EP1230386A2 - Diagnosis kit, method and microarray for determining human detoxification capacity - Google Patents

Diagnosis kit, method and microarray for determining human detoxification capacity

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EP1230386A2
EP1230386A2 EP00969543A EP00969543A EP1230386A2 EP 1230386 A2 EP1230386 A2 EP 1230386A2 EP 00969543 A EP00969543 A EP 00969543A EP 00969543 A EP00969543 A EP 00969543A EP 1230386 A2 EP1230386 A2 EP 1230386A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
oligonucleotides
dna
diagnostic kit
enzyme
kit according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00969543A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Stefanie WASCHÜTZA
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Alere Diagnostics GmbH
Original Assignee
Adnagen GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Adnagen GmbH filed Critical Adnagen GmbH
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic kit, a method, a microarray and their
  • Diagnostic kits, methods and microarrays of this type are used in the field of environmental medicine and occupational medicine and the associated diseases such as neurodermatitis, asthma, MCS (multiple chemical sensitivity, multiple chemical sensitivity) or CFS (chronic fatigue syndrome, fatigue syndrome). They are also used in the field of pharmacology or to determine the human metabolism of medication or new products.
  • phase I reaction the order ⁇ world poisons initially by enzymes from the Zytochromsy- stem m reactive intermediates implemented, but which can be acutely toxic than the contaminants themselves.
  • These intermediates of the phase I reaction can, for example, to cellular components bind and thereby cause damage.
  • chronic damage is usually due to the water-insoluble starting substances.
  • phase II subsequent to phase I
  • the reaction converts the reactive intermediate products into end products that can be separated.
  • Phase I describes the implementation and activation of various known drugs and environmental chemicals (e.g. debrisoqum, opioids, Benzo (a) pyrene, polycyclic and aromatic hydrocarbons) and a number of as yet unknown xenobiotics to electrophilic, radical substances.
  • drugs and environmental chemicals e.g. debrisoqum, opioids, Benzo (a) pyrene, polycyclic and aromatic hydrocarbons
  • phase II reactions There are several reaction pathways in phase II reactions, including glucoronidation, sulfate ester formation, amino acid conjugation, the enzymes of the most important phase II reaction pathway (glutathione S transferases) being the intermediates from phase I (e.g. Deactivate epoxides, nitrosams) to end products that can be eliminated by conjugation with glutathione.
  • glutathione S transferases the enzymes of the most important phase II reaction pathway (glutathione S transferases) being the intermediates from phase I (e.g. Deactivate epoxides, nitrosams) to end products that can be eliminated by conjugation with glutathione.
  • glutathione-S-transferase This deactivates intermediates from the phase I reaction to end products which can be excreted by conjugation with glutathione, the reduced form of which has a nucleophilic SH group which easily reacts with electrophilic carbon atoms to form the thioether.
  • the highest possible activity of glutathione S-Transf erase means efficient conjugation and rapid detoxification, while a reduced or no activity of the Glutathione-S-Transferase causes a slow detoxification.
  • the system of glutathione-S-transferase has several different enzymes, for example the glutathione-S-transferase GSTM1 and the glutathione-S-transferase GSTT1.
  • the glutathione-S-transferase GSTM1 has a polymorphism in which the individual genotypes coexist on an equal footing.
  • Genotype 00 indicates the lack of the gene for GSTM1. If there is a functional gene, two different variants A and B can be distinguished. Both variants form active homodimeric enzymes (AA / BB or in the absence of the gene for an allele A0 / B0) or heterodimeric enzymes (AB), the mixed form AB showing the highest enzyme activity and, among other things, is made responsible for the "drug-resistance" phenomena in chemotherapy.
  • Glutathione-S-Transferase Ml plays a major role in the liver, lungs and skin, with the null genotype occurring in about 40% of the Caucasian population. This zero genotype is described with the development of various tumor diseases (lung, skin, and bladder cancer) as well as chronic diseases with environmental pollution factors (asbestosis, chronic bronchitis).
  • Glutathione-S-Transferase GSTT1 The glutathione-S-Transf erase Tl comes u. a. in the liver and erythrocytes and mediates glutathione conjugation with halogenated hydrocarbons and epoxides. No enzyme activity of glutathione-S-transferase was found in erythrocytes in about 25% of the German population examined to date. Genotype 00 indicates the lack of the gene for this glutathione S-transferase. The O genotype is therefore regarded as a risk factor because the GSTT1-mediated activity against DNA-damaging peroxides and other metabolites is reduced.
  • Known toxic substrates of GSTT1 include a. Methyl bromide, ethylene oxide and methylene chlorine id.
  • a stress test is carried out according to the state of the art, which can be used to determine the detoxification ability and thus enzyme activity of this individual.
  • this is done by administering a test substance that is broken down by the enzymes to be examined and then determining the clearance of the individual in question for this substance.
  • the disadvantage of this is that the determination of the enzyme activities can only be determined by additional exposure of the person to a chemical. Such a method of determination is particularly forbidden for children or people with a reduced general condition or people who are known to be heavily polluted. Therefore, this method cannot be used in every case, especially not in persons for whom the determination of the enzyme activity would be particularly important for determining the appropriate therapy due to their pollution.
  • DE 197 38 908 which goes back to the same inventors as the present invention, proposes to determine genetic polymorphisms of genes in individuals which code for an enzyme from the detoxification metabolism.
  • the polymorphism can consist of both the creation of a gene and m different allelic variabilities of one or more polymorphic genes.
  • the object of the present invention is therefore to provide a diagnostic kit, a microarray, a method and uses thereof, with which the human detoxification ability can be determined in a simple manner by any laboratory in a standardized manner.
  • the diagnostic kit according to the invention contains the substances required to carry out a polymerase chain reaction, as are also offered by various manufacturers. Furthermore, the diagnostic kit contains at least one pair of oligonucleotides, which are required as a reversepimer and forward primer for the amplification by means of the polymerase chain reaction. Such oligonucleotides are also used in the methods according to the invention. The oligonucleotides of the pairs are selected according to the invention in such a way that an amplification of a DNA segment takes place which codes for at least part of the enzyme GSTT1 of the animal detoxification metabolism. If an DNA segment is thus amplified, it can simply be determined whether a gene for the enzyme GSTT1 is present. This enables a zero-type determination.
  • oligonucleotides are used in the methods according to the invention or are given in the diagnostic kit for each of the alleles, so that an amplification of an allele can be detected. This can also be done, for example, in such a way that the oligonucleotides for the individual alleles differ in such a way that regions of the DNA of the alleles are amplified which differ, for example, by an interface for a restriction enzyme.
  • the detection of a gene or its alleles can also be carried out using the microarray according to the invention, e.g. of a DNA chip, with the individual cells of the chip having oligonucleotides that hybridize specifically to certain sections of the genes to be detected.
  • the detection can take place directly without amplification or only after amplification of the DNA section sought. In the same way, the detection can be carried out without or only after restriction digestion of the DNA or an amplified DNA section thereof into shorter DNA sections.
  • An advantage of the diagnostic kit according to the invention, the method according to the invention and the microarray according to the invention is that every laboratory doctor and every medical laboratory as well as every scientific laboratory which carries out such tests is provided with all coordinated substances, if necessary in a single diagnostic kit , or that any preparatory work for the laboratories is omitted and simple and
  • the polymorphism can be determined.
  • the polymer oligonucleotides or the oligonucleotides of the microarray have already been tested, so that the main work in developing corresponding oligonucleotides is omitted.
  • thermoscycler PCR device
  • a device for separating the individual amplified DNA fragments can be, for example, a gel electrophoresis unit or a capillary electrophoresis device.
  • a conventional capillary electrophoresis device is marketed, for example, by the company Per in Eimer Biosystems TM under the name "PE ABI P ⁇ sm Genetic Analyzer 310" TM.
  • Corresponding thermocyclers for amplifying the DNA are sold, for example, by the company Perkin Elmer Biosystems TM under the name "GenAmp 2400" TM or "GenAmp9600" TM.
  • At least one of the oligonucleotides of a pair can be labeled with a fluorophore, so that an automated evaluation based on the specific fluorescence emission of the respective fluorophores is also possible.
  • diagnosis kit, microarray and method according to the invention enable everyone to determine the polymorphism of detoxification enzymes in a simple, safe and standardized manner. not.
  • the diagnostic kit can also be developed in such a way that not only oligonucleotides for the determination of a single enzyme but also other oligonucleotide pairs for the determination of further genes of detoxification enzymes are added to the diagnosis kit.
  • the microarray according to the invention can also provide fields which have oligonucleotides with which further genes of detoxification enzymes can be detected.
  • kits and methods according to the invention are to be described below.
  • a first kit enables a multiplex zero type determination by means of PCR (polymerase chain reaction) of the genes for GSTM1 and GSTT1 with labeled oligonucleotides as primers for detection via the device Perkin Elmer ABI Prism Genetic Analyzer 310.
  • the kit contains the following ingredients separately in individual containers: 10 ⁇ l PCR buffer (10 x buffer, e.g. from Promega)
  • 2 ⁇ l dNTPs (10 mM) (deoxynucleotide triphosphates, e.g. guanine (G), adenine (A),
  • Ta ⁇ r polymerase 5U / ⁇ l (e.g. from Promega)
  • the oligonucleotides GSTMl fw which serve as forward primers, are labeled with the dye fern (carboxyfluorescein), the forward primer for albumin is labeled with Ned (fluorescent dye from PE Bio-systems) and the forward Primer for GSTT1 marked with hex (4, 7, 2 ', 4', 5 ', 7' -hexachloro-6-carboxy-fluorescein).
  • the individual primers have the following nucleotide sequences:
  • GSTMl fw GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C;
  • GSTMl rv GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G;
  • GSTT1 fw TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC;
  • GSTT1 rv TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA;
  • the kit also contains the description of the procedure for amplifying the DNA with the following parameters:
  • the evaluation can now be carried out, for example, using gel electrophoresis.
  • a 2.5% gel (SeaKem LE TM, Biozym TM) is poured, a marker (100 bp ladder) is also applied and the gel is run at a voltage of 100 mV for 45 minutes for separation.
  • the internal control for the gene for albumin is 350 bp in length and must be positive in every approach.
  • the GSTML has a length of 219 bp and the GSTT1 has a length of 480 bp.
  • the last two genes can only be seen as DNA bands in the gel if a functional gene is present, otherwise the respective null type is present.
  • Lane 1 shows such a gel, in which the bands for the GSTT1 (Tl) at 480 bp, for the gene for albumin (A) at 350 bp and for the gene GSTMl (Ml) at 219 bp clearly in lanes 3 and 4 are recognizable.
  • Lane 2 contains standard marker substances. In this case, therefore, both the gene for GSTMl and the GSTTl gene are present.
  • FIG. 2 shows a corresponding evaluation by means of capillary electrophoresis using the PE ABI Prism Genetic Analyzer 310 TM.
  • the corresponding bands can be clearly seen at the corresponding fragment lengths (in base pairs).
  • the heights of the individual bands depend on the fluorescent markers used and therefore do not provide any quantitative information.
  • the other bands represent the ROX standard, which enables the fragment sizes to be assigned.
  • FIG. 3 shows the results of a further investigation using capillary electrophoresis.
  • the bands of the Rox standard only the bands of the albumin standard (A) and the GSTT1 (Tl) occur. Obviously there is a null type with regard to the GSTM1.
  • a kit was used for the variant determination of the GSTML with labeled oligonucleotides as primers.
  • Glutathione-S-Transferase Ml is characterized by a genetic polymorphism in two ways.
  • one or both of the genes GSTM1 coding for the glutathione-S-transferase Ml may be missing and thus one type homozygous if two genes GSTMl are present, one heterozygous type with only one gene GSTMl and one in the absence of both Genes in turn are homozygous null type.
  • the exchange of guanine (G) for cytosine (C) at position 2619 results from an enzyme type B to an enzyme type A, the heterozygous AB type having the highest potential enzyme activity.
  • the kit used to determine this allele variability contains the following substances required for PCR, each in separate individual packaging:
  • A Adenine (A), thymine (T)
  • 0.5 ul tag polymerase (5U / ul) (e.g. from Promega)
  • the oligonucleotides GSTM1-A are marked with the fluorophore hex and the oligonucleotides GSTM1-B are marked with the fluorophore fern.
  • the oligonucleotides have the following base sequence:
  • GSTMl fw GCT TCA CGT GTT ATG GAG GTT C for both AI lele the GSTMl;
  • GSTM1-A TTG GGA AGG CGT CCA AGC GC
  • GSTMl -B TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG.
  • the kit also contains instructions with the following PCR program:
  • the DNA segments amplified by the above-mentioned PCR program have a length of 132 bp.
  • the detection is again carried out by capillary electrophoresis with the results shown in FIGS. 4 and 5.
  • the band that is formed by the 132 bp DNA fragment of variant B of the GSTM1 and is marked with the fluorophore FAM is identified by Ml-B, while Ml -A denotes the band that by the 132 bp l DNA pieces of variant A of the GSTMl are created.
  • the evaluation can also be carried out via gel electrophoresis.
  • a 2.5 mg gel (Se a-Kern LE Biozym TM) is poured, in which case a marker (100 bp ladder) is then also applied in addition to the PCR product in order to check the PCR success.
  • the gel then runs at a voltage of 100 mV for 45 minutes.
  • the PCR product is subjected to a restriction digest. Because Variant A contains an interface for Haell and is split into two fragments of 116 bp and 16 bp in length, while variant B contains no interface for the restriction enzyme Haell.
  • FIG. 6 shows such a gel for different samples of different gel traces, in which both the 116 bp band ("GSTM1-A" for variant A) and the 132 bp band ("GSTM1-B" for variant B) can be seen .
  • the second lane from the left contains standard marker substances.
  • Lanes 4, 6, 9 correspond to samples containing the gene for GSTM1 variant B, while lanes 3, 5, 7, 8, 10 to 14 contain samples with the gene for GSTMl variant A.

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Abstract

The invention relates to a diagnosis kit, a microarray and a method for determining human detoxification capacity. Said diagnosis kit contains at least one pair of oligonucleotides (reverse primer, forward primer), the two oligonucleotides of a pair being suitable for use as primers for amplifying one of the two complementary strands of a DNA segment that is sought by means of polymerase chain reaction, respectively and the DNA segment that is sought coding for at least one part of an enzyme of the animal detoxification metabolism.

Description

Diagnose-Kit, Verfahren und Mikroarrav zur Bestimmung der menschlichen EntgiftungsfähigkeitDiagnostic kit, procedure and microarrave to determine human detoxification ability
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Dia- gnose-Kit, ein Verfahren, ein Mikroarray sowie derenThe present invention relates to a diagnostic kit, a method, a microarray and their
Verwendung für die Bestimmung der menschlichen Entgiftungsfähigkeit. Derartige Diagnose-Kits, Verfahren und Mikroarrays werden im Bereich der Umweltmedizin und Arbeitsmedizin und den damit verbundenen Erkran- kungen wie Neurodermitis, Asthma, MCS (Multiple Chemical Sensitivity, Multiple Chemikalien- Empfindlichkeit) oder CFS (Chronic Fatigue Syndrom, Müdigkeitssyndrom) verwendet. Weitere Verwendung finden sie im Bereich der Pharmakologie, bzw. zur Be- Stimmung der menschlichen Verstof wechselung von Medikamenten oder neuen Produkten.Use for the determination of human detoxification ability. Diagnostic kits, methods and microarrays of this type are used in the field of environmental medicine and occupational medicine and the associated diseases such as neurodermatitis, asthma, MCS (multiple chemical sensitivity, multiple chemical sensitivity) or CFS (chronic fatigue syndrome, fatigue syndrome). They are also used in the field of pharmacology or to determine the human metabolism of medication or new products.
Die Umwelt des Menschen ist durch Umweltchemikalien (Xenobiotika = Fremdstoffe für den lebenden Organis- us) natürlichen und anthropogenen Ursprungs bela- stet, die nach heutigen Maßstäben nicht mit höherem Leben vereinbar, also unphysiologisch sind. Durch sie werden Störungen in diffizil regulierten physiologischen Systemen hervorgerufen, die nur schwer oder überhaupt nicht reparabel sind. Diese Fremdstoffe gelangen durch die Luft, die Haut oder die Nahrung m den menschlichen oder tierischen Organismus . Wasserlösliche Stoffe werden meist schnell wieder ausge¬ schieden, nicht so jedoch die wasserunlöslichen. Die- se sammeln sich im Gegenteil im Korper -oft im Fettgewebe- an (Bioakkumulation) , wenn sie nicht zeitnah verstoff wechselt und abgebaut werden.The environment of humans is polluted by environmental chemicals (xenobiotics = foreign substances for the living organism) of natural and anthropogenic origin. steadily, which by today's standards are not compatible with higher life, so they are non-physiological. They cause disorders in difficultly regulated physiological systems that are difficult or impossible to repair at all. These foreign substances enter the human or animal organism through the air, skin or food. Water-soluble substances are usually again rapidly cleared out ¬ so but not the water. On the contrary, these accumulate in the body - often in the adipose tissue (bioaccumulation) if they are not metabolized and broken down promptly.
Daher verfugen der Mensch und höhere Organismen über ein komplexes Enzymsystem, durch das wasserunlöslicheTherefore, humans and higher organisms have a complex enzyme system, through the water-insoluble
Substanzen der Ausscheidung zugangig gemacht werden. Dieses komplexe Enzymsystem vermittelt folgende Reaktionen in zwei Phasen:Excretion substances are made accessible. This complex enzyme system mediates the following reactions in two phases:
In der sogenannten Phase-I-Reaktion werden die Um¬ weltgifte zunächst durch Enzyme aus dem Zytochromsy- stem m reaktive Zwischenprodukte umgesetzt, die jedoch akut toxischer sein können als die Schadstoffe selbst. Diese Zwischenprodukte der Phase-I-Reaktion können z.B. an zellulare Komponenten binden und dadurch Schaden anrichten. Chronische Schaden sind jedoch m der Regel eher auf die wasserunlöslichen Ausgangssubstanzen zur ckzuf hren.In the so-called phase I reaction, the order ¬ world poisons initially by enzymes from the Zytochromsy- stem m reactive intermediates implemented, but which can be acutely toxic than the contaminants themselves. These intermediates of the phase I reaction can, for example, to cellular components bind and thereby cause damage. However, chronic damage is usually due to the water-insoluble starting substances.
Die sich an die Phase-I anschließende Phase-II-The phase II subsequent to phase I
Reaktion setzt die reaktiven Zwischenprodukte zu aus- scheidbaren Endprodukten um.The reaction converts the reactive intermediate products into end products that can be separated.
Phase-I beschreibt also die Umsetzung und Aktivierung beispielsweise von verschiedenen bekannten Medikamenten und Umweltchemikalien (z.B. Debrisoqum, Opioide, Benzo ( a ) pyren, polyzklische und aromatische Kohlenwasserstoffe) sowie einer Anzahl von noch nicht bekannten Xenobiotika zu elektrophilen, radikalen Substanzen .Phase I describes the implementation and activation of various known drugs and environmental chemicals (e.g. debrisoqum, opioids, Benzo (a) pyrene, polycyclic and aromatic hydrocarbons) and a number of as yet unknown xenobiotics to electrophilic, radical substances.
Bei den Phase-II-Reaktionen gibt es mehrere Reaktionswege, unter anderem Glucoronidierung, Sulfatester- bildung, Aminosäure-Konjugation, wobei die Enzyme des wichtigsten Phase-II-Reaktionsweges (Glutathion-S- Transferasen) die Zwischenprodukte aus der Phase-I (z.B. Epoxide, Nitrosamme) zu ausscheidbaren Endstoffen deaktivieren durch Konjugation mit Glutathion.There are several reaction pathways in phase II reactions, including glucoronidation, sulfate ester formation, amino acid conjugation, the enzymes of the most important phase II reaction pathway (glutathione S transferases) being the intermediates from phase I (e.g. Deactivate epoxides, nitrosams) to end products that can be eliminated by conjugation with glutathione.
Es besteht dabei ein Zusammenhang zwischen der Schwere von VergiftungsSymptomen und der Verminderung der Enzymaktivitaten der beteiligten Enzyme des Entgiftungssystems. Bei einigen dieser Enzyme sind genetische Variationen beschrieben, die sich direkt auf die Aktivität dieser Enzyme auswirken und dadurch derenThere is a connection between the severity of the symptoms of intoxication and the reduction in the enzyme activities of the enzymes involved in the detoxification system. Some of these enzymes have genetic variations that directly affect the activity of these enzymes and thereby theirs
Leistungsfähigkeit entscheidend beeinflussen. Die individuelle genetisch bedingte Variation m der Aktivität der einzelnen Enzyme erlaubt folglich die Zuordnung des Individuums zu verschiedenen Stufen des Entgiftungspotentials . Zur Beurteilung, welche Dosis eine Giftwirkung hervorruft, ist neben der Giftaufnahme und dem Giftstoffwechsel folglich auch die Giftausscheidung von entscheidender Bedeutung.Decisively influence performance. The individual, genetically determined variation in the activity of the individual enzymes consequently allows the individual to be assigned to different stages of the detoxification potential. In order to assess which dose produces a poisonous effect, in addition to the poison intake and the poisoning metabolism, the poison excretion is therefore of crucial importance.
Dies gilt hier auch für die Glutathion-S-Transferase . Diese deaktiviert Zwischenprodukte aus der Phase-I- Reaktion zu ausscheidbaren Endstoffen durch Konjugation mit Glutathion, dessen reduzierte Form eine nu- kleophile SH-Gruppe besitzt, die leicht mit Verbin- d ng mit elektrophilen C-Atomen zum Thioether reagiert. Eine möglichst hohe Aktivität der Glutathion- S-Transf erase bedeutet dabei eine effiziente Konjugation und schnelle Entgiftung, während eine verminderte bzw. fehlende Aktivität der Glutathion-S- Transferase eine verlangsamte Entgiftung bewirkt.This also applies to the glutathione-S-transferase. This deactivates intermediates from the phase I reaction to end products which can be excreted by conjugation with glutathione, the reduced form of which has a nucleophilic SH group which easily reacts with electrophilic carbon atoms to form the thioether. The highest possible activity of glutathione S-Transf erase means efficient conjugation and rapid detoxification, while a reduced or no activity of the Glutathione-S-Transferase causes a slow detoxification.
Das System der Glutathion-S-Transf erasen weist mehrere unterschiedliche Enzyme auf, beispielsweise die Glutathion-S-Transferase GSTM1 und die Glutathion-S- Transf erase GSTT1.The system of glutathione-S-transferase has several different enzymes, for example the glutathione-S-transferase GSTM1 and the glutathione-S-transferase GSTT1.
Glutathion-S-Transferase GSTM 1Glutathione-S-Transferase GSTM 1
Die Glutathion-S-Transferase GSTM1 weist einen Poly- morphismus auf, bei dem die einzelnen Genotypen gleichberechtigt nebeneinander vorkommen. Durch denThe glutathione-S-transferase GSTM1 has a polymorphism in which the individual genotypes coexist on an equal footing. By the
Genotyp 00 wird das Fehlen des Gens für die GSTM1 angezeigt. Liegt ein funktionelles Gen vor, können zwei verschiedene Varianten A und B unterschieden werden. Beide Varianten formen aktive homodimere Enzyme (AA/BB bzw. bei Fehlen des Gens für ein Allel A0/B0) oder heterodimere Enzyme (AB) , wobei die Mischform AB die höchste Enzymaktivität zeigt und u.a. mitverantwortlich gemacht wird für das "drug-resistence"- Phäno en in der Chemotherapie.Genotype 00 indicates the lack of the gene for GSTM1. If there is a functional gene, two different variants A and B can be distinguished. Both variants form active homodimeric enzymes (AA / BB or in the absence of the gene for an allele A0 / B0) or heterodimeric enzymes (AB), the mixed form AB showing the highest enzyme activity and, among other things, is made responsible for the "drug-resistance" phenomena in chemotherapy.
Die Glutathion-S-Transferase Ml spielt in der Leber, Lunge und der Haut eine große Rolle, wobei in etwas 40 % der kaukasischen Bevölkerung der Null-Genotyp vorkommt. Dieser Null-Genotyp wird mit der Entstehung diverser Tumorerkrankungen (Lungen-, Haut-, Blasenkrebs) sowie chronische Erkrankungen mit Umweltbelastungsfaktor (Asbestosis, chronische Bronchitis) beschrieben.Glutathione-S-Transferase Ml plays a major role in the liver, lungs and skin, with the null genotype occurring in about 40% of the Caucasian population. This zero genotype is described with the development of various tumor diseases (lung, skin, and bladder cancer) as well as chronic diseases with environmental pollution factors (asbestosis, chronic bronchitis).
Glutathion-S-Transferase GSTT1 Die Glutathion-S-Transf erase Tl kommt u . a . m der Leber und m Erythrozyten vor und vermittelt die Glutathion-Konjugation mit halogenierten Kohlenwassersto f fen und Epoxiden . Bei etwa 25 % der bisher un- tersuchten deutschen Bevölkerung wurde m Erythrozyten keine Enzymaktivitat der Glutathion-S-Trans- f erase gefunden . Durch den Genotyp 00 wird das Fehlen des Genes für diese Glutathion-S-Transferase angezeigt . Der O-Genotyp wird daher als Risikofaktor an- gesehen, weil hier die GSTT1 vermittelte Aktivität gegenüber DNA-schadigenden Peroxiden und anderen Me- taboliten vermindert ist . Bekannte toxische Substrate der GSTT1 sind u . a . Methylbromid, Ethylenoxid und Methylenchlor id .Glutathione-S-Transferase GSTT1 The glutathione-S-Transf erase Tl comes u. a. in the liver and erythrocytes and mediates glutathione conjugation with halogenated hydrocarbons and epoxides. No enzyme activity of glutathione-S-transferase was found in erythrocytes in about 25% of the German population examined to date. Genotype 00 indicates the lack of the gene for this glutathione S-transferase. The O genotype is therefore regarded as a risk factor because the GSTT1-mediated activity against DNA-damaging peroxides and other metabolites is reduced. Known toxic substrates of GSTT1 include a. Methyl bromide, ethylene oxide and methylene chlorine id.
Das gleichzeitige Fehlen beider Enzyme, d.h. der genetische Null-Typ für GSTM1 und GSTT1 wurde m 10 % der kaukasischen Bevölkerung gefunden. Für diesen Be- volkerungsanteil ergibt sich folglich ein erhöhtes Risiko aufgrund verminderter Entgiftungskapazitat .The simultaneous absence of both enzymes, i.e. the zero genetic type for GSTM1 and GSTT1 was found in 10% of the Caucasian population. This proportion of the population consequently has an increased risk due to reduced detoxification capacity.
Die geltenden MAK-Werte (max. Arbeitsplatzkonzentra- tionen) berücksichtigen derzeit nicht den Anteil an genetisch bedingt empfindlichen Menschen.The current MAK values (max. Workplace concentrations) do not currently take into account the proportion of genetically sensitive people.
Um die individuelle Belastungsfahigkeit mit Umwelt- chemikalien zu bestimmen bzw. um bei erkrankten Personen die richtige Therapie zu ermitteln, wird nach dem Stand der Technik ein Belastungstest durchge- fuhrt, über den auf die Entgiftungsfahigke t und damit Enzymaktivitat dieses Individuums geschlossen werden kann. Dies erfolgt nach dem Stand der Technik durch Gabe einer Testsubstanz, die durch die zu untersuchenden Enzyme abgebaut wird und anschließende Bestimmung der Clearance des jeweiligen Individuums für diese Substanz. Nachteilig hieran ist, daß die Bestimmung der Enzymaktivitaten nur über eine zusätzliche Belastung der Person mit einer Chemikalie bestimmt werden kann. Eine derartige Bestimmungsmethode verbietet sich insbesondere bei Kindern oder Personen mit reduziertem Allgemeinzustand oder Personen, von denen bekannt ist, daß sie bereits stark schadstoffbelastet sind. Daher kann dieses Verfahren nicht m jedem Falle an- gewandt werden, insbesondere nicht bei Personen, bei denen aufgrund ihrer Schadstoffbelastung d e Bestimmung der Enzymaktivitat zur Ermittlung der geeigneten Therapie besonders wichtig wäre.In order to determine the individual's ability to cope with environmental chemicals or to determine the correct therapy for sick people, a stress test is carried out according to the state of the art, which can be used to determine the detoxification ability and thus enzyme activity of this individual. According to the prior art, this is done by administering a test substance that is broken down by the enzymes to be examined and then determining the clearance of the individual in question for this substance. The disadvantage of this is that the determination of the enzyme activities can only be determined by additional exposure of the person to a chemical. Such a method of determination is particularly forbidden for children or people with a reduced general condition or people who are known to be heavily polluted. Therefore, this method cannot be used in every case, especially not in persons for whom the determination of the enzyme activity would be particularly important for determining the appropriate therapy due to their pollution.
Demgegenüber schlagt die DE 197 38 908, die auf dieselben Erfinder wie die vorliegende Erfindung zurückgeht, vor, genetische Polymorphismen von Genen m Individuen zu bestimmen, die für ein Enzym aus dem Entgiftungsstoffwechsel kodieren. Der Polymorphismus kann dabei sowohl m der Anlage eines Genes als auch m verschiedenen allelischen Variabilitäten eines oder mehrerer polymorpher Gene bestehen.In contrast, DE 197 38 908, which goes back to the same inventors as the present invention, proposes to determine genetic polymorphisms of genes in individuals which code for an enzyme from the detoxification metabolism. The polymorphism can consist of both the creation of a gene and m different allelic variabilities of one or more polymorphic genes.
Das m der DE 197 38 908 vorgeschlagene Verfahren ist jedoch extrem aufwendig und kann nur von einzelnen spezialisierten Laboren durchgeführt werden. Denn für dieses Verfahren ist es erforderlich, eine Multiplikation der DNA eines Menschen durchzufuhren, wozu eine erhebliche molekularbiologische Kenntnis sowie ein Höchstmaß an experimenteller Erfahrung gehört. Denn die Entwicklung entsprechender Peaktionsansatze, beispielsweise für eine Polymerase-Kettenreaktion, ist aufwendig und erfordert zum sicheren Gelingen eine weit über das Durchschnittskonnen des Fachmanns er- forderliche Erfahrung und Kenntnis. Nachteilig an dem m der DE 197 38 908 vorgeschlagenen Verfahren ist daher, daß dieses nicht von jedem beliebigen Laborarzt bzw. medizinischen Labor nachvollzogen werden kann.However, the method proposed by DE 197 38 908 is extremely complex and can only be carried out by individual specialized laboratories. For this method it is necessary to multiply a person's DNA, which includes a considerable knowledge of molecular biology as well as a high degree of experimental experience. This is because the development of appropriate reaction approaches, for example for a polymerase chain reaction, is complex and requires the experience and knowledge required by a person skilled in the art to be successful in order to be successful. A disadvantage of the method proposed in DE 197 38 908 hence that this cannot be reproduced by any laboratory doctor or medical laboratory.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Diagnose-Kit, ein Mikroarray, ein Verfahren sowie Verwendungen hiervon zur Verfugung zu stellen, mit denen die menschliche Entgiftungsfahigkeit auf einfache Art und Weise von jedem beliebigen Labor standar- disiert bestimmt werden kann.The object of the present invention is therefore to provide a diagnostic kit, a microarray, a method and uses thereof, with which the human detoxification ability can be determined in a simple manner by any laboratory in a standardized manner.
Diese Aufgabe wird durch das Diagnose-Kit nach Anspruch 1, dem Mikroarray nach Anspruch 21, das Verfahren nach Anspruch 28 sowie die Verwendungen nach Anspruch 45 gelost. Vorteilhafte Weiterbildungen finden sich m den jeweiligen abhangigen Ansprüchen.This object is achieved by the diagnostic kit according to claim 1, the microarray according to claim 21, the method according to claim 28 and the uses according to claim 45. Advantageous further developments can be found in the respective dependent claims.
Das erfmdungsgemaße Diagnose-Kit enthalt dabei die zur Durchfuhrung einer Polymerrasekettenreaktion er- forderlichen Substanzen, wie sie auch von verschiedenen Herstellern angeboten werden. Weiterhin enthalt das Diagnose-Kit mindestens ein Paar Oligonukleotide, die als Reversepπmer und Forwardprimer bei der Am- plifikation mittels Polymerasekettenreaktion erfor- derlich sind. Derartige Oligonukleotide werden auch bei den erfmdungsgemaßen Verfahren eingesetzt. Die Oligonukleotide der Paare sind dabei erfmdungsgemäß so ausgesucht, daß eine Amplifikation eines DNS- Abschnittes erfolgt, der zumindest für einen Teil des Enzyms GSTT1 des tierischen Entgiftungssto fwechsel kodiert. Erfolgt somit eine Amplifikation eines DNS- Abschnittes, so kann einfach festgestellt werden, ob ein Gen für das Enzym GSTT1 vorliegt. Damit ist eine Null-Typ-Bestimmung möglich.The diagnostic kit according to the invention contains the substances required to carry out a polymerase chain reaction, as are also offered by various manufacturers. Furthermore, the diagnostic kit contains at least one pair of oligonucleotides, which are required as a reversepimer and forward primer for the amplification by means of the polymerase chain reaction. Such oligonucleotides are also used in the methods according to the invention. The oligonucleotides of the pairs are selected according to the invention in such a way that an amplification of a DNA segment takes place which codes for at least part of the enzyme GSTT1 of the animal detoxification metabolism. If an DNA segment is thus amplified, it can simply be determined whether a gene for the enzyme GSTT1 is present. This enables a zero-type determination.
Um weiterhin auch verschiedene Allele desselben Genes zu erfassen, werden in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet bzw. in das Diagnose-Kit für jedes der Allele verschiedene Oligonukleotide gegeben, so daß eine Amplifikation eines Alleles nachgewiesen werden kann. Dies kann beispielsweise auch so geschehen, daß die Oligonukleotide für die einzelnen Allele sich derart unterscheiden, daß Bereiche der DNS der Allele amplifiziert werden, die sich beispielsweise durch eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym unter- scheiden.To continue with different alleles of the same gene To be detected, different oligonucleotides are used in the methods according to the invention or are given in the diagnostic kit for each of the alleles, so that an amplification of an allele can be detected. This can also be done, for example, in such a way that the oligonucleotides for the individual alleles differ in such a way that regions of the DNA of the alleles are amplified which differ, for example, by an interface for a restriction enzyme.
Die Erfassung eines Gens bzw. seiner Allele kann auch mittels des erfindungsgemäßen Mikroarrays, z.B. eines DNA-Chips, erfolgen, wobei die einzelnen Zellen des Chips Oligonukleotide aufweisen, die spezifisch mit bestimmten Abschnitten der nachzuweisenden Gene hybridisieren. Zum Aufbau und dem Einsatz von DNS-Chips wird beispielhaft allgemein auf die EP 0 373 203 verwiesen. Der Nachweis kann dabei ohne Ampli ikation direkt oder auch erst nach Amplifikation des gesuchten DNS-Abschnittes erfolgen. In gleicher Weise kann der Nachweis ohne oder erst nach Restriktionsverdau der DNS bzw. eines amplifizierten DNS-Abschnittes hiervon in kürzere DNS-Abschnitte durchgeführt wer- den.The detection of a gene or its alleles can also be carried out using the microarray according to the invention, e.g. of a DNA chip, with the individual cells of the chip having oligonucleotides that hybridize specifically to certain sections of the genes to be detected. With regard to the structure and use of DNS chips, general reference is made, for example, to EP 0 373 203. The detection can take place directly without amplification or only after amplification of the DNA section sought. In the same way, the detection can be carried out without or only after restriction digestion of the DNA or an amplified DNA section thereof into shorter DNA sections.
Vorteilhaft an dem erfindungsgemäßen Diagnose-Kit, dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie dem erfindungsgemäßen Mikroarray ist es, daß jeder Laborarzt und jedes medizinische Labor sowie jedes wissenschaftliche Labor, das derartige Untersuchungen durchführt, sämtliche aufeinander abgestimmte Substanzen gegebenenfalls in einem einzigen Diagnose-Kit, zur Verfügung erhält, bzw. daß jegliche Vorbereitungsarbeiten für die Labore entfallen und auf einfache Art undAn advantage of the diagnostic kit according to the invention, the method according to the invention and the microarray according to the invention is that every laboratory doctor and every medical laboratory as well as every scientific laboratory which carries out such tests is provided with all coordinated substances, if necessary in a single diagnostic kit , or that any preparatory work for the laboratories is omitted and simple and
Weise der Polymorphismus bestimmt werden kann. Insbe- sondere sind die Pπmer-Oligonukleotide bzw. die Oligonukleotide des Mikroarrays bereits ausgetestet, so daß die Hauptarbeit bei der Entwicklung entsprechender Oligonukleotide entfallt.Way the polymorphism can be determined. In particular, in particular, the polymer oligonucleotides or the oligonucleotides of the microarray have already been tested, so that the main work in developing corresponding oligonucleotides is omitted.
Damit ist es erstmals möglich, die Bestimmung von Po- lymorphismen und des individuellen Entgiftungspotentials von einzelnen Patienten in großem Maßstäbe und am jeweiligen Ort des Patienten auf einfache und ko- stengunstige Weise durchzufuhren. Denn hierzu benotigt der einzelne Laborarzt bzw. das einzelne medizinische Labor lediglich noch einen erfmdungsgemaßen Mikroarray, einen herkömmlichen Thermoscycler (PCR- Gerat) und/oder ein Gerat zur Auftrennung der einzel- nen ampliflzierten DNS-Fragmente. Dies kann beispielsweise eine Gelelektrophorese-Emheit oder ein Kapillarelektrophoresegerat sein. Ein derartiges herkömmliches Kapillarelektrophoresegerat wird beispielsweise von der Firma Per in Eimer Biosystems™ unter dem Namen "PE ABI Pπsm Genetic Analyser 310"™ vertrieben. Entsprechende Thermocycler für die Ampli- fication der DNS werden beispielsweise von der Firma Perkin Eimer Biosystems™ unter dem Namen "GenAmp 2400"™ bzw. auch "GenAmp9600"™ vertrieben.This makes it possible for the first time to carry out the determination of polymorphisms and the individual detoxification potential of individual patients on a large scale and at the respective location of the patient in a simple and cost-effective manner. For this, the individual laboratory doctor or the individual medical laboratory only needs a microarray according to the invention, a conventional thermoscycler (PCR device) and / or a device for separating the individual amplified DNA fragments. This can be, for example, a gel electrophoresis unit or a capillary electrophoresis device. Such a conventional capillary electrophoresis device is marketed, for example, by the company Per in Eimer Biosystems ™ under the name "PE ABI Pπsm Genetic Analyzer 310" ™. Corresponding thermocyclers for amplifying the DNA are sold, for example, by the company Perkin Elmer Biosystems ™ under the name "GenAmp 2400" ™ or "GenAmp9600" ™.
Zur leichteren Erfassung der ampliflzierten DNS- Abschnitte kann jeweils mindestens eines der Oligonukleotide eines Paares mit einem Fluorophor gekennzeichnet sein, so daß hierdurch auch eine automati- sierte Auswertung anhand der spezifischen Fluoreszenzemission der jeweiligen Fluorophore möglich ist.For easier detection of the amplified DNA sections, at least one of the oligonucleotides of a pair can be labeled with a fluorophore, so that an automated evaluation based on the specific fluorescence emission of the respective fluorophores is also possible.
Insgesamt wird durch das erfmdungsgemaße Diagnose- Kit, Mikroarray bzw. Verfahren die Bestimmung des Po- lymorphismusses von Entgiftungsenzymen jedermann auf einfache, sichere und standardisierte Weise ermog- li cht .Overall, the diagnosis kit, microarray and method according to the invention enable everyone to determine the polymorphism of detoxification enzymes in a simple, safe and standardized manner. not.
Erfmdungsgemaß kann das Diagnose-Kit auch dahingehend weitergebildet werden, daß dem Diagnose-Kit nicht nur Oligonukleotide für die Bestimmung eines einzelnen Enzymes sondern auch weitere Oligonukleo- tidpaare für die Bestimmung weiterer Gene von Entgiftungsenzymen beigegeben werden. In gleicher Weise kann der erfmdungsgemaße Mikroarray auch Felder vor- sehen, die Oligonukleotide aufweisen, mit denen weitere Gene von Entgiftungsenzymen nachgewiesen werden können.According to the invention, the diagnostic kit can also be developed in such a way that not only oligonucleotides for the determination of a single enzyme but also other oligonucleotide pairs for the determination of further genes of detoxification enzymes are added to the diagnosis kit. In the same way, the microarray according to the invention can also provide fields which have oligonucleotides with which further genes of detoxification enzymes can be detected.
In diesem Falle ist es dem Anwender möglich, auf em- fache Art und Weise nicht nur eine Null-Typ- Bestimmung oder eine AIleibeStimmung eines einzelnen Enzymes durchzufuhren sondern zugleich weitere Enzyme zu bestimmen. So ist es ihm beispielsweise möglich, Informationen sowohl über die GSTM1 als auch die GSTT1 zu erfassen, und dadurch beispielsweise dasIn this case, it is possible for the user to not only carry out a zero-type determination or an individual mood of an individual enzyme in a simple manner, but also to determine further enzymes at the same time. For example, it is possible for him to collect information about both GSTM1 and GSTT1, and thus, for example, that
"drug-resιstence"-Phanomen m der Chemotherapie für einen Patienten vorherzusagen.Predict "drug-resιstence" phenomena in chemotherapy for a patient.
Im folgenden sollen einige Beispiele erfmdungsgema- ßer Kits und erfmdungsgemaßer Verfahren beschrieben werden.Some examples of kits and methods according to the invention are to be described below.
Ein erster Kit ermöglicht eine Multiplex-Null-Typ Bestimmung mittels PCR (Polymerase-Kettenreaktion) der Gene für GSTM1 und GSTT1 mit markierten Oligonukleo- tiden als Primer für einen Nachweis über das Gerat Perkin Eimer ABI Prism Genetic Analyzer 310.A first kit enables a multiplex zero type determination by means of PCR (polymerase chain reaction) of the genes for GSTM1 and GSTT1 with labeled oligonucleotides as primers for detection via the device Perkin Elmer ABI Prism Genetic Analyzer 310.
Als Substanzen, die für die PCR notig sind, enthalt der Kit die folgenden Inhaltsstoffe getrennt m einzelnen Behaltnissen: 10 μl PCR-Puffer ( 10 x Puf fer, z . B . der Fa . Promega )As substances that are necessary for the PCR, the kit contains the following ingredients separately in individual containers: 10 μl PCR buffer (10 x buffer, e.g. from Promega)
8 μl MgCl2 ( 25 mM)8 μl MgCl 2 (25 mM)
2 μl dNTPs (10 mM) (Desoxi-Nucleotid-Triphosphate, z.B. Guanin (G) , Adenin (A) ,2 μl dNTPs (10 mM) (deoxynucleotide triphosphates, e.g. guanine (G), adenine (A),
Cytosin (C) , Thymin (T))Cytosine (C), thymine (T))
2 μl Primer GSTMl fw (10 p ol/μl)2 μl primer GSTMl fw (10 p ol / μl)
2 μl Primer GSTMl rv (10 pmol/μl)2 μl primer GSTMl rv (10 pmol / μl)
2 μl Primer Albumin fw (10 pmol/μl) 2 μl Primer Albumin rv (10 pmol/μl)2 μl primer albumin fw (10 pmol / μl) 2 μl primer albumin rv (10 pmol / μl)
2 μl Primer GSTT1 fw (10 pmol/μl)2 μl primer GSTT1 fw (10 pmol / μl)
2 μl Primer GSTT1 rv (10 pmol/μl)2 μl primer GSTT1 rv (10 pmol / μl)
6 μl Template DNS (83 ng/μl)6 μl template DNS (83 ng / μl)
61, 5 μl H20 bidest. 0,5 μl Taςr-Polymerase (5U/μl) (z.B. der Fa. Promega)61.5 ul H 2 0 bidist. 0.5 μl Taςr polymerase (5U / μl) (e.g. from Promega)
Dabei sind die Oligonukleotdie GSTMl fw, die als Vor- wärts-Primer dienen, mit dem Farbstoff Farn (Car- boxyfluorescein) markiert, der Vorwärts-Primer für Albumin mit Ned ( Fluoreszenzfarbstoff der Fa. PE Bio- systems) markiert und der Vorwärts-Primer für GSTT1 mit Hex (4, 7, 2', 4', 5', 7 ' -Hexachloro-6-Carboxy- fluorescein) markiert.The oligonucleotides GSTMl fw, which serve as forward primers, are labeled with the dye fern (carboxyfluorescein), the forward primer for albumin is labeled with Ned (fluorescent dye from PE Bio-systems) and the forward Primer for GSTT1 marked with hex (4, 7, 2 ', 4', 5 ', 7' -hexachloro-6-carboxy-fluorescein).
Die einzelnen Primer besitzen die folgende Nukleo- tidabfolgen:The individual primers have the following nucleotide sequences:
GSTMl fw: GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C;GSTMl fw: GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C;
GSTMl rv: GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G;GSTMl rv: GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G;
GSTT1 fw: TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC;GSTT1 fw: TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC;
GSTT1 rv: TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA;GSTT1 rv: TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA;
Albumin fw: GCC CTC TGC TAA CAA GTC CTA C sowieAlbumin fw: GCC CTC TGC TAA CAA GTC CTA C such as
Albumin rv: GCC CTA AAA AGA AAA TCG CCA ATCAlbumin rv: GCC CTA AAA AGA AAA TCG CCA ATC
Weiterhin kann das Kit einen Fluoreszenzstandard (Rox-Standard, Rox = 6-carboxy-X-rhodamm) als Lan- genstandard für die Fragmentgroßenzuordnung enthalten.Furthermore, the kit can contain a fluorescence standard (Rox standard, Rox = 6-carboxy-X-rhodamm) as the length standard for the fragment size assignment.
Weiterhin enthalt das Kit die Verfahrensbeschreibung f r die Amplifikation der DNS mit den folgenden Parametern:The kit also contains the description of the procedure for amplifying the DNA with the following parameters:
Die Auswertung kann nun beispielsweise über Gelelektrophorese erfolgen. Hierzu wird ein 2,5 % ges Gel (SeaKem LE™, Biozym™) gegossen, ein Marker (100 bp- ladder) mitaufgetragen und das Gel bei einer Spannung von 100 mV für 45 Minuten zur Auftrennung laufengelassen. Die interne Kontrolle für das Gen für Albumin besitzt eine Lange von 350 bp und muß m jedem Ansatz positiv sein. Die GSTMl besitzt eine Lange von 219 bp und die GSTT1 eine Lange von 480 bp . Die letzten beiden Gene sind als DNS-Banden im Gel nur bei Vorhandensein eines funktioneilen Gens zu sehen, anderenfalls liegt der jeweilige Null-Typ vor. Figur 1 zeigt ein derartiges Gel, bei dem die Banden für die GSTT1 (Tl) bei 480 bp, für das Gen für Albumin (A) bei 350 bp sowie für das Gen GSTMl (Ml) bei 219 bp deutlich m den Spuren 3 und 4 zu erkennen sind. Spur 2 enthalt als Standard Markersubstanzen. In diesem Falle liegt also folglich sowohl das Gen für GSTMl als auch das GSTTl-Gen vor.The evaluation can now be carried out, for example, using gel electrophoresis. For this purpose, a 2.5% gel (SeaKem LE ™, Biozym ™) is poured, a marker (100 bp ladder) is also applied and the gel is run at a voltage of 100 mV for 45 minutes for separation. The internal control for the gene for albumin is 350 bp in length and must be positive in every approach. The GSTML has a length of 219 bp and the GSTT1 has a length of 480 bp. The last two genes can only be seen as DNA bands in the gel if a functional gene is present, otherwise the respective null type is present. FIG. 1 shows such a gel, in which the bands for the GSTT1 (Tl) at 480 bp, for the gene for albumin (A) at 350 bp and for the gene GSTMl (Ml) at 219 bp clearly in lanes 3 and 4 are recognizable. Lane 2 contains standard marker substances. In this case, therefore, both the gene for GSTMl and the GSTTl gene are present.
Figur 2 zeigt eine entsprechende Auswertung mittels Kapillarelektrophorese durch das Gerät PE ABI Prism Genetic Analyzer 310™. Auch hier sind die entsprechenden Banden bei den entsprechenden Fragmentlängen (in Basenpaaren) deutlich zu erkennen. Die Höhen der einzelnen Banden sind dabei von den verwendeten Fluo- reszenzmarkern abhängig und geben daher selbst keine quantitative Information. Die weiteren Banden stellen den ROX-Standard dar, der die Zuordnung der Fragmentgrößen ermöglicht.FIG. 2 shows a corresponding evaluation by means of capillary electrophoresis using the PE ABI Prism Genetic Analyzer 310 ™. Here too, the corresponding bands can be clearly seen at the corresponding fragment lengths (in base pairs). The heights of the individual bands depend on the fluorescent markers used and therefore do not provide any quantitative information. The other bands represent the ROX standard, which enables the fragment sizes to be assigned.
Figur 3 zeigt die Ergebnisse einer weiteren Untersuchung mittels Kapillarelektrophorese . Hierbei treten neben den Banden des Rox-Standards lediglich die Banden des Albumin-Standards (A) und der GSTT1 (Tl) auf. Offensichtlich liegt bezüglich der GSTMl ein Nulltyp vor.FIG. 3 shows the results of a further investigation using capillary electrophoresis. In addition to the bands of the Rox standard, only the bands of the albumin standard (A) and the GSTT1 (Tl) occur. Obviously there is a null type with regard to the GSTM1.
In einem weiteren Beispiel wurde ein Kit verwendet für die Variantenbestimmung der GSTMl mit markierten Oligonukleotiden als Primern .In another example, a kit was used for the variant determination of the GSTML with labeled oligonucleotides as primers.
Die Glutathion-S-Transferase Ml ist in zweierlei Hinsicht durch einen genetischen Polymorphismus ausgezeichnet. Zum einen kann eines oder beide der (auf den paarweisen Chromosomen befindlichen) für die Glutathion-S-Transferase Ml codierenden Gene GSTMl fehlen und dadurch ein bei Vorhandensein zweier Gene GSTMl homozygoter Typus, ein bei lediglich eines Genes GSTMl heterozygoter Typus sowie ein bei Fehlen beider Gene wiederum homozygoter Null-Typus entste- hen. Zum anderen führt der Austausch von Guanin (G) gegen Cytosin (C) an Position 2619 von einem Enzymtyp B zu einem Enzymtyp A, wobei der heterozygote AB-Typ die höchste potentielle Enzymaktivität aufweist. Durch die Bestimmung der genomischen Allelvariationen eines Individuums lassen sich daher die potentielle Entgiftungsfähigkeit und damit die potentiellen Bela- stungsgrenzwerte sowie die für dieses Individuum daraus folgende geeignete Therapie bestimmen.Glutathione-S-Transferase Ml is characterized by a genetic polymorphism in two ways. On the one hand, one or both of the genes GSTM1 coding for the glutathione-S-transferase Ml (located on the paired chromosomes) may be missing and thus one type homozygous if two genes GSTMl are present, one heterozygous type with only one gene GSTMl and one in the absence of both Genes in turn are homozygous null type. On the other hand, the exchange of guanine (G) for cytosine (C) at position 2619 results from an enzyme type B to an enzyme type A, the heterozygous AB type having the highest potential enzyme activity. By determining the genomic allele variations of an individual, the potential detoxification ability and thus the potential exposure limit values as well as the appropriate therapy resulting for this individual can be determined.
Der zur Bestimmung dieser Allelvariabilität dienende Kit enthält die folgenden, für die PCR erforderlichen Substanzen, jeweils in getrennter Einzelverpackung:The kit used to determine this allele variability contains the following substances required for PCR, each in separate individual packaging:
10 μl PCR-Puffer (10 x Puffer, z.B. der Fa. Promega)10 μl PCR buffer (10 x buffer, e.g. from Promega)
8 μl MgCl2 (25 mM) 2 μl dNTPs (10 mM) (Guanin (G) , Cytosin (C),8 μl MgCl 2 (25 mM) 2 μl dNTPs (10 mM) (guanine (G), cytosine (C),
Adenin (A) , Thymin (T)Adenine (A), thymine (T)
4 μl Primer GSTMl fw (10 pmol/μl)4 μl primer GSTMl fw (10 pmol / μl)
2 μl Primer GSTM1-A (10 pmol/μl)2 μl primer GSTM1-A (10 pmol / μl)
2 μl Primer GSTM1-B (10 pmol/μl) 6 μl Template DNA (83 ng/μl)2 μl primer GSTM1-B (10 pmol / μl) 6 μl template DNA (83 ng / μl)
65, 5 μl H20 bidest.65.5 ul H 2 0 bidist.
0 , 5 μl Tag-Polymerase ( 5U/μl ) ( z . B . der Fa . Promega )0.5 ul tag polymerase (5U / ul) (e.g. from Promega)
Dabei sind die Oligonukleotide GSTM1-A mi t dem Fluo- rophor Hex markiert und die Ol igonukleotide GSTM1-B mit dem Fluorophor Farn marki ert . Die Ol i gonukleotide weisen dabei die folgende Basenfolge auf :The oligonucleotides GSTM1-A are marked with the fluorophore hex and the oligonucleotides GSTM1-B are marked with the fluorophore fern. The oligonucleotides have the following base sequence:
GSTMl fw : GCT TCA CGT GTT ATG GAG GTT C für beide AI lele der GSTMl ;GSTMl fw: GCT TCA CGT GTT ATG GAG GTT C for both AI lele the GSTMl;
GSTM1-A : TTG GGA AGG CGT CCA AGC GC ; GSTMl -B : TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG .GSTM1-A: TTG GGA AGG CGT CCA AGC GC; GSTMl -B: TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG.
Weiterhin enthalt das Kit eine Anweisung mi t folgendem PCR-Programm :The kit also contains instructions with the following PCR program:
fplus 3 sec pro Zyklus f plus 3 sec per cycle
Die be dem genannten PCR-Programm ampli f l z i erten DNS-Segmente weisen eine Lange von 132 bp auf . Der Nachweis erfolgt wiederum über Kapillarelektrophorese mit den m den Figuren 4 und 5 dargestellten Ergebnissen . Dabei ist mit Ml-B j eweils die Bande gekennzeichnet , die durch das 132 bp lange DNS-S tuck der Variante B der GSTMl entsteht und mit dem Fluorophor FAM maκrιert ist , wahrend Ml -A die Bande kennzeichnet , die durch das 132 bp l ange DNS-Stucke s der Variante A der GSTMl entsteht .The DNA segments amplified by the above-mentioned PCR program have a length of 132 bp. The detection is again carried out by capillary electrophoresis with the results shown in FIGS. 4 and 5. The band that is formed by the 132 bp DNA fragment of variant B of the GSTM1 and is marked with the fluorophore FAM is identified by Ml-B, while Ml -A denotes the band that by the 132 bp l DNA pieces of variant A of the GSTMl are created.
Alternativ kann die Auswertung auch über Gelelektro- phorese erfolgen. Hierzu wird ein 2,5 ιges Gel (Se a- Kern LE Biozym™) gegossen, wobei dann anschließend neben dem PCR-Produkt auch ein Marker (100 bp-Ladder) mitaufgetragen wird, um den PCR-Erfolg zu prüfen. Das Gel lauft dann mit einer Spannung von 100 mV für 45 Minuten. Um mittels Gel-Elektrophorese zwischen der Variante A und B zu unterscheiden, wird das PCR- Produkt einem Restriktionsverdau unterworfen. Denn Variante A enthalt eine Schnittstelle für Haell und wird m zwei Fragmente von 116 bp und 16 bp Lange zerteilt, wahrend Variante B keine Schnittstelle für das Restriktionsenzym Haell enthalt. Daraufhin wird ein 4 %ιges Gel für die Auftrennung kleinerer Fragmente (Biorad) gegossen, wobei wiederum ein Marker (100 bp-Ladder) mitaufgetragen wird. Das 4 %ιge Gel lauft dann bei einer Spannung von 100 mV für eine Stunde. Bei diesem Gel können nun die entsprechenden Banden bei 116 bp und 16 bp für die Variante A und für 132 bp für die Variante B des Genes GSTMl erkannt werden .Alternatively, the evaluation can also be carried out via gel electrophoresis. For this purpose, a 2.5 mg gel (Se a-Kern LE Biozym ™) is poured, in which case a marker (100 bp ladder) is then also applied in addition to the PCR product in order to check the PCR success. The gel then runs at a voltage of 100 mV for 45 minutes. In order to differentiate between variant A and B by means of gel electrophoresis, the PCR product is subjected to a restriction digest. Because Variant A contains an interface for Haell and is split into two fragments of 116 bp and 16 bp in length, while variant B contains no interface for the restriction enzyme Haell. Thereupon a 4% gel is poured for the separation of smaller fragments (biorad), a marker (100 bp ladder) being applied in turn. The 4% gel then runs at a voltage of 100 mV for one hour. With this gel, the corresponding bands at 116 bp and 16 bp for variant A and for 132 bp for variant B of the GSTM1 gene can now be recognized.
Figur 6 zeigt ein derartiges Gel für verschiedene Proben verschiedener Gelspuren, bei dem sowohl die 116 bp-Bande ("GSTM1-A" für Variante A) als auch die 132 bp-Bande ("GSTM1-B" für Variante B) zu erkennen ist. Die zweite Spur von links enthalt als Standard Markersubstanzen. Die Spuren 4, 6, 9 entsprechen Pro- ben, die das Gen für die GSTMl Variante B enthalten, wahrend die Spuren 3, 5, 7, 8, 10 bis 14 Proben mit dem Gen für die GSTMl Variante A enthalten. FIG. 6 shows such a gel for different samples of different gel traces, in which both the 116 bp band ("GSTM1-A" for variant A) and the 132 bp band ("GSTM1-B" for variant B) can be seen , The second lane from the left contains standard marker substances. Lanes 4, 6, 9 correspond to samples containing the gene for GSTM1 variant B, while lanes 3, 5, 7, 8, 10 to 14 contain samples with the gene for GSTMl variant A.

Claims

Patentansprücheclaims
1 . Diagnose-Kit für die Bestimmung der menschlichen Entgi f tungsfahigkeit mit mindestens einem Paar Oligonukleotide ( Reverse- primer, Forwardprimer ) , wobei die beiden Oligonukleotide eines Paares als Primer zur Amplifi- kation mittels Polymerasekettenreaktion j eweils eines der beiden komplementären Strange eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und wobei der gesuchte DNS-Abschnitt zumindest für einen Teil eines Enzyms des tierischen Entgiftungsstof fwechsel s kodiert .1 . Diagnostic kit for determining the human detoxification ability with at least one pair of oligonucleotides (reverse primer, forward primer), the two oligonucleotides of a pair being primers for amplification by means of polymerase chain reactions, in each case one of the two complementary strands of a sought DNA segment are suitable, and wherein the DNA section sought encodes at least part of an enzyme of the animal detoxification metabolism.
2 . Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet , daß es die zur Durchfuhrung einer Polymerasekettenreaktion er forderlichen Substanzen enthalt .2nd Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that it contains the substances required to carry out a polymerase chain reaction.
3 . Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche , dadurch gekennzeichnet , daß es als zur Durchfuhrung einer Polymerasekettenreaktion erforderliche Substanzen eine Puf ferlo sung , Magnesiumchlor ld, Desoxynukleotid-Tripho sphate, sowie eine hitzes tabi le Polymerase enthalt . 3rd Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains a buffer solution, magnesium chloride, deoxynucleotide triphosphate, and a hot tabular polymerase as the substances required for carrying out a polymerase chain reaction.
4. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) enthalt.4. Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that it contains a polymerase from Thermus aquaticus (Taq polymerase) as a heat-stable polymerase.
5. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eines der beiden Oligonukleotide eines Paares von Oligonukleotiden mit einem Fluorophor markiert ist.5. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that at least one of the two oligonucleotides of a pair of oligonucleotides is labeled with a fluorophore.
6. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Positivkontrolle eine DNS-Probe mit dem gesuchten DNS-Abschnitt enthalt.6. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains a DNA sample with the searched DNA section as a positive control.
7. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin für eine Kontrollbestimmung einen7. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it is also a control determination
Abschnitt einer für em Albumin kodierenden DNS sowie zwei Oligonukleotide, die jeweils als Primer zur Amplifikation zumindest eines Abschnitts jeweils eines der beiden komple- mentaren Strange der für das Albumin kodierendenSection of a DNA coding for an albumin and two oligonucleotides, each of which acts as a primer for the amplification of at least one section of one of the two complementary strands of the coding for the albumin
DNS geeignet s nd, enthalt.DNS suitable s nd, contains.
8. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er zwei bzw. mehrere Paare Oligonukleotide für DNS- Abschnitte jeweils zweier bzw. mehrerer verschiedener Gene bzw. Genvarianten enthalt.8. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it has two or contains several pairs of oligonucleotides for DNA sections each of two or more different genes or gene variants.
Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die mehreren verschiedenen Gene bzw. Genvarianten für verschiedene Enzyme bzw. für verschiedene Varianten desselben Enzyms kodieren.Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that the several different genes or gene variants code for different enzymes or for different variants of the same enzyme.
10. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mehreren verschiedenen Gene für GSTMl und/oder GSTTl und/oder verschiedene Varianten des Enzyms GSTMl kodieren.10. Diagnostic kit according to one of the two preceding claims, characterized in that the several different genes for GSTMl and / or GSTTl and / or different variants of the enzyme GSTMl code.
11. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Bestimmung des Vorhandenseins des Enzyms GSTMl em Paar11. Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that it for determining the presence of the enzyme GSTMl em couple
Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen aufweist :Has oligonucleotides with the following sequences:
GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C undGAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C and
GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG GGTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G
12. Diagnose-Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Bestimmung des Vorhandenseins des Enzyms GSTTl em Paar Oligonukleotide mit folgenden Sequenzen aufweist: TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC und TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA.12. Diagnostic kit according to claim 10, characterized in that it has a pair of oligonucleotides with the following sequences for determining the presence of the enzyme GSTTl: TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC and TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA.
13. Diagnose-Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Bestimmung des Vorhandenseins und gegebenenfalls der vorhandenen Varianten des Enzyms GSTMl zwei Paare Oligonukleotide mit folgenden Sequenzen enthält:13. Diagnostic kit according to claim 10, characterized in that it contains two pairs of oligonucleotides with the following sequences for determining the presence and, if appropriate, the existing variants of the enzyme GSTMl:
GCT TCA CGT GTT ATG GAG GTT C identisch für beide Paare undGCT TCA CGT GTT ATG GAG GTT C identical for both pairs and
TTG GGA AGG CGT CCAAGC GC bzw.TTG GGA AGG CGT CCAAGC GC or
TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG.TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG.
14. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Oligonukleotide14. Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that the two oligonucleotides
TTG GGA AGG CGT CCAAGC GC bzw. TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG jeweils mit zueinander verschiedenen Fluoropho- ren markiert sind.TTG GGA AGG CGT CCAAGC GC or TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG are each marked with different fluorophores.
15. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin eine Anleitung zur Durchführung der Polymer¬ asekettenreaktion, eine Anleitung zur Durchfuhrung einer Fragmentanalyse enthalt.15. Diagnosis kit according to one of the preceding claims, characterized in that it further ¬ asekettenreaktion as instructions for conducting the polymer, contains instructions on how to carry out a fragment analysis.
16. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An- spruche, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Anleitung zur Durchfuhrung eines Restriktions- verdaus mit anschließender Gelelektrophorese enthalt .16. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains instructions for carrying out a restriction digest with subsequent gel electrophoresis.
17. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden17. Diagnostic kit according to one of the preceding
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er em Schema zur Auswertung der erhaltenen Meßergeb- msse enthalt.Claims, characterized in that it contains a scheme for evaluating the measurement results obtained.
18. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Mikroarray (DNS-Chip) enthalt, wobei der Mikroarray eine Anzahl Zellen (Felder) aufweist und mindestens einer Zelle em Oligonukleotid an- geordnet ist, das mit einem der gesuchten DNS-18. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains a microarray (DNA chip), the microarray having a number of cells (fields) and at least one cell em oligonucleotide which is arranged with one of the searched DNS
Abschnitte hybridisiert.Sections hybridized.
19. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Abschnitt, dadurch gekennzeichnet, daß m mindestens einer weiteren Zelle des Mikroarrays em weiteres Oligonukleotid angeordnet ist und die Sequenz αes Oligonukleotids, das der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotids unterscheidet . 19. Diagnostic kit according to the preceding section, characterized in that m at least one further cell of the microarray em further oligonucleotide is arranged and the sequence αes oligonucleotide, which is arranged the at least one cell, differs from the sequence of the further oligonucleotide.
20. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß m mindestens zwei Zellen jeweils em Oligonukleo- t d angeordnet ist, wobei die m verschiedenen Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit verschiedenen gesuchten DNS-Abschnitten hybridisieren.20. Diagnostic kit according to one of the two preceding claims, characterized in that m at least two cells each em oligonucleotide d is arranged, wherein the m different cells arranged oligonucleotides each hybridize with different sought DNA segments.
21. Mikroarray, beispielsweise DNS-Chip, m t einer21. Microarray, for example DNS chip, m t one
Anordnung von mehreren, voneinander getrennten Zellen (Feldern), dadurch gekennzeichnet, daß m mindestens einer Zelle em Oligonukleotid angeordnet ist, das mit einem DNS-Abschnitt hybπdi- siert, der für einen Teil eines Enzyms des Entgiftungsstoffwechsels kodiert.Arrangement of several, separate cells (fields), characterized in that in at least one cell an oligonucleotide is arranged, which hybridizes with a DNA segment which codes for a part of an enzyme of the detoxification metabolism.
22. Mikroarray nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß m mindestens einer weiteren Zelle e weiteres Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die Sequenz des Oligonukleotids, das der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotids unterscheidet.22. Microarray according to the preceding claim, characterized in that m at least one further cell e further oligonucleotide is arranged, the sequence of the oligonucleotide which is arranged the at least one cell differs from the sequence of the further oligonucleotide.
23. Mikroarray nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Zellen jeweils em Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die m verschiedenen Zellen angeordneten Oligo- nukleotide j eweils mit verschiedenen gesuchten DNS -Abschnitten hybridisieren .23. Microarray according to claim 21 or 22, characterized in that at least two cells are arranged in each case an oligonucleotide, wherein the m different cells arranged oligo Hybridize nucleotides with different searched DNA sections.
24 Mikroarray nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die gesuchten DNS- Abschnitte für einen Teil der Enzyme GSTTl und/oder GSTMl kodieren.24 microarray according to one of claims 21 to 23, characterized in that the DN S sections sought encode part of the enzymes GS TTl and / or GSTMl.
25. Mikroarray nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest einer der gesuchten DNS-Abschnitte Position 2619 des Gens enthält, das für das Enzym GSTMl kodiert.25. The microarray of any one of claims 21 to 2 4, d a d u rch in that at least one of the desired DNS sections Position 2619 contains the gene for the enzyme ated GSTMl k o d.
26. Mikroarray nach dem vorhergehenden Anspruch, da- durch gekennzeichnet, daß zumindest einer der gesuchten DNS-Abschnitte an Position 2619 em Cytosin oder em Guanin aufweist.26. A microarray according to the preceding nspruch, characterized d a- d urch in that at least one of the desired DNS sections having at position 2619 em em cytosine or guanine.
27. Mikroarray nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß ein gesuchter DNS- Abschnitt an Position 2619 e Guanin und ein weiterer gesuchter DNS-Abschnitt an Position 2619 ein Cytosin aufweist.27. microarray according to the preceding claim, ABy d in that a sought-DNA portion having at position 2619 e guanine and another sought DNA segment at position 2619 is a cytosine.
8 Verfahren zur Bestimmung der Entgiftungsfähig- keit eines Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorhandensein und/oder die allelische Variabilität zumindest eines Gens erfaßt wird, dasThat the presence and / or the allelic variability is detected at least a gene 8 V out to determine the Entgiftungsfähig- ness of a human, characterized in that
RECTIFIED SHEET (RULE 91) für ein Enzym des tierischen Entgiftungsstoffwechsels kodiert.RECTIFIED SHEET (RULE 91) encodes an enzyme of animal detoxification metabolism.
29. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorhandensein oder Fehlen der Glutathion-S-Transferase GSTTl erfaßt wird.29. The method according to the preceding claim, characterized in that the presence or absence of the glutathione-S-transferase GSTTl is detected.
30. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da- durch gekennzeichnet, daß die Entgiftungsfähigkeit in zunehmender Reihenfolge30. The method according to the preceding claim, characterized in that the detoxification ability in increasing order
00 < A0,AA bestimmt wird, wobei 00 für das Fehlen beider Gene der GSTTl und A0 bzw. AA für das Vorhandensein eines oder beider Gene der GSTTl steht.00 <A0, AA is determined, where 00 stands for the absence of both genes of the GSTTl and A0 or AA for the presence of one or both genes of the GSTTl.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorhandensein und/oder verschiedene Varianten der Glutathion- S-Transferase GSTMl erfaßt wird.31. The method according to any one of claims 28 to 30, characterized in that the presence and / or different variants of the glutathione-S-transferase GSTMl is detected.
32. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß erfaßt wird, ob an Position 2619 eines oder beider menschlicher Gene der GSTMl sich ein Guanin oder ein Cytosin befindet.32. The method according to the preceding claim, characterized in that it is detected whether there is a guanine or a cytosine at position 2619 of one or both human genes of the GSTM1.
RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISA/EP RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISA / EP
33. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Entgiftungsfähigkeit in zunehmender Reihenfolge33. The method according to any one of the two preceding claims, characterized in that the detoxification ability in increasing order
00 < A0,B0,AA,BB < AB bestimmt wird,00 <A0, B0, AA, BB <AB is determined
wobei 00 für das Fehlen beider Gene der GSTMl, A0 bzw. B0 für das Vorhandensein eines Gens der GSTMl, AA, BB für das Vorhandensein zweier Gene mit jeweils Cytosin an Position 2619 (A) bzw. Guanin an Position 2619 (B) und AB für das Vorhandensein je eines Gens der GSTMl mit Cytosin (A) bzw. Guanin (B) an Position 2619.00 for the absence of both genes of GSTMl, A0 and B0 for the presence of a gene of GSTMl, AA, BB for the presence of two genes, each with cytosine at position 2619 (A) and guanine at position 2619 (B) and AB for the presence of a gene of the GSTM1 with cytosine (A) or guanine (B) at position 2619.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß aus einer Probe des34. The method according to any one of claims 28 to 33, characterized in that from a sample of
Menschen DNS oder c-DNS isoliert und zumindest teilweise vervielfältigt und anschließend die allelische Variabilität und/oder das Vorhandensein oder Fehlen eines Gens erfaßt wird, das für ein Enzym des Entgiftungsstoffwechsels kodiert.Human DNA or c-DNA is isolated and at least partially reproduced and then the allelic variability and / or the presence or absence of a gene which codes for an enzyme of the detoxification metabolism is detected.
35. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die DNS durch Polymerasekettenreaktion vervielfältigt wird.35. The method according to the preceding claim, characterized in that the DNA is multiplied by polymerase chain reaction.
36. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerasekettenreaktion mit einem Paar Oligonukleotide durchge-36. The method according to the preceding claim, characterized in that the polymerase chain reaction with a pair of oligonucleotides
RECT1F1ED SHEET (RULE 91) ISA/EP fuhrt wird, die die folgenden Sequenzen aufweisen:RECT1F1ED SHEET (RULE 91) ISA / EP which has the following sequences:
TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC und TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA.TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC and TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA.
7. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß eines der beiden Oligonukleotide mit einem Fluoreszenzf arbsto f mar- kiert ist.7. The method according to the preceding claim, characterized in that one of the two oligonucleotides is marked with a fluorescent dye.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerasekettenreaktion mit einem Paar Oligonukleotide durchgeführt wird, die die folgenden Sequenzen aufweise .8. The method according to any one of claims 35 to 37, characterized in that the polymerase chain reaction is carried out with a pair of oligonucleotides which have the following sequences.
GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C und GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG GGAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C and GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G
39. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß eines der beiden Oligonukleotide mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist.39. The method according to the preceding claim, characterized in that one of the two oligonucleotides is marked with a fluorescent dye.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerasekettenreaktion mit zwei Paaren Oligonukleot den durchgeführt wird, die die folgenden Sequenzen aufweisen :40. The method according to any one of claims 35 to 39, characterized in that the polymerase chain reaction with two pairs of oligonucleotides which have the following sequences:
GCT TCA CGT GTT ATG GAG GTT C identisch für bei- de Paare undGCT TCA CGT GTT ATG GAG GTT C identical for both pairs and
TTG GGA AGG CGT CCAAGC GC bzw.TTG GGA AGG CGT CCAAGC GC or
TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG.TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG.
41. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da- durch gekennzeichnet, daß die beiden Oligonukleotide41. The method according to the preceding claim, characterized in that the two oligonucleotides
TTG GGA AGG CGT CCAAGC GC bzw.TTG GGA AGG CGT CCAAGC GC or
TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG jeweils mit zueinander verschiedenen Fluoropho- ren markiert sind.TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG are marked with different fluorophores.
42. Verfahren nach einem der Anspr che 28 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß die vervielfältigte DNS durch geeignete Pestriktionsenzyme verdaut und anhand der erzeugten DNS-Bruchstucke die al- lelische Variabilität bzw. das Vorhandensein oder Fehlen eines Gens erfaßt wird, das für em Enzym des Entgif tungsstof fwechsels kodiert.42. The method according to any one of claims 28 to 41, characterized in that the replicated DNA is digested by suitable restriction enzymes and the allelic variability or the presence or absence of a gene which is responsible for the enzyme is detected on the basis of the DNA fragments generated encoding the detoxification metabolism.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 37, 39 oder43. The method according to any one of claims 37, 39 or
41, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der vervielfältigten DNS die von der vervielfältigten DNS abgegebene Fluoreszenzstrahlung erfaßt wird. 41, characterized in that the fluorescent radiation emitted by the replicated DNA is detected to detect the replicated DNA.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 43, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung der allelischen Variabilität bzw. das Vorhandensein oder Fehlen eines Gens mittels eines Mikroarrays nach einem der Ansprüche 21 bis 27 erfolgt.44. The method according to any one of claims 28 to 43, characterized in that the detection of the allelic variability or the presence or absence of a gene is carried out by means of a microarray according to one of claims 21 to 27.
45. Verwendung eines Diagnose-Kits, Mikroarrays und/oder eines Verfahrens nach einem der vorher- gehenden Ansprüche zur Bestimmung der Anwesenheit bzw. des Fehlens von Genen und/oder zur Bestimmung der vorhandenen Varianten von Genen für Enzyme des Entgiftungsstoffwechsels.45. Use of a diagnostic kit, microarrays and / or a method according to one of the preceding claims for determining the presence or absence of genes and / or for determining the existing variants of genes for enzymes of the detoxification metabolism.
46. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch zur46. Use according to the preceding claim
Bestimmung des Nulltyps bzw. des Genpol ymorphis- uses für das Enzym Glutathion-S-Trans f erase GSTTl und gegebenenfalls GSTMl. Determination of the null type or the gene polymorphism use for the enzyme glutathione-S-transferase GSTTl and, if applicable, GSTMl.
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