EP1230352A2 - Inhibitoren der pflanzlichen cystathionin gamma-synthase - Google Patents

Inhibitoren der pflanzlichen cystathionin gamma-synthase

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EP1230352A2
EP1230352A2 EP00972855A EP00972855A EP1230352A2 EP 1230352 A2 EP1230352 A2 EP 1230352A2 EP 00972855 A EP00972855 A EP 00972855A EP 00972855 A EP00972855 A EP 00972855A EP 1230352 A2 EP1230352 A2 EP 1230352A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
atom
cgs
phe
tyr
ser
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00972855A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd Laber
Tim Clausen
Robert Huber
Clemens Steegborn
Albrecht Messerschmidt
Robert Klein
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer CropScience AG
Original Assignee
Aventis CropScience GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Aventis CropScience GmbH filed Critical Aventis CropScience GmbH
Publication of EP1230352A2 publication Critical patent/EP1230352A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/72—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms
    • A01N43/82—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms five-membered rings with three ring hetero atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-carbon bonds
    • A01N57/24—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-carbon bonds containing heterocyclic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • Plant cystathionin gamma synthase inhibitors Plant cystathionin gamma synthase inhibitors
  • the invention relates to a process for the production of crystals of plant cystathionine gamma synthase (CGS) in complex with inhibitors, plant CGS in a specific crystal form and a process for the development of new inhibitors of CGS with the aid of crystal data obtained from these complexes, in particular with the help of computer-aided modeling programs.
  • Further objects of the invention are the inhibitors of plant CGS identified by means of the method according to the invention, and their use as herbicides.
  • Herbicides make up about half of the crop protection products used worldwide. They are an important part of integrated crop protection and make a decisive contribution to crop yield and continuity of crops all over the world.
  • methionine and threonine which runs via the so-called aspartate route, is a promising target for new herbicides. Both amino acids are essential building blocks for proteins. Methionine is also important as a precursor for the methyl group donor S-adenosylmethionine, the plant hormone ethylene and for polyamines. Methionine is an amino acid essential for humans and animals that can only be found in microorganisms and plants can be produced. The enzymes for the biosynthesis of methionine and threonine therefore do not occur in humans and animals, so that no toxicity is to be expected from a specific inhibitor.
  • methionine and threonine synthesis is part of a multi-branched biosynthetic pathway that starts from aspartate and leads to the synthesis of lysine, methionine, threonine and isoleucine.
  • aspartate is converted into homoserine by the enzymes aspartate kinase, aspartate semialdehyde dehydrogenase and homoserine dehydrogenase.
  • homoserine kinase and threonine synthase then catalyze the formation of threonine.
  • homoserine is first converted into O-succinyl- or O-acetyl-homoserine by means of succinyl or acetyl-coenzyme A in microorganisms.
  • the CGS from microorganisms then catalyzes the condensation of O-succinyl- or O-acetyl-homoserine with L-cysteine to cystathionine (Umbarger, H.E. Annu. Rev. Biochem. 47 (1978), 533-606).
  • Methionine biosynthesis in plants differs from that in microorganisms because it does not branch off from threonine biosynthesis at the level of homoserine, but of LO-phospho-homoserine (L-homoserine phosphate, HSerP) (Bryan, JK (1980) Synthesis of the aspartate family and branched-chain amino acids.
  • LO-phospho-homoserine L-homoserine phosphate, HSerP
  • the first step in plant methionine biosynthesis the CGS-catalyzed condensation of HSerP with L-cysteine, is therefore a plant-specific reaction.
  • the CGS from plants and microorganisms are therefore different and hardly comparable.
  • CGS In plants as well as in microorganisms, the product of the reaction of the CGS, cystathionin, is converted to methionine via homocysteine.
  • CGS (EC 4.2.99.9) catalyzes the formation of cystathionin with the help of the enzyme-bound cofactor pyridoxal-5 ' -phosphate (PLP).
  • CGS CGS
  • inhibitors of CGS such as aminooxyacetic acid, hydroxylamine or propargylglycine
  • B 3- (Phosphonomethyl) pyridine-2-carboxylic acid, 4- (phosphonomethyl) pyridine-2-carboxylic acid, Z-3- (2-phosphonoethen-1-yl) pyridine-2-carboxylic acid and DL-E- 2-Amino-5-phosphono-3-pentenoic acid (Kreft, BD et al., Plant Physiology 104 (1994), 1215-1220).
  • cystathionine beta-lyase also involved in methionine biosynthesis and the cystathionine gamma-lyase (Alexander, F.W. et al., Eur. J. Biochem. 219 (1994), 953-960).
  • the invention relates to crystalline plant CGC, in particular CGS from Nicotiana tabacum, in the monoclinic space group C2.
  • CGC crystalline plant CGC
  • CGS from Nicotiana tabacum
  • the three-dimensional structure of these enzyme-inhibitor complexes shows characteristic differences from the known structure of the free enzyme. Based on these differences, it was possible to provide a method for developing highly specific inhibitors of CGS, as well as inhibitors obtained using this method.
  • the invention thus relates to a method comprising the following steps:
  • the invention furthermore relates to the use of the inhibitors obtained by means of the process according to the invention as herbicides.
  • the CGS from Nicotiana tabacum can be used as the starting material for the method according to the invention, particularly preferably the CGS-inhibitor complexes from Nicotiana tabacum produced recombinantly in E. coli.
  • compositions of those used for the crystallization experiments Solutions can be in terms of protein concentration, pH, type and concentration of buffer substances, salts and other additives, such as.
  • polyethylene glycol, dioxane or detergents vary widely. Crystals are preferably grown by vapor diffusion of a seated or hanging drop.
  • enzyme-inhibitor complexes can be prepared by immersing crystals of the CGS in inhibitor solutions or grown by cocrystallization of the CGS in the presence of an inhibitor.
  • the structure of the enzyme-inhibitor complexes is preferably solved by molecular replacement methods, particularly preferably using the structure of the native homotetramer of the CGS from Nicotiana tabacum.
  • the design of new inhibitors is preferably carried out after visual inspection of graphical representations of the structures of the CGS in the presence of inhibitors, in particular (a) by determining the volumes accessible to ligands at active sites, (b) by determining ideal ligand properties with regard to hydrophobicity or hydrogen bonding, and / or (c) by determining the electronic properties of surfaces accessible to ligands at the active sites. From these findings, structural and functional requirements for potential inhibitors of cystathionine gamma synthase can be derived. The invention also relates to inhibitors that meet these structural and functional requirements.
  • the spatial three-dimensional geometry of the complexes of the CGS from Nicotiana tabacum was determined exactly with the inhibitors 3- (phosphonomethyl) pyridine-2-carboxylic acid (Vbdg.1), DL-E-2-amino-5-phosphono-3- pentenoic acid (Vbdg.2) and [3- (3-chlorophenyl) - [1, 2,4] oxadiazol-5-ylsulfonyl] acetic acid (Vbdg.3).
  • Vbdg.2 is a connection analogous to the substrate HSerP.
  • the cofactor PLP is covalently bound to the side chain of LysA261 (internal aldimine).
  • VBDG.2 binds covalently to the cofactor PLP (external aldimine) through transaldimination.
  • the CGS catalyzes the cleavage of the proton from the C ⁇ atom of HSerP and retonotates the C4 ' atom of the cofactor.
  • An enzyme-linked ketimine is formed.
  • the side chain of LysA261 is forced by the enzyme-bound ketimine to adopt a completely different conformation than in the free enzyme.
  • Vbdg.2 The binding of VBDG.2 has only an insignificant influence on the geometry of the backbone of the enzyme, which is expressed by a standard deviation of only 0.3 ⁇ of the C ⁇ positions in the free and complexed enzyme.
  • the further interactions of Vbdg.2 with the CGS are shown schematically in FIG. 1.
  • Vbdg.2 is a connection analogous to the substrate HSerP.
  • VBDG.2 binds covalently to the PLP cofactor through transaldimination.
  • the CGS then catalyzes the cleavage of the ⁇ proton and tautomerizes to the ketimine.
  • the side chain of LysA261 which covalently binds the cofactor PLP in the substrate- or inhibitor-free state of the enzyme, assumes a completely different conformation than in the free enzyme.
  • the binding of VBDG.2 has only an insignificant influence on the geometry of the backbone of the enzyme, which is expressed by a standard deviation of only 0.3 ⁇ of the C ⁇ positions in the free and complexed enzyme.
  • the further interactions of the inhibitor Vbdg.2 with the CGS are shown schematically in FIG. 1.
  • the structural data of the complex are listed in Table 1.
  • the enzyme-inhibitor complex of CGS and Vbdg.1 shows some surprising conformational changes in the side chains compared to the free enzyme.
  • the guanidinium group of ArgA423 is shifted by 0.5 ⁇ and the amino group of LysC99 by 0.6 A in the direction of the inhibitor.
  • the side chain from TyrA163 differs significantly from the free enzyme by rotating the C ⁇ -Cß bond and the phenyl ring.
  • the cofactor PLP which forms a Schiff base with LysA261 and cannot react with VBDG.1, is also oriented differently than in the free enzyme, which creates additional space for the inhibitor.
  • the inhibitor's phosphonate group does not form a salt bridge with any of the basic amino acids available in the binding site.
  • the spatial proximity of the phosphonate group to the carbonyl oxygen of MetA402, to the carboxyl group of GluC107 and to the hydroxyl groups of TyrA163 and TyrC11 clearly indicates hydrogen bonds, which can only be explained plausibly by an at least partial protonation of the phosphonate.
  • the phosphonate group is located in a spacious cage of the basic amino acids LysA165, LysC99 and ArgC110 (see schematic representation in FIG. 2).
  • the binding of the inhibitor VBDG.1 has practically no influence on the backbone of the CGS; the standard deviation of the C ⁇ positions compared to the free enzyme is 0.2 ⁇ .
  • the structural data of the complex are listed in Table 2.
  • the C ⁇ positions of CysA162, TyrA163 and ArgA164 are 1.5 ⁇ , 1.2 ⁇ and 1.3 ⁇ respectively from the corresponding positions of the free enzyme if all C ⁇ atoms are superpositioned using the least-squares method. A further conformation change that is not to be expected to this extent is present for the amino acid ArgA423.
  • the bonds, C ⁇ -Cß, Cß-C ⁇ , C ⁇ -C ⁇ and C ⁇ -N ⁇ are around 80, -60, 27 or twisted 25 degrees, which gives the binding site, which largely coincides with the substrate binding site, a completely unexpected new shape compared to the uncomplexed CGS.
  • the binding mode of the inhibitor Vbdg.3 is exceptional because the 5-membered heterocycle forms a charge transfer complex with the guanidinium group of the amino acid ArgA423.
  • a prerequisite for such an interaction is the parallel arrangement of the two planes 3.4 ⁇ apart, which are defined by the atoms of the hetererocycle and by the atoms of the guanidinium group.
  • the carboxyl group of the inhibitor shows a salt bridge-like interaction with ArgA423. There are also hydrogen bonds between this carboxyl group and the peptide nitrogen of ArgA164 and the hydroxyl group of SerA403.
  • the meta-chlorinated phenyl ring of Vbdg.3 is located in a pocket that is mainly formed by hydrophobic amino acids.
  • the interactions are shown schematically in Fig. 3a and 3b.
  • the phenyl ring of TyrA163 is located in the immediate vicinity of the thioether bridge between the heterocycle and the carboxyl group of the inhibitor, on the side facing away from the acid function.
  • the position of this amino acid provides important information for the design of further inhibitors that can have a ⁇ -interaction with TyrA163 ( ⁇ -stacking).
  • the structural data of the complex are listed in Table 3.
  • the present invention relates to inhibitors that meet these structural and functional requirements. These requirements lead to the description of inhibitors.
  • the inhibitors according to the invention consist of a hydrophobic or moderately hydrophobic part Hy, a part Pi which contains an electron-rich conjugated or aromatic ⁇ -electron system, and a part A which has an acidic function.
  • the parts Hy and Pi are direct or are linked to one another via a linker L1, the parts Pi and A are linked via a linker L2.
  • the inhibitors according to the invention have the following formula (I):
  • Hy is a hydrophobic group that spatially corresponds to that described in Figure 3a
  • Hy is preferably a straight-chain branched and / or cyclic alkyl group with 1 to 6 C atoms, it being possible for one or more H atoms to be replaced by F,
  • Phenyl, naphthyl, where the latter two groups can be mono- or disubstituted, preferably with a substituent from the group C1,
  • Hy can be particularly preferred:
  • L1 is a spacer that should be selected so that Hy and Pi are separated by a maximum of 2 bonds.
  • L1 is preferably -CR 1 R 2 -, -O-, -S (O) m -, -NR 3 - particularly preferably -CH 2 -,
  • R 1 , R 2 , R 3 are H, F or an alkyl group with 1 to 3 C atoms;
  • n 0 or 1
  • Pi is an electron-rich conjugated or aromatic ⁇ -electron system that can form a charge transfer complex with the guanidinium group of the amino acid ArgA423, whereby the distance between the connecting points to Hy and L2 or between L1 and L2 is a maximum of 4 A (the length the bonds to Hy or L1 and L2 not included).
  • Pi preferably has the following structures:
  • V and V represent placeholders for the parts Hy or L1 and L2. Based on the analysis of the X-ray structure of the CGS inhibitor complex and the charge transfer interaction of the part Pi derived therefrom with the guanidinium group of ArgA43, V and V can swap their position in the general formulas for Pi above. So can be:
  • Heterocycles can determine the relative position of the connection points to H or L1 and
  • L2 be ortho, meta or para or (1, 2) or (1, 3)) or -NH-C (CN) N-
  • L2 is a spacer that should be selected so that Pi and A are separated directly by 2 to 5 bonds.
  • L2 is preferably a straight-chain or branched alkyl group with 1 to 8 C-
  • Atoms whereby one or more CH 2 groups can also be replaced by -S (O) m -, -O-, -SiR 1 R 2 - or NR 3 (with the proviso that S and / or O atoms are not adjacent may be).
  • L2 is particularly preferred:
  • A is a group capable of forming a salt bridge to ArgA423.
  • A can preferably be:
  • hydrophobic describes the tendency of molecules to dissolve not in water but preferably in apolar solvents (eg fats). Partial structures of a molecule are said to be hydrophobic if they compare this tendency of the whole molecule to the molecule in which is replaced by any reference partial structure. Hydrophobic structures include, but are not limited to, alkanes, alkenes, alkynes, cycloalkanes, cycloalkenes, cycloalkenes and aromatics such as benzenes, naphthols and phenanthrenes. "Moderately hydrophobic" in this context means that the tendency-forming property of hydrophobicity is slightly weakened by heteroatoms, for example.
  • the hydrophobic part Hy is said to match the enzyme pocket.
  • a charge transfer complex in the sense used here means the enthalpically favorable interaction of a neutral or anionic ⁇ system with the protonated, cationic guanidinium group of an arginine.
  • the plane formed by the ⁇ system is aligned parallel to the guanidinium group plane. The planes are spaced from each other by a maximum of 4.5 A.
  • the ⁇ system can be formed by conjugated multiple bonds or by an aromatic ring.
  • Salt bridge or salt bridge-like bond is understood to mean the energy-favorable interaction between a functional group which formally carries a negative charge by splitting off a proton and the protonated amino function of a lysine or guanidinium group of an arginine.
  • the prerequisite for such an interaction is a maximum distance of 3.5 A between amino nitrogen or one of the gunidinium nitrogen and one of the atoms in the functional group that carries negative formal charges.
  • HSerP can be converted in a reaction buffer in the pH range from pH 4 to 10, but preferably in the pH range from 7 to 8.5 by an enzyme with CGS activity to cystathionine and inorganic phosphate.
  • the activity of the CGS can then e.g. B.
  • radioactively labeled L-cysteine if radioactively labeled L-cysteine is used, it can be detected by quantifying the radioactive cystathionine formed after separating off radioactively labeled L-cysteine by ion exchange chromatography. Standard methods are available to the person skilled in the art of carrying out enzyme tests (see, for example, Daniel, J. Nature 264 (1976), 90-92; Datko, AH et al., J. Biol. Chem. 249 (1974), 1139 -1155; Kreft, BD et al., Plant Physiol. 104 (1994), 1215-1220; Ravanel, S. et al., Arch. Biochem. Biophys. 316 (1995), 572-584).
  • the suitable compositions of the reagents or the concentrations of salts, substrates and proteins, the pH values, the temperatures, the batch volumes and the wavelengths for measurement or detection can vary widely.
  • the CGS can either be isolated from plants in a manner known to the person skilled in the art or can also be produced recombinantly in transgenic host cells on the basis of cDNA known from the literature.
  • the enzyme inhibition can be quantified by a simple comparison of the catalytic activity of the CGS in the absence and in the presence of the test substance to be examined under otherwise identical test conditions in a manner known to the person skilled in the art.
  • the chemical compound to be investigated is preferably used in concentrations between 10 "9 M and 10 " 3 M, and particularly preferably in concentrations between 10 "7 M and 10 -4 M.
  • the inhibitory effect of test substances can be determined with purified plant CGS, but also with whole cells of a recombinant organism which expresses a plant CGS recombinantly, with CGS-containing extracts from this organism or enriched CGS-containing fractions from this organism.
  • Bacterial, insect and yeast cells may be mentioned as the preferred recombinant host organism.
  • a CGS isolated from plant tissue or plant cell cultures can also be used.
  • Inhibitors according to the invention or identified according to the invention influence (inhibit) the activity of the enzyme, preferably among those described Test conditions, preferably by at least 30%, particularly preferably by at least 50%.
  • the specificity of the compounds examined can be ensured by adding suitable reagents known to the person skilled in the art to the test mixture which prevent non-specific inhibition of the enzyme.
  • suitable reagents known to the person skilled in the art to the test mixture which prevent non-specific inhibition of the enzyme.
  • compounds which can inhibit the CGS nonspecifically are those compounds which e.g. by alkylation of essential sulfhydryl groups or by unspecific reaction with the cofactor PLP.
  • Inhibitors which also have an effect in an in vivo test are particularly preferred.
  • a variety of methods are available to those skilled in the art for checking the effect of a CGS inhibitor on plants in vivo.
  • the substances to be investigated e.g. defined chemical compounds, but also heterogeneous substance mixtures
  • auxiliaries such as wetting agents or solvents
  • the plants are rated.
  • Substances that damage a plant through selective inhibition of CGS cause at least one characteristic symptom. Chlorosis and / or necrosis often develop after application, which can be particularly pronounced in the newly formed tissue. Other symptoms can be a depression of growth or a very rapid death of the plant. The symptoms vary depending on the plant species, depending on their different sensitivity and depending on the properties of the inhibitor.
  • a simple and practical possibility for an in vivo test is e.g. B. represents the Lemna test described in Example 8.
  • An inhibitor according to the invention is subjected to a Lemna test under the conditions mentioned in Example 8, preferably in a concentration range from 10 "7 to 10 " 4 M.
  • Inhibitors according to the invention which are active in the Lemna test are preferred.
  • being active means that an inhibitor according to the invention brings about an at least 30%, preferably at least 50%, growth inhibition of the Lemna plants, or, particularly preferably, that the Lemna plants treated with the inhibitor according to the invention die.
  • the invention also relates to the use of an inhibitor according to the invention which is active as a herbicide in an in vivo test, preferably in the Lemna test.
  • Active means preferably the appearance of chlorotic and / or necrotic tissues, particularly preferably the appearance of chlorotic and / or necrotic tissues and a growth depression of the plant, preferably within ten, particularly preferably within seven days.
  • the invention also relates to a method for controlling undesired plant growth in crops, characterized in that a herbicidal composition is applied to the site of the crop, the crop or its propagation material, comprising an inhibitor according to the invention, which is preferably carried out in one in the test methods described above Concentration range from 10 "7 to 10 " 4 molar has an at least 30%, preferably at least 50%, inhibitory activity against CGS and, preferably, is active in the Lemna test.
  • the useful plants are preferably sugar beet, potato, tobacco, tomato, rapeseed, barley, rye, wheat, soybean, rice and corn, but also other crop species, in particular also those species which can be used as auxiliary agricultural plants.
  • Some of the inhibitors according to the invention are known and commercially available and some are new.
  • the compounds according to the invention are prepared by methods known per se from the literature, as described in standard works of organic synthesis, e.g. Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart.
  • the preparation takes place under reaction conditions which are known and suitable for the reactions mentioned. Use can also be made of variants which are known per se and are not mentioned here in any more detail.
  • the starting materials can also be formed in situ, in such a way that they are not isolated from the reaction mixture, but instead are immediately converted into the compounds of the formula (I).
  • DE-A 26 41 724 for compounds with pyrimidine-2,5-dily groups;
  • DE-A 40 26 223 and EP-A 03 91 203 for compounds with pyridine-2,5-dily groups;
  • DE-A 32 31 462 for compounds with pyhdazine-3,6-dily groups;
  • EP-A 309 514 for compounds with (1, 3,4) thiadiazole-2,5-dily groups;
  • WO-A 92/16500 for naphthalene-2,6-dily groups;
  • K. Seto et al Journal of the Chemical Society, Chemical Communications 1988, 56 for dioxobohnan-2,5-dily groups.
  • disubstituted pyridines disubstituted pyrazines, disubstituted pyrimidines and disubstituted pyridazines
  • disubstituted pyridines disubstituted pyrazines
  • disubstituted pyrimidines disubstituted pyridazines
  • Dioxane derivatives are expediently prepared by reacting an appropriate aldehyde (or one of its reactive derivatives) with a corresponding 1,3-diol (or one of its reactive derivatives), preferably in the presence of an inert solvent, such as benzene or toluene, and / or a catalyst, for example a strong acid such as sulfuric acid, benzene or p-toluenesulfonic acid, at temperatures between 20 ° C and about 150 ° C, preferably between 80 ° C and 120 ° C.
  • Acetals are primarily suitable as reactive derivatives of the starting materials.
  • Compounds in which an aromatic ring is substituted by at least one F atom can also be obtained from the corresponding diazonium salts by exchanging the diazonium group for a fluorine atom, e.g. according to the methods of Balz and Schiemann.
  • the corresponding carboxylic acids and alcohols or phenols are known or can be prepared analogously to known processes.
  • Suitable reactive derivatives of the carboxylic acids mentioned are in particular the acid halides, especially the chlorides and bromides, and also the anhydrides, for example also mixed anhydrides, azides or esters, in particular alkyl esters with 1-4 C atoms in the alkyl group.
  • Suitable reactive derivatives of the alcohols or phenols mentioned are in particular the corresponding metal alcoholates or phenolates, preferably an alkali metal, such as sodium or potassium.
  • the esterification is advantageously carried out in the presence of an inert solvent.
  • ethers such as diethyl ether, di-n-butyl ether, THF, dioxane or anisole, ketones such as acetone, butanone or cyclohexanone, amides such as DMF or phosphoric acid hexamethyltriamide, hydrocarbons such as benzene, toluene or xylene, halogenated hydrocarbons such as carbon tetrachloride , Dichloromethane or tetrachlorethylene and sulfoxides such as dimethyl sulfoxide or sulfolane.
  • Ethers of the formula (I) can be obtained by etherification of corresponding hydroxyl compounds, preferably corresponding phenols, the hydroxyl compound advantageously first being converted into a corresponding metal derivative, for example by treatment with NaH, NaNH 2 , NaOH, KOH, Na 2 CO 3 or K 2 CO 3 is converted into the corresponding alkali metal alcoholate or alkali metal phenolate.
  • alkyl halide alkyl sulfonate or dialkyl sulfate
  • an inert solvent such as acetone, 1, 2-dimethoxyethane, DMF or dimethyl sulfoxide, or with an excess of aqueous alcoholic NaOH or KOH at temperatures between about 20 ° C and 100 ° C.
  • the CGS inhibitors according to the invention can be used, for example, in the form of wettable powders, emulsifiable concentrates, sprayable solutions, dusts or granules in the customary formulations.
  • the invention therefore also relates to herbicidal compositions which contain inhibitors of CGS.
  • the inhibitors according to the invention can be formulated in various ways, depending on which biological and / or chemical-physical parameters are specified.
  • Possible formulation options are, for example: wettable powder (WP), water-soluble powder (SP), water-soluble concentrates, emulsifiable concentrates (EC), emulsions (EW), such as oil-in-water and water-in-oil emulsions, sprayable solutions , Suspension concentrates (SC), dispersions based on oil or water, oil-miscible solutions, capsule suspensions (CS), dusts (DP), mordants, granules for spreading and soil application, granules (GR) in the form of micro, spray, elevator - and adsorption granules, water-dispersible granules (WG), water-soluble granules (SG), ULV formulations, microcapsules and waxes.
  • WP wettable powder
  • SP water-soluble powder
  • EC emulsifiable concentrates
  • EW emulsions
  • SC Suspension concentrates
  • SC dispersions based on oil or water
  • combinations with other pesticidally active substances such as insecticides, acaricides, herbicides, Manufacture fungicides, as well as with safeners, fertilizers and / or growth regulators, for example in the form of a finished formulation or as a tank mix.
  • pesticidally active substances such as insecticides, acaricides, herbicides, Manufacture fungicides, as well as with safeners, fertilizers and / or growth regulators, for example in the form of a finished formulation or as a tank mix.
  • Spray powders are preparations which are uniformly dispersible in water and which, in addition to the active substance, contain not only a diluent or an inert substance, but also ionic and / or nonionic surfactants (wetting agents, dispersing agents), e.g.
  • the herbicidal active ingredients are finely ground, for example in conventional apparatus such as hammer mills, fan mills and air jet mills, and mixed at the same time or subsequently with the formulation auxiliaries.
  • Emulsifiable concentrates are made by dissolving the active ingredient in an organic solvent e.g. Butanol, cyclohexanone, dimethylformamide, xylene or higher-boiling aromatics or hydrocarbons or mixtures of the organic solvents with the addition of one or more surfactants of ionic and / or nonionic type (emulsifiers).
  • organic solvent e.g. Butanol, cyclohexanone, dimethylformamide, xylene or higher-boiling aromatics or hydrocarbons or mixtures of the organic solvents.
  • alkylarylsulfonic acid calcium salts such as calcium dodecylbenzenesulfonate or nonionic emulsifiers
  • fatty acid polyglycol esters alkylaryl polyglycol ethers, fatty alcohol polyglycol ethers, propylene oxide-ethylene oxide condensation products, alkyl polyethers, sorbitan esters such as e.g. Sorbitan fatty acid esters or polyoxethylene sorbitan esters such as e.g. Polyoxyethylene.
  • Dusts are obtained by grinding the active ingredient with finely divided solid substances, e.g. Talc, natural clays such as kaolin, bentonite and pyrophyllite, or diatomaceous earth.
  • finely divided solid substances e.g. Talc, natural clays such as kaolin, bentonite and pyrophyllite, or diatomaceous earth.
  • Suspension concentrates can be water or oil based. You can for example by wet grinding using commercially available bead mills and, if appropriate, addition of surfactants, such as those already listed above for the other types of formulation.
  • Emulsions e.g. Oil-in-water emulsions (EW) can be used, for example, with stirrers, colloid mills and / or static mixers using aqueous organic solvents and optionally surfactants, such as those e.g. already listed above for the other formulation types.
  • EW Oil-in-water emulsions
  • Granules can either be produced by spraying the active ingredient onto adsorbable, granulated inert material or by applying active ingredient concentrates by means of adhesives, e.g. Polyvinyl alcohol, sodium polyacrylic acid or mineral oils, on the surface of carriers such as sand, kaolinite or granulated inert material. Suitable active ingredients can also be granulated in the manner customary for the production of fertilizer granules, if desired in a mixture with fertilizers.
  • adhesives e.g. Polyvinyl alcohol, sodium polyacrylic acid or mineral oils
  • Water-dispersible granules are generally produced using the customary methods, such as spray drying, fluidized bed granulation, plate granulation, mixing with high-speed mixers and extrusion without solid inert material.
  • the agrochemical preparations generally contain 0.1 to 99% by weight, in particular 0.1 to 95 wt .-%, active ingredient.
  • the active substance concentration in wettable powders is e.g. about 10 to 90 wt .-%, the rest of 100 wt .-% consists of conventional formulation components.
  • the active substance concentration can be about 1 to 90, preferably 5 to 80,% by weight.
  • Dust-like formulations contain 1 to 30% by weight of active ingredient, preferably mostly 5 to 20% by weight of active ingredient, sprayable solutions contain about 0.05 to 80, preferably 2 to 50% by weight of active ingredient.
  • the active ingredient content depends in part on whether the active compound is in liquid or solid form and which granulating aids, fillers, etc. are used.
  • the active ingredient content of the water-dispersible granules is, for example, between 1 and 95% by weight, preferably between 10 and 80% by weight.
  • the active ingredient formulations mentioned may contain the customary adhesives, wetting agents, dispersants, emulsifiers, penetrants, preservatives, antifreezes and solvents, fillers, carriers and dyes, defoamers, evaporation inhibitors and the pH and Agents influencing viscosity.
  • the formulations present in commercial form are optionally diluted in the customary manner, for example in the case of wettable powders, emulsifiable concentrates, dispersions and water-dispersible granules, using water. Preparations in the form of dust, ground granules or scattering granules and sprayable solutions are usually no longer diluted with other inert substances before use.
  • the required application rate of the compounds according to the invention varies with the external conditions, such as temperature, moisture, the type of herbicide used, and others. It can vary within wide limits, for example between 0.001 and 10.0 kg / ha or more of active substance, but is preferably between 0.005 and 5 kg / ha.
  • the structural gene was cut out of p1064 with the aid of the restriction enzymes Taql / Xbal and with double strand generated from the synthetic oligonucleotides ON96 (5 ' -TCGACAAGGAGGATCCATATGGCTAAGGCCGT) and ON 97 (ON DNA 3 ' -GTTCCTCCTAGGTATACCGATTCCGGCAGC) ligated.
  • ON96 5 ' -TCGACAAGGAGGATCCATATGGCTAAGGCCGT
  • ON 97 ON DNA 3 ' -GTTCCTCCTAGGTATACCGATTCCGGCAGC
  • Plasmid p1117 was prepared by cutting the gene for the CGS with Ndel / Notl from p1115 and cloning it in pET23c (+). p1117 was used to transform E. coli BL21 (DE3) cells.
  • E. coli BL21 (DE3) cells which contained the plasmid p1117 with the inserted gene for the CGS from Nicotiana tabacum were cultivated in 5 liters of LB medium with 150 mg / l ampicillin to an optical density of 0.7 and 5 h with 1 mM isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG). The cells were harvested by centrifugation, resuspended in 50 ml buffer A (100 mM Ths / HCl pH 7.9, 0.01 mM PLP, 2 mM EDTA) with 2 mM PMSF and disrupted by treatment with ultrasound.
  • IPTG isopropyl-beta-D-thiogalactoside
  • Crystals suitable for diffraction analysis were grown by vapor diffusion of a seated drop at 22 ° C.
  • the protein concentration used for crystallization was 4 mg / ml in buffer B.
  • the drops consisted of 3 ⁇ l of the protein solution and 2 ⁇ l of a reservoir solution containing 100 mM MES / NaOH pH 6.5, 200 mM magnesium acetate and 10% ( w / v) contained polyethylene glycol 8000.
  • the crystals grew to a size of 0.4 x 0.3 x 0.2 mm within 5 days.
  • the crystals containing the inhibitor Vbdg. 1 were prepared by immersing them in a 10 mM Vbdg. 1 solution for 48 h.
  • the crystals containing the inhibitor Vbdg. 2 were prepared by immersing them in a 10 mM Vbdg. 2 solution for 10 h.
  • the crystals containing the inhibitor Vbdg. 3 were prepared by immersing them in a 5 mM Vbdg. 3 solution for 72 h.
  • Crystallographic data were collected on a MAR Research image plate detector (Hamburg, Germany) using monochromatic CuK ⁇ radiation from a rotating anode X-ray generator (Rigaku, Tokyo, Japan). Data reduction was performed with DENZO (Otwinowski et al., (1993) DENZO: a film processing for macromolecular crystallography, Yale University, New Haven, USA) and SCALEPACK (Otwinowski et al., (1993) DENZO: a film processing for macromolecular crystallography , Yale University, New Haven, USA). The structures were determined by molecular replacement methods using MOLREP (Vagin, A., Teplyakov, A., J. Appl. Cryst.
  • Example 3 Structure of the recombinant CGS from Nicotiana tabacum in complex with the inhibitor Vbdg. 1.
  • Example 4 Structure of the recombinant CGS from Nicotiana tabacum in complex with the inhibitor Vbdg. 2.
  • Example 5 Structure of the recombinant CGS from Nicotiana tabacum in complex with the inhibitor Vbdg. 3.
  • the CGS cleaned according to Example 1 was used in one of the following test systems to measure the enzyme activity.
  • a test system for measuring the inorganic phosphate released in the CGS reaction contained 100 mM MOPS pH 7.5, 0.1 mM PLP, 1 mM HSerP, 1 mM L-cysteine and CGS in a total volume of 100 ⁇ l.
  • the CGS reaction was terminated by either a) 100 ⁇ l of a reagent mixture containing 62.3 ⁇ g malachite green hydrochloride, 1.9 mg ammonium heptamolybdate and 0.5% (v / v) of a suitable detergent (eg Triton X- 100, Tween 80 or Tergitol NPX) in 1.88 N hydrochloric acid were added; the resulting color complex was stabilized after 1 min by adding 50 ⁇ l of a 26% (w / w) aqueous solution of trisodium citrate dihydrate and after 45 min incubation at room temperature the intensity of the color complex was determined Absorbance measurement at 620 nm was determined.
  • a suitable detergent eg Triton X- 100, Tween 80 or Tergitol NPX
  • the amount of inorganic phosphate released was determined by comparison with a calibration curve obtained by appropriate amounts of inorganic phosphate by determining the difference between the absorbance at 620 nm between a complete mixture of a CGS test system and a system without L-cysteine; or b) 100 ⁇ l of a reagent containing 3 mg of ascorbic acid, 0.5 mg of ammonium heptamolybdate and 1 mg of sodium dodecyl sulfate in 0.7 N hydrochloric acid were added.
  • the resulting color complex was stabilized after 7 minutes by adding 50 ⁇ l of a 6% (w / v) aqueous solution of sodium citrate dihydrate and after a further 20 minutes incubation at room temperature, the intensity of the color complex was determined by measuring the absorbance at 620 nm.
  • the amount of inorganic phosphate released was determined by comparison to a calibration curve obtained by appropriate amounts of inorganic phosphate by determining the difference between the absorbance at 620 nm between a complete mixture of a CGS test system and a system without L-cysteine.
  • Example 1 The CGS purified according to Example 1 was tested for its in vitro activity as described in Example 6. The measured relative activity of the mixture in the absence of test substances was set at 100%. After addition of Vbdg. 1, Vbdg. 2 and Vbdg. 3 (0.1 mM each), the remaining activity of the CGS was found to be 25, 18 and 8%. A precise kinetic analysis of enzyme inhibition (Segel, IH (1975) Enzyme Kinetics, John Wiley, New York, USA) showed that Vbdg. 1 the CGS competitively with respect to HSerP (K
  • the Km values for HSerP and L-cysteine were determined to be 7.1 and 0.23 mM.
  • the phytotoxic effect of the CGS inhibitor Vbdg. 3 could be determined in vivo by treatment of Lemna cultures.
  • Lemna gibba was added to this in sterile culture solution (0.4 g / l KNO 3> 0.8 g / l CaCl 2 * 2 H 2 O, 0.366 g / l MgSO 4 * 7 H 2 O, 0.2 g / l KH 2 PO 4 , 2 ml / l solution I (2.23 g / l MnSO 4 * 4 H 2 O, 83 mg / l KJ, 2.5 mg / l CoCI 2 * 6 H 2 O, 0.86 g / l ZnSO 4 * 7H 2 O, 2.5 mg / l CuSO 4 * 5 H 2 O, 0.62 g / l H 3 BO 3 , 25 mg / l Na 2 MoO 4 * 2 H 2 O) and 2 ml / l solution II (14.92 g / l Na-EDTA, 10.92 g / l FeSO 4 * 7 H 2 O)).
  • the phytotoxic effect of the CGS inhibitor Vbdg. 3 was characterized by an initial growth depression with chlorosis and necrosis of newly formed tissue. After prolonged exposure, the plants died completely.
  • Residual abbreviation amino acid code or abbreviation for molecular part, e.g. "PLP"
  • Table 1 Selected coordinates from the X-ray structure analysis of the
  • ATOM 422 CA TYR C 10? 15,932 -52,595 75,440

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Abstract

Ein Verfahren zum Identifizieren von Inhibitoren der pflanzlichen CGS, umfasst die Schritte: a) Aufreinigung einer pflanzlichen CGS bis zur apparenten Homogenität; f) Züchtung von zur Diffraktionsanalyse geeigneten Kristallen von CGS-Inhibitor Komplexen; g) Sammlung von kristallographischen Daten von CGS-Inhibitor Komplexen unter Verwendung von Röntgenstrahlen und Reduktion dieser Daten unter Verwendung geeigneter Computerprogramme; h) Lösung der Struktur der Enzym-Inhibitor Komplexe durch molekulare Ersetzungsverfahren unter Verwendung der Struktur einer nativen pflanzlichen CGS und Verfeinerung der so erhaltenen Modelle unter Verwendung geeigneter Computerprogramme; und i) das Design neuer Inhibitoren für die pflanzliche Cystathionin gamma-Synthase, basierend auf den erhaltenen Strukturinformationen. Beansprucht werden Inhibitoren, die nach diesem Verfahren gefunden werden, sowie deren Verwendung als Herbizide.

Description

Beschreibung
Inhibitoren der pflanzlichen Cystathionin gamma-Synthase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kristallen der pflanzlichen Cystathionin gamma-Synthase (CGS) im Komplex mit Inhibitoren, pflanzliche CGS in einer bestimmten Kristallform und ein Verfahren zur Entwicklung neuer Inhibitoren der CGS mit Hilfe von aus diesen Komplexen gewonnenen Kristalldaten, insbesondere mit Hilfe von computergestützten Modelling-Programmen. Weitere Erfindungsgegenstände sind die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Inhibitoren der pflanzlichen CGS, sowie deren Verwendung als Herbizide.
Herbizide machen etwa die Hälfte der weltweit eingesetzten Pflanzenschutzmittel aus. Sie sind ein wichtiger Bestandteil des integrierten Pflanzenschutzes und tragen entscheidend zu Ernteertrag und Kontinuität der Ernten in aller Welt bei.
Da sich die ökologischen und ökonomischen Anforderungen an moderne Herbizide laufend erhöhen, beispielsweise was Rückstandsbildung, Toxizität, Selektivität, Aufwandmenge und günstige Herstellbarkeit angeht, und außerdem z.B. Probleme mit Resistenzen auftreten können, besteht die ständige Aufgabe, neue Herbizide zu entwickeln, die zumindest in Teilbereichen beispielsweise die oben aufgeführten Probleme überwinden.
Als vielversprechende Zielorte für neue Herbizide bietet sich die Biosynthese von Methionin und Threonin an, die über den sogenannten Aspartatweg verläuft. Beide Aminosäuren sind essentielle Bausteine für Proteine. Methionin besitzt darüber hinaus Bedeutung als Vorstufe für den Methylgruppendonor S-Adenosylmethionin, das Pflanzen hormon Ethylen und für Polyamine. Methionin ist eine für Menschen und Tiere essentielle Aminosäure, die nur von Mikroorganismen und Pflanzen produziert werden kann. Die Enzyme der Biosynthese von Methionin und Threonin kommen daher bei Menschen und Tieren nicht vor, so daß von einem spezifischen Inhibitor keine Toxizität zu erwarten ist.
In Pflanzen und Mikroorganismen ist die Methionin- und Threoninsynthese Teil eines vielfach verzweigten Biosyntheseweges, der von Aspartat ausgeht und zur Synthese von Lysin, Methionin, Threonin und Isoleucin führt. Für die Biosynthese von Methionin und Threonin wird Aspartat durch die Enzyme Aspartat-Kinase, Aspartat- Semialdehyd-Dehydrogenase und Homoserin-Dehydrogenase in Homoserin umgewandelt. In Pflanzen und Mikroorganismen katalysieren Homoserin-Kinase und Threonin-Synthase dann die Bildung von Threonin. Für die Biosynthese von Methionin wird in Mikroorganismen Homoserin zuerst mittels Succinyl- oder Acetyl- Coenzym A in O-Succinyl- oder O-Acetyl-Homoserin umgewandelt. Die CGS aus Mikroorganismen katalysiert dann die Kondensation von O-Succinyl- oder O-Acetyl- Homoserin mit L-Cystein zu Cystathionin (Umbarger, H. E. Annu. Rev. Biochem. 47 (1978), 533-606).
Die Methioninbiosynthese in Pflanzen unterscheidet sich von der in Mikroorganismen, weil sie nicht auf der Stufe von Homoserin, sondern von L-O- Phospho-Homoserin (L-Homoserinphosphat, HSerP) von der Threoninbiosynthese abzweigt (Bryan, J. K. (1980) Synthesis of the aspartate family and branched-chain amino acids. In P. K. Stumpf, E. E. Conn, eds., The Biochemistry of Plants: A Comprehensive Treatise, Vol 5, B. J. Miflin ed., Amino Acids and Derivatives. Academic Press, New York, 403 - 452). Der erste Schritt der pflanzlichen Methioninbiosynthese, die ebenfalls von der CGS katalysierte Kondensation von HSerP mit L-Cystein, ist daher eine pflanzenspezifische Reaktion. Die CGS aus Pflanzen und Mikroorganismen sind daher unterschiedlich und kaum vergleichbar.
In Pflanzen wie auch in Mikroorganismen wird das Produkt der Reaktion der CGS, Cystathionin, über Homocystein zu Methionin umgesetzt. Die CGS (EC 4.2.99.9) katalysiert die Bildung von Cystathionin mit Hilfe des enzymgebundenen Kofaktors Pyridoxal-5'-Phosphat (PLP).
Die bisher bekannten Inhibitoren der CGS, wie Aminooxyessigsäure, Hydroxylamin oder Propargylglycin, inhibieren die pflanzliche CGS entweder nicht spezifisch oder besitzen auf Grund ihrer unzureichenden Wirkstärke keine herbizide Aktivität, wie z. B. 3-(Phosphonomethyl)-pyridin-2-Carbonsäure, 4-(Phosphonomethyl)-pyridin-2- Carbonsäure, Z-3-(2-Phosphonoethen-1-yl)-pyridin-2-Carbonsäure und DL-E-2- Amino-5-phosphono-3-pentensäure (Kreft, B. D. et al., Plant Physiology 104 (1994), 1215-1220). Für die Entwicklung neuer Herbizide, deren Wirkmechanismus die Inhibition der pflanzlichen CGS ist, ist es daher notwendig, stärker wirksamere und spezifischer wirkende Verbindungen zu finden. Um dies auf rationale Weise zu ermöglichen, besteht ein großes Bedürfnis nach weiteren Erkenntnissen über die pflanzliche CGS hinsichtlich ihrer genauen Struktur, und insbesondere hinsichtlich der genauen Art und Weise der Wechselwirkung von bekannten Inhibitoren mit dem Aktivzentrum der pflanzlichen CGS.
Für die pflanzliche CGS kodierende Gene konnten aus der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) und Tabak (Nicotiana tabacum) kloniert und in Escherichia coli überexprimiert werden (Ravanel, S. et al., Biochem. J. 331 (1998), 639-648). Ein Vergleich der aus den DNA-Sequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit den Sequenzen anderer PLP-abhängiger Enzyme ergab, daß die pflanzlichen CGS Mitglieder der gamma-Familie PLP-abhängiger Enzyme sind. Andere Mitglieder dieser Familie sind z. B. die ebenfalls an der Methionin Biosynthese beteiligte Cystathionin beta-Lyase und die Cystathionin gamma-Lyase (Alexander, F. W. et al., Eur. J. Biochem. 219 (1994), 953-960).
Von der rekombinanten CGS aus Nicotiana tabacum konnten unter Anwendung der Dampfdiffusionsmethode für die Röntgenstrukturanalyse geeignete orthorhombische Kristalle der Raumgruppe P2ι2121 und den Zellkonstanten a = 120,0 A, b = 129,5 Ä, c = 309,8 Ä und α = ß = γ = 90° gezüchtet werden. Durch Röntgenstrukturanalyse dieser Kristalle konnte die dreidimensionale Struktur der CGS aus Nicotiana tabacum bestimmt werden (Steegborn, C. et al., J. Mol. Biol. 290 (1999), 983-996).
Um die Herstellung von hochwirksamen und hochspezifischen Inhibitoren der pflanzlichen CGS auf rationale Weise zu ermöglichen, ist aber die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur dieses Enzyms allein nicht ausreichend. Es ist nämlich bei vielen PLP-abhängigen Enzymen beschrieben worden, daß die Bindung eines Liganden, wie z. B. eines Substrats, eines Substratanalogons oder eines Inhibitors, an das aktive Zentrum erhebliche Veränderungen in der räumlichen Anordnung des Kofaktors und der Aminosäuren im Aktivzentrum induziert (Hohenester, E. et al., Biochemistry 33 (1994), 13561-13570; Shah, S. A. et al., Structure 5 (1997), 1067- 1075; Stamper, C. G. F. et al., Biochemistry 37 (1998), 10438-10445). Bei einigen PLP-abhängigen Enzymen, wie z. B. Aspartat-Aminotransferase (Jager, J. et al., J. Mol. Biol. 239 (1994), 285-305) und O-Acetylserin-Sulfhydrylase (Burkhard, P. et al., J. Mol. Biol. 291 (1999), 941-953), kommt es darüber hinaus zusätzlich noch zu großen, ganze Domänen erfassenden Konformationsänderungen, wie z. B. den Übergang aus einer sog. offenen Konformation des Enzyms in Abwesenheit eines Liganden zu einer sog. geschlossenen Konformation nach Ligandenbindung. Somit wird ersichtlich, daß ein großes Bedürfnis nach genauen Erkenntnissen über die dreidimensionale Struktur der CGS in Anwesenheit von Liganden besteht, denn nur mit Hilfe derartiger Kristallstrukturen wird die Herstellung von hochwirksamen und hochspezifischen Inhibitoren auf rationale Weise möglich.
Es ist nun überraschenderweise gelungen, die aufgereinigte CGS aus Nicotiana tabacum in einer neuen Kristallform zu kristallisieren. Kristalle mit dieser Kristallform konnten in Lösungen, die verschiedene Inhibitoren der CGS enthielten, überführt werden (Inhibitor-Soak), ohne daß die Kristalle zerstört wurden oder deren Fähigkeit, Röntgenstrahlen zu streuen, verloren ging.
Gegenstand der Erfindung ist kristalline pflanzliche CGC, insbesondere CGS aus Nicotiana tabacum, in der monoklinischen Raumgruppe C2. Überraschenderweise zeigt die dreidimensionale Struktur dieser Enzym-Inhibitor- Komplexe charakteristische Unterschiede zur bekannten Struktur des freien Enzyms. Beruhend auf diesen Unterschieden war es möglich, ein Verfahren zur Entwicklung hochspezifischer Inhibitoren der CGS, sowie mit Hilfe dieses Verfahrens gewonnene Inhibitoren bereitzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren, folgende Schritte umfassend:
(a) Aufreinigung einer pflanzlichen CGS bis zur apparenten Homogenität,
(b) Züchtung von zur Diffraktionsanalyse geeigneten Kristallen von CGS-Inhibitor Komplexen,
(c) Sammlung von kristallographischen Daten von CGS-Inhibitor Komplexen unter Verwendung von Röntgenstrahlen und Reduktion dieser Daten unter Verwendung geeigneter Computerprogramme,
(d) Lösung der Struktur der Enzym-Inhibitor Komplexe durch molekulare Ersetzungsverfahren unter Verwendung der Struktur einer nativen pflanzlichen CGS und Verfeinerung der so erhalten Modelle unter Verwendung geeigneter Computerprogramme, und
(e) das Design neuer Inhibitoren für die pflanzliche Cystathionin gamma-Synthase, basierend auf den erhaltenen Strukturinformationen.
Weiterhin Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Inhibitoren als Herbizide.
Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren kann die CGS aus Nicotiana tabacum verwendet werden, besonders bevorzugt die rekombinant in E. coli produzierte von CGS-Inhibitor Komplexen aus Nicotiana tabacum.
Zur Kristallisation der pflanzlichen CGS stehen dem in der Durchführung von Kristallisationsexperimenten erfahrenen Fachmann eine Reihe von Standardmethoden zur Verfügung (s. z. B. Ducruix, A. und Giege, R. (1992) Crystallization of nucleic acids and proteins. A practical approach. IRL Press, New York). Die Zusammensetzungen der für die Kristallisationsversuche verwendeten Lösungen können dabei hinsichtlich Proteinkonzentration, pH-Wert, Art und Konzentration von Puffersubstanzen, Salzen und sonstigen Additiven, wie z. B. Polyethylenglykol, Dioxan oder Detergentien, in weiten Bereichen variieren. Bevorzugt werden Kristalle durch Dampfdiffusion eines sitzenden oder hängenden Tropfens gezüchtet.
Zur Herstellung von Enzym-Inhibitor Komplexen stehen dem erfahrenen Fachmann eine Reihe von Standardmethoden zur Verfügung. Z. B. können Enzym-Inhibitor Komplexe durch Eintauchen von Kristallen der CGS in Inhibitorlösungen hergestellt oder durch Kokristallisation der CGS in Anwesenheit eines Inhibitors gezüchtet werden.
Die Lösung der Struktur der Enzym-Inhibitor Komplexe erfolgt bevorzugt durch molekulare Ersetzungsverfahren, besonders bevorzugt unter Verwendung der Struktur des nativen Homotetramers der CGS aus Nicotiana tabacum.
Das Design neuer Inhibitoren erfolgt bevorzugt nach visueller Inspektion graphischer Darstellungen der Strukturen der CGS in Anwesenheit von Inhibitoren, und zwar insbesondere (a) durch Bestimmung der für Liganden zugänglichen Volumina an aktiven Stellen, (b) durch Bestimmung von idealen Ligandeneigenschaften hinsichtlich Hydrophobizität oder Wasserstoffbrückenbindungen, und/oder (c) durch Bestimmung der elektronischen Eigenschaften von für Liganden zugänglichen Oberflächen an den aktiven Stellen. Aus diesen Befunden lassen sich strukturelle und funktionale Anforderungen an potentielle Inhibitoren der Cystathionin gamma- Synthase ableiten. Die Erfindung bezieht sich auch auf Inhibitoren, die diesen strukturellen und funktionalen Anforderungen genügen.
Erfindungsgemäß erfolgte eine exakte Bestimmung der räumlichen dreidimensionalen Geometrie der Komplexe der CGS aus Nicotiana tabacum mit den Inhibitoren 3-(Phosphonomethyl)-pyridin-2-Carbonsäure (Vbdg.1), DL-E-2- Amino-5-phosphono-3-pentensäure (Vbdg.2) und [3-(3-Chlorphenyl)- [1 ,2,4]oxadiazol-5-ylsulfonyl]-essigsäure (Vbdg.3). Bei Vbdg.2 handelt es sich um eine zum Substrat HSerP analoge Verbindung. Im substrat- bzw. inhibitorfreien Zustand ist der Kofaktor PLP kovalent an die Seitenkette von LysA261 gebunden (internes Aldimin). VBDG.2 bindet durch Transaldiminierung kovalent an den Kofaktor PLP (externes Aldimin). Anschließend katalysiert die CGS die Abspaltung des Protons vom Cα-Atom von HSerP und reprotoniert das C4'-Atom des Kofaktors. Es entsteht ein enzymgebundenes Ketimin. Die Seitenkette von LysA261 wird durch das enzymgebundene Ketimin gezwungen, eine gänzlich andere Konformation als im freien Enzym anzunehmen. Auf die Geometrie des Rückgrats des Enzyms hat die Bindung von VBDG.2 nur unwesentlichen Einfluss, was durch eine Standardabweichung von nur 0.3 Ä der Cα- Positonen im freien und komplexierten Enzym zum Ausdruck kommt. Die weiteren Wechselwirkungen von Vbdg.2 mit der CGS sind in Figur 1 schematisch wiedergegeben.
Bei Vbdg.2 handelt es sich um eine zum Substrat HSerP analoge Verbindung. VBDG.2 bindet durch Transaldiminierung kovalent an den Kofaktor PLP. Anschließend katalysiert die CGS die Abspaltung des α-Protons und tautomerisiert zum Ketimin. Die Seitenkette von LysA261 , das im substrat- bzw. inhibitorfreien Zustand des Enzyms den Kofaktor PLP kovalent bindet, nimmt eine gänzlich andere Konformation an als im freien Enzym. Auf die Geometrie des Rückgrats des Enzyms hat die Bindung von VBDG.2 nur unwesentlichen Einfluss, was durch eine Standardabweichung von nur 0.3 Ä der Cα-Positonen im freien und komplexierten Enzym zum Ausdruck kommt. Die weiteren Wechselwirkungen des Inhibitors Vbdg.2 mit der CGS sind in Figur 1 schematisch wiedergegeben. Die Strukturdaten des Komplexes sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Der Enzym-Inhibitor Komplex von CGS und Vbdg.1 weist einige überraschende Konformationsänderungen der Seitenketten im Vergleich zum freien Enzym auf. So ist die Guanidiniumgruppe von ArgA423 um 0.5 Ä und die Aminogruppe von LysC99 um 0.6 A jeweils in Richtung des Inhibitors verschoben. Auch die Seitenkette von TyrA163 unterscheidet sich durch Drehung der Cα-Cß-Bindung und des Phenylringes deutlich vom freien Enzym. Der Kofaktor PLP, der mit LysA261 eine Schiffsche Base bildet und nicht mit VBDG.1 reagieren kann, orientiert sich ebenfalls deutlich anders als im freien Enzym, was dem Inhibitor zusätzlichen Raum verschafft. Interessanterweise bildet die Phosphonatgruppe des Inhibitors keine Salzbrücke zu einer der in der Bindungsstelle verfügbaren basischen Aminosäuren. Vielmehr deutet die räumliche Nähe der Phosphonatgruppe zum Carbonylsauerstoff von MetA402, zur Carboxylgruppe von GluC107 und zu den Hydroxylgruppen von TyrA163 und TyrC11 eindeutig auf Wasserstoffbrücken hin, die nur durch eine zumindest teilweise Protonierung des Phosphonats plausibel zu erklären sind. Die Phosphonatgruppe befindet sich gleichsam in einem weiträumigen Käfig der basischen Aminosäuren LysA165, LysC99 und ArgC110 (siehe schematische Darstellung in Figur 2). Auf das Rückgrat der CGS hat die Bindung des Inhibitors VBDG.1 praktisch keinen Einfluss; die Standardabweichung der Cα-Positionen im Vergleich zum freien Enzym beträgt 0.2 Ä. Die Strukturdaten des Komplexes sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Überraschenderweise zeigt der Vergleich der Komplexstruktur der CGS mit Vbdg.3 nicht nur deutliche Veränderungen in den Positionen der Seitenketten von Aminosäuren im Aktivzentrum, sondern auch von beträchtlichen Teilen des Enzymrückgrats. Diese Veränderungen, die so weder auf Grund von Erfahrungswerten noch mit Hilfe gängiger theoretischer Methoden vorhersehbar waren, lassen das Design völlig neuartiger Inhibitoren der CGS zu. Die Geometrieveränderungen im Rückgrat des Enzyms sind insbesondere in den Aminosäuren ThrA160 bis LysA176 lokalisiert. ThrA160, AspA161 und CysA162 sind Teil eines Loops, während die Aminosäuren TyrA163 bis LysA176 eine Helix bilden. Die Cα-Positionen von CysA162, TyrA163 bzw. ArgA164 sind 1.5 Ä, 1.2 Ä, bzw. 1.3 Ä entfernt von den entsprechenden Positionen des freien Enzyms, wenn eine Superposition aller Cα-Atome nach der Methode der kleinsten Abstandsquadrate vorgenommen wird. Eine weitere in diesem Ausmaß nicht zu erwartende Konformationseränderung liegt bei der Aminosäure ArgA423 vor. In Bezug auf das freie Enzym sind die Bindungen, Cα-Cß, Cß-Cγ, Cγ-Cδ bzw. Cδ-Nε um 80, -60, 27 bzw 25 Grad verdreht, was der Bindungsstelle, die zum großen Teil mit der Substratbindungsstelle räumlich zusammenfällt, im Vergleich zur unkomplexierten CGS eine völlig unerwartete neue Gestalt verleiht. Der Bindungsmodus des Inhibitors Vbdg.3 ist außergewöhnlich, da der 5-gliedrige Heterozyklus einen Charge-Transfer-Komplex mit der Guanidinium-Gruppe der Aminosäure ArgA423 bildet. Voraussetzung für eine solche Interaktion ist die parallele Anordnung der beiden 3.4 Ä voneinander entfernten Ebenen, die einmal durch die Atome des Hetererozyklus und zum anderen durch die Atome der Guanidinium-Gruppe definiert sind. Die Carboxylgruppe des Inhibitors weist eine salzbrückenartige Wechselwirkung mit ArgA423 auf. Zudem bestehen Wasserstoffbrücken zwischen dieser Carboxylgruppe und dem Peptidstickstoff von ArgA164 sowie der Hydroxylgruppe von SerA403. Der meta-chlorierte Phenylring von Vbdg.3 befindet sich einer Tasche, die hauptsächlich von hydrophoben Aminosäuren gebildet wird. Die Wechselwirkungen sind schematisch in Abb. Figur 3a und 3b dargestellt. In unmittelbarer Nähe der Thioetherbrücke zwischen Heterozyklus und Carboxylgruppe des Inhibitors, auf der der Säurefunktion abgewandten Seite, befindet sich der Phenylring von TyrA163. Aus der Stellung dieser Aminosäure ergeben sich wichtige Hinweise für das Design weiterer Inhibitoren, die eine π-Wechselwirkung mit TyrA163 ausüben können (π-stacking). Die Strukturdaten des Komplexes sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Aus diesen Befunden lassen sich strukturelle und funktionale Anforderungen an potentielle Inhibitoren der CGS ableiten. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Inhibitoren, die diesen strukturellen und funktionalen Anforderungen genügen. Diese Anforderungen führen zur Beschreibung von Inhibitoren.
Die erfindungsmäßigen Inhibitoren bestehen aus einem hydrophoben oder moderat hydrophoben Teil Hy, einem Teil Pi, der ein elektronenreiches konjugiertes oder aromatisches π-Elektronensystem enthält, und einem Teil A, der eine saure Funktion trägt. Die Teile Hy und Pi sind direkt oder sind über einen Linker L1 miteinander verknüpft, die Teile Pi und A sind über einen Linker L2 verknüpft.
Die erfindungsmäßigen Inhibitoren haben folgende Formel (I):
Hy- (Ll)n - Pi- L2 - A (I)
wobei die Symbole und Indizes folgende Bedeutungen haben:
Hy ist eine hydrophobe Gruppe, die räumlich in die in Figur 3a beschriebene
Tasche paßt.
Hy ist vorzugsweise eine geradkettige verzweigte und/oder cyclische Alkylgruppe mit 1 bis 6 C-Atomen, wobei ein oder mehrere H-Atome durch F ersetzt sein können,
Phenyl, Naphthyl, wobei die beiden letztgenannten Gruppen ein- oder zweifach substituiert sein können, vorzugsweise mit einem Substituenten aus der Gruppe Cl,
F, CH3) CF3. Besonders bevorzugt kann Hy sein:
-CH3, -CH2CH33, -CH(CH3)2, -CH2CH2CH3, -CF3, -CH22CF3, -CH(CF3)2,
Cyclohexyl, m-Chlorphenyl, o-Chlorphenyl, p-Chlorphenyl,
2,3-Dichlorphenyl, 2,4-Dichlorphenyl, 2,5-Dichlorphenyl, 3,4-Dichlorphenyl,
3,5-Dichlorphenyl,
1 -Naphthyl;
L1 ist ein Spacer, der so zu wählen ist, daß Hy und Pi auf direktem Weg maximal durch 2 Bindungen getrennt sind.
L1 ist vorzugsweise -CR1R2-, -O-, -S(O)m-, -NR3- besonders bevorzugt -CH2-,
-S- oder -O-.
R1, R2, R3, sind H, F oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 C-Atomen;
n ist 0 oder 1 ;
m ist 0,1 oder 2 Pi ist ein elektronenreiches konjugiertes oder aromatisches π-Elektronensystem, das mit der Guanidiniumgruppe der Aminosäure ArgA423 einen Charge-Transfer- Komplex bilden kann, wobei der Abstand zwischen den Verknüpfungspunkten zu Hy und L2 bzw. zwischen L1 und L2 beträgt maximal 4 A (die Länge der Bindungen zu Hy bzw. L1 und L2 nicht einbezogen). Pi besitzt vorzugsweise folgende Strukturen:
), C(CH2OH), N
-V xr X→ = CH, C(OH), C(CH2OH), N
// -x. X2 = CH, C(OH), C(CH2OH), N v Y = NH, O, S
X1 = CH, C(OH), C(CH2OH), N X2 = CH, C(OH), C(CH2OH), N X3 = CH, C(OH), C(CH2OH), N
V und V stellen dabei Platzhalter für die Teile Hy bzw. L1 und L2 dar. Auf Grund der Analyse der Röntgenstruktur des CGS-Inhibitor-Komplexes und der daraus abgeleiteten Charge-Transfer-Wechselwirking des Teils Pi mit der Guanidiniumgruppe von ArgA43 können V und V ihre Position in obigen allgemeinen Formeln für Pi gleichsam vertauschen. Somit können sein:
V = Hy - (L1)n - und V = - L2 - A, - L3 - R oder:
V = Hy-, Hy-L1- und V = - L2 - A, - L3 - R
Pi ist besonders bevorzugt
Imidazol, Oxazol, Isoxazol, Oximidazol, Pyrazol, Pyrimidin, Pyridin, Triazin (bei allen
Heterozyklen kann die relative Stellung der Verknüpfungspunkte zu H bzw. L1 und
L2 ortho, meta oder para bzw. (1 ,2) oder (1 ,3) sein) oder -NH-C(CN)N-
(Cyanoamidin)-;
L2 ist ein Spacer, der so zu wählen ist, daß Pi und A auf direktem Weg durch 2 bis 5 Bindungen getrennt sind.
L2 ist vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 8 C-
Atomen, wobei auch eine oder mehrere CH2-Gruppen durch -S(O)m-, -O-, -SiR1R2- oder NR3 ersetzt sein können (mit der Maßgabe, daß S und/oder O Atome nicht benachbart sein dürfen).
L2 ist besonders bevorzugt:
-CH2, -S-, -O-, -NH-
-CH2-S-, -CH2-O-, -CH2-NH-, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-,-CH2-CH2-,
-CH2-CH2-S-, -CH2-CH2-O-, -CH2-O-CH2-, -CH2-S-CH2, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH -CH -,-CH2-CH2-CH2-O-,-CH2-CH2-CH2-S-;
A ist eine zur Bildung einer Salzbrücke zu ArgA423 befähigte Gruppe. Bevorzugt kann A sein:
-COOH, -SO2H, -SO2(OH), -PO(OH)2, -PO(H)(OH), -PO(CH3)(OH).
Der Begriff „hydrophob" beschreibt die tendenzielle Eigenschaft von Molekülen, sich nicht in Wasser sondern vorzugsweise in apolaren Lösungsmitteln (z.B. Fetten) zu lösen. Teilstrukturen eines Moleküls werden dann als hydrophob bezeichnet, wenn sie diese Tendenz des Gesamtmoleküls im Vergleich zu dem Molekül, in dem diese Teilstruktur durch eine beliebige Referenzteilstruktur ersetzt ist, verstärken. Hydrophobe Strukturen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Alkane, Alkene, Alkine, Cycloalkane, Cycloalkene, Cycloalkine und Aromaten wie etwa Benzole, Naphthole und Phenanthrene. „Moderat hydrophob" heißt in diesem Zusammenhang, dass die tendenzbildende Eigenschaft der Hydrophobie etwa durch Heteroatome leicht geschwächt ist.
Die Eigenschaft einer Teilstruktur, räumlich in eine vorgegebene Enzymtasche zu passen, wird folgendermaßen definiert: Alle Nichtwasserstoffatome der in Figur 3b aufgeführten Aminosäuren des Enzyms in jenen räumlichen Positionen, wie sie aus der Röntgenstrukturanalyse des CGS-Vbdg.3-Komplexes hervorgegangen sind, werden im Computermodell mit Kugeln umgeben, deren Mittelpunkt mit den Atompositionen zusammenfällt und deren Radius 1 A beträgt. Dadurch wird ein Hohlraum innerhalb des Enzyms festgelegt, wie er in Figur 3b schematisch wiedergegeben ist. Die Nichtwasserstoffatome eines potenziellen Inhibitors mit einer entsprechenden hydrophoben Teilstruktur Hy werden in der gleichen Weise mit Kugeln des Radius 1 Ä umgeben. Hierzu verwendet man nur die 3-dimensionalen Konformationen des potenziellen Inhibitors, bei denen die Standarabweichung der Bindungslängen und Bindungswinkel von den Standardgeometriewerten 0.2 Ä bzw. 1 Grad nicht überschreitet. Findet man mindestens eine Konformation, die durch Verschiebung und Drehung relativ zur Enzymstruktur so angeordnet werden kann, dass sich der Schwerpunkt von Hy innerhalb des oben beschrieben Hohlraums befindet, ohne dass sich die virtuellen Kugeln des potenziellen Inhibitors mit denen, die den Hohlraum des Enzyms begrenzen, überschneiden, so wird der hydrophobe Teil Hy als passend zur Enzymtasche bezeichnet.
Unter einem Charge-Transfer-Komplex im hier verwendeten Sinne versteht man die enthalpisch günstige Wechselwirkung eines neutralen oder anionischen π-Systems mit der protonierten, kationischen Guanidiniumgruppe eines Arginins. Die durch das π-System gebildete Ebene ist hierbei parallel zur Ebene der Guanidiniumgruppe ausgerichtet. Die Ebenen haben einen Abstand voneinander von maximal 4.5 A. Das π-System kann durch konjugierte Mehrfachbindungen oder durch einen aromatischen Ring gebildet werden.
Unter Salzbrücke bzw. salzbrückenartiger Bindung versteht man die energiegünstige Wechselwirkung zwischen einer funktioneilen Gruppe, die durch Abspaltung eine Protons formal eine negative Ladung trägt, und der protonierten Aminofunktion eines Lysins bzw. Guanidiniumgruppe eines Arginins. Voraussetzung einer solchen Wechselwirkung ist ein Abstand von maximal 3.5 A zwischen Amino-Stickstoff bzw. einem der Gunidinium-Stickstoffe und einem der Atome der funktionellen Gruppe, die negative Formalladungen tragen.
Zur Findung von Molekülstrukturen, die den oben beschriebenen Anforderungen an potenzielle Inhibitoren der CGS genügen, ist folgende Vorgehensweise vorteilhaft: Aus den obigen Angaben, welche chemische Formel die einzelnen Bestandteile des potenziellen Inhibitors vorzugsweise tragen sollten, lassen sich vielfältige Template- Strukturen erzeugen. Die einzelnen Bestandteile können durch Intuition oder per Zufall in den Grenzen der vorgegbenen Bedingungen bezüglich bestimmter Eigenschaften variiert werden. Über die weitere Untersuchung einer solchen Struktur entscheidet gegebenenfalls die synthetische Machbarkeit. Mit Hilfe gängiger Modelling-Programme wie etwa Cerius2 (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA, 1999), Insightll (Cehus2 (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA, 1999) oder Sybyl (Tripos Inc., St. Loius, MO, 1998) kann durch visuelle Inspektion überprüft werden, ob eine so erzeugte Struktur die weiteren oben beschriebenen Anforderungen erfüllt.
Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I) bzw. nach den erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Verbindungen, die in einem in vitro Test die Aktivität einer pflanzlichen CGS spezifisch inhibieren.
Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der CGS stehen eine Reihe von geeigneten Verfahren zur Verfügung, bei denen man eine pflanzliche CGS, besonders bevorzugt die CGS aus Nicotiana tabacum, in einem geeigneten Reaktionspuffer unter geeigneten Reaktionsbedingungen bezüglich Reaktionstemperatur und pH-Wert mit einem geeigneten Substrat, wie z. B. HSerP, inkubiert. Besonders geeignete, beispielhafte Ausführungsformen des CGS- Aktivitätstests sind im folgenden dargestellt:
HSerP kann in einem Reaktionspuffer im pH-Bereich von pH 4 bis 10, bevorzugt aber im pH-Bereich von 7 bis 8,5 von einem Enzym mit CGS-Aktivität zu Cystathionin und anorganischem Phosphat umgesetzt werden. Die Aktivität der CGS kann dann z. B.
(a) durch Messung der Abnahme der Konzentration des Substrats HSerP, durch Messung der Abnahme der Konzentration des Substrats L-Cystein oder der Zunahme der Konzentration des Produkts Cystathionin mittels Aminosäureanalyse,
(b) durch kolorimetrische Messung des bei der CGS-Reaktion aus HSerP freigesetzten anorganischen Phosphats oder,
(c) bei Verwendung von radioaktiv markiertem HSerP nach Fällung des nicht umgesetzten Substrats mittels Bariumsalzen durch Quantifizierung des im Überstand löslich verbleibenden radioaktiven Cystathionins oder
(d) bei Verwendung von radioaktiv markiertem L-Cystein durch Quantifizierung des gebildeten radioaktiven Cystathionins nach Abtrennung von radioaktiv markiertem L-Cystein durch lonenaustauschchromatographie nachgewiesen werden. Dem in der Durchführung von Enzymtests erfahrenen Fachmann stehen hierfür Standardmethoden zur Verfügung (s. z. B. Daniel, J. Nature 264 (1976), 90-92; Datko, A. H. et al., J. Biol. Chem. 249 (1974), 1139-1155; Kreft, B. D. et al., Plant Physiol. 104 (1994), 1215-1220; Ravanel, S. et al., Arch. Biochem. Biophys. 316 (1995), 572-584). Die geeigneten Zusammensetzungen der Reagenzien oder die Konzentrationen von Salzen, Substraten und Proteinen, die pH-Werte, die Temperaturen, die Ansatzvolumina und die Wellenlängen zur Messung oder bei der Detektion können dabei in weiten Bereichen variieren. Die CGS kann in einer dem Fachmann bekannten Weise entweder aus Pflanzen isoliert werden oder auch ausgehend von literaturbekannter cDNA rekombinant in transgenen Wirtszellen produziert werden.
Die Quantifizierung der Enzyminhibition kann durch einen einfachen Vergleich der katalytischen Aktivität der CGS in Abwesenheit und in Anwesenheit der zu untersuchenden Testsubstanz unter ansonsten identischen Testbedingungen in einer dem Fachmann bekannten Weise geschehen. Die zu untersuchende chemische Verbindung wird dabei bevorzugt in Konzentrationen zwischen 10"9 M und 10"3 M, und besonders bevorzugt in Konzentrationen zwischen 10"7 M und 10~4 M eingesetzt.
Die Bestimmung der inhibitorischen Wirkung von Testsubstanzen kann mit gereinigter pflanzlicher CGS durchgeführt werden, aber auch mit ganzen Zellen eines rekombinanten Organismus, welcher eine pflanzliche CGS rekombinant exprimiert, mit CGS-haltigen Extrakten aus diesem Organismus oder angereicherten CGS-haltigen Fraktionen aus diesem Organismus. Als bevorzugter rekombinanter Wirtsorganismus seien Bakterien-, Insekten- und Hefezellen genannt. Alternativ kann auch eine aus Pflanzengewebe oder Pflanzenzellkulturen isolierte CGS verwendet werden.
Erfindungsgemäße bzw. erfindungsgemäß identifizierte Inhibitoren, beeinflussen (inhibieren) die Aktivität des Enzyms, vorzugsweise unter den beschriebenen Testbedingungen, vorzugsweise um mindestens 30 %, besonders bevorzugt um mindestens 50 %.
Die Spezifität der untersuchten Verbindungen kann sichergestellt werden, indem man dem Testansatz geeignete, dem Fachmann bekannte und geläufige Reagenzien zusetzt, die eine unspezifische Hemmung des Enzyms unterbinden. Beispiele für Verbindungen, welche die CGS unspezifisch hemmen können, sind solche Verbindungen, die z.B. durch Alkylierung von essentiellen Sulfhydrylgruppen oder durch unspezifische Reaktion mit dem Kofaktor PLP wirken. Sie können z. B. durch Zusatz von Sulfhydrylreagentien oder PLP zum Testansatz unwirksam gemacht werden. So wird sichergestellt, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nur spezifische Inhibitoren der CGS identifiziert werden.
Besonders bevorzugt sind Inhibitoren, die auch in einem in vivo Test Wirkung zeigen.
Zur Überprüfung der Wirkung eines CGS Inhibitors auf Pflanzen in vivo stehen dem Fachmann vielfältige Methoden zur Verfügung. Die zu untersuchenden Substanzen (z.B. definierte chemische Verbindungen, aber auch heterogene Stoffgemische) werden Pflanzen appliziert, wobei verschiedenste Hilfsstoffe, wie beispielsweise Netzmittel oder Lösungsmittel, verwendet werden können. Nach der Applikation der zu untersuchenden Substanzen werden die Pflanzen bonitiert. Substanzen, welche eine Pflanze durch selektive Inhibition der CGS schädigen, rufen mindestens ein charakteristisches Symptom hervor. Häufig entstehen nach Applikation Chlorosen und/oder Nekrosen, die bei dem neugebildeten Gewebe besonders ausgeprägt sein können. Weitere Symtome können eine Depression des Wachstums oder auch ein sehr rasches Absterben der Pflanze sein. Die Symptome variieren je nach Pflanzenspezies in Abhängigkeit von deren unterschiedlicher Empfindlichkeit und in Abhängigkeit der Eigenschaften des Inhibitors.
Eine einfache und praxistaugliche Möglichkeit für einen in vivo Test stellt z. B. der in Beispiel 8 beschriebene Lemna-Test dar. Dabei wird ein erfindungsgemäßer Inhibitor unter den in Beispiel 8 genannten Bedingungen, vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von 10"7 bis 10"4 M, einem Lemna-Test unterzogen. Bevorzugt sind erfindungsgemäße Inhibitoren, die im Lemna-Test aktiv sind. Aktiv sein heißt in diesem Zusammenhang, daß ein erfindungsgemäßer Inhibitor eine mindestens 30-%ige, bevorzugt mindestens 50- %ige Wachstumshemmung der Lemna-Pflanzen hervorruft, oder, besonders bevorzugt, daß die mit dem erfindungsgemäßen Inhibitor behandelten Lemna- Pflanzen absterben.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Inhibitors, der in einem in-vivo Test, vorzugsweise im Lemna-Test, aktiv ist als Herbizid.
Aktiv bedeutet vorzugsweise das Auftreten von chlorotischen und/oder nekrotischen Geweben, besonders bevorzugt das Auftreten von chlorotischen und/oder nekrotischen Geweben und einer Wachstumsdepression der Pflanze, vorzugsweise innerhalb von zehn, besonders bevorzugt innerhalb von sieben Tagen.
Ebenso Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs in Nutzpflanzenkulturen, dadurch gekennzeichnet, daß man auf den Ort der Nutzpflanze, die Nutzpflanze oder deren Vermehrungsgut ein herbizides Mittel aufbringt, enthaltend einen erfindungsgemäßen Inhibitor, der vorzugsweise in den oben beschriebenen Testverfahren in einem Konzentrationsbereich von 10"7 bis 10"4 molar eine mindestens 30-%ige, bevorzugt mindestens 50-%ige, Inhibitorwirkung gegenüber CGS aufweist und, vorzugsweise, im Lemna-Test aktiv ist.
Die Nutzpflanzen sind vorzugsweise Zuckerrübe, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Gerste, Roggen, Weizen, Sojabohne, Reis und Mais, aber auch andere Kulturpflanzenspezies, insbesondere auch solche Spezies, die als landwirtschaftliche Hilfspflanzen verwendbar sind. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren sind teilweise bekannt und kommerziell erhältlich und teilweise neu.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt nach an sich literaturbekannten Methoden, wie sie in Standardwerken der Organischen Synthese, z.B. Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart, beschrieben werden.
Die Herstellung erfolgt dabei unter Reaktionsbedingungen, die für die genannten Umsetzungen bekannt und geeignet sind. Dabei kann auch von an sich bekannten, hier nicht näher erwähnten Varianten Gebrauch gemacht werden.
Die Ausgangsstoffe können gewünschtenfalls auch in situ gebildet werden, und zwar derart, dass man sie aus dem Reaktionsgemisch nicht isoliert, sondern sofort zu den Verbindungen der Formel (I) umsetzt.
Beispielsweise sei verwiesen auf DE-A 23 44 732, 24 50 088, 24 29 093, 25 02 94, 26 36 684, 27 01 591 und 27 52 975 für Verbindungen mit 1 ,4-Cyclohexylen und 1 ,4- Phenylen-Gruppen; DE-A 26 41 724 für Verbindungen mit Pyrimidin-2,5-dily- Gruppen; DE-A 40 26 223 und EP-A 03 91 203 für Verbindungen mit Pyridin-2,5- dily-Gruppen; DE-A 32 31 462 für Verbindungen mit Pyhdazin-3,6-dily-Gruppen; EP- A 309 514 für Verbindungen mit (1 ,3,4)-Thiadiazol-2,5-dily-Gruppen; WO-A 92/16500 für Naphthalin-2,6-dily-Gruppen; K. Seto et al, Journal of the Chemical Society, Chemical Communications 1988, 56 für Dioxobohnan-2,5-dily-Gruppen.
Die Herstellung disubstituierter Pyridine, disubstituierter Pyrazine, disubstituierter Pyrimidine und disubstituierter Pyridazine findet sich beispielsweise auch in den entsprechenden Bänden der Serie „The Chemistry of Heterocyclic Compounds" von A. Weissberger und E.C. Taylor (Herausgeber). Dioxanderivate werden zweckmäßig durch Reaktion eines entsprechenden Aldehyds (oder eines seiner reaktionsfähigen Derivate) mit einem entsprechenden 1 ,3-Diol (oder einem seiner reaktionsfähigen Derivate) hergestellt, vorzugsweise in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels, wie Benzol oder Toluol, und/oder eines Katalysators, z.B. einer starken Säure, wie Schwefelsäure, Benzol- oder p- Toluolsulfonsäure, bei Temperaturen zwischen 20°C und etwa 150°C, vorzugsweise zwischen 80°C und 120°C. Als reaktionsfähige Derivate der Ausgangsstoffe eignen sich in erster Linie Acetale.
Verbindungen, worin ein aromatischer Ring durch mindestens ein F-Atom substituiert ist, können auch aus den entsprechenden Diazoniumsalzen durch Austausch der Diazoniumgruppe gegen ein Fluoratom, z.B. nach den Methoden von Balz und Schiemann, erhalten werden.
Was die Verknüpfungen der Ringsysteme miteinander angeht, sei beispielsweise verwiesen auf:
N. Miyaura, T. Yanagai und A. Suzuki in Synthetic Communications 11 (1981 ), 513- 519, DE-C 39 30 663; M.J. Sharp, W. Cheng, V. Snieckus ind Tetrahedron Letters 28 (1987) 5093; G.W. Gray in J. Chem. Soc. Perkin Trans II 1989, 2041 und Mol. Cryst. Liq. Cryst. 172 (1989) 165, 204 (1991) 43 und 91; EP-A 0449 015; WO-A 89/12039; WO-A 89/03821 ; EP-A 0 354434 und EP-A 0694 530 für die direkte Verknüpfung von Aromaten und Heteroaromaten; und DE-A 32 01 721 für Verbindungen mit -CH2CH2-Brückengliedem.
Ester der Formel (I) auch durch Veresterung entsprechender Carbonsäuren (oder ihrer reaktionsfähigen Derivate) mit Alkohol bzw. Phenolen (oder ihren reaktionsfähigen Derivaten), nach der DCC-Methode (DCC = Dicyclohexylcarbodiimid) oder analog DE-A 44 27 198 erhalten werden. Die entsprechenden Carbonsäuren und Alkohole bzw. Phenole sind bekannt oder können in Analogie zu bekannten Verfahren hergestellt werden. Als reaktionsfähige Derivate der genannten Carbonsäuren eignen sich insbesondere die Säurehalogenide, vor allem die Chloride und Bromide, ferner die Anhydride, z.B. auch gemischte Anhydride, Azide oder Ester, insbesondere Alkylester mit 1-4 C- Atomen in der Alkylgruppe.
Als reaktionsfähige Derivate der genannten Alkohole bzw. Phenole kommen insbesondere die entsprechenden Metallalkoholate bzw. Phenolate, vorzugsweise eines Alkalimetalls, wie Natrium oder Kalium, in Betracht.
Die Veresterung wird vorteilhaft in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels durchgeführt. Gut geeignet sind insbesondere Ether, wie Diethylether, Di-n- butylether, THF, Dioxan oder Anisol, Ketone, wie Aceton, Butanon oder Cyclohexanon, Amide, wie DMF oder Phosphorsäurehexamethyltriamid, Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol oder Xylol, Halogenkohlenwasserstoffe, wie Tetrachlorkohlenstoffe, Dichlormethan oder Tetrachlorethylen und Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid oder Sulfolan.
Ether der Formel (I) sind durch Veretherung entsprechender Hydroxyverbindungen, vorzugsweise entsprechender Phenole, erhältlich, wobei die Hydroxyverbindung zweckmäßig zunächst in ein entsprechendes Metallderivat, z.B. durch Behandeln mit NaH, NaNH2, NaOH, KOH, Na2CO3 oder K2CO3 in das entsprechende Alkalimetallalkoholat oder Alkalimetallphenolat übergeführt wird. Dieses kann dann mit dem entsprechenden Alkylhalogenid, Alkylsulfonat oder Dialkylsulfat umgesetzt werden, zweckmäßig in einem inerten Lösungsmittel, wie Aceton, 1 ,2- Dimethoxyethan, DMF oder Dimethylsulfoxid, oder auch mit einem Überschuß an wäßrig-alkoholishcer NaOH oder KOH bei Temperaturen zwischen etwa 20° C und 100°C.
Die erfindungsgemäßen CGS-Inhibitoren können beispielsweise in Form von Spritzpulvern, emulgierbaren Konzentraten, versprühbaren Lösungen, Stäubemitteln oder Granulaten in den üblichen Zubereitungen angewendet werden. Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch herbizide Mittel, die Inhibitoren der CGS enthalten. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren können auf verschiedene Art formuliert werden, je nachdem welche biologischen und/oder chemisch-physikalischen Parameter vorgegeben sind. Als Formulierungsmöglichkeiten kommen beispielsweise in Frage: Spritzpulver (WP), wasserlösliche Pulver (SP), wasserlösliche Konzentrate, emulgierbare Konzentrate (EC), Emulsionen (EW), wie Öl-in-Wasser- und Wasser-in-ÖI-Emulsionen, versprühbare Lösungen, Suspensionskonzentrate (SC), Dispersionen auf Öl- oder Wasserbasis, ölmischbare Lösungen, Kapselsuspensionen (CS), Stäubemittel (DP), Beizmittel, Granulate für die Streu- und Bodenapplikation, Granulate (GR) in Form von Mikro-, Sprüh-, Aufzugs- und Adsorptionsgranulaten, wasserdispergierbare Granulate (WG), wasserlösliche Granulate (SG), ULV-Formulierungen, Mikrokapseln und Wachse. Diese einzelnen Formulierungstypen sind im Prinzip bekannt und werden beispielsweise beschrieben in: Winnacker-Küchler, "Chemische Technologie", Band 7, C. Hauser Verlag München, 4. Aufl. 1986, Wade van Valkenburg, "Pesticide Formulations", Marcel Dekker, N.Y., 1973; K. Martens, "Spray Drying" Handbook, 3rd Ed. 1979, G. Goodwin Ltd. London.
Die notwendigen Formulierungshilfsmittel wie Inertmaterialien, Tenside, Lösungsmittel und weitere Zusatzstoffe sind ebenfalls bekannt und werden beispielsweise beschrieben in: Watkins, "Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers", 2nd Ed., Darland Books, Caldwell N.J., H.v. Olphen, "Introduction to Clay Colloid Chemistry"; 2nd Ed., J. Wiley & Sons, N.Y.; C. Marsden, "Solvents Guide"; 2nd Ed., Interscience, N.Y. 1963; McCutcheon's "Detergents and Emulsifiers Annual", MC Publ. Corp., Ridgewood N.J.; Sisley and Wood, "Encyclopedia of Surface Active Agents", Chem. Publ. Co. Inc., N.Y. 1964; Schönfeldt, "Grenzflächenaktive Äthylenoxidaddukte", Wiss. Verlagsgesell., Stuttgart 1976; Winnacker-Küchler, "Chemische Technologie", Band 7, C. Hauser Verlag München, 4. Aufl. 1986.
Auf der Basis dieser Formulierungen lassen sich auch Kombinationen mit anderen pestizid wirksamen Stoffen, wie z.B. Insektiziden, Akariziden, Herbiziden, Fungiziden, sowie mit Safenern, Düngemitteln und/oder Wachstumsregulatoren herstellen, z.B. in Form einer Fertigformulierung oder als Tankmix.
Spritzpulver sind in Wasser gleichmäßig dispergierbare Präparate, die neben dem Wirkstoff außer einem Verdünnungs- oder Inertstoff noch Tenside ionischer und/oder nichtionischer Art (Netzmittel, Dispergiermittel), z.B. polyoxyethylierte Alkylphenole, polyoxethylierte Fettalkohole, polyoxethylierte Fettamine, Fettalkoholpolyglykolethersulfate, Alkansulfonate, Alkylbenzolsulfonate, ligninsulfonsaures Natrium, 2,2'-dinaphthylmethan-6,6'-disulfonsaures Natrium, dibutylnaphthalin-sulfonsaures Natrium oder auch oleoylmethyltaurinsaures Natrium enthalten. Zur Herstellung der Spritzpulver werden die herbiziden Wirkstoffe beispielsweise in üblichen Apparaturen wie Hammermühlen, Gebläsemühlen und Luftstrahlmühlen feingemahlen und gleichzeitig oder anschließend mit den Formulierungshilfsmitteln vermischt.
Emulgierbare Konzentrate werden durch Auflösen des Wirkstoffes in einem organischen Lösungsmittel z.B. Butanol, Cyclohexanon, Dimethylformamid, Xylol oder auch höhersiedenden Aromaten oder Kohlenwasserstoffen oder Mischungen der organischen Lösungsmittel unter Zusatz von einem oder mehreren Tensiden ionischer und/oder nichtionischer Art (Emulgatoren) hergestellt. Als Emuigatoren können beispielsweise verwendet werden: Alkylarylsulfonsaure Calzium-Salze wie Ca-Dodecylbenzolsulfonat oder nichtionische Emulgatoren wie Fettsäurepolyglykolester, Alkylarylpolyglykolether, Fettalkoholpolyglykolether, Propylenoxid-Ethylenoxid-Kondensationsprodukte, Alkylpolyether, Sorbitanester wie z.B. Sorbitanfettsäureester oder Polyoxethylensorbitanester wie z.B. Polyoxyethylensorbitanfettsäureester.
Stäubemittel erhält man durch Vermählen des Wirkstoffes mit fein verteilten festen Stoffen, z.B. Talkum, natürlichen Tonen, wie Kaolin, Bentonit und Pyrophyllit, oder Diatomeenerde.
Suspensionskonzentrate können auf Wasser- oder Ölbasis sein. Sie können beispielsweise durch Naß-Vermahlung mittels handelsüblicher Perlmühlen und gegebenenfalls Zusatz von Tensiden, wie sie z.B. oben bei den anderen Formulierungstypen bereits aufgeführt sind, hergestellt werden.
Emulsionen, z.B. ÖI-in-Wasser-Emulsionen (EW), lassen sich beispielsweise mittels Rührern, Kolloidmühlen und/oder statischen Mischern unter Verwendung von wäßrigen organischen Lösungsmitteln und gegebenenfalls Tensiden, wie sie z.B. oben bei den anderen Formulierungstypen bereits aufgeführt sind, herstellen.
Granulate können entweder durch Verdüsen des Wirkstoffes auf adsorptionsfähiges, granuliertes Inertmaterial hergestellt werden oder durch Aufbringen von Wirkstoffkonzentraten mittels Klebemitteln, z.B. Polyvinylalkohol, polyacrylsaurem Natrium oder auch Mineralölen, auf die Oberfläche von Trägerstoffen wie Sand, Kaolinite oder von granuliertem Inertmaterial. Auch können geeignete Wirkstoffe in der für die Herstellung von Düngemittelgranulaten üblichen Weise - gewünschtenfalls in Mischung mit Düngemitteln - granuliert werden.
Wasserdispergierbare Granulate werden in der Regel nach den üblichen Verfahren wie Sprühtrocknung, Wirbelbett-Granulierung, Teller-Granulierung, Mischung mit Hochgeschwindigkeitsmischern und Extrusion ohne festes Inertmaterial hergestellt.
Zur Herstellung von Teller-, Fließbett-, Extruder- und Sprühgranulaten siehe z.B. Verfahren in "Spray-Drying Handbook" 3rd ed. 1979, G. Goodwin Ltd., London; J.E. Browning, "Agglomeration", Chemical and Engineering 1967, Seiten 147 ff; "Perry's Chemical Engineer's Handbook", 5th Ed., McGraw-Hill, New York 1973, S. 8-57.
Für weitere Einzelheiten zur Formulierung von Pflanzenschutzmitteln siehe z.B. G.C. Klingman, "Weed Control as a Science", John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961 , Seiten 81-96 und J.D. Freyer, S.A. Evans, "Weed Control Handbook", 5th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1968, Seiten 101-103.
Die agrochemischen Zubereitungen enthalten in der Regel 0.1 bis 99 Gew.-%, insbesondere 0.1 bis 95 Gew.-%, Wirkstoff.
In Spritzpulvern beträgt die Wirkstoffkonzentration z.B. etwa 10 bis 90 Gew.-%, der Rest zu 100 Gew.-% besteht aus üblichen Formulierungsbestandteilen. Bei emulgierbaren Konzentraten kann die Wirkstoffkonzentration etwa 1 bis 90, vorzugsweise 5 bis 80 Gew.-% betragen. Staubförmige Formulierungen enthalten 1 bis 30 Gew.-% Wirkstoff, vorzugsweise meistens 5 bis 20 Gew.-% an Wirkstoff, versprühbare Lösungen enthalten etwa 0.05 bis 80, vorzugsweise 2 bis 50 Gew.-% Wirkstoff. Bei wasserdispergierbaren Granulaten hängt der Wirkstoffgehalt zum Teil davon ab, ob die wirksame Verbindung flüssig oder fest vorliegt und welche Granulierhilfsmittel, Füllstoffe usw. verwendet werden. Bei den in Wasser dispergierbaren Granulaten liegt der Gehalt an Wirkstoff beispielsweise zwischen 1 und 95 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 10 und 80 Gew.-%.
Daneben enthalten die genannten Wirkstofformulierungen gegebenenfalls die jeweils üblichen Haft-, Netz-, Dispergier-, Emulgier-, Penetrations-, Konservierungs-, Frostschutz- und Lösungsmittel, Füll-, Träger- und Farbstoffe, Entschäumer, Verdunstungshemmer und den pH-Wert und die Viskosität beeinflussende Mittel.
Als Kombinationspartner für die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in Mischungsformulierungen oder im Tank-Mix sind beispielsweise bekannte Wirkstoffe einsetzbar, wie sie z.B. aus Weed Research 26 (1986) 441-445 oder "The Pesticide Manual", 11th edition, The British Crop Protection Council and the Royal Soc. of Chemistry, 1997 und dort zitierter Literatur beschrieben sind.
Zur Anwendung werden die in handelsüblicher Form vorliegenden Formulierungen gegebenenfalls in üblicher weise verdünnt z.B. bei Spritzpulvern, emulgierbaren Konzentraten, Dispersionen und wasserdispergierbaren Granulaten mittels Wasser. Staubförmige Zubereitungen, Boden- bzw. Streugranulate sowie versprühbare Lösungen werden vor der Anwendung üblicherweise nicht mehr mit weiteren inerten Stoffen verdünnt. Mit den äußeren Bedingungen wie Temperatur, Feuchtigkeit, der Art des verwendeten Herbizids, u.a. variiert die erforderliche Aufwandmenge der erfindungsgemäßen Verbindungen. Sie kann innerhalb weiter Grenzen schwanken, z.B. zwischen 0.001 und 10.0 kg/ha oder mehr Aktivsubstanz, vorzugsweise liegt sie jedoch zwischen 0.005 und 5 kg/ha.
Die Erfindung wird durch die Beispiele näher erläutert, ohne sie dadurch zu beschränken.
Beispiele
Beispiel 1 : Proteinreinigung und Kristallisation
Zur Klonierung, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Transformation von DNA wurden Standardtechniken verwendet (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Mullis und Faloona (1987) Meth. Enzymol. 155, 335-350; Hanahan (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580).
Zur Klonierung des Gens für die CGS aus Nicotiana tabacum wurden synthetische Oligonukleotidprimer aus den Nukleotiden 1-22 und 483-505 eines partiellen, die CGS aus Arabidopsis thaliana kodierenden Gens (Le Guen, L. et al., Mol. Gen. Genet. 245 (1994), 390-396) abgeleitet. Unter Verwendung dieser Oligonukleotidprimer wurde mittels PCR genomische DNA von Arabidopsis thaliana amplifiziert. Mit dem so erzeugten PCR-Fragment als Sonde wurde eine lambda- ZAP cDNA Bibliothek von Nicotiana tabacum durchmustert. Aus hybridisierenden Klonen wurden die entsprechenden, auf den Vektor pBlueskript SK(-) basierenden Plasmide in-vivo ausgeschnitten. Das Plasmid p1064, welches das längste Insert enthielt, wurde anschließend sequenziert. Die Analyse des offenen Leserahmens und Aminosäuresequenzvergleiche bestätigten, daß das Plasmid p1064 die für die CGS aus Nicotiana tabacum kodierende Nukleinsäuresequenz enthielt.
Um die reife CGS aus Nicotiana tabacum rekombinant in E. coli produzieren zu können, wurde das Strukturgen mit Hilfe der Restriktionsenzyme Taql / Xbal aus p1064 ausgeschnitten und mit aus den synthetischen Oligonukleotiden ON96 (5'-TCGACAAGGAGGATCCATATGGCTAAGGCCGT) und ON 97 erzeugter doppelstrang-DNA (3'-GTTCCTCCTAGGTATACCGATTCCGGCAGC) ligiert. Dadurch wurde eine Ndel-Schnittstelle und ein ATG-Translationsstartkodon direkt vor dem Kodon eingefügt, das die erste Aminosäure der reifen CGS (Ala11 ) kodiert. Das resultierende DNA-Fragment wurde in mit Sall / Xbal geschnittenem pBlueskript SK(+) subkloniert (p1115). Das Plasmid p1117 wurde hergestellt, indem das Gen für die CGS mit Ndel / Notl aus p1115 ausgeschnitten und in pET23c(+) kloniert wurde. p1117 wurde zur Transformation von E. coli BL21 (DE3) Zellen verwendet.
E. coli BL21 (DE3) Zellen, die das Plasmid p1117 mit dem insertierten Gen für die CGS aus Nicotiana tabacum enthielten, wurden in 5 Litern LB-Medium mit 150 mg/l Ampicillin bis zu einer optischen Dichte von 0,7 kultiviert und 5 h lang mit 1 mM Isopropyl-beta-D-thiogalaktosid (IPTG) induziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in 50 ml Puffer A (100 mM Ths/HCl pH 7,9, 0,01 mM PLP, 2 mM EDTA) mit 2 mM PMSF resuspendiert und durch Behandlung mit Ultraschall aufgeschlossen. Nach Zentrifugation wurde die Zelldebris verworfen und der Überstand auf eine mit Puffer A äquilibrierte 500 ml DEAE Sepharose FF Säule aufgetragen. Die Säule wurde anschließend mit Puffer A gewaschen und die CGS mittels eines linear ansteigenden Salzgradienten (0 - 0,5 M (NH4)2SO4 in Puffer A) eluiert. CGS-haltige Fraktionen wurden vereinigt, auf 1 M (NH4)2SO eingestellt und auf eine mit 1 M (NH4) SO4 in Puffer A äquilibrierte 75 ml Phenylsepharose HP Säule aufgetragen. Die Säule wurde anschließend mit 1 M (NH )2SO in Puffer A gewaschen und die CGS mittels eines linear abfallenden Salzgradienten (1 - 0 M (NH )2SO in Puffer A) eluiert. CGS-haltige Fraktionen wurden vereinigt, mittels Ultrafiltration aufkonzentriert und durch Gelfiltration über eine mit Puffer B (10 mM Tris/HCI pH 7,9, 0,01 mM PLP) äquilibrierte Sephacryl S200 HR Säule bis zur offensichtlichen Homogenität endgereinigt.
Zur Diffraktionsanalyse geeignete Kristalle wurden durch Dampfdiffusion eines sitzenden Tropfenens bei 22° C gezüchtet. Die Proteinkonzentration, die zur Kristallisation verwendet wurde, war 4 mg/ml in Puffer B. Die Tropfen bestanden aus 3 μl der Proteinlösung und 2 μl einer Reservoirlösung, die 100 mM MES/NaOH pH 6,5, 200 mM Magnesiumacetat und 10% (w/v) Polyethylenglykol 8000 enthielt. Die Kristalle wuchsen innerhalb von 5 Tagen bis zu einer Größe von 0,4 x 0,3 x 0,2 mm heran. Die Kristalle zeigten die monoklinische Raumgruppe C2 und hatten Zellkonstanten von a = 310 A, b = 170 A, c = 162 Ä, α = 90°, ß = 90,1 °, γ = 90°.
Die den Inhibitor Vbdg. 1 enthaltenden Kristalle wurden durch Eintauchen in eine 10 mM Vbdg. 1 -Lösung für 48 h hergeteilt. Die den Inhibitor Vbdg. 2 enthaltenden Kristalle wurden durch Eintauchen in eine 10 mM Vbdg. 2-Lösung für 10 h hergetellt. Die den Inhibitor Vbdg. 3 enthaltenden Kristalle wurden durch Eintauchen in eine 5 mM Vbdg. 3-Lösung für 72 h hergetellt.
Beispiel 2: Kristallographie
Kristallographische Daten wurden auf einem MAR Research image plate detector (Hamburg, Deutschland) unter Verwendung von monochromatischer CuKα- Strahlung von einem rotierenden Anodenröntgenstrahlgenerator (Rigaku, Tokyo, Japan) gesammelt. Die Datenreduktion wurde mit DENZO (Otwinowski et al., (1993) DENZO: a film processing for macromolecular crystallography, Yale University, New Haven, USA) und SCALEPACK (Otwinowski et al., (1993) DENZO: a film processing for macromolecular crystallography, Yale University, New Haven, USA) durchgeführt. Die Strukturen wurde durch molekulare Ersetzungsverfahren (molecular replacement methods) mittels MOLREP (Vagin, A., Teplyakov, A., J. Appl. Cryst. 30 (1997), 1022-1025) unter Verwendung der Struktur des nativen Homotetramers der CGS aus Nicotiana tabacum (Steegborn, C. et al., J. Mol. Biol. 290 (1999), 983-996) ohne den Kofaktor PLP als Suchmodell gelöst. Rotations- und Translationssuche im Pattersonraum ergaben jeweils eine eindeutige Lösung mit drei Homotetrameren in der asymmetrischen Einheit. Die erhaltenen Elektronendichten wiesen deutliche Dichte sowohl für den Kofaktor PLP als auch für den jeweiligen Inhibitor auf. Die Qualität der Elektronendichten wurde durch zwölffaches Mitteln im realen Raum mit dem Programm AVE (Jones, T.A., (1992), Molecular Replacement (CCP4), 92-105. Daresbury Laboratory, Warrington) verbessert. Die nicht-kristallographischen Symmetrieoperatoren wurden mit LSQMAN (Kleywegt, G.J., Jones, T.A., ESF/CCP4 Newsletters 31 (1994), 9-14) bestimmt. Die Strukturmodelle wurden mit dem Programm O (Jones, T.A., Kjelgaard, M., (1991 ) O-The Manual, Uppsala, Schweden) in die gemittelten 2F0-FC und F0-Fc Elektronendichten gebaut. Die Verfeinerung der Modelle wurde mit XPLOR (Brünger, A.T., (1992) X-PLOR: A System for Crystallography and NMR, Yale University Press, New Haven, USA) durchgeführt, unter Verwendung der Parameter von Engh & Huber (Engh, R.A., Huber, R., Acta Cryst. Sect. A 47 (1991 ), 392-400). Parameter für die Inhibitoren wurden mit XPLO2D (Kleywegt, G.J., ESF/CCP4 Newsletter 31 (1995), 45-50) erzeugt. Abweichungen von den nicht- kristallographischen Symmetrien wurden eingeschränkt, außer für Bereiche, die an Tetramer- oder Kristallkontakten beteiligt sind. Der Fortgang der Verfeinerung wurde über den kristallographischen R-Faktor verfolgt, wobei 5 % der Strukturfaktoren dazu verwendet wurden, Rfree-Werte zu berechnen. In einer späten Phase der Verfeinerung wurde ein globaler anisotroper B-Faktor verfeinert, gefolgt von der Verfeinerung individueller isotroper B-Faktoren für die einzelnen Atome. Die Polypeptid kette konnte von Rest 50 bis 445 identifiziert werden. Die Stereochemie der Modelle wurde mit den Programmen XPLOR und PROCHECK (Laskowski, R.A. et al., J. Appl. Cryst. 26 (1993), 283-291 ) analysiert. Zum Vergleich der über nicht- kristallographische Symmetrie miteinander verwandten Moleküle, sowie der Inhibitor- Komplexe mit dem Liganden-freien Enzym, wurde das Programm LSQMAN eingesetzt. Beispiel 3: Struktur der rekombinanten CGS aus Nicotiana tabacum im Komplex mit dem Inhibitor Vbdg. 1.
Siehe Tabelle 1
Beispiel 4: Struktur der rekombinanten CGS aus Nicotiana tabacum im Komplex mit dem Inhibitor Vbdg. 2.
Siehe Tabelle 2
Beispiel 5: Struktur der rekombinanten CGS aus Nicotiana tabacum im Komplex mit dem Inhibitor Vbdg. 3.
Siehe Tabelle 3
Beispiel 6: Enzymtest
Die gemäß Beispiel 1 gereinigte CGS wurde in einem der folgenden Testsysteme zur Messung der Enzymaktivität verwendet.
Ein Testsystem zum Messen des anorganischen Phosphats, das in der CGS- Reaktion freigesetzt wird, enthielt 100 mM MOPS pH 7,5, 0,1 mM PLP, 1 mM HSerP, 1 mM L-Cystein und CGS in einem Gesamtvolumen von 100 μl. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wurde die CGS-Reaktion beendet indem entweder a) 100 μl einer Reagenzmischung enthaltend 62,3 μg Malachitgrün Hydrochlorid, 1 ,9 mg Ammoniumheptamolybdat, und 0,5 % (v/v) eines geeigneten Detergens (z.B. Triton X-100, Tween 80 oder Tergitol NPX) in 1 ,88 N Salzsäure zugegeben wurden; der entstandene Farbkomplex nach 1 min durch Zugabe von 50 μl einer 26 %igen (w/w) wäßrigen Lösung von Trinatriumzitratdihydrat stabilisiert wurde und nach 45 min Inkubation bei Raumtemperatur die Intensität des Farbkomplexes durch Messung der Extinktion bei 620 nm bestimmt wurde. Die Menge des freigesetzten anorganischen Phosphats wurde durch Vergleich mit einer Eichkurve bestimmt, die durch geeignete Mengen anorganischen Phosphats erhalten wird, indem die Differenz zwischen der Extinktion bei 620 nm zwischen einer vollständigen Mischung eines CGS-Testsystems und einem System ohne L-Cystein bestimmt wird; oder b) es wurden 100 μl eines Reagenzes, enthaltend 3 mg Ascorbinsäure, 0,5 mg Ammoniumheptamolybdat und 1 mg Natriumdodecylsulfat in 0,7 N Salzsäure zugegeben. Der entstandene Farbkomplex wurde nach 7 Minuten durch Zugabe von 50 μl einer 6 % (w/v) wäßrigen Lösung von Thnatriumzitratdihydrat stabilisiert und nach weiteren 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Intensität des Farbkomplexes durch Messung der Extinktion bei 620 nm bestimmt. Die Menge des freigesetzten anorganischen Phosphats wurde durch Vergleich mit einer Eichkurve bestimmt, die durch geeignete Mengen anorganischen Phosphats erhalten wird, indem die Differenz zwischen der Extinktion bei 620 nm zwischen einer vollständigen Mischung eines CGS-Testsystems und einem System ohne L-Cystein bestimmt wird.
Beispiel 7: Inhibition der CGS
Die gemäß Beispiel 1 gereinigte CGS wurde wie in Beispiel 6 beschrieben auf ihre in vitro Aktivität getestet. Die gemessene relative Aktivität des Ansatzes in Abwesenheit von Testsubstanzen wurde mit 100% festgelegt. Nach Zusatz von Vbdg. 1 , Vbdg. 2 und Vbdg. 3 (jeweils 0,1 mM) wurde die verbliebene Aktivität der CGS zu 25, 18 und 8 % ermittelt. Eine genaue kinetische Analyse der Enzyminhibition (Segel, I. H. (1975) Enzyme Kinetics, John Wiley, New York, USA) ergab, daß Vbdg. 1 die CGS kompetitiv in Bezug auf HSerP (K| = 0,20 mM) und unkompetitiv in Bezug auf L-Cystein (Kj = 0,46 mM) inhibiert. Vbdg. 2 inhibiert das Enzym ebenfalls kompetitiv in Bezug auf HSerP (Kj = 0,027 mM) und unkompetitiv in Bezug auf L-Cystein (Kι = 0,042 mM). Auch Vbdg. 3 inhibiert die CGS kompetitiv in Bezug auf HSerP (Kj = 0,0017 mM) und unkompetitiv in Bezug auf L-Cystein (Kj = 0,007 mM). Die Km-Werte für HSerP und L-Cystein wurden zu 7,1 und 0,23 mM bestimmt.
Beispiel 8: Lemna Test
Die phytotoxische Wirkung des CGS-Inhibitors Vbdg. 3 konnte in vivo durch Behandlung von Lemna Kulturen festgestellt werden.
Dazu wurde Lemna gibba in steriler Kulturlösung (0,4 g/l KNO3> 0,8 g/l CaCI2 * 2 H2O, 0,366 g/l MgSO4 * 7 H2O, 0,2 g/l KH2PO4, 2 ml/l Lösung I (2,23 g/l MnSO4 * 4 H2O, 83 mg/l KJ, 2,5 mg/l CoCI2 * 6 H2O, 0,86 g/l ZnSO4 * 7H2O, 2,5 mg/l CuSO4 * 5 H2O, 0,62 g/l H3BO3, 25 mg/l Na2MoO4 * 2 H2O) und 2 ml/l Lösung II (14,92 g/l Na- EDTA, 10,92 g/l FeSO4 * 7 H2O)) kultiviert. Jeweils 3 Pflanzen wurden unter sterilen Bedingungen in einen 100 ml Erlenmeyerkolben gesetzt, welcher mit 50 ml Kulturlösung, enthaltend den CGS-Inhibitor in einer Konzentration von 20 μM, gefüllt war. Die Kulturkolben wurden bei 25 °C im Abstand von 70 cm mit zwei 36 W Tageslicht-Leuchtstoffröhren beleuchtet (24 h Dauerlicht). Das Wachstum und das äußere Erscheinungsbild der Lemna-Pflanzen wurde über 7 Tage hinweg beobachtet und mit dem Wachstum und dem äußeren Erscheinungsbild von Lemna- Pflanzen verglichen, die in Kulturlösung ohne Inhibitor unter ansonsten identischen Bedingungen kultiviert wurden.
Bei einer Konzentration von 10 ppm war die phytotoxische Wirkung des CGS- Inhibitors Vbdg. 3 charkterisiert durch eine anfängliche Wachstumsdepression mit Chlorosen und Nekrosen neu gebildeter Gewebe. Nach längerer Einwirkung kam es zum kompletten Absterben der Pflanzen.
Tabellen
Erläuterungen zum PDB-Format
Folgende Zeile ist ein Beispiel für die Koordinaten eines Atoms; die darauffolgende Zeile weist den einzelnen Bestandteilen eine Zeile Buchstaben zu, anhand derer anschließend die Bedeutung der Bestandteile erläutert wird:
ATOM 1 N MET A 135 -64.138 -47.242 161.154 N
A: Art des Zeileneintrags („ATOM", „HETATM" = Koordinateneintrag, " HEADER" =
Überschrift)
B: fortlaufende Nummer des Atoms
C: graphische Bezeichnung des Atoms
D: Residuenkurzel = Aminosaurecode oder Kürzel für Molekulteil, z.B. „PLP"
E: Untereinheit
F: fortlaufende Nummer des Residuums (der Aminosäure)
G: X-Koordiante in Angstrom
H: Y-Koordiante in Angstrom
I: Z-Koordiante in Angstrom
J: chemisches Zeichen des Atoms
Tabelle 1: Ausgewählte Koordinaten aus der Röntgenstrukturanalyse des
Komplexes aus CGS und Vbdg.2 in PDB-Format.
HEADER APPS/PLP - CGS Komplex
ATOM 1 N ALA A 136 97.949 -44.481 70.931
N
ATOM 2 CA ALA A 136 96.532 -44.586 70.646
C
ATOM 3 CB ALA A 136 96.322 -45.358 69.368
C
ATOM 4 C ALA A 136 95.810 -45.271 71.779
C
ATOM 5 0 ALA A 136 94.593 -45.182 71.889
O ATOM SER A 137 96.564 -45.966 72.620
N
ATOM CA SER A 137 95.979 -46.670 73.755
C
ATOM 8 CB SER A 137 95.159 -47.864 73.272
C
ATOM 9 OG SER A 137 95.917 -49.059 73.340
0
ATOM 10 SER A 137 97.062 -47.158 74.702
C
ATOM 11 O SER A 137 98.207 -47.355 74.297
0
ATOM 12 N GLY A 138 96.700 -47.348 75.964
N
ATOM 13 CA GLY A 13? 97.671 -47.825 76.927
C
ATOM 14 GLY A 135 98.470 -48.975 76.343
C
ATOM 15 O GLY A 138 99.683 -48.875 76.15
0
ATOM 16 N MET A 139 97.776 -50.067 76.036
N
ATOM 17 CA MET A 139 98.398 -51.257 75.470
C
ATOM 18 CB MET A 139 97.336 -52.167 74.854
C
ATOM 19 CG MET A 139 96.763 -53.204 75.809
C
ATOM 20 SD MET A 139 97.976 -53.795 76.987
S
ATOM 21 CE MET A 139 99.233 -54.424 75.886
C
ATOM 22 MET A 139 99.424 -50.909 74.412
C
ATOM 23 O MET A 139 100.469 -51.540 74.320
0
ATOM 24 N CYS A 140 99.119 -49.911 73.59E
N
ATOM 25 CA CYS A 140 100.043 -49.494 72.557
C ATOM 26 CB CYS A 140 99.464 -48.294 71.795
C
ATOM 27 SG CYS A 140 100.375 -47.792 70.307
S
ATOM 28 CYS A 140 101.362 -49.116 73.22E
C
ATOM 29 O CYS A 140 102.422 -49.648 72.890
0
ATOM 30 N ALA A 141 101.272 -48.206 74.196
N
ATOM 31 CA ALA A 141 102.431 -47.727 74.941
C
ATOM 32 CB ALA A 141 101.973 -46.861 76.102
C
ATOM 33 ALA A 141 103.303 -48.872 75.449
C
ATOM 34 O ALA A 141 104.421 -49.068 74.970
O
ATOM 35 N SER A 142 102.799 -49.626 76.41?
N
ATOM 36 CA SER A 142 103.552 -50.750 76.962
C
ATOM 37 CB SER A 142 102.623 -51.670 77.759
C
ATOM 38 OG SER A 142 101.296 -51.177 77.781
O
ATOM 39 C SER A 142 104.210 -51.544 75.831
C
ATOM 40 O SER A 142 105.427 -51.753 75.810
O
ATOM 41 N THR A 143 103.381 -51.978 74.892
N
ATOM 42 CA THR A 143 103.821 -52.746 73.742
C
ATOM 43 CB THR A 143 102.715 -52.796 72.685
C
ATOM 44 OG1 THR A 143 101.643 -53.621 73.152
0
ATOM 45 CG2 THR A 143 103.247 -53.360 71.390
C ATOM 46 C THR A 143 105.063 -52.132 73.11E
C
ATOM 47 O THR A 143 106.139 -52.723 73.136
0
ATOM 48 N ASP A 161 101.038 -59.613 89.566
N
ATOM 49 CA ASP A 161 99.758 -58.937 89.442
C
ATOM 50 CB ASP A 161 99.456 -58.153 90.721
C
ATOM 51 CG ASP A 161 98.262 -58.710 91.479
C
ATOM 52 OD1 ASP A 161 98.396 -59.789 92.101
0
ATOM 53 OD2 ASP A 161 97.189 -58.069 91.454
O
ATOM 54 ASP A 161 99.727 -58.006 88.240
C
ATOM 55 O ASP A 161 99.362 -56.840 88.352
O
ATOM 56 N CYS A 162 100.121 -58.528 87.086
N
ATOM 57 CA CYS A 162 100.111 -57.747 85.855
C
ATOM 58 CB CYS A 162 101.033 -58.390 84.809
C
ATOM 59 SG CYS A 162 102.614 -57.538 84.516
S
ATOM 60 C CYS A 162 98.679 -57.722 85.322
C
ATOM 61 O CYS A 162 97.842 -58.534 85.71t
O
ATOM 62 N TYR A 163 98.390 -56.784 84.432
N
ATOM 63 CA TYR A 163 97.061 -56.707 83.850
C
ATOM 64 CB TYR A 163 96.815 -55.304 83.2i
C
ATOM 65 CG TYR A 163 95.889 -55.278 82.094
C ATOM 66 CD1 TYR A 163 94.561 -55.696 82.209
C
ATOM 67 CE1 TYR A 163 93.713 -55.709 81.104
C
ATOM 68 CD2 TYR A 163 96.348 -54.866 80.843
C
ATOM 69 CE2 TYR A 163 95.509 -54.874 79.732
C
ATOM 70 CZ TYR A 163 94.194 -55.298 79.867
C
ATOM 71 OH TYR A 163 93.371 -55.321 78.763
0
ATOM 72 TYR A 163 96.993 -57.754 82.734
C
ATOM 73 O TYR A 163 97.863 -57.800 81.856
0
ATOM 74 N ARG A 164 95.959 -58.590 82.780
N
ATOM 75 CA ARG A 164 95.748 -59.660 81.804
C
ATOM 76 CB ARG A 164 94.259 -59.786 81.490
C
ATOM 77 CG ARG A 164 93.901 -61.044 80.712
C
ATOM 78 CD ARG A 164 94.022 -62.280 81.584
C
ATOM 79 NE ARG A 164 94.240 -63.493 80.800
N
ATOM 30 CZ ARG A 164 93.265 -64.251 80.304
C
ATOM NH1 ARG A 164 91.995 -63.924 80.50?
N
ATOM 82 NH2 ARG A 164 93.563 -65.340 79.612
N
ATOM 13 C ARG A 164 96.518 -59.549 80.4?
C
ATOM 14 O ARG A 164 97.530 -60.219 80.290
0
ATOM 55 N LYS A 165 96.023 -58.704 79.590
N ATOM CA LYS A 165 96.639 -58.517 78.287
C
ATOM 17 CB LYS A 165 95.914 -57.416 77.51?
C
ATOM CG LYS A 165 95.031 -57.937 76.390
C
ATOM 19 CD LYS A 165 93.684 -58.423 76.900
C
ATOM 90 CE LYS A 165 93.258 -59.709 76.214
C
ATOM 91 NZ LYS A 165 91.778 -59.863 76.205
N
ATOM 92 LYS A 165 98.122 -58.199 78.35?
C
ATOM 93 0 LYS A 165 98.918 -58.801 77.640
0
ATOM 94 N THR A 16( 98.4? -57.259 79.21?
N
ATOM 95 CA THR A 166 99.903 -56.890 79.346
C
ATOM 96 CB THR A 166 100.139 -55.964 80.54?
C
ATOM 97 0G1 THR A U 99.500 -54.701 80.312
0
ATOM 98 CG2 THR A 166 101.631 -55.735 80.756
C
ATOM 99 C THR A 166 100.718 -58.152 79.530
C
ATOM 100 O THR A 166 101.820 -58.281 78.99?
0
ATOM 101 N PHE A 205 109.769 -54.011 85.001
N
ATOM 102 CA PHE A 205 108.519 -53.342 84.698
C
ATOM 103 CB PHE A 205 108.205 -53.483 83.211
C
ATOM 104 CG PHE A 205 106.791 -53.143 82.85?
C
ATOM 105 CD1 PHE A 205 106.449 -51.849 82.499
C ATOM 106 CD2 PHE A 205 105 . 796 -54 . 116 82 . 892
C
ATOM 107 CE1 PHE A 205 105.136 -51.524 82.177
C
ATOM 108 CE2 PHE A 205 104.478 -53.804 82.572
C
ATOM 109 CZ PHE A 205 104.146 -52.507 82.214
C
ATOM 110 C PHE A 205 107.345 -53.855 85.499
C
ATOM 111 0 PHE A 205 107.143 -55.066 85.631
O
ATOM 112 N THR A 206 106.557 -52.920 86.011
N
ATOM 113 CA THR A 206 105.386 -53.276 86.783
C
ATOM 114 CB THR A 206 105.766 -53.829 88.145
C
ATOM 115 OG1 THR A 206 104.573 -54.148 88.871
0
ATOM 116 CG2 THR A 206 106.572 -52.799 88.924
C
ATOM 117 C THR A 206 104.503 -52.068 87.011
C
ATOM 118 O THR A 206 104.909 -50.937 86.760
O
ATOM 119 N GLU A 207 103.291 -52.320 87.489
N
ATOM 120 CA GLU A 207 102.344 -51.258 87.76?
C
ATOM 121 CB GLU A 207 100.996 -51.587 87.143
C
ATOM 122 CG GLU A 207 100.676 -53.062 87.151
C
ATOM 123 CD GLU A 207 99.426 -53.390 86.356
C
ATOM 124 OE1 GLU A 207 99.435 -53.194 85.11?
O
ATOM 125 OE2 GLU A 207 98.432 -53.844 86.966
O ATOM 126 C GLU A 207 102 . 188 -51 . 125 89 . 280
C
ATOM 127 O GLU A 207 102.192 -52.124 90.001
0
ATOM 128 N SER A 20? 102.058 -49.891 89.754
N
ATOM 129 CA SER A 208 101.888 -49.636 91.177
C
ATOM 130 CB SER A 20? 103.248 -49.424 91.843
C
ATOM 131 OG SER A 20? 103.096 -49.145 93.224
0
ATOM 132 SER A 20? 101.012 -48.399 91.364
C
ATOM 133 O SER A 208 101.393 -47.299 90.973
0
ATOM 134 N PRO A 209 99.826 -48.562 91.966
N
ATOM 135 CD PRO A 209 98.923 -47.420 92.183
C
ATOM 136 CA PRO A 209 99.257 -49.813 92.479
C
ATOM 137 CB PRO A 209 97.895 -49.397 93.034
C
ATOM 138 CG PRO A 209 97.990 -47.922 93.230
C
ATOM 139 PRO A 209 99.123 -50.877 91.400
C
ATOM 140 O PRO A 209 99.336 -50.601 90.220
0
ATOM 141 N THR A 210 98.759 -52.088 91.813
N
ATOM 142 CA THR A 210 98.596 -53.203 90.893
C
ATOM 143 CB THR A 210 99.177 -54.487 91.509
C
ATOM 144 OG1 THR A 210 99.929 -55.190 90.51?
O
ATOM 145 CG2 THR A 210 98.072 -55.389 92.02?
C ATOM 146 C THR A 210 97.125 -53.433 90.539
C
ATOM 147 O THR A 210 96.241 -52.756 91.056
0
ATOM 148 N ASN A 211 96.869 -54.387 89.651
N
ATOM 149 CA ASN A 211 95.504 -54.711 89.249
C
ATOM 150 CB ASN A 211 95.248 -54.290 87.798
C
ATOM 151 CG ASN A 211 93.829 -54.615 87.337
C
ATOM 152 OD1 ASN A 211 93.142 -53.771 86.760
0
ATOM 153 ND2 ASN A 211 93.387 -55.842 87.589
N
ATOM 154 ASN A 211 95.221 -56.203 89.383
C
ATOM 155 O ASN A 211 95.959 -57.041 88.871
0
ATOM 156 N PRO A 212 94.125 -56.551 90.05?
N
ATOM 157 CD PRO A 212 93.693 -57.953 90.16?
C
ATOM 158 CA PRO A 212 93.150 -55.658 90.685
C
ATOM 159 CB PRO A 212 91.826 -56.323 90.353
C
ATOM 160 CG PRO A 212 92.178 -57.828 90.278
C
ATOM 161 PRO A 212 93.329 -55.502 92.203
C
ATOM 162 O PRO A 212 92.569 -54.782 92.852
0
ATOM 163 N ASP A 236 103.944 -48.505 85.867
N
ATOM 164 CA ASP A 236 102.637 -48.243 85.297
C
ATOM 165 CB ASP A 236 102.037 -49.538 84.739
C ATOM 166 CG ASP A 236 100 . 704 -49 . 314 84 . 032
C
ATOM 167 OD1 ASP A 236 100.071 -48.258 84.25?
O
ATOM 168 OD2 ASP A 236 100.289 -50.200 83.251
O
ATOM 169 ASP A 236 101.758 -47.678 86.411
C
ATOM 170 O ASP A 236 100.996 -48.401 87.053
0
ATOM 171 N GLY A 237 101.883 -46.376 86.639
N
ATOM 172 CA GLY A 237 101.103 -45.727 87.671
C
ATOM 173 C GLY A 237 99.703 -45.343 87.235
C
ATOM 174 O GLY A 237 99.155 -44.359 87.724
O
ATOM 175 N THR A 238 99.116 -46.112 86.325
N
ATOM 176 CA THR A 238 97.770 -45.826 85.843
C
ATOM 177 CB THR A 238 97.219 -47.001 85.005
C
ATOM 178 OG1 THR A 238 97.732 -46.912 83.668
O
ATOM 179 CG2 THR A 23? 95.692 -46.977 84.969
C
ATOM 180 C THR A 23? 96.825 -45.560 87.004
C
ATOM 181 O THR A 23? 96.251 -44.484 87.106
O
ATOM 182 N PHE Ä 239 96.679 -46.543 87.881
N
ATOM 183 CA PHE A 239 95.794 -46.424 89.03?
C
ATOM 184 CB PHE A 239 95.833 -47.715 89.859
C
ATOM 185 CG PHE A 239 94.912 -48.783 89.357
C ATOM 186 CD1 PHE A 239 93.547 -48.707 89.590
C
ATOM 187 CD2 PHE A 239 95.413 -49.874 88.65?
C
ATOM 188 CE1 PHE A 239 92.696 -49.702 89.131
C
ATOM 189 CE2 PHE A 239 94.566 -50.873 88.196
C
ATOM 190 CZ PHE A 239 93.208 -50.788 88.432
C
ATOM 191 PHE A 239 96.155 -45.253 89.955
C
ATOM 192 0 PHE A 239 95.282 -44.587 90.51?
0
ATOM 193 N ALA A 240 97.451 -45.023 90.106
N
ATOM 194 CA ALA A 240 97.954 -43.965 90.961
C
ATOM 195 CB ALA A 240 99.464 -44.066 91.070
C
ATOM 196 C ALA A 240 97.575 -42.587 90.469
C
ATOM 197 O ALA A 240 96.944 -41.822 91.189
O
ATOM 198 N LEU A 256 104.398 -44.828 82.873
N
ATOM 199 CA LEU A 256 103.415 -44.807 81.800
C
ATOM 200 CB LEU A 256 103.684 -45.944 80.810
C
ATOM 201 CG LEU A 256 103.189 -47.338 81.1?
C
ATOM 202 CD1 LEU A 256 101.773 -47.531 80.694
C
ATOM 203 CD2 LEU A 256 104.105 -48.381 80.57?
C
ATOM 204 C LEU A 256 102.006 -44.921 82.370
C
ATOM 205 O LEU A 256 101.801 -45.513 83.422
O ATOM 206 N HIS A 257 101.040 -44.344 81.669
N
ATOM 207 CA HIS A 257 99.651 -44.372 82.109
C
ATOM 208 CB HIS A 257 99.226 -43.008 82.654
C
ATOM 209 CG HIS A 257 100.011 -42.540 83.833
C
ATOM 210 CD2 HIS A 257 101.253 -42.009 83.926
C
ATOM 211 ND1 HIS A 257 99.500 -42.550 85.112
N
ATOM 212 CE1 HIS A 257 100.392 -42.042 85.942
C
ATOM 213 NE2 HIS A 257 101.464 -41.707 85.249
N
ATOM 214 HIS A 257 98.717 -44.698 80.960
C
ATOM 215 O HIS A 257 99.068 -44.550 79.787
0
ATOM 216 N SER A 25? 97.511 -45.121 81.313
N
ATOM 217 CA SER A 25? 96.496 -45.414 80.326
C
ATOM 218 CB SER A 25? 95.810 -46.739 80.643
C
ATOM 219 OG SER A 25? 94.513 -46.790 80.074
O
ATOM 220 SER A 25? 95.515 -44.263 80.456
C
ATOM 221 O SER A 25? 94.553 -44.347 81.209
O
ATOM 222 N ALA A 259 95.780 -43.177 79.73?
N
ATOM 223 CA ALA A 259 94.923 -41.995 79.777
C
ATOM 224 CB ALA A 259 95.322 -41.028 78.6(
C
ATOM 225 C ALA A 259 93.449 -42.370 79.646
C ATOM 226 O ALA A 259 92.560 -41.599 80.005
0
ATOM 227 N THR A 260 93.200 -43.564 79.129
N
ATOM 228 CA THR A 260 91.851 -44.065 78.951
C
ATOM 229 CB THR A 260 91.872 -45.554 78.574
C
ATOM 230 OG1 THR A 260 92.747 -45.751 77.460
0
ATOM 231 CG2 THR A 260 90.487 -46.034 78.216
C
ATOM 232 THR A 260 91.053 -43.928 80.236
C
ATOM 233 O THR A 260 19.855 -43.636 80.206
0
ATOM 234 N LYS A 261 91.734 -44.125 81.364
N
ATOM 235 CA LYS A 261 91.106 -44.089 82.683
C
ATOM 236 CB LYS A 261 91.859 -45.031 83.625
C
ATOM 237 CG LYS A 261 92.337 -46.318 82.967
C
ATOM 238 CD LYS A 261 91.199 -47.310 82.827
C
ATOM 239 CE LYS A 261 91.370 -48.188 81.601
C
ATOM 240 NZ LYS A 261 90.421 -49.337 81.616
N
ATOM 241 LYS A 261 90.925 -42.742 83.375
C
ATOM 242 O LYS A 261 19.943 -42.037 83.134
0
ATOM 243 N VAL A 269 37.192 -42.120 75.4!
N
ATOM 244 CA VAL A 269 88.406 -42.059 74.680
C
ATOM 245 CB VAL A 269 934 -40.607 74.616
C ATOM 246 CGI VAL A 269 1.975 -40.010 76.012
C
ATOM 247 CG2 VAL A 269 90.313 -40.575 73.986
C
ATOM 248 VAL A 269 19.522 -42.953 75.212
C
ATOM 249 O VAL A 269 19.679 -43.111 76.420
0
ATOM 250 N LEU A 270 90.293 -43.535 74.300
N
ATOM 251 CA LEU A 270 91.412 -44.391 74.670
C
ATOM 252 CB LEU A 270 91.423 -45.672 73.843
C
ATOM 253 CG LEU A 270 90.130 -46.459 73.679
C
ATOM 254 CD1 LEU A 270 90.467 -47.927 73.565
C
ATOM 255 CD2 LEU A 270 19.203 -46.210 74.850
C
ATOM 256 LEU A 270 92.688 -43.624 74.389
C
ATOM 257 O LEU A 270 92.741 -42.826 73.454
0
ATOM 258 N ALA A 271 93.716 -43.868 75.193
N
ATOM 259 CA ALA A 271 94.983 -43.185 75.007
C
ATOM 260 CB ALA A 271 94.827 -41.706 75.307
C
ATOM 261 C ALA A 271 96.100 -43.763 75.856
C
ATOM 262 O ALA A 271 95.920 -44.050 77.039
0
ATOM 263 N GLY A 272 97.256 -43.941 75.226
N
ATOM 264 CA GLY A 272 98.420 -44.452 75.91?
C
ATOM 265 GLY A 272 99.282 -43.247 76.229
C ATOM 266 0 GLY A 272 99.155 -42.209 75.571
0
ATOM 267 N CYS A 273 100.161 -43.371 77.215
N
ATOM 268 CA CYS A 273 101.003 -42.249 77.590
C
ATOM 269 CB CYS A 273 100.169 -41.279 78.424
C
ATOM 270 SG CYS A 273 101.033 -40.480 79.749
S
ATOM 271 CYS A 273 102.239 -42.694 78.360
C
ATOM 272 O CYS A 273 102.141 -43.440 79.32!
O
ATOM 273 N ALA A 386 10.742 -52.982 83.491
N
ATOM 274 CA ALA A 386 11.615 -52.961 82.332
C
ATOM 275 CB ALA A 386 11.216 -51.811 81.43^
C
ATOM 276 ALA A 386 13.080 -52.820 82.740
C
ATOM 277 O ALA A 386 13.392 -52.598 83.913
O
ATOM 278 N PRO A 387 14.003 -52.963 81.776
N
ATOM 279 CD PRO A 387 13.760 -53.273 80.35?
C
ATOM 280 CA PRO A 387 15.437 -52.839 82.066
C
ATOM 281 CB PRO A 387 16.117 -53.391 80.815
C
ATOM 282 CG PRO A 387 15.008 -53.967 79.961
C
ATOM 283 C PRO A 387 15.819 -51.383 82.311
C
ATOM 284 O PRO A 387 14.953 -50.544 82.567
O
ATOM 285 N SER A 388 17.112 -51.085 82.230
N ATOM 286 CA SER A 38? 17.590 -49.719 82.436
C
ATOM 287 CB SER A 3? 16.980 -48.793 81.37?
C
ATOM 288 OG SER A 388 17.524 -47.485 81.459
0
ATOM 289 SER A 3? 17.287 -49.163 83.834
C
ATOM 290 0 SER A 3? 16.629 -49.814 84.653
0
ATOM 291 N PHE A 389 17.768 -47.948 84.090
N
ATOM 292 CA PHE A 389 37.569 -47.290 85.377
C
ATOM 293 CB PHE A 389 .186 -48.136 86.480
C
ATOM 294 CG PHE A 389 19.635 -48.395 86.277
C
ATOM 295 CD1 PHE A 389 90.578 -47.457 86.669
C
ATOM 296 CD2 PHE A 389 90.062 -49.559 85.65?
C
ATOM 297 CE1 PHE A 389 91.935 -47.671 86.444
C
ATOM 298 CE2 PHE A 389 91.419 -49.785 85.42?
C
ATOM 299 CZ PHE A 389 92.356 -48.837 85.822
C
ATOM 300 C PHE A 389 .230 -45.914 85.391
C
ATOM 301 O PHE A 389 39.037 -45.593 84.524
0
ATOM 302 N ILE A 395 11.746 -47.523 87.853
N
ATOM 303 CA ILE A 395 11.723 -48.813 87.168
C
ATOM 304 CB ILE A 395 12.720 -48.827 85.981
C
ATOM 305 CG2 ILE A 395 32.578 -50.121 85.1?
C ATOM 306 CGI ILE A 395 32.473 -47.617 85.075
C
ATOM 307 CD1 ILE A 395 13.641 -47.274 84.170
C
ATOM 308 ILE A 395 82.069 -49.979 88.087
C
ATOM 309 O ILE A 395 82.891 -49.842 89.001
0
ATOM 310 N ASP A 397 12.523 -54.556 88.12?
N
ATOM 311 CA ASP A 397 32.735 -55.753 17.321
C
ATOM 312 CB ASP A 397 13.707 -55.464 86.176
C
ATOM 313 CG ASP A 397 35.141 -55.712 86.559
C
ATOM 314 OD1 ASP A 397 15.538 -55.275 87.659
0
ATOM 315 OD2 ASP A 397 15.872 -56.342 85.765
O
ATOM 316 ASP A 397 33.267 -56.898 88.161
C
ATOM 317 O ASP A 397 13.840 -56.685 89.226
0
ATOM 318 N PRO A 399 15.880 -59.348 87.707
N
ATOM 319 CD PRO A 399 86.195 -58.228 88.608
C
ATOM 320 CA PRO A 399 87.078 -59.806 87.008
C
ATOM 321 CB PRO A 399 186 -59.544 88.018
C
ATOM 322 CG PRO A 399 37.689 -58.359 88.821
C
ATOM 323 C PRO A 399 37.023 -61.264 86.571
C
ATOM 324 O PRO A 399 37.367 -61.588 85.434
O
ATOM 325 N ILE A 401 34.634 -63.102 85.719
N ATOM 326 CA ILE A 401 13.842 -63.189 84.499
C
ATOM 327 CB ILE A 401 32.362 -62.940 84.797
C
ATOM 328 CG2 ILE A 401 11.533 -63.211 83.575
C
ATOM 329 CGI ILE A 401 11.907 -63.835 85.937
C
ATOM 330 CD1 ILE A 401 10.751 -63.265 86.697
C
ATOM 331 ILE A 401 34.292 -62.139 83.492
C
ATOM 332 O ILE A 401 84.608 -62.438 82.341
O
ATOM 333 N MET A 402 34.311 -60.898 83.953
N
ATOM 334 CA MET A 402 14.690 -59.770 83.127
C
ATOM 335 CB MET A 402 14.878 -58.524 83.996
C
ATOM 336 CG MET A 402 14.665 -57.230 83.236
C
ATOM 337 SD MET A 402 13.692 -57.475 11.731
S
ATOM 338 CE MET A 402 12.440 -56.238 81.936
C
ATOM 339 MET A 402 35.928 -59.966 82.271
C
ATOM 340 O MET A 402 35.931 -59.586 81.107
O
ATOM 341 N SER A 403 86.982 -60.552 82.825
N
ATOM 342 CA SER A 403 88.200 -60.724 82.040
C
ATOM 343 CB SER A 403 19.133 -59.525 82.274
C
ATOM 344 OG SER A 403 ,468 -58.471 82.957
O
ATOM 345 SER A 403 1.966 -62.026 82.285
C ATOM 346 O SER A 403 90.167 -62.107 82.001
0
ATOM 347 N TYR A 404 .280 -63.046 82.793
N
ATOM 348 CA TYR A 404 18.930 -64.322 83.062
C
ATOM 349 CB TYR A 404 19.456 -64.342 84.493
C
ATOM 350 CG TYR A 404 90.711 -63.528 84.691
C
ATOM 351 CD1 TYR A 404 90.643 -62.200 85.10?
C
ATOM 352 CE1 TYR A 404 91.804 -61.449 85.331
C
ATOM 353 CD2 TYR A 404 91.971 -64.092 84.494
C
ATOM 354 CE2 TYR A 404 93.137 -63.353 84.714
C
ATOM 355 CZ TYR A 404 93.045 -62.033 15.134
C
ATOM 356 OH TYR A 404 94.183 -61.297 85.376
0
ATOM 357 TYR A 404 1.004 -65.510 82.847
C
ATOM 358 O TYR A 404 18.374 -66.651 83.11?
0
ATOM 359 N ARG A 423 15.387 -55.607 91.721
N
ATOM 360 CA ARG A 423 16.186 -54.407 91.522
C
ATOM 361 CB ARG A 423 17.083 -54.568 90.292
C
ATOM 362 CG ARG A 423 88.396 -53.830 90.402
C
ATOM 363 CD ARG A 423 549 -52.825 89.289
C
ATOM 364 NE ARG A 423 19.240 -53.419 88.155
N
ATOM 365 CZ ARG A 423 1.774 -53.423 86.911
C ATOM 366 NH1 ARG A 423 37.606 -52.859 86.62?
N
ATOM 367 NH2 ARG A 423 19.475 -54.006 85.950
N
ATOM 368 ARG A 423 35.289 -53.203 91.340
C
ATOM 369 O ARG A 423 14.588 -53.090 90.339
0
ATOM 370 N SER C 85 34.493 -45.352 75.852
N
ATOM 371 CA SER C 85 15.694 -46.129 76.115
C
ATOM 372 CB SER C 85 16.496 -45.498 77.24!
C
ATOM 373 OG SER C 35.739 -45.456 78.441
0
ATOM 374 SER C 85 35.328 -47.557 76.484
C
ATOM 375 0 SER C 85 16.187 -48.435 76.509
0
ATOM 376 N ALA C 86 84.050 -47.790 76.766
N
ATOM 377 CA ALA C 86 13.598 -49.123 77.134
C
ATOM 378 CB ALA C 86 13.964 -49.409 78.574
C
ATOM 379 C ALA C 86 32.102 -49.316 76.930
C
ATOM 380 O ALA C 86 31.359 -48.354 76.760
0
ATOM 381 N PHE C 98 77.204 -63.048 76.601
N
ATOM 382 CA PHE C 98 78.194 -62.494 75.686
C
ATOM 383 CB PHE C 98 78.469 -61.024 76.00?
C
ATOM 384 CG PHE C 98 79.847 -60.567 75.60?
C
ATOM 385 CD1 PHE C 98 30.244 -60.593 74.27!
C ATOM 386 CD2 PHE C 9? 10.755 -60.132 76.565
C
ATOM 387 CE1 PHE C 98 11.528 -60.197 73.905
C
ATOM 388 CE2 PHE C 9? 12.042 -59.733 76.202
C
ATOM 389 CZ PHE C 98 32.428 -59.767 74.
C
ATOM 390 C PHE C 98 79.500 -63.266 75.75'
C
ATOM 391 O PHE C 98 10.018 -63.712 74.733
0
ATOM 392 N LYS C 99 80.032 -63.408 76.966
N
ATOM 393 CA LYS C 99 11.289 -64.121 77.177
C
ATOM 394 CB LYS C 99 11.651 -64.098 78.661
C
ATOM 395 CG LYS C 99 12.302 -62.805 79.105
C
ATOM 396 CD LYS C 99 13.697 -62.681 78.520
C
ATOM 397 CE LYS C 99 34.234 -61.267 78.646
C
ATOM 398 NZ LYS C 99 15.708 -61.265 78.857
N
ATOM 399 LYS C 99 11.229 -65.565 76.67?
C
ATOM 400 O LYS C 99 12.254 -66.155 76.334
0
ATOM 401 N PHE C 106 30.988 -55.205 72.04?
N
ATOM 402 CA PHE C 106 32.395 -54.894 71.832
C
ATOM 403 CB PHE C 106 32.532 -53.505 71.226
C
ATOM 404 CG PHE C 106 11.777 -53.334 69.949
C
ATOM 405 CD1 PHE C 106 32.186 -53.989 68.797
C ATOM 406 CD2 PHE C 106 30.656 -52.516 69.894
C
ATOM 407 CE1 PHE C 106 11.492 -53.834 67.604
C
ATOM 408 CE2 PHE C 106 79.955 -52.355 68.704
C
ATOM 409 CZ PHE C 106 10.376 -53.017 67.55?
C
ATOM 410 C PHE C 106 13.151 -54.954 73.153
C
ATOM 411 O PHE C 106 14.375 -55.042 73.17!
0
ATOM 412 N GLU C 107 12.401 -54.914 74.247
N
ATOM 413 CA GLU C 107 32.973 -54.954 75.586
C
ATOM 414 CB GLU C 107 13.835 -56.209 75.776
C
ATOM 415 CG GLU C 107 14.398 -56.372 77.191
C
ATOM 416 CD GLU C 107 15.298 -57.591 77.341
C
ATOM 417 OE1 GLU C 107 043 -57.658 78.342
0
ATOM 418 OE2 GLU C 107 85.264 -58.482 76.462
O
ATOM 419 GLU C 107 13.817 -53.717 75.834
C
ATOM 420 O GLU C 107 13.390 -52.787 76.517
0
ATOM 421 N TYR C 10? 15.016 -53.711 75.269
N
ATOM 422 CA TYR C 10? 15.932 -52.595 75.440
C
ATOM 423 CB TYR C 10? 37.274 -53.119 75.952
C
ATOM 424 CG TYR C 10? 1.170 -52.084 76.600
C
ATOM 425 CD1 TYR C 10? 37.695 -51.239 77.603
C ATOM 426 CE1 TYR C 108 ,536 -50.300 78.204
C
ATOM 427 CD2 TYR C 10? 19.506 -51.965 76.216
C
ATOM 428 CE2 TYR C 108 90.350 -51.036 76.807
C
ATOM 429 CZ TYR C 10? 89.863 -50.207 77.795
C
ATOM 430 OH TYR C 108 90.704 -49.274 78.354
O
ATOM 431 TYR C 108 16.121 -51.866 74.11?
C
ATOM 432 O TYR C 108 16.048 -52.472 73.051
0
ATOM 433 N GLY C 109 16.362 -50.562 74.191
N
ATOM 434 CA GLY C 109 16.558 -49.791 72.982
C
ATOM 435 GLY C 109 87.690 -50.316 72.113
C
ATOM 436 O GLY C 109 17.598 -50.319 70.890
O
ATOM 437 N ARG C 110 ,767 -50.771 72.739
N
ATOM 438 CA ARG C 110 19.906 -51.270 71.986
C
ATOM 439 CB ARG C 110 91.058 -51.615 72.930
C
ATOM 440 CG ARG C 110 92.432 -51.308 72.357
C
ATOM 441 CD ARG C 110 93.503 -52.179 72.986
C
ATOM 442 NE ARG C 110 93.650 -51.921 74.415
N
ATOM 443 CZ ARG C 110 93.324 -52.791 75.364
C
ATOM 444 NH1 ARG C 110 92.829 -53.977 75.035
N
ATOM 445 NH2 ARG C 110 93.500 -52.481 76.640
N ATOM 446 C ARG C 110 19.556 -52.488 71.160 c
ATOM 147 O ARG C 110 90.338 -52.910 70.310
O
ATOM 448 N TYR C 111 1.379 -53.052 71.400
N
ATOM 449 CA TYR C 111 37.971 -54.243 70.671
C
ATOM 450 CB TYR C 111 17.409 -55.274 71.647
C
ATOM 451 CG TYR C 111 38.360 -55.591 72.779
C
ATOM 452 CD1 TYR C 111 19.744 -55.487 72.605
C
ATOM 453 CE1 TYR C 111 90.625 -55.775 73.644
C
ATOM 454 CD2 TYR C 111 17.883 -55.993 74.026
C
ATOM 455 CE2 TYR C 111 1.758 -56.284 75.071
C
ATOM 456 CZ TYR C 111 90.126 -56.174 74.874
C
ATOM 457 OH TYR C 111 90.997 -56.467 75.900
O
ATOM 458 TYR C 111 16.966 -53.954 69.572
C
ATOM 459 O TYR C 111 16.782 -54.761 68.660
O
ATOM 460 N HIS C 289 94.091 -56.498 68.991
N
ATOM 461 CA HIS C 289 93.457 -56.267 70.281
C
ATOM 462 CB HIS C 289 92.459 -57.385 70.576
C
ATOM 463 CG HIS C 289 91.194 -57.278 69.791
C
ATOM 464 CD2 HIS C 289 90.736 -56.303 68.972
C
ATOM 465 ND1 HIS C 289 90.227 -58.260 69.799
N ATOM 466 CE1 HIS C 289 19.228 -57.893 69.016
C
ATOM 467 NE2 HIS C 289 19.511 -56.710 68.503
N
ATOM 468 C HIS C 289 94.470 -56.165 71.419
C
ATOM 469 O HIS C 289 94.120 -55.825 72.547
O
ATOM 470 N ILE C 290 95.729 -56.452 71.121
N
ATOM 471 CA ILE C 290 96.759 -56.388 72.13?
C
ATOM 472 CB ILE C 290 97.560 -57.694 72.195
C
ATOM 473 CG2 ILE C 290 98.787 -57.520 73.062
C
ATOM 474 CGI ILE C 290 96.685 -58.809 72.759
C
ATOM 475 CD1 ILE C 290 96.987 -60.165 72.170
C
ATOM 476 ILE C 290 97.708 -55.239 71.864
C
ATOM 477 O ILE C 290 98.066 -54.493 72.774
O
ATOM 478 N LEU C 291 98.116 -55.093 70.609
N
ATOM 479 CA LEU C 291 99.031 -54.022 70.251
C
ATOM 480 CB LEU C 291 99.500 -54.202 68.803
C
ATOM 481 CG LEU C 291 100.206 -55.536 68.493
C
ATOM 482 CD1 LEU C 291 100.998 -55.418 67.200
C
ATOM 483 CD2 LEU C 291 101.130 -55.921 69.63?
C
ATOM 484 C LEU C 291 98.347 -52.676 70.456
C
ATOM 485 O LEU C 291 99.001 -51.636 70.521
O ATOM 486 N GLY C 292 97.022 -52.717 70.565
N
ATOM 487 CA GLY C 292 96.236 -51.518 70.807
ATOM 488 C GLY C 292 96.445 -50.315 69.906
C
ATOM 489 O GLY C 292 96.805 -49.231 70.373
O
ATOM 490 N GLY C 293 96.216 -50.505 .611
N
ATOM 491 CA GLY C 293 96.355 -49.415 67.667
ATOM 492 C GLY C 293 94.970 -49.034 67.185
C
ATOM 493 O GLY C 293 94.784 -48.627 66.038
O
HETATM 494 Nl PLP 500 97.604 -50.191 82.524
N
HETATM 495 C2 PLP 500 96.757 -50.619 83.560
C
HETATM 496 C2A PLP 500 97.322 -50.438 84.93(
C
HETATM 497 C3 PLP 500 95.478 -51.159 83.202
C
HETATM 498 03 PLP 500 94.671 -51.571 84.152
0
HETATM 499 C4 PLP 500 95.149 -51.217 81.760
C
HETATM 500 C4A PLP 500 93.775 -51.749 81.293
C
HETATM 501 C5 PLP 500 96.144 -50.727 80.762
C
HETATM 502 C6 PLP 500 97.344 -50.227 81.180
C
HETATM 503 C5A PLP 500 95.794 -50.798 79.254
C
HETATM 504 0P4 PLP 500 95.524 -49.519 78.713
0
HETATM 505 P PLP 500 94.508 -49.397 77.422
P HETATM 506 OPl PLP 500 94.240 -47.941 77.241
0
HETATM 507 0P2 PLP 500 93.271 -50.104 77.710
0
HETATM 508 OP3 PLP 500 95.226 -50.050 76.297
0
HETATM 509 N4A APPS 600 92.710 -52.185 82.060
N
HETATM 510 CAI APPS 600 91.590 -52.631 81.864
C
HETATM 511 CBC APPS 600 90.663 -52.974 83.062
C
HETATM 512 02B APPS 600 91.105 -53.842 83.962
0
HETATM 513 03B APPS 600 1.535 -52.471 83.234
O
HETATM 514 CBI APPS 600 91.070 -52.841 80.469
C
HETATM 515 CGI APPS 600 90.842 -54.089 80.091
C
HETATM 516 CEI APPS 600 90.289 -54.465 78.762
C
HETATM 517 PG APPS 600 19.143 -55.874 79.174
F
HETATM 518 OGl APPS 600 19.942 -57.025 79.980
0
HETATM 519 0G2 APPS 600 38.655 -56.485 77.913
0
HETATM 520 0G3 APPS 600 88.140 -55.298 80.109
0
Tabelle 2: Ausgewählte Koordinaten aus der Röntgenstrukturanalyse des Komplexes aus CGS und Vbdg.l in PDB-Format. HEADER PPCS/PLP CGS Komplex α
ATOM 1 N ALA A 136 78.382 -26.015 98.027
N
ATOM 2 CA ALA A 136 77.552 -24.823 98.030
C
ATOM 3 CB ALA A 136 76.300 -25.067 97.201
C
ATOM 4 C ALA A 136 77.167 -24.392 99.438
C
ATOM 5 O ALA A 136 77.003 -23.202 99.704
O
ATOM 6 N SER A 137 77.012 -25.353 100.339
N
ATOM 7 CA SER A 137 76.637 -25.033 101.711
C
ATOM 8 CB SER A 137 75.139 -24.718 101.781
C
ATOM 9 OG SER A 137 74.358 -25.861 101.477
O
ATOM 10 C SER A 137 76.976 -26.151 102.694
C
ATOM 11 O SER A 137 77.372 -27.247 102.293
O
ATOM 12 N GLY A 138 76.830 -25.859 103.983
N
ATOM 13 CA GLY A 138 77.109 -26.854 105.000
C
ATOM 14 C GLY A 138 7 6 . 197 -28 . 057 104 . 863
C
ATOM 15 O GLY A 138 76.645 -29.197 104.962
O
ATOM 16 N MET A 139 74.913 -27.795 104.632
N
ATOM 17 CA MET A 139 73.911 -28.843 104.474
C ATOM 18 CB MET A 139 72 . 539 -28 . 225 104 . 200
C
ATOM 19 CG MET A 139 71.755 -27.828 105.442
C
ATOM 20 SD MET A 139 71.833 -29.040 106.772
S
ATOM 21 CE MET A 139 71.295 -30.514 105.924
C
ATOM 22 MET A 139 74.288 -29.756 103.320
C
ATOM 23 O MET A 139 74.174 -30.976 103.406
0
ATOM 24 N CYS A 140 74.735 -29.148 102.232
N
ATOM 25 CA CYS A 140 75.134 -29.901 101.055
C
ATOM 26 CB CYS A 140 75.596 -28.944 99.957
C
ATOM 27 SG CYS A 140 75.999 -29.741 98.401
S
ATOM 28 CYS A 140 76.263 -30.852 101.424
C
ATOM 29 O CYS A 140 76.312 -31.990 100.963
0
ATOM 30 N ALA A 141 77.166 -30.375 102.271
N
ATOM 31 CA ALA A 141 78.299 -31.168 102.708
C
ATOM 32 CB ALA A 141 79.209 -30.320 103.587
C
ATOM 33 ALA A 141 77.842 -32.418 103.460
C
ATOM 34 O ALA A 141 78.184 -33.538 103.082
O
ATOM 35 N SER A 142 77.068 -32.225 104.522
N
ATOM 36 CA SER A 142 76.577 -33.345 105.311
C
ATOM 37 CB SER A 142 75.719 -32.841 106.473
C ATOM 38 OG SER A 142 76 . 014 -31 . 4 90 106 . 785
O
ATOM 39 C SER A 142 75.752 -34.283 104.441
C
ATOM 40 O SER A 142 75.952 -35.495 104.452
0
ATOM 41 N ASP A 161 71.043 -34.158 119.983
N
ATOM 42 CA ASP A 161 71.203 -32.720 119.777
C
ATOM 43 CB ASP A 161 72.245 -32.174 120.756
C
ATOM 44 CG ASP A 161 71.650 -31.827 122.109
C
ATOM 45 OD1 ASP A 161 71.073 -32.727 122.75?
0
ATOM 46 OD2 ASP A 161 71.762 -30.651 122.523
O
ATOM 47 ASP A 161 71.598 -32.355 118.346
C
ATOM 48 O ASP A 161 71.993 -31.220 118.067
0
ATOM 49 N CYS A 162 71.483 -33.326 117.447
N
ATOM 50 CA CYS A 162 71.812 -33.134 116.039
C
ATOM 51 CB CYS A 162 71.445 -34.391 115.252
C
ATOM 52 SG CYS A 162 72.324 -34.577 113.701
S
ATOM 53 C CYS A 162 71.080 -31.935 115.447
C
ATOM 54 O CYS A 162 69.953 -31.632 115.83t
0
ATOM 55 N TYR A 163 71.730 -31.256 114.509
N
ATOM 56 CA TYR A 163 71.137 -30.096 113.855
C
ATOM 57 CB TYR A 163 72.075 -29.582 112.755
C ATOM 58 CG TYR A 163 71.574 -28.354 112.01!
C
ATOM 59 CD1 TYR A 163 71.393 -27.139 112.67!
C
ATOM 60 CE1 TYR A 163 70.919 -26.011 111.998
C
ATOM 61 CD2 TYR A 163 71.271 -28.411 110.659
C
ATOM 62 CE2 TYR A 163 70.799 -27.291 109.974
C
ATOM 63 CZ TYR A 163 70.624 -26.098 110.647
C
ATOM 64 OH TYR A 163 70.136 -25.005 109.967
O
ATOM 65 TYR A 163 69.789 -30.521 113.270
C
ATOM 66 O TYR A 163 69.696 -31.541 112.583
O
ATOM 67 N ARG A 164 68.748 -29.743 113.550
N
ATOM 68 CA ARG A 164 67.406 -30.067 113.081
C
ATOM 69 CB ARG A 164 66.477 -28.868 113.259
C
ATOM 70 CG ARG A 164 65.048 -29.149 112.835
C
ATOM 71 CD ARG A 164 64.061 -28.758 113.914
C
ATOM 72 NE ARG A 164 62.804 -29.497 113.809
N
ATOM 73 CZ ARG A 164 61.645 -28.964 113.429
C
ATOM 74 NH1 ARG A 164 61.568 -27.678 113.110
N
ATOM 75 NH2 ARG A 164 60.558 -29.716 113.370
N
ATOM 76 C ARG A 164 67.322 -30.554 111.639
C
ATOM 77 O ARG A 164 66.940 -31.696 111.387
O ATOM 78 N LYS A 165 67.670 -29.688 110.694
N
ATOM 79 CA LYS A 165 67.614 -30.040 109.281
C
ATOM 80 CB LYS A 165 68.228 -28.926 108.433
C
ATOM 11 CG LYS A 165 67.262 -28.311 107.42?
C
ATOM 82 CD LYS A 165 66.539 -27.099 108.005
C
ATOM 13 CE LYS A 165 65.060 -27.389 108.219
C
ATOM 34 NZ LYS A 165 64.243 -26.976 107.045
N
ATOM 85 LYS A 165 68.311 -31.359 108.977
C
ATOM 86 O LYS A 165 67.804 -32.168 108.201
0
ATOM 17 N THR A 166 69.473 -31.579 109.584
N
ATOM CA THR A 166 70.212 -32.815 109.363
C
ATOM 89 CB THR A 166 71.589 -32.768 110.026
C
ATOM 90 OG1 THR A 166 72.280 -31.593 109.592
O
ATOM 91 CG2 THR A 166 72.405 -33.989 109.643
C
ATOM 92 THR A 166 69.433 -33.996 109.925
C
ATOM 93 O THR A 166 69.475 -35.099 109.377
0
ATOM 94 N PHE A 205 77.995 -40.047 113.376
N
ATOM 95 CA PHE A 205 78.030 -38.644 113.024
C
ATOM 96 CB PHE A 205 77.211 -38.409 111.756
C
ATOM 97 CG PHE A 205 76.997 -36.961 111.439
C ATOM 98 CD1 PHE A 205 77.964 -36.240 110.744
C
ATOM 99 CD2 PHE A 205 75.838 -36.309 111.849
C
ATOM 100 CE1 PHE A 205 77.782 -34.888 110.463
C
ATOM 101 CE2 PHE A 205 75.645 -34.957 111.573
C
ATOM 102 CZ PHE A 205 76.620 -34.245 110.879
C
ATOM 103 PHE A 205 77.495 -37.776 114.142
C
ATOM 104 O PHE A 205 76.490 -38.107 114.766
0
ATOM 105 N THR A 206 78.175 -36.660 114.383
N
ATOM 106 CA THR A 206 77.768 -35.720 115.415
C
ATOM 107 CB THR A 206 77.914 -36.321 116.813
C
ATOM 108 OG1 THR A 206 77.561 -35.334 117.785
O
ATOM 109 CG2 THR A 206 79.345 -36.767 117.055
C.
ATOM 110 THR A 20« 78.594 -34.447 115.370
C
ATOM 111 O THR A 206 79.683 -34.417 114.796
O
ATOM 112 N GLU A 207 78.068 -33.391 115.975
N
ATOM 113 CA GLU A 207 78.777 -32.123 116.019
C
ATOM 114 CB GLU A 207 77.873 -30.983 115.559
C
ATOM 115 CG GLU A 207 76.586 -30.884 116.336
C
ATOM 116 CD GLU A 207 75.372 -30.941 115.444
C
ATOM 117 OE1 GLU A 207 75.362 -31.771 114.512
O ATOM 118 OE2 GLU A 207 74.428 -30.157 115.673
0
ATOM 119 GLU A 207 79.212 -31.888 117.455
C
ATOM 120 0 GLU A 207 78.575 -32.373 118.385
0
ATOM 121 N SER A 20? 10.301 -31.151 117.632
N
ATOM 122 CA SER A 20? 80.812 -30.859 118.961
C
ATOM 123 CB SER A 20? 11.634 -32.038 119.476
C
ATOM 124 OG SER A 20? 32.374 -31.666 120.624
0
ATOM 125 SER A 20? 31.682 -29.613 118.927
C
ATOM 126 O SER A 20? 32.734 -29.607 118.296
0
ATOM 127 N PRO A 209 11.253 -28.535 119.600
N
ATOM 128 CD PRO A 209 32.046 -27.297 119.633
C
ATOM 129 CA PRO A 209 80.022 -28.414 120.393
C
ATOM 130 CB PRO A 209 80.095 -27.001 120.976
C
ATOM 131 CG PRO A 209 11.526 -26.599 120.846
C
ATOM 132 PRO A 209 78.724 -28.635 119.617
C
ATOM 133 O PRO A 209 78.676 -28.529 118.395
0
ATOM 134 N THR A 210 77.670 -28.932 120.362
N
ATOM 135 CA THR A 210 76.353 -29.187 119.804
C
ATOM 136 CB THR A 210 75.615 -30.246 120.66?
C
ATOM 137 OG1 THR A 210 75.254 -31.362 119.851
O ATOM 138 CG2 THR A 210 74.366 -29.660 121.326
C
ATOM 139 C THR A 210 75.521 -27.907 119.745
C
ATOM 140 O THR A 210 75.900 -26.882 120.305
0
ATOM 141 N ASN A 211 74.389 -27.972 119.053
N
ATOM 142 CA ASN A 211 73.488 -26.834 118.949
C
ATOM 143 CB ASN A 211 73.306 -26.430 117.485
C
ATOM 144 CG ASN A 211 72.204 -25.398 117.293
C
ATOM 145 OD1 ASN A 211 72.321 -24.255 117.733
O
ATOM 146 ND2 ASN A 211 71.129 -25.800 116.627
N
ATOM 147 ASN A 211 72.145 -27.249 119.552
C
ATOM 148 O ASN A 211 71.631 -28.332 119.264
0
ATOM 149 N PRO A 212 71.554 -26.392 120.39?
N
ATOM 150 CD PRO A 212 70.229 -26.643 120.980
C
ATOM 151 CA PRO A 212 72.053 -25.089 120.827
C
ATOM 152 CB PRO A 212 70.796 -24.238 120.809
C
ATOM 153 CG PRO A 212 69.693 -25.234 121.207
C
ATOM 154 PRO A 212 72.676 -25.125 122.222
C
ATOM 155 O PRO A 212 73.088 -24.093 122.752
0
ATOM 156 N ASP A 236 11.221 -32.507 113.306
N
ATOM 157 CA ASP A 236 10.845 -31.230 112.725
C ATOM 158 CB ASP A 236 79.327 -31.142 112.606
C
ATOM 159 CG ASP A 236 78.870 -29.851 111.986
C
ATOM 160 OD1 ASP A 236 79.72? -29.074 111.536
0
ATOM 161 OD2 ASP A 236 77.652 -29.608 111.947
0
ATOM 162 ASP A 236 11.373 -30.132 113.646
C
ATOM 163 O ASP A 23( 80.686 -29.685 114.564
0
ATOM 164 N GLY A 237 32.604 -29.704 113.393
N
ATOM 165 CA GLY A 237 13.217 -28.686 114.226
C
ATOM 166 C GLY A 237 12.864 -27.260 113.877
C
ATOM 167 O GLY A 237 13.686 -26.358 114.039
0
ATOM 168 N THR A 23? 11.640 -27.051 113.407
N
ATOM 169 CA THR A 23? 11.176 -25.717 113.031
C
ATOM 170 CB THR A 238 79.680 -25.739 112.642
C
ATOM 171 OG1 THR A 23? 79.488 -26.598 111.514
0
ATOM 172 CG2 THR A 238 79.205 -24.343 112.289
C
ATOM 173 THR A 23? 11.364 -24.702 114.160
C
ATOM 174 O THR A 23? 12.018 -23.670 113.983
0
ATOM 175 N PHE A 239 10.780 -25.006 115.315
N
ATOM 176 CA PHE A 239 30.861 -24.141 116.484
C
ATOM 177 CB PHE A 239 79.998 -24.711 117.609
C ATOM 178 CG PHE A 239 541 -24.363 117.502
C
ATOM 179 CD1 PHE A 239 78.085 -23.100 117.861
C
ATOM 180 CD2 PHE A 239 77.621 -25.307 117.060
C
ATOM 181 CE1 PHE A 239 76.736 -22.784 117.782
C
ATOM 182 CE2 PHE A 239 76.269 -24.995 116.97?
C
ATOM 183 CZ PHE A 239 75.828 -23.733 117.340
C
ATOM 184 PHE A 239 82.295 -24.004 116.987
C
ATOM 185 O PHE A 239 82.696 -22.954 117.4!
0
ATOM 186 N LEU A 256 83.691 -31.903 109.211
N
ATOM 187 CA LEU A 256 83.033 -31.005 108.288
C
ATOM 188 CB LEU A 256 11.835 -31.698 107.633
C
ATOM 189 CG LEU A 256 10.455 -31.664 108.283
C
ATOM 190 CD1 LEU A 256 79.668 -30.470 107.780
C
ATOM 191 CD2 LEU A 256 79.725 -32.955 107.955
C
ATOM 192 LEU A 256 82.613 -29.735 109.002
C
ATOM 193 O LEU A 256 12.320 -29.752 110.196
O
ATOM 194 N HIS A 257 82.610 -28.632 108.262
N
ATOM 195 CA HIS A 257 82.250 -27.329 108.800
C
ATOM 196 CB HIS A 257 83.481 -26.420 108.840
C
ATOM 197 CG HIS A 257 84.481 -26.804 109.880
C ATOM 198 CD2 HIS A 257 15.415 -27.782 109.896
C
ATOM 199 ND1 HIS A 257 14.581 -26.155 111.091
N
ATOM 200 CE1 HIS A 257 15.534 -26.720 111.809
C
ATOM 201 NE2 HIS A 257 16.055 -27.710 111.107
N
ATOM 202 HIS A 257 81.192 -26.659 107.944
C
ATOM 203 O HIS A 257 80.749 -27.207 106.940
O
ATOM 204 N SER A 25? 80.802 -25.461 108.363
N
ATOM 205 CA SER A 258 79.831 -24.653 107.650
C
ATOM 206 CB SER A 25? 78.543 -24.532 108.449
C
ATOM 207 OG SER A 25? 77.617 -23.714 107.765
O
ATOM 208 SER A 258 80.484 -23.290 107.509
C
ATOM 209 O SER A 25? 80.321 -22.427 108.363
O
ATOM 210 N ALA A 259 11.249 -23.119 106.438
N
ATOM 211 CA ALA A 259 11.960 -21.876 106.183
C
ATOM 212 CB ALA A 259 12.587 -21.919 104.801
C
ATOM 213 C ALA A 259 81.046 -20.672 106.309
C
ATOM 214 O ALA A 259 11.506 -19.549 106.507
O
ATOM 215 N THR A 260 79.746 -20.919 106.199
N
ATOM 216 CA THR A 260 78.736 -19.871 106.295
C
ATOM 217 CB THR A 260 77.314 -20.466 106.185
C ATOM 218 OG1 THR A 260 77.217 -21.270 105.005
0
ATOM 219 CG2 THR A 260 76.277 -19.364 106.127
C
ATOM 220 THR A 260 78.828 -19.125 107.61?
C
ATOM 221 O THR A 260 78.455 -17.959 107.71'
O
ATOM 222 N LYS A 261 79.343 -19.810 108.633
N
ATOM 223 CA LYS A 261 79.457 -19.260 109.978
C
ATOM 224 CB LYS A 261 79.246 -20.386 110.997
C
ATOM 225 CG LYS A 261 78.014 -21.246 110.718
C
ATOM 226 CD LYS A 261 76.705 -20.555 111.10?
C
ATOM 227 CE LYS A 261 75.526 -21.141 110.339
C
ATOM 228 NZ LYS A 261 75.352 -22.574 110.723
N
ATOM 229 LYS A 261 80.745 -18.504 110.304
C
ATOM 230 O LYS A 261 10.878 -17.318 109.985
O
ATOM 231 N PHE A 262 11.683 -19.200 110.944
N
ATOM 232 CA PHE A 262 12.947 -18.607 111.362
C
ATOM 233 CB PHE A 262 13.529 -19.403 112.533
C
ATOM 234 CG PHE A 262 82.800 -19.207 113.835
C
ATOM 235 CD1 PHE A 262 32.917 -18.015 114.542
C
ATOM 236 CD2 PHE A 262 32.018 -20.230 114.371
C
ATOM 237 CE1 PHE A 262 32.268 -17.843 115.769
C ATOM 238 CE2 PHE A 262 11.365 -20.069 115.595
C
ATOM 239 CZ PHE A 262 11.491 -18.873 116.295
C
ATOM 240 PHE A 262 14.005 -18.488 110.271
C
ATOM 241 O PHE A 262 14.677 -17.464 110.17?
0
ATOM 242 N VAL A 269 78.053 -15.024 102.702
N
ATOM 243 CA VAL A 26? 78.286 -16.118 101.763
C
ATOM 244 CB VAL A 269 79.727 -16.081 101.20?
C
ATOM 245 CGI VAL A 269 10.729 -16.176 102.339
C
ATOM 246 CG2 VAL A 269 79.936 -17.213 100.236
C
ATOM 247 VAL A 269 78.038 -17.469 102.421
C
ATOM 248 O VAL A 269 78.241 -17.626 103.621
0
ATOM 249 N LEU A 270 77.580 -18.436 101.630
N
ATOM 250 CA LEU A 270 77.303 -19.786 102.124
C
ATOM 251 CB LEU A 270 75.888 -20.228 101.719
C
ATOM 252 CG LEU A 270 74.632 -19.436 102.10?
C
ATOM 253 CD1 LEU A 270 73.543 -20.414 102.521
C
ATOM 254 CD2 LEU A 270 74.924 -18.467 103.233
C
ATOM 255 LEU A 270 78.316 -20.771 101.541
C
ATOM 256 O LEU A 270 78.714 -20.641 100.3?
0
ATOM 257 N ALA A 271 78.729 -21.758 102.332
N ATOM 258 CA ALA A 271 79.690 -22.747 101.853
C
ATOM 259 CB ALA A 271 11.058 -22.117 101.732
C
ATOM 260 ALA A 271 79.768 -23.995 102.729
C
ATOM 261 O ALA A 271 79.483 -23.947 103.922
0
ATOM 262 N GLY A 272 10.155 -25.109 102.113
N
ATOM 263 CA GLY A 272 80.273 -26.367 102.826
C
ATOM 264 GLY A 272 81.724 -26.788 102.937
C
ATOM 265 O GLY A 272 32.530 -26.490 102.061
O
ATOM 266 N ALA A 386 68.316 -12.685 114.01?
N
ATOM 267 CA ALA A 3? 68.317 -13.520 112.830
C
ATOM 268 CB ALA A 386 69.046 -12.803 111.711
C
ATOM 269 ALA A 3? 68.962 -14.871 113.093
C
ATOM 270 O ALA A 386 39.485 -15.123 114.179
O
ATOM 271 N PRO A 387 68.913 -15.778 112.105
N
ATOM 272 CD PRO A 387 68.294 -15.700 110.775
C
ATOM 273 CA PRO A 387 69.534 -17.080 112.333
C
ATOM 274 CB PRO A 387 68.810 -18.006 111.352
C
ATOM 275 CG PRO A 387 67.887 -17.114 110.529
C
ATOM 276 PRO A 387 71.024 -16.974 112.040
C
ATOM 277 O PRO A 387 71.543 -15.877 111.837
O ATOM 278 N SER A 3? 71.709 112 112.01!
N
ATOM 279 CA SER A 3? 73.140 -18.140 111.751
C
ATOM 280 CB SER A 3? 73.462 -17.348 110.484
C
ATOM 281 OG SER A 3? 74.739 -17.698 109.984
0
ATOM 282 SER A 3? 73.934 -17.577 112.925
C
ATOM 283 0 SER A 3? 73.365 -17.164 113.937
0
ATOM 284 N PHE A 389 75.253 -17.557 112.780
N
ATOM 285 CA PHE A 389 76.122 -17.066 113.835
C
ATOM 286 CB PHE A 389 75.933 -17.933 115.07!
C
ATOM 287 CG PHE A 389 76.158 -19.397 114.826
C
ATOM 288 CD1 PHE A 389 77.447 -19.921 114.787
C
ATOM 289 CD2 PHE A 389 75.087 -20.247 114.590
C
ATOM 290 CE1 PHE A 389 77.659 -21.267 114.514
C
ATOM 291 CE2 PHE A 389 75.292 -21.592 114.316
C
ATOM 292 CZ PHE A 389 76 . 578 -22 . 102 114 . 27 ?
C
ATOM 293 C PHE A 389 77.581 -17.132 113.396
C
ATOM 294 0 PHE A 389 77.911 -17.806 112.424
O
ATOM 295 N ASP A 397 68.549 -14.840 118.953
N
ATOM 296 CA ASP A 397 67.331 -15.512 118.519
C
ATOM 297 CB ASP A 397 67.565 -16.246 117.189
C ATOM 298 CG ASP A 397 68 . 052 - 17 . 673 117 . 37 ?
C
ATOM 299 OD1 ASP A 397 68.892 -17.909 118.270
0
ATOM 300 OD2 ASP A 397 67.598 -18.562 116.626
0
ATOM 301 ASP A 397 66.829 -16.484 119.573
C
ATOM 302 O ASP A 397 67.579 -16.914 120.44
0
ATOM 303 N GLN A 39? 65.544 -16.808 119.493
N
ATOM 304 CA GLN A 398 64.912 -17.745 120.416
C
ATOM 305 CB GLN A 39? 63.584 -17.186 120.920
C
ATOM 306 CG GLN A 398 63.653 -16.530 122.279
C
ATOM 307 CD GLN A 39? 62.377 -15.788 122.625
C
ATOM 308 OE1 GLN A 398 62.151 -14.669 122.166
O
ATOM 309 NE2 GLN A 398 61.535 -16.410 123.439
N
ATOM 310 GLN A 39? 64.648 -19.022 119.633
C
ATOM 311 O GLN A 39? 63.608 -19.158 118.991
0
ATOM 312 N PRO A 399 65.590 -19.975 119.673
N
ATOM 313 CD PRO A 399 66.856 -19.913 120.425
C
ATOM 314 CA PRO A 399 65.446 -21.243 118.954
C
ATOM 315 CB PRO A 399 66.432 -22.162 119.664
C
ATOM 316 CG PRO A 399 67.505 -21.241 120.129
C
ATOM 317 PRO A 399 64.026 -21.802 118.952
C ATOM 318 0 PRO A 399 63.616 -22.462 118.005
0
ATOM 319 N ALA A 400 63.279 -21.530 120.017
N
ATOM 320 CA ALA A 400 61.906 -22.004 120.132
C
ATOM 321 CB ALA A 400 61.331 -21.605 121.47?
C
ATOM 322 ALA A 400 61.055 -21.422 119.016
C
ATOM 323 O ALA A 400 60.268 -22.127 118.3?
O
ATOM 324 N MET A 402 62.477 -19.281 116.3?
N
ATOM 325 CA MET A 402 63.276 -19.324 115.172
C
ATOM 326 CB MET A 402 64.706 -18.883 115.47?
C
ATOM 327 CG MET A 402 65.032 -17.481 114.996
C
ATOM 328 SD MET A 402 65.036 -17.343 113.203
S
ATOM 329 CE MET A 402 65.590 -15.675 113.010
C
ATOM 330 C MET A 402 63.333 -20.640 114.413
C
ATOM 331 O MET A 402 63.306 -20.642 113.185
O
ATOM 332 N SER A 403 63.410 -21.759 115.123
N
ATOM 333 CA SER A 403 63.519 -23.044 114.439
C
ATOM 334 CB SER A 403 64.981 -23.512 114.47?
C
ATOM 335 OG SER A 403 65.820 -22.525 115.059
0
ATOM 336 C SER A 403 62.622 -24.186 114.913
C
ATOM 337 O SER A 403 62.841 -25.334 114.532
0 ATOM 338 N TYR A 404 61.616 -23.896 115.729
N
ATOM 339 CA TYR A 404 60.739 -24.953 116.216
C
ATOM 340 CB TYR A 404 61.271 -25.509 117.537
C
ATOM 341 CG TYR A 404 62.599 -26.225 117.432
C
ATOM 342 CD1 TYR A 404 53.801 -25.520 117.46?
C
ATOM 343 CE1 TYR A 404 65.028 -26.183 117.406
C
ATOM 344 CD2 TYR A 404 62.655 -27.613 117.32?
C
ATOM 345 CE2 TYR A 404 63.872 -28.284 117.267
C
ATOM 346 CZ TYR A 404 Ϊ5.053 -27.566 117.30?
C
ATOM 347 OH TYR A 404 >6.255 -28.234 117.264
0
ATOM 348 TYR A 40' 59.314 -24.459 116.419
C
ATOM 349 O TYR A 404 58.527 -25.082 117.12?
0
ATOM 350 N ARG A 423 69.771 -17.950 122.204
N
ATOM 351 CA ARG A 423 71.089 -18.231 121.661
C
ATOM 352 CB ARG A 423 70.985 -19.188 120.47?
C
ATOM 353 CG ARG A 423 72.248 -19.988 120.230
C
ATOM 354 CD ARG A 423 72.810 -19.713 118.842
C
ATOM 355 NE ARG A 423 72.344 -20.679 117.!
N
ATOM 356 CZ ARG A 423 71.761 -20.352 116.69?
C
ATOM 357 NH1 ARG A 423 71.565 -19.075 116.383
N ATOM 358 NH2 ARG A 423 71.372 -21.304 115.862
N
ATOM 359 C ARG A 423 71.759 -16.939 121.222
C
ATOM 360 0 ARG A 423 71.300 -16.269 120.303
0
ATOM 361 N SER C 85 74.037 -13.859 104.354
N
ATOM 362 CA SER C 73.850 -15.259 104.686
C
ATOM 363 CB SER C 85 75.007 -15.766 105.551
C
ATOM 364 OG SER C 85 75.038 -15.124 106.814
O
ATOM 365 C SER C 85 72.534 -15.429 105.424
C
ATOM 366 0 SER C 85 71.966 -16.516 105.456
O
ATOM 367 N ALA C 86 72.044 -14.345 106.013
N
ATOM 368 CA ALA C 86 70.793 -14.397 106.74?
C
ATOM 369 CB ALA C 86 71.065 -14.729 108.209
C
ATOM 370 ALA C 86 70.027 -13.089 106.643
C
ATOM 371 0 ALA C 86 70.521 -12.109 106.095
0
ATOM 372 N PHE C 9? 56.033 -13.862 110.585
N
ATOM 373 CA PHE C 9? 56.610 -14.550 109.441
C
ATOM 374 CB PHE C 9? 58.107 -14.240 109.329
C
ATOM 375 CG PHE C 98 58.905 -15.330 108.665
C
ATOM 376 CD1 PHE C 9E 58.850 -15.513 107.284
C
ATOM 377 CD2 PHE C 98 59.701 -16.186 109.419
C ATOM 378 CE1 PHE C 98 59.574 -16.534 106.665
C
ATOM 379 CE2 PHE C 9? 60.430 -17.211 108.810
C
ATOM 380 CZ PHE C 9? 60.365 -17.383 107.430
C
ATOM 381 C PHE C 98 56.406 -16.054 109.593
C
ATOM 382 0 PHE C 98 55.977 -16.731 108.656
O
ATOM 383 N LYS C 99 56.714 -16.573 110.77?
N
ATOM 384 CA LYS C 99 56.572 -18.000 111.045
C
ATOM 385 CB LYS C 99 57.107 -18.330 112.439
C
ATOM 386 CG LYS C 99 58.621 -18.358 112.525
C
ATOM 387 CD LYS C 99 59.197 -19.522 111.740
C
ATOM 388 CE LYS C 99 60.703 -19.374 111.577
C
ATOM 389 NZ LYS C 99 61.385 -20.675 111.336
N
ATOM 390 LYS C 99 55.122 -18.458 110.932
C
ATOM 391 0 LYS C 99 54.852 -19.633 110.677
O
ATOM 392 N PHE C 106 62.996 -14.430 103.694
N
ATOM 393 CA PHE C 106 63.735 -15.619 103.306
C
ATOM 394 CB PHE C 106 64.850 -15.251 102.331
C
ATOM 395 CG PHE C 106 64.357 -14.619 101.065
C
ATOM 396 CDl PHE C 10' 63.546 -15.330 100.190
C
ATOM 397 CD2 PHE C 106 64.698 -13.310 100.747
C ATOM 398 CE1 PHE C 106 63.077 -14.745 99.016
C
ATOM 399 CE2 PHE C 106 64.234 -12.717 99.574
C
ATOM 400 CZ PHE C 106 63.423 -13.437 98.709
C
ATOM 401 PHE C 10« 64.321 -16.274 104.546
C
ATOM 402 O PHE C 106 64.637 -17.462 104.530
0
ATOM 403 N GLU C 107 64.456 -15.488 105.615
N
ATOM 404 CA GLU C 107 64.992 -15.955 106.898
C
ATOM 405 CB GLU C 107 64.218 -17.189 107.386
C
ATOM 406 CG GLU C 107 64.350 -17.452 108.877
C
ATOM 407 CD GLU C 107 64.146 -18.911 109.246
C
ATOM 408 OE1 GLU C 107 65.145 -19.587 109.564
0
ATOM 409 OE2 GLU C 107 62.987 -19.379 109.225
O
ATOM 410 GLU C 107 66.476 -16.289 106.823
C
ATOM 411 O GLU C 107 67.308 -15.631 107.443
0
ATOM 412 N TYR C 10? 66.791 -17.327 106.059
N
ATOM 413 CA TYR C 10? 68.163 -17.780 105.884
C
ATOM 414 CB TYR C 10E 68.311 -19.190 106.449
C
ATOM 415 CG TYR C 10? 69.740 -19.644 106.607
C
ATOM 416 CDl TYR C 10E 70.683 -18.841 107.242
C
ATOM 417 CE1 TYR C 10E 71.995 -19.266 107.394
C ATOM 418 CD2 TYR C 10? 70.147 -20.883 106.12?
C
ATOM 419 CE2 TYR C 10? 71.454 -21.314 106.277
C
ATOM 420 CZ TYR C 10? 72.370 -20.504 106.908
C
ATOM 421 OH TYR C 10? 73.661 -20.938 107.058
0
ATOM 422 TYR C 10E 68.524 -17.777 104.402
C
ATOM 423 O TYR C 10E 67.653 -17.932 103.546
0
ATOM 424 N GLY C 109 69.809 -17.611 104.107
N
ATOM 425 CA GLY C 109 70.263 -17.574 102.72?
C
ATOM 426 C GLY C 109 70.019 -18.840 101.92?
C
ATOM 427 O GLY C 109 69.958 -18.794 100.699
0
ATOM 428 N ARG C 110 69.884 -19.971 102.614
N
ATOM 429 CA ARG C 110 69.649 -21.246 101.940
C
ATOM 430 CB ARG C 110 69.936 -22.417 102.8?
C
ATOM 431 CG ARG C 110 70.944 -23.416 102.355
C
ATOM 432 CD ARG C 110 70.772 -24.774 103.013
C
ATOM 433 NE ARG C 110 71.144 -24.747 104.425
N
ATOM 434 CZ ARG C 110 70.285 -24.901 105.427
C
ATOM 435 NH1 ARG C 110 68.998 -25.095 105.181
N
ATOM 436 NH2 ARG C 110 70.712 -24.857 106.679
N
ATOM 437 C ARG C 110 68.213 -21.344 101.454
C ATOM 438 0 ARG C 110 67.882 -22.185 100.621
O
ATOM 439 N TYR C 111 67.362 -20.470 101.968
N
ATOM 440 CA TYR C 111 65.958 -20.499 101.605
C
ATOM 441 CB TYR C 111 65.106 -20.373 102.871
C
ATOM 442 CG TYR C 111 65.499 -21.358 103.956
C
ATOM 443 CDl TYR C 111 65.843 -22.672 103.63?
C
ATOM 444 CE1 TYR C 111 66.218 -23.581 104.624
C
ATOM 445 CD2 TYR C 111 65.538 -20.977 105.296
C
ATOM 446 CE2 TYR C 111 65.913 -21.883 106.295
C
ATOM 447 CZ TYR C 111 66.252 -23.184 105.949
C
ATOM 448 OH TYR C 111 66.630 -24.091 106.918
0
ATOM 449 C TYR C 111 65.554 -19.446 100.587
C
ATOM 450 O TYR C 111 64.383 -19.340 100.226
O
ATOM 451 N HIS C 289 65.855 -27.130 99.974
N
ATOM 452 CA HIS C 289 66.184 -26.430 101.206
C
ATOM 453 CB HIS C 289 64.907 -25.923 101.870
C
ATOM 454 CG HIS C 289 64.316 -24.722 101.199
C
ATOM 455 CD2 HIS C 289 64.801 -23.917 100.225
C
ATOM 456 ND1 HIS C 289 63.080 -24.217 101.535
N
ATOM 457 CE1 HIS C 289 62.829 -23.149 100.798
C ATOM 458 NE2 HIS C 289 63.859 -22.947 99.995
N
ATOM 459 HIS C 289 66.947 -27.317 102.173
C
ATOM 460 O HIS C 2? 67.533 -26.831 103.133
0
ATOM 461 N ILE C 290 66.939 -28.621 101.916
N
ATOM 462 CA ILE C 290 67.634 -29.567 102.776
C
ATOM 463 CB ILE C 290 66.792 -30.851 103.007
C
ATOM 464 CG2 ILE C 290 67.642 -31.934 103.640
C
ATOM 465 CGI ILE C 290 65.618 -30.545 103.934
C
ATOM 466 CDl ILE C 290 64.583 -31.633 103.975
C
ATOM 467 ILE C 290 68.973 -29.956 102.170
C
ATOM 468 O ILE C 290 70.002 -29.899 102.838
O
ATOM 469 N LEU C 291 68.962 -30.351 100.902
N
ATOM 470 CA LEU C 291 70.195 -30.752 100.23?
C
ATOM 471 CB LEU C 291 69.881 -31.307 98.847
C
ATOM 472 CG LEU C 291 69.009 -32.567 98.826
C
ATOM 473 CDl LEU C 291 69.005 -33.138 97.431
C
ATOM 474 CD2 LEU C 291 69.530 -33.597 99.800
C
ATOM 475 C LEU C 291 71.177 -29.585 100.147
C
ATOM 476 O LEU C 291 72.383 -29.782 100.008
O
ATOM 477 N GLY C 292 70.645 -28.371 100.223
N ATOM 478 CA GLY C 292 71.470 -27.179 100.183
C
ATOM 479 C GLY C 292 72.288 -26.902 98.937
ATOM 480 O GLY C 292 73.494 -26.676 99.034
O
ATOM 481 N GLY C 293 71.649 -26.911 97.771
N
ATOM 482 CA GLY C 293 72.367 -26.621 96.539
C
ATOM 483 C GLY C 293 72.107 -25.185 96.102
ATOM 484 O GLY C 293 71.929 -24.897 94.91?
O
ATOM 485 N ALA C 294 72.091 -24.278 97.072
N
ATOM 486 CA ALA C 294 71.824 -22.868 96.821
C
ATOM 487 CB ALA C 294 71.895 -22.097 98.130
ATOM 488 C ALA C 294 72.734 -22.213 95.791
C
ATOM 489 O ALA C 294 73.910 -22.557 95.666
O
HETATM 490 Nl PLP 500 74.873 -27.734 111.209
N
HETATM 491 C2 PLP 500 75.282 -26.800 112.162
C
HETATM 492 C2A PLP 500 75.560 -27.377 113.542
C
HETATM 493 C5 PLP 500 74.759 -26.200 109.408
C
HETATM 494 C6 PLP 500 74.611 -27.478 109.899
C
HETATM 495 C5A PLP 500 74.331 -25.930 107.93?
C
HETATM 496 OP4 PLP 500 75.020 -24.891 107.242
O
HETATM 497 P PLP 500 74.417 -24.251 105.889
P HETATM 498 OP1 PLP 500 75.385 -23.191 105.598
O
HETATM 499 OP2 PLP 500 73.066 -23.684 106.292
O
HETATM 500 OP3 PLP 500 74.227 -25.240 104.838
0
HETATM 501 C4A PLP 500 75.456 -23.669 109.890
C
HETATM 502 C4 PLP 500 75.210 -25.066 110.351
C
HETATM 503 C3 PLP 500 75.441 -25.409 111.712
C
HETATM 504 03 PLP 500 75.706 -24.564 112.737
0
HETATM 505 C2 INH 600 69.842 -21.914 112.372
C
HETATM 506 C3 INH 600 69.405 -21.725 111.000
C
HETATM 507 CA INH 600 67.927 -21.389 110.647
C
HETATM 508 Pl INH 600 66.665 -22.740 110.544
P
HETATM 509 03 INH 600 67.253 -24.059 110.916
O
HETATM 510 02 INH 600 65.529 -22.427 111.462
O
HETATM 511 01 INH 600 66.134 -22.829 109.163
O
HETATM 512 C4 INH 600 70.383 -21.859 109.972
C
HETATM 513 C5 INH 600 71.736 -22.165 110.281
C
HETATM 514 C6 INH 600 72.092 -22.329 111.634
C
HETATM 515 Nl INH 600 71.151 -22.203 112.623
N
HETATM 516 C INH 600 68.954 -21.813 113.616
C
HETATM 517 OC1 INH 600 68.849 -22.887 114.399
O HETATM 518 OC2 INH 600 68.353 -20.797 113.947
0
TER
Tabelle 3: Ausgewählte Koordinaten aus der Röntgenstrukturanalyse des
Komplexes aus CGS und Vbdg.3 in PDB-Format.
HEADER AEC512800/PLP CGS komplex
ATOM 1 N MET A 135 -64.138 -47.242 161.154
N
ATOM 2 CA MET A 135 -64.293 -48.024 159.935
C
ATOM 3 CB MET A 135 -64.430 -49.509 160.256
C
ATOM 4 CG MET A 135 -63.116 -50.239 160.329
C
ATOM 5 SD MET A 135 -62.433 -50.086 161.973
S
ATOM 6 CE MET A 135 -61.842 -51.757 162.240
C
ATOM 7 C MET A 135 -65.523 -47.569 159.172
C
ATOM 8 O MET A 135 -66.171 -46.597 159.547
O
ATOM 9 N ALA A 136 -65.846 -48.283 158.102
N
ATOM 10 CA ALA A 136 -66.995 -47.938 157.289
C
ATOM 11 CB ALA A 136 -66.820 -48.501 155.894
C
ATOM 12 C ALA A 136 -68.289 -48.454 157.906
C
ATOM 13 O ALA A 136 -69.380 -48.040 157.516
O
ATOM 14 N SER A 137 -68.167 -49.354 158.873
N
ATOM 15 CA SER A 137 -69.343 -49.912 159.522
C
ATOM 16 CB SER A 137 -70.158 -50.714 158.515
C
ATOM 17 OG SER A 137 -69.827 -52.088 158.596
O
ATOM 18 C SER A 137 -68.960 -50.813 160.683
C ATOM 19 0 SER A 137 -67.876 -51.396 160.696
0
ATOM 20 N GLY A 13? -69.860 -50.929 161.653
N
ATOM 21 CA GLY A 13? ■69.604 -51.768 162.808
C
ATOM 22 GLY A 13? -69.077 -53.127 162.401
C
ATOM 23 O GLY A 13? ■68.048 -53.590 162.903
O
ATOM 24 N MET A 139 -69.783 -53.768 161.477
N
ATOM 25 CA MET A 139 -69.370 -55.075 161.002
C
ATOM 26 CB MET A 13? -70.209 -55.485 159.800
C
ATOM 27 CG MET A 139 -71.382 -56.380 160.156
C
ATOM 28 SD MET A 139 -71.094 -57.346 161.649
S
ATOM 29 CE MET A 139 -69.676 -58.320 161.15?
C
ATOM 30 MET A 139 -67.901 -55.038 160.622
C
ATOM 31 O MET A 139 -67.131 -55.925 160.987
0
ATOM 32 N CYS A 140 ■67.517 -53.998 159.890
N
ATOM 33 CA CYS A 140 -66.133 -53.838 159.47?
C
ATOM 34 CB CYS A 140 -65.952 -52.531 158.705
C
ATOM 35 SG CYS A 140 -64.470 -52.480 157.673
S
ATOM 36 C CYS A 140 -65.271 -53.817 160.727
C
ATOM 37 O CYS A 140 -64.316 -54.580 160.847
0
ATOM 38 N ALA A 141 -65.630 -52.947 161.663
N ATOM 39 CA ALA A 141 -64.895 -52.816 162.914
C
ATOM 40 CB ALA A 141 -65.659 -51.924 163.872
C
ATOM 41 ALA A 141 -64.637 -54.168 163.562
C
ATOM 42 0 ALA A 141 -63.506 -54.656 163.569
0
ATOM 43 N SER A 142 -65.687 -54.771 164.109
N
ATOM 44 CA SER A 142 -65.560 -56.070 164.758
C
ATOM 15 CB SER A 142 -66.942 -56.654 165.047
C
ATOM 46 OG SER A 142 -67.914 -56.088 164.191
O
ATOM 47 C SER A 142 -64.778 -57.038 163.882
C
ATOM 48 O SER A 142 -63.796 -57.644 164.320
O
ATOM 49 N ASP A 161 -75.462 -65.004 173.008
N
ATOM 50 CA ASP A 161 -76.244 -63.916 172.434
C
ATOM 51 CB ASP A 161 -76.908 -63.099 173.540
C
ATOM 52 CG ASP A 161 -78.307 -63.572 173.852
C
ATOM 53 OD1 ASP A 161 -78.548 -64.797 173.800
O
ATOM 54 OD2 ASP A 161 -79.165 -62.717 174.150
O
ATOM 55 ASP A 161 -75.295 -63.025 171.645
C
ATOM 56 O ASP A 161 -74.436 -62.356 172.221
0
ATOM 57 N CYS A 162 -75.443 -63.021 170.32?
N
ATOM 58 CA CYS A 162 -74.576 -62.213 169.4?
C ATOM 59 CB CYS A 162 -73.423 -63.062 168.949
C
ATOM 60 SG CYS A 162 -71.777 -62.450 169.380
S
ATOM 61 CYS A 162 -75.344 -61.617 168.326
C
ATOM 62 O CYS A 162 -76.511 -61.943 168.103
O
ATOM 63 N TYR A 163 -74.680 -60.731 167.593
N
ATOM 64 CA TYR A 163 -75.283 -60.099 166.431
C
ATOM 65 CB TYR A 163 -74.507 -58.839 166.053
C
ATOM 66 CG TYR A 163 -75.226 -57.984 165.045
C
ATOM 67 CDl TYR A 163 -76.419 -57.344 165.375
C
ATOM 68 CE1 TYR A 163 -77.100 -56.566 164.447
C
ATOM 69 CD2 TYR A 163 -74.727 -57.823 163.754
C
ATOM 70 CE2 TYR A 163 -75.400 -57.046 162.814
C
ATOM 71 CZ TYR A 163 -76.586 -56.420 163.170
C
ATOM 72 OH TYR A 163 -77.258 -55.644 162.254
0
ATOM 73 TYR A 163 -75.215 -61.113 165.295
C
ATOM 74 O TYR A 163 -74.125 -61.517 164.885
O
ATOM 75 N ARG A 164 -76.382 -61.529 164.805
N
ATOM 76 CA ARG A 164 -76.472 -62.515 163.730
C
ATOM 77 CB ARG A 164 -77.699 -62.236 162.854
C
ATOM 78 CG ARG A 164 -78.032 -63.352 161.867
C ATOM 79 CD ARG A 164 -78.536 -64.598 162.57?
C
ATOM 80 NE ARG A 164 -78.280 -65.809 161.805
N
ATOM 11 CZ ARG A 164 -79.106 -66.303 160.887
C
ATOM 82 NH1 ARG A 164 -80.252 -65.689 160.622
N
ATOM 83 NH2 ARG A 164 -78.785 -67.410 160.230
N
ATOM 14 ARG A 164 -75.220 -62.553 162.862
C
ATOM 85 O ARG A 164 -74.486 -63.539 162.860
O
ATOM 16 N LYS A 165 -74.974 -61.468 162.137
N
ATOM 37 CA LYS A 165 -73.814 -61.382 161.260
C
ATOM CB LYS A 165 -73.726 -59.982 160.647
C
ATOM 89 CG LYS A 165 -74.288 -59.889 159.227
C
ATOM 90 CD LYS A 165 -75.724 -60.412 159.135
C
ATOM 91 CE LYS A 165 -76.027 -60.996 157.754
C
ATOM 92 NZ LYS A 165 -77.407 -61.567 157.646
N
ATOM 93 LYS A 165 -72.521 -61.714 161.995
C
ATOM 94 O LYS A 165 -71.795 -62.628 161.604
O
ATOM 95 N THR A 166 -72.238 -60.975 163.061
N
ATOM 96 CA THR A 166 -71.031 -61.210 163.840
C
ATOM 97 CB THR A 166 -71.096 -60.490 165.208
C
ATOM 98 OG1 THR A 166 -71.254 -59.078 165.005
O ATOM 99 CG2 THR A 166 -69.817 -60.736 165.997
C
ATOM 100 THR A 166 -70.848 -62.709 164.071
C
ATOM 101 O THR A 166 -69.734 -63.228 163.990
0
ATOM 102 N ARG A 167 -71.949 -63.401 164.345
N
ATOM 103 CA ARG A 167 -71.920 -64.841 164.582
C
ATOM 104 CB ARG A 167 -73.337 -65.367 164.774
C
ATOM 105 CG ARG A 167 -73.462 -66.466 165.799
C
ATOM 106 CD ARG A 167 -74.658 -66.201 166.690
C
ATOM 107 NE ARG A 167 -74.753 -67.155 167.787
N
ATOM 108 CZ ARG A 167 -75.822 -67.285 168.562
C
ATOM 109 NH1 ARG A 167 -76.887 -66.518 168.355
N
ATOM 110 NH2 ARG A 167 -75.827 -68.179 169.540
N
ATOM 111 ARG A 167 -71.2? -65.581 163.415
C
ATOM 112 O ARG A 167 -70.254 -66.235 163.557
O
ATOM 113 N PHE A 205 -64.569 -61.875 173.455
N
ATOM 114 CA PHE A 205 -65.341 -60.834 172.805
C
ATOM 115 CB PHE A 205 -65.059 -60.859 171.304
C
ATOM 116 CG PHE A 205 -66.021 -60.047 170.500
C
ATOM 117 CDl PHE A 205 -65.867 -58.672 170.395
C
ATOM 118 CD2 PHE A 205 -67.099 -60.649 169.870
C ATOM 119 CE1 PHE A 205 -66.775 -57.906 169.675
C
ATOM 120 CE2 PHE A 205 -68.013 -59.891 169.14!
C
ATOM 121 CZ PHE A 205 -67.850 -58.515 169.052
C
ATOM 122 PHE A 205 -66.834 -60.995 173.050
C
ATOM 123 O PHE A 205 -67.381 -62.086 172.903
0
ATOM 124 N THR A 206 -67.487 -59.903 173.424
N
ATOM 125 CA THR A 206 -68.924 -59.923 173.662
C
ATOM 126 CB THR A 206 -69.291 -60.688 174.923
C
ATOM 127 OG1 THR A 206 -70.702 -60.571 175.144
0
ATOM 128 CG2 THR A 206 -68.558 -60.113 176.115
C
ATOM 129 C THR A 206 -69.462 -58.519 173.826
C
ATOM 130 O THR A 206 -68.720 -57.596 174.15?
O
ATOM 131 N GLU A 207 -70.760 -58.366 173.603
N
ATOM 132 CA GLU A 207 -71.395 -57.068 173.725
C
ATOM 133 CB GLU A 207 -72.200 -56.749 172.464
C
ATOM 134 CG GLU A 207 -73.454 -57.582 172.285
C
ATOM 135 CD GLU A 207 -73.322 -58.588 171.15?
C
ATOM 136 OE1 GLU A 207 -72.473 -59.499 171.280
0
ATOM 137 OE2 GLU A 207 -74.062 -58.470 170.155
0
ATOM 138 C GLU A 207 -72.305 -57.044 174.93?
C ATOM 139 0 GLU A 207 -72.965 -58.033 175.251
O
ATOM 140 N SER A 20? -72.328 -55.906 175.620
N
ATOM 141 CA SER A 20? -73.157 -55.738 176.799
C
ATOM 142 CB SER A 20? -72.351 -56.049 178.057
C
ATOM 143 OG SER A 20? -72.65? -55.130 179.091
0
ATOM 144 SER A 20? -73.651 -54.299 176.835
C
ATOM 145 O SER A 20? -72.851 -53.366 176.850
O
ATOM 146 N PRO A 209 -74.978 -54.100 176.857
N
ATOM 147 CD PRO A 209 -75.593 -52.763 176.876
C
ATOM 148 CA PRO A 209 -75.988 -55.162 176.84?
C
ATOM 149 CB PRO A 209 -77.318 -54.412 176.850
C
ATOM 150 CG PRO A 209 -76.990 -53.046 177.308
C
ATOM 151 PRO A 209 -75.857 -56.067 175.635
C
ATOM 152 O PRO A 209 -75.221 -55.706 174.642
O
ATOM 153 N THR A 210 -76.464 -57.244 175.736
N
ATOM 154 CA THR A 210 -76.442 -58.234 174.672
C
ATOM 155 CB THR A 210 -76.421 -59.652 175.267
C
ATOM 156 OG1 THR A 210 -75.498 -60.463 174.534
O
ATOM 157 CG2 THR A 210 -77.806 -60.283 175.216
C
ATOM 158 C THR A 210 -77.677 -58.078 173.786
C ATOM 159 O THR A 210 -78.558 -57.276 174.07?
0
ATOM 160 N ASN A 211 -77.739 -58.846 172.705
N
ATOM 161 CA ASN A 211 -78.879 -58.785 171.803
C
ATOM 162 CB ASN A 211 -78.447 -58.219 170.446
C
ATOM 163 CG ASN A 211 -79.610 -58.062 169.481
C
ATOM 164 OD1 ASN A 211 -79.906 -56.961 169.021
0
ATOM 165 ND2 ASN A 211 30.274 -59.168 169.169
N
ATOM 166 C ASN A 211 -79.462 -60.183 171.619
C
ATOM 167 O ASN A 211 -78.724 -61.160 171.481
O
ATOM 168 N PRO A 212 -80.800 -60.298 171.612
N
ATOM 169 CD PRO A 212 11.488 -61.571 171.360
C
ATOM 170 CA PRO A 212 11.776 -59.220 171.760
C
ATOM 171 CB PRO A 212 12.829 -59.581 170.734
C
ATOM 172 CG PRO A 212 12.807 -61.119 170.743
C
ATOM 173 C PRO A 212 32.369 -59.202 173.157
C
ATOM 174 O PRO A 212 13.394 -58.565 173.391
0
ATOM 175 N LEU A 214 -80.701 -58.148 175.805
N
ATOM 176 CA LEU A 214 -79.963 -57.153 176.572
C
ATOM 177 CB LEU A 214 -80.908 -56.024 176.987
C
ATOM 178 CG LEU A 214 11.611 -55.332 175.815
C ATOM 179 CDl LEU A 214 12.873 -56.096 175.444
C
ATOM 180 CD2 LEU A 214 11.945 -53.903 176.192
C
ATOM 181 LEU A 214 -79.254 -57.714 177.800
C
ATOM 182 O LEU A 214 -79.096 -57.017 178.802
0
ATOM 183 N ILE A 235 -65.338 -55.420 174.362
N
ATOM 184 CA ILE A 235 -66.773 -55.268 174.546
C
ATOM 185 CB ILE A 235 -67.092 -54.649 175.915
C
ATOM 186 CG2 ILE A 235 -68.595 -54.528 176.089
C
ATOM 187 CGI ILE A 235 -66.474 -55.500 177.027
C
ATOM 188 CDl ILE A 235 -66.868 -56.965 176.983
C
ATOM 189 C ILE A 235 -67.421 -54.397 173.4!
C
ATOM 190 O ILE A 235 -66.890 -53.353 173.116
0
ATOM 191 N ASP A 236 -68.579 -54.834 173.012
N
ATOM 192 CA ASP A 236 -69.315 -54.086 172.010
C
ATOM 193 CB ASP A 236 -69.873 -55.025 170.948
C
ATOM 194 CG ASP A 236 -70.585 -54.284 169.839
C
ATOM 195 OD1 ASP A 236 -71.190 -53.229 170.125
0
ATOM 196 OD2 ASP A 236 -70.537 -54.754 168.682
O
ATOM 197 C ASP A 236 -70.453 -53.371 172.716
C
ATOM 198 O ASP A 236 -71.577 -53.864 172.764
O ATOM 199 N GLY A 237 -70.154 -52.202 173.265
N
ATOM 200 CA GLY A 237 -71.167 -51.454 173.979
C
ATOM 201 C GLY A 237 -72.101 -50.684 173.079
C
ATOM 202 O GLY A 237 -72.597 -49.627 173.459
O
ATOM 203 N THR A 23? -72.351 -51.203 171.886
N
ATOM 204 CA THR A 238 -73.237 -50.516 170.960
C
ATOM 205 CB THR A 238 -73.592 -51.403 169.751
C
ATOM 206 OG1 THR A 238 -72.470 -51.475 168.863
O
ATOM 207 CG2 THR A 238 -74.788 -50.826 169.000
C
ATOM 208 THR A 238 -74.528 -50.111 171.65?
C
ATOM 209 O THR A 238 -74.863 -48.932 171.725
O
ATOM 210 N PHE A 239 -75.241 -51.099 172.182
N
ATOM 211 CA PHE A 239 -76.505 -50.863 172.866
C
ATOM 212 CB PHE A 239 -77.079 -52.184 173.360
C
ATOM 213 CG PHE A 239 -77.979 -52.855 172.379
C
ATOM 214 CDl PHE A 239 -79.134 -52.225 171.936
C
ATOM 215 CD2 PHE A 239 -77.675 -54.120 171.898
C
ATOM 216 CE1 PHE A 239 -79.978 -52.847 171.023
C
ATOM 217 CE2 PHE A 239 -78.510 -54.751 170.985
C
ATOM 218 CZ PHE A 239 -79.665 -54.113 170.546
C ATOM 219 C PHE A 239 -76.382 -49.918 174.049
C
ATOM 220 O PHE A 239 -77.324 -49.208 174.383
0
ATOM 221 N LEU A 256 i.056 -51.147 171.379
N
ATOM 222 CA LEU A 256 -66.460 -50.753 170.043
C
ATOM 223 CB LEU A 256 -65.911 -51.742 169.020
C
ATOM 224 CG LEU A 256 -66.395 -53.179 169.203
C
ATOM 225 CDl LEU A 256 -67.589 -53.440 168.300
C
ATOM 226 CD2 LEU A 256 -65.260 -54.133 168.879
C
ATOM 227 LEU A 256 -67.962 -50.679 169.905
C
ATOM 228 O LEU A 256 -68.690 -51.431 170.546
0
ATOM 229 N HIS A 257 -68.413 -49.764 169.05?
N
ATOM 230 CA HIS A 257 •69.831 -49.588 168.812
C
ATOM 231 CB HIS A 257 -70.365 -48.311 169.464
C
ATOM 232 CG HIS A 257 -69.778 -48.008 170.802
C
ATOM 233 CD2 HIS A 257 -68.537 -47.606 171.161
C
ATOM 234 ND1 HIS A 257 -70.521 -48.049 171.960
N
ATOM 235 CE1 HIS A 257 -69.763 -47.684 172.979
C
ATOM 236 NE2 HIS A 257 -68.555 -47.410 172.521
N
ATOM 237 C HIS A 257 -70.083 -49.464 167.326
C
ATOM 238 O HIS A 257 -69.159 -49.266 166.537
O ATOM 239 N SER A 258 -71.354 -49.576 166.964
N
ATOM 240 CA SER A 258 -71.781 -49.422 165.591
C
ATOM 241 CB SER A 25? -72.843 -50.457 165.23?
C
ATOM 242 OG SER A 25? -73.661 -50.003 164.171
0
ATOM 243 SER A 25? -72.393 -48.031 165.567
C
ATOM 244 O SER A 25? -73.592 -47.869 165.79?
0
ATOM 245 N ALA A 259 -71.555 -47.028 165.315
N
ATOM 246 CA ALA A 259 -71.994 -45.636 165.270
C
ATOM 247 CB ALA A 259 -70.883 -44.756 164.741
C
ATOM 248 ALA A 259 -73.218 -45.505 164.389
C
ATOM 249 O ALA A 259 -73.929 -44.503 164.435
0
ATOM 250 N THR A 260 -73.446 -46.528 163.57?
N
ATOM 251 CA THR A 260 -74.588 -46.567 162.686
C
ATOM 252 CB THR A 260 -74.687 -47.934 161.997
C
ATOM 253 OG1 THR A 260 -73.447 -48.229 161.346
0
ATOM 254 CG2 THR A 260 -75.817 -47.942 160.983
C
ATOM 255 C THR A 260 -75.866 -46.359 163.482
C
ATOM 256 O THR A 260 -76.835 -45.795 162.977
O
ATOM 257 N LYS A 261 -75.853 -46.804 164.736
N
ATOM 258 CA LYS A 261 -77.030 -46.722 165.593
C ATOM 259 CB LYS A 261 -77.074 -47.952 166.501
C
ATOM 260 CG LYS A 261 -76.613 -49.228 165.823
C
ATOM 261 CD LYS A 261 -77.783 -50.006 165.242
C
ATOM 262 CE LYS A 261 -77.308 -51.030 164.215
C
ATOM 263 NZ LYS A 261 -76.208 -51.869 164.774
N
ATOM 264 LYS A 261 -77.254 -45.471 166.441
C
ATOM 265 O LYS A 261 -78.009 -44.581 166.057
0
ATOM 266 N PHE A 262 -76.618 -45.415 167.604
N
ATOM 267 CA PHE A 262 -76.799 -44.289 168.506
C
ATOM 268 CB PHE A 262 -76.604 -44.750 169.949
C
ATOM 269 CG PHE A 262 -77.778 -45.497 170.510
C
ATOM 270 CDl PHE A 262 -79.011 -44.871 170.659
C
ATOM 271 CD2 PHE A 262 -77.651 -46.829 170.890
C
ATOM 272 CE1 PHE A 262 10.104 -45.561 171.179
C
ATOM 273 CE2 PHE A 262 -78.735 -47.529 171.412
C
ATOM 274 CZ PHE A 262 -79.964 -46.893 171.556
C
ATOM 275 PHE A 262 -75.897 -43.095 168.231
C
ATOM 276 O PHE A 262 -76.367 -41.959 168.170
O
ATOM 277 N VAL A 269 -76.659 -43.045 158.139
N
ATOM 278 CA VAL A 269 -75.236 -43.262 157.90?
C ATOM 279 CB VAL A 269 -74.408 -42.053 158.373
C
ATOM 280 CGI VAL A 269 -74.733 -41.737 159.813
C
ATOM 281 CG2 VAL A 269 -72.927 -42.341 158.222
C
ATOM 282 VAL A 269 -74.709 -44.496 158.618
C
ATOM 283 O VAL A 269 -75.142 -44.825 159.719
0
ATOM 284 N LEU A 270 -73.772 -45.178 157.970
N
ATOM 285 CA LEU A 270 -73.160 -46.370 158.533
C
ATOM 286 CB LEU A 270 -73.156 -47.512 157.515
C
ATOM 287 CG LEU A 270 -74.464 -48.002 156.894
C
ATOM 288 CDl LEU A 270 -74.389 -49.506 156.762
C
ATOM 289 CD2 LEU A 270 -75.662 -47.598 157.735
C
ATOM 290 LEU A 270 -71.723 -46.053 158.921
C
ATOM 291 O LEU A 270 -71.027 -45.318 158.217
0
ATOM 292 N ALA A 271 -71.282 -46.617 160.040
N
ATOM 293 CA ALA A 271 -69.928 -46.404 160.520
C
ATOM 294 CB ALA A 271 -69.698 -44.935 160.797
C
ATOM 295 C ALA A 271 -69.683 -47.210 161.782
C
ATOM 296 O ALA A 271 -70.580 -47.374 162.614
O
ATOM 297 N GLY A 272 -68.464 -47.722 161.90?
N
ATOM 298 CA GLY A 272 -68.095 -48.495 163.078
C ATOM 299 GLY A 272 -66.887 -47.833 163.705
C
ATOM 300 0 GLY A 272 -66.199 -47.054 163.040
O
ATOM 301 N CYS A 273 -66.621 -48.119 164.975
N
ATOM 302 CA CYS A 273 -65.468 -47.518 165.624
C
ATOM 303 CB CYS A 273 -65.801 -46.107 166.098
C
ATOM 304 SG CYS A 273 -66.991 -46.054 167.439
S
ATOM 305 CYS A 273 -64.962 -48.337 166.792
C
ATOM 306 O CYS A 273 -65.740 -48.911 167.5'
O
ATOM 307 N GLY A 360 32.253 -47.373 175.01?
N
ATOM 308 CA GLY A 360 13.619 -47.115 174.619
C
ATOM 309 GLY A 360 34.175 -48.295 173.863
C
ATOM 310 O GLY A 360 35.155 -48.169 173.133
O
ATOM 311 N ALA A 361 -83.542 -49.447 174.034
N
ATOM 312 CA ALA A 361 13.994 -50.654 173.363
C
ATOM 313 CB ALA A 361 32.814 -51.380 172.747
C
ATOM 314 ALA A 361 34.711 -51.559 174.355
C
ATOM 315 O ALA A 361 14.257 -51.740 175.485
0
ATOM 316 N VAL A 362 15.837 -52.121 173.930
N
ATOM 317 CA VAL A 362 16.611 -53.010 174.783
C
ATOM 318 CB VAL A 362 37.796 -52.281 175.426
C ATOM 319 CGI VAL A 362 18.750 -53.290 176.039
C
ATOM 320 CG2 VAL A 362 37.297 -51.318 176.480
C
ATOM 321 VAL A 362 17.162 -54.187 174.001
C
ATOM 322 O VAL A 362 -87.817 -54.013 172.974
O
ATOM 323 N SER A 363 -86.891 -55.387 174.496
N
ATOM 324 CA SER A 363 17.374 -56.602 173.863
C
ATOM 325 CB SER A 363 16.241 -57.613 173.717
C
ATOM 326 OG SER A 363 -85.569 -57.439 172.486
0
ATOM 327 C SER A 363 18.459 -57.184 174.749
C
ATOM 328 O SER A 363 -88.416 -57.035 175.969
0
ATOM 329 N TYR A 384 -91.045 -47.619 162.623
N
ATOM 330 CA TYR A 384 -90.855 -48.195 161.301
C
ATOM 331 CB TYR A 384 19.735 -47.473 160.545
C
ATOM 332 CG TYR A 384 -90.092 -46.103 160.012
C
ATOM 333 CDl TYR A 384 -90.737 -45.955 158.783
C
ATOM 334 CE1 TYR A 384 -91.028 -44.688 158.269
C
ATOM 335 CD2 TYR A 384 19.748 -44.951 160.71?
C
ATOM 336 CE2 TYR A 384 -90.034 -43.682 160.214
C
ATOM 337 CZ TYR A 384 -90.672 -43.557 158.990
C
ATOM 338 OH TYR A 384 -90.944 -42.300 158.491
0 ATOM 339 TYR A 384 -90.441 -49.642 161.504
C
ATOM 340 0 TYR A 384 -89.686 -49.950 162.424
O
ATOM 341 N ILE A 385 -90.934 -50.530 160.655
N
ATOM 342 CA ILE A 385 -90.571 -51.935 160.75?
C
ATOM 343 CB ILE A 385 -91.672 -52.837 160.192
C
ATOM 344 CG2 ILE A 385 -91.279 -54.294 160.355
C
ATOM 345 CGI ILE A 385 -92.998 -52.532 160.891
C
ATOM 346 CDl ILE A 385 -94.196 -53.199 160.256
C
ATOM 347 ILE A 385 19.307 -52.152 159.944
C
ATOM 348 O ILE A 385 19.347 -52.133 158.717
O
ATOM 349 N ALA A 386 -88.184 -52.354 160.622
N
ATOM 350 CA ALA A 386 -86.915 -52.560 159.933
C
ATOM 351 CB ALA A 386 16.550 -51.312 159.140
C
ATOM 352 ALA A 386 35.815 -52.869 160.934
C
ATOM 353 O ALA A 386 36.011 -52.732 162.143
0
ATOM 354 N PRO A 387 14.646 -53.312 160.44!
N
ATOM 355 CD PRO A 387 14.275 -53.577 159.052
C
ATOM 356 CA PRO A 387 -83.547 -53.616 161.369
C
ATOM 357 CB PRO A 387 -82.494 -54.273 160.480
C
ATOM 358 CG PRO A 387 -83.198 -54.587 159.197
C ATOM 359 PRO A 387 -83.038 -52.312 161.984
C
ATOM 360 O PRO A 387 -83.786 -51.341 162.105
0
ATOM 361 N SER A 3? -81.768 -52.284 162.366
N
ATOM 362 CA SER A 3? -81.189 -51.083 162.953
C
ATOM 363 CB SER A 3? -81.069 -49.988 161.898
C
ATOM 364 OG SER A 3? -80.194 -48.963 162.337
0
ATOM 365 SER A 3? -81.985 -50.550 164.138
C
ATOM 366 O SER A 3? -83.109 -50.977 164.395
0
ATOM 367 N PHE A 389 11.390 -49.597 164.84!
N
ATOM 368 CA PHE A 389 -82.008 -48.997 166.025
C
ATOM 369 CB PHE A 389 32.122 -50.041 167.124
C
ATOM 370 CG PHE A 389 -80.810 -50.678 167.478
C
ATOM 371 CDl PHE A 389 -79.977 -50.102 168.429
C
ATOM 372 CD2 PHE A 389 -80.400 -51.850 166.854
C
ATOM 373 CE1 PHE A 389 -78.753 -50. 17 168.752
C
ATOM 374 CE2 PHE A 389 -79.180 -52.442 167.170
C
ATOM 375 CZ PHE A 389 -78.356 -51.859 168.122
C
ATOM 376 C PHE A 3E 11.140 -47.856 166.537
C
ATOM 377 O PHE A 389 -79.991 -47.705 166.125
0
ATOM 378 N GLY A 390 11.688 -47.058 167.444
N ATOM 379 CA GLY A 390 -80.921 -45.963 168.007
C
ATOM 380 C GLY A 390 -81.130 -44.615 167.356
C
ATOM 381 0 GLY A 390 -80.539 -43.620 167.776
0
ATOM 382 N SER A 394 -88.506 -44.160 165.859
N
ATOM 383 CA SER A 394 -88.683 -45.424 166.563
C
ATOM 384 CB SER A 394 -89.982 -45.398 167.361
C
ATOM 385 OG SER A 394 -89.841 -44.600 168.518
O
ATOM 386 SER A 394 -88.709 -46.594 165.587
C
ATOM 387 O SER A 394 -89.192 -46.459 164.462
0
ATOM 388 N ILE A 395 -88.195 -47.743 166.019
N
ATOM 389 CA ILE A 395 -88.164 -48.925 165.166
C
ATOM 390 CB ILE A 395 -86.751 -49.152 164.592
C
ATOM 391 CG2 ILE A 395 -86.769 -50.306 163.606
C
ATOM 392 CGI ILE A 395 16.258 -47.878 163.904
C
ATOM 393 CDl ILE A 395 -84.795 -47.917 163.513
C
ATOM 394 ILE A 395 -88.589 -50.192 165.902
C
ATOM 395 O ILE A 395 -88.320 -50.347 167.094
O
ATOM 396 N VAL A 396 39.255 -51.091 165.181
N
ATOM 397 CA VAL A 396 19.713 -52.364 165.732
C
ATOM 398 CB VAL A 396 -91.228 -52.398 165.937
C ATOM 399 CGI VAL A 396 -91.549 -52.273 167.404
C
ATOM 400 CG2 VAL A 396 -91.889 -51.300 165.124
C
ATOM 401 VAL A 396 -89.392 -53.459 164.744
C
ATOM 402 O VAL A 396 -89.112 -53.186 163.582
0
ATOM 403 N ASP A 397 19.441 -54.702 165.200
N
ATOM 404 CA ASP A 397 19.173 -55.822 164.317
C
ATOM 405 CB ASP A 397 37.729 -55.769 163.804
C
ATOM 406 CG ASP A 397 ,761 -56.505 164.69?
C
ATOM 407 OD1 ASP A 397 16.973 -56.510 165.926
0
ATOM 408 OD2 ASP A 397 35.784 -57.076 164.174
0
ATOM 409 ASP A 397 -89.438 -57.138 165.015
C
ATOM 410 O ASP A 397 -89.508 -57.200 166.242
0
ATOM 411 N GLN A 398 -89.605 -58.186 164.220
N
ATOM 412 CA GLN A 39? -89.862 -59.518 164.747
C
ATOM 413 CB GLN A 39? ■91.157 -60.081 164.164
C
ATOM 414 CG GLN A 398 -92.092 -60.666 165.199
C
ATOM 415 CD GLN A 398 -93.416 -61.095 164.601
C
ATOM 416 OE1 GLN A 398 -93.937 -60.448 163.694
O
ATOM 417 NE2 GLN A 398 -93.967 -62.192 165.106
N
ATOM 418 C GLN A 398 -88.694 -60.402 164.352
C ATOM 119 GLN A 398 .758 -61.133 163.369
0
ATOM 420 N PRO A 399 -87.604 -60.337 165.120
N
ATOM 421 CD PRO A 399 37.482 -59.494 166.319
C
ATOM 422 CA PRO A 399 -86.389 -61.115 164.884
C
ATOM 423 CB PRO A 399 -85.833 -61.331 166.286
C
ATOM 424 CG PRO A 399 16.398 -60.179 167.113
C
ATOM 425 PRO A 399 16.651 -62.428 164.161
C
ATOM 426 O PRO A 399 16.011 -62.728 163.149
0
ATOM 427 N ALA A 400 -87.599 -63.197 164.689
N
ATOM 428 CA ALA A 400 37.973 -64.484 164.119
C
ATOM 429 CB ALA A 400 -89.309 -64.921 164.678
C
ATOM 430 C ALA A 400 -88.051 -64.397 162.603
C
ATOM 431 O ALA A 400 -87.645 -65.314 161.890
0
ATOM 432 N ILE A 401 ,578 -63.280 162.122
N
ATOM 433 CA ILE A 401 -88.721 -63.041 160.695
C
ATOM 434 CB ILE A 401 -90.064 -62.368 160.382
C
ATOM 435 CG2 ILE A 401 -90.187 -62.131 158.898
C
ATOM 436 CGI ILE A 401 -91.217 -63.227 160.895
C
ATOM 437 CDl ILE A 401 -92.426 -62.417 161.301
C
ATOM 438 C ILE A 401 -87.620 -62.106 160.219
C ATOM 439 0 ILE A 401 -86.838 -62.443 159.334
0
ATOM 440 N MET A 402 -87.578 -60.927 160.828
N
ATOM 441 CA MET A 402 -86.610 -59.896 160.487
C
ATOM 442 CB MET A 402 16.519 -58.863 161.614
C
ATOM 443 CG MET A 402 -85.790 -57.588 161.211
C
ATOM 444 SD MET A 402 -86.084 -57.140 159.482
S
ATOM 445 CE MET A 402 -87.462 -55.989 159.653
C
ATOM 446 MET A 402 15.211 -60.392 160.149
C
ATOM 447 O MET A 402 34.557 -59.838 159.268
O
ATOM 448 N SER A 403 -84.739 -61.428 160.829
N
ATOM 449 CA SER A 403 -83.398 -61.908 160.534
C
ATOM 450 CB SER A 403 12.376 -61.007 161.221
C
ATOM 451 OG SER A 403 32.968 -60.361 162.334
0
ATOM 452 SER A 403 33.147 -63.348 160.933
C
ATOM 453 O SER A 403 -82.000 -63.763 161.079
0
ATOM 454 N TYR A 404 -84.214 -64.116 161.103
N
ATOM 455 CA TYR A 404 34.069 -65.512 161.487
C
ATOM 456 CB TYR A 404 14.287 -65.667 162.987
C
ATOM 457 CG TYR A 404 -83.106 -65.210 163.803
C
ATOM 458 CDl TYR A 404 -83.022 -63.899 164.266
C ATOM 459 CE1 TYR A 404 -81.924 -63.468 165.010
C
ATOM 460 CD2 TYR A 404 -82.063 -66.084 164.101
C
ATOM 461 CE2 TYR A 404 -80.961 -65.666 164.843
C
ATOM 462 CZ TYR A 404 -80.897 -64.358 165.296
C
ATOM 463 OH TYR A 404 -79.812 -63.942 166.041
0
ATOM 464 TYR A 404 -85.046 -66.388 160.733
C
ATOM 465 O TYR A 404 -85.107 -67.598 160.945
0
ATOM 466 N ILE A 417 14.936 -67.315 170.156
N
ATOM 467 CA ILE A 417 15.734 -66.493 169.255
C
ATOM 468 CB ILE A 417 -85.067 -66.366 167.87?
C
ATOM 469 CG2 ILE A 417 15.792 -65.322 167.049
C
ATOM 470 CGI ILE A 417 -83.594 -65.994 168.046
C
ATOM 471 CDl ILE A 417 -83.366 -64.715 168.814
C
ATOM 472 ILE A 417 17.125 -67.071 169.059
C
ATOM 473 O ILE A 417 37.325 -67.976 168.251
O
ATOM 474 N VAL A 422 -90.350 -59.553 170.365
N
ATOM 475 CA VAL A 422 -90.466 -58.337 169.574
C
ATOM 476 CB VAL A 422 -91.855 -57.701 169.713
C
ATOM 477 CGI VAL A 422 -91.812 -56.256 169.239
C
ATOM 478 CG2 VAL A 422 -92.862 -58.491 168.915
C ATOM 479 C VAL A 422 39.443 -57.328 170.069
C
ATOM 480 0 VAL A 422 19.362 -57.054 171.269
0
ATOM 481 N ARG A 423 18.658 -56.783 169.148
N
ATOM 482 CA ARG A 423 17.657 -55.794 169.511
C
ATOM 483 CB ARG A 423 16.383 -55.987 168.692
C
ATOM 484 CG ARG A 423 15.607 -57.236 169.047
C
ATOM 485 CD ARG A 423 14.301 -57.310 168.284
C
ATOM 486 NE ARG A 423 14.500 -57.725 166.898
N
ATOM 487 CZ ARG A 423 13.538 -58.211 166.122
C
ATOM 488 NH1 ARG A 423 32.308 -58.343 166.597
N
ATOM 489 NH2 ARG A 423 -83.801 -58.555 164.868
N
ATOM 490 C ARG A 423 .241 -54.427 169.229
C
ATOM 491 O ARG A 423 199 -54.223 168.20?
O
ATOM 492 N PHE A 424 ,004 -53.492 170.139
N
ATOM 493 CA PHE A 424 .518 -52.148 169.977
C
ATOM 494 CB PHE A 424 19.736 -51.948 170.870
C
ATOM 495 CG PHE A 424 -90.618 -50.819 170.442
C
ATOM 496 CDl PHE A 424 ■90.101 -49.539 170.26?
C
ATOM 497 CD2 PHE A 424 -91.973 -51.032 170.213
C
ATOM 498 CE1 PHE A 424 -90.921 -48.487 169.869
C ATOM 499 CE2 PHE A 424 -92.803 -49.989 169.814
C
ATOM 500 CZ PHE A 424 -92.278 -48.714 169.641
C
ATOM 501 PHE A 424 37.466 -51.110 170.314
C
ATOM 502 O PHE A 424 -87.103 -50.933 171.474
0
ATOM 503 N SER A 425 -86.964 -50.434 169.290
N
ATOM 504 CA SER A 425 -85.979 -49.388 169.496
C
ATOM 505 CB SER A 425 -85.032 -49.282 168.308
C
ATOM 506 OG SER A 425 14.290 -48.073 168.371
O
ATOM 507 SER A 425 -86.771 -48.103 169.621
C
ATOM 508 O SER A 425 17.249 -47.556 168.627
0
ATOM 509 N PHE A 42« 16.927 -47.630 170.84?
N
ATOM 510 CA PHE A 426 37.677 -46.411 171.07?
C
ATOM 511 CB PHE A 426 17.906 -46.210 172.57?
C
ATOM 512 CG PHE A 426 36 -47.184 173.167
C
ATOM 513 CDl PHE A 426 -90.226 -47.154 172.789
C
ATOM 514 CD2 PHE A 426 18.464 -48.162 174.062
C
ATOM 515 CE1 PHE A 426 -91.133 -48.085 173.289
C
ATOM 516 CE2 PHE A 426 -89.365 -49.100 174.570
C
ATOM 517 CZ PHE A 426 ■90.702 -49.061 174.180
C
ATOM 518 PHE A 426 16.959 -45.216 170.475
C ATOM 519 0 PHE A 426 -85.772 -44.991 170.720
O
ATOM 520 N SER C 85 -79.882 -45.552 156.765
N
ATOM 521 CA SER C 85 -79.098 -46.615 157.375
C
ATOM 522 CB SER C 85 -78.829 -46.291 158.844
C
ATOM 523 OG SER C 85 -79.905 -46.724 159.659
O
ATOM 524 SER C 85 -79.830 -47.947 157.275
C
ATOM 525 O SER C 85 -79.252 -49.004 157.534
O
ATOM 526 N GLU C 107 -83.116 -54.238 152.501
N
ATOM 527 CA GLU C 107 33.219 -54.678 153.892
C
ATOM 528 CB GLU C 107 32.752 -56.133 154.032
C
ATOM 529 CG GLU C 107 13.085 -56.776 155.374
C
ATOM 530 CD GLU C 107 32.313 -58.064 155.61?
C
ATOM 531 OE1 GLU C 107 32.122 -58.432 156.799
0
ATOM 532 OE2 GLU C 107 11.898 -58.706 154.628
O
ATOM 533 GLU C 107 32.390 -53.779 154.802
C
ATOM 534 O GLU C 107 32.934 -53.071 155.652
O
ATOM 535 N TYR C 10? 11.074 -53.815 154.618
N
ATOM 536 CA TYR C 10E -80.157 -53.003 155.410
C
ATOM 537 CB TYR C 10E -79.311 -53.891 156.324
C
ATOM 538 CG TYR C 10? -78.734 -53.161 157.51?
C ATOM 539 CDl TYR C 10? -79.549 -52.773 158.584
C
ATOM 540 CE1 TYR C 10? -79.022 -52.114 159.693
C
ATOM 541 CD2 TYR C 108 -77.371 -52.868 157.591
C
ATOM 542 CE2 TYR C 10? -76.834 -52.209 158.696
C
ATOM 543 CZ TYR C 10? -77.664 -51.837 159.742
C
ATOM 544 OH TYR C 10? -77.137 -51.199 160.842
O
ATOM 545 TYR C 10? -79.241 -52.186 154.50t
C
ATOM 546 O TYR C 10? -78.932 -52.595 153.387
0
ATOM 547 N GLY C 109 -78.805 -51.033 155.005
N
ATOM 548 CA GLY C 109 -77.930 -50.169 154.233
C
ATOM 549 GLY C 109 -76.646 -50.842 153.793
C
ATOM 550 O GLY C 109 -76.034 -50.440 152.802
O
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N
ATOM 552 CA ARG C 110 -75.010 -52.596 154.204
C
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C
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C
ATOM 555 CD ARG C 110 -72.608 -54.567 156.549
C
ATOM 556 NE ARG C 110 -73.298 -54.155 157.769
N
ATOM 557 CZ ARG C 110 -74.217 -54.886 158.394
C
ATOM 558 NH1 ARG C 110 -74.565 -56.076 157.91!
N ATOM 559 NH2 ARG C 110 -74.785 -54.426 159.500
N
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C
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0
ATOM 562 N TYR C 111 -76.539 -53.880 152.831
N
ATOM 563 CA TYR C 111 -76.926 -54.827 151.792
C
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C
ATOM 565 CG TYR C 111 -77.960 -56.341 153.603
C
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C
ATOM 567 CE1 TYR C 111 -76.546 -57.247 155.362
C
ATOM 568 CD2 TYR C 111 -79.075 -56.727 154.34!
C
ATOM 569 CE2 TYR C 111 -78.937 -57.363 155.580
C
ATOM 570 CZ TYR C 111 -77.672 -57.620 156.079
C
ATOM 571 OH TYR C 111 -77.535 -58.252 157.294
0
ATOM 572 TYR C 111 -77.273 -54.135 150.474
C
ATOM 573 O TYR C 111 -77.774 -54.775 149.546
0
ATOM 574 N HIS C 289 -71.223 -58.390 152.464
N
ATOM 575 CA HIS C 289 -72.285 -58.045 153.395
C
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C
ATOM 577 CG HIS C 289 -74.348 -58.275 151.946
C
ATOM 578 CD2 HIS C 289 -74.334 -57.050 151.369
C ATOM 579 ND1 HIS C 289 -75.318 -58.999 151.287
N
ATOM 580 CE1 HIS C 289 -75.868 -58.243 150.352
C
ATOM 581 NE2 HIS C 289 -75.289 -57.056 150.381
N
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C
ATOM 583 O HIS C 289 -72.399 -57.733 155.764
O
ATOM 584 N ILE C 290 -70.908 -59.227 155.003
N
ATOM 585 CA ILE C 290 -70.434 -59.574 156.333
C
ATOM 586 CB ILE C 290 -69.928 -61.020 156.384
C
ATOM 587 CG2 ILE C 290 -69.183 -61.267 157.682
C
ATOM 588 CGI ILE C 290 -71.106 -61.983 156.276
C
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C
ATOM 590 C ILE C 290 -69.310 -58.656 156.77?
C
ATOM 591 O ILE C 290 -69.415 -57.994 157.807
0
ATOM 592 N LEU C 291 -68.229 -58.621 156.009
N
ATOM 593 CA LEU C 291 -67.100 -57.772 156.356
C
ATOM 594 CB LEU C 291 -65.990 -57.926 155.316
C
ATOM 595 CG LEU C 291 -65.520 -59.358 155.03?
C
ATOM 596 CDl LEU C 291 -64.120 -59.329 154.451
C
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C
ATOM 598 C LEU C 291 -67.542 -56.314 156.455
C ATOM 599 O LEU C 291 -66.829 -55.474 157.004
0
ATOM 600 N GLY C 292 -68.727 -56.031 155.920
N
ATOM 01 CA GLY C 292 ■69.287 -54.692 155.961
C
ATOM 602 C GLY C 292 -68.354 -53.550 155.614
C
ATOM 603 O GLY C 292 -67.881 -52.826 156.494
O
ATOM 604 N GLY C 293 -68.091 -53.383 154.324
N
ATOM 605 CA GLY C 293 -67.224 -52.310 153.873
C
ATOM 606 C GLY C 293 -68.001 -51.443 152.90?
ATOM 607 O GLY C 293 -67.434 -50.833 152.000
O
ATOM 608 N ALA C 294 -69.313 -51.395 153.120
N
ATOM 609 CA ALA C 294 -70.232 -50.632 152.27?
C
ATOM 610 CB ALA C 294 -71.593 -50.533 152.95E
ATOM 611 C ALA C 294 -69.749 -49.239 151.892
C
ATOM 612 O ALA C 294 -69.061 -48.566 152.659
O
HETATM 613 Nl PLP 500 -72.613 -55.213 166.143
N
HETATM 614 C2 PLP 500 -73.654 -55.118 167.083
C
HETATM 615 C2A PLP 500 -73.381 -55.815 168.409
C
HETATM 616 C5 PLP 500 -73.778 -54.092 164.417
C
HETATM 617 C6 PLP 500 -72.641 -54.734 164.862
C
HETATM 618 C5A PLP 500 -73.870 -53.607 162.956
C HETATM 619 OP4 PLP 500 -73.029 -52.510 162.655
O
HETATM 620 P PLP 500 -72.978 -51.937 161.154
P
HETATM 621 OP1 PLP 500 -72.246 -50.678 161.263
0
HETATM 622 OP2 PLP 500 -74.436 -51.685 160.761
0
HETATM 623 OP3 PLP 500 -72.349 -52.974 160.319
O
HETATM 624 C4A PLP 500 -76.211 -53.215 164.925
C
HETATM 625 C4 PLP 500 -74.975 -53.901 165.337
C
HETATM 626 C3 PLP 500 -74.890 -54.422 166.647
C
HETATM 627 03 PLP 500 -75.868 -54.427 167.596
0
HETATM 628 Cl INH 600 -83.409 -54.393 165.857
C
HETATM 629 C2 INH 600 14.541 -54.007 165.07!
C
HETATM 630 C3 INH 600 35.574 -53.214 165.650
C
HETATM 631 C4 INH 600 -85.477 -52.803 167.011
C
HETATM 632 C5 INH 600 14.347 -53.188 167.790
C
HETATM 633 C6 INH 600 33.319 -53.979 167.219
C
HETATM 634 CL5 INH 600 -84.226 -52.681 169.461
Cl
HETATM 635 01 INH 600 10.322 -56.263 164.954
0
HETATM 636 C2A INH 600 11.21? -56.537 163.953
C
HETATM 637 S3 INH 600 -80.841 -57.590 162.581
S
HETATM 638 N3 INH 600 12.404 -55.928 164.126
N HETATM 639 CIA INH 600 -82.332 -55.223 165.260
C
HETATM 640 N2 INH 600 -81.100 -55.411 165.765
N
HETATM 641 C1B INH 600 -79.613 -58.697 163.363
C
HETATM 642 C INH 600 -80.207 -59.618 164.404
C
HETATM 643 02 INH 600 -79.408 -60.110 165.250
O
HETATM 644 03 INH 600 -81.447 -59.867 164.397
0

Claims

Patentansprüche:
1. Kristalline pflanzliche Cysthathionin gamma-Synthase (CGS) in der monoklinen Raumgruppe C2.
2. CGS gemäß Anspruch 1 , d.g., daß es sich um die CGS der Nicotiana tabacum handelt.
3. Verfahren zum Identifizieren von Inhibitoren der pflanzlichen CGS, umfassend die Schritte, a) Aufreinigung einer pflanzlichen CGS bis zur apparenten Homogenität,
b) Züchtung von zur Diffraktionsanalyse geeigneten Kristallen von CGS- Inhibitor Komplexen,
c) Sammlung von kristallographischen Daten von CGS-Inhibitor Komplexen unter Verwendung von Röntgenstrahlen und Reduktion dieser Daten unter Verwendung geeigneter Computerprogramme,
d) Lösung der Struktur der Enzym-Inhibitor Komplexe durch molekulare Ersetzungsverfahren unter Verwendung der Struktur einer nativen pflanzlichen CGS und Verfeinerung der so erhaltenen Modelle unter Verwendung geeigneter Computerprogramme, und
e) das Design neuer Inhibitoren für die pflanzliche Cystathionin gamma- Synthase, basierend auf den erhaltenen Strukturinformationen.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei man den gefundenen Inhibitor synthetisiert und in einem in-vitro und/oder in-vivo Test auf Inhibitoreigenschaften bzw. herbizide Aktivität überprüft.
5. Verwendung von Inhibitoren der pflanzlichen CGS, die nach einem Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4 identifiziert wurden, als Herbizid.
6. Verwendung einer Verbindung der Formel (I)
Hy - (L1)n - Pi - L2 - A (I)
als Inhibitor der pflanzlichen CGS,
wobei die Symbole und Indizes folgende Bedeutungen haben:
Hy ist eine hydrophobe Gruppe, die räumlich in die in Figur 3a beschriebene Tasche paßt;
L1 ist ein Spacer, der so zu wählen ist, daß Hy und Pi auf direktem Weg maximal durch 2 Bindungen getrennt sind;
n ist 0 oder 1 ;
Pi ist ein elektronenreiches konjugiertes oder aromatisches π- Elektronensystem, das mit der Guanidiniumgruppe der Aminosäure ArgA423 einen Charge-Transfer-Komplex bilden kann, wobei der Abstand zwischen den Verknüpfungspunkten zu Hy und L2 bzw. zwischen L1 und L2 beträgt maximal 4 A (die Länge der Bindungen zu Hy bzw. L1 und L2 nicht einbezogen);
L2 ist ein Spacer, der so zu wählen ist, daß Pi und A auf direktem Weg durch 2 bis 5 Bindungen getrennt sind;
und
A ist eine zur Bildung einer Salzbrücke zu ArgA423 befähigte Gruppe.
7. Verwendung von Inhibitoren der pflanzlichen CGS gemäß Formel (I) in Anspruch 6 als Herbizide.
8. Herbizides Mittel, enthaltend einen Inhibitor der pflanzlichen CGS, der mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 3 oder 4 identifiziert wurde.
9. Herbizides Mittel, enthaltend eine Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 6.
10. Verfahren zur Bekämpfung von unerwünschten Pflanzenwuchs in Nutzpflanzenkulturen, wobei man auf den Ort der Nutzpflanze, die Nutzpflanze oder deren Vermehrungsgut ein herbizides Mittel aufbringt, enthaltend einen Inhibitor der pflanzlichen CGS, identifiziert mit einem Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4 oder einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 6.
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