EP1144651A1 - Polypeptides derives de jnk3 - Google Patents
Polypeptides derives de jnk3Info
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- EP1144651A1 EP1144651A1 EP00900608A EP00900608A EP1144651A1 EP 1144651 A1 EP1144651 A1 EP 1144651A1 EP 00900608 A EP00900608 A EP 00900608A EP 00900608 A EP00900608 A EP 00900608A EP 1144651 A1 EP1144651 A1 EP 1144651A1
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Definitions
- JNK3 The tissue distribution of isoforms is widely dispersed with varying levels of expression.
- JNK3 isoforms are more selectively expressed in the brain (for example in the hippocampus or in the cerebellum (Mohit et al. 1995)), but also in the heart and the testes.
- a growing number of results underlines the importance of JNK3 in the phenomena of neurodegeneration and neuronal death by apoptosis, however, the mode of action of JNK3 is not known to date.
- JNK3 immunoreactivity is diffuse and only cytoplasmic (Zhang et al. 1998).
- JNK3 immunoreactivity is diffuse and only cytoplasmic (Zhang et al. 1998).
- the deletion of the JNK3 gene in mice allows resistance to kainic acid, a glutamate receptor agonist participating in the phenomena of excitotoxicity.
- the authors describe in detail the reduction of epileptic effects and the prevention of neuronal death by apoptosis in the hippocampus, after injection of kainic acid in these mice deleted for JNK3.
- a mutated form of PBS2 is expressed in the strain indicated above: PBS2 DD (Wurgler-Mu ⁇ hy et al. 1997) which has a toxic effect on the growth of yeast.
- PBS2 DD Wood-Mu ⁇ hy et al.
- This toxicity depends on the activity of the downstream protein kinase, which according to the present invention is a new isoform of JNK3.
- Inhibitors of these new isoform of JNK3 are likely in this case to inhibit the toxic effect of mutated PBS2 and thus allow the restoration of the growth of this strain.
- Another subject of the invention relates to compounds or ligands capable of inhibiting the activity of the polypeptides according to the invention and capable of being obtained using one of these microorganisms as a screening tool
- Another subject of the invention relates to the use of a compound or ligand identified and / or obtained according to one of the methods described above as a medicament.
- Such compounds are in fact capable of being used for the prevention, improvement or treatment of various pathologies caused by neuronal degeneration, among which may be mentioned Alzheimer's disease, Huntington's disease and Parkinson's disease , senile dementia and those due to AIDS, head trauma, anoxia, hypoxia and cerebral edema.
- the identification of the specific partner polypeptides of the different isoforms of JNK3 can be carried out by the technique of cloning in double hybrid according to the techniques described by Fields et al. 1994; the bait protein can in particular be the whole protein JNK3 ⁇ N ⁇ l or JNK3 ⁇ N ⁇ 2, or the N-terminal extension of 38 amino acids of JNK3 which is absent in the JNK3 ⁇ N isoforms.
- the bait protein can in particular be the whole protein JNK3 ⁇ N ⁇ l or JNK3 ⁇ N ⁇ 2, or the N-terminal extension of 38 amino acids of JNK3 which is absent in the JNK3 ⁇ N isoforms.
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Abstract
La présente invention est relative au domaine de la biologie et de la régulation du cycle cellulaire. Plus particulièrement, la présente invention concerne des polypeptides dérivés de la protéine JNK3 humaine, leurs variants, les séquences nucléotidiques correspondantes, et leurs utilisations.
Description
POLYPEPTIDES DERIVES DE JNK3
La présente invention est relative au domaine de la biologie et de la régulation des voies de transduction du signal en réponse aux stimuli extracellulaires. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux polypeptides dérivés de la protéine JNK3 humaine, leurs variants, les séquences nucléotidiques correspondantes, et leurs utilisations.
La protéine JNK (c-jun N-terminal kinase), nommée aussi SAPK (Stress- Activated Protein Kinase), appartient à la famille des MAP (Mitogen-Activated Protein) kinases. Elle est impliquée dans les voies de transduction du signal en réponse aux stimuli extracellulaires (par exemple cytokines proinflammatoires ou stress environnementaux). Son activation nécessite la phosphorylation de la Thréonine 221 et de la Tyrosine 223 au sein d'un motif tripeptide très conservé T-P-Y situé dans le domaine kinase (Dérijard et al. 1994). Les substrats de la JNK sont des facteurs de transcription tels que c-Jun (phosphorylé sur la Serine 63 et la Serine 73), ATF-2 (phosphorylé sur la Thréonine 69 et la Thréonine 71) et Elk-1.
Les JNK présentent de nombreuses isoformes, et dix isoformes ont été répertoriées à ce jour. Elles dérivent de trois gènes différents, nommés JNK1 , JNK2 et JNK3. Les gènes JNK1 et JNK2 codent pour deux isoformes α et β par épissage alternatif (Gupta et al. 1996). Pour chaque isoforme α et β, il existe une version courte et une version longue en C-terminal. La version courte est liée à l'insertion, lors de l 'épissage alternatif, de cinq nucléotides qui apportent un codon de terminaison.
Les JNK3αl et J K3α2 sont les deux seules isoformes de J K3 répertoriées jusqu'à présent. Elles diffèrent des JNK1 ou JNK2 entre autre par une extension en N-terminal de 38 acides aminés dont la fonction n'a pas encore été établie. L'homologue JNK3 de rat, nommée SAPKβ, ne présente pas cette particularité.
La répartition tissulaire des isoformes est très dispersée avec des taux d'expression variables. Cependant, il a été montré que les isoformes JNK3 sont plus sélectivement exprimées dans le cerveau (par exemple dans l'hippocampe ou dans le cervelet (Mohit et al. 1995)), mais aussi dans le coeur et les testicules.
Un nombre croissant de résultats souligne l'importance de JNK3 dans les phénomènes de neurodégénérescence et de mort neuronale par apoptose cependant, on ne connaît pas à ce jour le mode d'action de JNK3.
Il a été montré que les neurones de la région CA1 de l'hippocampe de patients ayant subi une hypoxie ont une forte immunoréactivité JNK3 au niveau nucléaire alors que dans des échantillons contrôles, l' immunoréactivité JNK3 est diffuse et uniquement cytoplasmique (Zhang et al. 1998). De plus, la délétion du gène JNK3 chez la souris permet la résistance à l'acide kainique, agoniste des récepteurs au glutamate participant aux phénomènes d'excitotoxicité. Les auteurs (Yang et al. 1997) décrivent de façon détaillée la réduction des effets épileptiques et la prévention de la mort neuronale par apoptose dans l'hippocampe, après injection d'acide kainique dans ces souris délétées pour JNK3. Enfin, l'un des substrats préférentiels de JNK3 est le facteur de transcription c-Jun, un des composants du complexe API lui aussi largement impliqué dans des fonctions de survie et de dégénérescence neuronale. Le facteur c-Jun semble être porteur d'une double fonction à la fois dans la mort cellulaire et dans la protection neuronale (Herdegen et al. 1997). La suppression de l'expression de c-Jun ou son inhibition fonctionnelle protègent les neurones hippocampiques et sympathiques de la mort cellulaire en culture (Estus et al. 1994, Ham et al. 1995). Enfin, l'expression de c-Jun est augmentée dans des neurones apoptotiques en dégénérescence après ischémie, section de nerfs, irradiation mais aussi dans des biopsies de malades atteints des pathologies neurodégénératives telles que la sclérose multiple, la sclérose amyotrophique latérale, les maladies d'Alzheimer, Parkinson et Huntington (Anderson et al. 1994, Herdegen et al. 1998, Martin et al. 1996).
La protéine kinase JNK3 apparaît aujourd'hui comme un des éléments clefs impliqués dans la dégénérescence neuronale, cependant on ne connaît pas la nature précise de son mode d'action. A cet égard l'identification de nouvelles isoformes naturelles de JNK3 constitue un enjeu majeur pour la compréhension du mécanisme d'action de cette protéine dans les phénomènes de dégénérescence neuronale et pour l'identification de nouvelles cibles à visée thérapeutique.
La présente invention décrit la mise en évidence, le clonage et la caractérisation de nouveaux polypeptides dérivés de JNK3.
La présente invention résulte de la caractérisation de trois nouvelles isoformes de JNK3 humaine nommées hJNK3αl39, JNK3ΔNαl et JNK3ΔNα2. Elle découle plus particulièrement de la mise en évidence que deux de ces isoformes JNK3ΔNαl et JNK3ΔNα2, sont dépourvues de l'extension N-terminale qui caractérise les isoformes connues de JNK3 et de la démonstration que ces isoformes JNK3ΔNαl et JNK3ΔNα2 présentent des propriétés différentes des isoformes de JNK3 déjà décrites. Elle découle en outre de la découverte que ces nouvelles isoformes dépourvues de l'extension N-terminale présentent de manière inattendue des propriétés communes avec les isoformes JNKl βl et JNK2αl .
L'identification de ces nouvelles isoformes de JNK3 permet d'envisager de nombreuses applications. Ces applications recouvrent notamment l'identification de nouveaux composés neuroprotecteurs capables d'interagir spécifiquement avec ces isoformes. Ces composés peuvent être utilisés pour la prévention et le traitement de différentes pathologies causées par une dégénérescence neuronale, parmi lesquelles on peut citer la maladie d' Alzheimer, la maladie de Huntington et la maladie de Parkinson, les démences séniles et celles dues au SIDA, les traumatismes crâniens, les anoxies, hypoxies et oedèmes cérébraux. Ces nouvelles isoformes peuvent également être utilisées en modélisation moléculaire pour permettre une meilleure compréhension de la structure et de la fonction de ces enzymes ainsi que de leur implication dans les pathologies mettant en cause une ou plusieurs isoformes de JNK3. Enfin, ces isoformes de JNK3 sont également utiles pour mettre en évidence de nouvelles protéines impliquées dans des voies de signalisation intracellulaire spécifiques à chacune d'elles. Il est ainsi possible d'identifier de nouvelles cibles pertinentes impliquées dans les neuropathologies dégénératives.
Un premier objet de l'invention concerne des polypeptides dérivés des isoformes JNK3αl ou JNK3α2 comportant une délétion en N-terminal ou C-terminal. Selon un premier mode, il s'agit de dérivés comportant une délétion en N-terminal correspondant aux 38 premiers acides aminés de ces isoformes. Selon une autre variante, il s'agit de dérivés comportant une délétion des acides aminés C-terminaux à partir de l'acide aminé 139.
Préférentiellement, les dérivés selon l'invention sont des polypeptides choisis parmi les séquences SEQ ID N°23, SEQ ID N°25, SEQ ID N°27 ou un variant de celles-ci.
Le terme variant au sens de l'invention désigne tout polypeptide dont la structure se distingue d'un polypeptide choisi parmi les séquences SEQ ID N°23 ou SEQ ID N°25 ou SEQ ID N°27 par une ou plusieurs modifications de nature génétique, biochimique et/ou chimique et conservant au moins l'une des propriétés biologiques dudit polypeptide. Il peut s'agir en particulier de toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'améliorer leur niveau de production, celui d'augmenter leur résistance à des protéases ou d'améliorer leur passage à travers les membranes cellulaires, celui d'augmenter leur efficacité thérapeutique ou de réduire leurs effets secondaires, celui d'augmenter l'affinité des polypeptides pour leurs sites d'interaction, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques. Avantageusement, les variants comprennent des délétions ou des mutations portant sur des acides aminés dont la présence n'est pas déterminante à l'activité du dérivé. De tels acides aminés peuvent être identifiés par exemple par des tests d'activité cellulaire comme décrit dans les exemples.
L'invention a également pour objet, un polypeptide tel que défini selon la séquence SEQ ID N°29 correspondant au fragment 1-38 des des formes JNK3αl ou JNK3α2.
Un autre objet de la présente invention concerne tout acide nucléique codant pour un polypeptide dérivé de JNK3 tel que défini ci-avant.
L'acide nucléique selon l'invention peut être un acide ribonucléique (ARN) ou désoxyribonucléique (ADN). En outre, il peut s'agir d'un ADN génomique (ADNg) ou complémentaire (ADNc). Il peut être d'origine humaine, animale, virale, synthétique ou semi-synthétique. Il peut être obtenu de différentes manières et notamment par synthèse chimique en utilisant les séquences présentées dans la demande et par exemple un synthétiseur d'acides nucléiques. Il peut également être obtenu par criblage de banques au moyen de sondes spécifiques, notamment telles que décrites
dans la demande. Il peut encore être obtenu par des techniques mixtes incluant la modification chimique (élongation, délétion, substitution, etc.) de séquences criblées à partir de banques. D'une manière générale, les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier.
Préférentiellement, l'acide nucléique selon l'invention est un ADNc ou un
ARN. L'acide nucléique selon l'invention est avantageusement choisi parmi :
(a) tout ou partie de la séquence SEQ ID N°22 ou SEQ ID N°24 ou SEQ ID N°26 ou de leur brin complémentaire,
(b) toute séquence hybridant avec les séquences (a) et codant pour un dérivé selon l'invention,
(c) les variants de (a) et (b) résultant de la dégénérescence du code génétique.
Les séquences d'acides nucléiques selon l'invention peuvent également servir à la réalisation d'oligonucléotides antisens utilisables pour contrôler l'expression des différentes isoformes de JNK3. A cet égard, l'invention concerne également les séquences antisens, dont l'expression dans une cellule cible permet de contrôler spécifiquement la traduction d'ARNm cellulaires codant pour JNK3ΔNαl ou JNK3ΔN 2 ou hJNK3αl 39 ou encore JNK3αl ou JNK3α2 , par hybridation des oligonucléotides antisens sur les séquences spécifiques aux ARNm correspondants. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires des ARNm cellulaires des différentes isoformes de JNK3 et bloquer ainsi leur traduction en protéine selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences nucléotidiques SEQ ID N°22, 24 ou 26 transcrites dans l'orientation inverse.
L'invention permet également la réalisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hybrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de diagnostic, pour la détection de l'expression ou surexpression des différentes isoformes de JNK3, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Ces sondes peuvent également être utilisées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques
homologues codant pour des peptides tels que définis précédemment, à partir d'autres sources cellulaires et préférentiellement de cellules d'origines humaines. Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 17 bases et avantageusement moins de 300 bases, mais elles peuvent également comporter jusqu'à l'intégralité d'une des séquences précitées ou de leur brin complémentaire. Préférentiellement, ces sondes sont marquées préalablement à leur utilisation. Pour cela, différentes techniques connues de l'homme du métier peuvent être employées (marquage radioactif, enzymatique, etc.).
Les sondes nucléotidiques peuvent être utilisées, notamment par PCR, comme outil de diagnostic pour identifier :
- soit les isoformes codant pour les JNK3ΔNαl ou α2 en utilisant un oligonucléotide correspondant à la séquence d'insertion de 27 nucléotides spécifique des SEQ ID N°22 et 24 située en 5' du codon d'initiation, et d'un oligonucléotide commun à toutes les isoformes JNK3 ;
- soit les isoformes codant pour les JNK3 précédemment décrites dans la littérature en utilisant un oligonucléotide correspondant à la séquence située de part et d'autre de la région d'insertion présente dans la séquence des JNK3ΔN αl ou α.2, et d'un oligonucléotide commun à toutes les isoformes de JNK3.
Le diagnostic peut être réalisé également par Northern (Maniatis, T. et al.1989) pour identifier :
- soit les isoformes codant pour les JNK3ΔNαl ou α.2 en utilisant une sonde ohgonucléotidique correspondant à la séquence d'insertion de 27 nucléotides spécifique des SEQ ID N°22 et 24 située en 5' du codon d'initiation ;
- soit les isoformes codant pour les JNK3 précédemment décrites dans la littérature en utilisant une sonde ohgonucléotidique correspondant à la séquence de JNK3 située de part et d'autre de la région d'insertion présente dans la séquence des JNK3ΔNαl ou α2.
La présente invention concerne également toute cassette d'expression comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant, un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la transcription.
Un autre objet de l'invention concerne en outre tout vecteur comprenant une séquence nucléotidique selon l'invention ou une cassette d'expression telle que définie ci-avant. Le vecteur de l'invention peut être par exemple un plasmide, un cosmide ou tout ADN non encapsidé par un virus, un phage, un chromosome artificiel, un virus recombinant etc. Il s'agit de préférence d'un plasmide ou d'un virus recombinant.
A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention on peut tout particulièrement citer les vecteurs de type adénovirus, rétrovirus, virus associés à l'adénovirus (AAV), virus de l'herpès ou virus de la vaccine. La présente demande a également pour objet des virus recombinants défectifs comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'invention. De tels vecteurs sont susceptibles d'être utilisés en thérapie génique pour le traitement de traumas périphériques tels que notamment les traumas de la moelle épinière ou les dégénérescences rétiniennes.
La présente invention a également pour objet des cellules hôtes transformées avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique ou un vecteur selon l'invention. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des polypeptides selon l'invention sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules d'insecte Sf9, les cellules COS, CHO, C127, les cellules de neuroblastomes humains etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces .
Selon un mode préféré, les cellules hôtes sont avantageusement représentées par des souches de levures recombinantes. Préférentiellement, les cellules hôtes
comprennent au moins une séquence ou un fragment de séquence choisis parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°22 ou SEQ ID N°24 ou SEQ ID N°26 pour la production des polypeptides selon l'invention.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de préparation des polypeptides selon l'invention selon lequel on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon l'invention, dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, séquence leader de sécrétion, etc.) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé.
Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à réplication autonome chez l'hôte choisi. S'agissant de vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés, par exemple, en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragments d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier ces anticorps peuvent être préparés par immunisation d'un animal contre un polypeptide dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID N°23 ou SEQ ID N°25 ou SEQ ID N°27 ou tout fragment ou dérivé de celles-ci, puis prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme du métier. Les anticoφs ou fragments d'anticoφs selon l'invention peuvent notamment être utilisés en diagnostic pour la réalisation de Western blot (Maniatis, T. et al.1989) permettant l'identification des différentes isoformes protéiques des JNK3 en fonction de leur poids moléculaire en utilisant un anticoφs spécifique des JNK3 pour visualiser ces protéines. Ces anticoφs peuvent aussi être à l'origine de la fabrication de ScFv qui au moyen de vecteurs appropriés (adénovirus, AAV, rétrovirus, etc ...) pourront être utilisés en thérapie génique pour
inhiber spécifiquement certaines isoformes de JNK3 selon la technique décrite dans WO94/29446 ou selon la technique décrite par Marasco (Marasco et al, 1997).
Selon un mode préféré, l'invention concerne des anticoφs spécifiques des isoformes JNK3αl et JNK3α2. Il peut s'agir notamment d'anticoφs monoclonaux capables de reconnaître un épitope situé dans la partie N-terminale des formes JNK3αl et JNK3α2 . De manière avantageuse, il s'agit d'un épitope compris dans le fragment délimité entre les acides aminés situés aux positions 1 et 38 des formes JNK3αl et JNK3α2 ; ce fragment est représenté dans la séquence SEQ ID N°29. De tels anticoφs sont susceptibles d'induire un effet neuroprotecteur en neutralisant spécifiquement les formes JNK3αl et JNK3α2. Ces anticoφs sont également susceptibles de conférer à la protéine des propriétés particulières qui peuvent modifier son taux d'expression, sa stabilité, son activité catalytique, sa spécificité de substrats, et son affinité pour des protéines qui interviennent dans la modulation de ces propriétés.
L'invention englobe également les anticoφs dérivés des anticoφs monoclonaux définis ci-avant. Au sens de la présente invention, on entend par anticoφs dérivés toute molécule qui comprend l'idiotype des anticoφs monoclonaux selon l'invention et notamment les anticoφs chimériques, les anticoφs simple chaîne et les fragments Fab. De tels anticoφs chimériques peuvent être obtenus selon les techniques décrites par Morrison et al., J. Bacteriol. 159 : 870 ( 1984) ; Neberger et al., Nature 312:604-608 (1984) ; Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985), incoφorées à la présente par référence. Les fragments Fab qui contiennent l'idiotype des anticoφs selon l'invention peuvent être générés par toute technique connue de l'homme du métier. L'invention a également pour objet des anticoφs simple chaîne ScFv dérivés des anticoφs monoclonaux définis ci-avant. De tel anticoφs simple chaîne peuvent être obtenus selon les techniques décrites dans les brevet US 4,946,778, US 5,132,405 et US 5,476,786.
La présente invention concerne également un procédé d'identification de composés capables de se lier aux polypeptides selon l'invention. La mise en évidence et/ou l'isolement de ces composés, peut-être réalisée selon les étapes suivantes :
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et,
- on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Selon un mode particulier, un tel procédé permet d'identifier des molécules capables de bloquer spécifiquement les isoformes JNK3ΔNαl et JNK3ΔNα2 et de moduler ainsi les processus de dégénérescence neuronale. Ces molécules sont susceptibles de posséder une activité neuroprotectrice du fait de l'inhibition spécifique de ces isoformes. Selon un autre mode, un tel procédé permet d'identifier des inhibiteurs spécifiques des isoformes JNK3αl et JNK3α2.
La présente invention concerne en outre des procédés d'identification de composés capables d'inhiber l'activité des dérivés de JNK3 selon l'invention par mesure de la croissance de microorganismes transformés avec un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention. La mise en évidence et/ou l'isolement de ces composés, peut-être réalisée par un crible négatif de sélection de drogue (la drogue inhibe la croissance de la levure) et ou par un crible positif (la drogue restaure la croissance de la levure) . Ce dernier évite la sélection d'antifongiques qui faussent les résultats. Ces deux cribles utilisent un mutant Hogl exprimant une isoforme de JNK3. Le premier est utilisé en condition hyperosmotique. Le deuxième contient en supplément la forme PBS2dd qui hyperstimule la voie Hogl induisant la mort de la levure en condition normale. PBS2dd n'est toxique que si Hogl est fonctionel ou remplacé par JNK3.
La présente invention est donc relative à un procédé d'identification de composés inhibant la croissance de microorganismes transformés avec un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention comprenant les étapes suivantes :
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec au moins un microorganisme transformés avec un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention, dans des conditions permettant la croissance dudit microorganisme, et
- on détecte et/ou isole les molécules inhibant la croissance dudit microorganisme.
Elle a en outre pour objet un un procédé d'identification de composés permettant la croissance de microorganismes transformés avec un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention comprenant les étapes suivantes :
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec au moins un microorganisme transformés avec un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention, dans des conditions inhibant la croissance dudit microorganisme, et
- on détecte et/ou isole les molécules permettant la croissance dudit microorganisme.
Ce microorganisme peut être une levure contenant un gène Hogl inactif et exprimant une des nouvelles isoformes de JNK3 selon l'invention, telle que celle décrite dans les exemples qui suivent, ou tout autre microorganisme présentant des propriétés équivalentes. Cette levure pousse en condition hyperosmotique. Des produits inhibiteurs de ces nouvelles isoforme de JNK3 sont suceptibles d'inhiber ou de ralentir la croissance de cette souche en conditions hyperosmotiques.
Selon un autre mode de mise en oeuvre on exprime dans la souche indiquée ci-dessus une forme mutée de PBS2 : PBS2DD (Wurgler-Muφhy et al. 1997) qui a un effet toxique sur la croissance de la levure. Cette toxicité dépend de l'activité de la protéine kinase située en aval, qui selon la présente invention, est une nouvelle isoforme de JNK3. Des produits inhibiteurs de ces nouvelles isoforme de JNK3 sont suceptibles dans ce cas d'inhiber l'effet toxique de PBS2 muté et ainsi permettre la retauration de la croissance de cette souche.
Un autre objet de l'invention concerne des composés ou ligands capables d'inhiber l'activité des polypeptides selon l'invention et susceptibles d'être obtenus en utilisant un de ces microorganimes comme outil de criblage
Un autre objet de l'invention concerne des composés ou ligands capables de se lier aux polypeptides selon l'invention et susceptibles d'être obtenus selon l'un des procédés définis ci-avant.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un composé ou ligand identifié et/ou obtenu selon l'un des procédés décrits ci-avant comme médicament. De tels composés sont en effet susceptibles d'être utilisés pour la prévention, l'amélioration ou le traitement de différentes pathologies causées par une dégénérescence neuronale, parmi lesquelles on peut citer les maladies d'Alzheimer, la maladie de Huntington et la maladie de Parkinson, les démences séniles et celles dues au SIDA, les traumatismes crâniens, les anoxies, les hypoxies et les oedèmes cérébraux.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un composé ou ligand tel que défini ci-avant.
Les polypeptides de l'invention sont également utiles pour l'identification d'autres partenaires intervenant dans les mécanismes de dégénérescence neuronale ou dans le domaine de l'ischémie cardiaque par recherche et identification de molécules interagissant in vivo avec ces polypeptides. A cet égard, un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de polypeptides partenaires spécifiques des différentes isoformes naturelles de JNK3. Il peut s'agir de polypeptides partenaires spécifiques des formes JNK3αlΔN ou JNK3α2ΔN ou hJNK3αl 39 ou de polypeptides partenaires spécifiques des formes JNK3αl et JNK3α2. L'identification des polypeptides partenaires spécifiques des différentes isoformes de JNK3 peut être réalisée par la technique de clonage en double hybride selon les techniques décrites par Fields et al. 1994 ; la protéine appât pouvant notamment être la protéine entière JNK3ΔNαl ou JNK3ΔNα2, ou l'extension N-terminale de 38 acides aminés de JNK3 qui est absente dans les isoformes JNK3ΔN.
D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : comparaison des séquences nucléotidiques entre les différentes isoformes de JNK3 humain. Les séquences nucléotidiques de la région 5' des différentes isoformes de JNK3 ont été alignées les unes par rapport aux autres. Les différences de séquence par rapport aux séquences publiées de JNK3αl et 3α2 sont notées en gras et les codons de terminaison apportés sont soulignés.
Figure 2 : comparaison entre les séquences nucléotidiques de la région 5' de la JNK3αΔN humaine et de la SAPKβ de rat. Les séquences nucléotidiques de la région 5' des isoformes humaines de JNK3ΔNαl et ΔNα2 ont été alignées par rapport à celle de rat SAPKβ. Les différences entre les séquences sont indiquées par des astérisques.
Figure 3 : comparaison entre les séquences polypeptidiques des différentes JNK3 humaines. Les séquences polypeptidiques des différentes isoformes de JNK3 ont été alignées les unes par rapport aux autres montrant une différence dans la région N- terminale.
MATERIEL ET METHODES
1 ) Microorganismes utilisés.
S.cerevisiae W303a : MATa , ade2, trpl, leu2, ura3, his3.
E.coli TG1 : F'f traD 36, lacf>,A(lacZ) Ml 5, proA+ B+J supEA(hsdm-mcrb)5 (rκ mκ~ McrB), thi Δ (lac pro AB)
2) Milieux de culture
Milieu YPD (milieu complet pour levures) : Bacto-yeast extract (Difco) 10 g/1
, Bacto-peptone (Difco) 20 g/1 , Glucose (Merk) 20 g/1. Ce milieu peut être solidifié par addition d'agar (20g/l) et stérilisé par autoclavage à 110°C pendant 20mn. On ajoute, si nécessaire, à ce milieu 0,5M ou 0,9M de NaCl oui M de Sorbitol pour être en condition hyperosmotique.
Milieu YNB (milieu minimum pour levures) : Bacto-yeast nitrogen base w/o amino acids (Difco) 6,7 g/1 , Glucose (Merk) 20 g/1. Ce milieu peut être solidifié par addition d'agar (20g/l) et stérilisé par autoclavage. Les acides aminés ou les bases azotées nécessaires à la croissance des levures auxotrophes, préalablement stérilisés par filtration, sont ajoutés ensuite à 50 mg/1. De l'ampicilline (100 μg / ml) peut être ajoutée à ce milieu pour éviter les contaminations bactériennes.
LB (milieu complet pour bactéries) : Bacto-yeast extract (Difco) 5 g/1, Bacto- tryptone (Difco) 10g/l, NaCl (Difco) 5 g/1. Ce milieu peut être solidifié par addition d'agar (12 g/1) et stérilisé par autoclavage. L'ampicilline est ajoutée à 100 μg/ml pour sélectionner les bactéries ayant été transformées par les plasmides portant le marqueur de résistance correspondant.
3) Plasmides
pIC20R : le plasmide pIC20R est un plasmide bactérien de 2.7 kb dérivé de pUC19. Il possède une origine de réplication ColEl et un gène de résistance ampicilline. Ce plasmide est utilisé pour cloner la protéine kinase STEl 1. Il possède un site multiple de clonage dans lequel sont insérées les séquences codant pour les kinases.
pYX 232 : le plasmide pYX 232 est un plasmide navette de 7.4 kb et 9.5 kb respectivement, pouvant être propagé et sélectionné dans les bactéries E.coli aussi bien que dans les levures. Il possède une origine de réplication ColEl et un gène de résistance à l'ampicilline (propagation et sélection dans E.coli) ainsi qu'une origine de réplication 2μm et un gène de sélection TRP1 (sélection chez les levures trpl déficientes pour la synthèse du tryptophane). Un site multiple de clonage placé en aval du promoteur TPI (Triose Phosphate Isomérase) permet d'insérer les séquences des gènes à exprimer. Le plasmide pYX232 est utilisé pour exprimer chez la levure
les protéines JNKl βl, JNK2αl et les différentes isoformes de JNK3 humain. Les séquences codant pour ces protéines ont été insérées au site de clonage EcoRI préalablement rendu bord franc par digestion avec le fragment Klenow de l'ADN polymérase d'E. coli.
pFA6a-kan MX4 : le plasmide pFA6a-kan MX4 est un plasmide de 2.5 kb dérivé du plasmide pSP72 (Promega). La construction du plasmide pFA6a et l'introduction d'un module de sélection kanMX, dérivé du transposon Tn903 d'E. coli, ont été décrits par Wach (Wach, 1994). Ce plasmide a été utilisé pour réaliser la délétion du gène codant pour Hogl dans la souche W303a. La sélection des transformants est réalisée sur milieu additionné de généticine (G418).
4) Oligonucléotides de synthèse
Les séquences correpondantes aux différentes JNK ont été amplifiées avec des oligo nucléotides de synthèse et à partir de banques double hybrides d'ADN génomique de levure ou à partir de plasmides.
Différents oligonucléotides de synthèse ont été générés pour réaliser les fragments de délétion, pour réaliser le séquençage et pour vérifier la délétion du gène Hogl chez la levure.
4.1 - Oligonucléotides utilisés pour amplifier JNK3 humain par PCR :
Les oligonucléotides ont été choisis de manière à amplifier uniquement la phase codante correspondant à JNK3αl et 3α2. En gras sont indiqués les codons d'initiation et de terminaison et en italique les sites de restriction utilisés pour le clonage dans les vecteurs appropriés.
- Série d'oligonucléotides utilisés sur la banque d'ADNc de cervelet humain :
Oligonucléotide correspondant à la région 5'de JNK3αl et 3α2 (SEQ ID N°l)
5'-GCG GGA TCC TAT GAG CCT CCA TTT CTT ATA CTA CTG CAG TGA ACCAAC-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3' de JNK3αl (SEQ ID N°2)
5'-CAC GGTACC TCA CTG CTG CAC CTG TGC TGA AGG AGA AGG C-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3' de JNK3α2 (SEQ ID N°3)
5'- GGC GGTACC TCA CCT GCA ACA ACC CAG GGG TCC TGC CG-3'
- Série d'oligonucléotides utilisés sur la banque d'ADNc de cerveau humain :
Oligonucléotide correspondant à la région 5'de JNK3αl et 3α2 (SEQ ID N°4)
5'-TCC CCC GGG ATC CAA AAT GAG CCT CCA TTT CTT ATA CTA C-3 '
Oligonucléotide correspondant à la région 3' de JNK3αl (SEQ ID N°5)
5'-TCC CCC GGG CTC GAG TCA CTG CTG CAC CTG TGC TGA-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3' de JNK3α2 (SEQ ID N°6)
5'-TCC CCC GGG CTC GAG TCA CCT GCA ACA ACC CAG GGG-3'
- Série d'oligonucléotides utilisés pour sous cloner les isoformes ΔN de JNK3 humain
Oligonucléotide correspondant à la région 5' de JNK3ΔNαl et ΔNα2 (SEQ ID N°7)
5'- TCC CCC GGG ATC CAA AAT GAG CAA AAG CAA AGT TGA CAA-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3' de JNK3ΔNαl (SEQ ID N°8)
5'-TCC CCC GGG CTC GAG TCA CTG CTG CAC CTG TGC TGA-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3 'de JNK3ΔNα2 (SEQ ID N°9)
5'-TCC CCC GGG CTC GAG TCA CCT GCA ACA ACC CAG GGG-3'
4.2 - Oligonucléotides utilisés pour amplifier JNKl β 1 et JNK2αl humain par PCR :
Les oligonucléotides ont été choisis de manière à amplifier uniquement la phase codante correspondant à JNKl βl et JNK2αl . En gras sont indiqués les codons d'initiation et de terminaison et en italique les sites de restriction utilisés pour le clonage dans le vecteur d'expression levure.
- Oligonucléotides pour amplifier JNKl β 1
Oligonucléotide correspondant à la région 5'de JNKlβl (SEQ ID N°10)
5'-TCC CCC GGG ATC CAA AAT GAG CAG AAG CAA GCG TGA C-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3 'de JNKl βl (SEQ ID N°l 1)
5'-TCC CCC GGG CTC GAG TCA CTG CTG CAC CTG TGC -3'
- Oligonucléotides pour amplifier JNK2αl :
Oligonucléotide correspondant à la région 5'de JNK2αl (SEQ ID N°12)
5'-TCC CCC GGG ATC CAA AAT GAG CGA CAG TAA ATG TGA C-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3'de JNK2αl (SEQ ID N°13)
5'-TCC CCC GGG CTC GAG TTA CTG CTG CAT CTG TGC TGA-3'
4.3 - Oligonucléotides utilisés pour réaliser et valider la délétion du gène Hogl chez la levure :
- Oligonucléotides utilisés pour réaliser la délétion du gène Hogl chez la levure :
Le premier couple d'oligonucléotides s'hybride au gène de résistance au G418 et au gène de levure Hogl en amont du codon d'initiation (SEQ ID N°14) ou en aval du codon de terminaison (SEQ ID N° 15) :
5 '-TAGGACACAGATATTCGGTACAGCTGAAGCTTCGTACGC-3 ' (SEQ ID N°14)
5 '-GACCTTTGTTTCCACCAGCTGCATAGGCC ACTAGTGGATCTG -3 ' (SEQ ID N°15)
Le second couple d'oligonucléotides s'hybride au gène de levure Hogl et à la partie correspondant à la séquence du gène Hogl du premier couple d'oligonucléotides (SEQ ID N0 14 ou 15) :
5 '-ACCACTAACGAGGAATTCATTAGGACACAGATATTCGGTA-3 ' (SEQ ID N016)
5 '-TTTGCAGCTACATGATCGCTGACCTTTGTTTCCACCAGCT-3 ' (SEQ ID N°17)
- Oligonucléotides pour valider la délétion du gène Hogl chez la levure :
Oligonucléotides pour amplifier une partie du gène Hogl non délété:
5 '-GAG TAG TAA TTA CTT TCT TG-3' (SEQ ID N°18)
5'-CCG TGA CAA AAT ATA TAT CTT CC-3' (SEQ ID N°19)
Oligonucléotides pour amplifier une partie du gène Hogl délété par insertion du gène de résistance au G418 :
5 '-GAG TAG TAA TTA CTT TCT TG-3' (SEQ ID N°20)
5 '-GGA TCT TGC CAT CCT ATG G-3 ' (SEQ ID N°21 )
5) Préparation d'ADN plasmidique :
Les préparations en petite ou en grande quantité d'ADN plasmidique ont été effectuées selon les protocoles décrits par Maniatis et al. (\ 9S9).
6) Amplification en chaîne par la polvmérase Taq thermostable (ou PCR) :
La PCR permet d'amplifier une séquence d'ADN entre deux régions connues où peuvent se fixer des oligonucléotides (de 20 nucléotides environ) qui serviront d'amorces à une polymérase thermostable. Les réactions sont effectuées dans un volume final de 100 ml en présence de la matrice d'ADN (50 ng), de dNTP (0,2 M), de tampon PCR (TrisHCl pH8,5 l OmM; MgC l ,5mM; KC1 5mM; gélatine 0,01 %), des deux oligonucléotides (500 ng chacun) et de 2,5 UI d'Ampli Taq DNA
polymérase. Le mélange est recouvert de 2 gouttes d'huile de paraffine pour limiter l'évaporation de l'échantillon. Le programme utilisé comporte 32 cycles : 1 cycle de dénaturation de la matrice (5 min à 95°C), 30 cycles (1 mn de dénaturation à 94°C, lmin d'hybridation des oligonucléotides sur la matrice d'ADN à 50°C, 1min d'élongation par la Taq polymérase à 72°C), enfin 1 cycle d'élongation finale (5 min à 72°C). La PCR peut être effectuée directement sur des cultures de bactéries ou de levures en phase exponentielle de croissance à la place de la matrice d'ADN.
7) Séquençage par fluorescence :
La technique de séquençage utilisée est dérivée de la méthode de Sanger et al. (1977) et adaptée pour le séquençage par fluorescence développé par Applied Biosystems. Le protocole utilisé est celui décrit par les concepteurs du système (Perkin Elmer, 1995).
8 ) Insertion d'un fragment d'ADN dans un plasmide par ligation :
L'insert provenant d'un ADN plasmidique ou d'une réaction PCR est digéré pendant lh par des enzymes de restriction appropriées à lU/mg d'ADN dans leur tampon respectif (Biolabs). Les fragments issus de la digestion sont séparés selon leur taille par électrophorèse sur un gel "préparatif d'agarose 0.8% préparé dans un tampon TBE (Tris 90mM, Borate 90mM, EDTA 2mM PH8) avec 0.5μg/ml de Bet. Du Bleu de dépôt (1/10 de volume) est ajouté aux échantillons avant leur chargement sur le gel à coté d'un marqueur de poids moléculaire (1KB Ladder, Gibco BRL). La migration s'effectue à 90 volts/cm2 constants dans du tampon TBE. L'ADN est révélé sous UV par la fluorescence du Bet qui s'est intercalé entre les bases. Les morceaux de gel contenant les fragments d'ADN de tailles voulues (vecteurs et inserts) sont découpés au scalpel, introduits dans un boudin de dialyse avec du TBE et soumis à une électrophorèse pendant 30min à 90 volts. L'ADN extrait du gel est ensuite récupéré, traité par un volume de phénol/chloroforme/isoamylate (25/24/1), précipité par 3 volumes d'éthanol absolu en présence de NaCl 0.25M, lavé une fois à l'éthanol 70%o, séché, et enfin repris dans 20μl H20. Après avoir estimé sur gel les quantités respectives de vecteur et d'insert, ces derniers sont mélangés dans un rapport de 1/1 en présence de 40UI de T4 DNA ligase, du tampon de ligation IX final (Tris, HC1
50mM PH7.5, MgCl2 lOmM, ATP ImM) dans un volume total de 20μl. La ligation s'effectue à 20°C pendant lh au moins.
9) Transformation des bactéries par un plasmide :
Méthode dite au "TSB" (Chung et a , 1988): cette méthode consiste à fragiliser la paroi des bactéries par un traitement au DMSO pour permettre l'entrée de l'ADN dans les cellules. Son efficacité est de 106 transformants/μg d'ADN. Les bactéries sont cultivées dans un milieu LB liquide pendant environ 3h sous agitation (jusqu'à A6oo= 0.6). La culture est centrifugée 10 min à 3000 φm, le culot est repris dans 1/10 du volume initial par du TSB (milieu LB, PEG4000 10%, DMSO 5%, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM), et incubé 15min à 4°C. Environ 50 ng d'ADN ( 1 Oμl pour le produit de ligation) sont ajoutés à lOOμl de bactéries compétentes, puis le mélange est incubé 30 min à 4°C. Après addition de TSBglu (TSB, glucose 20 mM) et incubation 1 h à 37°C, les bactéries sont étalées sur milieu gélose LB contenant de l'ampicilline.
10) Transformation de la levure par un vecteur d'expression :
Les levures sont rendues compétentes par un traitement au LiAc/PEG d'après la méthode décrite par Gietz (Gietz et al, 1995).
Les levures sont cultivées sur milieu solide YPD à 28°C pendant une nuit. Elles sont ensuite resuspendues dans 1ml de solution I stérile (LiAc 0.1 M, Tris.HCL lOmM, EDTA ImM pH7.5), centrifugées 1 min à 3000 φm et reprises à nouveau dans 1 ml de solution I. 50μL de la suspension sont alors mélangés à 5μg d'ADN de sperme de saumon (ADN entraîneur), 1 à 5μg d'ADN plasmidique et 300μl de solution II stérile (LiAc 0.1M, Tris,HCl lOmM, EDTA ImM PH7.5, PEG400o 50%). Le mélange est incubé 30 min à 28°C puis subit un choc thermique pendant 20 min à 42°C. Après centrifugation 1 min à 3000 φm, les cellules sont lavées une fois à l'eau stérile et reprises dans 100 μl d'eau stérile. Puis, les levures sont étalées sur milieu gélose Y B additionné des acides aminés nécessaires à leur croissance. Pour permettre la sélection des souches de levure transformées, les acides aminés et les bases azotées correspondant aux marqueurs de sélection portés par les plasmides ne sont pas ajoutés. Après étalement des cellules de levure, les boîtes incubées à 28°C pendant 3 jours.
1 1 ) Test en goutte:
Ce test permet d'analyser le phénotype d'une souche de levure. Une goutte (environ 5 μl) d'une suspension de levures légèrement trouble (environ 105 cellules /ml) est déposée sur différents milieux géloses hyperosmotiques et non hyperosmotiques, et la croissance est observée après 2 jours d'incubation à 28°C.
EXEMPLES
Exemple 1 - clonage d'ADNc codant pour de nouvelles isoformes de J K3 humaines : JNK3ΔNαl, JNK3ΔNα2 et JNK3αl39.
Le clonage moléculaire de JNK3 humain a été réalisé par PCR à partir d'une banque d'expression d'ADNc de cervelet humain (Clontech®) ou d'une banque double hybrides d'ADNc de cerveau humain (Clontech®). Les amorces nucléotidiques ont été choisies de manière à amplifier par PCR la phase codante correspondant à JNK3αl et 3α2 (Genbank U34820 et U34819) (voir Matériel et Méthodes).
Une première série oligonucléotides utilisée pour amplifier JNK3 à partir de la banque de cervelet a permis d'apporter les sites de clonage BamHI en 5' et Kpnl en 3' pour pouvoir introduire les fragments amplifiés d'ADN dans des vecteurs de clonage ou d'expression appropriés (SEQ ID N° 1, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3).
La deuxième série, utilisée sur la banque deux hybrides d'ADNc de cerveau, a permis d'introduire les sites Smal et BamHI en 5' et Smal et Xhol en 3 '(SEQ ID N° 4, SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6).
La réaction de PCR a été effectuée avec l μg d'ADN de l'une des deux banques d'expression et 0,5 μg de chaque oligonucléotides encadrant la région à amplifier. Les fragments d'ADN obtenus ont été clones dans des vecteurs de clonage appropriés pour analyser leur séquence.
Il a été constaté que, parmi l'ensemble des fragments isolés, les séquences correspondant aux JNK3αl et 3α2 déjà décrites étaient minoritaires par rapport à celles correspondant à trois nouvelles isoformes.
La comparaison de la séquence des ces isoformes est présentée dans la figure 1. On observe que deux séquences, appelées JNK3ΔNαl et JNK3ΔNα2, sont comparables respectivement à JNK3αl et 3α2, et présentent une insertion de 27 nucléotides en position +66 par rapport à l'ATG. Cette séquence qui est très homologue à la séquence 5' non codant de SAPKβ de rat (figure 2), apporte un codon de terminaison qui implique une initiation au deuxième ATG.
La séquence nucléotidique complète de JNK3ΔNαl est présentée dans la séquence SEQ ID N°22 et la séquence nucléotidique complète de JNK3ΔNα2 est présentée dans la séquence SEQ ID N°24. Les séquences polypeptidiques correspondantes sont présentées respectivement dans la séquence SEQ ID N°23
(JNK3ΔNαl) et N°25 (JNK3ΔNα2).
La protéine exprimée à partir de ces séquences présente une délétion de 38 acides aminés correspondant à l'extension N-terminale de JNK3 qui la distingue des autres JNK (figure 3).
La troisième séquence correpondant à l'isoforme JNK3αl 39 est caractérisée par une substitution du nucléotide C en T, en position 418 de l'ATG, dans la partie commune de JNK3αl et JNK3α2 (figure 1). Cette mutation permet la création d'un codon de terminaison. La protéine exprimée à partir de cette séquence est délétée d'une grande partie de la région C-terminale de JNK3. Ce polypeptide ne comprend que les 139 premiers acides aminées communs à JNK3αl et 3α2 (figure 3) qui inclus le site de liaison à l'ATP. La séquence nucléotidique de JNK3αl39 est présentée dans la séquence SEQ ID N°26 et la séquence polypeptidique correspondante est présentée dans la séquence SEQ ID N°27.
Exemple 2 - construction d'une souche de levure mutée dans le gène Hogl
Des études ont montré qu'il était possible de complémenter une levure mutée dans le gène Hogl homologue aux JNK de mammifère par le gène JNKl humain (Galcheva-Garvona et al. 1994) ou p38 de souris (Han et al. 1994). Le gène Hogl est impliqué dans une voie de réponse aux stress hyperosmotiques chez la levure qui aboutit à une synthèse de glycerol intracellulaire afin de compenser les différences de pression osmotique avec le milieu extérieur. Un modèle levure a donc été retenu pour
évaluer les propriétés fonctionnelles de isoformes de JNK3 tronquées en N-terminal (JNK3ΔNαl, JNK3ΔNα2) et les comparer à celles des autres isoformes connues de JNK3.
Pour réaliser ce modèle, il est nécessaire d'interrompre la voie de réponse au stress hyperosmotique chez la levure en introduisant une mutation au niveau du gène Hogl . Un tel mutant doit être incapable de pousser sur un milieu contenant de fortes concentrations en sel comme du NaCl (0,5M ou 0,9M) ou en sorbitol (1M). Il est utilisé pour tester par complémentation si les différentes isoformes de JNK3 humaine sont capables de restaurer la croissance cellulaire en condition de stress hyperosmotique.
Délétion du gène Hogl de S.cerevisiae par une cassette de disruption contenant le marqueur de résistance au G418.
La délétion du gène Hogl a été réalisée selon la technique décrite par Wach (Wach et al. 1994). Cette technique utilise un fragment de délétion d'ADN obtenu directement par PCR. Celui-ci correspond à une partie de la séquence du gène à détruire interrompu par un marqueur de résistance. Pour construire ce fragment, il a été utilisé un couple d'oligonucléotides dont la séquence permet d'amplifier par PCR le gène de résistance au G418, tout en générant aux extrémités du fragment amplifié les séquences correspondant au gène à détruire. Ce marqueur de résistance est sous le contrôle du promoteur et du terminateur d'un gène fortement exprimé, le gène TEF de Ashbya gossypii.
Pour réaliser le fragment de délétion du gène Hogl, deux couples d'oligonucléotides ont été synthétisés. Le premier couple (SEQ ID N°14 et SEQ ID N°15) s'hybride aux extrémités terminales du gène de résistance au G418 porté par le plasmide pFA6a-kanMX4. Ces oligonucléotides contiennent également une courte séquence flottante de 20 paires de base chacune correspondant respectivement à la région juste en amont de l'ATG et en aval du codon stop de Hogl . Le deuxième couple d'oligonucléotides (SEQ ID N°16 et SEQ ID N°l 7) permet de rallonger de 20 paires de base ces séquences flottantes lors d'une deuxième étape de PCR. Ce rallongement a pour but d'augmenter la fréquence de crossing-over dans ces séquences flottantes et, de ce fait, la délétion du gène Hogl .
Le fragment de délétion a été réalisé en deux étapes de PCR en utilisant dans la première le plasmide pFA6a-kan MX4 comme matrice et dans la deuxième le produit de la première PCR. Le fragment a été utilisé pour transformer la souche W303a.
Les souches transformées ont d'abord été sélectionnées pour leur résistance au
G418 qui est conférée par le fragment de délétion, puis pour le phénotype d'osmo- ssensibilité correspondant à l'inactivation totale de la voie de stress hyperosmotique via la délétion du gène Hogl . Sur quatre souches G418 sélectionnées, deux souches présentaient le phénotype d'osmo-sensibilité qui correspond à l'incapacité des souches à pousser sur milieu complet (YPD) contenant 0,5M ou 0,9M de chlorure de sodium (NaCl) ou 1M de sorbitol.
Afin de vérifier que le gène Hogl était bien délété dans ces souches, une amplification par PCR sur leur ADN génomique a été réalisée. Deux couples d'oligonucléotides permettant d'amplifier respectivement le gène Hogl délété ou non délété ont été utilisés (voir Matériel et Méthodes).
Le couple d'oligonucléotides (SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21) utilisé pour amplifier la région correspondant au gène Hogl délété a permis d'obtenir un fragment de PCR uniquement sur de l'ADN génomique provenant des souches osmo-sensibles, montrant ainsi que ces souches étaient bien délétées dans le gène Hogl . Inversement, l'autre couple d'oligonucléotides (SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19) n'a pu générer de fragment qu'à partir de l'ADN génomique des souches osmo-résistantes. Ceci permet de confirmer que ces souches ne sont pas délétées dans le gène Hogl . La souche de levure délétée dans le gène Hogl est appelée ylMl .
Exemple 3 - complémentation de la souche de levure osmo-sensible par les différentes isoformes de JNK3 humaines.
Cet exemple illustre les propriétés des différents isoformes de JNK3 humaines. Le test de complémentation de la souche osmo-sensible mutée dans le gène Hogl(yΙMl) a été réalisé avec les différentes isoformes de JNK3. Les kinases JNKl β l (u35004) et JNK2αl (u34821 ) ont été utilisées comme contrôle. Dans ce test
les kinases ayant une fonction homologue à la kinase HOG1 sont capables de restaurer la croissance de la levure ylMl en condition de stress hyperosmotique.
Construction de vecteurs d'expression pour exprimer les différentes JNK chez la levure.
Le vecteur d'expression pYX232 (R&D) qui se réplique à haut nombre de copies dans la cellule a été choisi pour exprimer les différentes JNK chez la levure. Il possède le gène Tφl comme marqueur de sélection et une cassette d'expression constituée par le promoteur TPI (Triose phosphate isomérase) et une séquence polyA séparés par un multisite de clonage. Les différents inserts codant pour JNKl βl , JNK2αl et les isoformes de JNK3 humaines ont été introduits au niveau du site EcoRI de ce plasmide, préalablement clivé par l'enzyme de restriction correspondante et rendu bord franc par le fragment de Klenow de la ADN polymérase I.
Les fragments JNKlβl, JNK2αl, JNK3αl , JNK3α2, JNK3ΔNαl et JNK3ΔNα2 ont été obtenus par PCR à partir de plasmides contenant le cDNA correspondant et des oligonucléotides, décrits dans Matériel et Méthodes (SEQ ID N°10 et N°l 1 pour amplifier le fragment codant pour JNKl β l , SEQ ID N°12 et N°13 pour amplifier le fragment codant pour JNK2αl , SEQ ID N°4 et N°5 pour amplifier le fragment codant pour JNK3αl, SEQ ID N°4 et N°6 pour amplifier le fragment codant pour JNK3α2, SEQ ID N°7 et N°8 pour amplifier le fragment codant pour JNK3ΔNαl , SEQ ID N°7 et N°9 pour amplifier le fragment codant pour JNK3ΔNα2), introduisant chacun un site de restriction Smal à chaque extrémité.
Ces fragments ont été clivés par l'enzyme Smal pour pouvoir être introduits par ligation dans le plasmide pYX232. L'ensemble de ces constructions a été contrôlé par séquençage pour vérifier que les inserts étaient introduits aux sites de restriction correspondants et qu'ils ne contenaient pas de mutations générées par la réaction de
PCR.
Test de complémentation de la souche osmo-sensible Hogl - par les différents vecteurs d'expression de JNK.
Les différentes constructions permettant l'expression des JNK humaines ainsi que le plasmide pYX332 sans insert ont été utilisées pour transformer la levure osmo-
sensible Hogl-. Les clones contenant les différents plasmides ont été sélectionnés sur milieu minimum YNB additionné des acides aminés ou bases azotées nécessaires pour la croissance de la souche W303a à l'exception du tryptophane. Trois clones correspondant à chaque construction ont été analysés par test en goutte sur milieu complet contenant 0,5 ou 0,9 M NaCl ou 1 M sorbitol. Les souches sont incubées trois jours à 30 degrés. Les résultats sont présentés dans le tableau ci dessous.
Les différentes souches indiquées dans la 1ère colonne sont testée en culture sur différents milieux complets (YPD) additionnés ou non de Sorbitol ou de NaCl comme indiqué dans les colonnes n°2 à n°5. Le signe + indique l'aptitude de croissance, le signe - indique l'absence de croissance.
Les clones transformés par les plasmides codant pour JNKl β l , JNK2αl et deux des isoformes de JNK3 délétées de la région N-terminale (JNK3ΔNαl et
JNK3ΔNα2) sont capables de croître sur milieu complet contenant 0,5 M NaCl ou 1M sorbitol. Les clones exprimant JNKlβl sont les seuls qui présentent une légère croissance sur milieu contenant 0,9 M NaCl.
Par contre, les souches transformées par le plasmide sans insert ou les plasmides codant pour JNK3αl et JNK3α2 ne poussent que dans des conditions de milieu non hyperosmotiques. Ainsi JNKlβl, JNK2αl et deux des isoformes de JNK3 délétées de leur région N-terminale (JNK3ΔNαl et JNK3ΔNα2) sont fonctionnelles dans la levure et sont capables de remplacer la kinase HOG
Ces résultats indiquent que l'absence du fragment correspondant aux 38 premiers acides aminés des isoformes connues de JNK3 (JNK3α et JNK3α2) confère aux isoformes JNK3ΔNαl ou JNK3ΔNα2 une fonction homologue à la kinase HOG Cette fonction est retrouvée dans les isoformes JNKlβl, JNK2αl qui sont également dépourvues du fragment correspondant aux 38 premiers acides aminés de JNK3α et JNK3α2. A l'inverse, la présence du fragment correspondant aux 38 premiers acides aminés des isoformes connues de JNK3 (JNK3α et JNK3α2) est lié à l'absence de la fonction homologue à la kinase HOG1 pour ces isoformes.
Ces nouvelles isoformes présentent donc, chez la levure, une activité différente des deux formes de JNK3 décrites dans la littérature. Cette différence peut être liée au processus d'activation de ces kinases chez la levure. Comme pour JNKl ou p38, on a montré que les nouvelles isoformes de JNK3 sont activées par la MapKinase Kinase PBS2 de la levure car une souche de levure double mutante hogl, pbs2 complémentée par les nouvelles isoformes de JNK3 est incapable de pousser dans des conditions hyperosmotiques. De même, il est possible que ces nouvelles isoformes présentent une spécificité de substrat différente des JNK3 déjà décrites qui leur permet d'activer la voie de réponse au stress hyperosmotique chez la levure.
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Claims
1. Dérivé de JNK caractérisé en ce qu'il comporte une délétion dans la région N- terminale correspondant au fragment 1-38 de l'isoforme JNKαl ou de l'isoforme JNKα.2 ou une délétion des acides aminés C-terminaux à partir de l'acide aminé 139.
2. Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID N°23 ou d'un variant de celle-ci.
3. Polypeptide de séquence SEQ ID N°23
4. Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID N°25 ou d'un variant de celle-ci.
5. Polypeptide de séquence SEQ ID N°25.
6. Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID N°27 ou d'un variant de celle-ci.
7. Polypeptide de séquence SEQ ID N°27.
8. Acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7.
9. Acide nucléique selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ADNc ou d'un ARN.
10. Acide nucléique selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi :
(a) tout ou partie de la séquence SEQ ID N°22 ou SEQ ID N°24 ou SEQ ID N°26 ou de leur brin complémentaire,
(b) toute séquence hybridant avec les séquences (a) et codant pour un dérivé selon l'une des revendications 1 à 7,
(c) les variants de (a) et (b) résultant de la dégénérescence du code génétique.
1 1. Acide nucléique de séquence SEQ ID N°22.
12. Acide nucléique de séquence SEQ ID N°24
13. Acide nucléique de séquence SEQ ID N°26.
14. Cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 8 à 13, un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la transcription.
15. Vecteur comportant un acide nucléique selon l'une des revendications 8 à 13 ou une cassette selon la revendication 14.
16. Vecteur selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique.
17. Vecteur selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
18. Cellule hôte transformée avec un acide nucléique selon l'une des revendications 8 à 13, ou comportant une cassette selon la revendication 14 ou un vecteur selon l'une des revendications 15 à 17.
19. Procédé de préparation d'un dérivé ou d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7, selon lequel on cultive une cellule comprenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 8 à 13 , dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit.
20. Anticoφs ou fragment d'anticoφs dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 ou contre le polypeptide de séquence SEQ ID N°29.
21. Procédé de mise en évidence ou d'identification de composés capables de se lier spécifiquement avec un polypeptide tel que défini selon les revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes :
a - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications à dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et, b - on détecte et/ou isole les molécules liées avec ledit polypeptide.
22. Procédé d'identification de composés capables d'inhiber la croissance de microorganismes transformés avec un acide nucléique selon l'une des revendications 8 à 13 comprenant les étapes suivantes :
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec au moins un microorganisme transformés avec un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention, dans des conditions permettant la croissance dudit microorganisme, et
-on détecte et/ou isole les molécules inhibant la croissance dudit microorganisme.
23. Procédé d'identification de composés permettant la croissance de microorganismes transformés avec un acide nucléique selon l'une des revendications 8 à 13 comprenant les étapes suivantes :
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec au moins un microorganisme transformés avec un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention, dans des conditions inhibant la croissance dudit microorganisme, et
-on détecte et/ou isole les molécules permettant la croissance dudit microorganisme.
24. Procédé selon l'une des revendications 22 et 23 caractérisé en ce que le microorganisme est une levure.
25. Procédé selon l'une des revendications 22 à 24 caractérisé en ce que le gène Hogl de la levure a été inactivé.
26. Procédé selon l'une des revendications 23, 24 et 25 caractérisé en ce que le microorganisme est une levure qui exprime le gène PBS2 sous une forme mutée
PBS2 DD inhibant la croissance de la levure.
27. Ligand d'un polypeptide tel que défini selon les revendications 1 à 7, susceptible d'être obtenu selon le procédé de l'une des revendications 21 à 26.
28. Utilisation d'un ligand selon la revendication 27 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention, l'amélioration ou le traitement des maladies impliquant une dégénérescence neuronale
29. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins ligand selon la revendication 27 ou un anticoφs selon la revendication 20.
30. Composition selon la revendication 29 destinée à la prévention, l'amélioration ou le traitement des maladies neurodégénératives.
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