EP1349964A2 - Verfahren zur vorhersage des gefährdungspotentials für karzinomerkrankungen und entzündliche darmerkrankungen und zugehörige tests - Google Patents

Verfahren zur vorhersage des gefährdungspotentials für karzinomerkrankungen und entzündliche darmerkrankungen und zugehörige tests

Info

Publication number
EP1349964A2
EP1349964A2 EP02701160A EP02701160A EP1349964A2 EP 1349964 A2 EP1349964 A2 EP 1349964A2 EP 02701160 A EP02701160 A EP 02701160A EP 02701160 A EP02701160 A EP 02701160A EP 1349964 A2 EP1349964 A2 EP 1349964A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
ugt1a7
mutations
codon
polymorphic
diseases
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02701160A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Manns
Christian Strassburg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medizinische Hochschule Hannover
Original Assignee
Medizinische Hochschule Hannover
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medizinische Hochschule Hannover filed Critical Medizinische Hochschule Hannover
Publication of EP1349964A2 publication Critical patent/EP1349964A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Definitions

  • the invention relates to a method for predicting the risk potential for carcinoma diseases and inflammatory bowel diseases and for diagnosing these diseases.
  • the invention relates primarily to a method for the hazard potential assessment for colorectal cancer.
  • the invention further relates to tests for the diagnosis of DNA samples of an individual to be examined and the use of new polymorphic forms of the UGT1A7 gene for the metabolic characterization of medicaments, in particular tumor therapeutics.
  • UGT Human uridine diphosphate
  • UGT2 -5'-glucuronosyltransferase
  • UGT8 The UGT1 family alone distinguishes between numerous isoforms.
  • Five family 1A UGT isoforms (UGT1A1, 1A3, 1A4, 1A6 and 1A9) have been discovered and cloned in the liver in the past 10 years, including the bilirubin UGT isoform UGT1A1.
  • Three extrahepatic UGT1A gene products were isolated from bile ducts (UGT1A10), stomach (UGT1A7) and colon (UGT1A8).
  • the proteins encoded at the human UGT1A7 locus serve to detoxify a large number of endogenous and exogenous (xenobiotic, i.e. poorly degradable compounds of technical origin) compounds of the human body through glucuronidation. They are proteins of the so-called phase 2 metabolism of humans, which includes, for example, acetylation, sulfation and glucuronidation. Detoxification of polycyclic hydrocarbons and heterocyclic amines was demonstrated for UGT1A7, which was first described as a transcript in 1996. These substances are also considered to be carcinogenic.
  • WO 00/06776 discloses the identification of genetic polymorphisms in human UGT2B4, UGT2B7 and UGT2B15 genes that alter UGT2B activity.
  • UGT2 enzymes are involved in steroid metabolism.
  • Nucleic acids containing the UGT2 polymorphic sequences have been used to alert patients to changes in metabolism for UGT2B substrates, possible drug-drug interactions and adverse effects / side effects, as well as to diseases related to exposure to environmental or occupational poisons come from, to test. With the help of nucleic acids, animal, cell and in vitro models for drug metabolisms were established.
  • WO 99/57322 has identified genetic polymorphisms in the human UGT1 gene which alter the UGT1-dependent drug metabolism.
  • the polymorphic sequences were used to test patients for a changed metabolism for UGT1 substrates, possible drug-drug interactions and adverse effects / side effects, as well as for diseases resulting from exposure to environmental or occupational poisons. With the help of the nucleic acids, animal, cell and in vitro models for drug metabolisms were again established.
  • the object of the invention was to find a specific connection between a cancer risk, in particular for colon carcinoma (colorectal cancer, CRC) and genetic dispositions and to provide a test for the detection of this disposition.
  • UGT1A7 * 2, UGT1A7 * 3 and UGT1A7 * 4 are statistically astonishingly relevant with the occurrence of colorectal cancer (CRC) and also with certain inflammatory bowel diseases (IBD, inflammatory bowl disease; Crohn's disease) as well as cancer of the pancreas, liver, stomach and esophagus.
  • CRC colorectal cancer
  • IBD inflammatory bowl disease
  • UGT1A7 is not expressed in the large intestine, ie not in the diseased region. It is astonishing and it has not yet been found in previous studies that a genetic predisposition does not depend on an expression in the affected organ, but is also possible spatially separated. It follows that the genetic Modification must have a global and not just an organ-specific effect. Such a connection could be shown here for the first time.
  • the genetic polymorphisms are those of the germline and not somatic mutations of the tumor.
  • the underlying analyzes were performed on genomic DNA from lymphocytes from patients with tumors (CRC), inflammatory bowel disease (IBD) and reference persons who did not have these diseases.
  • CRC lymphocytes from patients with tumors
  • IBD inflammatory bowel disease
  • the analysis of a total of 111 individuals comes to the conclusion that the polymorphisms on the individual codons do not occur independently of one another but can only be inherited in combination.
  • UGT1 A7 * 2 is characterized by a silent mutation at codon 11 with an exchange from C to A at position 3 (CCC to CCA). This mutation falls within the signal peptide domain of the endoplasmic reticulum. Linked to this is a second mutation on codon 208, namely W208R, an exchange T to C, which leads to a non-conservative substitution of an aromatic tryptophan to a positively charged arginine residue.
  • the polymorphism at codon 208 falls within a sequence region that is conserved not only in the first exons of UGT1A7-10, but in all members of the UGT1A7 family. The presence of an RV-N sequence motif between amino acids 206 and 209 is common to all UGT1A proteins.
  • the W208R exchange in UGT1A7 represents the wild-type sequence of UGT1A8 and UGT1A9.
  • the investigations by the applicants show that the polymorphisms on codon 11 and on codon 208 do not occur individually (in a study on 111 people). Characterization at both positions of heterozygous individuals and the fact that no individually homozygous patterns could be found on codon 11 or codon 208 suggest that both exchanges are on the UGT1A7 * 2 allele.
  • UGT1A7 * 3 contains two mutations. The first is a T to G exchange on codon 129, which results in a conservative codon exchange from asparagine to lysine (N129K). The second is shown on codon 131 in a double exchange from C to A at position 1 and G to A at position 2 of the codon, which leads to an arginine-to-lysine exchange (R131 K). This polymorphism also affects highly conserved sequences of the UGT protein. Following Leucin-127, that in all UGT1A7 proteins is present, an LHN-L motif (amino acids 128-133) in
  • UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4 and UGT1A5 preserved. At amino acid position 128-
  • N129K / R131 K mutations can be identified on a single allele that occurs independently of UGT1A7 * 2.
  • UGT1A7 corresponds to the wild-type sequence of UGT1A9 on these codons, which further suggests that the 3 base pair mutations are inherited as a haplotype.
  • the third allele, UGT1A7 combines all of the changes observed in UGT1A7 * 2 and UGT1A7 * 3. Individuals with homozygous mutations were found on codons 11, 129, 131 and 208, indicating that all 4 polymorphisms can occur on a single allele. It is noteworthy that the polymorphisms on codons 11, 129, 131 or 208 were heterozygous or homozygous individually. This observation also supports, as stated above, the assumption that the polymorphisms on codons 11 and 208 and also on codon 129 with codon 131 are inherited as haplotypes.
  • the object is achieved according to the invention by a method for predicting the risk potential for carcinoma diseases or inflammatory bowel diseases and / or for diagnosing carcinoma diseases or inflammatory bowel diseases, in which a DNA sample of a person to be examined for the presence of polymorphic UGT1A / - Alleles that include mutations on codons 11, 129, 131 and / or 208 are tested.
  • a positive result for a mutation on codon 11 and codon 208 is evaluated as a positive sign of sensitivity to carcinoma diseases, especially for colorectal cancer or colon cancer (CRC). Test options for this are given below.
  • the positive rated mutations are a W208R exchange and a silent mutation CCC to CCA of codon 11.
  • a positive result for a mutation on all four codons 11, 129/131 and 208 is used as an indication of a sensitivity to inflammatory bowel disease, namely in particular those under the term "inflammatory bowl disease” (IBD) and ulcerative colitis Diseases, and a carcinoma, especially CRC.
  • IBD inflammatory bowl disease
  • CRC ulcerative colitis Diseases
  • the positive mutations are N129K, R131 K and W208R and the silent mutation CCC to CCA on codon 11.
  • UGT1A7 polymorphisms and colorectal carcinoma and inflammatory bowel diseases which in turn form a risk factor for colon carcinogenesis, enable the use of the markers described here to identify risk patients for tumor diseases. Since the detoxification enzymes, on which polymorphisms have been detected, have a global function in the human organism, relevance beyond the colorectal carcinoma shown here is also likely for other cancers of the gastrointestinal tract, the respiratory system, blood formation and the genital organs and glands.
  • An advantage of the invention is that patients can be divided into appropriate risk groups at an early stage and given preventive treatment, which leads to an improvement in early detection.
  • Another advantage of the invention is that the method can also be used for diagnosis. Improving the diagnosis is one way to get a clear diagnosis of the patient's condition even faster and to treat it earlier and more appropriately. Early detection and immediate therapy are of crucial importance, especially for carcinoma diseases. With early detection, the CRC is in most cases avoidable or curable. Genomic DNA from lymphocytes is preferably used for an investigation. The genomic DNA can be isolated from a blood sample of the test person using column chromatography methods and chemical processing.
  • This genomic DNA which represents the genetic material of the person to be examined, forms the basis of all other genetic test strategies.
  • the patient DNA obtained is amplified using the polymerase chain reaction.
  • a PCR amplification of the entire exon 1 of the UGT1A7 gene (approx. 855 base pairs) can be carried out, which is followed by a sequence analysis.
  • the determined sequence can be evaluated in a suitable manner, i.e. with the sequence of the wild type and the UGT1A7 alleles UGT1A7 * 2, UGT1A7 * 3 and UGT1A7 * 4 relevant for this method.
  • only those cDNA fragments are amplified which are intended to provide information about the mutations sought.
  • the DNA sample is therefore preferably treated with the aid of specific primer pairs, one of which binds upstream and one downstream of the relevant mutated DNA regions around codons 11, 129/131 or 208, and cDNA fragments are generated in a polymerase chain reaction corresponding fragments of the wild-type allele or the polymorphic alleles are similar, the presence of mutations on codons 11, 129, 131 and / or 208 subsequently being detected with the aid of sequencing and / or hybridization techniques.
  • those primer pairs are used which each bind about 50 base pairs upstream and downstream of codo 11, codon 129/131 and codon 208, whereby cDNA fragments of approximately 100 to 150 base pairs are obtained.
  • polymorphisms can be detected in various ways using sequencing and / or hybridization methods. In principle, the person skilled in the art is free here to select suitable methods from those known to him. Among other things, the polymorphisms sought can be
  • Conformation polymorphism analysis can be investigated by detecting the complete recombination of a patient cDNA fragment obtained with the previous PCR with a corresponding cDNA fragment of the wild-type allele into double strands.
  • the underlying principle is based on the fact that a varied DNA sequence is unable to form completely congruent double strands with the wild-type sequence. This can be displayed by gel electrophoresis for the screening examination and indicates the existence of a mutation.
  • the detection of the polymorphic cDNA fragments can be carried out by temperature gradient gel electrophoresis (TGGE).
  • the presence or absence of mutations would preferably be checked by sequencing the cDNA in question using automated fluorescent dye sequencing.
  • Another detection possibility is that in a purely PCR-based strategy (amplification refractory mutation system, system of amplification-resistant mutation), the presence of a polymorphism is represented by specific primer sequences which bind to the base exchange of the polymorphism at their 3 'terminus.
  • this method can be modified to discriminate between heterozygous and homozygous carriers.
  • An embodiment of this method as an automated test kit system is given below as an example. Oligonucleotides are used as primers which bind the wild type sequence on the one hand and the polymorphic sequence on the other hand, as well as corresponding counter primers (anti sense primer).
  • a PCR product is only generated with these if the wild-type coded on the primer or the primer-coded polymorphic allele is present.
  • defined cDNAs containing the defined polymorphisms are used as controls.
  • the method can be automated using quantitative Taqman PCR.
  • the PCR conjugates can be detected in the usual way with fluorescent dyes or enzyme markers.
  • the specialist is sufficient for this suitable techniques to choose from, which need not be described separately here.
  • the invention also includes test kits or test arrangements for carrying out the method according to the invention.
  • the test arrangement belonging to this invention basically comprises at least the genetic detection reagents required for the method, namely the required primers or cDNAs, on a stationary support in an arrangement or sequence prepared for reading the result, it being provided that the prepared and additionally marked DNA samples of the individual to be examined are brought into contact with the test arrangement, bind to one of the detection reagents and are detected at this location with the aid of the marker.
  • the test person's DNA can be labeled using fluorescent dyes or radioactive isotopes.
  • the various detection reagents required for this i.e. e.g. the primers for the different codons 11, 129/131 and 208 or the DNA fragments of wild-type and UGT1A7 * 2/3/4 alleles, depending on the strategy chosen, together on a test arrangement, e.g. be immobilized on a gene chip.
  • a label or imprint is arranged on the stationary support in association with the detection reagents.
  • the combination analysis of all UGT1A7 polymorphisms can be carried out using a gene chip technique.
  • the oligonucleotide sequence of the polymorphisms and of the wild type can be immobilized in the stationary phase.
  • Corresponding oligonucleotides from the subject's DNA are amplified by PCR and labeled with fluorescent dyes, radioactive isotopes or other conjugates.
  • the subsequent hybridization reaction identifies the corresponding oligonucleotide on the gene array and determines its existence - Kl of a polymorphism.
  • Test strategies are possible and can be adapted to this procedure by a specialist.
  • the polymorphic UGT1A7 * 2, UGT1A7 * 3 and UGT1A7 * 4 genes can be used for the production of associated UGT isotypes.
  • the identified polymorphisms can be expressed as recombinant proteins and used, for example, for the metabolic characterization of tumor therapeutics in order to enable a prediction of the metabolism of these substances.
  • all polymorphisms of UGT1A7 can serve to investigate the metabolism of potentially mutagenic or carcinogenic substances with the aim of making predictions about their toxicity or carcinogenic potency.
  • the expression of the polymorphic alleles is used in heterologous expression systems, in bacteria, eukaryotic cell cultures and their subsequent use as an enzyme preparation for catalytic analyzes.
  • Test kits that contain a series of different polymorphism proteins enable simple in vitro analysis.
  • the invention therefore also includes the use of UGT1A7 genes or gene fragments for the production of a gene therapeutic medicament for the treatment of UGT1A7 polymorphisms of the types UGT1A7 * 2, UGT1A7 * 3 and UGT1A7 * 4.
  • a further development of the invention is therefore the oral or parenteral use of the recombinant protein from genes of the UGT1A family in tumor therapy or intended for tumor prevention in high-risk patients.
  • UGT1A7 cDNA or homologous UGT1A cDNAs in human cells and tumor cells can be used in vectors which are basically known to the person skilled in the art and which he can select with his expert knowledge. This leads to expression of the protein in the target tissue including embryonic or fetal tissue, where the UGT1A7 gene therapy drug for the
  • the UGT1A cDNA can be transported, for example, by parenteral vectors with organ-specific promoters, by the intramuscular injection of UGT1A cDNA or by liposome-packed cDNA via the gastrointestinal tract.
  • the specialist can choose suitable delivery systems based on his specialist knowledge.
  • Oligonucleotides are used which bind the wild-type sequence on the one hand and the polymorphic sequences on the other hand and corresponding counterprimer (anti sense primer). With these, a PCR product is only ever created if the wild-type coded on the primer or the primer-coded polymorphic allele is present.
  • the principle is shown in Figure 1. Defined cDNAs containing the defined polymorphisms are used as controls.
  • the primers used are shown in Table 1:
  • the samples were collected from 111 patients from the Institute of Gastroenterology and Hepatology at the Hannover Medical School in 1999.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • n 31, 36.74 ⁇ 11, 79 years, 14 male / 16 female
  • the diagnoses of ulcerative colitis and Crohn's disease are based on findings from upper and lower endoscopy and were confirmed histologically by intestinal biopsies.
  • Genomic DNA The genomic DNA was prepared from whole blood samples using the QuiaAmp ® system according to the manufacturer's recommendations (Quiagen, Hilden, Germany). Concentration data were determined spectrophotometrically at 260 and 280 nm and the samples were stored in 10 mM Tris / EDTA buffer (pH 8.0) at 4 ° C until further investigation.
  • the UGT1A7 exon 1 sequence was amplified with the polymerase chain reaction.
  • the forward primer was from base pair 61 to 38 upstream of the ATG start codon (GenBank accession number U39570) from UGT1A7 (5'-gcggctcgagccacttactatattataggagct-3 ').
  • the counterprimer was between base pair 855 and 829 (GenBank accession number U89507) of the UGT1A7 exonl sequence (5'-gcggatatccataggcactggctttccctgatgaca-3 ').
  • a 916 base pair product was in a volume of 100 ul, containing 10 mM KCI, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM ammonium sulfate, 2 mM magnesium sulfate, 1% Triton X-100, 0.2 mM each dNTP, 20ng genomic DNA, 2 ⁇ M primer and 5 units VENT (exo) DNA polymerase (NEB, Beverly, MA) amplified.
  • Figure 1 is a graphical representation of UGT1A7 polymorphism diagnostics
  • FIG. 3 polymorphic sites of the human UGT1 A7 exon 1 sequence; Figure 4 Comparison of regions around codon 11, 129, 131 and 208;
  • FIG. 1 shows a UGT1A7 polymorphism diagnosis, in which the region around the identified polymorphisms is amplified by polymerase chain reaction (PCR). Specific primer pairs are used which bind about 50 base pairs upstream and downstream of codon 11, codon 129/131 and codon 208. In this PCR, 100 to 150 bp complementary deoxyribonucleic acid fragments (cDNAs) are generated which correspond to the wild-type allele or which carry the identified polymorphisms.
  • PCR polymerase chain reaction
  • FIG. 2 shows the analysis of the prevalence of the polymorphic UGT1A7 alleles as defined in FIG. 3.
  • This analysis which is based on the defined polymorphic UGT1A7 alleles, shows a significant association of UGT1A7 and UGT1A7 * 2 with colorectal cancer (CRC) and the low occurrence of these alleles in the normal control group (NC).
  • CRC colorectal cancer
  • NC normal control group
  • IBD inflammatory bowel disease
  • No significant association with the UGT1A7 * 3 allele was found for either CRC or IBD.
  • the association of heterozygous UGT1A7 * 3 / UGT1A7 * 4 individuals with CRC and IBD was significant.
  • UGT1A7 * 2 is defined as a combination of CCA on codon 11 and the W208R mutation. This is based on the observation that the two mutations are always combined and not individually identified heterozygous or homozygous at either codon 11 or codon 208 become. UGT1A7 * 2 was not detected as a homozygous allele. UGT1A7 * 3 is only defined by the combination of N129K and R131 K. These patents were either homozygous or heterozygous for both N129K and R131 K. The heterozygous UGT1A7 * 4 may alternatively represent the compound heterozygous UGT1A7 * 2 / UGT1A7 * 3.
  • Figure 3 shows a graphical representation of the 3 polymorphic sites identified in the human UGT1A7 exon 1 sequence.
  • the CCC / A mutation on codon 11 is silent.
  • the mutations lead to amino acid substitutions.
  • Sequence analysis revealed the presence of 3 different polymorphisms that were assigned to UGT1A7 * 2, UGT1A7 * 3 and UGT1A7.
  • the exchange on codons 11 and 208 (UGT1A7 * 2) and the polymorphisms on codons 129 and 131 (UGT1A7 * 3) did not occur individually.
  • FIG. 4 shows that, compared to the region around codon 11, the identified polymorphisms at position 129/131 and position 208 fall into highly conserved sequence areas.
  • the N129K / R131 K polymorphism represents the wild-type sequence of UGT1A9 in this position.
  • W208R represents the wild type sequence of UGT1A8 and UGT1A9 at this position.
  • Figure 5 shows that the association of W208R mutations with colorectal cancer and inflammatory bowel disease is highly statistically significant. While mutations on codon 208 (W208R) only occur in 22% of the normal controls, these are found in 73% of the patients with colorectal cancer and in 61% of the patients with inflammatory bowel diseases. For the UGT1A7 * 2 allele there was a significant association with colorectal cancer (19% versus 7%) but not with inflammatory bowel diseases. The UGT1A7 * 4 allele was significantly associated with colorectal cancer and inflammatory bowel disease, while no significant association was shown for UGT1A7 * 3 (low level of significance).
  • the * shows significant levels compared to the normal controls (Kruskal Wallis Test). In the following mean: n.s. - not significant, NC normal controls; CRC - colorectal carcinoma and IBD - inflammatory bowel disease.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Bei dem Verfahren zur Vorhersage des Gefährdungspotentials und/oder Diagnose von Karzinomerkrankungen oder entzündlichen Darmerkrankungen wird eine DNA-Probe auf das Vorhandensein polymorpher UGT1A7-Allele getestet. Ein positives Ergebnis für eine Mutation gilt als positives Anzeichen für eine Sensibilität für Karzinomerkrankungen. Ebenso kann eine Vorhersage über eine Sensibilität für eine entzündliche Darmerkrankung gemacht werden. Bei dem Verfahren wird durch die DNA-Probe eine PCR-Amplifikation des Exons 1 mit anschliessender Sequenzanalyse durchgeführt und die ermittelte Sequenz mit der des Wildtyps und der polymorphen Allele verglichen. Das Vorliegen oder Nichtvorliegen von Mutationen wird durch Sequenzieren der betreffenden cDNA mittels automatisierter Fluoreszenzfarbstoffsequenzierung überprüft. Die Testanordnung für dieses Verfahren erfordert genetische Nachweisreagenzien, nämlich die erforderlichen Primer oder cDNAs, auf einem stationären Träger in einer für das Ablesen des Ergebnisses vorbereiteten Anordnung oder Reihenfolge. Die rekombinanten UGT1A7-Enzyme werden auch für therapeutische Zwecke verwendet.

Description

Verfahren zur Vorhersage des Gefährdungspotentials für Karzinomerkrankungen und entzündliche Darmerkrankungen und zugehörige Tests
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorhersage des Gefährdungspotentials für Karzinomerkrankungen und entzündliche Darmerkrankungen und zur Diagnose dieser Erkrankungen. In erster Linie betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Gefährdungspotential-Abschätzung für Kolorektalkarzinome. Ferner betrifft die Erfindung Tests für die Diagnostik an DNA-Proben eines zu untersuchenden Individuums sowie die Verwendung neuer polymorpher Formen des UGT1A7-Gens für die metabolische Charakterisierung von Medikamenten, insbesondere von Tumortherapeutika.
Man vermutet heute, dass das Risiko für Krebs durch eine genetische Prädisposition und durch Umwelteinflüsse einschließlich dem Ausgesetztsein gegenüber krebserregenden Substanzen bestimmt wird.
Es wurde daher schon häufiger ein Zusammenhang zwischen genetischen Polymorphismen karzinogenmetabolisierender Enzyme und einer Krebsentstehung vermutet. Konkrete, statistisch bestätigte Zusammenhänge sind jedoch schwer zu finden, da die Metabolisierung nicht mit einer Detoxifizierung gleichgesetzt werden kann. Für eine Krebsrisiko-Vorhersage genügt es daher nicht, überhaupt genetische Abwandlungen festzustellen, sondern es muss bekannt sein, dass die Veränderung zu deutlich negativen Folgen im Metabolismus führt.
Ein weiteres Problem beim Auffinden eines solchen Zusammenhangs besteht darin, dass der menschliche Stoffwechsel sehr komplex ist und eine Unzahl von Substanzen, darunter Stoffwechselprodukte, Proteine und gerade auch Enzyme als Marker für ein Krebsrisiko in Frage kommen könnten. Dies gilt auch für das Kolon- oder kolorektale Karzinom (CRC), eine der häufigsten Krebsarten der westlichen Welt. Der menschliche Darm ist ein großes Organ, das durch vielerlei Körperprozesse und auch die Ernährung beeinflußt wird. Es musste daher fraglich sein, ob überhaupt eine eindeutige Risikoabschätzung aufgrund einer genetischen Veranlagung möglich ist. Am Stoffwechsel im Darm sind eine Vielzahl von Enzymklassen beteiligt, darunter solche, die für die Verstoffwechselung von Fremdsubstanzen zuständig sind.
Die humane Uridindiphosphat(UDP)-5'-Glucuronosyltransferase (UGT) ist eine große Enzymklasse, die die Glukuronidierung zahlreicher Substrate bewirkt. Innerhalb dieser Superfamilie sind drei Familien mit besonderen Aufgaben identifiziert worden, UGT1 , UGT2 und UGT8. Allein unter den Enzymen der Familie UGT1 unterscheidet man zahlreiche Isoformen. In der Leber wurden in den letzten 10 Jahren 5 Familie 1A UGT-Isoformen (UGT1A1 , 1A3, 1A4, 1A6 und 1A9) entdeckt und kloniert, darunter die Bilirubin-UGT-Isoform UGT1A1. Drei extrahepatische UGT1A- Genprodukte konnten aus Gallenwegen (UGT1A10), Magen (UGT1A7) und Kolon (UGT1A8) isoliert werden.
Die am menschlichen UGT1A7-Genort kodierten Proteine dienen durch die Glukuronidierung der Entgiftung einer Vielzahl endogener und exogener (xenobiotischer, d.h. schwer abbaubarer Verbindungen technischen Ursprungs) Verbindungen des menschlichen Körpers. Es sind Proteine des sogenannten Phase 2-Stoffwechsels des Menschen, der zum Beispiel die Acetylierung, Sulfatierung und Glukuronidierung umfasst. Für das 1996 erstmalig als Transkript beschriebene UGT1A7 konnte eine Detoxifikation von polycylischen Kohlenwasserstoffen und heterozyklischen Aminen demonstriert werden. Diese Substanzen gelten auch als karzinogen.
In der WO 00/06776, ist die Identifizierung genetischer Polymorphismen in menschlichen UGT2B4-, UGT2B7- und UGT2B15-Genen offenbart, die die UGT2B- Aktivität ändern. UGT2-Enzyme sind u.a. bei der Steroid-Metabolisierung beteiligt. Nukleinsäuren, die die polymorphe UGT2-Sequenzen enthalten, wurden verwendet, um Patienten auf einen geänderten Metabolismus für UGT2B-Substrate, mögliche Wirkstoff-Wirkstoff-Wechselwirkungen und nachteilige Wirkungen/Nebenwirkungen, sowie auf Krankheiten, die von der Exposition gegenüber Umwelt- oder berufsbedingten Giften herrühren, durchzutesten. Mit Hilfe der Nukleinsäuren wurde Tier-, Zeil- und in vitro Modelle für Wirkstoffmetabolismen etabliert. ln der WO 99/57322 wurden genetische Polymorphismen im menschlichen UGT1 Gen identifiziert, welche den UGT1 -abhängigen Wirkstoffmetabolismus verändern. Auch hier wurden die polymorphen Sequenzen verwendet, um Patienten auf einen geänderten Metabolismus für UGT1 -Substrate, mögliche Wirkstoff-Wirkstoff- Wechselwirkungen und nachteilige Wirkungen/Nebenwirkungen, sowie auf Krankheiten, die von der Exposition gegenüber Umwelt- oder berufsbedingten Giften Herrühren, durchzutesten. Mit Hilfe der Nukleinsäuren wurden wiederum Tier-, Zeil und in vitro-Modelle für Wirkstoffmetabolismen etabliert.
Es wurden des weiteren bereits funktionale Konsequenzen einer genetischen Veränderung des menschlichen UGT1A7-Gens beschrieben in "C. Guillemette, J. K. Ritter, D. J. Auyeung, F. K. Kessler, D. E. Housman; „Struktural hetreogeneity at the UDP-glucuronosyltransferase 1 locus: functional consequences of three novel missense mutations in the human UGT1A7 gene", Pharmacogenetics, 2000, 10:629-644". Dabei wird auch die mögliche Rolle von UGT1A7 bei der Entgiftung und Eliminierung von karzinogenen Produkten in der Lunge diskutiert. UGT1A7 wird in der Lunge exprimiert, nicht jedoch im menschlichen Dickdarm.
Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, einen konkreten Zusammenhang zwischen einem Krebsrisiko, insbesondere für Kolonkarzinom (Kolorektalkarzinom, CRC) und genetischen Dispositionen zu finden und einen Test für den Nachweis dieser Disposition zur Verfügung zu stellen.
Dies gelang durch das Auffinden neuer polymorpher UGT1A7-Allele, die mit UGT1A7*2, UGT1A7*3 und UGT1A7*4 bezeichnet wurden und die mit statistisch erstaunlicher Relevanz mit dem Auftreten eines Kolorektalkarzinoms (CRC) und darüberhinaus mit bestimmten entzündlichen Darmerkrankungen (IBD, inflammatory bowl disease; Morbus Crohn) sowie den Krebsarten Bauchspeicheldrüsen-, Leber-, Magen- und Speiseröhrenkrebs in Verbindung gebracht werden können. Dieses Ergebnis ist insofern überraschend, als UGT1A7 nicht im Dickdarm, d.h. nicht in der erkrankten Region exprimiert wird. Es ist erstaunlich und bei bisherigen Untersuchungen noch nicht so gefunden worden, dass eine genetische Prädisposition nicht von einer Expression im betroffenen Organ abhängt, sondern auch räumlich getrennt möglich ist. Hieraus ergibt sich, dass die genetische Modifikation einen globalen und nicht nur einen organspezifischen Effekt besitzen muss. Ein solcher Zusammenhang konnte hier erstmals aufgezeigt werden.
Bei den genetischen Polymorphismen handelt es sich um solche der Keimbahn und nicht um somatische Mutationen des Tumors. Die zugrundeliegenden Analysen erfolgten an genomischer DNA aus Lymphozyten von Patienten mit Tumoren (CRC), entzündlicher Darmerkrankung (IBD) und Referenzpersonen, die diese Erkrankungen nicht aufwiesen. Die Analyse von insgesamt 111 Individuen kommt zu dem Ergebnis, dass die Polymorphismen an den einzelnen Kodons nicht unabhängig voneinander auftreten sondern nur kombiniert vererbt werden können.
UGT1 A7*2 ist durch eine stille Mutation an Kodon 11 mit einem Austausch von C zu A an Position 3 (CCC zu CCA) gekennzeichnet. Diese Mutation fällt in die Signal- Peptid-Domäne des endoplasmatischen Retikulums. Hiermit verbunden ist eine zweite Mutation an Kodon 208, und zwar W208R, ein Austausch T zu C, der zu einer nicht-konservativen Substitution eines aromatischen Tryptophans zu einem positiv geladenen Arginin-Rest führt. Der Polymorphismus an Kodon 208 fällt in einen Sequenzbereich, der nicht nur in den ersten Exons von UGT1A7-10, sondern in allen Mitgliedern der UGT1A7-Familie konserviert ist. Die Anwesenheit eines RV- N-Sequenzmotivs zwischen Aminosäuren 206 und 209 ist allen UGT1A-Proteinen gemeinsam. Der W208R-Austausch in UGT1A7 repräsentiert die Wildtyp-Sequenz von UGT1A8 und UGT1A9. Die Untersuchungen der Anmelder zeigen, dass die Polymorphismen an Kodon 11 und an Kodon 208 nicht einzeln auftreten (bei einer Studie an 111 Personen). Die Charakterisierung an beiden Positionen heterozygoter Individuen und die Tatsache, dass keine individuell homozygoten Muster an Kodon 11 oder an Kodon 208 gefunden werden konnten, legen nahe, dass sich beide Austausche auf dem UGT1A7*2-Allel befinden.
UGT1A7*3 umfasst zwei Mutationen. Die erste ist ein T zu G-Tausch an Kodon 129, was einen konservativen Kodon-Austausch von Asparagin zu Lysin ergibt (N129K). Die zweite zeigt sich an Kodon 131 in einem doppelten Austausch von C zu A an Position 1 und G zu A an Position 2 des Kodons, was zu einem Arginin-zu-Lysin- Austausch führt (R131 K). Dieser Polymorphismus beeinflusst ebenfalls stark konservierte Sequenzen des UGT-Proteins. Auf Leucin-127 folgend, das in allen UGT1A7-Proteinen anwesend ist, ist ein LHN-L-Motiv (Aminosäuren 128-133) in
UGT1A1 , UGT1A3, UGT1A4 und UGT1A5 konserviert. An Aminosäureposition 128-
134 ist in UGT1A7, UGT1A8, UGT1A9 und UGT1A10 ein F-D-KLV-
Aminosäuremotiv konserviert. Die Analyse der N129K- und R131 K-Polymorphismen zeigte, dass diese Austausche nicht unabhängig voneinander auftreten. Es konnten homozygote UGT1A7*3-Allele identifiziert werden, was zeigt, dass die
N129K/R131 K-Mutationen auf einem einzelnen Allel identifiziert werden können, das unabhängig von UGT1A7*2 auftritt. Der N129/R131 K-Polymorphismus von
UGT1A7 entspricht der Wildtyp-Sequenz von UGT1A9 an diesen Kodons, was weiterhin nahelegt, dass die 3-Basenpaar-Mutationen als ein Haplotyp vererbt werden.
Das dritte Allel, UGT1A7 , verbindet alle Veränderungen, die in UGT1A7*2 und UGT1A7*3 beobachtet werden. Es wurden Individuen mit homozygoten Mutationen an den Kodons 11 , 129, 131 und 208 festgestellt, was anzeigt, das alle 4 Polymorphismen auf einem einzelnen Allel vorkommen können. Es ist bemerkenswert, dass die Polymorphismen an den Kodons 11 , 129, 131 oder 208 einzeln heterozygot oder homozygot auftraten.. Diese Beobachtung stützt auch wie oben ausgeführt die Annahme, dass die Polymorphismen an Kodons 11 und 208 und ebenfalls an Kodon 129 mit Kodon 131 als Haplotypen vererbt werden.
Auf Basis dieser Ergebnisse wird die Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Vorhersage des Gefährdungspotentials für Karzinomerkrankungen oder entzündlichen Darmerkrankungen und/oder für die Diagnose von Karzinomerkrankungen oder entzündlichen Darmerkrankungen gelöst, bei welchem eine DNA-Probe einer zu untersuchenden Person auf das Vorhandensein polymorpher UGT1A/-Allele, die Mutationen an den Kodons 11 , 129, 131 und/oder 208 umfassen, getestet wird.
Dabei wird insbesondere ein positives Ergebnis für eine Mutation an Kodon 11 und Kodon 208 als positives Anzeichen für eine Sensibilität für Karzinomerkrankungen, speziell für das Kolorektalkarzinom oder Kolonkarzinom (CRC) gewertet. Testmöglichkeiten hierfür sind nachfolgend angegeben. In Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass zusätzlich überprüft wird, dass die als positiv gewerteten Mutationen ein W208R-Austausch und eine stille Mutation CCC zu CCA des Kodons 11 sind.
Ferner wird gemäß dieser Erfindung ein positives Ergebnis für eine Mutation an allen vier Kodons 11 , 129/131 und 208 als Anzeichen für eine Sensibilität für eine entzündliche Darmerkrankung, nämlich insbesondere die unter dem Begriff "inflammatory bowl disease" (IBD) und Colitis ulzerosa gefassten Erkrankungen, und eine Karzinomerkrankung, speziell CRC, gewertet. In zugehörigen Tests kann vorgesehen sein, dass überprüft wird, dass die positiv gewerteten Mutationen N129K, R131 K und W208R sowie die stille Mutation CCC zu CCA an Kodon 11 sind.
Der identifizierte Zusammenhang von UGT1A7-Polymorphismen und dem kolorektalen Karzinom sowie den entzündlichen Darmerkrankungen, die ihrerseits einen Risikofaktor der Kolonkarzinogenese bilden, ermöglichen den Einsatz der hier beschriebenen Marker zur Identifizierung von Risikopatienten für Tumorerkrankungen. Da die Detoxifikationsenzyme, an denen hier Polymorphismen nachgewiesen wurden, eine globale Funktion im menschlichen Organismus ausüben, ist eine Relevanz über das hier dargestellte kolorektale Karzinom hinausgehend auch für andere Krebserkrankungen des Gastrointestinaltraktes, des Atemwegsystems, der Blutbildung und der Geschlechtsorgane und -drüsen wahrscheinlich.
Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, dass Patienten frühzeitig in entsprechende Risikogruppen eingeteilt und einer präventiven Behandlung zugeführt werden können, was zu einer Verbesserung der Früherkennung führt.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass das Verfahren auch für die Diagnose angewandt werden kann. Eine Verbesserung der Diagnose ist eine Möglichkeit noch schneller einen klaren Befund über den Zustand der Patienten zu erhalten und dementsprechend frühzeitiger und zielgerichteter zu therapieren. Ein frühzeitiges erkennen und sofortige Therapie sind gerade bei Karzinomerkrankungen von entscheidender Bedeutung. Das CRC ist bei früher Erkennung in den meisten Fällen vermeidbar oder heilbar. Für eine Untersuchung wird vorzugsweise genomische DNA aus Lymphozyten verwendet. Die genomische DNA kann aus einer Blutprobe des Probanden mittels säulenchromatographischer Verfahren und chemischer Aufbereitung isoliert werden.
Diese genomische DNA, die das Erbgut der zu untersuchenden Person repräsentiert, bildet die Grundlage aller weiteren genetischen Teststrategien.
Zunächst ist allgemein vorgesehen, dass die gewonnene Patienten-DNA mit der Polymerasekettenreaktion amplifiziert wird.
Hierfür kann in einer ersten Ausführungsform der Erfindung eine PCR-Amplifikation des gesamten Exons 1 des UGT1A7-Gens (ca. 855 Basenpaare) erfolgen, woran sich eine Sequenzanalyse anschließt. Die ermittelte Seqenz kann in geeigneter Weise ausgewertet, d.h. mit der Sequenz des Wildtyps und der für dieses Verfahren relevanten UGT1A7-Allele UGT1A7*2, UGT1A7*3 und UGT1A7*4 verglichen werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform werden nur gerade solche cDNA- Fragmente amplifiziert, die Aufschluss über die gesuchten Mutationen geben sollen. Vorzugsweise wird daher die DNA-Probe mit Hilfe spezifischer Primerpaare behandelt, von denen jeweils eines stromaufwärts und eines stromabwärts der relevanten mutierten DNA-Bereiche um die Kodons 11 , 129/131 oder 208 binden, und in einer Polymerasekettenreaktion werden cDNA-Fragmente erzeugt, die entsprechenden Fragmenten des Wildtyp-Allels oder der polymorphen Allele gleichen, wobei das Vorliegen von Mutationen an den Kodons 11 , 129, 131 und/oder 208 nachfolgend mit Hilfe von Sequenzierungs- und/oder Hybridisierungstechniken detektiert wird.
Vorzugsweise werden solche Primerpaare verwendet, die jeweils ca. 50 Basenpaare stromaufwärts und stromabwärts des Kodos 11 , des Kodons 129/131 sowie des Kodons 208 binden, wodurch etwa 100 bis 150 Basenpaare große cDNA- Fragmente erhalten werden.
Die Detektion der Polymorphismen kann mit Sequenzierungs- und/oder Hybridisierungsverfahren auf verschiedene Weise erfolgen. Der Fachmann ist hier grundsätzlich frei, aus den ihm bekannten Verfahren geeignete auszuwählen. Unter anderem können die gesuchten Polymorphismen durch Einzelstrang-
Konformationspolymorphismus-Analyse (SSCP) untersucht werden, indem die vollständige Rekombination eines mit der vorausgegangenen PCR erhaltenen Patienten-cDNA-Fragments mit einem jeweils entsprechenden cDNA-Fragment des Wildtyp-Allels zu Doppelsträngen detektiert wird. Das zugrundeliegende Prinzip beruht auf der Tatsache, dass eine variierte DNA-Sequenz nicht in der Lage ist komplett kongruente Doppelstränge mit der Wildtyp-Sequenz zu bilden. Dies kann für die Screening-Untersuchung gelelektrophoretisch dargestellt werden und zeigt die Existenz einer Mutation an. In einer Abwandlung dieser Methodik kann die Detektion der polymorphen cDNA-Fragmente durch Temperaturgradienten- Gelelektrophorese (TGGE) erfolgen.
Das Vorliegen oder Nichtvorliegen von Mutationen würde vorzugsweise durch Sequenzieren der betreffenden cDNA mittels automatisierter Fluoreszenzfarbstoffsequenzierung überprüft.
Eine weitere Detektionsmöglichkeit besteht darin, dass in einer rein PCR-basierten Strategie (amplification refractory mutation System, System der amplifizierungsresistenten Mutation) durch spezifische Primersequenzen, die an ihrem 3'-Terminus an den Basenaustausch des Polymorphismus binden, die Präsenz eines Polymorphismus dargestellt wird. Zugleich kann diese Methode modifiziert werden, heterozygote und homozygote Träger zu diskriminieren. Ein Ausführungsbeispiel dieser Methode als automatisierbares Testkit-System ist nachfolgend als Beispiel angegeben. Als Primer werden Oligonukleotide verwendet, die einerseits die Wildtyp-Sequenz und andererseits die polymorphe Sequenz binden, sowie korrespondierende Gegenprimer (anti sense Primer). Mit diesen entsteht immer nur dann ein PCR-Produkt, wenn der auf dem Primer kodierte Wildtyp oder das Primerkodierte polymorphe Allel vorliegt. Als Kontrollen werden definierte cDNAs eingesetzt, die die definierten Polymorphismen enthalten. Die Methode ist beispielsweise unter Einsatz der quantitativen Taqman-PCR automatisierbar.
Die PCR-Konjugate können auf übliche Weise mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Enzym-Markern nachgewiesen werden. Dem Fachmann stehen hierfür genügend geeignete Techniken zur Auswahl, die hier nicht gesondert beschrieben werden müssen.
Die Erfindung umfasst auch Testkits bzw. Testanordnungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die zu dieser Erfindung gehörige Testanordnung umfasst grundsätzlich zumindest die für das Verfahren erforderlichen genetischen Nachweisreagenzien, nämlich die erforderlichen Primer oder cDNAs, auf einem stationären Träger in einer für das Ablesen des Ergebnisses vorbereiteten Anordnung oder Reihenfolge, wobei vorgesehen ist, dass die vorbereiteten und zusätzlich markierten DNA-Proben des zu untersuchenden Individuums in Kontakt mit der Testanordnung gebracht werden, an einem der Nachweisreagenzien binden und mit Hilfe des Markers an diesem Ort detektiert werden. Dabei kann die Markierung der Probanden-DNA durch Fluoreszenzfarbstoffe oder radioaktive Isotope erfolgen.
Für eine Kombinationsanalyse mehrerer UGT1A7-Polymorphismen, die in jedem Fall zweckmäßig ist, können die hierfür erforderlichen verschiedenen Nachweisreagenzien, d.h. z.B. die Primer für die verschiedenen Kodons 11 , 129/131 und 208 oder die DNA-Fragmente von Wildtyp- und UGT1A7*2/3/4-Allele, je nach gewählter Strategie, gemeinsam auf einer Testanordnung, z.B. auf einem Genchip, immobilisiert sein.
Um das Ablesen des Ergebnisses zu erleichtern, ist es vorteilhaft, wenn auf dem stationären Träger eine Beschriftung oder ein Aufdruck in Zuordnung zu den Nachweisreagenzien angeordnet ist.
Die Kombinationsanalyse aller UGT1A7-Polymorphismen kann über eine Genchiptechnik erfolgen. Dabei kann beispielsweise in der stationären Phase die Oligonukleotid-Sequenz der Polymorphismen sowie des Wildtyps immobilisiert sein. Von der Probanden-DNA werden korrespondierende Oligonukleotide durch PCR amplifiziert und durch Fluoreszenzfarbstoffe, radioaktive Isotope oder andere Konjugate markiert. Die nachfolgende Hybridisierungsreaktion identifiziert das korrespondierende Oligonukleotid auf dem Gen-Array und determiniert die Existenz - Kl eines Polymorphismus. Verschiedene Ausführungen einer Array-basierten
Teststratgie sind möglich und können vom Fachmann an dieses Verfahren angepasst werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung können die polymorphen UGT1A7*2-, UGT1A7*3- und UGT1A7*4-Gene für die Herstellung zugehöriger UGT-Isotypen verwendet werden. Die Identifizierten Polymorphismen können als rekombinante Proteine exprimiert und beispielsweise für die metabolische Charakterisierung von Tumortherapeutike eingesetzt werden, um eine Vorhersage des Metabolismus dieser Substanzen zu ermöglichen. Ebenso können alle Polymorphismen von UGT1A7 dazu dienen, den Metabolismus von potentiell mutagenen oder krebserzeugenden Substanzen zu untersuchen, mit dem Ziel, Voraussagen über deren Giftigkeit oder karzinogenetische Potenz zu machen. Hierzu dient die Expression der polymorphen Allele in heterologen Expressionssystemen, in Bakterien, Eukaryotenzellkulturen und ihr nachfolgender Einsatz als Enzympräparation für katalytische Analysen. Testkits, die eine Serie verschiedener Polymorphismen-Proteine beinhalten, ermöglichen hier eine einfache in vitro Analyse.
Die Identifikation von Suszeptibilitätsmarkern für das Kolonkarzinom und entzündliche Darmerkrankungen ermöglicht prinzipiell deren Einsatz für gentherapeutische Strategien. Grundsätzliche gentherapeutische
Anwendungsmöglichkeiten sind dem Fachmann heute bereits bekannt, so dass verschiedene Umsetzungsmöglichkeiten offenstehen. Der Einsatz von UGT1A7 alleine oder in Kombination mit anderen homologen Mitgliedern dieser Enzymfamilie in der Tumortherapie ist eine Anwendung der definierten genetischen Assoziation.
Die Erfindung umfasst daher auch die Verwendung von UGT1A7-Genen oder - genfragmenten für die Herstellung eines gentherapeutischen Arzneimittels zur Behandlung bei UGT1A7-Polymorphismen des Typs UGT1A7*2, UGT1A7*3 und UGT1A7*4.
In Weiterbildung der Erfindung ist daher der orale oder parenterale Einsatz des rekombinanten Proteins von Genen der UGT1A-Familie in der Tumortherapie oder in der Tumorprävention bei Risikopatienten vorgesehen. Für den Transport von
UGT1A7 cDNA oder homologer UGT1A cDNAs in humane Zellen und Tumorzellen können Vektoren verwendet werden, die dem Fachmann grundsätzlich bekannt sind und die er mit seinem fachmännischen Wissen auswählen kann. Dies führt zur Expression des Proteins im Zielgewebe einschließlich von embryonalem oder fetalem Gewebe, wo das gentherapeutische UGT1A7-Arzneimittel für die
Modifikation von Vorläuferzellen verwendet werden kann.
Der Transport der UGT1A-cDNA kann beispielsweise durch parenterale Vektoren mit organspezifischen Promotoren, durch die intramuskuläre Injektion von UGT1A cDNA oder durch liposomverpackte cDNA über den Gastrointestinaltrakt erfolgen. Der Fachmann kann geeignete Delivery-Systeme im Rahmen seines Fachwissens aussuchen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und Figuren näher erläutert.
BEISPIEL 1 - Testbeispiel
Es werden Oligonukleotide (Primer) verwendet, die einerseits die Wildtyp-Sequenz und andererseits die polymorphen Sequenzen binden sowie korrespondierende Gegenprimer (anti sense Primer). Mit diesen entsteht immer nur dann ein PCR- Produkt, wenn der auf dem Primer kodierte Wildtyp oder das primerkodierte polymorphe Allel vorliegt. Das Prinzip ist in Figur 1 dargestellt. Als Kontrollen werden definierte cDNAs eingesetzt, die die definierten Polymorphismen enthalten.
ie verwendeten Primer sind in Tabelle 1 dargestellt:
Tabelle 1
Beim Einsatz dieser Primer in der automatisierten, quantitativen PCR werden Konjugate mit Fluoreszenzfarbstoffen, enzymatischen Markern oder anderen Markierungssystemen für DNA hergestellt und für diese Diagnostik genutzt. Die Markierungsmittel sind allgemein bekannt und werden hier nicht gesondert beschrieben.
Mit Hilfe dieses Testsystems wurden Ergebnisse gefunden, die spezifisch das Vorliegen homo- sowie heterozygoter Mutationen detektieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Die Anwendung dieser Analysen für alle drei polymorphen Genorte 11 , 129/131 und 208 ist deshalb von großer Bedeutung, da das Vorliegen des UGT1A7*2-Allels (Kodon 11 und 208) sowie des UGT1A7*4-Allels (Kodon 11 , 129, 131 , 208) mit dem kolorektalen Karzinom, aber nur das Vorliegen des UGT1A7*4 Alieis mit entzündlichen Darmerkrankungen assoziiert sind. Die genetische Analyse besteht daher zweckmäßigerweise aus der Kombination der Analysen an den identifizierten Orten im Sinne eines Testkits.
Testreihe an 111 Probanden
Die Proben wurden von 111 Patienten des Instituts für Gastroenterologie und Hepatologie der Medizinischen Hochschule Hannover im Jahr 1999 gesammelt.
Die folgenden Gruppen wurden untersucht: a) Die Kontrollgruppe (n = 54, 44,32 + 15,65 Jahre, 31 männlich/23 weiblich) wurde definiert als Patienten die keinen Befund auf vorhergehende Krebserkrankungen hatten, ausgeschlossen durch abdominalen Ultraschall und Endoskopie (obere und untere). b) Kolorektalkrebs-Patienten (n = 26, 62,15 ± 11 ,25 Jahre, 15 männlich / 11 weiblich) litten an Kolorektalkarzinom, wie durch Ausschluss nach den Amsterdamm Il-Kriterien bestätigt. c) Die Beispiele für entzündliche Darmerkrankungen (IBD) (n = 31 , 36,74 ± 11 ,79 Jahre, 14 männlich / 16 weiblich) umfassten Patienten mit Colitis ulzeriosa (n = 14, 35,07 ± 13,86 Jahre, 9 männlich / 5 weiblich) und Morbus Crohn (n = 17, 38,12 + 10,00 Jahre 5 männlich / 12 weiblich). Die Diagnosen der Colitis ulzeriosa und von Morbus Crohn basieren auf Befunden oberer und unterer Endoskopie und wurden histologisch durch intestinale Biopsien bestätigt.
Genomische DNA: Die genomische DNA wurde aus Vollblutproben mit Hilfe des QuiaAmp ® Systems nach den Empfehlungen des Herstellers präpariert (Quiagen, Hilden, Deutschland). Konzentrationsdaten wurden spektrophotometrisch bei 260 und 280 nm bestimmt, und die Proben wurden in 10 mM Tris/EDTA- Puffer (pH 8,0) bei 4 °C bis zur weiteren Untersuchung gelagert.
Analyse der UGT1A7 Exonl Sequenz: Die UGT1A7 Exon 1 -Sequenz wurde mit der Polymerasekettenreaktion amplifiziert. Der Forward-Primer war von Basenpaar 61 bis 38 stromaufwärts des ATG-Startkodons (GenBank Zugangsnummer U39570) von UGT1A7 (5'-gcggctcgagccacttactatattataggagct-3'). Der Gegenprimer lag zwischen Basenpaar 855 und 829 (GenBank Zugangsnummer U89507) der UGT1A7 Exonl -Sequenz (5'-gcggatatccataggcactggctttccctgatgaca-3').Die Lokalisierung des stromaufwärtigen Primers außerhalb des offenen Leserahmens war erforderlich um die Spezifität der Amplifikation zu erreichen, da die Exonl - Sequenz von UGT1A7-10 Homologien von 93 % besitzt. Ein 916 Basenpaare großes Produkt wurde in einem Volumen von 100 μl, enthaltend 10 mM KCI, 20 mM Tris-HCI (pH 8,8), 10 mM Ammoniumsulfat, 2 mM Magnesiumsulfat, 1 % Triton X- 100, 0,2 mM je dNTP, 20 ng genomische DNA, 2 μM Primer und 5 Einheiten VENT (exo-)DNA-Poiymerase (NEB, Beverly, MA) amplifiziert. Nach einem heißen Start bei 94 °C für 3 Minuten wurden 30 Zyklen bei 94 °C über 3 Sekunden, bei 57 °C für 30 Sekunden und bei 72 °C für 30 Sekunden auf einem Perkin Eimer Gene Amp PCR 2400 System gefahren. Die Produkte wurden in einer Elektrophorese mit 2% Agarosegel sichtbar gemacht und mit QuiaQuick ® Säulen gemäß den Angaben des Herstellers (Quiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt. Die Sequenzen der PCR- Produkte wurden an beiden Strängen mit automatisierter Fluoreszenzfarbstoffsequenzierung bestimmt (MWG-Biotech, Ebersbach, Deutschland). Die Sequenzdaten wurden mit dem PC-Gene-software-package (Oxford Molecular, Campbell, CA, U.S.A.) analysiert. Die statistische Analyse wurde mit dem Kruskal-Wallis-Test berechnet. GenBank Accession Numbers: UGT1A7*1 : U89507; UGT1A7*2: AF2969226;
UGT1A7*3: AF292627, UGT1A7*4 AF292627
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Figuren näher erläutert, wobei im Einzelnen zeigen:
Figur 1 die graphische Darstellung der UGT1A7-Polymorphismus-Diagnostik;
Figur 2 Assoziation von UGT1 A7*2 und UGT1 A7*4 mit NC, CRC und IBD;
Figur 3 3 polymorphe Orte(Sites) der menschlichen UGT1 A7 Exon 1 Sequenz; Figur 4 Vergleich der Regionen um das Kodon 11 , 129, 131 und 208;
Figur 5 Assoziationen zwischen der W208R Mutation und dem Kolorektalem
Karzinom und entzündlichem Darmerkrankungen.
Figur 1 zeigt eine UGT1A7-Polymorphismus-Diagnostik, bei der die Region um die identifizierten Polymorphismen durch Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert wird. Dabei werden spezifische Primerpaare verwendet, die zirka 50 Basenpaare stromaufwärts und stromabwärts des Kodons 11 , des Kodons 129/131 sowie des Kodons 208 binden. Bei dieser PCR werden 100 bis 150 bp große komplementäre Desoxyribonukleinsäure-Fragmente (cDNAs) erzeugt, die dem Wildtyp-Allel entsprechen oder die identifizierten Polymorphismen tragen.
Figur 2 zeigt die Analyse der Prävalenz der polymorphen UGT1A7-Allelen wie in Figur 3 definiert. Dies Analyse, die auf den definierten polymorphen UGT1A7-Allelen basiert zeigt eine Signifikante Assoziation von UGT1A7 und UGT1A7*2 mit kolorektalem Krebs (CRC) und dem geringen Vorkommen von diesen Allelen in der normalen Kontrollgruppe (NC). Im Gegensatz dazu sind entzündliche Darmerkrankungen (IBD) nur mit der Anwesenheit von UGT1A7*4 assoziiert. Weder für CRC noch für IBD wurde eine signifikante Assoziation mit dem UGT1A7*3-Allel gefunden. Die Assoziation von Verbindungen der heterozygoten UGT1A7*3/UGT1A7*4-Individuen mit CRC und IBD war jedoch signifikant. Statistisch signifikante Vergleiche sind durch * angezeigt. UGT1A7*2 ist definiert als eine Kombination von CCA an Kodon 11 und der W208R-Mutation. Dies beruht auf der Beobachtung, dass die zwei Mutationen immer kombiniert und nicht individuell heterozygot oder homozygot entweder an Kodon 11 oder Kodon 208 identifiziert werden. UGT1A7*2 wurde nicht als homozygotes Allel delektiert. UGT1A7*3 ist nur durch die Kombination von N129K und R131 K definiert. Diese Patenten waren entweder homozygot oder heterozygot sowohl fürN129K als auch R131 K. Das heterozygote UGT1A7*4 kann alternativ die Verbindung heterozygot UGT1A7*2/UGT1A7*3 repräsentieren.
Figur 3 zeigt eine graphische Darstellung der 3 polymorphen Sites, die in der menschlichen UGT1A7 Exon 1 Sequenz identifiziert wurden. Die Mutation CCC/A an Kodon 11 ist still. An Kodon 129, 131 und 208 führen die Mutationen zu Aminosäuresubstitutionen. Die Sequenzanalyse hat die Anwesenheit von 3 verschiedenen Polymorphismen aufgezeigt, die UGT1A7*2, UGT1A7*3 und UGT1A7 zugeordnet wurden. Der Austausch an Kodon 11 und 208 (UGT1A7*2) sowie die Polymorphismen an Kodon 129 und 131 (UGT1A7*3) kamen nicht einzeln vor.
Figur 4 zeigt, dass verglichen mit der Region um das Kodon 11 die identifizierten Polymorphismen an Position 129/131 und Position 208 in hochkonservierte Sequenzbereiche fallen. Der N129K/R131 K Polymorphismus repräsentiert die Wildtyp-Sequenz von UGT1A9 in dieser Position. W208R repräsentiert die Wildtyp- Sequenz von UGT1A8 und UGT1A9 an dieser Position.
Figur 5 zeigt, dass die Assoziation von W208R-Mutationen mit Kolorektalkarzinomerkrankungen und entzündlichen Darmerkrankungen hochgradig statistisch signifikant ist. Während Mutationen an Kodon 208 (W208R) nur in 22 % der Normalkontrollen auftreten, finden diese sich in 73 % der Patienten mit kolorektalen Karzinomen und in 61 % der Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen. Für das UGT1A7*2-Allel zeigte sich eine signifikante Assoziation mit dem kolorektalen Karzinom (19 % gegenüber 7 %) aber nicht mit entzündlichen Darmerkrankungen. Das UGT1A7*4-Allel war signifikant mit dem kolorektalen Karzinom sowie auch mit entzündlichen Darmerkrankungen assoziiert, während sich für UGT1A7*3 keine signifikante Assoziation zeigte (niedrige Signifikanzlevel). Die statistische Signifikanz für die Anwesenheit von W208R- Mutationen in CRC-Patienten (73%) gegenüber Normalkontrollen (22%) war sehr hoch (p < 0,0001 ) Hierbei wurden heterozygote (50% gegenüber 15%, p < 0,001 ) und homozygote (23 % gegenüber 7 %, p < 0,02) W208R-Mutationen berücksichtigt. Die Assoziation war niedriger, jedoch ebenfalls signifikant für IBD- patienten, die 61 % W208R-Mutationen (p < 0,0001 ) zeigte, in 35 % heterozygoten und 26 % homozygoten Individuen. Bei dem Auftreten der W208R-Mutationen zu 22% bei den Normalkontrollen ist zusätzlich zu berücksichtigen, dass ein tumorfreier
Zustand zum Zeitpunkt der Blutprobenentnahme die spätere Entwicklung von CRC nicht ausschließt.
Der * zeigt signifikante Level gegenüber den Normalenkontrollen (Kruskal Wallis Test). Im Folgenden bedeuten: n.s. - nicht signifikant, NC - Normalkontrollen; CRC - kolorektales Karzinom (colorectal carcinoma) und IBD - entzündliche Darmerkrankungen (inflammatory bowel disease).

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Vorhersage des Gefährdungspotentials für und/oder die Diagnose von Karzinomerkrankungen oder entzündlichen Darmerkrankungen aufgrund genetischer Disposition, dadurch gekennzeichnet, dass eine DNA-Probe einer zu untersuchenden Person auf das Vorhandensein polymorpher UGT1A7- Allele, die Mutationen an den Kodons 11 , 129, 131 und/oder 208 umfassen, getestet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei ein positives Ergebnis für eine Mutation an Kodon 11 und 208 als positives Anzeichen für eine Sensibilität für Karzinomerkrankungen, insbesondere für Dickdarm-, Bauchspeicheldrüsen-, Leber-, Magen- und Speiseröhrenkrebs gewertet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei überprüft wird, dass die als positiv gewerteten Mutationen ein W208R-Austausch und eine stille Mutation CCC zu CCA des Kodons 11 sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei ein positives Ergebnis für eine Mutation an Kodon 11 , 129, 131 und 208 als Anzeichen für eine Sensibilität für eine entzündliche Darmerkrankung und eine Karzinomerkrankung gewertet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei überprüft wird, dass die als positiv bewerteten Mutationen N129K, R131 K und I208R sowie die stille Mutation CCC zu CCA an Kodon 11 sind.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass für die Probe genomische DNA, vorzugsweise aus Lymphozyten, verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die genomische Desoxyribonukleinsäure aus einer Blutprobe mittels säulenchromatographischer Verfahren und chemischer Aufbereitung isoliert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass mit der DNA-Probe eine PCR-Amplifikation des Exons 1 von UGT1A7 (ca. 855 Basenpaare) mit anschließender Sequenzanalyse durchgeführt wird und die ermittelte Sequenz mit der des Wildtyps und der polymorphen Allele von UGT1A7 verglichen wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zu der DNA-Probe mit Hilfe spezifischer Primerpaare, von denen jeweils eines stromaufwärts und eines stromabwärts der relevanten mutierten DNA-Bereiche um die Kodons 11 , 129/131 oder 208 binden, in einer Polymerasekettenreaktion cDNA-Fragmente erzeugt werden, die entsprechenden Fragmente des Wildtyp- Allels oder der polymorphen Allele gleichen, und dass das Vorliegen von Mutationen an den Kodons 11 , 129, 131 und/oder 208 mit Hilfe von Sequenzierungs- und/oder Hybridisierungstechniken detektiert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Primerpaare jeweils ca. 50 Basenpaare stromaufwärts und stromabwärts des Kodons 11 , des Kodons 129/131 sowie des Kodons 208 binden, wodurch etwa 100 bis 150 Basenpaare große cDNA-Fragmente gebildet werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorliegen von Mutationen an den relevanten Kodons durch Einzelstrang- Konformationspolymorphismus-Analyse (SSCP) mit einem jeweils entsprechenden cDNA-Fragment des Wildtyp-Allels detektiert wird, wobei Wildtyp- und polymorphe Allele vorzugsweise gelelektrophoretisch, weiter vorzugsweise mit Temperaturgradienten-Gelelektrophorese (TGGE), unterschieden werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Vorliegen oder Nichtvorliegen von Mutationen durch Sequenzieren der betreffenden cDNA mittels automatisierter Fluoreszenzfarbstoffsequenzierung überprüft wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass mit einer Polymerasekettenreaktion mit Hilfe von Primer-Sequenzen, die an ihrem 3'-Terminus an den Basentausch des Polymorphismus binden, das Vorhandensein eines Polymorphismus nachgewiesen wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorliegen von Mutationen mit Hilfe homologer Olignucleotide mit der Wildtyp- oder der
Polymorphismus-Sequenz und korrespondierenden Gegenprimern (anti sense primern) mit einer PCR-Technik nachgewiesen wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine quantitative Taqman-PCR verwendet wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR- Konjugate mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Enzym-Markern nachgewiesen werden.
17. Testanordnung, umfassend die gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 erforderlichen genetischen Nachweisreagenzien, nämlich die erforderlichen Primer oder cDNAs, auf einem stationären Träger in einer für das Ablesen des Ergebnisses vorbereiteten Anordnung oder Reihenfolge, wobei die gemäß in einem der Ansprüche 8 bis 10 vorbereitete^ ) und zusätzlich markierten(n) DNA-Probe(n) eines zu untersuchenden Individuums bei Inkontaktbringen mit der Testanordnung an einem der Nachweisreagenzien bindet/binden und mit Hilfe des Markers an diesem Ort detektiert wird/werden.
18. Testanordnung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung durch Fluoreszenzfarbstoffe oder radioaktive Isotope erfolgt.
19. Testanordnung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweisreagenzien für eine Kombinationsanalyse mehrerer UGT1A7- Polymorphismen gemeinsam auf einer Testanordnung immobilisiert sind.
20. Testanordnung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem stationären Träger für das Ablesen des Ergebnisses eine Beschriftung oder ein Aufdruck in Zuordnung zu den Nachweisreagenzien angeordnet ist.
21. Verwendung von polymorphen UGT1A7*2-, UGT1A7*3- und UGT1A7*4-Gene für die Herstellung der von ihnen kodierten polymorphen UGT-Isoformen.
22. Verwendung der UGT-Isoformen nach Anspruch 21 für die metabolische Charakterisierung von Tumortherapeutika sowie zur Untersuchung der Toxizität und/oder Karzinogenität potentieller UGT1A7-Substrate.
23. Verwendung von UGTIA-Wildtyp-Genen oder -genfragmenten für die Herstellung eines gentherapeutischen Arzneimittels zur Behandlung bei UGT1A-Polymorphismen, insbesondere solchen des Typs UGT1A7*2 oder UGT1A7*4.
24. Verwendung von rekombinanten UGT1A7-Enzymen für therapeutische Zwecke.
EP02701160A 2001-01-05 2002-01-03 Verfahren zur vorhersage des gefährdungspotentials für karzinomerkrankungen und entzündliche darmerkrankungen und zugehörige tests Withdrawn EP1349964A2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10100238 2001-01-05
DE2001100238 DE10100238A1 (de) 2001-01-05 2001-01-05 Verfahren zur Vorhersage des Gefährdungspotentials für Karzinomerkrankungen und entzündliche Darmerkrankungen und zugehörige Tests
PCT/DE2002/000003 WO2002053770A2 (de) 2001-01-05 2002-01-03 Verfahren zur vorhersage des gefährdungspotentials für karzinomerkrankungen und entzündliche darmerkrankungen und zugehörige tests

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1349964A2 true EP1349964A2 (de) 2003-10-08

Family

ID=7669779

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP02701160A Withdrawn EP1349964A2 (de) 2001-01-05 2002-01-03 Verfahren zur vorhersage des gefährdungspotentials für karzinomerkrankungen und entzündliche darmerkrankungen und zugehörige tests

Country Status (5)

Country Link
US (2) US7264928B2 (de)
EP (1) EP1349964A2 (de)
JP (1) JP4274796B2 (de)
DE (2) DE10100238A1 (de)
WO (1) WO2002053770A2 (de)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6395481B1 (en) * 1999-02-16 2002-05-28 Arch Development Corp. Methods for detection of promoter polymorphism in a UGT gene promoter
US20030099960A1 (en) * 2001-01-26 2003-05-29 The University Of Chicago Compositions and methods for optimizing UGT2B7 substrate dosings and for predicting UGT2B7 substrate toxicity
US20040203034A1 (en) * 2003-01-03 2004-10-14 The University Of Chicago Optimization of cancer treatment with irinotecan
ES2308208T3 (es) 2003-05-30 2008-12-01 University Of Chicago Metodos y composiciones para predecir la toxicidad del irinotecano.
US20090247475A1 (en) * 2004-03-05 2009-10-01 The Regents Of The University Of California Methods and compositions relating to pharmacogenetics of different gene variants in the context of irinotecan-based therapies
WO2006027182A1 (en) * 2004-09-06 2006-03-16 Medizinische Hochschule Hannover Methods and its kits based on ugt1a7 promoter polymorphism
US20080255764A1 (en) * 2005-09-12 2008-10-16 Phenomenome Discoveries Inc. Methods for the Diagnosis of Colorectal Cancer and Ovarian Cancer by the Measurement of Vitamin E-Related Metabolites
SG165370A1 (en) 2005-09-12 2010-10-28 Phenomenome Discoveries Inc Method for the diagnosis of colorectal cancer and ovarian cancer by the measurement of vitamin e-related metabolites
EP1790343A1 (de) * 2005-11-11 2007-05-30 Emotional Brain B.V. Pharmazeutische Zusammensetzungen und deren Verwendung zur Behandlung sexueller Störungen der Frau

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3305197A (en) * 1996-06-06 1998-01-05 University Of Massachusetts Non-activated receptor complex proteins and uses thereof
EP1084271A2 (de) 1998-05-07 2001-03-21 Axys Pharmaceuticals, Inc. Typisierung des humanen udp-glucuronosyltransferase 1 (ugt1) genes
US6586175B1 (en) * 1998-07-28 2003-07-01 Dna Sciences Laboratories, Inc. Genotyping the human UDP-glucuronosyltransferase 2B7 (UGT2B7) gene
US6395481B1 (en) * 1999-02-16 2002-05-28 Arch Development Corp. Methods for detection of promoter polymorphism in a UGT gene promoter

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO02053770A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002053770A2 (de) 2002-07-11
JP4274796B2 (ja) 2009-06-10
WO2002053770A3 (de) 2003-07-24
JP2004533808A (ja) 2004-11-11
DE10100238A1 (de) 2002-08-22
DE10290016D2 (de) 2003-12-04
US7264928B2 (en) 2007-09-04
US20040121327A1 (en) 2004-06-24
US20080107604A1 (en) 2008-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Paavola et al. The locus for Meckel syndrome with multiple congenital anomalies maps to chromosome 17q21–q24
DE69800415T2 (de) Prostatakrebs-gen
Grison et al. Mesencephalic dopaminergic neurons express a repertoire of olfactory receptors and respond to odorant-like molecules
US20080107604A1 (en) Method for the Prediction of the Risk Potential for Cancerous Diseases and Inflammatory Intestinal Diseases and Corresponding Tests
Mäkelä-Bengs et al. Assignment of the disease locus for lethal congenital contracture syndrome to a restricted region of chromosome 9q34, by genome scan using five affected individuals
Poirier et al. Polymorphisms of genes of the cardiac calcineurin pathway and cardiac hypertrophy
DE60036487T2 (de) Polymorphismus im humanen mdr-1 gen und dessen verwendung
Bijlsma et al. Misleading linkage results in an NF2 presymptomatic test owing to mosaicism.
Ohtsuki et al. Mutational analysis of the synapsin III gene on chromosome 22q12-q13 in schizophrenia
DE602005004026T2 (de) Einen transkriptionsfaktor kodierendes humanes prädispositionsgen für autismus sowie dessen verwendungen
Reliene et al. Mouse models for induced genetic instability at endogenous loci
DE102005048899A1 (de) Verfahren zur Diagnose thromboembolischer Erkrankungen und koronarer Herzerkrankungen
Park Recent advances in Neurofibromatosis type 1 research: Towards tailored therapeutics and treatment strategies
Xiao et al. Identification of genes differentially expressed in wild type and Purkinje cell degeneration mice
DE102020111423B4 (de) MYH11/NDE1 Region als epigenetischer Marker für die Identifizierung von Endothel-Vorläuferzellen (EPCs)
Feng et al. Novel deletion of SPAST in a Chinese family with hereditary spastic paraplegia
KR102110883B1 (ko) 정신 질환 진단용 kmt2c 다형성 마커
Bian et al. No association of the C> T polymorphism that is located 1385 upstream from initial code of fibroblast growth factor 1 gene with Alzheimer's disease in Chinese
Gilliam et al. Huntington's disease
EP1052292B1 (de) Prostatakrebs-Gen
Jafarian-Motlagh et al. Metformin decreases the aneuploidy rate in the human preimplantation embryos of the patients with polycystic ovarian syndrome
Bijlsma et al. Misleading linkageresults in an NF2
Valdmanis Genetic analysis of amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron disorders
Bull Molecular genetic studies of Huntington's disease
Sohrabifar et al. Estrogen receptor alpha gene polymorphisms in patients with late onset Alzheimer’s disease

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20030801

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL LT LV MK RO SI

17Q First examination report despatched

Effective date: 20070516

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20111028