EP1082594A2 - Method and device for processing extremely small substance quantities - Google Patents

Method and device for processing extremely small substance quantities

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EP1082594A2
EP1082594A2 EP99926440A EP99926440A EP1082594A2 EP 1082594 A2 EP1082594 A2 EP 1082594A2 EP 99926440 A EP99926440 A EP 99926440A EP 99926440 A EP99926440 A EP 99926440A EP 1082594 A2 EP1082594 A2 EP 1082594A2
Authority
EP
European Patent Office
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reservoir
carrier material
substance
carrier
magnetic
Prior art date
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Ceased
Application number
EP99926440A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Markus Kalkum
Martin Müller
Eckhard Nordhoff
Richard Reinhardt
Holger Eickhoff
Holger Rauth
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Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of EP1082594A2 publication Critical patent/EP1082594A2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation
    • G—PHYSICS
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    • G01N2035/1027—General features of the devices
    • G01N2035/1034—Transferring microquantities of liquid
    • G01N2035/1039—Micropipettes, e.g. microcapillary tubes
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    • G01N2035/1048—General features of the devices using the transfer device for another function
    • G01N2035/1053—General features of the devices using the transfer device for another function for separating part of the liquid, e.g. filters, extraction phase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/2575—Volumetric liquid transfer

Definitions

  • the invention relates to methods for processing very small amounts of substance in the reservoir of a fluid metering device, in particular to a method for collecting, cleaning and / or concentrating substance samples in capillary-shaped containers, e.g. in micropipettes or microdispensers, and devices for implementing the methods.
  • a magnetic separation device for separating magnetic particles from a non-magnetic test medium.
  • the magnetic particles are small particles on the surfaces of which the substances of interest are bound, or, for example, biological cells in which magnetic substances are incorporated. With a large number of magnets, a magnetic field gradient is built up in the test medium in such a way that the magnetic particles are moved to the vessel wall and collected there.
  • the magnetic separator known from US-A-5 186 872 has the following disadvantages.
  • the separator has a complex structure. To form the field gradients, at least four magnets must be present, which are arranged in a predetermined manner and require the use of certain containers for the test medium.
  • the for characteristic container dimensions in the cm range designed conventional separation device allows, especially when using electromagnets, no miniaturization. This prevents use at the above-mentioned interface between macroscopic containers and miniature carriers for the tools used.
  • the conventional separation device is limited to the pure separation process. The loading of magnetic particles with the substances of interest in the separating device is not provided.
  • a sample collector is known from US Pat. No. 5,498,550 in which complexes of protein samples and magnetically labeled antibodies are manipulated in a reactor under the action of an external magnetic field.
  • this sample collector is not suitable for handling substance quantities with volumes in the nl to ⁇ l range.
  • Another disadvantage is the restriction to certain substances that enter into the respective antigen-antibody reaction for complex formation.
  • a system for controlling magnetic particles in pipetting arrangements is also known from WO 97/44671 and JP 08/062224 (in: Patent Abstracts of Japan, 1996). The magnetic particles are suspended in a pipette-shaped cuvette and can be pulled to the edge of the cuvette with an external permanent magnet. When the permanent magnet is removed, the particles are released and can sink to the open end of the cuvette.
  • This system is also limited to the manipulation of larger sample volumes in the ml range. Furthermore, there is a disadvantage in that the particle control only comprises the binding or release, but not a specific movement of the particles in the cuvette.
  • a magnetic separation device is described in WO 96/09550 (or US Pat. No. 5,567,326), in which magnetizable particles are extracted from a non-magnetic test medium. The test medium is housed in a cuvette arrangement in which each cuvette is diving a pin-shaped permanent magnet is set up. The disadvantage of this technique is that the cuvettes do not allow the test medium to be dispersed, and thus that
  • Test medium is difficult to handle.
  • the method should be easy to integrate into the usual methods for sample handling, sample detection and sample processing from biochemistry, genetic engineering and medicine.
  • the object of the invention is also to provide a device for implementing such a method.
  • the object of the invention is achieved by a method or devices according to claims 1 and 11, respectively. Preferred embodiments of the invention result from the dependent claims.
  • the method according to the invention for collecting substance samples is based on the arrangement and movement of a solid phase (carrier material) directly in the reservoir of a microdosing device, the substance of interest being bound on the surface of the carrier material and being held in the reservoir for a predetermined sequence of work steps.
  • the reservoir has a characteristic volume that is generally less than 500 ⁇ l and preferably less than 10 ⁇ l, in particular less than 2 ⁇ l, up to 1 nl.
  • the dosing device is designed for microdrop delivery in the sub nl range.
  • the carrier material can be formed by magnetic particles which are moved by an external magnetic field force or by a porous carrier ball which is moved by an external mechanical actuation.
  • the carrier material consists of an inherently incompressible and hard material. This means that the carrier material does not undergo a change in shape when the metering device is actuated, for example by applying a pressure pulse.
  • the bond between the substance or substances of interest and the surface of the carrier material takes place via the formation of van der Vaals forces due to hydrophobic interactions. This means that the binding takes place with a relatively low specificity with regard to the individual substance and the invention can thus be implemented with entire substance classes in mixtures of substances (e.g. mixtures of peptides, proteins, DNA or oligonucleotides).
  • the term “reservoir” of the dosing device here denotes the active dosing volume or stroke volume or - when implemented with appropriate devices - the pipette volume or the dispenser volume.
  • the metering device can be formed by any suitable pumping or metering device which is set up to deliver predetermined amounts of fluid from the reservoir to a target substrate.
  • the invention is preferably implemented with dosing devices for the smallest amounts of substance (nanoliter and sub-nanoliter). These include, for example, micropipettes or microdispensers or micropumps (in particular with a pneumatic or electric drive) or other microdroplet devices which function analogously to the inkjet techniques.
  • the carrier material is preferably arranged or moved in the immediate vicinity of an outlet opening of the reservoir of the metering device.
  • a particular advantage of the invention is its compatibility with any conventional metering device. It was found for the first time that a sample collection according to the principle of the known solid phase purification in metering devices is possible without impairing their function. This applies in particular to the implementation of the invention in microdosing devices with nl volumes.
  • a device according to the invention is characterized in that a carrier as a solid phase with a binding-active surface is arranged in the reservoir of a fluid metering device and can be manipulated with an external drive device.
  • a plurality of fluid metering devices are preferably operated in parallel, only one common drive device being provided for manipulating the solid phases.
  • the invention has the advantage that the problem of miniaturized sample purification or collection is solved for the first time.
  • the invention is simple with available micropipettes or microdispensers, especially with their single or serial use, can be implemented without disrupting conventional processes.
  • For the first time it has been possible to bind sample substances to a carrier material in microdispensers and to move them in the microdispenser without restricting the function of the microdispenser. This is an unexpected and significant success, since normally, for example, piezoelectric microdispensers show a functional failure if there is a compressible component inside, for example based on particles, suspended liquids or gas inclusions.
  • a particular advantage of the invention relates to use with micropipettes or microdispensers.
  • the geometric properties of the dispenser tip and the electrical piezo parameters must be optimally coordinated.
  • the invention makes it possible that the solid carrier material required for a temporary attachment of the molecules does not interfere with the dispersion process, ie neither the vessel dimensions nor the pressure wave running through the liquid are effectively influenced. Further advantages and details of the invention are described below with reference to the accompanying drawings:
  • FIG. 1 a schematic illustration of a first embodiment of the invention, in which a magnetic carrier material is used in a metering device
  • FIG. 2 a schematic illustration of a second embodiment of the invention in which a porous carrier bale is used in a metering device
  • FIG. 3 shows a schematic top view of a device according to the invention with a number of microdispensers, each of which is set up to implement the method according to the invention
  • FIG. 4 a schematic side view of the device according to FIG. 3.
  • the invention is preferably implemented with metering devices which are set up for dispensing liquid quantities in the nl to pl range.
  • the dosing device each has a dosing reservoir in the 1/10 nl to ⁇ l range, from which droplets or portions with volumes below 100 pl can be dispensed, preferably when actuated by pressure.
  • An example of such a metering device is a microdispenser, as described below with reference to FIGS. 1 and 2 will be explained.
  • the piezoelectric dispenser 1 shows an example of the end of a piezoelectric microdispenser that was used to implement the method according to the invention in accordance with a first embodiment of the invention (magnetic manipulation of the solid carrier material). is aimed.
  • the piezoelectric dispenser 1 comprises an electrical converter 2 and a dosing reservoir 3, which is formed by a capillary.
  • the converter 2 is set up to reduce the volume of the metering reservoir 3 in the form of a pulse. When the converter 2 is actuated for a pulse time
  • a pressure wave runs through the liquid 4 in the dosing reservoir 3. This causes a liquid to be ejected at the outlet 5 (diameter around 50 ⁇ m) of the dosing reservoir 3, which is formed here by the end of the capillary ( Dispenser tip).
  • the liquid 4 comprises, for example, a solution or suspension of sample molecules which, in biochemical applications, comprise peptides, proteins, nucleic acids or DNA molecules, fats or carbohydrates.
  • sample molecules which, in biochemical applications, comprise peptides, proteins, nucleic acids or DNA molecules, fats or carbohydrates.
  • a large number of magnetic particles 7 are arranged in the dosing reservoir 3, preferably in the vicinity of the outlet 5, which are provided with a drive device for holding and / or moving the magnetic Particles 7 in the form of a magnetic device 8 can be manipulated.
  • the magnet device 8 comprises two permanent magnets 81, 82, each with a variable distance with respect to the dosing reservoir 3 with the magnetic particles. Both permanent magnets 81, 82 point toward the reservoir 3 with the same pole. Further details of the magnet device 8 and an associated drive device (not shown here) are explained below with reference to FIGS. 3 and 4.
  • the magnetic particles 7 have a diameter which is approximately one to two powers of ten smaller than the diameter of the dispenser nozzle (outlet 5) and preferably in the region from 0.25 to 2 ⁇ m. This ensures that the particles
  • the deposited particles 7, i.e. the particles adhering to the inner wall of the dispenser under the magnetic field force do not impede the piezoelectric dispensing process due to their small spatial expansion.
  • the particles 7 have an affinity for the sample molecules, so that they are bound to the particles from the liquid 4 inside the dispenser tip.
  • the magnetic particles 7 can be moved in a predetermined manner in the metering reservoir 3 by changing the magnetic field forces.
  • the magnetic field forces are changed by moving the microdispenser 1 and the magnet device 8 relative to one another, the permanent magnets 81, 82 preferably being moved with respect to the stationary dispenser tip.
  • the particles 7, which form the solid carrier material (solid phase) are moved through the liquid 4, flowed around by it and mixed with it, so that further sample molecules are bound while other solution components remain in the liquid 4.
  • the sample molecules of interest can be collected in sufficient quantities (enrichment).
  • the targeted movement of the particles with the bound sample substances through the liquid represents an essential advantage of the invention that cannot be achieved by conventional dispensing systems with large liquid volumes. According to the invention, not only statically bound or released states are decisive for the particles, but also dynamically bound states, in which are deliberately moved through the liquid. Further processing steps are explained below.
  • the permanent magnets 81, 82 are preferably NdFeB magnets with an application-specific remanence. When used with microdispensers, the remanence is preferably approx. 1 Tesla to 1.5 Tesla.
  • Fig. 2 shows a second embodiment of the invention, again using the example of a microdispenser 1 with a piezoelectric transducer 2 and a dosing reservoir 3, from the outlet 5 of which a microdrop 6 can be dispensed when the transducer 2 is actuated.
  • a carrier bale 9 is provided as the carrier material, which has a drive device for holding and / or moving the bale 9 in the form of a thread-like or rod-shaped actuating element 91, which is movable through the metering reservoir 3 of the dispenser 1 (arrow direction).
  • the carrier bale 9 is a coherent, sponge-like solid phase which has the largest possible active surface.
  • the preferably porous, but incompressible material of the carrier bale 9 consists, for example, of nitrocellulose or a column filling material such as is used in HPLC separations (for example material "Porous" (registered trademark)).
  • a mechanical operating principle is implemented in the second embodiment.
  • the carrier bale 9 is moved with the actuating element 91 through the interior of the dosing reservoir 3 in order to collect sample molecules.
  • the carrier bale 9 can be flowed through by the liquid 4 in the microdispenser 4, so that an undesired dispensing of liquid is avoided.
  • the carrier bale 9 is pulled upward through the dispenser tip through the transducer 2.
  • a dosing device is prepared by taking up the solid carrier material in the reservoir of the dosing device.
  • the magnetic particles are taken up and deposited in the reservoir (for example in the metering reservoir of the microdispenser), in which a particle suspension is filled into the reservoir either through the outlet of the reservoir or through an additional supply line with the simultaneous action of the magnetic field forces . Under the action of the magnetic field forces, the particles are immediately drawn to a reservoir wall and held there (landfill).
  • the preparation step comprises feeding the carrier bale into the reservoir of the metering device and fixing the actuating element used for this purpose in such a way that the carrier bale is positioned in the reservoir near its outlet.
  • a solution is added or the substance samples of interest are dispensed. This recording is carried out accordingly through an outlet of the metering device or through an additional supply line.
  • the forces acting on the respective carrier material are changed in such a way that the carrier material moves through the absorbed solution or suspension and is thereby washed around by it, so that the substance binds to the carrier material.
  • the magnetic field forces are changed such that the magnetic particles move from the original deposit site to another part of the reservoir wall (e.g. opposite wall).
  • the drive element (for example in FIG. 2, reference number 91) is moved in such a way that the carrier material is flushed around by the solution or suspension.
  • the movement of the carrier material through the liquid is preferably carried out periodically with a large number of movements.
  • the speed and The duration of the carrier material movement and thus of the binding step are chosen depending on the application.
  • the liquid is discharged from the reservoir of the metering device through the outlet or through a line leading away from the opposite (upper) end.
  • a further solution or suspension with the substance of interest or without a sample substance can now be added.
  • the substance is enriched in the reservoir.
  • Concentration is initially carried out in the bound state on the carrier materials.
  • the bound substance is then released into the liquid or suspension again by taking up a suitable elution solution in the reservoir.
  • the elution solution has a higher concentration than the originally supplied solution.
  • the second In this case it can be provided to supply a cleaning solution with which a predetermined type of substances which were unintentionally bound to the carrier materials in the previous binding step can be detached again. This corresponds to cleaning or another selective choice of substances. The substance is then detached again from the carrier materials using a suitable elution solution.
  • micro-preparative and microsynthetic purposes can also be pursued with suitable repetition with selected substances. It is thus possible, for example, to first collect and / or clean a first reaction partner in the reservoir, in order then to react it with a correspondingly collected and / or cleaned second reaction partner. This reaction can take place in the bound state on the carrier material or in the dissolved or suspended state in the reservoir or after dispensing on a substrate.
  • the intended dosing with the dosing device is carried out by dispensing the concentrated or purified solution onto a target substrate.
  • this is done by dropping drops through the outlet as intended.
  • peptides from a volume of the order of 1 .mu.l to 2 .mu.l are bound to the surface of magnetic particles, then with approx. 10 ⁇ l of rinsing liquid are cleaned and then eluted in a few 100 nl to 10 nl.
  • Several analyzes of each eluate are made with application-specific amounts of substance. For this purpose, approx. 0.1 nl to 1.0 nl per analysis dispensed onto a sample carrier.
  • FIGS. 3 and 4 schematically show a processing station for the parallel processing of a large number of substances in top and side views.
  • the processing station comprises a dispenser unit 10 with a multiplicity of microdispensers 1 (for example piezoelectric dispenser according to FIG. 1), a magnet unit 20 with a multiplicity of magnet devices 8 and a drive unit 30 which is used to adjust the position or to move the magnet unit 20 is set up in relation to the dispenser unit 10.
  • a dispenser unit 10 with a multiplicity of microdispensers 1 (for example piezoelectric dispenser according to FIG. 1)
  • a magnet unit 20 with a multiplicity of magnet devices 8
  • a drive unit 30 which is used to adjust the position or to move the magnet unit 20 is set up in relation to the dispenser unit 10.
  • the microdispensers 1 of the dispenser unit 10 are arranged as a straight row.
  • the number and spacing of the microdispensers are selected depending on the application and the shape of the respective macroscopic container from which samples are to be taken.
  • the arrangement of the microdispensers is preferably adapted to the shape of a microtiter plate. In the embodiment shown, for example sixteen microdispensers 1 are provided corresponding to a microtiter plate with sixteen volumes arranged in rows.
  • the microdispensers 1 are attached to a holding and adjusting device (not shown).
  • the magnet unit 20 comprises a plurality of magnet devices 8, the number of which is at least equal to the number of microdispensers 1. Preferably, however, at the ends of the Row of microdispensers 1 each to create an additional magnetic unit to create uniform field conditions in the microdispensers at the ends of the row.
  • Each magnet device 8 consists of two spaced apart permanent magnets 81, 82, between each of which a microdispenser is arranged for substance processing.
  • the permanent magnets 81, 82 are fastened to the longitudinal sides of a frame 21 which surrounds the row of microdispensers and which extends in a manner corresponding to the row of dispensers.
  • the frame 21 can be moved with the drive unit 30 in a direction parallel to the longitudinal extent of the microdispensers 1 (up / down movement) and in a reference plane oriented perpendicular to the microdispensers 1 (forward / backward movement).
  • the long sides of the frame 21 are spaced such that a microdispenser in a position immediately adjacent to one of the permanent magnets 81, 82 is exposed essentially exclusively to the field forces of this permanent magnet and negligibly low field forces of the opposite permanent magnet.
  • the distance is chosen so that when the microdispensers change position from one to the opposite permanent manganese (forward / backward movement), the particles cannot sink so far towards the outlet under the effect of gravity that they affect the force action range of the respective permanent magnet. This ensures that the particles do not reach the outlet and cannot cause any disturbances due to clogging or the like.
  • the distance of the permanent magnet rows along the long side of the frame 21 is less than 1 cm when combined with microdispensers and is preferably approx. 6 mm to 7.5 mm.
  • the drive unit 30 comprises two servomotors 31, which
  • Pivot levers 32 are connected to the ends of the frame 21. By simultaneously actuating the servo motors 31, the frame 21 with the swivel levers 32 can be pivoted from a first position in which the dispenser row is arranged near one permanent magnet row (permanent magnets 81) to a second position in which the dispenser row is close to the respective other permanent magnet row ( Permanent magnet 82) is arranged. All dispensers and all permanent magnets are advantageously moved simultaneously relative to one another.
  • the servomotors are preferably set up to provide different swiveling speeds. For example, three swivel speeds are provided, at which different particle speeds are achieved in the reservoir of each microdispenser. With the three swiveling speeds, the change of position from the first to the second position requires, for example, approx. a quarter of a second, a half a second or a second and a half.
  • the drive unit 30 further comprises two adjusting devices 33, with which the height position of the magnet devices 8 with respect to the longitudinal direction of the microdispensers can be adjusted.
  • the actuating devices 33 are preferably spring suspensions with predetermined setting positions. There is preferably a first position in which the processing takes place in the microdispensers and a second position in which the dispenser ends protrude below the level of the frame 21, for example in order to be filled into a vessel (for example into the volumes of a microtiter plate) to become.
  • the servomotors 31 with the frame 21 for releasing the dispenser tips are pressed upwards against return springs of the actuating device 33 and anchored in the filling position.
  • the drive unit 30 also has a motor suspension 34, the actuation of which is in turn synchronized with the mounting and actuating device of the row of dispensers.
  • the processing station according to FIGS. 3 and 4 must be adapted accordingly. Accordingly, the carrier bales are to be fastened in rows to a common carrier and to be actuated with adapted actuating elements in a direction corresponding to the longitudinal direction of the microdispenser (up / down movement).
  • the actuating elements in particular have a wire or thread suspension for each carrier bale, with which the carrier bale can be pulled up from the outlet (or the nozzle) of the microdispenser to an upper dispenser area.
  • the suspension Above the piezoelectric transducer, the suspension can be moved magnetically or mechanically.
  • the processing according to the invention of the smallest amounts of substances in microdispensers has the advantage that only small amounts of the eluent are required in order to elute the bound sample substances in the dispenser tip from the solid phase.
  • 100 to 300 nl of a mixture of acetonitrile (80% by volume) with trifluoroacetic acid (0.1% by volume) are used as eluents.
  • the elution agent is taken up through the microdispenser outlet (nozzle) by creating a negative pressure (for example about 10 mbar) on the microdispenser via a supply line.
  • the eluent is sucked into the microdispenser by adjusting the surface forces or the capillary forces.
  • the implementation of the invention is not limited to the embodiments described above. In particular, the following modifications are possible.
  • the use of magnetically and mechanically actuated carrier materials is possible simultaneously.
  • two permanent magnets it is possible to provide only one permanent magnet, the position of which in relation to the respective microdispenser is changed with an adjusting device so that the magnetic particles remain constantly under the influence of the field.
  • More than two permanent magnets can also be provided per dispenser.
  • the microdispensers or micropipettes described other metering devices can also be used. Additional means for shaping the magnetic field in the area of the reservoirs of the microdispensers can be provided.
  • electromagnets or magnets based on micro superconductors can be used if there is enough space for their positioning.
  • the steps of the method according to the invention described above can be repeated and modified in order to achieve certain processings.

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Abstract

To process substances in the reservoir (3) of a microdroplet dosing device (1), a fixed support material having a binding-active surface is moved in the reservoir and the substance is bound to the surface of the support material which comprises magnetic particles (7) or a support bale.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum Prozessieren von Kleinstsubstanzmengen Method and device for processing small quantities of substances
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Prozessieren von Kleinstsubstanzmengen im Reservoir einer Fluid-Dosiereinrichtung, insbesondere ein Verfahren zum Sammeln, Reinigen und/oder Aufkonzentrieren von Substanzproben in kapillarförmigen Behältern, z.B. in Mikropipetten oder Mikrodispensern, und Vorrichtungen zur Realisierung der Verfahren.The invention relates to methods for processing very small amounts of substance in the reservoir of a fluid metering device, in particular to a method for collecting, cleaning and / or concentrating substance samples in capillary-shaped containers, e.g. in micropipettes or microdispensers, and devices for implementing the methods.
Im Bereich der Biochemie, Gentechnik und Medizin werden kleinste Probenmengen gewonnen, nachgewiesen, analysiert, be- oder verarbeitet. Dabei besteht häufig die Aufgabe, die in einer Flüssigkeit gelösten oder suspendierten Proben zwischen makroskopischen Behältnissen wie z.B. Mikrotiterplatten (μl- Volumina) und miniaturisierten Trägern wie z.B. Membranen, Filtern, MALDI-MS-Targets, Silizium- afern oder Nanotiterplat- ten (nl-Volumina) zu transferieren. Als Werkzeuge zur Übertragung geringster Substanzmengen (Untergrenze rd. 1/10 nl) sind sogenannte "Pin-Tools", bei denen die zu transferierenden Proben an Nadelspitzen anhaften, oder Mikropipetten oder Mikro- dispenser bekannt, bei denen analog zur Tintenstrahldrucktech- nik kleinste Tropfen mit der inkorporierten Probe auf dem jeweiligen Ziel-Substrat plaziert werden. Bei der Übertragung an der Schnittstelle zwischen makroskopischen Behältnissen und miniaturisierten Trägern besteht generell das Problem, daß durch die Verwendung eines Teils der im makroskopischen Behältnis vorliegenden Probenmenge nach der Übertragung auf den miniaturisierten Träger zu wenig Substanz vorhanden ist, um einen zuverlässigen Analyse- oder Bearbeitungsvorgang anzuschließen. Daher besteht ein Interesse daran, Substanzmengen in kleinen Volumina (μl-Bereich) aufzukonzentrieren, zu sammeln und/oder zu reinigen. Beim Nachweis der interessierenden Substanzen erreichen mas- senspektrometrische Verfahren heute Nachweisempfindlichkeiten im Attomol- bis unteren Femtomol-Bereich . Diese Empfindlichkeit kann in der Praxis effektiv nur dann genutzt werden, wenn der Analyt in möglichst reiner Form in einem nur wenige Nano- liter umfassenden Volumen vorliegt. Auch hierfür besteht ein Interesse an einer Aufreinigung oder Anreicherung von Substanzproben.In the field of biochemistry, genetic engineering and medicine, the smallest sample quantities are obtained, detected, analyzed, processed or processed. There is often the task of dissolving or suspending samples in a liquid between macroscopic containers such as microtiter plates (μl volumes) and miniaturized carriers such as membranes, filters, MALDI-MS targets, silicon averters or nanotiter plates (nl- Volumes) to transfer. So-called "pin tools", in which the samples to be transferred adhere to needle tips, or micropipettes or micro-dispensers, in which, in analogy to inkjet printing technology, the smallest drops are known as tools for transferring the smallest amounts of substance (lower limit approx. 1/10 nl) with the incorporated sample on the respective target substrate. When transferring at the interface between macroscopic containers and miniaturized carriers, there is generally the problem that the use of a part of the amount of sample present in the macroscopic container after transfer to the miniaturized carrier means that too little substance is present to enable a reliable analysis or processing process to be carried out . There is therefore an interest in concentrating, collecting and / or cleaning substance amounts in small volumes (μl range). When detecting the substances of interest, mass spectrometric methods today achieve detection sensitivities in the attomol to lower femtomol range. In practice, this sensitivity can only be used effectively if the analyte is in the purest form possible in a volume comprising only a few nanometers. There is also an interest in the purification or enrichment of substance samples.
Aus der chemischen und biochemischen Analytik ist allgemein bekannt, zur Probenanreicherung in die jeweilige Lösung oder Suspension Festphasen einzubringen, an denen die gewünschten Moleküle vorübergehend gebunden werden. Bei geeigneten magnetischen Materialeigenschaften können die Festphasen unter Wirkung magnetischer Feldkräfte manipuliert werden (magnetische Aufreinigung) .From chemical and biochemical analysis it is generally known to introduce solid phases into the respective solution or suspension for sample enrichment, to which the desired molecules are temporarily bound. With suitable magnetic material properties, the solid phases can be manipulated under the influence of magnetic field forces (magnetic purification).
Aus US-A-5 186 872 ist eine magnetische Trenneinrichtung zur Trennung magnetischer Teilchen von einem nicht-magnetischen Testmedium bekannt. Die magnetischen Teilchen sind kleine Partikel, auf deren Oberflächen die interessierenden Substanzen gebunden sind, oder beispielsweise biologische Zellen, in die magnetische Substanzen inkorporiert sind. Mit einer Vielzahl von Magneten wird im Testmedium ein magnetischer Feldgradient derart aufgebaut, daß die magnetischen Teilchen an die Gefäßwandung bewegt und dort gesammelt werden. Die aus US-A-5 186 872 bekannte magnetische Trenneinrichtung besitzt die folgenden Nachteile.From US-A-5 186 872 a magnetic separation device for separating magnetic particles from a non-magnetic test medium is known. The magnetic particles are small particles on the surfaces of which the substances of interest are bound, or, for example, biological cells in which magnetic substances are incorporated. With a large number of magnets, a magnetic field gradient is built up in the test medium in such a way that the magnetic particles are moved to the vessel wall and collected there. The magnetic separator known from US-A-5 186 872 has the following disadvantages.
Die Trenneinrichtung besitzt einen komplexen Aufbau. Zur Ausbildung der Feldgradienten müssen mindestens vier Magneten vorhanden sein, die in vorbestimmter Weise angeordnet sind und die Verwendung bestimmter Behältnisse für das Testmedium erfordern. Die für charakteristische Behältnis-Dimensionen im cm-Bereich konzipierte herkömmliche Trenneinrichtung erlaubt, insbesondere beim Einsatz von Elektromagneten, keine Miniaturisierung. Damit ist ein Einsatz an der oben genannten Schnittstelle zwischen makroskopischen Behältnissen und Miniaturträgern bei den verwendeten Werkzeugen ausgeschlossen. Schließlich ist die herkömmliche Trenneinrichtung auf den reinen Trennvorgang beschränkt. Die Beladung magnetischer Teilchen mit den interessierenden Substanzen in der Trenneinrichtung ist nicht vorgesehen.The separator has a complex structure. To form the field gradients, at least four magnets must be present, which are arranged in a predetermined manner and require the use of certain containers for the test medium. The for characteristic container dimensions in the cm range designed conventional separation device allows, especially when using electromagnets, no miniaturization. This prevents use at the above-mentioned interface between macroscopic containers and miniature carriers for the tools used. Finally, the conventional separation device is limited to the pure separation process. The loading of magnetic particles with the substances of interest in the separating device is not provided.
Aus US-A-5 498 550 ist ein Probensammler bekannt, bei dem Komplexe aus Proteinproben und magnetisch markierten Antikörpern unter der Wirkung eines externen Magnetfeldes in einem Reaktor manipuliert werden. Dieser Probensammler ist jedoch nicht für die Handhabung von Substanzmengen mit Volumina im nl- bis μl- Bereich geeignet. Ein weiterer Nachteil besteht in der Einschränkung auf bestimmte Substanzen, die die jeweilige Anti- gen-Antikörper-Reaktion zur Komplexbildung eingehen. Des weiteren ist aus WO 97/44671 und JP 08/062224 (in: Patent Abstracts of Japan, 1996) ein System zur Steuerung magnetischer Partikel in Pipettieranordnungen bekannt. Die magnetischen Partikel befinden sich suspendiert in einer pipettenför- migen Küvette und können mit einem äußeren Permanentmagneten an den Küvettenrand gezogen werden. Bei Entfernung des Permanentmagneten werden die Partikel freigegeben und können dadurch zum unten offenen Ende der Küvette sinken. Auch dieses System ist auf die Manipulierung größerer Probenvolumina im ml-Bereich beschränkt. Des weiteren besteht ein Nachteil dahingehend, daß die Partikelsteuerung lediglich die Bindung oder Freigabe, jedoch nicht eine gezielte Bewegung der Partikel in der Küvette umfaßt. Eine magnetische Trenneinrichtung wird in WO 96/09550 (bzw. US-A-5 567 326) beschrieben, in der magnetisierbare Partikel aus einem nicht-magnetischen Testmedium extrahiert werden. Das Testmedium ist in einer Küvet- tenanordnung untergebracht, bei der jede Küvette zum Ein- tauchen eines stiftförmigen Permanentmagneten eingerichtet ist. Der Nachteil dieser Technik besteht darin, daß die Küvet- ten kein Dispersieren des Testmediums erlauben und damit dasA sample collector is known from US Pat. No. 5,498,550 in which complexes of protein samples and magnetically labeled antibodies are manipulated in a reactor under the action of an external magnetic field. However, this sample collector is not suitable for handling substance quantities with volumes in the nl to μl range. Another disadvantage is the restriction to certain substances that enter into the respective antigen-antibody reaction for complex formation. A system for controlling magnetic particles in pipetting arrangements is also known from WO 97/44671 and JP 08/062224 (in: Patent Abstracts of Japan, 1996). The magnetic particles are suspended in a pipette-shaped cuvette and can be pulled to the edge of the cuvette with an external permanent magnet. When the permanent magnet is removed, the particles are released and can sink to the open end of the cuvette. This system is also limited to the manipulation of larger sample volumes in the ml range. Furthermore, there is a disadvantage in that the particle control only comprises the binding or release, but not a specific movement of the particles in the cuvette. A magnetic separation device is described in WO 96/09550 (or US Pat. No. 5,567,326), in which magnetizable particles are extracted from a non-magnetic test medium. The test medium is housed in a cuvette arrangement in which each cuvette is diving a pin-shaped permanent magnet is set up. The disadvantage of this technique is that the cuvettes do not allow the test medium to be dispersed, and thus that
Testmedium nur schwer handhabbar ist.Test medium is difficult to handle.
Weitere Systeme zur Manipulierung magnetischer oder magneti- sierbarer Partikel sind aus WO 86/06493, WO 89/01161, US-A-5 147 529 und US-A-3 985 649 bekannt. All diese Systeme erlauben jedoch keine Medienabgabe nach Art eines Dispensers. Diese Dispensierfunktion ist jedoch gerade in Zusammenhang mit den eingangs genannten Aufgaben in der Biochemie, Gentechnik und Medizin von entscheidender Bedeutung.Further systems for manipulating magnetic or magnetizable particles are known from WO 86/06493, WO 89/01161, US-A-5 147 529 and US-A-3 985 649. However, all of these systems do not allow media dispensing in the manner of a dispenser. However, this dispensing function is of crucial importance in connection with the tasks mentioned above in biochemistry, genetic engineering and medicine.
Gegenwärtig ist keine Aufreinigungs- oder Anreicherungstechnik bekannt, die zur Prozessierung (z. B. Handhabung, Sammlung, Reinigung oder dergl . ) kleinster Substanzmengen (bis zum nl- Bereich und darunter) einsetzbar ist.No purification or enrichment technology is currently known which can be used for processing (e.g. handling, collecting, cleaning or the like) the smallest amounts of substance (up to the nl range and below).
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Prozessieren kleinster Substanzmengen anzugeben, das insbesondere mit dem Einsatz herkömmlicher Werkzeuge zur Probenhandhabung im nl-Bereich kompatibel ist und einen möglichst breiten Einsatzbereich besitzt. Das Verfahren soll einfach in die üblichen Methoden zur Probenhandhabung, zum Probennachweis und zur Probenbearbeitung aus der Biochemie, Gentechnik und Medizin integrierbar sein. Die Aufgabe der Erfindung besteht auch darin, eine Vorrichtung zur Implementierung eines derartigen Verfahrens anzugeben.It is the object of the invention to provide a method for processing the smallest quantities of substance, which is particularly compatible with the use of conventional tools for sample handling in the nl range and has the widest possible range of use. The method should be easy to integrate into the usual methods for sample handling, sample detection and sample processing from biochemistry, genetic engineering and medicine. The object of the invention is also to provide a device for implementing such a method.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren oder Vorrichtungen gemäß den Patentansprüchen 1 bzw. 11 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Sammlung von Substanzproben basiert auf der Anordnung und Bewegung einer Festphase (Trägermaterial) unmittelbar im Reservoir einer Mikrodosierein- richtung, wobei die interessierende Substanz auf der Oberfläche des Trägermaterials gebunden und für eine vorbestimmte Folge von Arbeitsschritten im Reservoir gehalten wird. Das Reservoir besitzt ein charakteristisches Volumen, das allgemein kleiner als 500 μl ist und vorzugsweise weniger als 10 μl, insbesondere weniger als 2 μl, bis zu 1 nl, beträgt. Die Dosiereinrichtung ist zur Mikrotropfenabgabe im Sub-nl- Bereich ausgelegt. Das Trägermaterial kann durch magnetische Partikel, die durch eine äußere magnetische Feldkraft bewegt werden, oder durch einen porösen Trägerballen gebildet werden, der durch eine äußere mechanische Betätigung bewegt wird. Das Trägermaterial besteht aus einem an sich inkompressiblen und harten Material. Dies bedeutet, daß das Trägermaterial bei Betätigung der Dosiereinrichtung, z.B. durch Anlegen eines Druckpulses, keine Formänderung eingeht.The object of the invention is achieved by a method or devices according to claims 1 and 11, respectively. Preferred embodiments of the invention result from the dependent claims. The method according to the invention for collecting substance samples is based on the arrangement and movement of a solid phase (carrier material) directly in the reservoir of a microdosing device, the substance of interest being bound on the surface of the carrier material and being held in the reservoir for a predetermined sequence of work steps. The reservoir has a characteristic volume that is generally less than 500 μl and preferably less than 10 μl, in particular less than 2 μl, up to 1 nl. The dosing device is designed for microdrop delivery in the sub nl range. The carrier material can be formed by magnetic particles which are moved by an external magnetic field force or by a porous carrier ball which is moved by an external mechanical actuation. The carrier material consists of an inherently incompressible and hard material. This means that the carrier material does not undergo a change in shape when the metering device is actuated, for example by applying a pressure pulse.
Die Bindung zwischen der oder den interessierenden Substanzen und der Oberfläche des Trägermaterials erfolgt über die Ausbildung von van-der-Vaals-Kräften aufgrund von hydrophoben Wechselwirkungen. Dies bedeutet, daß die Bindung mit einer relativ geringen Spezifität hinsichtlich des einzelnen Stoffes erfolgt und damit die Erfindung mit ganzen Substanzklassen in Stoffgemischen (z.B. Gemische von Peptiden, Proteine, DNA oder Oligonukleotide) realisiert werden kann.The bond between the substance or substances of interest and the surface of the carrier material takes place via the formation of van der Vaals forces due to hydrophobic interactions. This means that the binding takes place with a relatively low specificity with regard to the individual substance and the invention can thus be implemented with entire substance classes in mixtures of substances (e.g. mixtures of peptides, proteins, DNA or oligonucleotides).
Mit dem Begriff "Reservoir" der Dosiereinrichtung wird hier das aktive Dosiervolumen oder Hubvolumen oder - bei Implementierung mit entsprechenden Einrichtungen - das Pipettenvolumen oder das Dispenservolumen bezeichnet. Die Dosiereinrichtung kann durch jede geeignete Pump- oder Dosiereinrichtung gebildet werden, die zur Abgabe vorbestimmter Fluidmengen vom Reservoir auf ein Zielsubstrat eingerichtet ist. Die Erfindung wird vorzugsweise mit Dosiereinrichtungen für kleinste Substanzmengen (Nanoliter und Sub-Nanoliter) realisiert. Hierzu zählen beispielsweise Mikropipetten oder Mikrodispenser oder Mikropumpen (insbesondere mit pneumatischem oder elektrischem Antrieb) oder andere Mikrotropfenschußeinrichtungen, die analog zu den Tintenstrahltechniken funktionieren.The term “reservoir” of the dosing device here denotes the active dosing volume or stroke volume or - when implemented with appropriate devices - the pipette volume or the dispenser volume. The metering device can be formed by any suitable pumping or metering device which is set up to deliver predetermined amounts of fluid from the reservoir to a target substrate. The invention is preferably implemented with dosing devices for the smallest amounts of substance (nanoliter and sub-nanoliter). These include, for example, micropipettes or microdispensers or micropumps (in particular with a pneumatic or electric drive) or other microdroplet devices which function analogously to the inkjet techniques.
Zur Prozessierung kleinster Subtanzmengen wird das Trägermaterial vorzugsweise in unmittelbarer Nähe einer Austrittsöffnung des Reservoirs der Dosiereinrichtung angeordnet bzw. bewegt. Dies bedeutet beispielsweise eine Manipulierung des Trägermaterials an oder nahe der Spitze einer Dosierkapillare z.B. eines Mikrodispensers . Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht in deren Kompatibilität mit beliebigen, herkömmlichen Dosiereinrichtungen. Es wurde erstmalig festgestellt, daß eine Probensammlung nach dem Prinzip der an sich bekannten Festphasen-Aufreinigung in Dosiereinrichtungen möglich ist, ohne deren Funktion zu beeinträchtigen. Dies betrifft insbesondere die Implementierung der Erfindung in Mikrodosiereinrichtungen mit nl-Volumina.For processing the smallest amounts of substance, the carrier material is preferably arranged or moved in the immediate vicinity of an outlet opening of the reservoir of the metering device. This means, for example, manipulation of the carrier material at or near the tip of a metering capillary e.g. a microdispenser. A particular advantage of the invention is its compatibility with any conventional metering device. It was found for the first time that a sample collection according to the principle of the known solid phase purification in metering devices is possible without impairing their function. This applies in particular to the implementation of the invention in microdosing devices with nl volumes.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich dadurch aus, daß im Reservoir einer Fluid-Dosiereinrichtung ein Trägermittel als Festphase mit bindungsaktiver Oberfläche angeordnet und mit einer äußeren Antriebseinrichtung manipulierbar ist. Vorzugsweise werden eine Vielzahl von Fluid-Dosierein- richtungen parallel betrieben, wobei nur eine gemeinsame Antriebseinrichtung zur Manipulierung der Festphasen vorgesehen ist .A device according to the invention is characterized in that a carrier as a solid phase with a binding-active surface is arranged in the reservoir of a fluid metering device and can be manipulated with an external drive device. A plurality of fluid metering devices are preferably operated in parallel, only one common drive device being provided for manipulating the solid phases.
Die Erfindung besitzt den Vorteil, daß erstmalig das Problem der miniaturisierten Proben-Aufreinigung oder -Sammlung gelöst wird. Die Erfindung ist einfach mit verfügbaren Mikropipetten oder Mikrodispensern, insbesondere bei deren einzelnem oder seriellem Einsatz, ohne Störung herkömmlicher Verfahrensabläufe realisierbar. Es ist erstmalig gelungen, in Mikrodispensern Probensubstanzen an einem Trägermaterial zu binden und mit diesem im Mikrodispenser zu bewegen, ohne die Funktion des Mikrodispensers einzuschränken. Dies stellt einen unerwarteten und wesentlichen Erfolg dar, da normalerweise z.B. piezoelektrische Mikrodispenser einen Funktionsausfall zeigen, wenn sich in ihrem Inneren ein kompressibler Bestandteil, z.B. auf der Basis von Partikeln, suspendierten Flüssigkeiten oder Gaseinschlüssen, befindet. Es hat sich gezeigt, daß bei Verwendung von magnetischen Partikeln als Trägermaterial, die einen charakteristische Größe im Bereich von 200 nm bis 1 μm besitzen, in vorteilhafter Weise eine Doppelfunktion erfüllt wird. Einerseits besitzen sie eine sehr große affine Oberfläche zur Bindung der Probensubstanzen. Andererseits wird durch die kleinen Partikel der Dispensiervorgang nicht gestört, wobei insbesondere auch ein Verstopfen der Austrittsdüse ausgeschlossen wird. Die Erfindung erlaubt sowohl die Bindung der interessierenden Substanzen am Trägermaterial als auch dessen Manipulierung innerhalb eines Behältnisses des Reservoirs ohne Zusatzschritte. Diese Manipulierung umfaßt insbesondere eine Elution der am Trägermaterial phasengebundenen Substanzen.The invention has the advantage that the problem of miniaturized sample purification or collection is solved for the first time. The invention is simple with available micropipettes or microdispensers, especially with their single or serial use, can be implemented without disrupting conventional processes. For the first time, it has been possible to bind sample substances to a carrier material in microdispensers and to move them in the microdispenser without restricting the function of the microdispenser. This is an unexpected and significant success, since normally, for example, piezoelectric microdispensers show a functional failure if there is a compressible component inside, for example based on particles, suspended liquids or gas inclusions. It has been found that when magnetic particles are used as carrier material, which have a characteristic size in the range from 200 nm to 1 μm, a double function is advantageously fulfilled. On the one hand, they have a very large affine surface for binding the sample substances. On the other hand, the dispensing process is not disturbed by the small particles, and in particular clogging of the outlet nozzle is also excluded. The invention allows both the binding of the substances of interest on the carrier material and its manipulation within a container of the reservoir without additional steps. This manipulation includes, in particular, elution of the substances phase-bound on the carrier material.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung betrifft den Einsatz bei Mikropipetten oder Mikrodispensern. Für das reproduzierbare, genaue Dispensieren kleinster Flüssigkeitsmengen müssen nämlich die geometrischen Eigenschaften der Dispenserspitze sowie die elektrischen Piezoparameter optimal aufeinander abgestimmt sein. Die Erfindung ermöglicht es, daß das für eine vorübergehende Anbindung der Moleküle erforderliche feste Trägermaterial den Dispersiervorgang nicht stört, d.h. weder die Gefäßdimensionen noch die durch die Flüssigkeit laufende Druckwelle effektiv beeinflußt werden. Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden im folgenden unter Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben:A particular advantage of the invention relates to use with micropipettes or microdispensers. For the reproducible, precise dispensing of the smallest quantities of liquid, the geometric properties of the dispenser tip and the electrical piezo parameters must be optimally coordinated. The invention makes it possible that the solid carrier material required for a temporary attachment of the molecules does not interfere with the dispersion process, ie neither the vessel dimensions nor the pressure wave running through the liquid are effectively influenced. Further advantages and details of the invention are described below with reference to the accompanying drawings:
Fig. 1: eine schematische Illustration einer ersten Ausführungsform der Erfindung, bei der ein magnetisches Trägermaterial in einer Dosiereinrichtung verwendet wird,1: a schematic illustration of a first embodiment of the invention, in which a magnetic carrier material is used in a metering device,
Fig. 2: eine schematische Illustration einer zweiten Ausführungsform der Erfindung bei der ein poröser Trägerballen in einer Dosiereinrichtung verwendet wird,2: a schematic illustration of a second embodiment of the invention in which a porous carrier bale is used in a metering device,
Fig. 3: eine schematische Draufsicht auf eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer Reihe von Mikrodispensern, die jeweils zur Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet sind, und3 shows a schematic top view of a device according to the invention with a number of microdispensers, each of which is set up to implement the method according to the invention,
Fig. 4: eine schematische Seitenansicht der Vorrichtung gemäß Fig. 3.FIG. 4: a schematic side view of the device according to FIG. 3.
Die Erfindung wird vorzugsweise mit Dosiereinrichtungen realisiert, die für eine Abgabe von Flüssigkeitsmengen im nl- bis pl-Bereich eingerichtet sind. Dies bedeutet, daß die Dosiereinrichtung jeweils ein Dosier-Reservoir im 1/10 nl- bis μl-Bereich besitzt, aus dem, vorzugsweise bei Druckbetätigung, Tröpfen oder Portionen mit Volumina unterhalb 100 pl abgegeben werden können. Ein Beispiel für eine derartige Dosiereinrichtung ist ein Mikrodispenser, wie er im folgenden unter Bezug auf die Fign. 1 und 2 erläutert wird.The invention is preferably implemented with metering devices which are set up for dispensing liquid quantities in the nl to pl range. This means that the dosing device each has a dosing reservoir in the 1/10 nl to μl range, from which droplets or portions with volumes below 100 pl can be dispensed, preferably when actuated by pressure. An example of such a metering device is a microdispenser, as described below with reference to FIGS. 1 and 2 will be explained.
Fig. 1 zeigt beispielhaft das Ende eines piezoelektrischen Mikrodispensers, der zur Implementierung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung (magnetische Manipulierung des festen Trägermaterials) einge- richtet ist. Der piezoelektrische Dispenser 1 umfaßt einen elektrischen Wandler 2 und ein Dosier-Reservoir 3, das durch eine Kapillare gebildet wird. Der Wandler 2 ist zur pulsförmi- gen Verringerung des Volumens des Dosier-Reservoirs 3 eingerichtet. Bei Betätigung des Wandlers 2 für eine Pulszeit1 shows an example of the end of a piezoelectric microdispenser that was used to implement the method according to the invention in accordance with a first embodiment of the invention (magnetic manipulation of the solid carrier material). is aimed. The piezoelectric dispenser 1 comprises an electrical converter 2 and a dosing reservoir 3, which is formed by a capillary. The converter 2 is set up to reduce the volume of the metering reservoir 3 in the form of a pulse. When the converter 2 is actuated for a pulse time
(typischerweise rd. 40 μs) läuft eine Druckwelle durch die Flüssigkeit 4 im Dosier-Reservoir 3. Dies bewirkt einen Flüssigkeitsausstoß am Auslaß 5 (Durchmesser rd. 50 μm) des Dosier-Reservoirs 3, der hier durch das Ende der Kapillare gebildet wird (Dispenserspitze) . Wenn die Druckwelle in der Flüssigkeit 4 die am Auslaß 5 auftretenden Rückhaltekräfte(typically around 40 μs) a pressure wave runs through the liquid 4 in the dosing reservoir 3. This causes a liquid to be ejected at the outlet 5 (diameter around 50 μm) of the dosing reservoir 3, which is formed here by the end of the capillary ( Dispenser tip). When the pressure wave in the liquid 4 the retention forces occurring at the outlet 5
(Kapillarkräfte und Oberflächenspannung) überwindet, so kommt es zur Abgabe eines Tropfens 6.(Capillary forces and surface tension), a drop 6 is released.
Die Flüssigkeit 4 umfaßt beispielsweise eine Lösung oder Suspension von Probenmolekülen, die bei biochemischen Anwendungen Peptide, Proteine, Nukleinsäuren bzw. DNA-Moleküle, Fette oder Kohlenhydrate umfassen. Um die Probenmoleküle (Substanzprobe) im Dosier-Reservoir 3 erfindungsgemäß aufzukonzentrieren oder aufzureinigen, ist im Dosier-Reservoir 3, vorzugsweise in der Nähe des Auslaß 5, eine Vielzahl magnetischer Partikel 7 angeordnet, die mit einer Antriebseinrichtung zur Halterung und/oder Bewegung der magnetischen Partikel 7 in Form einer Magneteinrichtung 8 manipulierbar sind. Die Magneteinrichtung 8 umfaßt zwei Permanentmagneten 81, 82 mit jeweils veränderlichem Abstand in Bezug auf das Dosier-Reservoir 3 mit den magnetischen Partikeln. Beide Permanentmagneten 81, 82 weisen mit dem gleichen Pol hin zum Reservoir 3. Weitere Einzelheiten der Magneteinrichtung 8 und einer zugehörigen (hier nicht dargestellten) Antriebseinrichtung werden unten unter Bezug auf die Figuren 3 und 4 erläutert.The liquid 4 comprises, for example, a solution or suspension of sample molecules which, in biochemical applications, comprise peptides, proteins, nucleic acids or DNA molecules, fats or carbohydrates. In order to concentrate or purify the sample molecules (substance sample) in the dosing reservoir 3 according to the invention, a large number of magnetic particles 7 are arranged in the dosing reservoir 3, preferably in the vicinity of the outlet 5, which are provided with a drive device for holding and / or moving the magnetic Particles 7 in the form of a magnetic device 8 can be manipulated. The magnet device 8 comprises two permanent magnets 81, 82, each with a variable distance with respect to the dosing reservoir 3 with the magnetic particles. Both permanent magnets 81, 82 point toward the reservoir 3 with the same pole. Further details of the magnet device 8 and an associated drive device (not shown here) are explained below with reference to FIGS. 3 and 4.
Die magnetischen Partikel 7 besitzen einen Durchmesser, der etwa ein bis zwei Zehnerpotenzen kleiner als der Durchmesser der Dispenserdüse (Auslaß 5) ist und vorzugsweise im Bereich von 0,25 bis 2 μm liegt. Damit wird erreicht, daß die PartikelThe magnetic particles 7 have a diameter which is approximately one to two powers of ten smaller than the diameter of the dispenser nozzle (outlet 5) and preferably in the region from 0.25 to 2 μm. This ensures that the particles
7 problemlos als Suspension in den Dispenser 1 eingesaugt und im Dosier-Reservoir 3 deponiert bzw. bewegt werden können. Dies ist sogar in der Nähe des Auslaß 5 möglich, da die magnetische Feldeinwirkung der Magneteinrichtung 8 vorteilhafterweise verhindert, daß Partikel 7 unerwünscht an den Auslaß 5 bzw. aus diesem hinaus gelangen. Ein weiterer Vorteil der angegebenen Partikelgröße besteht darin, daß die deponierten Partikel 7, d.h. die unter der magnetischen Feldkraft an der Dispenserinnenwand haftenden Partikel, aufgrund ihrer geringen Raumausdehnung den piezoelektrischen Dispensiervorgang nicht behindern .7 can be easily sucked into the dispenser 1 as a suspension and deposited or moved in the dosing reservoir 3. This is even possible in the vicinity of the outlet 5, since the magnetic field effect of the magnet device 8 advantageously prevents particles 7 from undesirably reaching the outlet 5 or out of it. Another advantage of the specified particle size is that the deposited particles 7, i.e. the particles adhering to the inner wall of the dispenser under the magnetic field force do not impede the piezoelectric dispensing process due to their small spatial expansion.
Als magnetische Partikel 7 werden vorzugsweise kommerziell verfügbare Substanzen mit einer genügenden Magnetisierbarkeit und mit einer möglichst großen aktiven Partikeloberfläche verwendet. Die Partikel 7 besitzen eine Affinität für die Probenmoleküle, so daß diese aus der Flüssigkeit 4 heraus im Inneren der Dispenserspitze an die Partikel gebunden werden.Commercially available substances with sufficient magnetizability and with the largest possible active particle surface are preferably used as magnetic particles 7. The particles 7 have an affinity for the sample molecules, so that they are bound to the particles from the liquid 4 inside the dispenser tip.
Erfindungsgemäß können die magnetischen Partikel 7 durch Veränderung der magnetischen Feldkräfte in vorbestimmter Weise im Dosier-Reservoir 3 bewegt werden. Die Veränderung der magnetischen Feldkräfte erfolgt durch eine Bewegung des Mikrodispensers 1 und der Magneteinrichtung 8 relativ zueinander, wobei vorzugsweise die Permanentmagneten 81, 82 in Bezug auf die ortsfeste Dispenserspitze bewegt werden. So ist es beispielsweise möglich, durch simultane Entfernung des Magneten 81 und Annäherung des Magneten 82 von der entgegengesetzten Dis- penserseite her, die Partikel mit der Probenbeladung durch die Flüssigkeit 4 von einer Wandung des Dosier-Reservoirs 3 zur entgegengesetzten Wandung zu bewegen. Die Partikel 7, die das feste Trägermaterial (Festphase) bilden, werden durch die Flüssigkeit 4 bewegt, von dieser umströmt und mit ihr vermischt, so daß weitere Probenmoleküle gebunden werden, während andere Lösungsbestandteile in der Flüssigkeit 4 verbleiben.According to the invention, the magnetic particles 7 can be moved in a predetermined manner in the metering reservoir 3 by changing the magnetic field forces. The magnetic field forces are changed by moving the microdispenser 1 and the magnet device 8 relative to one another, the permanent magnets 81, 82 preferably being moved with respect to the stationary dispenser tip. For example, by simultaneously removing the magnet 81 and approaching the magnet 82 from the opposite side of the dispenser, it is possible to move the particles with the sample loading through the liquid 4 from one wall of the metering reservoir 3 to the opposite wall. The particles 7, which form the solid carrier material (solid phase), are moved through the liquid 4, flowed around by it and mixed with it, so that further sample molecules are bound while other solution components remain in the liquid 4.
Durch wiederholtes Bewegen der Partikel 7 durch die Flüssigkeit 4 können in ausreichender Menge die interessierenden Probenmoleküle gesammelt werden (Anreicherung) . Das gezielte Bewegen der Partikel mit den gebundenen Probensubstanzen durch die Flüssigkeit stellt einen wesentlichen und durch herkömmliche Dispensiersysteme mit großen Flüssigkeitsvolumina nicht erzielbaren Vorteil der Erfindung dar. Erfindungsgemäß sind für die Partikel nicht nur statisch gebundene oder freigegebene Zustände maßgeblich, sondern auch dynamisch gebundene Zustände, in denen das gezielte Bewegen durch die Flüssigkeit erfolgt. Weitere Prozessierungsschritte werden weiter unten erläutert .By repeatedly moving the particles 7 through the liquid 4, the sample molecules of interest can be collected in sufficient quantities (enrichment). The targeted movement of the particles with the bound sample substances through the liquid represents an essential advantage of the invention that cannot be achieved by conventional dispensing systems with large liquid volumes. According to the invention, not only statically bound or released states are decisive for the particles, but also dynamically bound states, in which are deliberately moved through the liquid. Further processing steps are explained below.
Die Permanentmagneten 81, 82 sind vorzugsweise NdFeB-Magneten mit einer anwendungsabhängig gewählten Remanenz, Beim Einsatz mit Mikrodispensern beträgt die Remanenz vorzugsweise rd. 1 Tesla bis 1,5 Tesla.The permanent magnets 81, 82 are preferably NdFeB magnets with an application-specific remanence. When used with microdispensers, the remanence is preferably approx. 1 Tesla to 1.5 Tesla.
Fig. 2 zeigt eine zweite Ausführungsform der Erfindung wiederum am Beispiel eines Mikrodispensers 1 mit einem piezoelektrischen Wandler 2 und einem Dosier-Reservoir 3, von dessen Auslaß 5 bei Betätigung des Wandlers 2 ein Mikrotropfen 6 abgegeben werden kann. Als Trägermaterial ist erfindungsgemäß ein Trägerballen 9 vorgesehen, der mit einer Antriebseinrichtung zur Halterung und/oder Bewegung des Ballens 9 in Form eines faden- oder stabförmigen Betätigungselements 91, das durch das Dosier-Reservoir 3 des Dispensers 1 beweglich ist (Pfeilrichtung) . Der Trägerballen 9 ist eine zusammenhängende, schwammartige feste Phase, die eine möglichst große aktive Oberfläche besitzt. Das vorzugsweise poröse, an sich jedoch inkompressi- ble Material des Trägerballens 9 besteht beispielsweise aus Nitrocellulose oder einem Säulenfüllmaterial, wie es bei HPLC- Trennungen verwendet wird (z.B. Material "Porös" (registrierte Marke) ) . Anstelle der Probensammlung mit den bewegten, magnetischen Partikeln (erste Ausführungsform) wird bei der zweiten Ausführungsform ein mechanisches Wirkprinzip realisiert. Der Trägerballen 9 wird mit dem Betätigungselement 91 durch den Innenraum des Dosier-Reservoir 3 bewegt, um Probenmoleküle aufzusammeln. Der Trägerballen 9 ist von der Flüssigkeit 4 im Mikrodispenser 4 durchströmbar, so daß eine unerwünschte Flüssigkeitsabgabe vermieden wird. Nach dem Anreicherungsvorgang, wenn die aufkonzentrierten Analytmoleküle funktionsgemäß vom Mikrodispenser 1 auf ein bestimmtes Substrat abgegeben werden sollen, wird der Trägerballen 9 durch die Dispenserspitze nach oben durch den Wandler 2 hindurchgezogen.Fig. 2 shows a second embodiment of the invention, again using the example of a microdispenser 1 with a piezoelectric transducer 2 and a dosing reservoir 3, from the outlet 5 of which a microdrop 6 can be dispensed when the transducer 2 is actuated. According to the invention, a carrier bale 9 is provided as the carrier material, which has a drive device for holding and / or moving the bale 9 in the form of a thread-like or rod-shaped actuating element 91, which is movable through the metering reservoir 3 of the dispenser 1 (arrow direction). The carrier bale 9 is a coherent, sponge-like solid phase which has the largest possible active surface. The preferably porous, but incompressible material of the carrier bale 9 consists, for example, of nitrocellulose or a column filling material such as is used in HPLC separations (for example material "Porous" (registered trademark)). Instead of the sample collection with the moving, magnetic particles (first embodiment), a mechanical operating principle is implemented in the second embodiment. The carrier bale 9 is moved with the actuating element 91 through the interior of the dosing reservoir 3 in order to collect sample molecules. The carrier bale 9 can be flowed through by the liquid 4 in the microdispenser 4, so that an undesired dispensing of liquid is avoided. After the enrichment process, when the concentrated analyte molecules are to be functionally discharged from the microdispenser 1 onto a specific substrate, the carrier bale 9 is pulled upward through the dispenser tip through the transducer 2.
Zur Verwendung für die erfindungsgemäße Prozessierung von kleinsten Substanzmengen wird eine Dosiereinrichtung durch Aufnahme des festen Trägermaterials in das Reservoir der Dosiereinrichtung vorbereitet. Bei der ersten Ausführungsform erfolgt eine Aufnahme und Deponierung der magnetischen Partikel im Reservoir (z.B. im Dosier-Reservoir des Mikrodispensers), in dem eine Partikelsuspension entweder durch den Auslaß des Reservoirs oder durch eine zusätzliche Versorgungsleitung unter gleichzeitiger Einwirkung der magnetischen Feldkräfte in das Reservoir gefüllt wird. Unter Wirkung der magnetischen Feldkräfte werden die Partikel sofort an eine Reservoirwandung gezogen und dort festgehalten (Deponierung) . Bei der zweiten Ausführungsform umfaßt der Vorbereitungsschritt die Zuführung des Trägerballens in das Reservoir der Dosiereinrichtung und eine Fixierung des hierfür verwendeten Betätigungselements derart, daß der Trägerballen im Reservoir nahe dessen Auslaß positioniert ist.For use in the processing of very small amounts of substance according to the invention, a dosing device is prepared by taking up the solid carrier material in the reservoir of the dosing device. In the first embodiment, the magnetic particles are taken up and deposited in the reservoir (for example in the metering reservoir of the microdispenser), in which a particle suspension is filled into the reservoir either through the outlet of the reservoir or through an additional supply line with the simultaneous action of the magnetic field forces . Under the action of the magnetic field forces, the particles are immediately drawn to a reservoir wall and held there (landfill). In the second embodiment, the preparation step comprises feeding the carrier bale into the reservoir of the metering device and fixing the actuating element used for this purpose in such a way that the carrier bale is positioned in the reservoir near its outlet.
Nach dem Vorbereitungsschritt erfolgt die Aufnahme einer Lösung oder Dispensierung der interessierenden Substanzproben. Diese Aufnahme erfolgt entsprechend durch einen Auslaß der Dosiereinrichtung oder durch eine zusätzliche Zufuhrleitung.After the preparatory step, a solution is added or the substance samples of interest are dispensed. This recording is carried out accordingly through an outlet of the metering device or through an additional supply line.
Beim folgenden Bindungsschritt werden die auf das jeweilige Trägermaterial wirkenden Kräfte derart verändert, daß sich das Trägermaterial durch die aufgenommene Lösung oder Suspension bewegt und dabei von dieser umspült wird, so daß sich eine Bindung der Substanz auf dem Trägermaterial ergibt . Bei der ersten Ausführungsform werden die magnetischen Feldkräfte derart verändert, daß sich die magnetischen Partikel vom ursprünglichen Deponierungsort zu einem anderen Teil der Reservoirwandung (z.B. gegenüberliegende Wandung) bewegen. Bei der zweiten Ausführungsform wird das Antriebselement (z.B. in Fig. 2, Bezugszeichen 91, derart bewegt, daß das Trägermaterial von der Lösung oder Suspension umspült wird. Die Bewegung des Trägermaterials durch die Flüssigkeit erfolgt vorzugsweise periodisch mit einer Vielzahl von Bewegungsabläufen. Die Geschwindigkeit und Dauer der Trägermaterialbewegung und somit des Bindungsschrittes werden anwendungsabhängig gewählt.In the following binding step, the forces acting on the respective carrier material are changed in such a way that the carrier material moves through the absorbed solution or suspension and is thereby washed around by it, so that the substance binds to the carrier material. In the first embodiment, the magnetic field forces are changed such that the magnetic particles move from the original deposit site to another part of the reservoir wall (e.g. opposite wall). In the second embodiment, the drive element (for example in FIG. 2, reference number 91) is moved in such a way that the carrier material is flushed around by the solution or suspension. The movement of the carrier material through the liquid is preferably carried out periodically with a large number of movements. The speed and The duration of the carrier material movement and thus of the binding step are chosen depending on the application.
Nach Anbindung der interessierenden Substanz am Trägermaterial wird die Flüssigkeit aus dem Reservoir der Dosiereinrichtung durch den Auslaß oder durch eine vom entgegengesetzten (oberen) Ende wegeführende Leitung abgegeben. Je nach Anwendungsfall kann nun eine weitere Lösung oder Suspension mit der interessierenden Substanz oder ohne eine Probensubstanz zugeführt werden. Im ersten Fall wird damit eine Anreicherung der Substanz im Reservoir erzielt. Das Aufkonzentrieren erfolgt zunächst im gebundenen Zustand an den Trägermaterialien. Nach wiederholter Zufuhr von Probenlösungen wird dann durch Aufnahme einer geeigneten Elutionslösung in das Reservoir die gebundene Substanz wieder in die Flüssigkeit oder Suspension abgegeben. Nach dem Ablösen der Substanz von den Partikeln oder vom Trägerballen besitzt die Elutionslösung eine höhere Konzentration als die ursprünglich zugeführte Lösung. Im zweiten Fall kann vorgesehen sein, eine Reinigungslösung zuzuführen, mit der eine vorbestimmte Art von Substanzen, die beim vorherigen Bindungsschritt unbeabsichtigt an den Trägermaterialien angebunden wurden, wieder abgelöst werden. Dies entspricht einer Reinigung oder weiteren selektiven Substanzwahl. Anschließend erfolgt wiederum die Ablösung der Substanz von den Trägermaterialien mit einer geeigneten Elutionslösung.After the substance of interest has been attached to the carrier material, the liquid is discharged from the reservoir of the metering device through the outlet or through a line leading away from the opposite (upper) end. Depending on the application, a further solution or suspension with the substance of interest or without a sample substance can now be added. In the first case, the substance is enriched in the reservoir. Concentration is initially carried out in the bound state on the carrier materials. After repeated supply of sample solutions, the bound substance is then released into the liquid or suspension again by taking up a suitable elution solution in the reservoir. After the substance has been detached from the particles or from the carrier bale, the elution solution has a higher concentration than the originally supplied solution. In the second In this case, it can be provided to supply a cleaning solution with which a predetermined type of substances which were unintentionally bound to the carrier materials in the previous binding step can be detached again. This corresponds to cleaning or another selective choice of substances. The substance is then detached again from the carrier materials using a suitable elution solution.
Mit den vorher beschriebenen Prozessierungsschritten umfassend die Probenbindung und die Proben-Konzentration und/oder Reinigung, können bei geeigneter Wiederholung mit jeweils ausgewählten Substanzen auch mikropräparative und mikrosynthetische Zwecke verfolgt werden. So ist es beispielsweise möglich, zunächst einen ersten Reaktionspartner im Reservoir zu sammeln und/oder zu reinigen, um ihn dann mit einem entsprechend gesammelten und/oder gereinigten zweiten Reaktionspartner zur Reaktion zu bringen. Diese Reaktion kann im gebundenen Zustand auf dem Trägermaterial oder im gelösten oder suspendierten Zustand im Reservoir oder nach Dispensierung auf einem Substrat erfolgen .With the processing steps described above, including sample binding and sample concentration and / or cleaning, micro-preparative and microsynthetic purposes can also be pursued with suitable repetition with selected substances. It is thus possible, for example, to first collect and / or clean a first reaction partner in the reservoir, in order then to react it with a correspondingly collected and / or cleaned second reaction partner. This reaction can take place in the bound state on the carrier material or in the dissolved or suspended state in the reservoir or after dispensing on a substrate.
Nach der Substanzfreigabe von den Trägermaterialien erfolgt die bestimmungsgemäße Dosierung mit der Dosiereinrichtung durch Abgabe der konzentrierten oder gereinigten Lösung auf ein Ziel-Substrat. Dies erfolgt beispielsweise bei dem beschriebenen Mikrodispenser durch die bestimmungsgemäße Tropfenabgabe durch den Auslaß.After the substance has been released from the carrier materials, the intended dosing with the dosing device is carried out by dispensing the concentrated or purified solution onto a target substrate. In the microdispenser described, for example, this is done by dropping drops through the outlet as intended.
Bei einer erfindungsgemäßen Probensubstanzbehandlung werden beispielsweise Peptide aus einem Volumen der Größenordnung 1 μl bis 2 μl an die Oberfläche magnetischer Partikel gebunden, anschließend mit rd. 10 μl Spülflüssigkeit gereinigt und daraufhin in wenigen 100 nl bis 10 nl eluiert. Von jedem Eluat werden mehrere Analysen mit anwendungsabhängig gewählten Substanzmengen angefertigt. Hierzu werden beispielsweise rd. 0.1 nl bis 1.0 nl pro Analyse auf einen Probenträger dispensiert .In a sample substance treatment according to the invention, for example, peptides from a volume of the order of 1 .mu.l to 2 .mu.l are bound to the surface of magnetic particles, then with approx. 10 μl of rinsing liquid are cleaned and then eluted in a few 100 nl to 10 nl. Several analyzes of each eluate are made with application-specific amounts of substance. For this purpose, approx. 0.1 nl to 1.0 nl per analysis dispensed onto a sample carrier.
Im folgenden wird eine weitere Ausführungsform der Erfindung mit einer Vielzahl von Dosiereinrichtungen, in denen jeweils Substanzen entsprechend den oben beschriebenen Prinzipien prozessiert werden können, unter Bezug auf die Figuren 3 und 4 beschrieben.A further embodiment of the invention is described below with a plurality of metering devices, in each of which substances can be processed according to the principles described above, with reference to FIGS. 3 and 4.
Die Figuren 3 und 4 zeigen schematisch eine Prozessierungs- station für die parallele Bearbeitung einer Vielzahl von Substanzen in Drauf- bzw. Seitenansicht. Die Prozessierungs- station umfaßt eine Dispensereinheit 10 mit einer Vielzahl von Mikrodispensern 1 (z.B. piezoelektrische Dispenser gem. Fig. 1), eine Magneteinheit 20 mit einer Vielzahl von Magneteinrichtungen 8 und eine Antriebseinheit 30, die zur Einstellung der Position bzw. zur Bewegung der Magneteinheit 20 in Bezug auf die Dispensereinheit 10 eingerichtet ist.FIGS. 3 and 4 schematically show a processing station for the parallel processing of a large number of substances in top and side views. The processing station comprises a dispenser unit 10 with a multiplicity of microdispensers 1 (for example piezoelectric dispenser according to FIG. 1), a magnet unit 20 with a multiplicity of magnet devices 8 and a drive unit 30 which is used to adjust the position or to move the magnet unit 20 is set up in relation to the dispenser unit 10.
Die Mikrodispenser 1 der Dispensereinheit 10 sind als gerade Reihe angeordnet. Die Anzahl und Abstände der Mikrodispenser sind anwendungsabhängig von der Gestalt des jeweiligen makroskopischen Behältnisses gewählt, von dem Proben übernommen werden sollen. Die Anordnung der Mikrodispenser ist vorzugsweise an die Gestalt einer Mikrotiterplatte angepaßt. Bei der dargestellten Ausführungsform sind beispielsweise sechzehn Mikrodispenser 1 entsprechend einer Mikrotiterplatte mit sechzehn reihenweise angeordneten Volumina vorgesehen. Die Mikrodispenser 1 sind an einer (nicht dargestellten) Halterungsund Stelleinrichtung angebracht.The microdispensers 1 of the dispenser unit 10 are arranged as a straight row. The number and spacing of the microdispensers are selected depending on the application and the shape of the respective macroscopic container from which samples are to be taken. The arrangement of the microdispensers is preferably adapted to the shape of a microtiter plate. In the embodiment shown, for example sixteen microdispensers 1 are provided corresponding to a microtiter plate with sixteen volumes arranged in rows. The microdispensers 1 are attached to a holding and adjusting device (not shown).
Die Magneteinheit 20 umfaßt eine Vielzahl von Magneteinrichtungen 8, deren Anzahl mindestens gleich der Anzahl der Mikrodispenser 1 ist. Vorzugsweise wird jedoch an den Enden der Reihe der Mikrodispenser 1 jeweils eine zusätzliche Magneteinheit zur Schaffung gleichförmiger Feldverhältnisse in den Mikrodispensern an den Enden der Reihe zu schaffen. Jede Magneteinrichtung 8 besteht aus zwei voneinander beabstandeten Permanentmagneten 81, 82, zwischen denen zur Substanzprozes- sierung jeweils ein Mikrodispenser angeordnet ist.The magnet unit 20 comprises a plurality of magnet devices 8, the number of which is at least equal to the number of microdispensers 1. Preferably, however, at the ends of the Row of microdispensers 1 each to create an additional magnetic unit to create uniform field conditions in the microdispensers at the ends of the row. Each magnet device 8 consists of two spaced apart permanent magnets 81, 82, between each of which a microdispenser is arranged for substance processing.
Die Permanentmagneten 81, 82 sind an den Längsseiten eines die Mikrodispenserreihe umgebenden, sich entsprechend der Dispensereihe länglich erstreckenden Rahmens 21 befestigt. Der Rahmen 21 ist mit der Antriebseinheit 30 in einer Richtung parallel zur Längserstreckung der Mikrodispenser 1 (Auf-/Ab- Bewegung) und in einer zu den Mikrodispensern 1 senkrecht ausgerichteten Bezugsebene (Vor-/Rück-Bewegung) beweglich. Die Längsseiten des Rahmens 21 besitzen einen derartigen Abstand, daß einem Mikrodispenser in einer Position unmittelbar benachbart zu einem der Permanentmagneten 81, 82 die magnetischen Partikel im wesentlichen ausschließlich Feldkräften dieses Permanentmagneten und vernachlässigbar geringen Feldkräften des gegenüberliegenden Permanentmagneten ausgesetzt sind. Außerdem wird der Abstand so gewählt, daß beim Positionswechsel der Mikrodispenser von einem zum gegenüberliegenden Perma- nentmangeten (Vor-/Rück-Bewegung) die Partikel unter der Wirkung der Schwerkraft dem jeweiligen Reservoir nicht so weit hin zum Auslaß absinken können, daß sie den Kraftwirkungsbereich des jeweiligen Permanentmagneten verlassen. Damit wird sichergestellt, daß die Partikel den Auslaß nicht erreichen und dort keine Störungen durch Verstopfen oder dergl. verursachen können.The permanent magnets 81, 82 are fastened to the longitudinal sides of a frame 21 which surrounds the row of microdispensers and which extends in a manner corresponding to the row of dispensers. The frame 21 can be moved with the drive unit 30 in a direction parallel to the longitudinal extent of the microdispensers 1 (up / down movement) and in a reference plane oriented perpendicular to the microdispensers 1 (forward / backward movement). The long sides of the frame 21 are spaced such that a microdispenser in a position immediately adjacent to one of the permanent magnets 81, 82 is exposed essentially exclusively to the field forces of this permanent magnet and negligibly low field forces of the opposite permanent magnet. In addition, the distance is chosen so that when the microdispensers change position from one to the opposite permanent manganese (forward / backward movement), the particles cannot sink so far towards the outlet under the effect of gravity that they affect the force action range of the respective permanent magnet. This ensures that the particles do not reach the outlet and cannot cause any disturbances due to clogging or the like.
Der Abstand der Permanentmagnetreihen entlang der Längsseite des Rahmens 21 ist bei der Kombination mit Mikrodispensern kleiner als 1 cm und beträgt vorzugsweise rd. 6 mm bis 7,5 mm. Die Antriebseinheit 30 umfaßt zwei Servomotoren 31, die überThe distance of the permanent magnet rows along the long side of the frame 21 is less than 1 cm when combined with microdispensers and is preferably approx. 6 mm to 7.5 mm. The drive unit 30 comprises two servomotors 31, which
Schwenkhebel 32 mit den Enden des Rahmens 21 verbunden sind. Durch gleichzeitiges Betätigen der Servomotoren 31 ist der Rahmen 21 mit den Schwenkhebeln 32 von einer ersten Position, in der die Dispenserreihe nahe der einen Permanentmagnetenreihe (Permanentmagnete 81) angeordnet ist, in eine zweite Position verschwenkbar, in der die Dispenserreihe nahe der jeweils anderen Permanentmagnetenreihe (Permanentmagneten 82) angeordnet ist. Vorteilhafterweise werden sämtliche Dispenser und sämtliche Permanentmagneten simultan relativ zueinander bewegt. Die Servomotoren sind vorzugsweise zur Bereitstellung verschiedener Schwenkgeschwindigkeiten eingerichtet. Es sind beispielsweise drei Schwenkgeschwindigkeiten vorgesehen, bei denen jeweils unterschiedliche Partikelgeschwindigkeiten im Reservoir jedes Mikrodispensers erzielt werden. Bei den drei Schwenkgeschwindigkeiten benötigt der Positionswechsel von der ersten zur zweiten Position beispielsweise rd. eine viertel Sekunde, eine halbe Sekunde bzw. eineinhalb Sekunden.Pivot levers 32 are connected to the ends of the frame 21. By simultaneously actuating the servo motors 31, the frame 21 with the swivel levers 32 can be pivoted from a first position in which the dispenser row is arranged near one permanent magnet row (permanent magnets 81) to a second position in which the dispenser row is close to the respective other permanent magnet row ( Permanent magnet 82) is arranged. All dispensers and all permanent magnets are advantageously moved simultaneously relative to one another. The servomotors are preferably set up to provide different swiveling speeds. For example, three swivel speeds are provided, at which different particle speeds are achieved in the reservoir of each microdispenser. With the three swiveling speeds, the change of position from the first to the second position requires, for example, approx. a quarter of a second, a half a second or a second and a half.
Die Antriebseinheit 30 umfaßt ferner zwei Stelleinrichtungen 33, mit denen die Höhenposition der Magneteinrichtungen 8 in Bezug auf die Längsrichtung der Mikrodispenser einstellbar ist. Die Stelleinrichtungen 33 sind vorzugsweise Federaufhängungen mit vorbestimmten Einstellpositionen. Es ist vorzugsweise eine erste Position, in der die Prozessierung in den Mikrodispensern erfolgt, und eine zweite Position vorgesehen, in der die Dispenserenden unterhalb der Ebene des Rahmens 21 hervorragen, um beispielsweise zur Befüllung in ein Gefäß (z.B. in die Volumina einer Mikrotiterplatte) gefahren zu werden. Zur Umstellung von der Prozessierungsposition zur Befüllungsposition werden die Servomotoren 31 mit dem Rahmen 21 zur Freigabe der Dispenserspitzen nach oben gegen Rückholfedern der Stelleinrichtung 33 gedrückt und in der Befüllungsposition verankert. Nach der Befüllung wird die Verankerung freigegeben und die Rückholfedern drücken die Servomotoren 31 mit dem Rah- men 21 zurück in die Prozessierungsposition. Die Antriebseinheit 30 besitzt ferner eine Motoraufhängung 34, deren Betätigung wiederum mit der Halterungs- und Stelleinrichtung der Dispenserreihe synchronisiert ist.The drive unit 30 further comprises two adjusting devices 33, with which the height position of the magnet devices 8 with respect to the longitudinal direction of the microdispensers can be adjusted. The actuating devices 33 are preferably spring suspensions with predetermined setting positions. There is preferably a first position in which the processing takes place in the microdispensers and a second position in which the dispenser ends protrude below the level of the frame 21, for example in order to be filled into a vessel (for example into the volumes of a microtiter plate) to become. To switch from the processing position to the filling position, the servomotors 31 with the frame 21 for releasing the dispenser tips are pressed upwards against return springs of the actuating device 33 and anchored in the filling position. After filling, the anchoring is released and the return springs press the servo motors 31 with the frame. men 21 back to the processing position. The drive unit 30 also has a motor suspension 34, the actuation of which is in turn synchronized with the mounting and actuating device of the row of dispensers.
Bei der Realisierung der oben genannten zweiten Ausführungsform ist die Prozessierungsstation gemäß den Figuren 3 und 4 entsprechend anzupassen. Demnach sind die Trägerballen an einem gemeinsamen Träger reihenweise zu befestigen und mit angepaßten Betätigungselementen in einer Richtung entsprechend der Längsrichtung der Mikrodispenser (Auf-/Ab-Bewegung) zu betätigen .When implementing the second embodiment mentioned above, the processing station according to FIGS. 3 and 4 must be adapted accordingly. Accordingly, the carrier bales are to be fastened in rows to a common carrier and to be actuated with adapted actuating elements in a direction corresponding to the longitudinal direction of the microdispenser (up / down movement).
Die Betätigungselemente besitzen insbesondere für jeden Trägerballen eine Draht- oder Faden-Aufhängung, mit der der Trägerballen vom Auslaß (oder der Düse) des Mikrodispensers bis zu einem oberen Dispenserbereich hochgezogen werden kann. Oberhalb des piezoelektrischen Wandlers kann die Bewegung der Aufhängung magnetisch oder mechanisch erfolgen.The actuating elements in particular have a wire or thread suspension for each carrier bale, with which the carrier bale can be pulled up from the outlet (or the nozzle) of the microdispenser to an upper dispenser area. Above the piezoelectric transducer, the suspension can be moved magnetically or mechanically.
Die erfindungsgemäße Prozessierung geringster Substanzmengen in Mikrodispensern besitzt den Vorteil, daß nur geringe Mengen des Elutionsmittels benötigt werden, um die gebundenen Probensubstanzen in der Dispenserspitze von der festen Phase zu eluieren. Als Elutionsmittel kommen beispielsweise 100 bis 300 nl eines Gemisches aus Acetonitril (80 Vol-%) mit Tri- fluoressigsäure (0.1 Vol-%) zum Einsatz. Die Aufnahme des Elutionsmittels erfolgt durch den Mikrodispenserauslaß (Düse) , indem über eine Versorgungsleitung ein Unterdruck (z.B. rd. 10 mbar) am Mikrodispenser erzeugt wird. Über die Einstellung der Oberflächenkräfte bzw. der Kapillarkräfte wird das Elutionsmittel in den Mikrodispenser eingesogen. Die Implementierung der Erfindung ist nicht auf die oben beschriebenen Ausführungsformen beschränkt. Es sind insbesondere die folgenden Modifikationen möglich. Es ist der Einsatz magnetisch und mechanisch betätigbarer Trägermaterialien simultan möglich. Es ist möglich, anstelle von zwei Permanentmagneten nur einen Permanentmagneten vorzusehen, dessen Position in Bezug auf den jeweiligen Mikrodispenser mit einer Versteileinrichtung so geändert wird, daß die magnetischen Partikel ständig unter Feldeinfluß bleiben. Es können auch mehr als zwei Permanentmagneten pro Dispenser vorgesehen sein. Anstelle der beschriebenen Mikrodispenser oder Mikropipetten können auch andere Dosiereinrichtungen eingesetzt werden. Es können zusätzliche Mittel zur Formung des Magnetfeldes im Bereich der Reservoire der Mikrodispenser vorgesehen sein. Anstelle der Permanentmagneten können Elektromagneten oder Magneten auf der Basis von Mikrosupraleitern eingesetzt werden, falls genügend Platz für deren Positionierung gegeben ist. Die oben beschriebenen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens können wiederholt und modifiziert werden, um bestimmte Prozessierungen zu erzielen. The processing according to the invention of the smallest amounts of substances in microdispensers has the advantage that only small amounts of the eluent are required in order to elute the bound sample substances in the dispenser tip from the solid phase. For example, 100 to 300 nl of a mixture of acetonitrile (80% by volume) with trifluoroacetic acid (0.1% by volume) are used as eluents. The elution agent is taken up through the microdispenser outlet (nozzle) by creating a negative pressure (for example about 10 mbar) on the microdispenser via a supply line. The eluent is sucked into the microdispenser by adjusting the surface forces or the capillary forces. The implementation of the invention is not limited to the embodiments described above. In particular, the following modifications are possible. The use of magnetically and mechanically actuated carrier materials is possible simultaneously. Instead of two permanent magnets, it is possible to provide only one permanent magnet, the position of which in relation to the respective microdispenser is changed with an adjusting device so that the magnetic particles remain constantly under the influence of the field. More than two permanent magnets can also be provided per dispenser. Instead of the microdispensers or micropipettes described, other metering devices can also be used. Additional means for shaping the magnetic field in the area of the reservoirs of the microdispensers can be provided. Instead of permanent magnets, electromagnets or magnets based on micro superconductors can be used if there is enough space for their positioning. The steps of the method according to the invention described above can be repeated and modified in order to achieve certain processings.

Claims

PATENTA SPRUCHE PATENTA SPEECH
1. Verfahren zum Prozessieren von Substanzen im Reservoir (3) einer Mikrodosiereinrichtung (1) , die zur Mikrotropfenabgabe ausgelegt ist, mit den Schritten:1. A method for processing substances in the reservoir (3) of a microdosing device (1), which is designed for microdrop delivery, with the steps:
- Bewegung eines festen Trägermaterials mit einer bindungsaktiven Oberfläche im Reservoir (3), und- Movement of a solid carrier material with a binding active surface in the reservoir (3), and
- Bindung der Substanz auf der Oberfläche des Trägermaterials .- Binding of the substance on the surface of the carrier material.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem zum Sammeln von Substanzen im Reservoir (3) abwechselnd wiederholt eine Aufnahme einer Lösung oder Suspension der Substanz in das Reservoir und eine Bindung der Substanz an das Trägermaterial erfolgt.2. The method according to claim 1, wherein in order to collect substances in the reservoir (3), a solution or suspension of the substance is repeatedly taken up in the reservoir and the substance is bound to the carrier material.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem in das Reservoir (3) der Dosiereinrichtung ein Elutionsmittel aufgenommen wird, mit dem die am Trägermaterial gebundene Substanz abgelöst wird.3. The method according to claim 1 or 2, wherein in the reservoir (3) of the metering device, an eluent is added, with which the substance bound to the carrier material is detached.
4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Trägermaterial magnetische Partikel (7) umfaßt, deren Bewegung unter der Einwirkung eines veränderlichen Magnetfeldes erfolgt .4. The method according to any one of the preceding claims, wherein the carrier material comprises magnetic particles (7), the movement of which takes place under the action of a variable magnetic field.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem das veränderliche Magnetfeld durch die simultane Bewegung von Permanentmagneten5. The method according to claim 4, wherein the variable magnetic field by the simultaneous movement of permanent magnets
(81, 82) in Bezug auf das Reservoir (3) gebildet wird.(81, 82) with respect to the reservoir (3) is formed.
6. Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem das veränderliche Magnetfeld durch Elektromagneten oder Mikrosupraleiter erzeugt wird. 6. The method according to claim 4, wherein the variable magnetic field is generated by electromagnets or micro superconductors.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Trägermaterial einen Trägerballen (9) umfaßt, dessen Bewegung mit einem mechanischen Betätigungselement erfolgt.7. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the carrier material comprises a carrier bale (9), the movement of which takes place with a mechanical actuating element.
8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem als Dosiereinrichtung ein Mikrodispenser (1) oder eine Mikro- pipette verwendet wird.8. The method according to any one of the preceding claims, in which a microdispenser (1) or a micropipette is used as the metering device.
9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche bei dem das Prozessieren der Substanz ein Aufkonzentrieren, Aufreinigen, Präparieren und/oder Synthetisieren umfaßt.9. The method according to any one of the preceding claims, wherein the processing of the substance comprises concentrating, purifying, preparing and / or synthesizing.
10. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Reservoir (3) ein Volumen unterhalb von 500 μl besitzt.10. The method according to claim 1, wherein the reservoir (3) has a volume below 500 ul.
11. Vorrichtung zum Prozessieren von Substanzen, die durch eine Mikrodosierelnrichtung (1) mit einem Reservoir (3) gebildet wird, in dem ein Trägermaterial (7, 9) mit bindungsaktiver Oberfläche beweglich angeordnet ist, wobei eine Antriebsein- richtung zur Halterung und/oder Bewegung des Trägermaterials im Reservoir (3) vorgesehen ist und wobei die Dosiereinrichtung (1) zur Mikrotropfenabgabe ausgelegt ist.11. Device for processing substances, which is formed by a microdosing device (1) with a reservoir (3), in which a carrier material (7, 9) with a binding-active surface is movably arranged, a drive device for holding and / or Movement of the carrier material in the reservoir (3) is provided and the metering device (1) is designed for dispensing microdrops.
12. Vorrichtung gemäß Anspruch 11, bei der die Mikrodosierelnrichtung eine Mikropipette oder ein Mikrodispenser (1) ist.12. The device according to claim 11, wherein the microdosing direction is a micropipette or a microdispenser (1).
13. Vorrichtung gemäß Anspruch 11 oder 12, bei der das Trägermaterial magnetische Partikel (7) umfaßt.13. The apparatus of claim 11 or 12, wherein the carrier material comprises magnetic particles (7).
14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, bei der die Antriebseinrichtung eine Magneteinrichtung (8) umfaßt. 14. The apparatus of claim 13, wherein the drive means comprises a magnetic device (8).
15. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, bei der die Magneteinrichtung (8) mindestens einen Permanentmagneten umfaßt.15. The apparatus according to claim 14, wherein the magnetic device (8) comprises at least one permanent magnet.
16. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, bei der das Trägermaterial einen porösen Trägerballen (9) umfaßt.16. The device according to one of claims 11 or 12, wherein the carrier material comprises a porous carrier bale (9).
17. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 16, bei der eine Vielzahl von Mikrodosiereinrichtungen jeweils mit einem Reservoir und eine Antriebseinrichtung mit einer Vielzahl von Magneteinrichtungen (8) oder Trägerballen (9) vorgesehen sind.17. The device according to any one of claims 11 to 16, in which a plurality of microdosing devices each with a reservoir and a drive device with a plurality of magnetic devices (8) or carrier bales (9) are provided.
18. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, bei der die Vielzahl von Mikrodosiereinrichtungen eine Reihe von piezoelektrischen Mikrodispensern umfaßt.18. The apparatus of claim 17, wherein the plurality of microdosing devices comprises a series of piezoelectric microdispensers.
19. Vorrichtung gemäß Anspruch 11, bei der das Reservoir (3) ein Volumen unterhalb von 500 μl besitzt. 19. The apparatus of claim 11, wherein the reservoir (3) has a volume below 500 ul.
EP99926440A 1998-05-27 1999-05-27 Method and device for processing extremely small substance quantities Ceased EP1082594A2 (en)

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