EP0969885A1 - Procede de stimulation de la regeneration nerveuse - Google Patents

Procede de stimulation de la regeneration nerveuse

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EP0969885A1
EP0969885A1 EP98917224A EP98917224A EP0969885A1 EP 0969885 A1 EP0969885 A1 EP 0969885A1 EP 98917224 A EP98917224 A EP 98917224A EP 98917224 A EP98917224 A EP 98917224A EP 0969885 A1 EP0969885 A1 EP 0969885A1
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EP
European Patent Office
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nerve
sleeve
expression
neurotrophic factor
use according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98917224A
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German (de)
English (en)
Inventor
Pascal Peulve
Frédéric Revah
Marc Tadie
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer SA filed Critical Rhone Poulenc Rorer SA
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61L2430/32—Materials or treatment for tissue regeneration for nerve reconstruction

Definitions

  • the present invention relates to the field of biology, and in particular to medical biology of the nervous system. It relates more particularly to methods of stimulating nerve regeneration, applicable both to the peripheral nerves and to the central system, and in particular the spinal cord. Due to their local and specific character, the methods of the invention can be used to stimulate nerve regeneration in different pathological situations, and in particular in cases of lesions of the spinal cord, peripheral nerves, brachial or lumbar plexus.
  • the present invention provides a solution to this problem of the treatment of nerve, traumatic or degenerative lesions
  • the present invention relates in fact to a method of stimulating nerve regeneration by means of a biocompatible sleeve and of a composition of nucleic acids coding for neurotrophic factors
  • the present invention also relates to a device for stimulating nerve regeneration comprising a biocompatible sleeve into which is introduced a system for expressing a factor for stimulating nerve growth (neurotrophic factor).
  • kits for the stimulation of nerve regeneration comprising on the one hand a biocompatible sleeve and on the other hand a composition comprising a system for expressing a factor for stimulating nerve growth
  • the present invention also relates to the use , for the preparation of a composition intended to stimulate 1st nerve regeneration, of a biocompatible sleeve into which is introduced a system of expression of a neurotrophic factor
  • the present invention is also applicable both to the regeneration of the peripheral nerves and to stimulate axonal regeneration in the spinal cord
  • the present invention follows from several observations It follows in particular from the demonstration that it is possible to surgically restore between two sections of a nerve a physical bridge by means of an appropriate device, and to introduce into this device a expression system of a neurotrophic factor It also stems from the demonstration that it is possible to induce a local concentration of trophic factors, for a time sufficient to stimulate neuronal growth
  • the present invention thus combines several particularly advantageous properties on the therapeutic level It allows first of all a lasting action, thanks to an effect of prolonged release of the trophic factor
  • the biological effect of the neurotrophic factor is further potentiated by the stent effect of the sleeve, which makes it possible to accelerate and guide neuronal growth
  • the method of the invention also allows a very local action and therefore very specific, the trophic factors being partitioned in a sealed device, at the site of the trauma or degeneration
  • the results presented in the examples show
  • the method of the invention more particularly consists in intervening locally at the level of a nerve section.
  • the proximal or distal section of the nerve or sectioned bundle is introduced at one end of a biocompatible sleeve, where it is physically held in place
  • a composition comprising a system for expressing a neurotrophic factor is then introduced into said machon
  • the second section of the nerve or sectioned bundle is then introduced at the other end of the sleeve, where it is also held in place physically
  • the latter is advantageously ligated and / or maintained by a biological glue at the ends
  • This device can also allow new injections of expression systems
  • the presence of both the support and the factor neurotrophic in high concentration and for a prolonged period makes it possible, as illustrated in the examples, to reconstitute a nervous continuity and thus, to restore the corresponding activity
  • the method of the invention consists in taking a peripheral nerve or a root underlying the lesion and in putting in place a biocompatible sleeve after resection of a part of the nerve or of the root La proximal part of the section, whether motor or sensitive, is introduced into the sleeve and held in place, for example by suturing or by applying biological glue
  • the expression system coding for the active factor is injected into this sleeve, which is left in place
  • the distal part of the section is then reconnected at the other end of the sleeve allowing the restoration of an axonal continuity (Figure 1)
  • the method of the invention is also particularly suitable for bridging lesions of the spinal cord.
  • This type of trauma constitutes, moreover, one of the main applications of the system of the invention.
  • Two types of application can be envisaged, either bypassing the peripheral afferents underlying a lesion to the healthy spinal cord overlying this lesion (Fig 5), or bridging of the healthy marrow overlying a lesion, to the marrow underlying this lesion (Fig 6)
  • a medullary lesion Fig 5A
  • the tutor can then receive expression systems carrying genes capable of stimulating the axonal elongation of the motor neurons, and / or possibly various factors known to stimulate axonal regrowth such as a peripheral nervous graft or cells
  • the tutor is then introduced into a longitudinal incision made in the healthy marrow overlying the lesion so that the proximal end of the tube is flush with the anterior horn of gray sustance (location of spinal motor neurons)
  • the stake is fixed by one or several arachnoid sutures and biological glue (F ⁇ g.5B)
  • Such an assembly can thus restore functionality to certain vital muscles
  • the injured part of the cord is excised and a stake is implanted upstream and downstream so as to join the main bundles (pyramidal, corticospinal, etc.) between the sus- and sub-lesional parts ( Figure 6)
  • the stake is then filled with the same substances as before
  • proximal part of the section, or proximal part of the nerve means the part of the nerve which is in contact with the central nervous system. As it is a peripheral nerve, its proximal part is that connected to the spinal cord As a lesion of the spinal cord, the proximal part is that which is in contact with the central nervous system
  • distal part of the section is also understood to mean the peripheral part of the nerve. As it is a peripheral nerve, its distal part is therefore that connected to the motor plate (j ° nc neuromuscular tion). a lesion of the spinal cord, the distal part is that which is disconnected from the central nervous system
  • the sleeve can consist of any device compatible with a therapeutic use.
  • the structure and the composition of the sleeve are advantageously defined so that (i) it restores an axonal continuity, (M) it can contain a composition comprising an expression system for active factors, (ni) it can serve as a tutor for axonal regrowth, both from the spinal cord to the periphery, from the periphery to the spinal cord, as well as the spinal cord towards the spinal cord
  • the guardian property of the sleeve is exercised by the faculty of the nerves to adhere and to push on it, in particular on its internal face Adhesion can result from any form of biological interaction and / or chemical and / or physical causing adhesion and / or fixing of the cells on the sleeve
  • the sleeve be of the waterproof or semi-permeable type, but not allowing the passage of the expression system
  • the sleeve is a solid, non-toxic and biocompatible support. It may in particular be a sleeve made of synthetic material (s), such as silicone, PAN / PVC, PVFD, polytetrafluoroethylene fibers (PTFE). ) or acrylic copolymers
  • s synthetic material
  • PTFE polytetrafluoroethylene fibers
  • acrylic copolymers it is preferable to use a sleeve made up or based on biomaterials, such as in particular crosslinked collagen, bone powder, polymers based on carbohydrates, polyglycohic / polylactic acid derivatives, hyaluronic acid esters, or limestone-based supports
  • collagen or silicone II can be used.
  • a sleeve consisting of a bilayer of collagen type I or III or IV, advantageously IV / IVox, or of silicone. Mention may be made, as a specific example a Silastic (Dow-Coming) sleeve, made of silicone.
  • the sleeve advantageously has a tubular shape, of cylindrical or angular section. The diameter of the sleeve can be adapted by a person skilled in the art according to the desired applications.
  • a relatively small diameter can be used, from 0.05 to 15 mm More preferably, the internal diameter of the sleeve is between 0.5 and 10 mm
  • the sleeves used have an internal diameter of up to 15 to 20 mm, depending on the nerve section concerned
  • the diameter of the sleeve advantageously corresponds the diameter of the root
  • the length of the sleeve is generally determined by the size of the loss of substance to be compensated Sleeve lengths between 0.5 and 5 cm can be used Preferably, the length of the sleeve remains less than 5 cm, substance losses greater than 5 cm being less frequent
  • the method of the invention consists, firstly, in introducing a first part of the nerve into the sleeve. It is advantageously the proximal part of the nerve. This is then held in place to ensure ( i) good nerve growth and (n) tightness of the device To do this, it is possible to make a suture between the nerve and the sleeve and / or to apply a biological glue
  • the suture can be carried out according to conventional methods of surgery, using appropriate thread
  • the biological glue can be any biocompatible glue, applicable to the nervous system II can be in particular any biological glue used in human surgery, and in particular an adhesive consisting of fibrin Biocolle (Biotransfusion, CRTS, Lille ), Tissucol (Immuno AG, Vienna, Austria), etc.
  • the method of the invention comprises, as indicated above, the introduction into the sleeve of a composition comprising a system for the expression of neurotrophic factors
  • the term “expression system” designates any construct allowing the expression in vivo of a nucleic acid coding for a neurotrophic factor.
  • the expression system comprises a nucleic acid coding for a neurotrophic factor. under the control of a transc ⁇ ptionnel promoter (expression cassette)
  • This acid nucleic acid can be DNA or RNA
  • cDNA, gDNA or hybrid DNA can be used, i.e. DNA containing one or more introns of gDNA, but not all DNA can also be synthetic or semi-synthetic, and in particular DNA artificially synthesized to optimize codons or create reduced forms
  • the transc ⁇ ptionnel promoter can be any promoter functional in a mammalian cell, preferably human, and in particular nervous II It can be the promoter region naturally responsible for the expression of the neurotrophic factor considered when this one is likely to function in the cell or the organism concerned II may also be regions of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic) In particular, they may be promoter regions of eukaryotic or viral genes For example, they may be promoter regions derived from the genome of the target cell.
  • any promoter or derived sequence may be used which stimulates or represses the transcription of a gene in a specific or non-specific, inducible or not, strong or weak They may in particular be ubiquitous promoters (promoter of the HPRT, PGK, ⁇ -actin, tubu ne genes, etc.), promoters of the f intermediate ilaments (promoter of the GFAP genes, desmin, vimentin, neurofilaments, keratin, etc.), of promoters of therapeutic genes (for example the promoter of the MDR, CFTR, Factor VIII, ApoAl genes, etc.) or of promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor, retinoic acid receptor, etc.) Likewise, they may be promoter sequences originating from the genome of a virus such as, for example, the promoters of the E1A and MLP genes of adenovirus, the promoter CMV, or the RSV LTR promote
  • a constitutive eukaryotic or viral promoter is used. It is more particularly a promoter chosen from the promoter of the HPRT, PGK, ⁇ -actin, tubulin genes or the promoter of the E1A and MLP d genes. adenovirus, the early CMV promoter, or the RSV LTR promoter
  • the expression cassette advantageously comprises a signal sequence directing the product synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of the product synthesized, but it may also be any other sequence. functional signal, or an artificial signal sequence
  • the expression cassette generally comprises a region located at 3 ′, which specifies a transcriptional end signal and a polyadenylation site.
  • the trophic factors which can be used in the context of the invention are essentially classified in the family of neurotrophins, the family of neurokines, the family of TGF beta, the family of fibroblast growth factors (FGFs) and growth factors of insulin type. (IGFs) (review 16)
  • BDNF BDNF, NT-3 or NT-4/5
  • the neurotrophic factor derived from the brain (BDNF), described by Thoenen (17), is a protein of 118 amino acids and molecular weight 13.5 kD
  • BDNF neurotrophic factor derived from the brain
  • the DNA sequence coding for human BDNF and for rat BDNF has been cloned and sequenced (19) as well as in particular the sequence coding for pork BDNF (20)
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) produced in the context of the present invention may be human BDNF. or an animal BDNF
  • Neurotrophin 3 is a secreted protein of 119 aa which allows in vitro survival of neurons even at very low concentrations (21)
  • the sequence of cDNA coding for human NT3 has been described (22)
  • the TGF-B family includes in particular the neurotrophic factor derived from Glial cells
  • the neurotrophic factor derived from Glial cells, GDNF (23) is a protein of 134 amino acids and molecular weight of 16 kD II has the essential capacity to promote in vitro the survival of dopaminergic neurons and motoneurons (16)
  • the neurotrophic factor derived from Glial cells (GDNF) produced in the context of the present invention can be human GDNF or animal GDNF
  • the cDNA sequences coding for human GDNF and the Rat GDNFs have been cloned and sequenced (23)
  • CNTF Ceral NeuroTrophic Factor
  • CNTF is a neurokine capable of preventing the death of neurons
  • CNTF is a neurokine capable of preventing the death of neurons
  • the invention now allows prolonged and continuous in vivo production of CNTF, alone or in combination with other trophic factors.
  • the cDNA and the human and mu ⁇ n CNTF gene have been cloned and sequenced (EP385,060 WO91 / 04316
  • IGF-1 Lewis et al, 1993
  • FGFa Fibroblast Growth Factors
  • IGF-1 and FGFa are very interesting candidates
  • the sequence of the FGFa gene has been described in the literature, as well as vectors allowing its expression
  • the expression system of the invention therefore allows the production in vivo of a neurotrophic factor chosen from neurotrophins, neurokines and TGF II is more preferably a factor chosen from BDNF, GDNF, CNTF, NT3, FGFa and IGF-l Of particular interest is the production of NT3
  • the expression system comprises either two expression cassettes, either a single cassette allowing the simultaneous expression of two nucleic acids (bicistronic unit)
  • the system comprises two expression cassettes, these can use identical or different promoters
  • the expression cassette (s) advantageously form part of a vector II can in particular be a viral or plasmid vector
  • the cassettes can be carried by separate vectors, or by the same vector
  • the vector used can be a standard plasmid vector, comprising, in addition to the expression cassette (s) according to the invention, an origin of replication and a marker gene.
  • Various types of improved vectors have also been described, devoid of marker gene. and of origin of replication (WO96 / 26270) or having for example an origin of conditional repation (PCT / FR96 / 01414)
  • the vector used can also be a viral vector.
  • Various vectors have been constructed from viruses, having gene transfer properties. Remarkable Mention may more particularly be made of adenoviruses, retroviruses, AAVs and the herpes virus.
  • the genome of these viruses is modified so as to render them incapable of autonomous rephcation in a cell. These viruses are said to be defective for rephcation Generally, the genome is modified by substitution of essential regions in trans for viral rephcation by the expression cassette (s)
  • Adenoviruses are viruses with linear double strand DNA with a size of approximately 36 (kilobases) kb
  • Their genome comprises in particular a repeated reverse sequence (ITR) to at each end, an encapsidation sequence (Psi), early genes and late genes
  • ITR repeated reverse sequence
  • Psi encapsidation sequence
  • the main early genes are contained in the regions E1, E2, E3 and E4 Among these, the genes contained in the region E1 in particular are necessary to viral propagation
  • the main late genes are contained in regions L1 to L5
  • the genome of the adenovirus Ad5 has been fully sequenced and is accessible on database (see in particular Genebank M73260) Likewise parts, even all of other adenoviral genomes (Ad2, Ad7, Ad12, etc.) have also been sequenced
  • constructs derived from adenoviruses have been prepared, incorporating various therapeutic genes. More particularly, the constructs described in the prior art are adenoviruses deleted from the E1 region, essential for viral rephcation at the level from which heterologous DNA sequences are inserted (Levrero et al, Gene 101 (1991) 195 Gosh-Choudhury et al Gene 50 (1986) 161) Furthermore, to improve the properties of the vector, it has been proposed to create other deletions or modifications in the genome of the adenovirus Thus, a heat-sensitive point mutation was introduced in the mutant ts125, making it possible to inactivate the DNA binding protein 72kDa (DBP) (13)
  • Other vectors include a deletion of another region essential for rephcation and / or viral propagation, the E4 region The E4 region is indeed involved in the regulation of the expression of late genes, in the stability of late nuclear RNAs, in the extinction of the expression of proteins of the host cell
  • recombinant adenoviruses described in the literature are produced from different serotypes of adenovirus II indeed exist different serotypes of adenovirus, whose structure and properties vary somewhat, but which have a comparable genetic organization More particularly, recombinant adenoviruses may be of human or animal origin Concerning adenoviruses of human origin, mention may preferably be made of those classified in group C, in particular adenoviruses of type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) or 12 ( Ad12) Among the various adenoviruses of animal origin, mention may preferably be made of adenoviruses of canine origin, and in particular all the strains of adenoviruses CAV2 [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example] Other adenoviruses of animal origin are cited in particular in application W094 / 26914 incorporated herein by reference
  • the recombinant adenovirus is a human adenovirus of group C More preferably it is an adenovirus Ad2 or Ad5 Recombinant adenoviruses are produced in an packaging line, that is to say a cell line capable of complementing in trans one or more of the deficient functions in the recombinant adenoviral genome
  • an packaging line that is to say a cell line capable of complementing in trans one or more of the deficient functions in the recombinant adenoviral genome
  • line 293 is a human embryonic kidney cell line containing the left end (approximately 11-12%) of the genome of adenovirus serotype 5 ( Ad5), comprising the left ITR, the packaging region, the E1 region, including E1a and E1b, the region coding for the protein pIX and part of the region coding for the protein plVa2
  • This line is capable of trans-complementing recombinant adenoviruses defective for the
  • Recombinant adenoviruses are usually produced by introduction of viral DNA into the packaging line, followed by lysis of the cells after approximately 2 or 3 days (the kinetics of the adenoviral cycle being of 24 at 36 hours) After the lysis of the cells, the recombinant viral particles are isolated by ce ⁇ t ⁇ fugation in cesium chloride gradient.
  • the expression cassette for the therapeutic gene (s) can be inserted at different sites in the genome of the recombinant adenovirus, according to the techniques described in the prior art. It can first of all be inserted at the E1 deletion. It can also be inserted at the level of the E3 region, in addition to or in substitution for sequences It can also be localized at the level of the deleted E4 region For the construction of vectors carrying two expression cassettes, one can be inserted at the level of the region E1, the other at the level of region E3 or E4 The two cassettes can also be introduced at the level of the same region
  • the composition comprising the expression system can be formulated in different ways. It can in particular be saline solutions (monosodium phosphate, disodium, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc, or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as the case may be of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes
  • saline solutions monosodium phosphate, disodium, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc, or mixtures of such salts
  • sterile, isotonic, or dry compositions in particular lyophilized, which, by addition as the case may be of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes
  • Other excipients may be used such as, for example, stabilizing proteins (human serum albumin, in particular FR96 03074), poloxamer or else a hydrogel
  • This hydrogel can be prepared from any
  • polymers polylysine type cationics polymers polylysine type cationics, (LKLK) n, (LKKL) n as described in application W095 / 21931, immine polyethylene (WO96 / 02655) and DEAE dextran or also cationic lipids or lipofectants They have the property of condensing DNA and promote its association with the cell membrane
  • mention may be made of hpopolyamines hpofectamine, transfectam, as described in application W095 / 18863 or W096 / 17823) different cationic or neutral lipids (DOTMA, DOGS, DOPE, etc.) as well as peptides of nuclear origin (WO96 / 25508), optionally functional to target certain tissues
  • hpopolyamines hpofectamine, transfectam, as described in application W095 / 18863 or W096 / 17823
  • DOTMA, DOGS, DOPE, etc. different cationic or neutral
  • the expression system used in the invention consists of a defective recombinant adenovirus encoding a neurotrophic factor. More particularly, the neurotrophic factor is NT3.
  • the adenoviruses are advantageously formulated and administered in the form of doses between 10 ⁇ and 10 ⁇ 4 pfu, and preferably 10 ⁇ to 10 " ⁇ pfu
  • the term pfu (“ plaque forming unit ”) corresponds to the infectious power of an adenovirus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measurement, generally after 15 days, of the number of plaques of infected cells.
  • the introduction of the expression system into the sleeve can be carried out in different ways, and in particular by means of syringes Injection by means of microsyringes is preferred (Hamilton or Terumo microsyringe)
  • One of the particularly interesting applications of the present invention is the stimulation of the regrowth of peripheral nerves.
  • This treatment can be applied in different pathological situations, in particular trauma or nerve degeneration II can be applied to any nerve accessible surgically, and in particular to the radial, ulnar, median, colateral nerves of the fingers and interosseous nerves, for the upper limbs, and sciatic nerves (diameter of about 1 cm at birth) or crural nerves (diameter 6-7 mm), for the lower limbs
  • the sleeves used preferably have an internal diameter of up to 15 to 20 mm
  • the diameter of the sleeve corresponds to the diameter of the root
  • the present invention therefore also relates to a product for the local and prolonged release of a neurotrophic substance at the level of a nerve lesion composed of a biocompatible sleeve making it possible to join the sus- and sub-lesional parts, into which is introduced a neurotrophic factor expression system
  • the present invention can be used to stimulate nerve regeneration in vivo in both animals and humans. It can also be used in animals to study the properties of a new trophic factor (new protein, mutant , etc.) For this, an animal is subjected to a nervous section, then a system for expressing the factor to be tested is introduced into a device according to the invention. The capacity of said factor to restore nervous continuity is determined as indicated in the examples This device also makes it possible to compare different factors, or to study synergistic associations of different factors
  • Figure 2 Micrograph taken at the sacro-lumbar portion of the spinal cord and showing a high production of ⁇ -galactosidase (revealed by the X-Gal substrate) within the spinal motor neurons
  • FIG. 3 Macroscopic appearance of tissue regrowth at D12
  • A Example observed in a control animal No tissue continuity is observed between the proximal and distal ends of the nerve repair
  • B Appearance of the content of the tutor in an animal having received injection of 10 7 pfu Ad-NT3 It is possible to note the presence of a tissue cable joining the proximal and distal ends of the nerve repair
  • Figure 7 Description of the motor response observed as a function of time after the intervention on the nerve and the installation of the device according to the invention 1.
  • the viral vectors and in particular the adenoviruses, constitute a particularly preferred embodiment of the invention
  • the recombinant adenoviruses used were obtained by homologous recombination according to the techniques described in the prior art. In short, they are constructed in 293 cells, by recombination between a fragment of linearized viral genome (dl324) and a plasmid containing the left ITR. , the packaging sequences, the transgene and its promoter and viral sequences allowing recombination Viruses are amplified on 293 cells II are regularly repurified in P3 in our laboratory Viral genomes can also be prepared in a prokaryotic cell according to the technique described in application WO96 / 25506 The following viruses are more particularly used
  • Ad- ⁇ Gal Defective recombinant adenovirus derived from an Ad5 serotype comprising (i) a deletion of the E1 region at the level of which is introduced an expression cassette comprising a nucleic acid coding for the ⁇ -galactosidase of E co under control of promoter of the RUS sarcoma virus LTR (designated LTR-RSV or RSV), and (n) a deletion of the E3 region
  • LTR-RSV designated RUS sarcoma virus LTR
  • An alternative construction includes an additional deletion in the E4 region, as described in application W096 / 22378 - Ad-CNTF Recombinant adenovirus of serotype Ad5 comprising, inserted into its genome in place of the deleted E1 region, a CNTF expression cassette composed of the cDNA coding for CNTF under the control of a transcptional promoter (in particular the LTR of the RSV)
  • WO94 / 08026 An alternative construction comprises an additional deletion in the E4 region, as described in application W096 / 22378
  • An alternative construction comprises an additional deletion in the E4 region, as described in application W096 / 22378 - Ad-BDNF Recombinant adenovirus of serotype Ad5 comprising, inserted in its genome in place of the deleted E1 region, a BDNF expression cassette composed of the cDNA coding for BDNF under the control of a transcriptional promoter (in particular the RSV LTR) The details of the construction are given in the WO95 / 25804)
  • An alternative construction comprises an additional deletion in the E4 region, as described in application WO96 / 22378
  • Ad-FGFa Recombinant adenovirus of serotype Ad5 comprising, inserted into its genome in place of the deleted E1 region, an FGFa expression cassette composed of the cDNA coding for FGFa under the control of a transcriptional promoter (in particular the LTR of RSV)
  • a transcriptional promoter in particular the LTR of RSV
  • the functionality of the constructed viruses is verified by infection of fibroblasts in culture
  • the presence of the corresponding neurotrophic factor is analyzed in the culture supernatant by ELISA and / or by highlighting the trophic properties of this supernatant on primary neuronal cultures
  • the animals consisted of male Sprague-Dawley rats weighing 320- 340 g (Iffa Credo - Les Oncins - France) Under general anesthesia (intra-peroneal injection of Pentobarbital 1 ml / kg - Sa ⁇ ofi Animal Health) posterior right is incised at the level of the thigh, and the muscular planes are separated in order to expose the right sciatic nerve The nerve is divided halfway between the pophthal fossa and the separation of the sciatic nerve, and a segment of 5 mm is oté (Fig 1 B) A tubular silicone prosthesis (14 mm long, 1 47 mm internal diameter, wall thickness 0 23 mm - Silastic, Dow Corning Corporation, USA) is presented The proximal end of the nerve is introduced in the tube and is held in place using a 9/0 nylon suture connecting the epineuria and the nerve A second suture between the tube and the nerve at the distal level is put in place so as to obtain a loss 10 mm
  • ⁇ -Galactosidase activity was visualized using the X-GalC substrate 4 ) Briefly, longitudinal sections of the sacro-lumbar cord 100 ⁇ m thick are incubated for 18 h at 37 ° C in PBS containing potassium hexacyanoferrate (4 mM), potassium fer ⁇ cyanide (4 mM), X-Gal substrate (0 4 mg / ml), and magnesium chloride (4 mM) After incubation, the tissue sections are rinsed in PBS, then mounted in an aqueous medium (Gelatin-Glycerol)
  • a lesion was practiced at the level of the sciatic nerve in the adult rat in order to create a loss of substance of at least 10 mm.
  • the proximal and distal parts of the lesion were joined by means of a device according to the invention (tube in silicone 14 mm in length, 1 47 mm in internal diameter - Silastic) into which was introduced either a saline solution, or AV-RSV ⁇ gal (10 7 pfu in 10 ⁇ l), or AV-RSVNT 3 (10 7 pfu in 10 ⁇ l), or the protein NT3
  • the functional recovery was measured by electromyography the motor response in the gastrocnemius muscle was recorded every two weeks (Fig 7)
  • a functional recovery was observed in the group treated with the AV-RSVNT 3 compared to the other groups This increase was statistically significant by comparison over time with the AV-RSV ⁇ gal group beyond day 112, and from day 70 to day 112 with the rNT3 group
  • An electromyographic analysis of the individual profiles shows that the treatment

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Abstract

La présente invention concerne des méthodes de stimulation de la régénération nerveuse, applicables aussi bien sur les nerfs périphériques que dans le système central, et en particulier la moelle épinière. L'invention fait appel en particulier à un système de manchon biocompatible dans lequel est introduit un système d'expression d'un facteur neurotrophique.

Description

PROCEDE DE STIMULATION DE LA REGENERATION NERVEUSE
La présente invention concerne le domaine de la biologie, et en particulier de la biologie médicale du système nerveux. Elle concerne plus particulièrement des méthodes de stimulation de la régénération nerveuse, applicables aussi bien sur les nerfs périphériques que dans le système central, et en particulier la moelle épinière. De part leur caractère local et spécifique, les méthodes de l'invention peuvent être utilisées pour stimuler la régénération nerveuse dans différentes situations pathologiques, et en particulier dans des cas de lésions de la moelle épinière, de nerfs périphériques, du plexus brachial ou lombaire.
Les lésions du système nerveux aussi bien central (SNC) que périphérique (SNP) sont fréquentes en traumatologie et dramatiques. Ainsi, les lésions médullaires, qu'elles soient d'origine traumatique ou dégénérative, les lésions de nerfs périphériques, les lésions de plexus brachial ou lombaire, laissent à ce jour les blessés ou malades lourdement handicapés à vie. Bien que le SNP possède une forte capacité à régénérer spontanément, l'utilisation de techniques classiques de réparation des nerfs ne donne que des résultats décevants. Ces techniques sont principalement composées par l'anastomose directe ou la pose d'un greffon nerveux autoiogue ou hétérologue lorsque les tensions sont trop importantes pour permettre la suture des deux extrémités nerveuses (en cas de perte de substance, ou de lacération excessive du nerf demandant la résection d'un segment nerveux). Avec ces techniques, moins de 5% des patients ayant reçu une réparation du nerf médian au niveau du poignet retrouvent une sensation ou une motricité normale après 5 ans (1 ).
Plus récemment, l'utilisation de prothèses tubulaires joignant les extrémités d'un nerf lésé (technique de manchonnage) a offert une alternative à ces techniques classiques de réparation des nerfs (2,3). Cette technique offre l'avantage de simplifier les conditions de réalignement des faisceaux nerveux, et a permis de ponter avec succès, à la fois expérimentalement mais aussi cliniquement, des petites pertes de substance (jusqu'à 5-7 mm (1 - 6)) Cependant, il apparaît que pour ponter des pertes de substance d'une taille supérieure l'adjonction de substances neurotrophiques ou de cellules à l'intérieur des tubes est indispensable Expérimentalement, plusieurs facteurs tels les FGF-1 et -2, ou le NGF en application in vivo dans le tuteur (7-10), ou encore le CNTF ou NGF II en application systémique ont été testés, sans pour autant démontrer clairement leur rôle sur la régénération nerveuse (7- 12) Par ailleurs, il n'existe actuellement aucun traitement clinique des lésions de la moelle épinière
La présente invention apporte une solution à ce problème du traitement des lésions nerveuses, traumatiques ou degénératives La présente invention concerne en effet un méthode de stimulation de la régénération nerveuse au moyen d'un manchon biocompatible et d'une composition d'acides nucléique codant pour des facteurs neurotrophiques La présente invention concerne également un dispositif pour stimuler la régénération nerveuse comprenant un manchon biocompatible dans lequel est introduit un système d'expression d'un facteur de stimulation de la croissance nerveuse (facteur neurotrophique) Un autre aspect de l'invention est relatif à un kit pour la stimulation de la régénération nerveuse comprenant d'une part un manchon biocompatible et d'autre part une composition comprenant un système d'expression d'un facteur de stimulation de la croissance nerveuse La présente invention concerne également l'utilisation, pour la préparation d'une composition destinée à stimuler la régérénation nerveuse, d'un manchon biocompatible dans lequel est introduit un système d'expression d'un facteur neurotrophique
La présente invention est en outre applicable aussi bien à la régérénation des nerfs périphériques que pour stimuler la régérénation axonale dans la moelle épinière La présente invention découle de plusieurs observations Elle découle en particulier de la mise en évidence qu'il est possible de rétablir chirurgicalement entre deux sections d'un nerf un pont physique au moyen d'un dispositif approprié, et d'introduire dans ce dispositif un système d'expression d'un facteur neurotrophique Elle découle également de la mise en évidence qu'il est possible d'induire une concentration locale de facteurs trophiques, pendant une durée suffisante pour stimuler la croissance neuronale La présente invention combine ainsi plusieurs propriétés particulièrement avantageuses sur le plan thérapeutique Elle permet tout d'abord un action durable, grâce à un effet de libération prolongé du facteur trophique L'effet biologique du facteur neurotrophique est de plus potentialisé par l'effet tuteur du manchon, qui permet d'accélérer et de guider la croissance neuronale La méthode de l'invention permet également une action très locale et donc très spécifique, les facteurs trophiques étant cloisonés dans un dispositif étanche, sur le site du traumatisme ou de la dégénérescence Les résultats présentés dans les exemples montrent à cet effet que la méthode de l'invention permet une réparation de nerfs rapide, efficace et locale
La méthode de l'invention consiste plus particulièrement à intervenir localement au niveau d'une section nerveuse La section proximale ou distale du nerf ou faisceau sectionné est introduite à une extrémité d'un manchon biocompatible, où elle est maintenue physiquement en place Un composition comprenant un système d'expression d'un facteur neurotrophique est ensuite introduite dans ledit machon La deuxième section du nerf ou faisceau sectionné est alors introduite à l'autre extrémité du manchon, où elle est également maintenue en place physiquement Pour éviter une diffusion du système d'expression hors du manchon, celui-ci est avantageusement ligaturé et/ou maintenu par une colle biologique au niveau des extrémités Ce dispositif peut en outre permettre de nouvelles injections de systèmes d'expression La présence à la fois du support et du facteur neurotrophique en concentration élevée et pour une durée prolongée permet, comme illustré dans les exemples, de reconstituer une continuité nerveuse et ainsi, de restituer l'activité correspondante
De manière plus spécifique au système nerveux périphérique, la méthode de l'invention consiste à prendre un nerf périphérique ou une racine sous jacente à la lésion et à mettre en place un manchon biocompatible après résection d'une partie du nerf ou de la racine La partie proximale de la section, qu'elle soit motrice ou sensitive, est introduite dans le manchon et maintenue en place, par exemple par suture ou par pose de colle biologique Le système d'expression codant pour le facteur actif est injecté dans ce manchon, qui est laissé en place La partie distale de la section est alors rebranchée à l'autre extrémité du manchon permettant la restitution d'une continuité axonale (Figure 1 )
Au niveau du système nerveux central, et en particulier médullaire, la méthode de l'invention est également particulièrement adaptée pour ponter les lésions de la moelle épinière Ce type de traumatisme constitue d'ailleurs l'une des applications principales du système de l'invention, et pour lesquelles aucun traitement clinique n'existe à ce jour Deux types d'applications peuvent être envisagés soit le pontage des afférences périphériques sous-jacentes à une lésion à la moelle saine sus-jacente à cette lésion (Fig 5), soit le pontage de la moelle saine sus-jacente à une lésion, à la moelle sous jacente à cette lésion (Fig 6)
Dans le premier cas, une ou plusieurs racines sous-jacentes à une lésion médullaire (Fig 5A) sont sectionnées introduites dans une prothèse tubulaire (manchon) et maintenues en place à l'aide de sutures et de colle biologique Le tuteur peut alors recevoir des systèmes d'expression portant des gènes suceptibles de stimuler I'élongation axonale des motoneurones, et/ou éventuellement différents facteurs connus pour stimuler la repousse axonale tel un greffon nerveux périphérique ou des cellules Le tuteur est alors introduit dans une incision longitudinale réalisée dans la moelle saine sus- jacente à la lésion de manière à ce que l'extrémité proximale du tube affleure la corne antérieure de la sustance grise (lieu de localisation des motoneurones spinaux) Le tuteur est fixé par une ou plusieurs sutures à l'arachnoïde et de la colle biologique (Fιg.5B) Un tel montage peut ainsi redonner une fonctionnalité à certains muscles vitaux
Dans le second cas la partie lésée de la moelle est excisée et un tuteur est implanté en amont et en aval de manière à joindre les principaux faisceaux (pyramidal, corticospinal etc ) entre les parties sus- et sous-lésionelles (Figure 6) Le tuteur est ensuite empli des mêmes substances que précédemment
Dans le cadre de l'invention, on entend par partie proximale de la section, ou partie proximale du nerf, la partie du nerf qui est en contact avec le système nerveux central S'agissant d'un nerf périphérique, sa partie proximale est celle connectée à la moelle épinière S'agissant d'une lésion de la moelle épinière, la partie proximale est celle qui est en contact avec le système nerveux central
On entend également par partie distale de la section, ou partie distale du nerf, la partie périphérique du nerf S'agissant d'un nerf périphérique sa partie distale est donc celle connectée à la plaque motrice (j°nctιon neuromusculaire) S'agissant d'une lésion de la moelle épinière, la partie distale est celle qui se trouve déconnectée du système nerveux central
Pour la mise en oeuvre de l'invention, le manchon peut être constitué de tout dispositif compatible avec une utilisation thérapeutique La structure et la composition du manchon sont avantageusement définies de sorte que (i) il restitue une continuité axonale, (M) il puisse contenir une composition comprenant un système d'expression de facteurs actifs, (ni) il puisse servir de tuteur à la repousse axonale, aussi bien de la moelle épinière vers la périphérie, de la périphérie vers la moelle épinière, que de la moelle épinière vers la moelle épinière La propriété de tuteur du manchon s'exerce par la faculté des nerfs d'adhérer et de pousser sur celui-ci, en particulier sur sa face interne L'adhérence peut résulter de toute forme d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique entraînant l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le manchon Par ailleurs, pour des applications en thérapie humaine, il est également souhaitable que le manchon soit de type imperméable ou semi-perméable, mais ne permettant pas la passage du système d'expression
Avantageusement, le manchon est un support solide, non toxique et biocompatible II peut s'agir en particulier d'un manchon constitué matérιau(x) synthétιque(s), tels que silicone, PAN/PVC, PVFD, des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou encore des copolymères acryliques Dans un mode particulier de mise en oeuvre de l'invention, on préfère utiliser un manchon constitué ou à base de biomatériaux, tel que notamment le collagène réticulé, la poudre d'os, les polymères à base d'hydrates de carbone, les dérivés d'acide polyglycohque/polylactique, les esters d'acide hyaluronique, ou les supports à base de calcaire De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène ou du silicone II peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou muπne Plus préférentiel lement, on utilise un manchon constitué d'une bicouche de collagène de type I ou III ou IV, avantageusement IV/IVox, ou de silicone On peut citer à titre d'exemple précis un manchon Silastic (Dow-Coming), constitué de silicone Par ailleurs, le manchon possède avantageusement une forme tubulaire, de section cylindrique ou angulaire Le diamètre du manchon peut être adapté par l'homme du métier en fonction des applications recherchées En particulier, s'agissant de stimuler la régénération d'un nerf périphérique, un diamètre relativement petit peut être utilisé, de 0,05 à 15 mm Plus préférentiellement, le diamètre intérieur du manchon est compris entre 0,5 et 10 mm Pour des application de régénération de la moelle épinière des manchons de diamètre intérieur plus important peuvent être choisis En particulier, pour ces applications, les manchons utilisés ont un diamètre interne pouvant atteindre 15 à 20 mm, selon la section nerveuse concernée Pour le pontage d'une racine avulsée au niveau du plexus brachial, le diamètre du manchon correspond avantageusement au diamètre de la racine La longueur du manchon est généralement déterminée par la taille de la perte de substance à compenser Des manchons d'une longueur comprise entre 0,5 et 5 cm peuvent être utilisés De manière préférentielle, la longueur du manchon reste inférieure à 5 cm, des pertes de substance supérieures à 5 cm étant moins fréquentes
Comme indiqué ci-avant, la méthode de l'invention consiste, dans un premier temps, à introduire une première partie du nerf dans le manchon II s'agit avantageusement de la partie proximale du nerf Celle ci est ensuite maintenue en place pour assurer (i) une bonne pousse nerveuse et (n) une étanchéité du dispositif Pour ce faire, il est possible d'effectuer une suture entre le nerf et le manchon et/ou de poser une colle biologique La suture peut être réalisée selon les méthodes classiques de chirurgie, en utilisant du fil approprié La colle biologique peut être toute colle biocompatible, applicable au système nerveux II peut s'agir notamment de toute colle biologique utilisée en chirurgie humaine, et en particulier une colle constituée de fibrine Biocolle (Biotransfusion, CRTS, Lille), Tissucol (Immuno AG, Vienne, Autriche), etc
Le procédé de l'invention comprend, comme indiqué ci-avant, l'introduction, dans le manchon d'une composition comprenant un système d'expression de facteurs neurotrophiques
Au sens de l'invention, le terme "système d'expression" désigne toute construction permettant l'expression in vivo d'un acide nucléique codant pour un facteur neurotrophique Avantageusement, le système d'expression comprend un acide nucléique codant pour un facteur neurotrophique sous le contrôle d'un promoteur transcπptionnel (cassette d'expression) Cet acide nucléique peut être un ADN ou un ARN S'agissant d'un ADN, on peut utiliser un ADNc, un ADNg ou un ADN hybride, c'est-à-dire un ADN contenant un ou plusieurs introns de l'ADNg, mais pas tous L'ADN peut également être synthétique ou semi-synthétique, et en particulier un ADN synthétisé artificiellement pour optimiser les codons ou créer des formes réduites
Le promoteur transcπptionnel peut être tout promoteur fonctionnel dans une cellule mammifère, de préférence humaine, et notamment nerveuse II peut s'agir de la région promotrice naturellement responsable de l'expression du facteur neurotrophique considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule ou l'organisme concernés II peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques) Notamment, il peut s'agir de régions promotrices de gènes eucaryotes ou viraux Par exemple, il peut s'agir de régions promotrices issues du génome de la cellule cible Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible II peut s'agir en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, α-actine, tubu ne, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, ApoAl, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroides, récepteur de l'acide rétinoique, etc) De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus tel que par exemple les promoteurs des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation ou permettant une expression tissu- spécifique ou majoritaire On utilise avantageusement dans le cadre de l'invention un promoteur constitutif eucaryote ou viral II s'agit plus particulièrement d'un promoteur choisi parmi le promoteur des gènes HPRT, PGK, α-actine, tubuline ou le promoteur des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV
Par ailleurs, la cassette d'expression comporte avantageusement une séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit synthétisé, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle
Enfin, la cassette d'expression comprend généralement une région située en 3', qui spécifie un signal de fin transcnptionnelle et un site de polyadénylation
Les facteurs trophiques utilisables dans le cadre de l'invention se classent essentiellement dans la famille des neurotrophines, la famille des neurokines, la famille du TGF béta, la famille des facteurs de croissance des fibroblastes (FGFs) et des facteurs de croissance de type insuline (IGFs) (revue 16)
Plus préférentiellement, dans la famille des neurotrophines, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention le BDNF, le NT-3 ou le NT-4/5
Le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), décrit par Thoenen (17), est une protéine de 118 acides aminés et de poids moléculaire 13,5 kD In vitro le BDNF stimule la formation de neuπtes et la survie en culture des neurones ganglionaires de la rétine, des neurones cholinergiques du septum ainsi que des neurones dopaminergiques du mesencephale (revue 18) La séquence d'ADN codant pour le BDNF humain et pour le BDNF de rat a été clonée et séquencée (19) ainsi que notamment la séquence codant pour le BDNF de porc (20) Bien que ses propriétés soient potentiellement intéressantes, l'application thérapeutique du BDNF se heurte à différents obstacles En particulier, l'absence de biodisponibi té du BDNF limite toute utilisation thérapeutique Le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) produit dans le cadre de la présente invention peut être le BDNF humain ou un BDNF animal
La neurotrophine 3 (NT3) est une protéine sécrétée de 119 aa qui permet la survie in vitro de neurones même à des concentrations très faibles (21 ) La séquence du cDNA codant pour la NT3 humaine a été décrite (22)
La famille du TGF-B comprend notamment le facteur neurotrophique dérivé des cellules Gliales Le facteur neurotrophique dérivé des cellules Gliales, GDNF (23) est une protéine de 134 acides aminés et de poids moléculaire de 16 kD II a la capacité essentielle de promouvoir in vitro la survie des neurones dopaminergiques et des motoneurones (16) Le facteur neurotrophique dérivé des cellules Gliales (GDNF) produit dans le cadre de la présente invention peut être le GDNF humain ou un GDNF animal Les séquences d'ADNc codant pour le GDNF humain et le GDNF du rat ont été clonées et séquencées (23)
Un autre facteur neurotrophique utilisable dans le cadre de la présente invention est notamment le CNTF ("Cihary NeuroTrophic Factor") Le CNTF est une neurokine susceptible d'empêcher la mort des neurones Comme indiqué précédemment, des essais cliniques ont été interrompus prématurément faute de résultats L'invention permet maintenant la production prolongée et continue in vivo de CNTF, seul ou en combinaison avec d'autres facteurs trophiques Le cDNA et le gène du CNTF humain et muπn ont été clones et séquences (EP385 060 WO91/04316
D'autres facteurs neurotrophiques utilisables dans le cadre de la présente invention sont par exemple l'IGF-1 (Lewis et al , 1993) et les Facteurs de Croissance des Fibroblastes (FGFa, FGFb) En particulier, l'IGF-l et le FGFa sont des candidats très intéressants La séquence du gène du FGFa a été décrite dans la littérature, ainsi que des vecteurs permettant son expression
Préférentiellement, le système d'expression de l'invention permet donc la production in vivo d'un facteur neurotrophique choisi parmi les neurotrophines, les neurokines et les TGF II s'agit plus préférentiellement d'un facteur choisi parmi le BDNF, le GDNF, le CNTF, la NT3, le FGFa et l'IGF-l D'un intérêt tout particulier est la production de NT3
Par ailleurs, selon une variante de l'invention, il est également possible de mettre en oeuvre un système d'expression permettant la production de deux facteurs neurotrophiques Dans ce mode de réalisation, le système d'expression comporte soit deux cassettes d'expression, soit une seule cassette permettant l'expression simultanée de deux acides nucléiques (unité bicistronique) Lorsque le système comprend deux cassette d'expression, celles-ci peuvent utiliser des promoteurs identiques ou différents
Dans les systèmes d'expression de l'invention, la ou les cassettes d'expression font avantageusement partie d'un vecteur II peut s'agir en particulier d'un vecteur viral ou plasmidique Dans le cas d'un système d'expression comportant plusieurs cassettes d'expression, les cassettes peuvent être portées par des vecteurs séparés, ou par le même vecteur
Le vecteur utilisé peut être un vecteur plasmidique standard, comportant, en plus de la ou des cassettes d'expression selon l'invention, une origine de réplication et un gène marqueur Différents types de vecteurs améliorés ont par ailleurs été décrits, dépourvus de gène marqueur et d'origine de réplication (WO96/26270) ou possédant par exemple une origine de rép cation conditionnelle (PCT/FR96/01414) Ces vecteurs sont utilisables avantageusement dans le cadre de la présente invention
Le vecteur utilisé peut également être un vecteur viral Différents vecteurs ont été construits à partir de virus, ayant des propriétés de transfert de gènes remarquables On peut citer plus particulièrement les adénovirus, les rétrovirus, les AAV et le virus de l'herpès Pour leur utilisation comme vecteurs de transfert de gènes, le génome de ces virus est modifié de manière à les rendre incapable de réphcation autonome dans une cellule Ces virus sont dits défectifs pour la réphcation Généralement, le génome est modifié par substitution des régions essentielles en trans à la réphcation virale par la ou les cassettes d'expression
Dans le cadre de l'invention, on préfère utiliser un vecteur viral dérivé des adénovirus Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 (kilobases) kb environ Leur génome comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions E1 , E2, E3 et E4 Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région E1 notamment sont nécessaires à la propagation virale Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions L1 à L5 Le génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquence et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260) De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adénoviraux (Ad2, Ad7, Ad12, etc) ont également été séquencées
Pour leur utilisation comme vecteurs de transfert de gènes, différentes constructions dérivées des adénovirus ont été préparées, incorporant différents gènes thérapeutiques Plus particulièrement, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés de la région E1 , essentielle à la réphcation virale au niveau de laquelle sont insérées les séquences d'ADN hétérologue (Levrero et al , Gène 101 (1991 ) 195 Gosh- Choudhury et al Gène 50 (1986) 161 ) Par ailleurs, pour améliorer les propriétés du vecteur, il a été proposé de créer d'autres délétions ou modifications dans le génome de l'adénovirus Ainsi, une mutation ponctuelle thermosensible a été introduite dans le mutant ts125, permettant d'inactiver la protéine de 72kDa de liaison à l'ADN (DBP) (13) D'autres vecteurs comprennent une deletion d'une autre région essentielle à la réphcation et/ou à la propagation virale, la région E4 La région E4 est en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la réphcation de l'ADN viral Des vecteurs adénoviraux dans lesquels les régions E1 et E4 sont délétées possèdent donc un bruit de fond de transcription et une expression de gènes viraux très réduits De tels vecteurs ont été décrits pas exemple dans les demandes W094/28152, WO95/02697, W096/22378 En outre, des vecteurs portant une modification au niveau du gène IVa2 ont également été décrits (W096/10088)
Les adénovirus recombinants décrits dans la littérature sont produits à partir de différents sérotypes d'adenovirus II existe en effet différents sérotypes d'adenovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable Plus particulièrement, les adénovirus recombinants peuvent être d'origine humaine ou animale Concernant les adénovirus d'origine humaine, on peut citer préférentiellement ceux classés dans le groupe C, en particulier les adénovirus de type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) ou 12 (Ad12) Parmi les différents adénovirus d'origine animale, on peut citer préférentiellement les adénovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple] D'autres adénovirus d'origine animale sont cités notamment dans la demande W094/26914 incorporée à la présente par référence
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, l'adénovirus recombinant est un adénovirus humain du groupe C De manière plus préférentielle il s'agit d'un adénovirus Ad2 ou Ad5 Les adénovirus recombinants sont produits dans une lignée d'encapsidation, c'est-à-dire une lignée de cellules capables de complémenter en trans une ou plusieurs des fonctions déficientes dans le génome adénoviral recombinant L'une de ces lignées est par exemple la lignée 293 dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été intégrée Plus précisément, la lignée 293 est une lignée de cellules embryonnaires humaines de rein contenant l'extrémité gauche (environ 11-12 %) du génome de l'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation, la région E1 , incluant E1a et E1b, la région codant pour la protéine pIX et une partie de la région codant pour la protéine plVa2 Cette lignée est capable de trans-complémenter des adénovirus recombinants défectifs pour la région E1 , c'est-à-dire dépourvus de tout ou partie de la région E1 , et de produire des stocks viraux ayant des titres élevés Cette lignée est également capable de produire, à température permissive (32°C), des stocks de virus comportant en outre la mutation E2 thermosensible D'autres lignées cellulaires capables de complémenter la région E1 ont été décrites, basées notamment sur des cellules de carcinome de poumon humain A549 (W094/28152) ou sur des rétinoblastes humains (Hum Gen Ther (1996) 215) Par ailleurs, des lignées capables de trans-complémenter plusieurs fonctions de l'adénovirus ont également été décrites En particulier, on peut citer des lignées complémentant les régions E1 et E4 (Yeh et al , J Virol 70 (1996) 559 , Cancer Gen Ther 2 (1995) 322 , Kroughak et al , Hum Gen Ther 6 (1995) 1575) et des lignées complémentant les régions E1 et E2 (W094/28152, WO95/02697, WO95/27071 ) Les adénovirus recombinants sont habituellement produits par introduction de l'ADN viral dans la lignée d'encapsidation, suivie d'une lyse des cellules après environ 2 ou 3 jours (la cinétique du cycle adénoviral étant de 24 à 36 heures) Après la lyse des cellules, les particules virales recombinantes sont isolées par ceπtπfugation en gradient de chlorure de césium Des méthodes alternatives ont été décrites dans la demande FR96 08164 incorporée à la présente par référence La cassette d'expression du ou des gènes thérapeutiques peut être insérée en différents sites du génome de l'adénovirus recombinant, selon les techniques décrites dans l'art antérieur Elle peut tout d'abord être insérée au niveau de la délétion E1 Elle peut également être insérée au niveau de la région E3, en addition ou en substitution de séquences Elle peut également être localisée au niveau de la région E4 délétée Pour la construction de vecteurs portant deux cassettes d'expression, l'une peut être insérée au niveau de la région E1 , l'autre au niveau de la région E3 ou E4 Les deux cassettes peuvent également être introduites au niveau de la même région
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, la composition comprenant le système d'expression peut être formulée de différentes façons II peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables D'autres excipients peuvent être utilisés tels que par exemple des protéines stabilisatrices (sérum-albumine humaine notamment FR96 03074), du poloxamère ou encore un hydrogel Cet hydrogel peut être préparé à partir de tout polymère (homo ou hétéro) bio-compatible et non cytotoxique De tels polymères ont par exemple été décrits dans la demande WO93/08845 Certains d'entre eux, comme notamment ceux obtenus à partir d'oxyde d'éthylène et/ou de propylène sont commerciaux Par ailleurs, lorsque le système d'expression est composé de vecteurs plasmidiques, il peut être avantageux d'ajouter dans la composition un ou plusieurs agents chimiques ou biochimiques favorisant le transfert de gènes A cet égard on peut citer plus particulièrement les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n tels que décrits dans la demande W095/21931 , polyéthylène immine (WO96/02655) et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire Parmi ces derniers, on peut citer les hpopolyamines (hpofectamine, transfectam, tels que décrits dans la demande W095/18863 ou W096/17823) différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc) ainsi que des peptides d'origine nucléaire (WO96/25508), éventuellement fonctionahsés pour cibler certains tissus La préparation d'un composition selon l'invention utilisant un tel vecteur chimique est réalisée selon toute technique connue de l'homme du métier, généralement par simple mise en contact des différents composants
De manière particulièrement préférée, le système d'expression utilisé dans l'invention est constitué par un adénovirus recombinant defectif codant pour un facteur neurotrophique Encore plus particulièrement, le facteurneurotrophique est la NT3 Pour leur utilisation dans l'invention, les adénovirus sont avantageusement formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 10^ et 10^4 pfu, et de préférence 10^ à 10"^ pfu Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution d'adenovirus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature Les exemples ci- après montrent de manière tout à fait remarquable que des doses de 109 et 107 permettent (i) un transfert efficace de gènes dans les neurones sectionnés, (n) une expression durable du transgène dans lesdits neurones et (m) une restitution de la continuité axonale
L'introduction du système d'expression dans le manchon peut être réalisée de différentes manières, et en particulier au moyen de seringues L'injection au moyen de microseringues est préférée (microseringue Hamilton ou Terumo)
Une des applications particulièrement intéressantes de la présente invention est la stimulation de la repousse des nerfs périphériques Ce traitement peut être appliqué dans différentes situations pathologiques, notamment des traumatismes ou des dégénérescences nerveuses II peut être appliqué à tout nerf accessible chirurgicalement, et en particulier aux nerfs radial, cubital, médian, colatéraux des doigts et inter-osseux, pour les membres supérieurs, et aux nerfs sciatique (diamètre d'environ 1 cm à sa naissance) ou crural (diamètre 6-7 mm), pour les membres inférieurs
Une autre application particulièrement avantageuse de l'invention est la restitution d'une continuité nerveuse au niveau des racines du plexus brachial (diamètre 5-6 mm) ou au sein même de la moelle épinière, consécutivement à un traumatisme Ce type de lésion ne connaît pas aujourd'hui de traitement La méthode de l'invention permet de réaliser un pontage entre la section sous-jacente à une section de la moelle et la section sus-jacente de celle-ci, de manière à joindre les principaux faisceaux et à régénérer une continuité nerveuse Pour ces applications, les manchons utilisés ont de préférence un diamètre interne pouvant atteindre 15 à 20 mm En particulier, pour le pontage d'une racine avulsée au niveau du plexus brachial, le diamètre du manchon correspond au diamètre de la racine
La présente invention a donc également pour objet un produit pour la libération locale et prolongée d'une substance neurotrophique au niveau d'une lésion nerveuse composé d'un manchon biocompatible permettant de joindre les parties sus- et sous-lésionnelles, dans lequel est introduit un système d'expression d'un facteur neurotrophique
La présente invention peut être utilisée pour stimuler la régénération nerveuse in vivo aussi bien chez l'animal que chez l'homme Elle peut en outre être utilisée chez l'animal, pour étudier les propriétés d'un nouveau facteur trophique (nouvelle protéine, mutant, etc) Pour cela, un animal est soumis à une section nerveuse, puis un système d'expression du facteur à tester est introduit dans un dispositif selon l'invention La capacité dudit facteur à restaurer une continuité nerveuse est déterminée comme indiqué dans les exemples Ce dispositif permet en outre de comparer différents facteurs, ou d'étudier des association synergiques de différents facteurs
La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs
Légende des Figures
Figure 1 Description de la mise en place, sur un nerf périphérique d'un dispositif selon l'invention
Figure 2 Microphotographie prise au niveau de la portion sacro-lombaire de la moelle épinière et montrant une forte production de β-galactosidase (révélée par le substrat X-Gal) au sein des motoneurones spinaux
Figure 3 Aspect macroscopique de la repousse tissulaire à J12 (A) Exemple observé chez un animal témoin Aucune continuité tissulaire n'est observée entre les extrémités proximale et distale de la réparation nerveuse (B) Aspect du contenu du tuteur chez un animal ayant reçu une injection de 107 pfu Ad-NT3 II est possible de noter la présence d'un cable tissulaire joignant les extrémités proximale et distale de la réparation nerveuse
Figure 4 Aspects de marquages rétrogrades par la HRP observés à J12 (A) Dans le groupe témoin, quelques rares motoneurones faiblement marqués sont observés (B) Dans le groupe traité par 107 pfu Ad-NT3, un grand nombre de neurones spinaux fortement marqués sont présents
Figure 5 Description de la mise en place selon l'invention d'un pontage des afférences périphériques sous-jacentes à une lésion au niveau de la moelle saine sus-jacente à ladite lésion
Figure 6 Description de la mise en place, dans la moelle épinière, d'un dispositif selon l'invention
Figure 7 Description de la réponse motrice observée en fonction du temps après l'intervention sur le nerf et la mise en place du dispositif selon l'invention 1. Méthodologie
1-1 Vecteurs adénoviraux
Comme indiqué précédemment, les vecteurs viraux, et notamment les adénovirus, constituent un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention
Les adénovirus recombinants utilisés ont été obtenus par recombinaison homologue selon les techniques décrites dans l'art antérieur En bref, il sont construits dans les cellules 293, par recombinaison entre un fragment de génome viral linéarisé (dl324) et un plasmide contenant l'ITR gauche, les séquences d'encapsidation, le transgène ainsi que son promoteur et des séquences virales permettant la recombinaison Les virus sont amplifiés sur cellules 293 II sont régulièrement repurifiés dans le P3 de notre laboratoire Les génomes viraux peuvent également être préparés dans une cellule procaryote selon la technique décrite dans la demande WO96/25506 Les virus suivants sont plus particulièrement utilisés
- Ad-βGal Adénovirus recombiπant defectif dérivé d'un sérotype Ad5 comprenant (i) une délétion de la région E1 au niveau de laquelle est introduite une cassette d'expression comportant un acide nucléique codant pour la β-galactosidase de E co sous contrôle du promoteur du LTR du virus du sarcome de rous (désigné LTR-RSV ou RSV), et (n) une délétion de la région E3 La construction de cet adénovirus a été décrite dans Stratford- Perπcaudet et al (J Clin Invest 90 (1992) 626)
- Ad-NT3 Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré dans son génome à la place de la région E1 délétée, une cassette d'expression du NT3 composée du cDNA codant pour le NT3 sous contrôle d'un promoteur transcriptionnel (en particulier le LTR du RSV) Une construction alternative comprend une délétion supplémentaire dans la région E4, telle que décrite dans la demande W096/22378 - Ad-CNTF Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré dans son génome à la place de la région E1 délétée, une cassette d'expression du CNTF composée du cDNA codant pour le CNTF sous contrôle d'un promoteur transcnptionnel (en particulier le LTR du RSV) Les détails de la construction sont données dans la demande WO94/08026 Une construction alternative comprend une délétion supplémentaire dans la région E4, telle que décrite dans la demande W096/22378
- Ad-GDNF Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré dans son génome à la place de la région E1 délétée, une cassette d'expression du GDNF composée du cDNA codant pour le GDNF sous contrôle d'un promoteur transcnptionnel (en particulier le LTR du RSV) Les détails de la construction sont données dans la demande WO95/26408) Une construction alternative comprend une délétion supplémentaire dans la région E4, telle que décrite dans la demande W096/22378 - Ad-BDNF Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré dans son génome à la place de la région E1 délétée, une cassette d'expression du BDNF composée du cDNA codant pour le BDNF sous contrôle d'un promoteur transcnptionnel (en particulier le LTR du RSV) Les détails de la construction sont données dans la demande WO95/25804) Une construction alternative comprend une délétion supplémentaire dans la région E4, telle que décrite dans la demande W096/22378
- Ad-FGFa Adénovirus recombinant de sérotype Ad5 comprenant, inséré dans son génome à la place de la région E1 délétée, une cassette d'expression du FGFa composée du cDNA codant pour le FGFa sous contrôle d'un promoteur transcnptionnel (en particulier le LTR du RSV) Les détails de la construction sont données dans la demande WO95/25803) Une construction alternative comprend une délétion supplémentaire dans la région E4, telle que décrite dans la demande W096/22378
La fonctionnalité des virus construits est vérifiée par infection de fibroblastes en culture La présence du facteur neurotrophique correspondant est analysée dans le surnageant de culture par ELISA et/ou en mettant en évidence les propriétés trophiques de ce surnageant sur des cultures primaires neuronales
Il est entendu que d'autres constructions dérivées des adénovirus peuvent être réalisées et utilisées dans le cadre de l'invention, et en particulier des vecteurs portant des délétions supplémentaires et/ou des promoteurs différents et/ou codant pour d'autres facteurs neurotrophiques
1-2 Protocole chirurgical
Les animaux étaient constitués par des rats mâles Sprague-Dawley de 320- 340 g (Iffa Credo - Les Oncins - France) Sous anesthesie générale (injection intra-péπtonéale de Pentobarbital 1 ml/kg - Saπofi Santé Animale), la peau de la patte postérieure droite est incisée au niveau de la cuisse, et les plans musculaires sont écartés de manière à exposer le nerf sciatique droit Le nerf est sectionné à mi-distance entre le creux pophté et la séparation du nerf sciatique, et un segment de 5 mm est oté (Fig 1 B) Une prothèse tubulaire en silicone (14 mm de long, 1 47 mm de diamètre interne, épaisseur de la paroi 0 23 mm - Silastic , Dow Corning Corporation, USA) est présentée L'extrémité proximale du nerf est introduite dans le tube et est maintenue en place à l'aide d'une suture 9/0 en nylon reliant l'épinèvre et le nerf Une seconde suture entre le tube et le nerf au niveau distal est mise en place de manière à obtenir une perte de substance de 10 mm (distance limite pour laquelle une régénération nerveuse périphérique spontanée peut être observée chez le rat dans les conditions expérimentales utilisées) (Fig 1 C) L'étanchéité du montage au niveau proximal est alors réalisée à l'aide d'une colle de fibrine (Tissucol, Immuno AG, Vienne Autriche), avant que 10 μl de la solution virale ou de soluté salin isotonique pour les animaux témoins, ne soit introduite dans le tuteur, en contact avec l'extrémité proximale du nerf, à l'aide d'une microseringue (Fig 1 D) Le volume mort du tuteur est empli par une solution saline isotonique (solution de Chlorure de Sodium à 0 9%) avant que l'extrémité distale du nerf ne soit introduite à son tour dans la prothèse tubulaire, et l'étanchéité de cette extrémité assurée par la colle de fibrine (Fig 1 E) Les plans musculaires et cutanés sont refermés à l'aide d'une suture standard en nylon 6/0 et 4/0 respectivement Les animaux sont replacés dans une cage individuelle, et maintenus en cycle jour/nuit 12h/12h
1 -3 Contrôle de la repousse axonale et marquage rétrograde des motoneurones spinaux par la Horseradish Peroxydase (HRP)
Douze jours plus tard, et après anesthesie générale des animaux, le montage est réexposé et disséqué des adhérences l'environnant La présence d'une continuité tissulaire est notée avant que le montage ne soit sectionné à 3 mm en aval de l'extrémité proximale de la section nerveuse d'origine Le "moignon" ainsi obtenu est rincé avec du soluté salin isotonique, avant d'être empli avec une solution de HRP à 30% (w/v)(Sιgma Chemical, St Louis, MO, USA) Après 1 heure d'incubation, cette solution est otée, et l'extrémité nerveuse rincée avec une solution saline isotonique avant que les plans musculaires et cutanés ne soient refermés et les animaux replacés dans leurs cages Quarante huit heures plus tard, les animaux sont réanesthésiés, et fixés, après rinçage en PBS, par perfusion intracardiaque de glutaraldehyde à 3 6% Les moelles épinières sont alors disséquées, post-fixées pendant 3 heures en glutaraldehyde 3 6%, et placées en sucrose 30%(w/v) pendant 48 heures à 72 heures Les parties lombo-sacrées des moelles sont coupées en congélation en coupes longitudinales sériées de 35 μm d'épaisseur, et la présence de HRP révélée suivant la technique classique décrite par MesulamO 5), et utilisant la 3,3',5,5'-Tetramethyl- Benzidine
1-4 Détection de la β-Galactosidase
L'activité β-Galactosidase a été visualisée par utilisation du substrat X- GalC4) Brièvement, des sections longitudinales de la moelle sacro-lombaire de 100 μm d'épaisseur sont incubées pendant 18 h à 37°C en PBS contenant de l'hexacyanoferrate de potassium (4 mM), du ferπcyanide de potassium (4 mM), du substrat X-Gal (0 4 mg/ml), et du chlorure de magnésium (4 mM) Après incubation, les coupes tissulaires sont rincées en PBS, puis montées en milieu aqueux (Gélatine-Glycérol)
2. Mise en évidence du transport rétrograde des adénovirus non- replicatifs par les motoneurones spinaux axotomisés, et vérification de l'expression du transgène.
Cette première étude a permis de mettre en évidence que des neurones axotomisés pouvaient effectuer un transport rétrograde de vecteurs adénoviraux et exprimer un transgène sur des temps pouvant atteindre 4 semaines Le vecteur (Adénovirus β-Galactosidase décrit en 1 -1 ) a été injecté à raison de 109 pfu par tube, et l'expression de son transgène testée à J4, J14, 4 semaines
A 4 jours, une forte expression de β-galactosidase était observée au niveau de la corne ventrale de la portion sacro-lombaire de la moelle épinière correspondant aux racines innervant le nerf sciatique (Fig 2) Cette forte expression du transgène par les motoneurones spinaux était retrouvée à 14 jours avec au total un nombre moyen de cellules β-galactosidase positive de 63 2±33 6 cell , soit une efficacité d'infection de l'ordre de 12 25% du nombre total de neurones spinaux innervant le nerf sciatique La présence d'une activité β-galactosidase dans la région sacro-lombaire de la moelle épinière a été détectée jusqu'à 4 semaines avec une intensité de marquage décroissante (Tableau I)
3. Test de l'effet d'un vecteur codant pour une neurotrophine (NT3) sur la repousse axonale du nerf sciatique de rat au travers d'une perte de substance de 10 mm.
Suite à ces résultats montrant la possibilité d'utiliser un système de type thérapie génique in vivo pour stimuler la repousse nerveuse après axotomie, Suite à ces résultats montrant la possibilité d'utiliser un système de type thérapie génique in vivo pour stimuler la repousse nerveuse après axotomie, nous avons testé l'effet d'un adénovirus portant un transgène codant pour la neurotrophine 3 (Ad-NT3 décrit en 1 -1 ) sur la régénération nerveuse périphérique Les résultats obtenus 12 jours après réalisation de l'axotomie et réparation du nerf avec un tuteur guide en Silastic ayant reçu 10? pfu de vecteur, ou une solution saline isotonique montrent qu'une continuité tissulaire n'est observée que dans le groupe d'animaux traités par un Ad-NT3 (Fig 3, Tableau II) L'analyse par marquage rétrograde par la HRP du nombre de motoneurones spinaux ayant régénéré un axone au travers du tuteur guide, indique que cette continuité tissulaire est constituée par une repousse nerveuse, avec une moyenne de 182 3±76 5 neurones HRP positif contre 24 25±42 7 neurones HRP positifs dans le groupe témoin (Fig 4, Tableau II)
Ces résultats permettent de conclure qu'un dispositif selon l'invention utilisant des vecteurs adénoviraux réphcation déficient portant des gênes codant pour des facteurs neurotrophiques peut être utilisé pour promouvoir une repousse axonale aussi bien centrale que périphérique
4. Comparaison de la reprise fonctionelle après section d'un nerf périphérique chez le rat
Une lésion a été pratiquée au niveau du nerf sciatique chez le rat adulte afin de créer une perte de substance d'au moins 10 mm Les parties proximales et distales de la lésion ont été jointes au moyen d'un dispositif selon l'invention (tube en silicone 14 mm de longueur, 1 47 mm de diamètre interne - Silastic) dans lequel a été introduit soit une solution saline, soit AV- RSVβgal (107 pfu dans 10μl), soit AV-RSVNT3 (107 pfu danslOμl), ou encore la protéine NT3 La reprise fonctionnelle a été mesurée par électromyographie la réponse motrice dans le muscle gastrocnemien a été enregistrée toutes les deux semaines (Fig 7) Une reprise fonctionnelle a été observée dans le goupe traité avec I' AV- RSVNT3 comparée aux autres groupes Cette augmentation a été statistiquement significative par comparaison dans le temps avec le groupe AV-RSVβgal au delà du jour 112, et du jour 70 au jour 112 avec le groupe rNT3 Une analyse electromyographique des profils individuels montrent que le traitement avec AV-RSVNT3 augmente la probabilité pour un animal donné d'miter la repousse du nerf Cependant, le taux de repousse n'est pas modifié lorsque la repousse a débuté
Ces résultats suggèrent donc que le transfert de gène codant pour un facteur neurotrophique au moyen de la technique décrite dans la présente invention est efficace pour augmenter la reprise fonctionelle après section d'un nerf périphérique
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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22- Hohn et al , Nature 344 (1990) 339 23- L -F Lin et al , Science, 260, 1130-1132 (1993) TABLEAU I: Détermination de l'efficacité d'infection des motoneurones axotomisés par un vecteur adénoviral codant pour la β-Galactosidase
TABLEAU II: Effet de l'injection d'un Ad-NT3 sur la repousse axonale à J12
N.D.: Non déterminé
* Animal décédé en cours de perfusion.

Claims

REVENDICATIONS
1 Dispositif pour la stimulation de la régénération nerveuse comprenant un manchon biocompatible dans lequel est introduit un système d'expression d'un facteur neurotrophique
2 Kit pour la stimulation de la régénération nerveuse comprenant d'une part un manchon biocompatible et d'autre part une composition comprenant un système d'expression d'un facteur neurotrophique
3 Utilisation, pour la préparation d'une composition destinée à stimuler la régérénation nerveuse, d'un manchon biocompatible dans lequel est introduit un système d'expression d'un facteur neurotrophique
4 Utilisation selon la revendication 3 pour la préparation d'une composition destinée à stimuler la régérénation des nerfs périphériques
5 Utilisation selon la revendication 3 pour la préparatιon d'une composition destinée à stimuler la régérénation axonale dans la moelle épinière
6 Utilisation, pour la préparation d'une composition destinée au traitement des lésions traumatiques du système nerveux, d'un manchon biocompatible dans lequel est introduit un système d'expression d'un facteur neurotrophique
7 Produit pour la libération locale et prolongée d'une substance neurotrophique au niveau d'une lésion nerveuse composé d'un manchon biocompatible permettant de joindre les parties sus- et sous-lésionnelles, dans lequel est introduit un système d'expression d'un facteur neurotrophique
8 Utilisation selon l'une des revendications 3 à 6 caractérisée en ce que le manchon est constitué d'un support tubulaire en matériaux non-toxique et biocompatible
9. Utilisation selon l'une des revendications 3 à 6 caractérisée en ce que la première section du nerf est introduite dans une extrémité du manchon où elle est maintenue en place par suture et/ou colle, le système d'expression est introduit dans le manchon, puis la deuxième section du nerf est insérée dans la deuxième extrémité du manchon où elle est maintenue par suture et/ou colle.
10. Utilisation selon l'une des revendications 3 à 6 caractérisée en ce que le système d'expression est constitué d'un vecteur comprenant un acide nucléique codant pour ledit facteur neurotrophique.
11. Utilisation selon la revendication 10 caractérisée en ce que le vecteur est un vecteur viral.
12. Utilisation selon la revendication 11 caractérisée en ce que le vecteur viral est un vecteur adénoviral.
13. Utilisation selon la revendication 10 caractérisé en ce que le facteur neurotrophique est choisi parmi les facteurs de la famille des neurotrophines, des neurokines, du TGF béta, des FGFs et des IGFs.
14. Utilisation selon la revendication 13 caractérisée en ce que le facteur neurotrophique est choisi parmi parmi le BDNF, le GDNF, le CNTF, la NT3, le FGFa et l'IGF-l.
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