EP1200836A1 - Verfahren zur qualitatskontrolle der endothelauskleidung von gefässprothesen - Google Patents

Verfahren zur qualitatskontrolle der endothelauskleidung von gefässprothesen

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Publication number
EP1200836A1
EP1200836A1 EP00951494A EP00951494A EP1200836A1 EP 1200836 A1 EP1200836 A1 EP 1200836A1 EP 00951494 A EP00951494 A EP 00951494A EP 00951494 A EP00951494 A EP 00951494A EP 1200836 A1 EP1200836 A1 EP 1200836A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
prostheses
vascular
endothelial
factor
cells
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00951494A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stephan Nees
Peter Lamm
Gerd Juchem
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vascular Biotech GmbH
Original Assignee
Vascular Biotech GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vascular Biotech GmbH filed Critical Vascular Biotech GmbH
Publication of EP1200836A1 publication Critical patent/EP1200836A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen

Definitions

  • the invention relates to a method for quality control of the endothelial lining of native blood vessels or artificial (or natural) blood vessels or blood vessel valves, cardiac cavities and heart valves for surgical implantation purposes according to the preamble of patent claim 1, provided with a grown endothelium (“endothelized”).
  • An intact endothelium can also completely re-clot thrombi (fibrin thrombi) through fibrin-dissolving or" profibrinolytic "effects Since this complexity and adaptability of antithrombogenic active factors can in no way be achieved in any way by a plastic material, it makes sense to settle vascular endothelial cells on the inner surface of the vascular prostheses to be implanted. After a cultivation phase lasting several days, these can divide and move - Finally cover the entire surface of multiplying cells.
  • endothelial cells For immunological reasons, such endothelial cells must originate from the patient himself (autologous endothelium).
  • the isolation of appropriate cells can be carried out routinely and in sufficient quantity without difficulty still from relatively small, surgically removed veins of the patient.
  • the isolated cells In the tissue laboratory, the isolated cells can be multiplied so considerably under sterile conditions that in principle larger vascular prostheses can be lined with them about 2 to 3 weeks later.
  • vascular prostheses made of artificial materials the particular problem arises of reliably and permanently anchoring sown endothelial cells on the inner walls of the plastic tube.
  • cryopreserved blood vessel prostheses originating from other people receive at least considerable residual amounts of the donor endothelium, which can lead to immunological rejection of the entire vessel. It was only recently that an important breakthrough was achieved with regard to the serial use of such vessels, in which it was possible to remove the donor endothelium selectively and gently.
  • the luminal surface of such "de-endothelialized”, previously cryopreserved and thawed vessels is ideal for permanent anchoring and lining with autologous endothelial tissue originating from the patient being treated ("autologous endothelium").
  • the object of the present invention is to provide a method for quality control of the endothelial coating of the above-mentioned vascular or cardiac parts in its entire extent, by means of which a quick and convincing documentation of the functionality of its endothelial coating is possible even on the day of the surgical implantation.
  • the clinically particularly impressive advantage of the method according to the invention is that specific proof of the morphological and functional intactness of the endothelial surface of the respectively prepared prostheses (see above 1 ) can be made shortly before the implantation in a patient. This may avoid serious patient complications that could include envisaged replacement product transplantation with an incomplete endothelium. If necessary, the cultivation phase must be extended until the relevant surface of the prosthesis is completely covered with the patient endothelium is. In any case, this results in the possibility of optimally using cryopreserved donor vessels. Similar considerations are also important with regard to autologous vessels damaged by disease, old age or latrogenic intervention. By introducing such vessels into a suitable endothelialization apparatus (DE-PS 199 18 558.1 AI), the endothelial lining can be completed and then the quality can also be checked on the basis of the methodology for which a patent has been applied.
  • a suitable endothelialization apparatus DE-PS 199 18 558.1 AI
  • the figure shows a vascular prosthesis that has only been partially coated with the patient's own endothelial cells.
  • endothelial cells originating from a small, surgically removed vein of the patient are isolated and increased so significantly that larger vascular prostheses 1 can also be lined with them.
  • a specially developed coating device for lining vascular prostheses with endothelial cells is explained in patent application DP 199 18 558.1. After sowing the endothelial cells and adhering them to the inner wall 2 of the vascular prosthesis 1, the adhering endothelial cells 3 multiply in a suitable culture medium such that they finally form a confluent endothelial cell layer on the inner wall 2 of the vascular prosthesis 1.
  • Culture medium is perfused through the vessel lumen in the manner explained in DE-PS 199 18 558.1 AI via cannulas (not shown) connected to the ends of the vascular prosthesis 1.
  • Endothelial cells 3 are physiologically characterized by various antithrombotic activities, which also extremely effectively prevent the formation of fibrin thrombi in the intact blood circulation.
  • a particularly prominent specialty of the endothelium or endothelial cells 3 in all blood vessels of the body that can be used for the purposes of the present invention is the activation of protein C, which is constantly fed into the blood plasma by the liver.
  • the cells of deeper layers of the blood vessel wall e.g. vascular muscle cells and pericytes
  • proteins C which is constantly fed into the blood plasma by the liver.
  • these cells are characterized by certain prothrombogenic properties, e.g. a particularly high concentration of tissue factor, which is now considered to play a decisive role in the development of intravascular fibrin thrombi. This prothrombogenic activity cannot be demonstrated in highly purified healthy arterial or venous endothelial cells of animal and human origin.
  • Solid arrows in the figure symbolize how the endothelial cells 3 activate protein C.
  • the dotted arrow mean, however, that the cells 4 of the deeper blood vessel wall develop tissue factor.
  • the invention now aims to detect and quantify the anti- or prothrombogenic activities of the cells 3 of the endothelial layer or of the cells 4 of the vessel wall which have been grown in the vascular prosthesis 1 in a highly specific manner.
  • active protein C formed from protein C in the presence of thrombin on the endothelium surface in a correspondingly composed incubation solution can be incubated after removing the incubation solution from the lumen of the vascular prosthesis 1 with a specific substrate commercially available for photometric tests.
  • the amount of product formed in proportion to the amount of PCA is registered as standard with the aid of optical measuring devices.
  • the detection of tissue factor on the inner wall and 2, which may need to be carried out additionally, proceeds analogously.
  • the vascular prosthesis 1 is incubated with a physiological salt solution containing the coagulation factors II, VII, IX and X (for example the commercially available preparation “Beriplex the Centeon, Marburg).
  • factor X In contact with wall areas that may not yet be covered by the grown endothelium and the tissue factor located there, factor X would be converted to factor Xa. After removing this salt solution and adding the coagulation factors Va or II, thrombin can then be formed in vitro under reproducible incubation conditions, which can hydrolyze a specific substrate which is present at the same time. The product formed in this way can again be registered online using an optical measuring method.
  • the proof of quality relates to the fewest possible features which, for reasons of objectivity, are highly selective, either of the complete endothelium-denuded or of the prosthesis wall completely covered with vital endothelial cells.
  • the entire endothelial wall of the prosthesis to be implanted is included.
  • the method according to the invention is based on scientifically accepted and undoubtedly documented measurement methods.
  • the quality control can already be carried out on the prosthesis that has not yet been implanted using the method according to the invention and provides information about the reached state of confluence of the still growing endothelial cells.
  • the method according to the invention enables quick results and gives direct information about the quality of the subsequently transplanted vascular prosthesis.
  • the method according to the invention is very inexpensive.
  • the described method can also be used to check the quality of the endothelialization of heart valves and cardiac cavities.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Qualitätskontrolle der Endothelbeschichtung für chirurgische Implantationszwecke entnommener, nativer Blutgefässe oder endothelialisierter künstlicher oder natürlicher Gefässprothesen (1), Gefässklappen, Herzklappen oder Herzhöhlen. Zur Qualitätskontrolle werden charakteristische und selektive metabolische Aktivitäten und/oder strukturelle Merkmale der an der jeweiligen Prothesenwand (2) aufgezüchteten Endothelschicht (3) und der Zellen (4) der tieferen Prothesenwandschichten (2) als Mass für die Vollständigkeit der Endothelialisierung erfasst und quantifiziert werden.

Description

VERFAHREN ZUR QUALITÄTSKONTROLLE DERENDOTHELAUSKLEIDUNG
VON GEFÄSSPROTHESEN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Qualitätskontrolle der Endothelauskleidung nativer Blutgefäße oder im Gewebelabor mit einem aufgezüchteten Endothel versehener ( „endothelialisierter" ) kunstlicher oder naturlicher Blut- gefäße oder Blutgefäßklappen, Herzhöhlen und Herzklappen für chirurgische Implantationszwecke nach dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.
Einhergehend mit der steigenden Lebenserwartung und der Häufigkeit von Herz- und Gefäßerkrankungen spielt der Ersatz funktionsuntϋchtiger Arterien und Herzklappen in der Chirurgie eine immer größere Rolle. Wenn dies irgendwie möglich ist, wird versucht, patienteneigene bzw. 'autolo- ge ' Blutgefäße für solche Zwecke zu rekrutieren, deren Verpflanzung zwar keine operativen und/oder immunologischen Probleme bereitet, die aber nur begrenzt verfügbar sind. Außerdem kann deren Endothel krankheitshalber bzw. präparationsbedingt auch Schäden aufweisen.
Bei vielen Patienten sind die relativ wenigen, für derartige Zwecke prinzipiell überhaupt nur in Frage kommenden Blutgefäße (z.B. die Vena saphena magna, Vena saphena par- va oder Arteria mammaria interna) durch Krankheiten (z.B. Varikosis oder Ateriosklerosis) allerdings oft schon so stark alteriert, daß sie nicht mehr verwendet werden können. Außerdem wachst die Zahl der Patienten, die sich nach einer Jahre zurückliegenden ersten Gefaßersatz-Operation plötzlich dringend einer zweiten derartigen Therapie unterziehen müssen, für die aber ein autologer Gefaßersatz dann nicht mehr zur Verfugung steht. In dieser bedrohli- chen Situation können bisher nur ein vollkommen protheti- scher Gefaßersatz durch flexible Kunststoffprothesen (z.B. aus PTFE) oder kryopraservierte Fremdvenen („Spendervenen") in Betracht gezogen werden. Leider haben solche Ersatzprodukte jedoch meist wegen rascher Thro bosierung nur eine sehr unbefriedigende Prognose.
Aus diesem Grunde wurde versucht, die Throrαbogenitat von prosthetischen Ersatzprodukten zu verringern. Alle Blutgefäße des Kreislaufsystems sind mit einer konfluenten En- dothelschicht ausgekleidet, die mit aktiven und auch regulierbaren physiologischen Funktionen die Bildung von Blutgerinnseln verhindern. Dazu gehören Blutplattchen (Throm- bozyten) hemmende Funktionen bzw. „antiaggregatorischeM Funktionen ebenso wie gerinnungshemmende bzw. „antikoagu- latorische" Mechanismen. Ein intaktes Endothel kann durch fibrinauflosende bzw. "profibrinolytische" Wirkungen bereits gebildete Gerinnungsthromben (Fibrinthromben) auch noch komplett wieder auflosen. Da diese Komplexität und Anpassungsfähigkeit antithrombogener Wirkfaktoren durch ein Kunststoffmaterial in gar keiner Weise auch nur annähernd erreicht werden kann, bietet es sich an, vaskuläre Endothelzellen auf der inneren Oberflache der zu implantierenden Gefäßprothesen anzusiedeln. Nach einer mehrtägigen Kultivationsphase können diese sich teilenden und ver- mehrenden Zellen schließlich die gesamte Oberflache abdek- ken.
Aus immunulogischen Gründen müssen solche Endothelzellen aus dem Patienten selbst stammen (autologes Endothel). Die Isolierung entsprechender Zellen kann bereits ohne Schwierigkeit routinemäßig und in ausreichender Menge selbst noch aus relativ kleinen, chirurgisch entnommenen Venen des Patienten erfolgen. Im Gewebelabor lassen sich die isolierten Zellen unter sterilen Bedingungen so erheblich vermehren, daß ca. 2 bis 3 Wochen spater im Prinzip auch größere Gefaßprothesen mit ihnen ausgekleidet werden können. Allerdings erhebt sich bei Gefaßprothesen aus kunstlichen Materialien das besondere Problem, ausgesäte Endothelzellen an den Innenwandungen der Kunststoffröhre zuverlässig dauerhaft zu verankern.
Kryopraservierte, von fremden Personen stammende Blutgefaßprothesen erhalten nach dem Auftauen zumindest noch betrachtliche Restmengen des Spenderendothels , das zur immunologischen Abstoßung des gesamten Gefäßes fuhren kann. Erst kurzlich wurde im Hinblick auf die serienmäßige Verwendung solcher Gefäße ein wichtiger Durchbruch erzielt, in dem es gelungen ist, das Spenderendothel selektiv und schonend zu entfernen. Die luminale Oberflache derartiger, „de-endothelialisierter", zuvor kryopraservierter und auf- getauter Gefäße eignet sich hervorragend zur dauerhaften Verankerung und Auskleidung mit autologem, aus dem thera- pierten Patienten selbst stammenden Endothelgewebe („auto- loges Endothel"). Eine vielversprechende erste Implantation eines solchen Gefäßes in eine Patientin wurde bereits publiziert (Lamm P., Juchem G., Weyπch P., Reichart B.: New alternative coronary bypass graft : First clinical ex- peπence with an autologous endothelialized cryopreserved allograft. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1999, 117 (6) , 1217-1219) . Entsprechende logistische Vorkehrungen voraus- gesetzt, erscheint auf dieser Basis ein ganz neuer, hervorragend geeigneter Gefaßersatz für entsprechende Problempatienten in naher Zukunft möglich zu sein.
Ein Problem besteht jedoch bis heute m der unbefriedigen- den Qualitätskontrolle der Endothelbeschichtung der ausgewählten Ersatzprodukte. Dieses Argument gilt sowohl im Hinblick auf eventuell noch zur Verfugung stehendes auto- loges Gefaßmaterial, als auch für natürliche und artifizi- elle, endothelialisierte oder nicht endothelialisierte Blutgefäße, Herzklappen, und Herzhohlen unmittelbar vor ihrer Implantation. Derzeit kann lediglich eine Überprüfung von endstandig abgeschnittenen Segmenten bzw. Gewebeproben der zur Implantation vorgesehenen Ersatzmateπali- en vorgenommen werden, wobei die Auswertung durch die übliche rasterelektronenmikroskopische Inspektion erst ein bis zwei Tage spater erfolgen kann. Auf die wirkliche Intaktheit der dann bereits transplantierten Protheseteile kann also lediglich indirekt zuruckgeschlossen werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Qualitätskontrolle der Endothelbeschichtung der oben bezeichneten Gefäß- oder Herzteile n ihrem gesamten Ausmaß zu schaffen, durch das eine schnelle und überzeugende Dokumentation der Funktionalität ihrer Endothelbeschichtung selbst noch am Tage der chirurgischen Implantation möglich wird.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren m t den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelost.
Der klinisch besonders bestechende Vorteil des erfmdungs- gemaßen Verfahrens besteht darin, daß ein spezifischer Nachweis der morphologischen und funktioneilen Intaktheit der Endotheloberflache der jeweils vorbereiteten Prothesen (s. oben1) schon kurz vor der Implantation in einen Pati- enten getroffen werden kann. Dadurch werden möglicherweise schwerwiegende Komplikationen für den Patienten vermieden, die darin bestehen konnten, daß vorgesehene Ersatzprodukte mit einem unvollständigen Endothel transplantiert werden. Im Bedarfsfall muß die Kultivationsphase noch lan- ger ausgedehnt werden, bis die relevante Oberflache der Prothesen vollständig mit dem Patientenendothel bedeckt ist. So ergibt sich in jedem Fall die Möglichkeit, kryo- praservierte Spendergefaße optimal zu nutzen. Auch im Hinblick auf durch Krankheit, Alter oder latrogene Intervention vorgeschadigte autologe Gefäße sind ähnliche Uberle- gungen wichtig. Durch Einbringung solcher Gefäße in eine geeignete Endothelialisierungsapparatur (DE-PS 199 18 558.1 AI) kann die Endothelauskleidung noch vervollständigt und dann auf der Grundlage der hiermit zum Patent angemeldeten Methodik qualitätsmäßig auch überprüft werden.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung gehen aus den Unteranspruchen hervor.
Im folgenden werden die Erfindungen und deren Ausgestal- tungen im Zusammenhang mit der Figur naher erläutert. Die Figur zeigt als exemplarisches Beispiel eine Gefaßprothese, die nur teilweise mit patienteneigenen Endothelzellen beschichtet wurde.
Im Gewebelabor werden aus einer kleinen, chirurgisch entnommenen Vene des Patienten stammende Endothelzellen isoliert und so erheblich vermehrt, daß mit ihnen auch größere Gefaßprothesen 1 ausgekleidet werden können. Eine speziell entwickelte Beschichtungsemrichtung zur Auskleidung von Gefaßprothesen mit Endothelzellen ist in der Patentanmeldung DP 199 18 558.1 erläutert. Nach dem Aussäen der Endothelzellen und dem Anhaften derselben auf der Innenwandung 2 der Gefaßprothese 1 vermehren sich die anhaftenden Endothelzellen 3 in einem geeigneten Kulturmedium derart, daß sie schließlich eine konfluente Endothelzel- lenschicht an der Innenwandung 2 der Gefaßprothese 1 bilden. Dabei wird Kulturmedium in der in DE-PS 199 18 558.1 AI erläuterten Weise über dicht mit den Enden der Gefaßprothese 1 verbundene Kanülen (nicht dargestellt) durch das Gefaßlumen perfundiert. Der Zielsetzung einer zuverlässigen und aussagekraftigen Qualitätskontrolle zur kompletten und funktioneil aktiven Endothelialisierung von Gefaßprpthesen folgend, führten die folgenden Überlegungen zur Erfindung.
Endothelzellen 3 zeichnen sich physiologischerweise durch diverse antithrombotische Aktivitäten aus, durch die im intakten Blutkreislauf auch die Bildung von Fibrinthromben äußerst wirksam verhindert wird. Beispielsweise besteht eine besonders hervortretende, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugt einsetzbare Spezialitat des En- dothels bzw. der Endothelzellen 3 in allen Blutgefäßen des Korpers in der Aktivierung von Protein C, das standig durch die Leber in das Blutplasma eingespeist wird. Die Zellen tieferer Schichten der Blutgefaßwand (z.B. Gefäßmuskelzellen und Perizyten) können Protein C nicht aktivieren. Andererseits zeichnen sich diese Zellen aber durch bestimmte prothrombogene Eigenschaften, z.B. eine besonders hohe Konzentration an Gewebefaktor aus, dem heu- te eine entscheidende Ausloserrolle bei der Entstehung in- travasaler Fibrinthromben zugemessen wird. Diese prothrombogene Aktivität laßt sich an hochgereinigten gesunden arteriellen oder venösen Endothelzellen tierischen und menschlichen Ursprungs nicht nachweisen.
In der Figur symbolisieren durchgehende Pfeile, wie die Endothelzellen 3 Protein C aktivieren. Die punktierten Pfeiledeuten dagegen an, daß die Zellen 4 der tieferen Blutgefaßwand Gewebefaktor entfalten. Je größer also die- jenige Fläche der Innenwandung 2 der Gefaßprothese 1 ist, die nicht von Endothelzellen 3 bewachsen ist, desto großer ist die Menge des Gewebefaktors, der im Kontakt mit einer in die Gefäßprothese 1 gefüllten Inkubationslösung 5 steht . Die Erfindung zielt nun darauf, daß anti- bzw. prothrombo- gene Aktivitäten der in der Gefaßprothese 1 aufgezüchteten Zellen 3 der Endothelschicht bzw. der Zellen 4 der Gefaßwand hochspezifisch zu erfassen und zu quantifizieren. Beispielsweise aus Protein C in Gegenwart von Thrombin an der Endotheloberflache in einer entsprechend zusammengesetzten Inkubationslosung gebildetes aktives Protein C (PCA) kann nach der Entnahme der Inkubationslosung aus dem Lumen der Gefaßprothese 1 mit einem spezifischen, für pho- tometπsche Tests kommerziell erhaltlichen Substrat inkubiert werden. Die dabei proportional zur PCA-Menge gebildete Produktmenge wird standardmäßig mit Hilfe optischer Meßgerate registriert. Im Prinzip analog verlauft der gegebenenfalls zusatzlich vorzunehmende Nachweis von Gewebe- faktor an der Innenwandund 2. In diesem Fall wird die Gefaßprothese 1 mit einer die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X enthaltenden physiologischen Salzlosung inkubiert (z.B. das kommerziell erhältliche Präparat Fa. „Beriplex der Centeon, Marburg) . Im Kontakt mit eventuell noch nicht vom gezüchteten Endothel abgedeckten Wandbereichen und dem dort befindlichen Gewebefaktor würde Faktor X zu Faktor Xa umgewandelt. Nach der Entnahme dieser Salzlosung und Zusatz der Gerinnungsfaktoren Va bzw. II kann dann in vitro unter reproduzierbaren Inkubationsbedingungen Thrombin ge- bildet werden, das ein gleichzeitig vorhandenes spezifisches Substrat hydrolisieren kann. Das dabei gebildete Produkt kann wieder on-line mit einem optischen Meßverfahren registriert werden.
Bei allen im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Kontakt mit der Innenwandung 2 der Gefaßprothese 1 zu bringenden Gerinnungsfaktoren bzw. deren Losungen handelt es sich um klinisch geprüfte Präparate, die samtliche Auflagen des Arzneimittelrechts erfüllen. Ein weiterer Vorteil des beschriebenen erfindungsgemaßen Verfahrens besteht darin, daß es sich auch mehrfach im Verlauf der Endotheliasierungsprozedur anwenden laßt. Zwischenzeitlich kann die Gefaßprothese wieder mit frischem Nahrmedium gefüllt und die Kultivation des Endothels fortgesetzt werden. Auf diese Weise laßt sich der Endothelia- sierungsprozeß im zeitlichen Verlauf genau verfolgen.
Erfindungsgemaß lassen sich alle notwendigen Testlosungen und Inkubationsprozesse problemlos unter vollkommen sterilen Bedingungen durchfuhren. Darüber hinaus liegt ein besonderer Vorteil auch in der Schnelligkeit des hier beschriebenen Qualitatskontrollverfahrens .
Schließlich handelt es sich bei allen in Rahmen des beschriebenen erfindungsgemaßen Verfahrens benötigten Faktoren bzw. Substanzen um klinisch bereits verfugbare in anderen Zusammenhangen schon eingesetzte Produkte, die relativ kostengünstig zu beziehen sind.
Zusammenfassend werden durch die vorliegende Erfindung die folgenden Vorteile erreicht.
1. Der Qualitätsnachweis bezieht sich bei der vorliegenden Erfindung auf möglichst wenige, aus Objektivitatsgrun- den heraus aber hochselektive Merkmale entweder der vollkommenen Endothel-denudierten oder der vollkommen mit vitalen Endothelzellen überzogenen Prothesenwand.
2. Die gesamte Endothelwand der zu implantierenden Prothese wird einbezogen.
3. Das erfindungsgemaße Verfahren erfaßt weniger passive
(z.B. rein anatomische) Merkmale als vielmehr funktio- nelle Merkmale. Diese belegen den Grad der erreichten Antithrombogenitat der Endothelflache der zu implantierenden Gefaßprothese.
4. Das erfmdungsgemaße Verfahren beruht auf wissenschaft- lieh akzeptierten und zweifelsfrei dokumentierten Meßmethoden .
5. Bei dem vorliegenden Verfahren werden vorteilhafterwei- se nur Chemikalien verwendet, gegen die keine arznei- mittelrechtlichen Bedenken bestehen.
6. Die Qualitätskontrolle laßt sich nach dem erfindungsgemaßen Verfahren schon an der noch nicht implantierten Prothese vollziehen und gibt Aufschluß über den er- reichten Konfluenzzustand der noch wachsenden Endothelzellen .
7. Das erfmdungsgemaße Verfahren ist wiederholt und stets unter strikt sterilen Bedingungen durchfuhrbar.
8. Das erfmdungsgemaße Verfahren ermöglicht schnelle Ergebnisse und gibt einen direkten Aufschluß über die Qualltat der anschließend sofort transplantierten Gefaßprothese .
9. Das erfmdungsgemaße Verfahren ist sehr kostengünstig.
10. Neben endothelialisierten Gefaßprothesen laßt sich das beschriebene Verfahren auch zur Qualitatsuberprufung der Endothelialisierung von Herzklappen und Herzhohlen einsetzen.
11. Schließlich eignet sich das hier beschriebene Verfahren auch zur Selektierung von für den autologen Gefaßersatz vor. Beispiel: Messung von Gewebefaktor im Lumen intakter Ohrvenen von Kaninchen
Nach Abschluß der Protein C-Aktivierungsstudien wurde dieselben Venensegmente mit Albumin/PBS-Losung grundlich gewaschen und dann mit 37 °C warmer Beriplex-Losung gefüllt ( eine Stammlosung von Beriplex P/N 500 [Centeon, Marburg] in 13 ml Aqua ad iniectabilia, davon ein 500μl Aliquot 1:25 mit SL verdünnt, ausreichend für 5 Standard- Venensegmente) , und bei 37°C inkubiert. Nach definierten Zeitintervallen wurden 100 μl-Aliquots abgenommen und in Mikrotiterplatten sofort mit 37 °C warmer Stop-Lösung ( wassrige Losung von 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 120 mM NaCl , 2,7 mM KC1, eingestellt auf pH 10,0) vermischt. Nach Zugabe von Substrat für aktivierten Faktor Xa („S-2222", Chro- mogenix) bis zur Endkonzentration 1,5 mM, wurde die photometrische Messreihe bei 37 °C begonnen. Dazu wurde alle 30 sec die Extinktionszunahme bei 405 nm über einen Zeitraum von 15 min gemessen. Als Referenz diente verdünnte Beri- plexlόsung, die zuvor im selben Verhältnis mit reiner Deoxycholatlosung (0,025 %ig in SL) und Stop-Losung vermischt worden war.
Gewebefaktor in der Endothel-denudierten Ohrvene des Ka- ninchens .
In der Zwischenzeit der Gewebefaktor-Photometrie (s.o.) wurden die nun schon mehrfach untersuchten Ohrvenen mit Albumin/PBS-Lόsung gespült und dann dem in der Literatur beschriebenen Verfahren von E. Jaffe folgend durch 30 mi- nütige Kollagenase-Inkubation bei 37 °C von Endothel befreit. Danach wurden die Gefäße kräftig mit PBS durchspült, wobei immer wieder auch Luftblasen in den Perfusi- onsstrom inkorporiert wurden. In den so de-endothelialisierten Gefäße wurden anschließend alle oben beschriebenen Inkubationsreihen zum Nachweis von aktivem Protein C bzw. freigelegtem Gewebefaktor unter sonst völlig analogen Bedingungen durchgeführt.

Claims

A n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Qualitätskontrolle der Endothelbeschich- tung f r chirurgische Implantationszwecke entnommener, nativer Blutgefäße oder endothelialisierter künstlicher oder naturlicher Gefaßprothesen (1), Gefaßklappen, Herzklappen oder Herzhohlen, dadurch gekennzeichnet, daß zur Qualitätskontrolle charakteristische und selektive meta- bolische Aktivitäten und/oder strukturellen Merkmale der an der jeweiligen Prothesenwand (2) aufgezüchteten En- dothelschicht (3) und der Zellen (4) der tieferen Pro- thesenwandschichten (2) als Maß für die Vollständigkeit der Endothelialisierung erfaßt und quantifiziert wer- den.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die antithrombogenen Aktivitäten der an der Prothesenwand (2) aufgezüchteten Endothelschicht (3) und die pro- thrombogenen Aktivitäten der Zellen (4) der tieferen Prothesenwandschichten (2) erfaßt werden.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den verwendeten Gefaßprothesen um durch „Tissue engeneering" hergestellte, kunstliche Gefäße handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Prothesen (1) kryopraservierte Blutgefäße, Herzklappen oder Herzhohlen verwendet werden, deren ursprungliche Endothelbeschichtung entfernt wurde und an deren relevanter Oberflache (2) eine patienteneigene Endothelschicht (4) aufgezüchtet wurde.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß aus Protein C in Gegenwart von Throm- bin und besonderen Oberflachenstrukturen der Endothel- schicht (3) der jeweiligen Prothese (1) im Verlauf einer Inkubationsphase gebildetes, losliches aktives Protein C (PCA) nach der Entnahme von Aliquots einer geeigneten Inkubationslosung (5) mit einem spezifischen Substrat inkubiert wird und die dabei proportional zur PCA-Menge gebildete Produktmenge registriert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Produktmenge mit der Hilfe optischer Meßgerate registriert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß mit den oben genannten Gefäß- bzw. Herzersatzteilen (1) eine Geringungsfaktoren enthaltende
Inkubationslosung in Kontakt gebracht wird, wobei die
Zellen (4) der tieferen Prothesenwandschichten (2), die nicht mit Endothelzellen abgedeckt sind aufgrund des dort exponierten „Gewebefaktors" Gerinnungsfaktoren der Inkubationslosung (5) aktivieren, deren Menge erfaßt und quantifiziert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß mit den bezeichneten Prothesen (1) eine physiologische Salzlosung als Inkubationslosung zusammen mit Gerinnungsfaktoren II, VII, VIIII und X kontaktiert wird, wobei durch den Gewebefaktor der Gerinnungsfaktor VII zum Faktor Vlla umgewandelt wird und dieser den Faktor X zum Faktor Xa umwandelt, und daß zu bestimmten Zeit- punkten Salzlosung aus dem Inkubationsgemisch (5) entnommen und mit einem spezifischen Faktor-Xa-Substrat inkubiert wird und daß das dabei entstehende farbige Produkt mit einem optischen Meßverfahren quantifiziert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine als Inkubationslosung dienende physiologische Salzlosung die notwendigen, oben genannten Gerin- nungsfaktoren zur Wirkung bringt, die z.B. ein als "Be- riplex" bezeichnetes Präparat der Firma Centeon, Marburg enthalt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubationslosung fortlaufend zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und photometrisch untersucht wird.
EP00951494A 1999-08-13 2000-08-10 Verfahren zur qualitatskontrolle der endothelauskleidung von gefässprothesen Withdrawn EP1200836A1 (de)

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