DE19955024A1 - Diagnostic kit - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Diagnose-Kit für die Bestimmung der menschlichen Entgiftungsfähigkeit mit mindestens einem Paar Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer), wobei die beiden Oligonukleotide eines Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind und wobei der gesuchte DNS-Abschnitt zumindest für einen Teil eines Enzyms des tierischen Entgiftungsstoffwechsels kodiert.The invention relates to a diagnostic kit for determining the human detoxification ability with at least one pair of oligonucleotides (reverse primer, forward primer), the two oligonucleotides of a pair being suitable as primers for amplification by means of a polymerase chain reaction in each case one of the two complementary strands of a sought DNA segment and wherein the DNA section searched encodes at least part of an enzyme of the animal detoxification metabolism.
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Dia gnose-Kit sowie seine Verwendung für die Bestimmung der menschlichen Entgiftungsfähigkeit. Derartige Dia gnose-Kits werden im Bereich der Umweltmedizin und Arbeitsmedizin und den damit verbundenen Erkrankungen wie Neurodermitis, Asthma, MCS (Multiple Chemical Sensitivity, Multiple Chemikalien-Empfindlichkeit) oder CFS (Chronic Fatigue Syndrom, Müdigkeitssyndrom) verwendet. Weitere Verwendung finden derartige Dia gnose-Kits im Bereich der Pharmakologie, bzw. zur Be stimmung der menschlichen Verstoffwechselung von Me dikamenten oder neuen Produkten.The present invention relates to a slide gnose kit and its use for determination of human detoxification ability. Such slide gnose kits are used in environmental medicine and Occupational medicine and the associated diseases such as neurodermatitis, asthma, MCS (Multiple Chemical Sensitivity, multiple chemical sensitivity) or CFS (Chronic Fatigue Syndrome) used. Such slides are also used gnose kits in the field of pharmacology, or for loading mood of the human metabolism of Me dicaments or new products.
Die Umwelt des Menschen ist durch Umweltchemikalien (Xenobiotika = Fremdstoffe für den lebenden Organis mus) natürlichen und anthropogenen Ursprungs bela stet, die nach heutigen Maßstäben nicht mit höherem Leben vereinbar, also unphysiologisch sind. Durch sie werden Störungen in diffizil regulierten physiologi schen Systemen hervorgerufen, die nur schwer oder überhaupt nicht reparabel sind. Diese Fremdstoffe ge langen durch die Luft, die Haut oder die Nahrung in den menschlichen oder tierischen Organismus. Wasser lösliche Stoffe werden meist schnell wieder ausge schieden, nicht so jedoch die wasserunlöslichen. Die se sammeln sich im Gegenteil im Körper - oft im Fett gewebe - an (Bioakkumulation), wenn sie nicht zeitnah verstoffwechselt und abgebaut werden.The human environment is through environmental chemicals (Xenobiotics = foreign substances for the living organ mus) of natural and anthropogenic origin bela continuously, which by today's standards not with higher Life is compatible, so it is non-physiological. Through it are disorders in difficult regulated physiology systems that are difficult or are not repairable at all. These foreign substances long through the air, skin or food the human or animal organism. Water Soluble substances are usually quickly removed again divorced, but not so the water-insoluble. The On the contrary, they accumulate in the body - often in fat tissue - on (bioaccumulation) if not timely metabolized and broken down.
Daher verfügen der Mensch und höhere Organismen über ein komplexes Enzymsystem, durch das wasserunlösliche Substanzen der Ausscheidung zugängig gemacht werden. Dieses komplexe Enzymsystem vermittelt folgende Reak tionen in zwei Phasen:Therefore, humans and higher organisms have a complex enzyme system through which water-insoluble Elimination substances are made accessible. This complex enzyme system mediates the following reac in two phases:
In der sogenannten Phase-I-Reaktion werden die Um weltgifte zunächst durch Enzyme aus dem Zytochromsy stem in reaktive Zwischenprodukte umgesetzt, die je doch akut toxischer sein können als die Schadstoffe selbst. Diese Zwischenprodukte der Phase-I-Reaktion können z. B. an zelluläre Komponenten binden und da durch Schaden anrichten. Chronische Schäden sind je doch in der Regel eher auf die wasserunlöslichen Aus gangssubstanzen zurückzuführen.In the so-called phase I reaction, the Um world poisons first through enzymes from the cytochrome stem into reactive intermediates, each but can be acutely more toxic than the pollutants itself. These intermediates of the phase I reaction can e.g. B. bind to cellular components and there to cause damage. Chronic damage is ever but usually rather on the water-insoluble out attributable to substances.
Die sich an die Phase-I anschließende Phase-II- Reaktion setzt die reaktiven Zwischenprodukte zu aus scheidbaren Endprodukten um.The phase II subsequent to phase I Reaction suspends the reactive intermediates separable end products.
Phase-I beschreibt also die Umsetzung und Aktivierung beispielsweise von verschiedenen bekannten Medikamen ten und Umweltchemikalien (z. B. Debrisoquin, Opioide, Benzo(a)pyren, polyzklische und aromatische Kohlen wasserstoffe) sowie einer Anzahl von noch nicht bekannten Xenobiotika zu elektrophilen, radikalen Sub stanzen.Phase I describes the implementation and activation for example from various known medicines and environmental chemicals (e.g. debrisoquine, opioids, Benzo (a) pyrene, polycyclic and aromatic coals hydrogen) and a number of as yet unknown Xenobiotics to electrophilic, radical sub punch.
Bei den Phase-II-Reaktionen gibt es mehrere Reakti onswege, unter anderem Glucoronidierung, Sulfatester bildung, Aminosäure-Konjugation, wobei die Enzyme des wichtigsten Phase-II-Reaktionsweges (Glutathion-S- Transferasen) die Zwischenprodukte aus der Phase-I (z. B. Epoxide, Nitrosamine) zu ausscheidbaren End stoffen deaktivieren durch Konjugation mit Glutathion.There are several reactions in the phase II reactions pathways, including glucoronidation, sulfate esters formation, amino acid conjugation, the enzymes of most important phase II pathway (glutathione S Transferases) the intermediates from phase I (e.g. epoxies, nitrosamines) to excreted end deactivate substances by conjugation with Glutathione.
Es besteht dabei ein Zusammenhang zwischen der Schwe re von Vergiftungssymptomen und der Verminderung der Enzymaktivitäten der beteiligten Enzyme des Entgif tungssystems. Bei einigen dieser Enzyme sind geneti sche Variationen beschrieben, die sich direkt auf die Aktivität dieser Enzyme auswirken und dadurch deren Leistungsfähigkeit entscheidend beeinflussen. Die in dividuelle genetisch bedingte Variation in der Akti vität der einzelnen Enzyme erlaubt folglich die Zu ordnung des Individuums zu verschiedenen Stufen des Entgiftungspotentials. Zur Beurteilung, welche Dosis eine Giftwirkung hervorruft, ist neben der Giftauf nahme und dem Giftstoffwechsel folglich auch die Giftausscheidung von entscheidender Bedeutung.There is a connection between the Schwe re of symptoms of intoxication and the reduction of Enzyme activities of the enzymes involved in the detoxification system. Some of these enzymes are genetic described variations that directly affect the Affect the activity of these enzymes and thereby their Decisively influence performance. The in individual genetic variation in the act The quality of the individual enzymes therefore allows the addition order of the individual at different levels of Detoxification potential. To assess what dose causes a poisonous effect is next to the poison and the metabolism of toxins Poison excretion is vital.
Dies gilt hier auch für die Glutathion-S-Transferase. Diese deaktiviert Zwischenprodukte aus der Phase-I- Reaktion zu ausscheidbaren Endstoffen durch Konjuga tion mit Glutathion, dessen reduzierte Form eine nu kleophile SH-Gruppe besitzt, die leicht mit Verbin dung mit elektrophilen C-Atomen zum Thioether rea giert. Eine möglichst hohe Aktivität der Glutathion- S-Transferase bedeutet dabei eine effiziente Konjuga tion und schnelle Entgiftung, während eine verminderte bzw. fehlende Aktivität der Glutathion-S- Transferase eine verlangsamte Entgiftung bewirkt.This also applies to the glutathione-S-transferase. This deactivates intermediate products from phase I Reaction to end products that can be excreted by conjugation tion with glutathione, the reduced form of which is a nu kleophile SH group that easily connects formation with electrophilic carbon atoms to thioether rea yaws. The highest possible activity of glutathione S-Transferase means an efficient conjuga tion and rapid detoxification while a diminished or lack of activity of glutathione-S- Transferase causes slow detoxification.
Das System der Glutathion-S-Transferasen weist mehre re unterschiedliche Enzyme auf, beispielsweise die Glutathion-S-Transferase GSTM1 und die Glutathion-S- Transferase GSTT1.The system of glutathione S transferases has several re different enzymes, for example the Glutathione-S-Transferase GSTM1 and the Glutathione-S- Transferase GSTT1.
Die Glutathion-S-Transferase GSTM1 weist einen Poly morphismus auf, bei dem die einzelnen Genotypen gleichberechtigt nebeneinander vorkommen. Durch den Genotyp 00 wird das Fehlen des Gens für die GSTM1 an gezeigt. Liegt ein funktionelles Gen vor, können zwei verschiedene Varianten A und B unterschieden werden. Beide Varianten formen aktive homodimere Enzyme (AA/BB bzw. bei Fehlen des Gens für ein Allel A0/B0) oder heterodimere Enzyme (AB), wobei die Mischform AB die höchste Enzymaktivität zeigt und u. a. mitverant wortlich gemacht wird für das "drug-resistence"- Phänomen in der Chemotherapie.The glutathione-S-transferase GSTM1 has a poly morphism based on which the individual genotypes occur side by side on an equal footing. By the Genotype 00 will indicate the lack of the gene for GSTM1 shown. If there is a functional gene, two can different variants A and B can be distinguished. Both variants form active homodimeric enzymes (AA / BB or in the absence of the gene for an allele A0 / B0) or heterodimeric enzymes (AB), the mixed form AB shows the highest enzyme activity and u. a. jointly responsible is literally made for "drug resistance" - Phenomenon in chemotherapy.
Die Glutathion-S-Transferase M1 spielt in der Leber, Lunge und der Haut eine große Rolle, wobei in etwas 40% der kaukasischen Bevölkerung der Null-Genotyp vorkommt. Dieser Null-Genotyp wird mit der Entstehung diverser Tumorerkrankungen (Lungen-, Haut-, Blasen krebs) sowie chronische Erkrankungen mit Umweltbela stungsfaktor (Asbestosis, chronische Bronchitis) be schrieben.Glutathione-S-Transferase M1 plays in the liver, Lungs and skin play a big role, being in something 40% of the Caucasian population has the zero genotype occurs. This zero genotype will come into existence various tumor diseases (lung, skin, blisters cancer) and chronic diseases with environmental pollution factor (asbestosis, chronic bronchitis) wrote.
Die Glutathion-S-Transferase T1 kommt u. a. in der Le ber und in Erythrozyten vor und vermittelt die Glutathion-Konjugation mit halogenierten Kohlenwas serstoffen und Epoxiden. Bei etwa 25% der bisher un tersuchten deutschen Bevölkerung wurde in Erythro zyten keine Enzymaktivität der Glutathion-S-Trans ferase gefunden. Durch den Genotyp 00 wird das Fehlen des Genes für diese Glutathion-S-Transferase ange zeigt. Der 0-Genotyp wird daher als Risikofaktor an gesehen, weil hier die GSTT1 vermittelte Aktivität gegenüber DNA-schädigenden Peroxiden und anderen Me taboliten vermindert ist. Bekannte toxische Substrate der GSTT1 sind u. a. Methylbromid, Ethylenoxid und Me thylenchlorid.The glutathione-S-transferase T1 comes u. a. in the le Above and in erythrocytes before and mediates the Glutathione conjugation with halogenated coal water substances and epoxides. In about 25% of the previously un German population was in erythro cytogenes no enzyme activity of glutathione-S-trans ferase found. The absence of genotype 00 of the gene for this glutathione-S-transferase shows. The 0 genotype is therefore considered a risk factor seen because here the GSTT1 mediated activity against DNA-damaging peroxides and other me tabolite is reduced. Known toxic substrates the GSTT1 are u. a. Methyl bromide, ethylene oxide and Me ethylene chloride.
Das gleichzeitige Fehlen beider Enzyme, d. h. der ge netische Null-Typ für GSTM1 und GSTT1 wurde in 10% der kaukasischen Bevölkerung gefunden. Für diesen Be völkerungsanteil ergibt sich folglich ein erhöhtes Risiko aufgrund verminderter Entgiftungskapazität.The simultaneous absence of both enzymes, i.e. H. the ge netic null type for GSTM1 and GSTT1 was in 10% of the Caucasian population. For this Be population share consequently results in an increased Risk due to decreased detoxification capacity.
Die geltenden MAK-Werte (max. Arbeitsplatzkonzentra tionen) berücksichtigen derzeit nicht den Anteil an genetisch bedingt empfindlichen Menschen.The applicable MAK values (max. Workplace concentration tions) do not currently take into account the share of genetically sensitive people.
Um die individuelle Belastungsfähigkeit mit Umwelt chemikalien zu bestimmen bzw. um bei erkrankten Per sonen die richtige Therapie zu ermitteln, wird nach dem Stand der Technik ein Belastungstest durchge führt, über den auf die Entgiftungsfähigkeit und da mit Enzymaktivität dieses Individuums geschlossen werden kann. Dies erfolgt nach dem Stand der Technik durch Gabe einer Testsubstanz, die durch die zu un tersuchenden Enzyme abgebaut wird und anschließende Bestimmung der Clearance des jeweiligen Individuums für diese Substanz.To the individual resilience with the environment to determine chemicals or in order to treat per to determine the right therapy will be followed the prior art a stress test leads over to the detoxification ability and there closed with enzyme activity of this individual can be. This is done according to the state of the art by administering a test substance that is caused by the un testering enzymes is broken down and subsequent Determination of the clearance of the individual for this substance.
Nachteilig hieran ist, daß die Bestimmung der Enzymaktivitäten nur über eine zusätzliche Belastung der Person mit einer Chemikalie bestimmt werden kann. Eine derartige Bestimmungsmethode verbietet sich ins besondere bei Kindern oder Personen mit reduziertem Allgemeinzustand oder Personen, von denen bekannt ist, daß sie bereits stark schadstoffbelastet sind. Daher kann dieses Verfahren nicht in jedem Falle an gewandt werden, insbesondere nicht bei Personen, bei denen aufgrund ihrer Schadstoffbelastung die Bestim mung der Enzymaktivität zur Ermittlung der geeigneten Therapie besonders wichtig wäre.The disadvantage of this is that the determination of the Enzyme activities only through an additional burden the person can be identified with a chemical. Such a method of determination is prohibited especially for children or people with reduced General condition or persons known of is that they are already heavily polluted. Therefore, this procedure may not work in every case be turned around, especially not with people which due to their pollution level the Measurement of the enzyme activity to determine the appropriate Therapy would be particularly important.
Demgegenüber schlägt die DE 197 38 908, die auf die selben Erfinder wie die vorliegende Erfindung zurück geht, vor, genetische Polymorphismen von Genen in In dividuen zu bestimmen, die für ein Enzym aus dem Ent giftungsstoffwechsel kodieren. Der Polymorphismus kann dabei sowohl in der Anlage eines Genes als auch in verschiedenen allelischen Variabilitäten eines oder mehrerer polymorpher Gene bestehen.In contrast, DE 197 38 908, which on the same inventor as the present invention proceeds, genetic polymorphisms of genes in In to determine the dividuen for an enzyme from the Ent encode toxic metabolism. The polymorphism can both in the creation of a gene and in different allelic variabilities one or several polymorphic genes.
Das in der DE 197 38 908 vorgeschlagene Verfahren ist jedoch extrem aufwendig und kann nur von einzelnen spezialisierten Laboren durchgeführt werden. Denn für dieses Verfahren ist es erforderlich, eine Multipli kation der DNA eines Menschen durchzuführen, wozu ei ne erhebliche molekularbiologische Kenntnis sowie ein Höchstmaß an experimenteller Erfahrung gehört. Denn die Entwicklung entsprechender Reaktionsansätze, bei spielsweise für eine Polymerase-Kettenreaktion, ist aufwendig und erfordert zum sicheren Gelingen eine weit über das Durchschnittskönnen des Fachmanns er forderliche Erfahrung und Kenntnis. Nachteilig an dem in der DE 197 38 908 vorgeschlagenen Verfahren ist daher, daß dieses nicht von jedem beliebigen Labor arzt bzw. medizinischen Labor nachvollzogen werden kann.The method proposed in DE 197 38 908 is however extremely complex and can only be done by individuals specialized laboratories. Because for this procedure requires a multipli to carry out cation of a person's DNA, for which purpose ne considerable molecular biological knowledge as well Heard of the highest level of experimental experience. Because the development of appropriate reaction approaches at for example for a polymerase chain reaction complex and requires one to succeed well above the average skill of the artisan required experience and knowledge. Disadvantage of that is proposed in DE 197 38 908 hence that this is not from any laboratory medical or medical laboratory can.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Diagnose-Kit zur Verfügung zu stellen, mit dem der genetische Polymorphismus von Genen, die für ein En zym des Entgiftungsstoffwechsels kodieren, auf einfa che Art und Weise von jedem beliebigen Labor standar disiert bestimmt werden kann.The object of the present invention is therefore a Provide diagnostic kit with which the genetic polymorphism of genes responsible for an en encode the detoxification metabolism to simpl standard of any laboratory can be determined discretely.
Diese Aufgabe wird durch das Diagnose-Kit nach An spruch 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen finden sich in den abhängigen Ansprüchen.This task is performed by the diagnostic kit according to An spell 1 solved. Find advantageous training themselves in the dependent claims.
Das erfindungsgemäße Diagnose-Kit enthält dabei die zur Durchführung einer Polymerrasekettenreaktion er forderlichen Substanzen, wie sie auch von verschiede nen Herstellern angeboten werden. Weiterhin enthält das Diagnose-Kit mindestens ein Paar Oligonukleotide, die als Reverseprimer und Forwardprimer bei der Am plifikation mittels Polymerasekettenreaktion erfor derlich sind. Diese beiden Oligonukleotide sind dabei erfindungsgemäß so ausgesucht, daß eine Amplifikation desjenigen DNS-Abschnittes erfolgt, der zumindest für einen Teil eines Enzyms des tierischen Entgiftungs stoffwechsel kodiert. Erfolgt somit eine Amplifikati on eines DNS-Abschnittes, so kann einfach festge stellt werden, ob ein Gen für das jeweilige Enzym vorliegt. Damit ist eine Null-Typ-Bestimmung möglich.The diagnostic kit according to the invention contains the to carry out a polymerase chain reaction required substances, such as those of various offered to manufacturers. Furthermore contains the diagnostic kit has at least one pair of oligonucleotides, that as reverse primer and forward primer at Am plication by polymerase chain reaction are such. These two oligonucleotides are included selected according to the invention such that an amplification of the DNA section that is at least for part of an enzyme in animal detoxification metabolism coded. An amplification is thus carried out on a DNS section, so you can simply fix be whether a gene for the respective enzyme is present. This enables a zero-type determination.
Um weiterhin auch verschiedene Allele desselben Genes zu erfassen, werden in das Diagnose-Kit für jedes der Allele verschiedene Oligonukleotide gegeben, so daß eine Amplifikation eines Alleles nachgewiesen werden kann. Dies kann beispielsweise auch so geschehen, daß die Oligonukleotide für die einzelnen Allele sich derart unterscheiden, daß Bereiche der DNS der Allele amplifiziert werden, die sich beispielsweise durch eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym unter scheiden.To continue with different alleles of the same gene to be recorded in the diagnostic kit for each of the Given alleles of different oligonucleotides, so that amplification of an allele can be demonstrated can. This can also be done, for example, in such a way that the oligonucleotides for the individual alleles so different that areas of the DNA of the alleles be amplified, for example, by an interface for a restriction enzyme below divorce.
Vorteilhaft an dem erfindungsgemäßen Diagnose-Kit ist es, daß jeder Laborarzt und jedes medizinische Labor sowie jedes wissenschaftliche Labor, das derartige Untersuchungen durchführt, sämtliche aufeinander ab gestimmte Substanzen in einem einzigen Diagnose-Kit zur Verfügung erhält, so daß jegliche Vorbereitungs arbeiten für die Labore entfallen und auf einfache Art und Weise der Polymorphismus bestimmt werden kann. Insbesondere sind die Inhaltsstoffe des Diagno se-Kits bereits ausgetestet, so daß die Hauptarbeit bei der Entwicklung entsprechender Amplifikationspro zeduren entfällt.The diagnostic kit according to the invention is advantageous it that every laboratory doctor and every medical laboratory as well as any scientific laboratory Conducts investigations, all on each other tuned substances in a single diagnostic kit gets available so that any prep work for the laboratories and simple Way the polymorphism can be determined can. In particular, the ingredients of the diagnosis se kits already tested, so the main work in the development of appropriate amplification pro cedure no longer applies.
Damit ist es erstmals möglich, die Bestimmung von Po lymorphismen und des individuellen Entgiftungspoten tials von einzelnen Patienten in großem Maßstabe und am jeweiligen Ort des Patienten auf einfache und ko stengünstige Weise durchzuführen. Denn hierzu benö tigt der einzelne Laborarzt bzw. das einzelne medizi nische Labor lediglich noch einen herkömmlichen Ther moscycler (PCR-Gerät) sowie ein Gerät zur Auftrennung der einzelnen amplifizierten DNS-Fragmente. Dies kann beispielsweise eine Gelelektrophorese-Einheit oder ein Kapillarelektrophoresegerät sein. Ein derartiges herkömmliches Kapillarelektrophoresegerät wird bei spielsweise von der Firma Perkin Elmer BiosystemsTM unter dem Namen "PE ABI Prism Genetic Analyser 310"TM vertrieben. Entsprechende Thermocycler für die Ampli fication der DNS werden beispielsweise von der Firma Perkin Elmer BiosystemsTM unter dem Namen "GenAmp 2400"TM bzw. auch "GenAmp 9600"TM vertrieben. This makes it possible for the first time to determine polymorphisms and the individual detoxification potential of individual patients on a large scale and at the respective location of the patient in a simple and cost-effective manner. For this, the individual laboratory doctor or the individual medical laboratory only needs a conventional thermos cycler (PCR device) and a device for the separation of the individual amplified DNA fragments. This can be, for example, a gel electrophoresis unit or a capillary electrophoresis device. Such a conventional capillary electrophoresis device is marketed for example by the company Perkin Elmer Biosystems ™ under the name "PE ABI Prism Genetic Analyzer 310" TM . Corresponding thermal cyclers for the amplification of the DNA are sold, for example, by the company Perkin Elmer Biosystems TM under the name "GenAmp 2400" TM or "GenAmp 9600" TM .
Zur leichteren Erfassung der amplifizierten DNS- Abschnitte kann jeweils mindestens eines der Oligonu kleotide eines Paares mit einem Fluorophor gekenn zeichnet sein, so daß hierdurch auch eine automati sierte Auswertung anhand der spezifischen Fluores zenzemission der jeweiligen Fluorophore möglich ist.For easier detection of the amplified DNA Sections can contain at least one of the oligonu a couple's dresses identified with a fluorophore be drawn, so that this also an automati based evaluation based on the specific fluorescence emission of the respective fluorophores is possible.
Insgesamt wird durch das erfindungsgemäße Diagnose- Kit die Bestimmung des Polymorphismusses von Entgif tungsenzymen jedermann auf einfache, sichere und standardisierte Weise ermöglicht.Overall, the diagnostic Kit determining the polymorphism of detox tion enzymes everyone on simple, safe and standardized way.
Erfindungsgemäß kann das Diagnose-Kit auch dahinge hend weitergebildet werden, daß dem Diagnose-Kit nicht nur Oligonukleotide für die Bestimmung eines einzelnen Enzymes sondern auch weitere Oligonukleo tidpaare für die Bestimmung weiterer Gene von Entgif tungsenzymen beigegeben werden.According to the invention, the diagnostic kit can also be used hend be trained that the diagnostic kit not just oligonucleotides for the determination of a single enzyme but also other oligonucleo tid pairs for the determination of further genes of Entgif enzymes are added.
In diesem Falle ist es dem Anwender möglich, auf ein fache Art und Weise nicht nur eine Null-Typ- Bestimmung oder eine Allelbestimmung eines einzelnen Enzymes durchzuführen sondern zugleich weitere Enzyme zu bestimmen. So ist es ihm beispielsweise möglich, Informationen sowohl über die GSTM1 als auch die GSTT1 zu erfassen, und dadurch beispielsweise das "drug-resistence"-Phänomen in der Chemotherapie für einen Patienten vorherzusagen.In this case, the user is able to click on one fold way not just a zero-type Determination or an allele determination of an individual Perform enzymes but at the same time other enzymes to determine. For example, it is possible for him Information about both the GSTM1 and the GSTT1 to record, and thus for example that "drug-resistence" phenomenon in chemotherapy for to predict a patient.
Im folgenden sollen einige Beispiele erfindungsgemä ßer Kits beschrieben werden.In the following some examples according to the invention kits are described.
Ein erster Kit ermöglicht eine Multiplex-Null-Typ Be stimmung mittels PCR (Polymerase-Kettenreaktion) der Gene für GSTM1 und GSTT1 mit markierten Oligonukleo tiden als Primer für einen Nachweis über das Gerät Perkin Elmer ABI Prism Genetic Analyzer 310.A first kit enables a multiplex zero type Be tuning using PCR (polymerase chain reaction) Genes for GSTM1 and GSTT1 with labeled oligonucleo tiden as a primer for a proof of the device Perkin Elmer ABI Prism Genetic Analyzer 310.
Als Substanzen, die für die PCR nötig sind, enthält
der Kit die folgenden Inhaltsstoffe getrennt in ein
zelnen Behältnissen:
10 µl PCR-Puffer (10 × Puffer, z. B. der Fa. Promega)
8 µl MgCl2 (25 mM)
2 µl dNTPs (10 mM) (Desoxi-Nucleotid-Triphosphate,
z. B. Guanin (G), Adenin (A),
Cytosin (C), Thymin (T))
2 µl Primer GSTM1 fw (10 pmol/µl)
2 µl Primer GSTM1 rv (10 pmol/µl)
2 µl Primer Albumin fw (10 pmol/µl)
2 µl Primer Albumin rv (10 pmol/µl)
2 µl Primer GSTT1 fw (10 pmol/µl)
2 µl Primer GSTT1 rv (10 pmol/µl)
6 µl Template DNS (83 ng/µl)
61,5 µl H2O bidest.
0,5 µl Taq-Polymerase (5 U/µl) (z. B. der Fa. Promega)As substances that are necessary for the PCR, the kit contains the following ingredients separately in an individual container:
10 µl PCR buffer (10 × buffer, e.g. from Promega)
8 µl MgCl 2 (25 mM)
2 µl dNTPs (10 mM) (deoxynucleotide triphosphates, e.g. guanine (G), adenine (A), cytosine (C), thymine (T))
2 µl primer GSTM1 fw (10 pmol / µl)
2 µl primer GSTM1 rv (10 pmol / µl)
2 µl primer albumin fw (10 pmol / µl)
2 µl primer albumin rv (10 pmol / µl)
2 µl primer GSTT1 fw (10 pmol / µl)
2 µl primer GSTT1 rv (10 pmol / µl)
6 µl template DNS (83 ng / µl)
61.5 µl H 2 O bidistilled.
0.5 µl Taq polymerase (5 U / µl) (e.g. from Promega)
Dabei sind die Oligonukleotdie GSTM1 fw, die als Vor wärts-Primer dienen, mit dem Farbstoff Fam (Car boxyfluorescein) markiert, der Vorwärts-Primer für Albumin mit Ned (Fluoreszenzfarbstoff der Fa. PE Bio systems) markiert und der Vorwärts-Primer für GSTT1 mit Hex (4,7,2',4',5',7'-Hexachloro-6-Carboxy fluorescein) markiert.The oligonucleotides are GSTM1 fw, which are pre serve primer with the dye Fam (Car boxyfluorescein), the forward primer for Albumin with Ned (fluorescent dye from PE Bio systems) and the forward primer for GSTT1 with hex (4,7,2 ', 4', 5 ', 7'-hexachloro-6-carboxy fluorescein).
Die einzelnen Primer besitzen die folgende Nukleo
tidabfolgen:
GSTM1 fw: GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C;
GSTM1 rv: GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G;
GSTT1 fw: TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC;
GSTT1 rv: TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA;
Albumin fw: GCC CTC TGC TAA CAA GTC CTA C
sowie
Albumin rv: GCC CTA AAA AGA AAA TCG CCA ATCThe individual primers have the following nucleotide sequences:
GSTM1 fw: GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C;
GSTM1 rv: GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G;
GSTT1 fw: TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC;
GSTT1 rv: TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA;
Albumin fw: GCC CTC TGC TAA CAA GTC CTA C
such as
Albumin rv: GCC CTA AAA AGA AAA TCG CCA ATC
Weiterhin kann das Kit einen Fluoreszenzstandard (Rox-Standard, Rox = 6-carboxy-X-rhodamin) als Län genstandard für die Fragmentgrößenzuordnung enthal ten.The kit can also be a fluorescence standard (Rox standard, Rox = 6-carboxy-X-rhodamine) as Län contain gene standard for the fragment size assignment ten.
Weiterhin enthält das Kit die Verfahrensbeschreibung
für die Amplifikation der DNS mit den folgenden Para
metern:
The kit also contains the procedure description for the amplification of the DNA with the following parameters:
Die Auswertung kann nun beispielsweise über Gelelek trophorese erfolgen. Hierzu wird ein 2,5%iges Gel (SeaKem LETM, BiozymTM) gegossen, ein Marker (100 bp- ladder) mitaufgetragen und das Gel bei einer Spannung von 100 mV für 45 Minuten zur Auftrennung laufenge lassen. Die interne Kontrolle für das Gen für Albumin besitzt eine Länge von 350 bp und muß in jedem Ansatz positiv sein. Die GSTM1 besitzt eine Länge von 219 bp und die GSTT1 eine Länge von 480 bp. Die letzten bei den Gene sind als DNS-Banden im Gel nur bei Vorhan densein eines funktionellen Gens zu sehen, anderen falls liegt der jeweilige Null-Typ vor. The evaluation can now take place, for example, via gel electrophoresis. For this purpose, a 2.5% gel (SeaKem LE TM , Biozym TM ) is poured, a marker (100 bp ladder) is also applied and the gel is run at a voltage of 100 mV for 45 minutes for separation. The internal control for the gene for albumin is 350 bp in length and must be positive in each approach. The GSTM1 has a length of 219 bp and the GSTT1 has a length of 480 bp. The last of the genes can only be seen as DNA bands in the gel if a functional gene is present, otherwise the respective null type is present.
Fig. 1 zeigt ein derartiges Gel, bei dem die Banden für die GSTT1 (T1) bei 480 bp, für das Gen für Albu min (A) bei 350 bp sowie für das Gen GSTM1 (M1) bei 219 bp deutlich in den Spuren 3 und 4 zu erkennen sind. Spur 2 enthält als Standard Markersubstanzen. In diesem Falle liegt also folglich sowohl das Gen für GSTM1 als auch das GSTT1-Gen vor. Fig. 1 shows such a gel, where the bands for the GSTT1 (T1) at 480 bp, bp at 350 for the gene for Albu min (A) and for the gene GSTM1 (M1) at 219 bp clearly in lanes 3 and 4 can be seen. Lane 2 contains marker substances as standard. In this case, therefore, both the gene for GSTM1 and the GSTT1 gene are present.
Fig. 2 zeigt eine entsprechende Auswertung mittels Kapillarelektrophorese durch das Gerät PE ABI Prism Genetic Analyzer 310TM. Auch hier sind die entspre chenden Banden bei den entsprechenden Fragmentlängen (in Basenpaaren) deutlich zu erkennen. Die Höhen der einzelnen Banden sind dabei von den verwendeten Fluo reszenzmarkern abhängig und geben daher selbst keine quantitative Information. Die weiteren Banden stellen den ROX-Standard dar, der die Zuordnung der Fragment größen ermöglicht. Fig. 2 shows a corresponding evaluation by capillary electrophoresis by the device PE ABI Prism 310 Genetic Analyzer ™. Here too, the corresponding bands can be clearly seen at the corresponding fragment lengths (in base pairs). The heights of the individual bands depend on the fluorescence markers used and therefore do not provide any quantitative information. The other bands represent the ROX standard, which enables the fragment sizes to be assigned.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse einer weiteren Untersu chung mittels Kapillarelektrophorese. Hierbei treten neben den Banden des Rox-Standards lediglich die Ban den des Albumin-Standards (A) und der GSTT1 (T1) auf, Offensichtlich liegt bezüglich der GSTM1 ein Nulltyp vor. Fig. 3 shows the results of a further investigation by means of capillary electrophoresis. In addition to the bands of the Rox standard, only the bands of the albumin standard (A) and the GSTT1 (T1) occur. Obviously, there is a null type with regard to the GSTM1.
In einem weiteren Beispiel wurde ein Kit verwendet für die Variantenbestimmung der GSTM1 mit markierten Oligonukleotiden als Primern.In another example, a kit was used for the variant determination of the GSTM1 with marked Oligonucleotides as primers.
Die Glutathion-S-Transferase M1 ist in zweierlei Hin sicht durch einen genetischen Polymorphismus ausge zeichnet. Zum einen kann eines oder beide der (auf den paarweisen Chromosomen befindlichen) für die Glutathion-S-Transferase M1 codierenden Gene GSTM1 fehlen und dadurch ein bei Vorhandensein zweier Gene GSTM1 homozygoter Typus, ein bei lediglich eines Ge nes GSTM1 heterozygoter Typus sowie ein bei Fehlen beider Gene wiederum homozygoter Null-Typus entste hen. Zum anderen führt der Austausch von Guanin (G) gegen Cytosin (C) an Position 2619 von einem Enzymtyp B zu einem Enzymtyp A, wobei der heterozygote AB-Typ die höchste potentielle Enzymaktivität aufweist. Durch die Bestimmung der genomischen Allelvariationen eines Individuums lassen sich daher die potentielle Entgiftungsfähigkeit und damit die potentiellen Bela stungsgrenzwerte sowie die für dieses Individuum dar aus folgende geeignete Therapie bestimmen.The glutathione-S-transferase M1 is in two ways genetic polymorphism draws. For one, one or both of the (on the paired chromosomes) for the Genes encoding glutathione S-transferase M1 GSTM1 are absent and therefore one in the presence of two genes GSTM1 homozygous type, one with only one Ge Nes GSTM1 heterozygous type and one in the absence both genes in turn result in homozygous null type hen. On the other hand, the exchange of guanine (G) against cytosine (C) at position 2619 of an enzyme type B to an enzyme type A, the heterozygous AB type has the highest potential enzyme activity. By determining the genomic allele variations an individual's potential Detoxification ability and thus the potential bela limits as well as those for this individual determine from the following suitable therapy.
Der zur Bestimmung dieser Allelvariabilität dienende
Kit enthält die folgenden, für die PCR erforderlichen
Substanzen, jeweils in getrennter Einzelverpackung:
10 µl PCR-Puffer (10 × Puffer, z. B. der Fa. Promega)
8 µl MgCl2 (25 mM)
2 µl dNTPs (10 mM) (Guanin (G), Cytosin (C),
Adenin (A), Thymin (T)
4 µl Primer GSTM1 fw (10 pmol/µl)
2 µl Primer GSTM1-A (10 pmol/µl)
2 µl Primer GSTM1-B (10 pmol/µl)
6 µl Template DNA (83 ng/µl)
65, 5 µl H2O bidest.
0,5 µl Taq-Polymerase (5 U/µl) (z. B. der Fa. Promega)The kit used to determine this allele variability contains the following substances required for PCR, each in separate individual packaging:
10 µl PCR buffer (10 × buffer, e.g. from Promega)
8 µl MgCl 2 (25 mM)
2 µl dNTPs (10 mM) (guanine (G), cytosine (C), adenine (A), thymine (T)
4 µl primer GSTM1 fw (10 pmol / µl)
2 µl primer GSTM1-A (10 pmol / µl)
2 µl primer GSTM1-B (10 pmol / µl)
6 µl template DNA (83 ng / µl)
65.5 µl H 2 O bidist.
0.5 µl Taq polymerase (5 U / µl) (e.g. from Promega)
Dabei sind die Oligonukleotide GSTM1-A mit dem Fluo
rophor Hex markiert und die Oligonukleotide GSTM1-B
mit dem Fluorophor Fam markiert. Die Oligonukleotide
weisen dabei die folgende Basenfolge auf:
GSTM1 fw: GCT TCA CGT GTT ATG GAG GTT C für beide Al
lele der GSTM1;
GSTM1-A: TTG GGA AGG CGT CCA AGC GC;
GSTM1-B: TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG.The oligonucleotides GSTM1-A are labeled with the fluorophore hex and the oligonucleotides GSTM1-B are labeled with the fluorophore Fam. The oligonucleotides have the following base sequence:
GSTM1 fw: GCT TCA CGT GTT ATG GAG GTT C for both all GSTM1;
GSTM1-A: TTG GGA AGG CGT CCA AGC GC;
GSTM1-B: TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG.
Weiterhin enthält das Kit eine Anweisung mit folgen
dem PCR-Programm:
The kit also contains instructions that follow the PCR program:
Die bei dem genannten PCR-Programm amplifizierten DNS-Segmente weisen eine Länge von 132 bp auf. Der Nachweis erfolgt wiederum über Kapillarelektrophorese mit den in den Fig. 4 und 5 dargestellten Ergeb nissen. Dabei ist mit M1-B jeweils die Bande gekenn zeichnet, die durch das 132 bp lange DNS-Stück der Variante B der GSTM1 entsteht und mit dem Fluorophor FAM makriert ist, während M1-A die Bande kennzeich net, die durch das 132 bp lange DNS-Stückes der Vari ante A der GSTM1 entsteht.The DNA segments amplified in the above-mentioned PCR program have a length of 132 bp. The detection is again carried out on capillary electrophoresis with the Nissen in FIGS. 4 and 5 resulting shown. M1-B denotes the band that is formed by the 132 bp DNA piece of variant B of the GSTM1 and is macrated with the fluorophore FAM, while M1-A identifies the band that is by the 132 bp long DNA piece of variant A of GSTM1 is created.
Alternativ kann die Auswertung auch über Gelelektro phorese erfolgen. Hierzu wird ein 2,5%iges Gel (Sea- Kem LE BiozymTM) gegossen, wobei dann anschließend neben dem PCR-Produkt auch ein Marker (100 bp-Ladder) mitaufgetragen wird, um den PCR-Erfolg zu prüfen. Das Gel läuft dann mit einer Spannung von 100 mV für 45 Minuten. Um mittels Gel-Elektrophorese zwischen der Variante A und B zu unterscheiden, wird das PCR- Produkt einem Restriktionsverdau unterworfen. Denn Variante A enthält eine Schnittstelle für HaeII und wird in zwei Fragmente von 116 bp und 16 bp Länge zerteilt, während Variante B keine Schnittstelle für das Restriktionsenzym HaeII enthält. Daraufhin wird ein 4%iges Gel für die Auftrennung kleinerer Frag mente (Biorad) gegossen, wobei wiederum ein Marker (100 bp-Ladder) mitaufgetragen wird. Das 4%ige Gel läuft dann bei einer Spannung von 100 mV für eine Stunde. Bei diesem Gel können nun die entsprechenden Banden bei 116 bp und 16 bp für die Variante A und für 132 bp für die Variante B des Genes GSTM1 erkannt werden.Alternatively, the evaluation can also be carried out using gel electrophoresis. For this, a 2.5% gel (SeaKem LE Biozym TM ) is poured, in which case a marker (100 bp ladder) is then also applied in addition to the PCR product in order to check the PCR success. The gel then runs at a voltage of 100 mV for 45 minutes. In order to differentiate between variant A and B by means of gel electrophoresis, the PCR product is subjected to a restriction digest. This is because variant A contains an interface for HaeII and is divided into two fragments of 116 bp and 16 bp in length, while variant B does not contain an interface for the restriction enzyme HaeII. Then a 4% gel for the separation of smaller fragments (biorad) is poured, with a marker (100 bp ladder) being applied. The 4% gel then runs at a voltage of 100 mV for one hour. With this gel, the corresponding bands at 116 bp and 16 bp for variant A and for 132 bp for variant B of the GSTM1 gene can now be recognized.
Fig. 6 zeigt ein derartiges Gel für verschiedene Proben in verschiedener Gelspuren, bei dem sowohl die 116 bp-Bande ("GSTM1-A" für Variante A) als auch die 132 bp-Bande ("GSTM1-B" für Variante B) zu erkennen ist. Die zweite Spur von links enthält als Standard Markersubstanzen. Die Spuren 4, 6, 9 entsprechen Pro ben, die das Gen für die GSTM1 Variante B enthalten, während die Spuren 3, 5, 7, 8, 10 bis 14 Proben mit dem Gen für die GSTM1 Variante A enthalten. Fig. 6 shows such a gel for different samples in different gel lanes in which both the 116 bp band ( "GSTM1-A" for variant A) as well as the 132 bp band ( "GSTM1-B" for variant B) is recognizable. The second lane from the left contains standard marker substances. Lanes 4, 6, 9 correspond to samples containing the gene for GSTM1 variant B, while lanes 3, 5, 7, 8, 10 to 14 contain samples with the gene for GSTM1 variant A.
Claims (19)
mindestens einem Paar Oligonukleotide (Reverse primer, Forwardprimer), wobei die beiden Oligo nukleotide eines Paares als Primer zur Amplifi kation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und
wobei der gesuchte DNS-Abschnitt zumindest für einen Teil eines Enzyms des tierischen Entgif tungsstoffwechsels kodiert.1. Diagnostic kit for determining human detoxification ability with
at least one pair of oligonucleotides (reverse primer, forward primer), the two oligo nucleotides of a pair being suitable as primers for amplification by means of a polymerase chain reaction in each case one of the two complementary strands of a sought DNA segment, and
wherein the DNA section searched encodes at least part of an enzyme of the animal detoxification metabolism.
GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C und
GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G11. Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that it has a pair of oligonucleotides with the following sequences for determining the presence of the enzyme GSTM1:
GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C and
GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G
TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC und
TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA. 12. Diagnostic kit according to claim 10, characterized in that it has a pair of oligonucleotides with the following sequences for determining the presence of the enzyme GSTT1:
TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC and
TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA.
GCT TCA CGT GTT ATG GAG GTT C identisch für beide Paare und
TTG GGA AGG CGT CCAAGC GC bzw.
TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG.13. Diagnostic kit according to claim 10, characterized in that it contains two pairs of oligonucleotides with the following sequences for determining the presence and possibly the existing variants of the enzyme GSTM1:
GCT TCA CGT GTT ATG GAG GTT C identical for both pairs and
TTG GGA AGG CGT CCAAGC GC or
TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG.
TTG GGA AGG CGT CCAAGC GC bzw.
TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG
jeweils mit zueinander verschiedenen Fluoropho ren markiert sind.14. Diagnostic kit according to the preceding claim, characterized in that the two oligonucleotides
TTG GGA AGG CGT CCAAGC GC or
TTG GGA AGG CGT CCA AGC AG
are each marked with different fluorophores.
eine Anleitung zur Durchführung der Polymer asekettenreaktion,
eine Anleitung zur Durchführung einer Fragment analyse enthält.15. Diagnostic kit according to one of the preceding claims, characterized in that it continues
instructions for carrying out the polymer chain reaction,
contains instructions for performing a fragment analysis.
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