the calcium concentration of the dispersion is easily adjustable, according to the invention, by elimination of part of the continuous aqueous phase.
  • the elimination of part of the aqueous phase can be carried out by ultrafiltration.
  • the colloidal dispersion of the invention has a concentration greater than 0.25 M in calcium in the form of colloids with apatitic structure, preferably greater than 0.5 M, advantageously greater than 1 M, this concentration possibly reaching 5M.
  • the pH of the colloidal dispersion of the invention varies between 5 and 9.5, better still between 6.5 and 8.5, for example between 6 and 8.
  • the invention relates to a process for preparing a stable aqueous colloidal dispersion, comprising the steps consisting in: a) bringing into contact, in aqueous solution, a source of Ca 2+ cations, and a source of PO 4 anions 3 " and an amino acid as stabilizing agent or a salt thereof with an acid or a base, at a pH between 5 and 10, the respective amounts of the source of Ca 2+ and of the source of PO 4 3 " anions being such that the Ca 2+ / P molar ratio varies between 1 and 3.5, preferably between 2 and 3.2, the amount of agent stabilizer being such that the stabilizing agent / Ca molar ratio varies between 0.3 and 2.5, preferably between 0.9 and 2; b) allow the solution thus obtained to mature at a temperature of between
  • source of PO 4 3 anions is meant a compound capable of releasing PO 4 3" ions in aqueous solution.
  • Examples of a source of Ca 2+ cations are calcium hydroxide, calcium oxides, water-soluble calcium salts.
  • Examples of calcium salts are the salts having for anion PF 6 “ , PCI 6 “ , BF 4 “ , BCI 4 “ , SbF 6 “ , BPh 4 “ , CIO 4 “ , CF 3 SO 3 " and more generally the carboxylates derivatives of C 2 -C 10 alkylcarboxylic acids and in particular acetate.
  • Other salts are calcium halides, calcium hydrogen carbonate and calcium nitrate.
  • those which can be used in the context of the invention are those having a water solubility sufficient to ensure the desired concentration of Ca 2+ in the aqueous phase.
  • the source of Ca 2+ cations is chosen from calcium hydroxide, calcium oxides, calcium halides, calcium nitrate, and calcium hydrogen carbonate.
  • the source of PO 3 " anions is the salt of a PO 3" anion, the salt of an HPO 2 " anion or the salt of an H 2 PO 4 " anion such as ammonium salt, or an alkali metal salt or a mixture of these salts.
  • n varies from 2 to 10 (and in particular the salts of the tripolyphosphate type) or else the salts of the trimetaphosphate anion (PO 3 ) 3 3 ⁇ , or the salts of the pyrophosphate anion (P2 ⁇ 7 ) 4 " .
  • an acid or a base preferably an acid or a mineral base
  • the bases and acid which can be used are those generally used in the art.
  • NH 4 OH or NaOH will be used.
  • acids which can be used are in particular HCI, H 2 SO, H 3 PO or HNO 3 .
  • HNO 3 or HCI will be used.
  • a buffer operating in the desired range can be used.
  • a buffer ensuring a pH of 6.5 to 9 is preferably used.
  • a buffer consisting of an aqueous solution of potassium dihydrogen phosphate (0.025M) and sodium hydrogen phosphate (0.025M) may be mentioned , which ensures a pH of 6.86 at 25 ° C.
  • the contacting of the sources with an aqueous medium can be carried out in any way.
  • the relative proportions of the compounds used respectively as a source of Ca 2+ and of PO 3 " are calculated so that the Ca / P molar ratio is between 1 and 3.5, preferably between 2 and 3.2.
  • the Ca / P molar ratio takes into account all of the Ca 2+ cations introduced and all of the phosphorus introduced into the solution, whether the phosphorus is in the form H 3 PO 4 , H 2 PO 4 3 " , HPO 4 2" or PO 4 3 ' .
  • the stabilizing agent is added either to the aqueous solution of Ca 2+ , or to the aqueous solution of PO 4 3 " , or to the two aqueous solutions, in which case the respective proportion of stabilizing agent added to each solution is arbitrary.
  • the stabilizing agent is added to the aqueous Ca 2+ solution.
  • the amount of stabilizing agent to be added to the total is defined so that the stabilizing agent / Ca molar ratio varies between 0.3 and 2.5, preferably between 0.9 and 2.
  • the amount of stabilizing agent used affects the dimensions of the colloids ultimately obtained. It is in particular by controlling this parameter that it is possible to obtain transparent aqueous dispersions.
  • a molar ratio of the stabilizing agent to Ca 2+ of between 1.0 and 2 leads in particular to transparent dispersions.
  • the next step consists in mixing the two aqueous solutions, this mixture being used in a conventional manner with stirring.
  • the pH of the two solutions is adjusted beforehand before mixing.
  • This pH can be adjusted between 5 and 11, preferably between 7 and 9.5.
  • the concentration of Ca 2+ cations in the solution is between 0.2 M and 2 M, preferably between 0.2 and 1 M; the concentration of PO 4 3 " , HPO 2" and H 2 PO 4 " ions total varies between 0.1 M and 1 M, preferably between 0.1 and 0.5 M; and the concentration of stabilizing agent is between 0 , 1 M and 3 M.
  • the mixing can be carried out either by adding the solution of the source of Ca 2+ possibly containing the stabilizing agent, to the solution of the source of PO 3 " possibly containing the stabilizing agent or vice versa.
  • This addition can be carried out instantaneously or gradually and at a constant rate.
  • this addition can be performed over a period of 15 min to 6 hours, preferably from 15 min to 4 hours, advantageously from 15 min to 1 hour.
  • the PO 4 3 " source solution will be gradually added to the Ca 2+ source solution containing the stabilizing agent.
  • Appropriate sources consist of the hydroxides of these metals or of the salts of these metals, such as halides or nitrates.
  • the metal cation is the cation of a lanthanide
  • the contacting of the source of Ca 2+ with the source of PO 4 3 " generally takes place at ambient temperature, for example between 15 and 30 ° C.
  • Step b) of the process of the invention is a maturing step during which the mixture of the two solutions is left to stand or stirred, the time necessary to observe the formation of colloids.
  • step b) the colloidal dispersion resulting from step a) which is a milky dispersion evolves towards a colloidal dispersion, stable with respect to decantation.
  • This ripening stage can be carried out at room temperature (15-30 ° C) or at a higher temperature, namely up to 180 ° C. Thus, generally, the temperature is fixed at this stage between 15 and 180 ° C, better still between 40 and 160 ° C.
  • the ripening is carried out in a closed enclosure at a temperature below 100 ° C. and in an autoclave at a temperature above 100 ° C.
  • the colloids obtained When the ripening step is carried out at a temperature below 100 ° C., in a closed enclosure, the colloids obtained preferably have an anisotropic morphology. Conversely, when one operates in an autoclave at a temperature above 100 ° C., one obtains a mixture of colloids with anisotropic morphology and colloids with isotropic morphology.
  • the ripening stage is preferably carried out in a closed enclosure.
  • the dispersion, conditioned in a closed enclosure, can be placed directly in an oven previously brought to the set temperature or undergo a temperature ramp up to the set temperature, the rate of temperature rise preferably varying between 0.1 ° C. / min and 10 ° C / min.
  • the ripening is carried out at various temperatures.
  • a first stage of ripening is carried out at a first temperature between 20 and 180 ° C.
  • a second stage of ripening is carried out at a second temperature, said second temperature also being between 20 and 180 ° C.
  • the second temperature is higher than said first temperature.
  • the ripening time varies depending on the operating conditions and more particularly on the temperature. Usually, the ripening time varies between 15 min and 24 hours.
  • the continuous phase of the colloidal dispersion can contain different species such as NH 4 + , Na + , K + , CI “ , NO 3 ' and SO 4 2" .
  • These ions come either from sources of calcium and PO 3 " , or from acids and mineral bases used for pH adjustments.
  • the continuous phase of the colloidal dispersion may also contain stabilizers in neutral form or in ionized form, not in interaction with the surface of the colloids, that is to say completely free, or in interaction with Ca 2+ ions present in the continuous phase of the dispersion. It is difficult to avoid the presence of various calcium or phosphorous species as well as the presence of the stabilizing agent within the aqueous continuous phase or alongside colloids with apatitic structure, so that it may be necessary to carry out a purification, for example by washing the dispersion.
  • This washing can be carried out in a conventional manner per se, by ultrafiltration or dialysis.
  • Ultrafiltration can be carried out in particular in air or in an atmosphere of air and nitrogen or even under nitrogen. It preferably takes place with water whose pH is adjusted to the pH of the dispersion and is, for example, implemented using 3 kD or 15 kD membranes.
  • the pH of the final dispersion may be adjusted between 6 and 8.
  • the size of the colloids can be determined by photometric counting from an analysis by METHR (Transmission Electron Microscopy at METHR).
  • the structure of the colloids and in particular their more or less significant degree of aggregation can be determined by cryo-transmission electron microscopy by following the Dubochet method.
  • the average length (in number) of the oblong colloids varies between 20 and 250 nm and their equivalent aspect ratio (ratio of the average length (in number) to the equivalent diameter) varies between 1 and 300.
  • colloidal dispersions of the invention can be used in multiple applications, as such, or after isolation of the colloids with apatitic structure to form porous materials.
  • colloidal dispersions of the invention can also be used after preparation of an emulsion by addition of an oily phase.
  • colloidal dispersions or porous materials examples are the separation and purification of proteins, use in prostheses and use in sustained release systems.
  • the isolation of the colloids can be carried out in a manner known per se: simple evaporation at room temperature, evaporation under vacuum, evaporation at temperature above 100 ° C., by ultracentrifugation or preferably drying-atomization.
  • Spray drying can be described as atomizing the colloidal dispersion by means of a nozzle in a temperature enclosure.
  • industrial spray dryers are the Niro or Buchi type spray dryers.
  • the redispersible colloids are obtained for outlet temperatures below 150 ° C.
  • the invention relates to colloids of apatitic structure redispersible in water which can be obtained by using steps consisting in: a) preparing a colloidal dispersion by implementing the method described above; b) isolating the colloids from the colloidal dispersion resulting from step a), in a manner known per se, and preferably by centrifugation.
  • the hydroxyapatite colloids obtained can be used in the treatment of osteoporosis, cramps, colitis, bone fractures, insomnia, as well as in dental hygiene.
  • Hydroxyapatite colloids can be used in the preparation of hydroxyapatite films, absorbent materials with high specific surface and high pore volume, encapsulation materials and catalytic materials, but also in the field of luminescence.
  • colloids of the aqueous dispersions of the invention can be isolated simply by ultracentrifugation. These colloids can present, bound or adsorbed, on their surface, a certain amount of stabilizing agent. The amount of stabilizing agent present can be determined by chemical determination.
  • the determination of the mass percentage of Ca of the colloids is carried out from the colloids isolated by centrifugation and dried at room temperature for 7 days, in the following manner.
  • the dried colloids are dissolved by microwave attack with HNO 3 / HF / H 2 O 2 .
  • the determination of Ca is then carried out by ICP / AES atomic emission by plasma induced on a Jobin Yvon Ultima device.
  • the principle is an excitation of atoms in an argon plasma, with emission of photons of different wavelengths.
  • a grating spectrometer allows the separation of wavelengths and the detection is carried out by a photo multiplier.
  • a mass percentage of carbon on the colloids recovered by ultracentrifugation and dried at room temperature for 7 days is determined by analysis with LECO CS-044. Oxidation is carried out in the presence of the product catalyst in an induction furnace under oxygen scavenging.
  • the detection and integration of CO 2 peaks is carried out by infrared.
  • the colloidal dispersion obtained is transparent to the naked eye.
  • Colloidal dispersions transparent to the naked eye are formed from poorly aggregated, well-individualized colloids.
  • at least 80% by number of the colloids, preferably at least 90% and advantageously at least 95% by number, are not aggregated.
  • This state of aggregation can be viewed by transmission electron cryomicroscopy, according to the Dubochet method. This method allows observation by transmission electron microscopy (TEM) of samples kept frozen in their natural environment which is either water or organic diluents. Freezing is carried out on thin films about 50 to 100 nm thick, either in liquid ethane for the aqueous samples, or in liquid nitrogen for the others.
  • TEM transmission electron microscopy
  • Freezing is carried out on thin films about 50 to 100 nm thick, either in liquid ethane for the aqueous samples, or in liquid nitrogen for the others.
  • Cryo MET the dispersion state of the particles is well preserved and representative of that present in the real
  • the invention relates to transparent colloidal dispersions formed from colloids of oblong shape with an average length (in number) of 20 to 150 nm or of spherical shape with a diameter of 10 to 100 nm, in which at least 80% of the colloids are not aggregated, the molar ratio of the stabilizing agent to the total calcium present in the colloids or at the surface of the colloids varies between 0.001 and 1, preferably between 0.01 and 0.5, the pH of the colloidal dispersion being between 5 and 9.5.
  • the stabilizing agent is chosen from alanine and lysine, optionally ionized, and a mixture of these compounds.
  • the molar ratio of the stabilizing agent to calcium is preferably greater than 0.5: 1, better still greater than 1: 1;
  • the pH is preferably between 5 and 9.5, better still between 7 and
  • the stabilizing agent is composed of one or more amino acids optionally in ionized form, preferably it is chosen from lysine, alanine and their ionized forms; d) bringing the source of Ca 2+ cations into contact with the source of anions
  • the stabilizing agent is produced by adding the solution from the source of PO 3" to the solution of the source of Ca 2+ , which contains the stabilizing agent or vice versa.
  • the invention relates to the transparent dispersions which can be obtained by implementing the method of the invention in which one or more of the parameters a) to d) above have been retained.
  • M denotes the molecular mass
  • a solution A is prepared by adding 25.4 ml of 0.98 M phosphoric acid, or 25 millimoles of phosphorus, to a beaker. We dilute with water demineralized to a final volume of 60 cm 3 . It is adjusted to pH 9 by the addition of 6 cm 3 of concentrated ammonia 10.5 M. It is made up to 75 cm 3 with demineralized water.
  • the molar ratio (Lysine: Ca) is 2.
  • Solution A is added instantaneously to solution B at room temperature.
  • the Ca / P ratio is equal to 3.
  • the mixture is left stirring for 15 min at room temperature.
  • the pH is pH 9.1.
  • the mixture is transferred to a closed enclosure (Parr spray, Teflon container) and the mixture is brought to an oven previously brought to a temperature of 120 ° C.
  • the duration of ripening is 16 hours.
  • a transparent colloidal dispersion is obtained, the calcium concentration of which is 0.5 M and perfectly stable over time with respect to decantation.
  • the well individualized colloids consist of a population of objects having an anisotropic morphology of average length of approximately 50 nm and equivalent diameter of approximately 10 nm and a second population of more isotropic morphology, spheres type, of diameter about 10 nm.
  • Solution A is prepared by adding 50.8 ml of 0.98 M phosphoric acid, or 50 millimoles of phosphorus, to a beaker. Diluted with demineralized water to a final volume of 120 cm 3 . It is adjusted to pH 9 by the addition of 12 cm 3 of concentrated ammonia 10.5 M. It is made up to 150 cm 3 with demineralized water.
  • Solution A is added instantaneously to solution B at room temperature.
  • the Ca / P ratio is equal to 3.
  • the pH is 8.6. Adjusted to pH 9 with 6 cm 3 of concentrated ammonia 10.5 M.
  • the mixture is left stirring for 15 min at room temperature.
  • the mixture is transferred to a closed enclosure and the mixture is allowed to mature at room temperature of 25 ° C. After 16 hours, a transparent colloidal dispersion is obtained.
  • a transparent colloidal dispersion is obtained, the calcium concentration of which is 0.5 M, perfectly stable with respect to decantation over time.
  • Solution A is prepared by adding 50.8 ml of 0.98 M phosphoric acid, or 50 millimoles of phosphorus, to a beaker. Diluted with demineralized water to a final volume of 120 cm 3 . It is adjusted to pH 9 by the addition of 12 cm 3 of concentrated ammonia 10.5 M. It is made up to 150 cm 3 with demineralized water.
  • the mixture is made up to 130 cm 3 with demineralized water.
  • the pH is 5.2.
  • the pH is adjusted to 9 by adding 12 cm 3 of 10.5 M ammonia and the mixture is made up to 150 cm 3 with demineralized water.
  • the molar ratio (glycine: Ca) is equal to 2.
  • Solution A is instantaneously added to solution B at room temperature.
  • the Ca / P ratio is equal to 3.
  • the pH is 8.9.
  • the mixture is left stirring for 15 min at room temperature.
  • the mixture is transferred to a closed enclosure and the mixture is brought to an oven previously brought to a temperature of 80 ° C.
  • the duration of ripening is 16 hours.
  • a colloidal dispersion is obtained, the calcium concentration of which is 0.5 M.
  • colloids made up of a population of objects having an anisotropic morphology of average length of approximately 150 nm and equivalent diameter of approximately 10 nm.
  • EXAMPLE 4 A solution A is prepared by adding 25.4 ml of 0.98 M phosphoric acid, or 25 millimoles of phosphorus, to a beaker. Adjusted to pH 9 by adding 5.5 cm 3 of concentrated ammonia 10.5 M. It is made up to 75 cm 3 with demineralized water.
  • the pH is 3.6.
  • the pH is adjusted to 9 by adding 10 cm 3 of 10.5 M ammonia and the mixture is made up to 75 cm 3 with demineralized water.
  • the molar ratio (asparagine: Ca) is equal to 2.
  • Solution A is added instantly to solution B at room temperature.
  • the Ca / P ratio is equal to 3.
  • the pH is 8.9.
  • the mixture is left stirring for 15 min at room temperature.
  • the mixture is transferred to a closed enclosure and the mixture is brought to an oven previously brought to a temperature of 80 ° C.
  • the duration of ripening is 16 hours.
  • a colloidal dispersion is obtained, the calcium concentration of which is 0.5 M.
  • To 100 cm 3 of the dispersion obtained are added 200 cm 3 of demineralized water.
  • Ultrafilter on a 3 KD membrane up to 100 cm 3 . We start the operation again.
  • EXAMPLE 5 A solution A is prepared by adding to a beaker 50.8 ml of 0.98 M phosphoric acid, ie 50 millimoles of phosphorus which is diluted with demineralized water to a final volume of 120 cm. 3 . The pH is adjusted to 9 by adding 24 cm 3 of 4 M NaOH. The mixture is made up to 150 cm 3 with demineralized water.
  • the mixture is made up to 120 cm 3 with demineralized water.
  • the pH is 5.6.
  • Solution A is added instantaneously to solution B at room temperature.
  • the Ca / P ratio is equal to 3.
  • the pH is 8.4. Adjusted to pH 9 with 7 cm 3 of NaOH 4M.
  • the mixture is left stirring for 15 min at room temperature.
  • the mixture is transferred to a closed enclosure and the mixture is allowed to mature at room temperature for 16 hours.
  • a transparent colloidal dispersion is obtained which is stable with respect to decantation over time, the calcium concentration of which is approximately 0.5 M.
  • a solution A is prepared by adding 25.4 ml of 0.98 M phosphoric acid, or 25 millimoles of phosphorus, to a beaker. It is adjusted to pH 9 by the addition of 6 cm 3 of concentrated ammonia 10.5 M. It is made up to 37.5 cm 3 with demineralized water.
  • a solution B is prepared by adding to a beaker 12.3 g of
  • Solution A is added instantaneously to solution B at room temperature.
  • the Ca / P ratio is equal to 3.
  • the mixture is left stirring for 15 min at room temperature.
  • the pH is 9.3.
  • the mixture is transferred to a closed enclosure (Parr spray, Teflon container) and the mixture is brought to an oven previously brought to a temperature of 80 ° C.
  • the duration of ripening is 16 hours.
  • a transparent colloidal dispersion is obtained, the calcium concentration of which is 1.0 M and perfectly stable over time with respect to decantation.
  • a solution A is prepared by adding 8.5 ml of 0.98 M phosphoric acid, or 8.33 millimoles of phosphorus, to a beaker, which is diluted to a final volume of 20 cm 3 . It is adjusted to pH 9 by addition of ammonia. It is made up to 25 cm 3 with demineralized water.
  • a solution B is prepared by adding 4.1 g of
  • Solution A is added instantaneously to solution B at room temperature.
  • the Ca / P ratio is equal to 3.
  • the mixture is left stirring for 15 min at room temperature.
  • the pH is 9.1.
  • the mixture is transferred to a closed enclosure (Parr spray, Teflon container) and the mixture is brought to an oven previously brought to a temperature of 80 ° C.
  • the duration of ripening is 16 hours.
  • a transparent colloidal dispersion is obtained, the calcium concentration of which is 0.5 M and perfectly stable over time with respect to decantation.
  • the well-individualized colloids are visualized.
  • the well-individualized colloids are made up of a population of objects having an anisotropic morphology with an average length of around 80 nm and an equivalent diameter of around 10 nm.

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Abstract

La présente invention concerne une dispersion colloïdale aqueuse stable de colloïdes à structure apatitique, présentant un pH compris entre 5 et 10, formée de colloïdes de forme oblongue d'une longueur moyenne (en nombre) comprise entre 20 et 250 nm et d'un rapport d'aspect équivalent (rapport de la longueur moyenne (en nombre) au diamètre équivalent) compris entre 1 et 300 ou bien de forme sphérique présentant un diamètre compris entre 10 et 100 nm, et comprenant un ou plusieurs acides aminés éventuellement sous forme ionisée, en tant qu'agent stabilisant lesdits colloïdes à structure apatitique ayant pour formule (I): Ca10-x (HPO4)x (PO4)6-x (J)2-x, dans laquelle: x et J sont tels que définis à la revendication 1.

Description

Dispersions d'hydroxyapatite comprenant un acide aminé en tant qu'agent stabilisant, et leur procédé de préparation
La présente invention a trait à des dispersions colloïdales aqueuses stables de colloïdes à structure apatitique dans laquelle les colloïdes, de forme oblongue ou sphérique, présentent des dimensions nanométriques.
Ces dispersions sont stabilisées par des agents stabilisants de type acide aminé, éventuellement sous forme ionisée, en interaction avec la surface des colloïdes. Ces colloïdes de forme oblongue sont sous forme plus ou moins agrégée, et présentent une longueur moyenne (en nombre) généralement comprise entre 20 et 250 nm et d'un rapport d'aspect équivalent (rapport de la longueur moyenne (en nombre) au diamètre équivalent) compris entre 1 et 300.
Les colloïdes de forme sphérique présentent un diamètre compris entre 10 et 100 nm, de préférence entre 10 et 60 nm, par exemple entre 10 et 40 nm.
Par dispersion colloïdale aqueuse, on entend généralement un système constitué d'une phase aqueuse continue dans laquelle sont dispersées de fines particules solides de dimensions colloïdales, lesdites fines particules définissant des colloïdes à la surface desquels peuvent être liées ou adsorbées des molécules d'un agent stabilisant ou diverses espèces ioniques présentes dans la phase aqueuse continue.
Par colloïdes à structure apatitique, on entend selon l'invention des colloïdes de formule générale :
Ca10-x (HPO4)x (PO4)6-x (J)2-x (I) dans laquelle : x est choisi parmi 0, 1 ou 2 ;
J est choisi parmi OH", F", CO3 2" et ou CI" et dans laquelle certains ions phosphate (PO4 3") ou hydrogénophosphate (HPO4 2") peuvent être remplacés par des ions carbonate (CO3 2"), et dans laquelle certains cations Ca2+ peuvent être remplacés par des cations métalliques Mn+ de métaux alcalins, alcalino-terreux ou de lanthanides où n représente 1 , 2 ou 3, étant entendu que le rapport molaire du cation Mn+, lorsqu'il est présent, à Ca2+, varie entre 0,01 :0,99 et 0,25:0,75, et que la substitution d'ions HPO4 2" ou d'ions PO4 3' par des ions CO3 2", l'incorporation d'ions CO3 2" en tant que J et la substitution de cations Ca2+ par des cations métalliques est réalisée de manière à satisfaire l'équilibre électronique, en particulier avec créations de lacunes.
De façon particulièrement préférée, lorsque Ca2+ est remplacé par un cation de métal alcalin, celui-ci est Na+. Lorsque Ca2+ est remplacé par un cation de métal alcalino-terreux, celui-ci est Sr2*. Lorsque Ca2+ est remplacé par un cation de lanthanide, celui-ci est préférablement Eu3+, Eu2+, Dy3+ ou Tb3+.
Plus généralement, on entend par lanthanide les éléments du groupe constitué par l'yttrium et par les éléments de la classification périodique de numéro atomique compris de façon inclusive entre 57 et 71 . La classification périodique des éléments à laquelle il est fait référence dans la présente description est celle publiée dans le supplément au bulletin de la Société Chimique de France n° 1 (janvier 1966).
Lorsque x = 0, les colloïdes sont des colloïdes d'hydroxyapatite. Lorsque x = 1 , les colloïdes sont des cristaux de phosphate tricalcique apatitique et lorsque x = 2, les colloïdes sont des cristaux de phosphate octocalcique.
L'expression colloïdes à structure apatitique englobe également des colloïdes obtenus par hydrolyse des colloïdes de formule I ci-dessus.
Dans le cas du phosphate octocalcique, on obtient après hydrolyse un colloïde de formule Ca8(HPO4)2,5 (PO4)3,5 OH0,5. Dans la formule ci-dessus, on préfère qu'aucun cation Ca2+ ne soit remplacé par un cation métallique Mn+. Toutefois, lorsque certains cations Ca2+ sont effectivement remplacés par des cations métalliques Mn+, alors on préfère que le rapport molaire Mπ+/Ca2+ varie entre 0,02/0,98 et 0,15/0,85.
Les colloïdes à structure apatitique sont généralement obtenus par mise en contact, en solution aqueuse, d'une source de Ca2+ et d'une source de PO 3" dans une plage de pH appropriée.
Conventionnellement, on obtient des colloïdes à structure apatitique dont il est difficile de contrôler et limiter la croissance. Les cinétiques de formation des particules sont souvent très élevées, de telle sorte qu'il est difficile d'arrêter la polycondensation minérale au stade de particules nanométriques. On obtient donc généralement in fine des particules de taille trop importante présentant une forte tendance à la décantation. L'invention fournit, selon un premier de ses aspects, un procédé permettant de contrôler la croissance des colloïdes à structure apatitique et conduisant à des dispersions colloïdales stables constituées de colloïdes de dimensions nanométriques.
Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne des dispersions colloïdales stables, aqueuses, de colloïdes à structure apatitique, formées de colloïdes relativement fins, de forme oblongue, d'une longueur moyenne (en nombre) comprise entre 20 et 250 nm et d'un rapport d'aspect équivalent (rapport de la longueur (en nombre) moyenne au diamètre équivalent) compris entre 1 et 300, ou bien de forme sphérique présentant un diamètre compris entre 10 et 100 nm. Ces dispersions sont généralement formées de colloïdes faiblement agrégés. Dans le cas de colloïdes à faibles dimensions et faiblement agrégés, les dispersions de l'invention sont transparentes à l'œil nu.
Par colloïdes faiblement agrégés, on entend un pourcentage en nombre d'objets parfaitement individualisés supérieur à 80%, de préférence supérieur à 90%, avantageusement supérieur à 95%.
Plus précisément, l'invention a trait à une dispersion colloïdale aqueuse stable de colloïdes à structure apatitique, présentant un pH compris entre 5 et 10, constituée de colloïdes de forme oblongue d'une longueur moyenne (en nombre) comprise entre 20 et 250 nm et d'un rapport d'aspect équivalent (rapport de la longueur moyenne (en nombre) au diamètre équivalent) compris entre 1 et 300, ou bien de forme sphérique présentant un diamètre compris entre 10 et 100 nm, et comprenant un ou plusieurs acides aminés éventuellement sous forme ionisée en tant qu'agent stabilisant; lesdits colloïdes à structure apatitique ayant pour formule : Caι0-x (HPO4)x (PO4)6-x (J)2-x (IV) dans laquelle : x est choisi parmi 0, 1 ou 2 ;
J est choisi parmi OH", F", CO3 2" ou CI" ; et dans laquelle certains ions phosphate (PO4 3") ou hydrogénophosphate
(HPO4 2") peuvent être remplacés par des ions carbonate (CO3 2") ; et dans laquelle certains Ca2+ peuvent être remplacés par des cations métalliques Mπ+ de métaux alcalins, alcalino-terreux ou de lanthanides où n représente 1 , 2 ou 3, étant entendu que le rapport molaire du cation Mπ+, lorsqu'il est présent, à Ca2+, varie entre 0,01 :0,99 et 0,25:0,75, et que la substitution d'ions HPO4 2" ou d'ions PO 3" par des ions CO3 2", l'incorporation d'ions CO3 2" en tant que J et la substitution de cations Ca2+ par des cations métalliques est réalisée de manière à satisfaire l'équilibre électronique, en particulier avec créations de lacunes.
Dans le cadre de l'invention, on entend par colloïdes de forme oblongue des colloïdes de forme parallélépipédique (par exemple en forme de bâtonnet) ou de forme aciculaire. Dans le cas des colloïdes de forme parallélépipédique, le diamètre équivalent est le diamètre qu'aurait le colloïde de forme aciculaire correspondant de même volume moyen et de même longueur moyenne.
Le diamètre équivalent attribué à la section droite du colloïde aciculaire correspond au diamètre d'une section droite moyenne. Les colloïdes de forme oblongue sont formés de colloïdes à structure apatitique faiblement agrégée. De façon générale, les colloïdes de forme oblongue présentent une longueur moyenne (en nombre) comprise entre 20 et
250 nm et un diamètre équivalent compris entre 0,5 et 20 nm.
On distingue plus particulièrement les colloïdes en forme de fibres aciculaires dont la longueur moyenne varie généralement entre 20 et 250 nm et le diamètre équivalent est compris entre 0,5 et 5 nm ; et les colloïdes en forme de bâtonnets dont la longueur moyenne varie généralement entre 20 et 250 nm et le diamètre équivalent est compris entre 5 et 20 nm.
Les colloïdes sphériques ont un diamètre généralement compris entre 10 et 100 nm, preférablement compris entre 10 et 60 nm, mieux encore compris entre 10 et 40 nm.
Les dispersions de l'invention sont soit uniformément formées de colloïdes de forme oblongue, soit uniformément formées de colloïdes sphériques, soit encore formées d'un mélange de colloïdes de forme oblongue et de forme sphérique.
Les colloïdes à structures apatitiques synthétisés sont de préférence des colloïdes de formule (I) dans laquelle x = 0, mieux encore des colloïdes de formule : Ca10 (PO4)6 (OH)2.
Plus précisément, on préfère que dans la formule (I), J représente OH" ou/et F". Il n'est pas nécessaire que tous les ions OH" soient remplacés par des ions F" mais seule une partie des ions OH" peut être remplacée par des ions F".
De même, lorsque J est choisi parmi OH", F", CO3 2" et CI", il n'est pas nécessaire que tous les J soient identiques entre eux.
La stabilisation de la dispersion colloïdale est obtenue par action d'un agent stabilisant. L'agent stabilisant contribue non seulement à assurer la stabilisation de la dispersion mais également à contrôler la croissance des colloïdes à structure apatitique lors de la préparation de la dispersion aqueuse. Dans le cadre de l'invention, l'agent stabilisant est un acide aminé naturel ou synthétique, éventuellement sous forme ionisée ou un mélange de ces composés.
Les α-aminoacides comprennent un atome de carbone portant un groupe amino, un groupe carboxyle, un atome d'hydrogène et un groupe latéral qui peut être un atome d'hydrogène (cas de la glycine) ou un autre groupe organique monovalent quelconque.
Les groupes latéraux peuvent être notamment des groupes alkyle (cas de l'alanine, de la valine, de la leucine, de l'isoleucine et de la praline), des groupes alkyle substitués (cas de la thréonine, la serine, la méthionine, la cystéine, l'asparagine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la glutamine, l'arginine et la lysine), des groupes arylalkyle (cas de la phénylalanine et du tryptophane), des groupes arylalkyle substitués (cas de la tyrosine), des groupes hétéroalkyle (cas de l'histidine).
Ces α-aminoacides sont notamment répertoriés dans Harper et al (1977) Review of Physiological Chemistry, i6eme édition, Lange Médical Publications, pages 21-24.
Selon l'invention, l'expression acide aminé comprend également les β-, γ-, δ- et ω-aminoacides. Par α-aminoacide de synthèse, on entend un α-aminoacide qui n'est pas incorporé dans une protéine sous le contrôle d'ARNm tel que par exemple un α- aminoacide fluoré tel que la fluoroalanine, la triméthylsilylalanine ou un α- aminoacide tel que :
où ni est un entier de 1 à 6 et n2 est un entier de 1 à 12.
Des aminoacides synthétiques sont par ailleurs décrits dans Williams (ed), Synthesis of Optically Active α-Amino Acids, Pergamon Press (1989) ; Evans et al, J. Amer. Chem. Soc. 112, 4011-4030 (1990) ; Pu et al, J. Amer. Chem. Soc.
56, 1280-1283 (1991 ) ; on Williams et al, J. Amer. Chem. Soc, 113, 9276-9286
(1991 ).
Les acides aminés utilisables comme agents de stabilisation sont soit sous leur forme L, soit sous leur forme D, soit encore sous forme de mélange racémique.
Plus généralement, un groupe préféré d'α-aminoacide est constitué des composés de formule :
W-NH-CH-COOH
I
L dans laquelle
L représente un groupe alkyle éventuellement interrompu par un atome d'oxygène et/ou un atome de soufre et/ou un atome d'azote, ledit atome d'azote étant porteur d'un atome d'hydrogène ou d'un radical alkyle, aryle, arylalkyle, alkylaryle, hétéroaryle ou hétéroarylalkyle, et ledit groupe alkyle étant éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux choisis parmi -OH, -NH2, guanidino, carboxy, carbamoyle, thiol, aryle (lui-même éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux T, identiques ou différents, tels que définis ci- dessous), héteroaryle (lui-même éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux T, identiques ou différents tels que définis ci-dessous) ;
W représente un atome d'hydrogène ou bien L et W représentent ensemble une chaîne alkylène éventuellement substituée ;
T représente hydroxy, amino, guanidino, carboxy, thiol, alkylthio, alkylamino, carbamoyle, dialkylamino, aryle, arylalkyle, alkylaryle, héteroaryle, alkylhétéroaryle ou hétéroarylalkyle.
Par alkylène, on entend une chaîne hydrocarbonée aliphatique, linéaire ou ramifiée.
Les substituants de la chaîne alkylène sont choisis parmi les groupes T définis ci-dessus. Par alkyle, on entend généralement une chaîne hydrocarbonée aliphatique ramifiée ou linéaire comportant de 1 à 18 atomes de carbone, preférablement de 1 à 10 atomes de carbone et notamment de 1 à 6 atomes de carbone.
Des exemples de radicaux alkyle sont les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, t-butyle, pentyle, isopentyle, néopentyle, 2- méthylbutyle, 1-éthylpropyle, hexyle, isohexyle, néohexyle, 1-méthylpentyle, 3- méthylpentyle, 1 ,1-diméthylbutyle, 1 ,3-diméthylbutyle, 2-éthylbutyle, 1-méthyl-1- éthylpropyle, heptyle, 1-méthylhexyle, 1-propylbutyle, 4,4-diméthylpentyle, octyle, 1 -méthylheptyle, 2-éthylhexyle, 5,5-diméthylhexyle, nonyle, décyle, 1- méthylnonyle, 3,7-diméthyloctyle et 7,7-diméthyloctyle. Plus particulièrement, alkyle représente méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, t-butyle, pentyle, isopentyle, néopentyle, 2-méthylbutyle, 1 - éthylpropyle, hexyle, isohexyle, néohexyle, 1-méthyl pentyle, 3-méthylpentyle, 1 ,1-diméthylbutyle, 1 ,3-diméthylbutyle, 2-éthylbutyle et 1 -méthyl-1 -éthylpropyle. Aryle désigne généralement un radical carbocyclique aromatique comportant de 6 à 18 atomes de carbone, de préférence de 6 à 10 atomes de carbone.
Aryle est mono- ou polycyclique et preférablement mono-, bi- ou tricyclique. Lorsque le radical carbocyclique comprend plus d'un noyau cyclique, les noyaux cycliques peuvent être condensés deux à deux ou rattachés deux à deux par des liaisons σ.
Des exemples de groupe aryle sont phényle, anthryle, naphtyle ou phénanthryle. Par héteroaryle on entend généralement des radicaux hétérocycliques comprenant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, S et N.
Les radicaux héteroaryle englobent les radicaux mono- et polycycliques ; de préférence les radicaux mono-, bi- ou tricycliques.
Dans le cas des radicaux polycycliques, il doit être entendu que ceux-ci sont constitués de monocycles condensés deux à deux (par exemple orthocondensés ou péricondensés), c'est-à-dire présentant au moins deux atomes de carbone en commun. De façon préférée, chaque monocycle comprend de 3 à 8 chaînons, mieux encore de 5 à 7.
De préférence, chacun des monocycles constituant l'hétérocycle comprend de 1 à 4 hétéroatomes, mieux encore de 1 à 3 hétéroatomes.
On distingue notamment :
- les hétérocycles monocycliques de 5 à 7 sommets tels que par exemple les hétéroaryles choisies parmi la pyridine, le furane, le thiophène, le pyrrole, le pyrrazole, l'imidazole, le thiazole, l'isoxazole, l'isothiazole, le furazane, la pyridazine, la pyrimidine, la pyrazine, les thiazines, l'oxazole, le pyrazole, l'oxadiazole, le triazole et le thiadiazole ;
- les héteroaryle bicycliques dans lesquels chaque monocycle comprend de 5 à 7 sommets, tels que par exemple choisis parmi indolizine, indole, isoindole, benzofuranne, benzothiophène, indazole, benzimidazole, benzothiazole, benzofurazane, benzothiofurazane, purine, quinoline, isoquinoline, cinnoline, phtalazine, quinazoline, quinoxaline, naphthyridines, pyrazolotriazine (tel que pyrazolo-1 ,3,4-triazine), pyrazolopyrimidine et ptéridine ; et
- les héteroaryle tricycliques dans lesquels chaque monocycle comprend de 5 à 7 sommets tels que par exemple l'acridine, la phénazine ou le carbazole. L'expression "éventuellement interrompue par O et/ou S et/ou N" signifie qu'un atome de carbone quelconque de la chaîne hydrocarbonée peut être remplacé par un atome d'oxygène et/ou de soufre et/ou d'azote, cet atome de carbone ne pouvant être situé à l'une des extrémités de ladite chaîne hydrocarbonée. La chaîne hydrocarbonée qui peut être alkyle, peut comprendre plusieurs atomes d'oxygène et/ou de soufre et/ou d'azote, de préférence les hétéroatomes étant séparés les uns des autres par au moins un atome de carbone, mieux encore par au moins deux atomes de carbone. Lorsque la chaîne alkylène est interrompue par un atome d'azote, on préfère que celui-ci soit porteur d'un atome d'hydrogène ou d'un groupe alkyle.
De manière particulièrement avantageuse, l'agent stabilisant utilisé est choisi parmi la lysine, la glycine, l'asparagine, la créatine, l'arginine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la serine, l'alanine, la valine, la leucine, leurs sels avec des acides ou des bases, et leurs mélanges.
De manière encore plus préférée, l'agent stabilisant est choisi parmi la lysine, la créatine, la glycine, l'alanine, l'asparagine, la serine, leurs sels avec des acides ou des bases, et leurs mélanges.
L'agent stabilisant peut également être le sel d'un acide aminé avec un base ou un acide, de préférence avec un acide ou une base inorganique.
Comme exemple d'acide inorganique, on peut citer les acides nitrique, phosphorique, phosphinique, phosphonique, chlorhydrique, sulfonique et sulfurique.
Comme exemple de base inorganique, on peut citer les bases de type hydroxyde de métal alcalin ou alcalino-terreux et hydroxyde d'ammonium.
L'agent de stabilisation peut être constitué d'un ou plusieurs acides aminés, éventuellement sous forme ionisée.
L'agent de stabilisation est généralement soit présent sous forme libre dans le milieu continu de la dispersion colloïdale, soit adsorbé ou lié à la surface des colloïdes, soit en interaction avec des ions Ca2+ présents dans la phase continue de la dispersion.
La phase colloïdale est majoritairement à structure apatitique telle que définie ci-dessus. Avantageusement, la structure apatitique représentent plus de 50% en poids de la phase colloïdale, preférablement plus de 75% en poids, mieux encore plus de 80%, par exemple plus de 85% en poids.
La phase colloïdale peut comprendre en outre d'autres structures, tels que Ca(H2PO4)2; CaHPO4; CaHPO4, 2H2O ou autre phase amorphe à base de calcium et de PO 3", HPO4 2" ou H2PO4 ' et OH". Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le rapport molaire du calcium total présent dans les colloïdes au phosphore total présent dans les colloïdes varie entre 1 ,3 et 1 ,7, mieux encore entre 1 ,5 et 1 ,67. Quant au rapport molaire de l'agent stabilisant total présent dans les colloïdes ou en surface des colloïdes au calcium total présent dans les colloïdes ou en surface des colloïdes, il varie entre 0,001 et 1 ,0, de préférence entre 0,01 et 0,5, avantageusement entre 0,01 et 0,1.
De manière particulièrement préférée, la phase colloïdale contient de 60 à 100% du calcium total, preférablement de 80 à 100%, par exemple de 90 à 100%, mieux encore de 95 à 100%.
De façon avantageuse, la phase colloïdale contient de 80 à 100% du phosphore total (ions PO 3', HPO4 2" et H2PO4 " totaux), preférablement de 90 à 100%, mieux encore de 95 à 100% en poids.
La concentration en calcium de la dispersion est facilement ajustable, selon l'invention, par élimination d'une partie de la phase aqueuse continue.
L'élimination d'une partie de la phase aqueuse peut être réalisée par ultrafiltration.
De manière préférée cependant, la dispersion colloïdale de l'invention présente une concentration supérieure à 0,25 M en calcium sous forme de colloïdes à structure apatitique, de préférence supérieure à 0,5 M, avantageusement supérieure à 1 M, cette concentration pouvant atteindre 5M.
Selon un mode préféré de l'invention, le pH de la dispersion colloïdale de l'invention varie entre 5 et 9,5, mieux encore entre 6,5 et 8,5, par exemple entre 6 et 8. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne un procédé de préparation d'une dispersion colloïdale aqueuse stable, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact, en solution aqueuse, une source de cations Ca2+, et une source d'anions PO4 3" et un acide aminé en tant qu'agent stabilisant ou d'un de sels avec un acide ou une base, à un pH compris entre 5 et 10, les quantités respectives de la source de Ca2+ et de la source d'anions PO4 3" étant telles que le rapport molaire Ca2+/P varie entre 1 et 3,5, de préférence entre 2 et 3,2, la quantité d'agent stabilisant étant telle que le rapport molaire agent stabilisant/Ca varie entre 0,3 et 2,5, de préférence entre 0,9 et 2 ; b) laisser mûrir la solution ainsi obtenue à une température comprise entre 15 et 150° C jusqu'à obtention d'une dispersion colloïdale. Par source de cations Ca2+, on entend un composé capable de libérer des ions Ca2+ en solution aqueuse.
Par source d'anions PO4 3", on entend un composé capable de libérer des ions PO4 3" en solution aqueuse.
Des exemples de source de cations Ca2+ sont l'hydroxyde de calcium, les oxydes de calcium, les sels de calcium hydrosolubles.
Des exemples de sels de calcium sont les sels ayant pour anion PF6 ", PCI6 ", BF4 ", BCI4 ", SbF6 ", BPh4 ", CIO4 ", CF3SO3 " et plus généralement les carboxylates dérivés d'acides alkylcarboxyliques en C2-Cιo et notamment l'acétate. D'autres sels sont les halogénures de calcium, l'hydrogénocarbonate de calcium et le nitrate de calcium. Parmi ces sels, ceux utilisables dans le cadre de l'invention sont ceux présentant une hydrosolubilité suffisante pour assurer la concentration souhaitée en Ca2+ en phase aqueuse.
De manière particulièrement préférée, la source de cations Ca2+ est choisie parmi l'hydroxyde de calcium, les oxydes de calcium, les halogénures de calcium, le nitrate de calcium, et l'hydrogénocarbonate de calcium.
A titre d'exemple, la source d'anions PO 3" est le sel d'un anion PO 3", le sel d'un anion HPO 2" ou le sel d'un anion H2PO4 " tel qu'un sel d'ammonium, ou un sel de métal alcalin ou un mélange de ces sels.
D'autres sources de PO 3" sont les sels des anions de type phosphate oligomère tels que les sels des polyphosphates (ou catena-polyphosphate) de formule générale :
dans laquelle n varie de 2 à 10 (et notamment les sels de type tripolyphosphate) ou encore les sels de l'anion trimétaphosphate (PO3)3 3~, ou les sels de l'anion pyrophosphate (P2θ7)4".
Comme source d'anions PO4 3", on peut également envisager d'utiliser l'acide H3PO4. De façon avantageuse, lorsqu'on utilise comme source de Ca2+, un oxyde de calcium ou un hydroxyde de calcium, il est souhaitable de sélectionner l'acide phosphorique comme source de PO 3".
La mise en présence de ces deux sources doit avoir lieu dans des conditions de pH bien déterminées pour conduire à la formation de colloïdes à structure apatitique recherchée : de façon générale, un pH compris entre 5 et 10, preférablement entre 5 et 9,5, mieux encore entre 7 et 9,2, convient bien.
Après mise en présence des deux sources en milieu aqueux, il peut donc s'avérer nécessaire d'ajuster le pH du milieu aqueux par addition à ce milieu d'un acide ou d'une base, de préférence un acide ou une base minérale.
Les base et acide utilisables sont ceux généralement utilisés dans la technique.
Comme bases utilisables, on peut citer NH4OH, KOH, NaOH, NaHCO3, Na2CO3, KHCO3 et K2CO3. De manière préférée, on utilisera NH4OH ou NaOH.
Des exemples d'acides utilisables sont notamment HCI, H2SO , H3PO ou HNO3. De manière préférée, on utilisera HNO3 ou HCI.
Pour l'ajustement du pH, un tampon opérant dans la gamme souhaitée peut être utilisé. On utilise de préférence un tampon assurant un pH de 6,5 à 9. Comme exemple particulièrement préféré, on peut mentionner un tampon constitué d'une solution aqueuse de dihydrogénophosphate de potassium (0,025M) et d'hydrogénophosphate de sodium (0.025M), lequel assure un pH de 6,86 à 25°C.
La mise en contact des sources eu milieu aqueux peut être réalisée de façon quelconque.
De façon préférée, il est recommandé de préparer dans un premier temps une solution aqueuse de la source de Ca2+ d'une part et une solution aqueuse de la source de PO4 3" d'autre part. Les proportions relatives des composés utilisés respectivement comme source de Ca2+ et de PO 3" sont calculées de façon à ce que le rapport molaire Ca/P soit compris entre 1 et 3,5, de préférence entre 2 et 3,2. Le rapport molaire Ca/P tient compte de la totalité des cations Ca2+ introduits et de la totalité du phosphore introduit dans la solution, que le phosphore soit sous forme H3PO4, H2PO4 3", HPO4 2" ou PO4 3'.
Puis l'agent stabilisant est ajouté soit à la solution aqueuse de Ca2+, soit à la solution aqueuse de PO4 3", soit aux deux solutions aqueuses, auquel cas la proportion respective d'agent stabilisant ajouté à chaque solution est quelconque.
De préférence, l'agent stabilisant est rajouté à la solution aqueuse de Ca2+.
La quantité d'agent stabilisant à ajouter au total est définie de façon à ce que le rapport molaire agent stabilisant/Ca varie entre 0,3 et 2,5, de préférence entre 0,9 et 2.
La quantité d'agent stabilisant utilisé joue sur les dimensions des colloïdes finalement obtenues. C'est notamment en contrôlant ce paramètre qu'il est possible d'aboutir à l'obtention de dispersions aqueuses transparentes. Un rapport molaire de l'agent stabilisant au Ca2+ compris entre 1 ,0 et 2 conduit notamment à des dispersions transparentes.
L'étape suivante consiste à mélanger les deux solutions aqueuses, ce mélange étant mis en oeuvre de façon conventionnelle sous agitation.
De façon préférée, on procède à un ajustement préalable du pH des deux solutions avant mélange. Ce pH peut être ajusté entre 5 et 11 , de préférence entre 7 et 9,5.
De façon avantageuse, après mélange, la concentration en cations Ca2+ dans la solution est comprise entre 0,2 M et 2 M, de préférence entre 0,2 et 1 M ; la concentration en ions PO4 3", HPO 2" et H2PO4 " totaux varie entre 0,1 M et 1 M, de préférence entre 0,1 et 0,5M ; et la concentration en agent stabilisant est comprise entre 0,1 M et 3 M.
Après mélange, il peut s'avérer nécessaire d'ajuster à nouveau le pH de la solution dans les conditions décrites ci-dessus.
Le mélange peut être réalisé soit par addition de la solution de la source de Ca2+ contenant éventuellement l'agent stabilisant, à la solution de la source de PO 3" contenant éventuellement l'agent stabilisant ou inversement.
Cette addition peut être réalisée de manière instantanée ou progressive et à débit constant. Dans le cas d'une addition à débit constant, cette addition peut être réalisée sur une période de 15 min à 6 heures, de préférence de 15 min à 4 heures, avantageusement de 15 min à 1 heure.
De préférence, on procédera à l'addition progressive de la solution de la source de PO4 3" à la solution de la source de Ca2+ contenant l'agent stabilisant. En vue de préparer des colloïdes dans lesquels certains des cations calcium sont remplacés par des cations métalliques, il est nécessaire d'ajouter au milieu réactionnel une ou plusieurs sources desdits cations métalliques. Des sources appropriées sont constituées par les hydroxydes de ces métaux ou des sels de ces métaux, tels que les halogénures ou des nitrates. Dans le cas où le cation métallique est le cation d'un lanthanide, il est préférable d'ajouter un sel dudit lanthanide à la solution réactionnelle, tel qu'un chlorure ou un nitrate. On ajoutera par exemple ce sel à la solution de la source de calcium avant son mélange à la source de PO4 3".
La mise en contact de la source de Ca2+ et de la source de PO4 3" a généralement lieu à température ambiante, par exemple entre 15 et 30° C.
L'étape b) du procédé de l'invention est une étape de mûrissement pendant laquelle on laisse le mélange des deux solutions au repos ou sous agitation, le temps nécessaire pour observer la formation de colloïdes.
A l'étape b), la dispersion colloïdale résultant de l'étape a) qui est une dispersion laiteuse évolue vers une dispersion colloïdale, stable vis à vis de la décantation.
Cette étape de mûrissement peut être conduite à température ambiante (15-30° C) ou à une température supérieure, à savoir jusqu'à 180° C. Ainsi, de façon générale, la température est fixée à cette étape entre 15 et 180° C, mieux encore entre 40 et 160° C.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le mûrissement est effectué en enceinte fermée à une température inférieure à 100°C et en autoclave à une température supérieure à 100°C.
Lorsque l'étape de mûrissement est mise en œuvre à une température inférieure à 100°C, en enceinte fermée, les colloïdes obtenus ont de préférence une morphologie anisotrope. A l'inverse, lorsque l'on opère en autoclave à une température supérieure à 100°C, on obtient un mélange de colloïdes à morphologie anisotrope et de colloïdes à morphologie isotrope.
L'étape de mûrissement est preférablement mise en œuvre dans une enceinte fermée.
La dispersion, conditionnée en enceinte fermée, peut être mise directement dans une étuve préalablement amenée à la température de consigne ou subir une rampe de température jusqu'à la température de consigne, la vitesse de montée en température variant preférablement entre 0,1 °C/min et 10°C/min.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le mûrissement est réalisé à diverses températures.
De manière préférée, une première phase du mûrissement est mise en œuvre à une première température comprise entre 20 et 180° C, et une deuxième phase de mûrissement est mise en œuvre à une seconde température, ladite seconde température étant également comprise entre 20 et 180° C. De façon avantageuse, la seconde température est supérieure à ladite première température.
Le temps de mûrissement varie en fonction des conditions opératoires et plus particulièrement de la température. Habituellement, le temps de mûrissement varie entre 15 min et 24 heures.
La phase continue de la dispersion colloïdale peut contenir différentes espèces telles que NH4 +, Na+, K+, CI", NO3 ' et SO4 2". Ces ions proviennent soit des sources de calcium et de PO 3", soit des acides et des bases minérales utilisés pour les ajustements de pH.
La phase continue de la dispersion colloïdale peut également contenir des agents de stabilisation sous forme neutre ou sous forme ionisée, non en interaction avec la surface des colloïdes, c'est-à-dire totalement libre, ou en interaction avec des ions Ca2+ présents dans la phase continue de la dispersion. II est difficile d'éviter la présence d'espèces calciques ou phosphorées diverses ainsi que la présence de l'agent de stabilisation au sein de la phase continue aqueuse ou au côté des colloïdes à structure apatitique, de telle sorte qu'il peut être nécessaire de procéder à une purification, par exemple par lavage de la dispersion.
Ce lavage peut être mis en oeuvre de façon conventionnelle en soi, par ultrafiltration ou dialyse. L'ultrafiltration peut être effectuée notamment sous air ou sous atmosphère d'air et d'azote ou encore sous azote. Elle se déroule de préférence avec une eau dont le pH est ajusté au pH de la dispersion et est par exemple mise en œuvre à l'aide de membranes 3 kD ou 15 kD.
Le cas échéant, on peut alors également procéder à une concentration de la dispersion par élimination d'une partie de la phase continue. La technique la plus appropriée pour ce faire est la technique d'ultrafiltration.
Le cas échéant, il peut être utile d'ajuster le pH de la dispersion finale par addition d'un acide ou d'une base, de préférence un acide ou une base inorganique tels que ceux définis ci-dessus. De façon avantageuse, le pH de la dispersion finale sera ajustée entre 6 et 8.
La taille des colloïdes peut être déterminée par comptage photométrique à partir d'une analyse par METHR (Microscopie Electronique par Transmission à
Haute Résolution). La structure des colloïdes et notamment leur degré plus ou moins important d'agrégation peut être déterminé par cryo-microscopie électronique à transmission en suivant la méthode Dubochet.
La longueur moyenne (en nombre) des colloïdes de forme oblongue varie entre 20 et 250 nm et leur rapport d'aspect équivalent (rapport de la longueur moyenne (en nombre) au diamètre équivalent) varie entre 1 et 300.
Concernant les colloïdes de forme sphérique, leur diamètre varie entre 10 et IOO nm. '
Les dispersions colloïdales de l'invention sont utilisables dans de multiples applications, telles quelles, ou après isolement des colloïdes à structure apatitique pour former des matériaux poreux.
Les dispersions colloïdales de l'invention peuvent également être utilisées après préparation d'une émulsion par addition d'une phase huileuse.
Des exemples d'application des dispersions colloïdales ou des matériaux poreux sont la séparation et la purification des protéines, l'utilisation dans des prothèses et l'utilisation dans des systèmes de libération prolongée. L'isolement des colloïdes peut être réalisé de façon connue en soi : simple évaporation à température ambiante, évaporation sous vide, évaporation à température supérieure à 100° C, par ultracentrifugation ou de préférence séchage-atomisation. Le séchage-atomisation peut être décrit comme une atomisation de la dispersion colloïdale au moyen d'une buse dans une enceinte en température. Des exemples de sécheurs-atomiseurs industriels sont les sécheurs-atomiseurs de type Niro ou Buchi. De préférence, les colloïdes redispersables sont obtenus pour des températures de sortie inférieures à 150° C. Ainsi, selon un autre de ses aspects, l'invention concerne les colloïdes de structure apatitique redispersables dans l'eau pouvant être obtenus par mise en œuvre des étapes consistant à : a) préparer une dispersion colloïdale par mise en œuvre du procédé décrit ci-dessus ; b) isoler les colloïdes de la dispersion colloïdale résultant de l'étape a), d'une façon connue en soi, et de préférence par centrifugation.
Dans le domaine pharmaceutique, les colloïdes d'hydroxyapatite obtenus sont utilisables dans le traitement de l'ostéoporose, des crampes, des colites, des fractures osseuses, de l'insomnie, ainsi qu'en hygiène dentaire. Les colloïdes d'hydroxyapatite peuvent être utilisés dans la préparation de films d'hydroxyapatite, de matériaux absorbants à haute surface spécifique et à haut volume poreux, de matériaux d'encapsulation et de matériaux catalytiques, mais également dans le domaine de la luminescence.
Les colloïdes des dispersions aqueuses de l'invention peuvent être isolés simplement par ultracentrifugation. Ces colloïdes peuvent présenter, liés ou adsorbés, à leur surface, une certaine quantité d'agent stabilisant. La quantité d'agent stabilisant présente peut être déterminée par dosage chimique.
La détermination du pourcentage massique de Ca des colloïdes est réalisée à partir des colloïdes isolés par centrifugation et séchés à température ambiante pendant 7 jours, de la manière suivante.
Les colloïdes séchés sont mis en solution par attaque micro ondes par HNO3/HF/H2O2. Le dosage de Ca est alors réalisé par ICP/AES émission atomique par plasma induit sur un appareil Jobin Yvon Ultima. Le principe est une excitation des atomes dans un plasma argon, avec émission des photons de longueurs d'ondes différentes. Un spectromètre à réseau permet la séparation des longueurs d'ondes et la détection est opérée par un photo multiplicateur. De même, un pourcentage massique en carbone sur les colloïdes récupérés par ultracentrifugation et séchés à température ambiante pendant 7 jours est déterminé par analyse au LECO CS-044. On réalise l'oxydation en présence de catalyseur du produit dans un four à induction sous balayage d'oxygène. On réalise la détection et l'intégration des pics CO2 par infrarouge.
On déterminé ainsi, à partir de ces analyses, un rapport massique expérimental C/Ca, et par calcul, le rapport molaire "agent de stabilisation/Ca" des colloïdes.
De manière particulièrement avantageuse, la dispersion colloïdale obtenue est transparente à l'œil nu. Les dispersions colloïdales transparentes à l'œil nu sont formées de colloïdes peu agrégés, bien individualisés. Pour ces dispersions transparentes, au moins 80% en nombre des colloïdes, de préférence au moins 90% et avantageusement au moins 95% en nombre, ne sont pas agrégés. Cet état d'agrégation peut être visualisé par Cryo-microscopie électronique à transmission, suivant la méthode Dubochet. Cette méthode permet d'observer par microscopie électronique à transmission (MET) des échantillons maintenus congelés dans leur milieu naturel qui est soit de l'eau, soit des diluants organiques. La congélation s'effectue sur des films minces d'environ 50 à 100 nm d'épaisseur, soit dans l'éthane liquide pour les échantillons aqueux, soit dans l'azote liquide pour les autres. Par Cryo MET, l'état de dispersion des particules est bien préservé et représentatif de celui présent dans le milieu réel. Pour ces dispersions, la longueur des colloïdes varie preférablement entre
20 et 150 nm, mieux encore elle est inférieure à 120 nm, avantageusement inférieure à 50 nm, et le diamètre des sphères varie entre 10 et 100 nm.
Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne des dispersions colloïdales transparentes formées de colloïdes de forme oblongue d'une longueur moyenne (en nombre) de 20 à 150 nm ou de forme sphérique d'un diamètre de 10 à 100 nm, dans laquelle au moins 80% des colloïdes ne sont pas agrégés, le rapport molaire de l'agent stabilisant au calcium total présent dans les colloïdes ou en surface des colloïdes varie entre 0,001 et 1 , de préférence entre 0,01 et 0,5, le pH de la dispersion colloïdale étant compris entre 5 et 9,5.
Plus preférablement, l'agent stabilisant est choisi parmi l'alanine et la lysine, éventuellement ionisée, et un mélange de ces composés. De façon à obtenir de telles dispersions aqueuses transparentes, il est souhaitable d'ajuster un ou plusieurs des paramètres de procédé de la façon suivante : a) le rapport molaire de l'agent stabilisant au calcium est preférablement supérieur à 0,5:1 , mieux encore supérieur à 1 :1 ; b) le pH est preférablement compris entre 5 et 9,5, mieux encore entre 7 et
9,5 ; c) l'agent stabilisant est composé d'un ou plusieurs acides aminés éventuellement sous forme ionisée, de préférence il est choisi parmi la lysine, l'alanine et leurs formes ionisées ; d) la mise en contact de la source de cations Ca2+, de la source d'anions
PO4 3" et de l'agent stabilisant est réalisée par addition de la solution de la source de PO 3" à la solution de la source de Ca2+, laquelle contient l'agent stabilisant ou inversement.
Aussi, selon un autre de ses aspects, l'invention concerne les dispersions transparentes pouvant être obtenues par mise en œuvre du procédé de l'invention dans lequel un ou plusieurs des paramètres a) à d) ci-dessus ont été retenus.
L'invention est plus précisément décrite ci-dessous en référence à des modes de réalisation particuliers de l'invention. Chacun des exemples ci-dessous illustre la préparation de dispersions aqueuses colloïdales de colloïdes d'hydroxyapatite.
Les exemples ci-dessous illustrent la préparation de colloïdes d'hydroxyapatite.
Dans la suite, M désigne la masse moléculaire.
EXEMPLE 1
On prépare une solution A en additionnant dans un bêcher 25,4 ml d'acide phosphorique 0,98 M, soit 25 millimoles de phosphore. On dilue par de l'eau déminéralisée jusqu'à un volume final de 60 cm3. On ajuste à pH 9 par addition de 6 cm3 d'ammoniaque concentré 10,5 M. On complète à 75 cm3 par de l'eau déminéralisée.
On prépare une solution B an additionnant dans un bêcher 12,3 g de Ca(NO3)3 (M = 164,1 g), soit 75 millimoles de Ca et 21 ,96 g de lysine ( M = 146 g) soit 150 millimoles. On complète à 75 cm3 par de l'eau déminéralisée. On laisse sous agitation jusqu'à dissolution complète des réactifs. Le pH est pH 9,7.
Le rapport molaire (Lysine:Ca) est égal à 2.
On additionne de manière instantanée la solution A dans la solution B à température ambiante. Le rapport Ca/P est égal à 3.
On laisse 15 min sous agitation à température ambiante. Le pH est pH 9,1.
On transfère le mélange dans une enceinte fermée (bombe de Parr, récipient téflon) et on porte le mélange dans une étuve préalablement mise en température de 120° C. La durée du mûrissement est de 16 heures. On obtient une dispersion colloïdale transparente dont la concentration en calcium est de 0,5 M et parfaitement stable au cours du temps vis-à-vis de la décantation.
Par microscopie électronique à transmission, par la méthode Cryo-MET, on visualise des colloïdes bien individualisés. Les colloïdes bien individualisés sont constitués d'une population d'objets possédant une morphologie anisotrope de longueur moyenne d'environ 50 nm et de diamètre équivalent d'environ 10 nm et d'une deuxième population à morphologie plus isotrope, type sphères, de diamètre d'environ 10 nm.
EXEMPLE 2
On prépare une solution A en additionnant dans un bêcher 50,8 ml d'acide phosphorique 0,98 M, soit 50 millimoles de phosphore. On dilue par de l'eau déminéralisée jusqu'à un volume final de 120 cm3. On ajuste à pH 9 par addition de 12 cm3 d'ammoniaque concentré 10,5 M. On complète à 150 cm3 par de l'eau déminéralisée.
On prépare une solution B en additionnant dans un bêcher 24,6 g de Ca(NO3)2 (M = 164,1 g), soit 150 millimoles de Ca et 26,6 g d'alanine ( M = 89 g), soit 300 millimoles. On complète à 140 cm3 par de l'eau déminéralisée. Après dissolution complète des réactifs, le pH est de 6,6. On ajuste à pH 9 par 6 cm3 d'ammoniaque 10,5 M et on complète à 150 cm3 par de l'eau déminéralisée. Le rapport molaire (alanine:Ca) est égal à 2.
On additionne de manière instantanée la solution A dans la solution B à température ambiante. Le rapport Ca/P est égal à 3. Le pH est 8,6. On ajuste à pH 9 par 6 cm3 d'ammoniaque concentrée 10,5 M.
On laisse 15 min sous agitation à température ambiante.
On transfère le mélange dans une enceinte fermée et on laisse mûrir le mélange à température ambiante de 25° C. Au bout de 16 heures, on obtient une dispersion colloïdale transparente.
On obtient une dispersion colloïdale transparente dont la concentration en calcium est de 0,5 M, parfaitement stable vis-à-vis de la décantation au cours du temps.
Par microscopie électronique à transmission, par la méthode Cryo-MET, on visualise des colloïdes possédant une morphologie anisotrope de longueur moyenne d'environ 100 nm et de diamètre équivalent inférieur à 7 nm.
EXEMPLE 3
On prépare une solution A en additionnant dans un bêcher 50,8 ml d'acide phosphorique 0,98 M, soit 50 millimoles de phosphore. On dilue par de l'eau déminéralisée jusqu'à un volume final de 120 cm3. On ajuste à pH 9 par addition de 12 cm3 d'ammoniaque concentré 10,5 M. On complète à 150 cm3 par de l'eau déminéralisée.
On prépare une solution B en additionnant dans un bêcher 24,6 g de Ca(NO3)3 (M = 164,1 g), soit 150 millimoles de Ca et 22,5 g de glycine (M = 75 g) soit 300 millimoles. On complète à 130 cm3 par de l'eau déminéralisée. Le pH est de 5,2. On ajuste à pH 9 par addition de 12 cm3 d'ammoniaque 10,5 M et on complète à 150 cm3 par de l'eau déminéralisée. Le rapport molaire (glycine:Ca) est égal à 2. On additionne de manière instantanée la solution A dans la solution B à température ambiante. Le rapport Ca/P est égal à 3. Le pH est 8,9. On laisse 15 min sous agitation à température ambiante. On transfère le mélange dans une enceinte fermée et on porte le mélange dans une étuve préalablement mise en température de 80° C. La durée du mûrissement est de 16 heures.
On obtient une dispersion colloïdale dont la concentration en calcium est de 0,5 M.
A 100 cm3 de la dispersion obtenue sont additionnés 200 cm3 d'eau déminéralisée. On ultrafiltre sur une membrane de 3 KD jusqu'à 100 cm3. On recommence l'opération une nouvelle fois.
Par microscopie électronique à transmission effectuée sur la dispersion ainsi lavée, par la méthode Cryo-MET, on visualise des colloïdes constitués d'une population d'objets possédant une morphologie anisotrope de longueur moyenne d'environ 150 nm et de diamètre équivalent d'environ 10 nm.
EXEMPLE 4 On prépare une solution A en additionnant dans un bêcher 25,4 ml d'acide phosphorique 0,98 M, soit 25 millimoles de phosphore. On ajuste à pH 9 par addition de 5,5 cm3 d'ammoniaque concentré 10,5 M. On complète à 75 cm3 par de l'eau déminéralisée.
On prépare une solution B en additionnant dans un bêcher 12,3 g de Ca(NO3)3 (M = 164,1 g), soit 75 millimoles de Ca et 22,5 g d'asparagine (M = 150 g) soit 150 millimoles. On complète à 60 cm3 par de l'eau déminéralisée. Le pH est de 3,6. On ajuste à pH 9 par addition de 10 cm3 d'ammoniaque 10,5 M et on complète à 75 cm3 par de l'eau déminéralisée. Le rapport molaire (asparagine:Ca) est égal à 2. On additionne de manière instantanée la solution A dans la solution B à température ambiante. Le rapport Ca/P est égal à 3. Le pH est 8,9. On laisse 15 min sous agitation à température ambiante. On transfère le mélange dans une enceinte fermée et on porte le mélange dans une étuve préalablement mise en température de 80° C. La durée du mûrissement est de 16 heures.
On obtient une dispersion colloïdale dont la concentration en calcium est de 0,5 M. A 100 cm3 de la dispersion obtenue sont additionnés 200 cm3 d'eau déminéralisée. On ultrafiltre sur une membrane de 3 KD jusqu'à 100 cm3. On recommence l'opération une nouvelle fois.
Par microscopie électronique à transmission effectuée sur la dispersion ainsi lavée, par la méthode Cryo-MET, on visualise des colloïdes agrégés constitués d'une population d'objets élémentaires, les objets élémentaires possédant une morphologie anisotrope de longueur moyenne d'environ 80 nm.
EXEMPLE 5 On prépare une solution A en additionnant dans un bêcher 50,8 ml d'acide phosphorique 0,98 M, soit 50 millimoles de phosphore que l'on dilue par de l'eau déminéralisée jusqu'à un volume final de 120 cm3. On ajuste à pH 9 par addition de 24 cm3 de NaOH 4 M. On complète à 150 cm3 par de l'eau déminéralisée.
On prépare une solution B en additionnant dans un bêcher 22 g de CaCI2 (M = 147 g), soit 150 millimoles de Ca et 26,6 g d'alanine (M = 89 g) soit 300 millimoles. On complète à 120 cm3 par de l'eau déminéralisée. Le pH est de 5,6.
On ajuste à pH 9 par addition de 13 cm3 de NaOH 4 M et on complète à 150 cm3 par de l'eau déminéralisée. Le rapport molaire (alanine:Ca) est égal à 2.
On additionne de manière instantanée la solution A dans la solution B à température ambiante. Le rapport Ca/P est égal à 3. Le pH est 8,4. On ajuste à pH 9 par 7 cm3 de NaOH 4M.
On laisse 15 min sous agitation à température ambiante. On transfère le mélange dans une enceinte fermée et on laisse mûrir le mélange à température ambiante pendant 16 heures. On obtient une dispersion colloïdale transparente, stable vis-à-vis de la décantation au cours du temps, dont la concentration en calcium est d'environ 0,5 M.
EXEMPLE 6 On prépare une solution A en additionnant dans un bêcher 25,4 ml d'acide phosphorique 0,98 M, soit 25 millimoles de phosphore. On ajuste à pH 9 par addition de 6 cm3 d'ammoniaque concentré 10,5 M. On complète à 37,5 cm3 par de l'eau déminéralisée. On prépare une solution B en additionnant dans un bêcher 12,3 g de
Ca(NO3)3 (M = 164,1 g), soit 75 millimoles de Ca et 21 ,96 g de lysine (M = 146 g) soit 150 millimoles. On complète à 37,5 cm3 par de l'eau déminéralisée. Après dissolution complète des réactifs, le pH est de 9,7. Le rapport molaire (lysine:Ca) est égal à 2.
On additionne de manière instantanée la solution A dans la solution B à température ambiante. Le rapport Ca/P est égal à 3.
On laisse 15 min sous agitation à température ambiante. Le pH est de 9,3.
On transfère le mélange dans une enceinte fermée (bombe de Parr, récipient téflon) et on porte le mélange dans une étuve préalablement mise en température de 80° C. La durée du mûrissement est de 16 heures.
On obtient une dispersion colloïdale transparente dont la concentration en calcium est de 1 ,0 M et parfaitement stable au cours du temps vis-à-vis de la décantation.
EXEMPLE 7
On prépare une solution A en additionnant dans un bêcher 8,5 ml d'acide phosphorique 0,98 M, soit 8,33 millimoles de phosphore que l'on dilue jusqu'à un volume final de 20 cm3. On ajuste à pH 9 par addition d'ammoniaque. On complète à 25 cm3 par de l'eau déminéralisée.
On prépare une solution B en additionnant dans un bêcher 4,1 g de
Ca(NO3)3 (M = 164,1 g), soit 25 millimoles de Ca et 2,2 g de lysine (M = 146 g) soit 15 millimoles. On complète à 25 cm3 par de l'eau déminéralisée et on laisse sous agitation jusqu'à dissolution complète des réactifs. Le rapport molaire (lysine:Ca) est égal à 0,6.
On additionne de manière instantanée la solution A dans la solution B à température ambiante. Le rapport Ca/P est égal à 3.
On laisse 15 min sous agitation à température ambiante. Le pH est de 9,1.
On transfère le mélange dans une enceinte fermée (bombe de Parr, récipient téflon) et on porte le mélange dans une étuve préalablement mise en température de 80° C. La durée du mûrissement est de 16 heures. On obtient une dispersion colloïdale transparente dont la concentration en calcium est de 0,5 M et parfaitement stable au cours du temps vis-à-vis de la décantation.
Par microscopie électronique à transmission, par la méthode Cryo-MET, on visualise des colloïdes bien individualisés. Les colloïdes bien individualisés sont constitués d'une population d'objets possédant une morphologie anisotrope de longueur moyenne d'environ 80 nm et de diamètre équivalent d'environ 10 nm.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispersion colloïdale aqueuse stable de colloïdes à structure apatitique, présentant un pH compris entre 5 et 10, formée de colloïdes de forme oblongue d'une longueur moyenne (en nombre) comprise entre 20 et 250 nm et d'un rapport d'aspect équivalent (rapport de la longueur moyenne (en nombre) au diamètre équivalent) compris entre 1 et 300, ou bien de forme sphérique présentant un diamètre compris entre 10 et 100 nm, et comprenant un ou plusieurs acides aminés éventuellement sous forme ionisée, en tant qu'agent stabilisant, lesdits colloïdes à structure apatitique ayant pour formule :
Ca10-X (HPO4)x (PO4)6-x (J)2-x (I) dans laquelle : x est choisi parmi 0, 1 ou 2 ; J est choisi parmi OH", F", CO3 2" ou CI" ; et dans laquelle certains ions phosphate (PO4 3") ou hydrogénophosphate (HPO4 2") peuvent être remplacés par des ions carbonate (CO3 2") ; et dans laquelle certains Ca2+ peuvent être remplacés par des cations métalliques Mn+ de métaux alcalins, alcalino-terreux ou de lanthanide où n représente 1 , 2 ou 3, étant entendu que le rapport molaire du cation Mn+, lorsqu'il est présent, à Ca2+, varie entre 0,01 :0,99 et 0,25:0,75, et que la substitution d'ions HPO4 2" ou d'ions PO4 3" par des ions CO3 2~, l'incorporation d'ions CO3 2" en tant que J et la substitution de cations Ca2+ par des cations métalliques est réalisée de manière à satisfaire l'équilibre électrostatique.
2. Dispersion colloïdale selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le rapport molaire du Ca2+ total au P total dans la phase colloïdale varie entre 1 ,3 et
1 ,7.
3. Dispersion colloïdale selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le rapport molaire de l'agent stabilisant total au Ca2+ total dans la phase colloïdale varie entre 0,001 et 1 ,0.
4. Dispersion colloïdale selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que x représente 0.
5. Dispersion colloïdale selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle les colloïdes à structure apatitique ont pour formule : Caιo(PO )δ
(OH)2.
6. Dispersion colloïdale selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'agent de stabilisation est choisi parmi la lysine, la glycine, l'asparagine, la créatine, l'arginine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la serine, l'alanine, la valine, la leucine, leurs sels avec des acides ou des bases, et leurs mélanges.
7. Dispersion colloïdale selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'agent de stabilisation est choisi parmi la lysine, la créatine, la glycine, l'alanine, l'asparagine, la serine, leurs sels avec des acides ou des bases, et leurs mélanges.
8. Dispersion colloïdale selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, présentant une concentration supérieure à 0,25 M en calcium sous forme de colloïdes à structure apatitique, mieux encore supérieure à 0,5 M.
9. Procédé de préparation d'une dispersion colloïdale aqueuse stable, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact, en solution aqueuse, une source de cations Ca2+, une source d'anions PO4 3" et un acide aminé ou un sel d'un tel acide aminé avec un acide ou une base en tant qu'agent stabilisant, à un pH compris entre 5 et 10, les quantités respectives de la source de Ca2+ et de la source d'anions PO4 3" étant telles que le rapport molaire Ca2+/P varie entre 1 et 3,5, de préférence entre 2 et 3,2, la quantité d'agent stabilisant étant telle que le rapport molaire agent stabilisant/Ca2+ varie entre 0,3 et 2,5, de préférence entre 0,9 et 2 ; b) éventuellement laisser mûrir la solution ainsi obtenue à une température comprise entre 15 et 150° C jusqu'à obtention d'une dispersion colloïdale.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la température est maintenue entre 40 et 150° C à l'étape b).
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que la solution obtenue à l'issue de l'étape b) est concentrée par ultrafiltration.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 , caractérisé en ce que l'agent de stabilisation est tel que défini à l'une quelconque des revendications 7 ou 8.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu'à l'étape a) la mise en contact de la source de Ca2+ avec la source de PO4 3" est réalisée par mélange d'une solution aqueuse d'une source de PO4 3" avec une solution aqueuse d'une source de Ca2+ contenant l'agent de stabilisation.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que la source de calcium est choisie parmi l'hydroxyde de calcium, les oxydes de calcium, les halogénures de calcium, le nitrate de calcium et l'hydrogénocarbonate de calcium.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 14, caractérisé en ce que la source de PO 3" est choisie parmi les sels des anions PO4 3", H2PO4 " ou HPO4 2" tels que les sels de métaux alcalins et les sels d'ammonium.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 15, caractérisé en ce que le pH est ajusté entre 7 et 9,2 à l'étape a).
17. Colloïdes de structure apatitique redispersables dans l'eau pouvant être obtenus par mise en œuvre des étapes consistant à : a) préparer une dispersion colloïdale par mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 16 ; b) isoler les colloïdes de la dispersion colloïdale résultant de l'étape a).
18. Procédé selon la revendication 9 pour la préparation d'une dispersion colloïdale transparente, caractérisé en ce que l'une ou plusieurs des conditions a) à d) suivantes sont remplies : a) le rapport molaire de l'agent stabilisant au calcium est supérieur à 0,5:1 , mieux encore supérieur à 1 :1 ; b) le pH est compris entre 5 et 9,5, mieux encore entre 7 et 9,5 ; c) l'agent stabilisant est composé d'un ou plusieurs acides aminés éventuellement sous forme ionisée, et est choisi parmi la lysine, l'alanine et leurs formes ionisées ; d) la mise en contact de la source de PO4 3", de la source de Ca2+ et de l'agent stabilisant est réalisée par addition de la source de PO4 3" à la solution de la source de Ca2+, laquelle contient l'agent stabilisant, ou inversement.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que les conditions a) à d) sont remplies.
20. Dispersion colloïdale pouvant être obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications 18 et 19.
21. Dispersion colloïdale transparente selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle est formée de colloïdes de-forme oblongue d'une longueur moyenne (en nombre) de 20 à 150 nm ou de forme sphérique d'un diamètre de 10 à 100 nm, dans laquelle au moins 80% des colloïdes ne sont pas agrégés, le rapport molaire de l'agent stabilisant au calcium total présent dans les colloïdes ou en surface des colloïdes est compris entre 0,001 et 1 , le pH de la dispersion colloïdale étant compris entre 5 et 9,5.
22. Dispersion colloïdale transparente selon la revendication 21 , caractérisée en ce que l'agent stabilisant est choisi parmi l'alanine et la lysine, éventuellement sous forme ionisée, et un mélange de ces composés.
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