EP1261425A1 - Testsystem auf basis von mikrokapillaren - Google Patents

Testsystem auf basis von mikrokapillaren

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EP1261425A1
EP1261425A1 EP01915235A EP01915235A EP1261425A1 EP 1261425 A1 EP1261425 A1 EP 1261425A1 EP 01915235 A EP01915235 A EP 01915235A EP 01915235 A EP01915235 A EP 01915235A EP 1261425 A1 EP1261425 A1 EP 1261425A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
microcapillary
test
microcapillaries
columns
capillary
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01915235A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Karlheinz Hildenbrand
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
Bayer Technology Services GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG, Bayer Technology Services GmbH filed Critical Bayer AG
Publication of EP1261425A1 publication Critical patent/EP1261425A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0825—Test strips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0832—Geometry, shape and general structure cylindrical, tube shaped
    • B01L2300/0838—Capillaries
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0406—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces capillary forces
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N2035/00178—Special arrangements of analysers
    • G01N2035/00237—Handling microquantities of analyte, e.g. microvalves, capillary networks

Definitions

  • the present invention relates to a test system based on microcapillaries for determining a component in a liquid sample, preferably one
  • sample liquid for example whole blood or interstitial tissue fluid
  • capillary as used for example in chromatography
  • biosensors based on electrochemical detection reactions and test strips based on membranes in which color reactions are evaluated by reflectometry.
  • biosensors that suck in the patient's blood via so-called "sip in” mechanisms are particularly favorable.
  • the entire electrode compartment in the electrochemical sensors (see, for example, USP 5 759 364) must be covered with blood, for which purpose at least 3 ⁇ l blood or more are generally required for the products known hitherto.
  • blood for membrane-based test strips (e.g. USP 5 453 360) that are evaluated by reflectometry, even higher amounts of blood are usually required.
  • the electrochemical biosensors involve the application of an enzyme / mediator formulation, for example by screen printing or micropipetting to the sensor electrode compartment.
  • microporous membranes are soaked or coated with enzyme / indicator formulations.
  • Microcapillaries in numerous variations are already known from chromatography, in particular gas chromatography (GC), see e.g. B. "Making and Manipulating Capillary Columns for Gas Chromatography” by Kurt Grob, Huething Verlag, 1986.
  • GC gas chromatography
  • Microcapillary columns which are used for example in chromatography, have made significant progress with regard to the above. Target criteria can be achieved.
  • the invention therefore relates to the use of microcapillaries in test systems for taking samples by capillary forces.
  • the invention also relates to test systems for liquid samples in which the analyte is taken up via a microcapillary. Sampling and detection of the analyte preferably take place in the microcapillary.
  • the test systems according to the invention have the advantage that the sample liquid cannot come into contact with binders or adhesives of the test format.
  • Suitable microcapillaries are known in particular from gas chromatography.
  • Such gas chromatography (GC) microcapillary columns meet both in terms of
  • Capillary geometry as well as coating the inside of the capillary with reagents e.g. polyethylene glycols for hydrophilic stationary phases or polysiloxanes for hydrophobic stationary phases, a high standard in terms of reproducibility and precision.
  • reagents e.g. polyethylene glycols for hydrophilic stationary phases or polysiloxanes for hydrophobic stationary phases, a high standard in terms of reproducibility and precision.
  • Suitable microcapillaries are also known from capillary electrophoresis.
  • the dimensions and material properties of the microcapillaries used according to the invention are such that they draw in an essentially aqueous sample liquid by capillary forces.
  • the aspirated sample volume is preferably less than 3 ⁇ l, particularly preferably less than 1 ⁇ l, very particularly preferably 0.5 ⁇ l or less.
  • the microcapillaries used according to the invention preferably have a round cross section.
  • the inner diameter of the micro capillaries is preferably less than 500 ⁇ m, particularly preferably less than 250 ⁇ m, very particularly preferably
  • the length of the microcapillary used is preferably up to 2 cm, particularly preferably up to 1 cm, very particularly preferably approximately 0.5 cm.
  • microcapillaries When using microcapillaries according to the invention, it is important, depending on the measuring principle used in each case, that the microcapillary contained in the respective test format sucks in a precisely defined sample volume; this applies in particular to determinations of the reaction end point, for example of enzymatic color reactions.
  • GC or capillary electrophoresis columns have proven to be suitable for the purposes of the invention, the dimensions of which are usually such that even very small amounts of sample liquid, for example 0.5 ⁇ l blood or interstitial tissue fluid, are sufficient for a functional test with capillary lengths of 1 cm or less.
  • the capillary columns according to the invention also meet the requirements for so-called “minimally invasive” test kits, which should be particularly advantageous for the patient, in particular painless.
  • microcapillaries consist of a suitable material which is inert under the respective conditions.
  • suitable material examples include quartz glass, normal glass and metal, such as Steel.
  • the microcapillaries have an inner coating, which is also called the stationary phase in chromatography. Numerous materials are possible for this coating, which are known in principle from the GC columns. Suitable hydrophilic materials such as polyethylene glycols of various molecular weights (Carbowax ®), polyethylene glycol derivatives, for example. Carbowax monostearate 4000th Further hydrophilic stationary phases can be produced from
  • Polyethyleneimine, polypropylene glycol or cyclodextrins Polyethyleneimine, polypropylene glycol or cyclodextrins.
  • Hydrophobic materials are also suitable for the internal coating with regard to lipophilic stationary phases, with siloxane polymers or siloxane copolymers being the most common.
  • siloxane polymers or siloxane copolymers being the most common. Examples are dimethylpolysiloxanes, (50% cyanopropyl) methylpolysiloxanes, (50% trifluoropropyl) methylpolysiloxanes or 5% phenylpolycarborane polysiloxanes
  • PLOT columns Physical Layer Open Tubular
  • microcapillaries in the sense of this invention.
  • PLOT columns for example, aluminum oxide, silica gel, molecular sieve or porous polymers are used as stationary phases.
  • microcapillary columns that are suitable for the test elements according to the invention are capillary electrophoresis columns, which are also available with very small inner diameters of, for example, 25 ⁇ m.
  • the conventional capillary columns usually consist of the aforementioned quartz (fused silica).
  • the glass columns previously used have lost much of their importance in chromatography, but are of great importance for the test elements according to the invention because of their excellent transparency.
  • the quartz columns are usually provided with a yellow / brown high-temperature-resistant polymide layer on the outside. This removes the brittleness of the quartz capillary and creates flexible systems that are easy to handle.
  • test elements according to the invention is more particularly with colorimetric
  • microcapillaries as an essential component for the test kits according to the invention is their ability to suck in whole blood or other test liquids with the help of capillary forces.
  • Suitable surfactants are ionic, for example SDS, zwitterionic, for example phospholipids and non-ionic, for example Pluronic R or fluorosurfactants (for example Bayowet
  • the sample liquid is usually an essentially aqueous liquid, in particular a body liquid.
  • a sample liquid is usually an essentially aqueous liquid, in particular a body liquid. Examples are urine, interstitial tissue fluid and blood.
  • Typical analytes that can be determined are, for example, glucose, bilirubin, ketones, pH, proteins and cholesterol.
  • the detection reagents are preferably in the inner coating of the
  • Microcapillary (stationary phase) included.
  • the measurement is usually made through the microcapillary wall, e.g. colorimetry.
  • the systems established in diagnostics can be used, e.g. Detection via enzymatic or non-enzymatic color reactions or by electrochemical means, where
  • Color reactions in particular enzymatic color reactions, are preferred. So for example, there are various enzymatically controlled color reactions for the quantitative detection of blood sugar to choose from, with oxygen-independent enzyme reactions being preferred for the capillary test kits described here.
  • glucose detection for example, the glucose dehydrogenase system or the hexokinase system with tetrazolium indicators can be used.
  • the appropriate reagents can be incorporated either via the recipes for the stationary phases, by subsequent coating on the stationary phases, or by combining these variants.
  • test reaction can either be heterogeneous, i.e. in the stationary phase, or the detection reagents incorporated in the stationary phase can dissolve in the sample liquid, a homogeneous reaction then taking place in the liquid phase, which can be monitored colorimetrically.
  • the color reaction can be evaluated, in particular when using PLOT columns, for example with aluminum oxide as the stationary phase, via refiection or with a transparent capillary system, for example GC columns with Polywax as the stationary phase, in transmission, with either the reaction kinetics or the reaction end point being determined can be.
  • PLOT columns for example with aluminum oxide as the stationary phase
  • a transparent capillary system for example GC columns with Polywax as the stationary phase
  • the transmission measurement of the color reaction can also be carried out in the
  • test formats are in principle familiar to the person skilled in the art. Those are preferred Formats that allow an optical evaluation of an enzymatic color reaction taking place in the microcapillary.
  • test strip format was produced with the help of polymer films and double-sided adhesive tapes, which also applies to the following
  • Fig. 1 shows the cross section of a microcapillary test format with cover film (1), spacer film (2), double-sided adhesive tape (3), microcapillary (4) and base film (5).
  • Fig. 2 shows a microcapillary test format in a top view.
  • test strip can also be constructed in such a way that there is no film or film at the point where it is photometrically evaluated
  • Adhesive tapes are present.
  • the top cover film can be transparent so that the filling process of the capillary can be observed.
  • the same goal namely the registration of the complete filling of the capillary with sample liquid, can also be achieved by using filler-containing (white) cover films which have a cutout at the end of the capillary column as a viewing window.
  • test arrays can be arranged vertically parallel to the geometry of microtiter plates, which, when immersed, sample liquids from the Aspirate individual microtiter plate compartments and trigger corresponding detection reactions.
  • Example 1 Preparation of an enzyme / indicator formulation
  • Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (Fluka 88415) Enzymes: glucose dehydrogenase (GDH 35U / mg)
  • Phospholipon 90G Rhone Poulenc
  • Microcapillary column HP-PLOT Al 2 O 3 "KCl” - deactivation 0.32 mm
  • a 1 cm long, coated microcapillary piece (Polywax coated GC column from Macherey-Nagel 320 ⁇ m inner diameter) sucked whole blood in without any problems ( ⁇ 1 sec.)
  • Each 1 cm long prepared capillary column was watered with the following
  • the brown polyimide coating was flamed to evaluate the color reaction.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Testsystem auf Basis von Mikrokapillaren für die Bestimmung einer Komponente in einer flüssigen Probe, vorzugsweise eines Analyten in einer Körperflüssigkeit und insbesondere von Glucose im Blut.

Description

Testsvstem auf Basis von Mikrokapillaren
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem auf Basis von Mikrokapillaren für die Bestimmung einer Komponente in einer flüssigen Probe, vorzugsweise eines
Analyten in einer Körperflüssigkeit und insbesondere von Glucose im Blut.
Charakteristisch für das beschriebene Testsystem ist, dass die Probenflüssigkeit, beispielsweise Vollblut oder interstitielle Gewebsflüssigkeit über Kapillarkräfte in eine Kapillare, wie sie beispielsweise in der Chromatographie verwendet werden, eingesaugt wird.
Die Selbstdiagnose im home user Bereich insbesondere von Blutzucker ist seit vielen
Jahren etablierter Stand der Technik.
Dennoch ist eine ständige Weiterentwicklung der bestehenden Produkte anzustreben mit dem Ziel, weitere Verbesserungen in der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit sowie insbesondere in der Handhabung und Benutzerfreundlichkeit zu erzielen.
Stand der Technik sind Biosensoren, basierend auf elektrochemischen Nachweisreaktionen sowie Teststreifen auf Membranbasis bei denen Farbreaktionen reflektormetrisch ausgewertet werden.
Im Hinblick auf Benutzerfreundlichkeit werden insbesondere Biosensoren, die über sog. "sip in" Mechanismen das Patientenblut einsaugen, günstig beurteilt.
Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, muss bei den elektrochemischen Sensoren (siehe z. B. USP 5 759 364) das gesamte Elektrodenkompartiment mit Blut bedeckt sein, wozu bei den bisher bekannten Produkten in der Regel mindestens 3 μl Blut oder mehr benötigt werden. Bei Teststreifen auf Membranbasis (z. B. USP 5 453 360), die reflektometrisch ausgewertet werden, sind in der Regel noch höhere Blutmengen erforderlich.
Im Hinblick auf Reproduzierbarkeit und Präzision sind neben der Konstanz der Sensorgeometrie bzw. Membranmorphologie v. a. die gleichmäßige Applikation des biochemischen Reagenzsystems in das Testelement entscheidend.
Bei den elektrochemischen Biosensoren handelt es sich hierbei um die Aufbringung einer Enzym/Mediator-Rezeptur, beispielsweise per Siebdruck oder Mikropipetting auf das Sensor-Elektrodenkompartiment.
Bei den colorimetrischen Teststreifensysteme werden mikroporöse Membranen mit Enzym/Indikator-Rezepturen getränkt bzw. beschichtet.
Mikrokapillaren in zahlreichen Variationen sind bereits aus der Chromatographie, insbesondere der Gaschromatographie (GC), bekannt, siehe z. B. "Making and Manipulating Capillary Columns for Gas Chromatography" von Kurt Grob, Huething Verlag, 1986.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass auf Basis von
Mikrokapillarsäulen, die beispielsweise in der Chromatographie verwendet werden, deutliche Fortschritte hinsichtlich der o. g. Zielkriterien erreicht werden können.
Die Erfindung betrifft daher die Verwendung von Mikrokapillaren in Testsystemen zur Probeaufnahme durch Kapillarkräfte.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch Testsysteme für flüssige Proben, bei denen die Probenaufnahme des Analyten über eine Mikrokapillare erfolgt. Bevorzugt finden Probenaufnahme und Detektion des Analyten in der Mikrokapillare statt. Die erfindungsgemäßen Testsysteme haben den Vorteil, daß die Probenflüssigkeit nicht mit Bindemitteln oder Klebstoffen des Testformats in Kontakt kommen kann.
Geeignete Mikrokapillaren sind insbesondere aus der Gaschromatographie bekannt. Solche Gaschromatographie-(GC)-Mikrokapillarsäulen erfüllen sowohl hinsichtlich
Kapillargeometrie als auch Beschichtung der Kapillarinnenseite mit Reagenzien, bspw. Polyethylenglykole für hydrophile stationäre Phasen oder Polysiloxane für hydrophobe stationäre Phasen, einen hohen Standard hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Präzision. Auch aus der Kapillarelektrophorese sind geeignete Mikrokapillaren bekannt.
Die Dimensionen und Materialeigenschaften der erfindungsgemäß eingesetzten Mikrokapillaren sind so beschaffen, daß sie eine im wesentlichen wäßrige Probenflüssigkeit durch Kapillarkräfte einsaugen. Das eingesaugte Probevolumen ist dabei vorzugsweise kleiner 3 μl, besonders bevorzugt kleiner 1 μl, ganz besonders bevorzugt 0,5 μl oder kleiner.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikrokapillaren haben bevorzugt einen runden Querschnitt. Der Innendurchmesser der Mikorkapillaren beträgt bevorzugt weniger als 500μm, besonders bevorzugt weniger als 250μm, ganz besonders bevorzugt
25μm bis 200 μm.
Die Länge der verwendeten Mikrokapillare beträgt vorzugsweise bis zu 2 cm, besonders bevorzugt bis zu 1cm, ganz besonders bevorzugt ca. 0.5 cm.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung von Mikrokapillaren ist es in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Meßprinzip wichtig, daß die in dem jeweiligen Testformat enthaltene Mikrokapillare ein genau definiertes Probevolumen einsaugt; dies gilt insbesondere für Bestimmungen des Reaktionsendpunktes, z.B. von enzymatischen Farbreaktionen. Als für die erfindungsgemäßen Zwecke geeignet haben sich GC- oder Kapillarelektrophoresesäulen erwiesen, deren Dimensionen üblicherweise so beschaffen sind, dass bereits sehr geringe Probeflüssigkeitsmengen, bspw. 0,5 μl Blut oder interstitielle Gewebsflüssigkeit für einen Funktionstest bei Kapillarlängen von 1 cm oder weniger ausreichend sind.
Wegen der geringen Probevolumina erfüllen die erfindungsgemässen Kapillarsäulen auch die Anforderungen an sog. "minimal invasive" Testkits, die für die Patienten besonders vorteilhaft, insbesondere schmerzarm sein sollen.
Die Mikrokapillaren bestehen aus einem geeigneten unter den jeweiligen Bedingungen inerten Material. Beispiele hierfür sind Quarzglas, normales Glas und Metall, wie z.B. Stahl.
Die Mikrokapillaren tragen eine Innenbeschichtung, die in der Chromatographie auch als stationäre Phase bezeichnet wird. Für diese Beschichtung kommen zahlreiche Materialien in Frage, die im Prinzip von den GC-Säulen bekannt sind. Geeignet sind hydrophile Materialien wie z.B. Polyethylenglykole mit verschiedenen Molekulargewichten (Carbowax®), Polyethylenglycolderivate, bspw. Carbowax 4000 monostearat. Weitere hydrophile stationäre Phasen können hergestellt werden aus
Polyethylenimin, Polypropylenglycol oder Cyclodextrinen.
Auch hydrophobe Materialien eignen sich für die Innenbeschichtung im Hinblick auf lipophile stationäre Phasen, wobei Siloxan- Polymere, bzw. Siloxancopolymere die gängigsten sind. Beispiele sind Dimethylpolysiloxane, (50% Cyanopropyl)- methylpolysiloxane, (50% Trifluorpropyl)- methylpolysiloxane oder 5% Phenylpolycarboranpolysiloxane
Hinsichtlich Aufbringen der stationären Phasen (Innenbeschichtung der Mikrokapillarsäulen) sei auf von den GC-Säulen bekannte Standardverfahren verwiesen. Es stehen, wie in o.g. Literatur (K. Grob, 1986) beschrieben, zwei prinzipielle Verfahren zur Verfügung. Es handelt sich um das "Static Coating" und "Dynamic Coating". Nach diesen Verfahren können Kapillaren in 60 bis 100 m Länge beschichtet werden. Die Polymeren der stationären Phasen können auch, wie in o. g. Literatur beschrieben, kovalent an die Oberfläche der Quarzsäule gebunden sein.
Neben den konventionellen GC-Säulen können auch sogenannte PLOT-Säulen (Porous Layer Open Tubular) als Mikrokapillaren im Sinne dieser Erfindung eingesetzt werden. In PLOT-Säulen werden als stationäre Phasen bspw. Aluminiumoxid, Kieselgel, Molekularsieb, oder poröse Polymere eingesetzt.
Weitere Mikrokapillar-Säulentypen, die für die erfindungsgemäßen Testelemente in Frage kommen, sind Kapillarelektrophorese-Säulen, die auch mit sehr geringen Innendurchmessern von bspw. 25 μm angeboten werden.
Die konventionellen Kapillarsäulen bestehen üblicherweise aus dem bereits erwähnten Quarz (fused silica). Die früher verwendeten Glassäulen haben in der Chromatographie stark an Bedeutung verloren, sind aber wegen ihrer hervorragenden Transparenz für die erfindungsgemässen Testelemente durchaus von Bedeutung.
Die Quarzsäulen sind in der Regel auf ihrer Außenseite mit einer gelb / braunen hochtemperaturbeständigen Polymidschicht versehen. Dadurch wird die Sprödigkeit der Quarzkapillare aufgehoben und es entstehen gut handhabbare flexible Systeme.
Für die erfindungsgemäßen Testelemente ist insbesondere bei colorimetrischer
Auswertung eine gute Transparenz erforderlich. Anstelle der farbigen Polymidbeschichtungen können daher auch transparente, farblose Polymere, wie z.B. Polysiloxane, Acrylpolymere, Polyvmylacetat, Polycarbonat, Polyamid oder Polyetherpolysulphon verwendet werden. Gegebenenfalls kann auch die störende Beschichtung im entsprechenden Bereich der Mikrokapillare für die optische
Auswertung entfernt werden. Essentielle Voraussetzung für die Mikrokapillaren als wesentlichem Bestandteil für die erfingungsgemäßen Testkits ist ihre Eigenschaft, Vollblut oder andere Testflüssigkeiten, mit Hilfe von Kapillarkräften einzusaugen.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass Säulen mit hydrophilen Beschichtungen, z. B. mit Polyethylenglykol (Carbowax®) oder Aluminiumoxid Blut hervorragend einsaugen, während mit hydrophoben Beschichtungen modifizierte Säulen (z. B. Polysiloxan-modifizierte) diese Eigenschaft nicht zeigten.
Letztere Säulentypen können jedoch durch Nachbehandeln mit bestimmten Tensiden dahingehend modifiziert werden.
Geeignete Tenside sind ionische, beispielsweise SDS, zwitterionische, bspw. Phospholipide und nicht ionische bspw. PluronicR oder Fluortenside (bspw. Bayowet
FT 219® ).
Die Probenflüssigkeit ist üblicherweise eine im wesentlichen wäßrige Flüssigkeit, insbesondere eine Körperflüssigkeit. Beispiele sind Urin, interstitielle Gewebsflüssigkeit und Blut.
Typische Analyten, die bestimmt werden können sind bspw. Glucose, Bilirubin, Ketone, pH-Wert, Proteine und Cholesterin.
Die Nachweisreagenzien sind vorzugsweise in der Innenbeschichtung der
Mikrokapillare (stationären Phase) enthalten. Die Messung erfolgt üblicherweise durch die Mikrokapillarwand hindurch, z.B. colorimetrisch. Im Hinblick auf die Integration der analytspezifischen Nachweisreagenzien können die in der Diagnostik etablierten Systeme eingesetzt werden, wie z.B. Nachweis über enzymatische oder nichtenzymatische Farbreaktionen oder auf elektrochemischem Weg, wobei
Farbreaktionen, insbesondere enzymatische Farbreaktionen, bevorzugt sind. So stehen beispielsweise für den quantitativen Nachweis für Blutzucker verschiedene enzymatisch gesteuerte Farbreaktionen zur Auswahl, wobei für die hier beschriebenen Kapillar-Testkits Sauerstoff-unabhängige Enzym-Reaktionen bevorzugt werden.
Für den Glucose-Nachweis kommen beispielsweise das Glucose- Dehydrogenasesystem oder das Hexokinasesystem mit Tetrazoliumindikatoren in Frage.
Die Einarbeitung der entsprechenden Reagenzien kann entweder über die Rezepturen für die stationären Phasen, durch nachträgliche Beschichtung auf die stationären Phasen oder durch Kombination dieser Varianten erfolgen.
Die Testreaktion kann entweder heterogen, d.h. in der stationären Phase, ablaufen oder die in der stationären Phase eingearbeiteten Nachweisreagenzien können sich in der Probenflüssigkeit auflösen, wobei dann eine homogene Reaktion in der flüssigen Phase abläuft, die colorimetrisch verfolgt werden kann.
Die Auswertung der Farbreaktion kann, insbesondere bei Verwendung von PLOT- Säulen, beispielsweise mit Aluminiumoxid als stationäre Phase, über Refiektion oder bei transparentem Kapillarsystem, bspw. GC Säulen mit Polywax als stationäre Phase, in Transmission erfolgen, wobei entweder die Reaktionskinetik oder der Reaktionsendpunkt bestimmt werden können.
Je nach Indikatortyp kann die Transmissionsmessung der Farbreaktion auch in der
Vollblutprobe, ohne vorherige Abtrennung der roten Blutkörperchen, erfolgen.
Im Hinblick auf eine praktikable Handhabung sind die erfindungsgemäßen
MikrokapiUarsysteme in ein entsprechendes Format zu integrieren. Geeignete Testformate sind dem Fachmann im Prinzip geläufig. Bevorzugt sind solche Formate, die eine optische Auswertung einer in der Mikrokapillare erfolgenden enzymatischen Farbreaktion erlauben.
Wie die Abb. 1 und 2 zeigen, wurde mit Hilfe von Polymerfolien und Doppelklebebändern ein "Teststreifenformat" hergestellt, das auch für den folgenden
Versuch eingesetzt wurde.
Abb. 1 zeigt den Querschnitt eines Mikrokapillar-Testformats mit Abdeckfolie (1), Abstandshalter-Folie (2), Doppelklebeband (3), Mikrokapillare (4) und Basisfolie (5).
Abb. 2 zeigt ein Mikrokapillar-Testformat in einer Aufsicht.
Der Teststreifen-Aufbau kann auch so erfolgen, dass an der Stelle an der photometrisch ausgewertet wird, durch entsprechendes Auslochen keine Folien oder
Klebebänder anwesend sind.
Die obere Abdeckfolie kann transparent sein, so dass man den Füllprozess der Kapillare beobachten kann.
Dasselbe Ziel, nämlich die Registrierung der vollständigen Füllung der Kapillare mit Probenflüssigkeit, kann auch dadurch erreicht werden, dass füllstoffhaltige (weisse) Abdeckfolien verwendet werden, die am Ende der Kapillarsäule einen Ausschnitt als Sichtfenster haben.
Neben der medizinischen Diagnostik sind für die erfindungsgemässen MikrokapiUarsysteme auch Anwendungen auf dem Gebiet des "High Throughput Screenings" denkbar.
So sind senkrecht parallel der Geometrie von Mikrotiterplatten entsprechend angeordnete Testarrays vorstellbar, die beim Antauchen Probeflüssigkeiten aus den einzelnen Mikrotiterplatten-Kompartimenten ansaugen und entsprechende Nachweisreaktionen auslösen.
Beispiele
Beispiel 1 : Herstellung einer Enzym/Indikator Rezeptur
1.1.Komponenten
Indikator: Thiazolylblau Tetrazoliumbromid (MTT)
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium-bromid (Fluka 88415) Enzyme: Glucosedehydrogenase (GDH 35U/mg)
Diaphorase (54 U/mg) Coenzym: NAD (Diphosphopyridinnucleotid Monohydrat)
Tensid: Phospholipon 90G (Rhone Poulenc)
1.2. Stammlösungen Indikatorlösung: 10% MTT in Methanol Enzym/Coenzym Lösungen: Jeweils Im Lösungen in Phosphatpuffer pH 7.0
Tensidlösung: 10% Phospholipon 90G in isoPropanol
1.3. Tränkrezeptur:
Folgende Komponenten wurden unter Rühren vermischt, wobei eine klare Lösung erhalten wurde.
MTT Lösung: 11.43 g
GDH Lösung: 28.57 g
Diaphorase Lösung. 28.57 g
NAD Lösung: 28.57 g Phospholipon Lösung: 2.86 g
Beispiel 2: Beschichten einer PLOT Säule
Mikrokapillarsäule: HP-PLOT Al2O3 "KCl"- Deaktivierung 0.32 mm
Innendurchmesser Wie in o.g. Literatur (K. Grob) beschrieben, wurde ein 20cm langes Stück der PLOT Säule mit Hilfe einer Spritze gefüllt.
Nach etwa 2 min. wurde Stickstoff durchgeblasen, anschliessend wurde die Säule mit Warmluft (40°C) getrocknet.
Beispiel 3: Einsaugverhalten mit Blut
Ein 1 cm langes, beschichtetes Mikrokapillarstück(Polywax beschichtete GC Säule der Fa Macherey-Nagel 320 μm Innendurchmesser) saugte Vollblut problemlos ein (< 1 sec.)
Testen mit Glucoselösungen:
Jeweils 1 cm lange präparierte Kapillarsäulen wurden mit folgenden wässerigen
Lösungen getestet: 0, 25,100,250 mg/dl Glucose.
Beim Einsaugen der Glucoselösungen wurden mit steigender Glucosekonzentration
Blaufärbungen mit zunehmender Intensität beobachtet.
Zum Auswerten der Farbreaktion wurde die braune Polyimidbeschichtung abgeflammt.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Mikrokapillaren in Testsystemen zur Probenaufhahme durch Kapillarkräfte.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Mikrokapillare auf der inneren
Oberfläche eine Beschichtung trägt und das Nachweissystem für den Analyten enthält.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Bestimmung von Glucose in Blut.
4. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Mikrokapillare aus Glas oder Quarz besteht.
5. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Innendurchmesser der Mikrokapillare 500 μm oder weniger beträgt.
6. Testsystem für flüssige Proben, bei dem die Probenaufhahme über eine Mikrokapillare erfolgt.
7. Testsystem gemäß Anspruch 6, bei dem die Probenaufhahme und die
Detektion des Analyten in der Mikrokapillare erfolgen.
8. Testsystem gemäß Anspruch 6 oder 7, bei dem das eingesaugte
Probevolumen kleiner 3 μl ist.
EP01915235A 2000-02-25 2001-02-13 Testsystem auf basis von mikrokapillaren Withdrawn EP1261425A1 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
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