EP0883689A1 - Speicherwürzelgewebespezifisches regulon der zuckerrübe - Google Patents

Speicherwürzelgewebespezifisches regulon der zuckerrübe

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EP0883689A1
EP0883689A1 EP96944671A EP96944671A EP0883689A1 EP 0883689 A1 EP0883689 A1 EP 0883689A1 EP 96944671 A EP96944671 A EP 96944671A EP 96944671 A EP96944671 A EP 96944671A EP 0883689 A1 EP0883689 A1 EP 0883689A1
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EP
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regulon
gene
plant
expression
dna
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Withdrawn
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EP96944671A
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English (en)
French (fr)
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Rainer Höfgen
Holger Hesse
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Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Publication date
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    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8227—Root-specific

Definitions

  • the present invention relates to a new regulon from plants which exhibits a storage-root tissue-specific expression pattern.
  • Plants are often exposed to strongly changing environmental conditions. It is advantageous for the plant if it can withstand rapidly changing environmental influences.
  • the adaptation to new changed environmental conditions takes place, for example, by changing the expression of the most varied genes.
  • the Sh1 gene from maize is induced under anaerobic conditions (Rowland et al., Mol. Gen. Genet. 218: 33-40 (1989)).
  • sucrose synthesis genes of potato and rice Salanoubat et al., Gene 84: 181-185 (1989) and Wang et al., Plant Mol. Biol. 18: 1191-1194 (1992)
  • sucrose synthase Another environmental factor that leads to increased expression of sucrose synthase is a lowered temperature (Mara ⁇ a et al., Gene 88: 167-172 (1990) and Crespi et al., Plant Physiol. 96: 887-891 (1991)). Furthermore, a limited supply of carbohydrates is responsible for an increased transcription of the maize gene Shl, while the Susi gene is expressed under these conditions with a reduced expression rate (Maas et al., EMBO J. 9: 3447-3452 ( 1990) and Koch et al, Plant Cell 4: 59-69 (1992)).
  • sucrose synthase genes For wheat and Arabidopsis it is also known that cold treatment induces the sucrose synthase genes (Mara ⁇ a et al., Gene 88: 167-172 (1990), Crespi, et al. Plant Physiol. 96: 887-891 (1991) and Martin et al., Plant J. 4: 367-377 (1993)).
  • the corn gene Sh1 the sucrose synthase gene of the potato and the wheat gene Ss1 show an increased expression under anaerobic conditions (Rowland et al., Mol. Gen. Genet.
  • the present invention was based on the technical problem of providing a new regulon which has an expression pattern which is not known from any of the regulatory elements disclosed in the prior art and which can be used advantageously for the expression of genes under its control.
  • this problem is solved by a regulon which constitutively expresses the gene under its control in the storage root tissue of the sugar beet (Beta vulgaris L.), regardless of the oxygen concentration in the environment, the ambient temperature and the sugar concentration in the root cells.
  • a regulon which constitutively expresses the gene under its control in the storage root tissue of the sugar beet (Beta vulgaris L.), regardless of the oxygen concentration in the environment, the ambient temperature and the sugar concentration in the root cells.
  • FIG 1 shows the expression of the SBSS1 gene in different
  • FIG. 1 shows the influence of cold treatment on the
  • FIG. 3 shows the influence of anaerobiosis on the expression of the SBSS1 gene.
  • FIG. 4 shows the influence of different sugar concentrations on the expression of the SBSS1 gene.
  • regulon means a DNA sequence which controls the expression of a gene under its control depending on endogenous and exogenous factors. These factors include, for example, inductors, repressors and similar DNA binding proteins, as well as environmental influences, such as temperature changes, changes in the concentration of ambient oxygen, and tissue injuries or the supply of nutrients.
  • a regulon can comprise several elements, such as enhancers, silencers or promoters. However, a regulon comprises at least one regulatory element that is responsible for the transcription of the gene under its control.
  • constitutive is understood to mean that the transcriptional activity of the regulon changes under changing conditions, for example when changing from normal temperature (approx. 22 ° C.) to cold (approx. 4 ° C.) or when changing from aerobic to anaerobic conditions, changes by less than a factor of 3.
  • a regulon is therefore considered to be “inducible” or “repressible” if its transcription activity changes by more than a factor of 3 under the influence of the inducing or repressing conditions.
  • the regulon according to the invention is distinguished in that it leads to constitutive expression of the gene under its control in storage root tissue.
  • the regulon In its natural environment in the Beta vulgaris L genome. it controls the expression of the sucrose synthase gene SBSS1 (cf. H. Hesse, dissertation, chemistry department of the Free University of Berlin, 1993).
  • SBSS1 sucrose synthase gene
  • the regulon is not affected in its transcription activity by a change in the oxygen concentration, such as in anaerobiosis.
  • a change in the ambient temperature for example the lowering of the temperature from 22 ° C. to 4 ° C. (ie under cold shock) does not lead to a change in the expression of the gene under the control of the regulon according to the invention in storage roots.
  • the regulon according to the invention is also constitutively transcriptionally active under a wide variety of sugar concentrations.
  • sucrose, glucose, fructose or mannose no change in the expression of the gene controlled by the regulon according to the invention.
  • all previously known promoters of sucrose synthase genes can be induced by anaerobiosis or cold; i.e. these known promoters are not constitutive promoters.
  • the regulon according to the invention can be isolated, for example, from a plant DNA bank, the DNA sample according to SEQ ID no. 1 can be used.
  • the hybridization conditions suitable for searching the bank can easily be determined by the person skilled in the art using the relevant literature, such as, for example, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • the clones identified as positive with the sample when the genomic DNA bank was searched can then be examined for their expression properties by standard methods.
  • the sequences hybridizing with the sample can be isolated from the vectors that were used to create the DNA bank and examined in conventional expression cassettes for their properties which influence the transcription.
  • the binary vectors BIN19 and pBI101, pBI101.2 and pBI101.3 come into consideration for this, for example.
  • the vector BIN19 was described by Bevan (Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711-8721) and is commercially available (Clontech Laboratories, Inc., USA).
  • the derivatives of the vector pBI101 were developed by Jefferson et al. (Plant Mol. Biol. Rep. 5 (1987), 387-405) and are also commercially available (Clontech Laboratories, Inc., USA).
  • any plant transformation vectors can be used, into which an expression cassette can be integrated and which allow the expression cassette to be integrated into the plant genome.
  • the transformation processes for plant cells for example using Agrobacterium tumefaciens or Ag-rohacteriu-n rhizogenes, are known to the person skilled in the art.
  • the use of T-DNA for the transformation of plant cells is described for example in EP-120516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plan Be. 4, 1-46; Ann et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287).
  • plant explants with Agrobacterium tumefaciens or A. rhizogenes are co-cultivated.
  • the whole plants can then be regenerated from the infected plant material (e.g. leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in suitable media containing the desired antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the plants thus obtained are examined for the presence of the introduced DNA.
  • the DNA introduced into the plants also contains a selection marker which shows the transformed plant cells resistance to one Biocide or an antibiotic, such as Kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin.
  • the transgenic plants are then conventionally obtained from the transformed cells (cf. McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
  • the transgenic plants obtained can optionally also be crossed with plants of a different genotype.
  • the various plant tissues can then be examined to determine whether the introduced DNA fragment has the expression pattern of the regulon according to the invention. Any reporter gene that is under the transcriptional control of the fragment to be tested can be used as an indicator of the expression activity of the introduced fragment.
  • DNA sequences that follow the fragment to be tested in the expression cassette can represent any coding sequences that lead to a detectable end product.
  • the fragment to be tested does not necessarily have to be tested in a sugar beet plant, but the potato is preferably used as the host plant for the fragment to be tested.
  • the transformation of potato plants with binary plasmids is described, for example, in Deblaere et al., Nucl. Acids Res. (1985), 4777-4788.
  • the use of potato plants to test the fragments for their expression patterns is based on the finding that a regulon which shows a certain expression pattern in storage root cells of the sugar beet shows the same pattern in the tubers of potato plants. This means that the regulon according to the invention is constantly and evenly transcriptionally active even in cells of the potato tuber, regardless of the Oxygen concentration of the environment, the ambient temperature and the sugar concentration in the cells of the potato tubers.
  • the regulon according to the invention controls the expression of the sucrose synthase gene (SBSS1) in Beta vulgaris.
  • the regulon according to the invention is preferably the regulatory element from the 5 kb-long region which adjoins the 5 'end of the transcription start of the SBSS1 gene in the genome of Beta vulgaris.
  • the start of transcription of the protein coding sequence is in SEQ ID No. 2 specified.
  • the regulons according to the invention are not only naturally occurring regulons, such as those obtained with the sample SEQ ID No. 1, but also derivatives derived therefrom (e.g. insertion (s), deletion (s) and / or substitution (s) carrying regulon (s)), provided that these derivatives have at least 20% of the transcription activity of the regulon of the SBSSl -Gen show the sugar beet under comparable conditions. Preferably, these derivatives show 100% or more of the activity of the sugar beet regulon.
  • the regulon according to the invention can be used advantageously, for example, to produce a recombinant DNA in which a gene of interest is under the control of the regulon.
  • a recombinant DNA thus allows expression of the gene product under conditions in which high expression rates have not been achieved hitherto.
  • the regulon according to the invention is also transcriptionally active at high sugar concentrations in the surrounding medium.
  • the plant cell By introducing a recombinant DNA containing the regulon according to the invention into a plant cell, the plant cell can be given new properties by the regulon according to the invention expressing products in the cell enables that the plant cell would otherwise not express or at different expression rates.
  • the regulon according to the invention thus allows the production of new plants with improved properties, such as uniform expression of any genes under the control of the regulon according to the invention, regardless of environmental influences, such as lack of oxygen, temperature fluctuations and / or the supply of sugar.
  • a transgenic plant can be produced by introducing the regulon according to the invention into a plant cell in the usual way and regenerating the transgenic plant therefrom.
  • the vectors pBluescript SK- (Stratagene) and EMBL 3 were used.
  • the DNA fragments were converted into the binary vectors BIN 19 (Bevan (1984), Nucl. Acids Res. 12, 8711-8720) and pBIlOl derivatives (Jefferson et al., (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5, 387-405).
  • the DNA was transferred into the bacteria by direct transformation according to the Höfgen & Willmitzer method (Nucl. Acids Res. 16 (1988), 9877).
  • the transformed DNA could be isolated and analyzed by gel electrophoresis after a suitable restriction cleavage.
  • the leaves were sprouted for expression on MS medium with 1.6% glucose, 1.4 mg / 1 zeatin ribose, 20 mg / l naphthylacetic acid, 20 mg / 1 giberellic acid, 250 mg / l Claforan, 50 mg / l kanamycin or 3 mg / l hygromycin B and 0.8% Bacto Agar. 5. Radioactive labeling of DNA fragments
  • the radioactive labeling of DNA fragments was carried out with the aid of a DNA random primer labeling kit from Boehringer (Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • the potato plants were kept in the greenhouse under the following conditions:
  • Genomic plant DNA was isolated according to Rogers & Bendich (1985; Plant Mol. Biol. 5, 69-76). The DNA from the transgenic potato plants was characterized by restriction mapping and Southern blot analyzes.
  • Ss-Glucuronidase is a bacterial enzyme that hydrolyzes ß-glucuronide and enables both quantitative and histochemical activity determination.
  • the activity determinations were carried out according to Jefferson et al. (1987, EMBO J. 6, 3901-3907).
  • the tissue samples were incubated in 1 mM X-Gluc, 50 mM Na phosphate, pH 7.0, and 0.1% Tween 20 until the desired blue color. This test allows that Determine expression patterns of any sequence in the different tissues of a transgenic plant.
  • the transcription-regulating properties of an approximately 4 kb long DNA segment, which extends from the start codon of the SBSS1 gene was cloned into various binary vectors, such as pBIN19 and pBI101 derivatives.
  • the vectors contain the coding region of the ⁇ -glucuronidase gene from Escherichia coli as a reporter gene. Under the control of the introduced fragment, this reporter gene shows in which tissues a transcription of the reporter gene occurs
  • fusion products from Regulon and CIS were introduced into potato plants via a gene transfer using Agrobacteria. Independently obtained transformants, in which the presence of the intact, non-rearranged chimeric fusion product had been demonstrated by means of Southern blot analyzes, were leaf, stem, tuber and roots on the
  • the 5 'region of a cDNA sequence which codes for the sucrose synthase gene from Beta vulgaris was used as a sample to isolate clones from a genomic DNA bank of Beta vulgaris breeding line 5S 0026 (Kleinwanzlebener Saatzucht AG).
  • the DNA sample used has the sequence SEQ ID No. 1.
  • genomic DNA library was created as follows. DNA was extracted from leaves of 3 to 4 month old sugar beet plants of the 5S 0026 breeding line essentially according to the method of Dellaporta et al. (1983; Plant Mol. Biol. Rep. 1, 19-21) isolated. The genomic DNA was partially digested with ten different concentrations of the enzyme Sau3A at 37 ° C for 15 minutes. The restriction enzyme was then heat inactivated at 70 ° C for 30 minutes. Aliquots of the different restriction batches were separated on a 0.7% agarose gel. Fractions with cut but still high molecular weight DNA were pooled and treated with alkaline phosphatase for 30 minutes.
  • the DNA was then purified by phenolic DNA, precipitated by adding 1/10 volume of sodium acetate and 2 volumes of 96% ethanol. The DNA was centrifuged off and the precipitate was washed with 70% ethanol. The DNA was dried briefly and dissolved in water. Lambda EMBL 3 arms pre-cut with BamHI (Strategene GmbH, Heidelberg, Germany) were used to clone this DNA prepared in this way. The packaging in phage heads was carried out using the Gigapack II Gold Kit (Stratagene GmbH, Heidelberg, Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • Diploid sugar beets from KWS were used. The plants were cultivated in soil in a greenhouse under a light / dark rhythm of 12.5 hours of light (20 ° C.) and 11.5 hours of darkness (13 ° C.).
  • 3-month-old sugar beet plants were either introduced for 48 hours in 4 ° C. under light (12.5 hours) (cold treatment) or immersed in water for 24 hours under normal greenhouse conditions (anaerobic treatment ). Control plants were kept under the conditions of the greenhouse for the same time. Each experiment was carried out in triplicate.
  • Gesarat-RNA was isolated for the expression studies according to the method of Logemann et al., Anal. Biochem. 163: 21-26 (1987), from 3 to 4 month old Beta vulgaris plants which had been grown in the greenhouse.
  • the RNA was fractionated on a 1.2% agarose / formaldehyde gel and transferred to nylon membranes (Hybond N, Amersham).
  • the hybridization was carried out in 50% formamide hybridization buffer according to Sharrock et al., Mol. Gen. Genet. 213: 9-14 (1988). Washing was done in 0.2 x SSC, 0.1% SDS at 65 ° C.
  • sucrose synthase gene under the control of the regulon according to the invention was followed by the sample SEQ ID No. 1 in the RNA blot experiments was used to determine the pattern of m-RNA expression of sucrose synthase in the various tissues such as leaves, storage roots and roots of B. to determine vulgaris.
  • the regulon according to the invention leads to a strong expression of the SBSS1 gene in the storage roots, while only an extremely small amount of expression is observed in other tissues.
  • total RNA from Beta vulgaris with the sample SEQ ID No. 1 analyzed. The result is shown in FIG. 1.
  • 50 ⁇ g of total RNA from “sink” leaves and “source” leaves, storage roots or side roots were separated by gel electrophoresis on a formaldehyde gel, transferred to a nylon membrane and with the sample SEQ ID No. 1 hybridizes.
  • "Sink” leaves are small leaves that are not yet independent in their energy metabolism and rely on energy from other parts of the plant;
  • Source leaves are fully grown leaves with sufficient own energy supply.
  • FIG. 4 shows the hybridization of equal amounts of total RNA from the different storage root samples. The transcripts were found at all sucrose, glucose, fructose and mannose concentrations. There was no increase in sucrose synthase transcript rate under the conditions.
  • FIG. 4 shows the hybridization of equal amounts of total RNA from the different storage root samples. The transcripts were found at all sucrose, glucose, fructose and mannose concentrations. There was no increase in sucrose synthase transcript rate under the conditions.
  • RNA blots in which equal amounts (50 ⁇ g) of total RNA, which were obtained from storage roots after a 24-hour incubation in the respective solutions, had been used. Blot (b) was exposed for 24 hours, while blot (a) was only exposed for 4 hours.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Regulon, das in Speicherwurzeln der Zuckerrübe (Beta vulgaris L.) das unter seiner Kontrolle stehende Gen konstitutiv exprimiert. Dabei verändert ein Übergang von aeroben Bedingungen auf anaerobe Bedingungen, ein Übergang von Normaltemperatur (ca. 22 °C) auf Kälte (ca. 4 °C) und sich ändernde Zuckerkonzentrationen nicht die Transkriptionsaktivität des Regulons in dem Speicherwurzelgewebe.

Description

Speicherwurzelgewebespezifisches Regulon der Zuckerrübe
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Regulon aus Pflanzen, das ein speicherwurzelgewebespezifisches Expressionsmuster zeigt.
Pflanzen sind häufig stark wechselnden Umweltbedingungen ausgesetzt. Dabei ist es für die Pflanze von Vorteil, wenn sie rasch sich ändernden Umwelteinflüssen widerstehen kann. Die Adaptation an neue veränderte Umweltbedingungen erfolgt beispielsweise über die veränderte Expression verschiedenster Gene. So wird beispielsweise das Sh1-Gen aus Mais unter anaeroben Bedingungen induziert (Rowland et al., Mol. Gen. Genet. 218: 33-40 (1989)). Einen ähnlichen Befund gibt es für die Sucrosesyn- thasegene der Kartoffel und von Reis (Salanoubat et al., Gene 84: 181-185 (1989) und Wang et al., Plant Mol. Biol. 18: 1191- 1194 (1992)). Ein weiterer Umweltfaktσr, der zur gesteigerten Expression von Sucrosesynthase führt, ist eine erniedrigte Temperatur (Maraήa et al., Gene 88: 167-172 (1990) und Crespi et al., Plant Physiol. 96: 887-891 (1991)). Weiterhin ist eine beschränkte Versorgung mit Kohlenhydraten dafür verantwortlich, daß es zu einer gesteigerten Transkription des Maisgens Shl kommt, während das Susi-Gen unter diesen Bedingungen mit einer verringerten Expressionsrate exprimiert wird (Maas et al., EMBO J. 9: 3447-3452 (1990) und Koch et al, Plant Cell 4: 59-69 (1992)). Für Weizen und Arabidopsis ist weiterhin bekannt, daß eine Kältebehandlung die Sucrosesynthasegene induziert (Maraήa et al., Gene 88: 167-172 (1990), Crespi, et al.. Plant Physiol. 96: 887-891 (1991) und Martin et al., Plant J. 4: 367-377 (1993)). Das Maisgen Sh1, das Sucrosesynthasegen der Kartoffel und das Weizengen Ss1 zeigen eine gesteigerte Expression unter anaeroben Bedingungen (Rowland et al., Mol. Gen. Genet. 218: 33-40 (1989), Salanoubat et al., Gene 84: 181-185 (1989) und Maraήa et al., Gene 88: 167-172 (1990)). Schließlich wird das Maisgen Shl auch durch eine externe Zufuhr von Sucrose beein- flußt (Martin et al., Plant J. 4: 367-377 (1993) und Koch et al., Plant Cell 4: 59-69 (1992)).
Der vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, ein neues Regulon bereitzustellen, das ein Expressionsmuster aufweist, wie es von keinem der im Stand der Technik offenbarten regulatorischen Elemente bekannt ist und das für die Expression von Genen unter seiner Kontrolle in vorteilhafter Weise eingesetzt werden kann.
Dieses Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Regulon, das in Speicherwurzelgewebe der Zuckerrübe (Beta vulgaris L . ) , unabhängig von der Sauerstoffkonzentration der Umgebung, der Umgebungstemperatur und der Zuckerkonzentration in den Wurzelzellen, das unter seiner Kontrolle stehende Gen konstitutiv exprimiert.
Figur 1 zeigt die Expression des SBSSl-Gens in verschiedenen
Geweben der Zuckerrübe J3. vulgaris .
Figur 2 zeigt den Einfluß einer Kältebehandlung auf die
Expression des SBSSl-Gens.
Figur 3 zeigt den Einfluß von Anaerobiose auf die Expression des SBSSl-Gens.
Figur 4 zeigt den Einfluß verschiedener Zuckerkonzentrationen auf die Expression des SBSSl-Gens.
Im folgenden bedeutet "Regulon" eine DNA-Sequenz, die die Expression eines Gens unter seiner Kontrolle in Abhängigkeit von endogenen und exogenen Faktoren steuert. Zu diesen Faktoren zählen beispielsweise Induktoren, Repressoren und ähnliche DNA- bindende Proteine, wie auch Umwelteinflüsse, wie Temperaturänderungen, Änderungen in der Konzentration des Umgebungssauerstoffs, und Gewebeverletzungen oder das Nährstoffangebot. Ein Regulon kann mehrere Elemente, wie Enhancer, Silencer oder Promotoren umfassen. Ein Regulon umfaßt jedoch mindestens ein regulatorisches Element, das für die Transkription des unter seiner Kontrolle stehenden Gens zuständig ist.
Unter "konstitutiv" wird im folgenden verstanden, daß sich die Transkriptionsaktivität des Regulons bei sich ändernden Bedingungen, beispielsweise beim Übergang von Normaltemperatur (ca. 22°C) auf Kälte (ca. 4°C) oder beim Übergang von aeroben zu anaeroben Bedingungen, um weniger als den Faktor 3 ändert. Demzufolge gilt ein Regulon als "induzierbar" bzw. "reprimierbar", wenn sich dessen Transkriptionsaktivität unter Einfluß der induzierenden bzw. reprimierenden Bedingungen um mehr als den Faktor 3 ändert.
Das erfindungsgemäße Regulon zeichnet sich dadurch aus, daß es in Speicherwurzelgewebe zur konstitutiven Expression des unter seiner Kontrolle stehenden Gens führt. In seiner natürlichen Umgebung in dem Genom von Beta vulgaris L . kontrolliert es die Expression des Sucrosesynthasegens SBSS1 (vgl. H. Hesse, Dissertation, Fachbereich Chemie der Freien Universität Berlin, 1993) . Dabei ist bemerkenswert, daß das Regulon durch eine Änderung der Sauerstoffkonzentration, wie beispielsweise bei Anaerobiose, nicht in seiner Transkriptionsaktivität beeinflußt wird. Weiterhin führt auch eine Änderung der Umgebungstemperatur, beispielsweise die Absenkung der Temperatur von 22°C auf 4°C (d.h. unter Kälteschock) nicht zu einer Veränderung der Expression des Gens unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Regulons in Speicherwurzeln. Schließlich ist das erfindungsgemäße Regulon auch konstitutiv transkriptionsaktiv unter den verschiedensten Zuckerkonzentrationen. So führt beispielsweise das Zuführen von Sucrose, Glucose, Fructose, bzw. Mannose zu keiner Veränderung der Expression des durch das erfindungsgemäße Regulon kontrollierten Gens.
Der Befund, daß das erfindungsgemäße Regulon in Speicherwurzelgewebe in ständig angeschaltetem Zustand vorliegt, unabhängig von den Sauerstoff- und/oder Temperaturbedingungen, sowie der Zuckerkonzentration unterscheidet das erfindungsgemäße Regulon von sämtlich bisher bekannten Elementen, die an der Expression von Pflanzengenen, insbesondere von Sucrosesynthasegenen, beteiligt sind. So sind beispielsweise sämtliche bisher bekannten Promotoren von Sucrosesynthasegenen durch Anaerobiose oder Kälte induzierbar; d.h. diese bekannten Promotoren sind keine konstitutiven Promotoren.
Das erfindungsgemäße Regulon kann beispielsweise aus einer Pflanzen-DNA-Bank isoliert werden, wobei zur Isolierung die DNA-Probe gemäß SEQ ID No. 1 eingesetzt werden kann. Die zum Absuchen der Bank geeigneten Hybridisierungsbedingungen können vom Fachmann leicht anhand der einschlägigen Literatur, wie beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben, ermittelt werden.
Die bei dem Absuchen der genomischen DNA-Bank als positiv mit der Probe identifizierten Klone lassen sich dann auf ihre Expressionseigenschaften hin nach Standardverfahren untersuchen. So können die mit der Probe hybridisierenden Sequenzen aus den Vektoren, die für das Erstellen der DNA-Bank verwendet wurden, isoliert und in herkömmlichen Expressionskassetten auf ihre die Transkription beeinflussenden Eigenschaften hin untersucht werden.
Zur Untersuchung der Expressionsaktivität der isolierten Fragmente können diese in Plasmide eingeführt werden, die zur Transformation von pflanzlichen Zellen geeignet sind, und die stabil in das pflanzliche Genom eingebaut werden. Hierfür kommen beispielsweise die binären Vektoren BIN19 und pBI101, pBI101.2 und pBI101.3 in Betracht. Der Vektor BIN19 wurde von Bevan (Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711-8721) beschrieben und ist kommerziell erhältlich (Clontech Laboratories, Inc., USA). Die Derivate des Vektors pBI101 wurden von Jefferson et al. (Plant Mol. Biol. Rep. 5 (1987), 387-405) beschrieben und sind ebenfalls gewerblich erhältlich (Clontech Laboratories, Inc., USA).
Es können jedoch beliebige Pflanzentransformationsvektoren verwendet werden, in die eine Expressionskassette integriert werden kann, und die die Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom ermöglichen. Die Transformationsverfahren für pflanzliche Zellen, beispielsweise unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Ag-rohacteriu-n rhizogenes, sind dem Fachmann geläufig. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist beispielsweise in EP-120516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sei. 4, 1-46; Ann et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287) beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in Pflanzenzellen können beispielsweise Pflanzenexplantate mit Agrobacterium tumefaciens oder A . rhizogenes cokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder suspensionskultivierte Pflanzenzellen) können dann in geeigneten Medien, welche die gewünschten Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten, dann wieder die vollständigen Pflanzen regeneriert werden.
Die so erhaltenen Pflanzen werden auf die Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht. Üblicherweise enthält die in die Pflanzen eingebrachte DNA weiterhin einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum, wie Kanamycin, G 418, Bleomy- cin, Hygromycin oder Phosphinotricin, verleiht. Aus den transformierten Zellen werden dann in herkömmlicherweise die transgenen Pflanzen erhalten (vgl. McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die erhaltenen transgenen Pflanzen können gegebenenfalls auch mit Pflanzen eines anderen Genotyps weiter gekreuzt werden.
Schließlich können dann die verschiedenen Pflanzengewebe daraufhin untersucht werden, ob das eingebrachte DNA-Fragment das Expressionsmuster des erfindungsgemäßen Regulons aufweist. Dabei kann als Indikator für die Expressionsaktivität des eingebrachten Fragments ein beliebiges Reportergen verwendet werden, das unter der Transkriptionskontrolle des zu testenden Fragments steht.
DNA-Sequenzen, die dem zu testenden Fragment in der Expressionskassette nachgeschaltet sind, können beliebige codierende Sequenzen darstellen, die zu einem nachweisbaren Endprodukt führen.
Das zu testende Fragment muß nicht notwendigerweise in einer Zuckerrübenpflanze ausgetestet werden, sondern es wird bevorzugterweise die Kartoffel als Wirtspflanze für das zu testende Fragment verwendet. Die Transformation von Kartoffelpflanzen mit binären Plasmiden ist beispielsweise beschrieben in Deblaere et al., Nucl. Acids Res. (1985), 4777-4788. Der Einsatz von Kartoffelpflanzen zum Austesten der Fragmente auf ihre Expressionsmuster hin beruht auf dem Befund, daß ein Regulon, das ein bestimmtes Expressionsmuster in Speicherwurzelzellen der Zuckerrübe zeigt, das gleiche Muster in den Knollen von Kartoffelpflanzen zeigt. Dies bedeutet, daß das erfindungsgemäße Regulon auch in Zellen der Kartoffelknolle ständig gleichmäßig transkriptionsaktiv ist, unabhängig von der Sauerstoffkonzentration der Umgebung, der Umgebungstemperatur und der Zuckerkonzentration in den Zellen der Kartoffelknollen.
Das erfindungsgemäße Regulon steuert in Beta vulgaris die Expression des Sucrosesynthasegens (SBSS1).
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Regulon das regulatorische Element aus der 5 kb-langen Region, die sich an das 5'- Ende des Transkriptionsstarts des SBSS1-Gens in dem Genom von Beta vulgaris anschließt. Der Transkriptionsstart der proteincodierenden Sequenz ist in SEQ ID No. 2 angegeben.
Als erfindungsgemäße Regulons kommen nicht nur natürlich vorkommende Regulons in Betracht, wie sie mit der Probe SEQ ID No. 1 erhalten werden können, sondern auch davon abgeleitete Derviate (beispielsweise Insertion (en), Deletion(en) und/oder Substitution (en) tragende(s) Regulon(s)), sofern diese Derivate mindestens 20 % der Transkriptionsaktivität des Regulons des SBSSl-Gens der Zuckerrübe unter vergleichbaren Bedingungen zeigen. Vorzugsweise zeigen diese Derivate 100 % oder mehr der Aktivität des Regulons aus Zuckerrübe.
Das erfindungsgemäße Regulon kann beispielsweise vorteilhaft eingesetzt werden zur Herstellung einer rekombinanten DNA, bei der ein Gen von Interesse unter der Kontrolle des Regulons steht. Eine solche rekombinante DNA erlaubt somit die Expression des Genprodukts unter Bedingungen, bei denen bisher hohe Expressionsraten nicht erzielt wurden. Beispielsweise ist das erfindungsgemäße Regulon auch transkriptionsaktiv unter hohen Zuckerkonzentrationen in dem umgebenden Medium.
Durch Einbringen einer rekombinanten DNA, enthaltend das erfindungsgemäße Regulon, in eine Pflanzenzelle, können der Pflanzenzelle neue Eigenschaften verliehen werden, indem das erfindungsgemäße Regulon die Expression von Produkten in der Zelle ermöglicht, die die Pflanzenzelle ansonsten nicht oder mit anderen Expressionsraten exprimieren würde.
Somit erlaubt das erfindungsgemäße Regulon die Herstellung von neuen Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften, wie gleichmäßige Expression von beliebigen Genen unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Regulons unabhängig von Umwelteinflüssen, wie Sauerstoffmangel, Temperaturschwankungen und/oder der Versorgung mit Zucker.
Eine transgene Pflanze läßt sich herstellen, indem das erfindungsgemäße Regulon auf übliche Weise in eine Pflanzenzelle eingebracht und die transgene Pflanze daraus regeneriert wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiele
1. Klσnierungsverfahren
Zur Klonierung in E . coli wurden die Vektoren pBluescript SK- (Stratagene) und EMBL 3 (Frischauf et al. (1983), J. Mol. Biol. 170, 827-842) verwendet. Zur Pflanzentransformation wurden die DNA-Fragmente in die binären Vektoren BIN 19 (Bevan (1984), Nucl. Acids Res. 12, 8711-8720) und pBIlOl-Derivate (Jefferson et al., (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5, 387-405) kloniert.
2. Bakterienstämme
Für die unter 1. genannten Plasmidvektoren wurde der E . coli- Stamm XL-1 Blue (Stratagene) und für den Phagenvektor der Stamm LE2392 (Stratagene) verwendet. Die Transformation der binären Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 pGV2260 (Deblaere et al., Nucl. Acids Res. (1985), 4777-4788) durchgeführt.
3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens
Der Transfer der DNA in die Bakterien erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (Nucl. Acids Res. 16 (1988), 9877). Die transformierte DNA konnte isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektro- phoretisch analysiert werden.
4. Transformation von Kartoffel
10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffelsterilkultur (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962), 473-497) mit 2 % Saccharose gelegt, wobei das Medium 50 μl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens über-Nacht-Kultur enthielt. Nach 3- bis 5-rainütigem leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Callusinduktion auf MS-Medium mit 1,6 % Glucose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylaminopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin bzw. 1 mg/l Hygromycin B und 0,8 % Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßexpression auf MS-Medium mit 1,6 % Glucose, 1,4 mg/1 Zeatinribose, 20 mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/1 Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin bzw. 3 mg/l Hygromycin B und 0,8 % Bacto Agar gelegt. 5. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
6. Pflanzenhaltung
Die Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten:
Lichtperiode 16 h bei 25000 Lux und 22 °C
Dunkelperiode 8 h bei 15°C
Luftfeuchte 60 %.
7. Analyse genomischer DNA aus transgenen Kartoffelpflanzen
Die Isolierung von genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers & Bendich (1985; Plant Mol. Biol. 5, 69-76). Die Charakterisierung der DNA aus den transgenen Kartoffelpflanzen erfolgte durch Restriktionskartierung und Southern Blot-Ana- lysen.
8. ß-Glucuronidase-Aktivitätstest (GUS-Assay)
Die ß-Glucuronidase ist ein bakterielles Enzym, das ß-Glucuro- nide hydrolysiert und sowohl eine quantitative als auch eine histochemische Aktivitätsbestimmung ermöglicht. Die Aktivitätsbestimmungen wurden nach Jefferson et al. (1987, EMBO J. 6, 3901-3907) durchgeführt. Die Gewebeproben wurden in 1 mM X- Gluc, 50 mM Na-Phosphat, pH 7,0, und 0,1 % Tween 20 bis zur gewünschten Blaufärbung inkubiert. Dieser Test erlaubt das Expressionsmuster einer beliebigen Sequenz in den verschiedenen Geweben einer transgenen Pflanze zu bestimmen. Die transkrip- tionsregulierenden Eigenschaften eines ca. 4 kb langen DNA- Segments, das sich beginnend vom Startcodon des SBSSl-Gens erstreckt, wurde in verschiedene binäre Vektoren, wie pBIN19 und pBI101-Derivate kloniert. Die Vektoren enthalten die codierende Region des ß-Glucuronidasegens aus Escherichia coli als Reportergen. Dieses Reportergen zeigt unter der Kontrolle des eingebrachten Fragments an, in welchen Geweben unter den jeweils gewählten Umwelteinflüssen es zu einer Transkription des Reportergens kommt.
Die Fusionsprodukte aus Regulon und GUS wurden über einen Gentransfer mit Hilfe von Agrobakterien in Kartoffelpflanzen eingebracht. Von unabhängig voneinander erhaltenen Transformanden, in denen die Präsenz des intakten, nicht-umgelagerten Chimären Fusionsprodukts mit Hilfe von Southern Blot-Analysen nachgewiesen worden war, wurden Blatt, Stamm, Knolle und Wurzeln auf die
Aktivität der ß-Glucuronidase hin untersucht.
9. Isolierung von Klonen, enthaltend DNA-Fragmente, die die transkriptionsregulierenden Eigenschaften des Regulons des SBSSl-Gens von Beta vulgaris L. zeigen
Der 5' -Bereich einer cDNA-Sequenz, die für das Saccharose- synthasegen aus Beta vulgaris codiert, diente als Probe, Klone aus einer genomischen DNA-Bank von Beta vulgaris Zuchtlinie 5S 0026 (Kleinwanzlebener Saatzucht AG) zu isolieren. Die verwendete DNA-Probe besitzt die Sequenz SEQ ID No. 1.
Zunächst wurde eine genomische DNA-Bank wie folgt hergestellt. DNA wurde aus Blättern von 3 bis 4 Monate alten Zuckerrübenpflanzen der Zuchtlinie 5S 0026 im wesentlichen nach der Methode von Dellaporta et al. (1983; Plant Mol. Biol. Rep. 1, 19-21) isoliert. Die genomische DNA wurde mit zehn verschiedenen Konzentrationen des Enzyms Sau3A bei 37°C für 15 Minuten partiell verdaut. Anschließend erfolgte eine Hitzeinaktivierung des Restriktionsenzyms für 30 Minuten bei 70ºC. Aliquots der verschiedenen Restriktionsansätze wurden auf einem 0,7 %igen Agarosegel aufgetrennt. Fraktionen mit geschnittener, aber noch hochmolekularer DNA wurden vereinigt und für 30 Minuten mit alkalischer Phosphatase behandelt. Im Anschluß wurde die DNA durch phenolische DNA gereinigt, durch Zugabe von 1/10 Volumen Natriumacetat und 2 Volumen 96 % Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde abzentrifugiert und der Niederschlag mit 70 % Ethanol gewaschen. Die DNA wurde kurz getrocknet und in Wasser gelöst. Zur Klonierung dieser so vorbereiteten DNA wurden mit BamHI vorgeschnittene Lambda EMBL 3 Arme verwendet (Strategene GmbH, Heidelberg, Deutschland). Das Verpacken in Phagenköpfe erfolgte unter Verwendung des Gigapack II-Gold Kits (Stratagene GmbH, Heidelberg, Deutschland) nach Angaben des Herstellers.
Ca. 200000 Plaques dieser genomischen DNA-Bibliothek wurden auf die gewünschten Sequenzen hin durchmustert, wobei stringente Bedingungen eingesetzt wurden (Hybridisierungspuffer mit 50 % Formamid für 14 Stunden bei 42°C nach Sharrock et al., 1988, Mol. Gen. Genet. 213, 9-14; Waschen der Hybridisierungsfilter nach der Hybridisierung in 2 x SSC/0,1 % SDS für 20 Minuten und 0,1 x SSC/0,1 % SDS für 15 Minuten, jeweils bei 65°C). Von den mit der Probe hybridisierenden Phagenklonen wurden nach deren Aufreinigung drei Klone bei der DSM, Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, unter der Bezeichnung SBSSl-λ271, SBSSl-λ321 und SBSSl-λ351 hinterlegt. 10. Analyse der transkriptionsregulierenden Eigenschaften des Regulons des SBSSl-Gens von Beta vulgaris L .
Es wurden diploide Zuckerrüben von der KWS (Kleinwanzlebener Saatzucht AG, Einbeck, Deutschland) verwendet. Die Pflanzen wurden im Gewächshaus in Erde kultiviert unter einem hell/dunkel-Rhythmus von 12,5 Stunden Licht (20°C) und 11,5 Stunden Dunkelheit (13°C).
Um den Einfluß von Kälte und einer anaeroben Behandlung zu untersuchen, wurden 3 Monate alte Zuckerrübenpflanzen entweder für 48 Stunden in 4°C unter Licht (12,5 Stunden) eingebracht (Kältebehandlung) oder für 24 Stunden unter normalen Gewächshausbedingungen in Wasser eingetaucht (anaerobe Behandlung). Kontrollpflanzen wurden für die gleiche Zeit unter den Bedingungen des Gewächshauses gehalten. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.
Für die Expressionsuntersuchungen wurde Gesarat-RNA isoliert gemäß dem Verfahren von Logemann et al., Anal. Biochem. 163: 21-26 (1987), aus 3 bis 4 Monate alten Beta vulgaris Pflanzen, die im Gewächshaus kultiviert worden waren. Die RNA wurde auf einem 1,2 % Agarose/Formaldehydgel fraktioniert und auf Nylonmembranen (Hybond N, Amersham) übertragen. Die Hybridisierung wurde in 50 % Formamid-Hybridisierungspuffer gemäß Sharrock et al., Mol. Gen. Genet. 213: 9-14 (1988), durchgeführt. Das Waschen wurde in 0,2 x SSC, 0,1 % SDS bei 65°C durchgeführt.
Zur Untersuchung des Einflusses der Zuckerkonzentration auf die Expression wurden Speicherwurzeln von 3 bis 4 Monate alten Zuckerrübenpflanzen geerntet. In jedem Experiment wurden 20 Scheiben mit 1,5 mm Dicke mit einer Fläche von l cm2 zufällig ausgewählt und zusammen in dem Inkubationsmedium inkubiert. Die Inkubation wurde in Dunkelheit bei 25°C durchgeführt. Das Experiment wurde jeweils dreifach durchgeführt. Die Expression des Sucrosesynthasegens unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Regulons wurde verfolgt, indem die Probe SEQ ID No. 1 in den RNA-Blot-Experimenten verwendet wurde, um das Muster der m-RNA-Expression der Sucrosesynthase in den verschiedenen Geweben, wie Blättern, Speicherwurzeln und Wurzeln von B . vulgaris zu bestimmen. Das erfindungsgemäße Regulon führt zu einer starken Expression des SBSSl-Gens in den Speicherwurzeln, während nur eine äußerst geringe Menge Expression in anderen Geweben beobachtet wird. Bei dieser Analyse wurde Gesamt-RNA von Beta vulgaris mit der Probe SEQ ID No. 1 analysiert. Das Ergebnis ist in Figur 1 dargestellt. In der gezeigten Figur wurden 50 μg an gesamter RNA aus "Sink"- Blättern und "Source"-Blättern, Speicherwurzeln oder Seitenwurzeln durch Gelelektrophorese auf einem Formaldehydgel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran übertragen und mit der Probe SEQ ID No. 1 hybridisiert. Unter "Sink"-Blättern werden kleine Blätter verstanden, die in ihrem Energiestoffwechsel noch nicht selbständig sind und auf Energiezufuhr aus anderen Pflanzenteilen angewiesen sind; "Source"-Blätter sind ausgewachsene Blätter mit ausreichender eigener Energieversorgung.
Einfluß eines Kälteschocks auf die Transkriptionsaktivität des erfindungsgemäßen Regulons
Um den Einfluß eines Kälteschocks auf die transkriptionsregu- lierende Aktivität des erfindungsgemäßen Regulons zu untersuchen, wurde die Expression des SBSSl-Gens während einer Kältebehandlung untersucht. Hierzu wurde RNA aus den "Sink"- und "Source"-Blättern, Speicherwurzeln und Seitenwurzeln von Pflanzen hergestellt, die 48 Stunden bei 4°C aufbewahrt wurden. Die Analayse der RNA-Blots durch Hybridisieren mit der Probe SEQ ID No. 1 zeigte, daß die Kältebehandlung keinen Einfluß auf das Expressionsmuster zeigte. Das Ergebnis ist in Figur 2 gezeigt. Es wurde gesamte RNA der Zuckerrübe (50 μg) auf einem Formaldehydgel aufgetrennt, die auf eine Nylonmembran übertragen und mit der Probe SEQ ID No. 1 hybridisiert wurde. Die Spuren 1 bis 4 zeigen RNA aus Pflanzen nach 48 Stunden der Kältebehandlung aus "Sink"- und "Source"-Blättern, Speicherwurzeln und Seitenwurzeln; Spuren 5 bis 8 zeigen RNA der Kontrollpflanzen, die im Gewächshaus kultiviert wurden.
Einfluß von anaeroben Bedingungen auf die Transkriptionsaktivität des erfindungsgemäßen Regulons
Der Einfluß von Anaerobiose wurde untersucht, indem Zuckerrübenpflanzen in Wasser für 24 Stunden eingetaucht wurden. Der Spiegel an Transkript nimmt unter diesen anaeroben Bedingungen in den "Sink"- und "Source"-Blättern, sowie in den Seitenwurzeln zu, während in den Speicherwurzeln die Transkription unverändert bleibt. Die Ergebnisse sind in Figur 3 gezeigt. Es wurden 50 μg Gesamt-RNA auf einem Formaldehydgel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übertragen und mit der Probe SEQ ID No. 1 hybridisiert. Die Spuren 1 bis 4 zeigen RNA von Pflanzen nach 24 Stunden unter anaeroben Bedingungen von "Sink"- und "Source"-Blättern, Speicherwurzeln und Seitenwurzeln; Spuren 5 bis 8 zeigen RNA aus den Kontrollpflanzen.
Einfluß von Zuckern auf die Transkriptionsaktivität des erfindungsgemäßen Regulons
Speicherwurzelscheiben von Pflanzen, die unter Gewächshausbedingungen kultiviert worden waren, wurden für 24 Stunden in der Dunkelheit bei Raumtemperatur verschiedenen Sucrosekonzentrationen ausgesetzt: 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8 und 10 % (Gew. /Vol.) Sucrose. Es wurde ferner mit verschiedenen Zuckern, wie Glucose, Fructose und Mannose, bei den Konzentrationen 1, 5 und 10 % (Gew. /Vol.) getestet. Die Figur 4 zeigt die Hybridisierung von gleichen Mengen an Gesamt-RNA aus den verschiedenen Speicherwurzelproben. Die Transkripte wurden bei sämtlichen Sucrose-, Glucose-, Fructose- und Mannosekonzentrationen gefunden. Es zeigte sich keine Steigerung in der Sucrosesynthasetranskriptrate unter den Bedingungen. Die Figur 4 zeigt das Ergebnis der RNA-Blots, bei denen gleiche Mengen (50 μg) Gesamt-RNA, die von Speicherwurzeln nach einer 24-stündigen Inkubation in den jeweiligen Lösungen erhalten wurden, eingesetzt worden waren. Der Blot (b) wurde für 24 Stunden exponiert, während der Blot (a) nur für 4 Stunden exponiert wurde.
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Regulon in Speicherwurzeln der Zuckerrübe zur konstitutiven Expression führt, wobei sich die Transskriptionsaktivtät des Regulons weder bei Kälteeinwirkung noch unter anaeroben Bedingungen noch unter sich ändernden Zuckerbedingungen verändert.

Claims

Patentansprüche
1. Regulon, das in Speicherwurzelgewebe der Zuckerrübe (Beta vulgaris L . ), unabhängig von der Sauerstoffkonzentration der Umgebung, der Umgebungstemperatur und der Zuckerkonzentration in den Wurzelzellen das unter seiner Kontrolle stehende Gen konstitutiv exprimiert.
2. Regulon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in seiner natürlichen Umgebung im Genom der Zuckerrübe die Expression des Succrosesynthasegens (SBSS1) steuert.
3. Regulon nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in seiner natürlichen Umgebung innerhalb von 5 kb 5' des Transkriptionsstarts des SBSSl-Gens vorliegt.
4. Regulon nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer genomischen Pflanzen-DNA-Bank, vorzugsweise von Beta vulgaris , durch Absuchen mit der DNA-Probe SEQ ID No. 1 und Isolieren von positiven Klonen erhältlich ist.
5. Rekombinante DNA, enthaltend ein Regulon nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Pflanzenzelle, enthaltend eine rekombinante DNA nach Anspruch 5.
7. Transgene Pflanze, enthaltend ein Regulon nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder eine rekombinante DNA nach Anspruch 5.
8. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß ein Regulon nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in eine Pflanzenzelle eingebracht und die transgene Pflanze daraus regeneriert wird.
9. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen, welches für das rekombinante Protein codiert, unter der Kontrolle des Regulons nach einem der Ansprüche 1 bis 4 steht.
10. Verwendung eines Regulons nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer Pflanzenzelle und/oder einer Pflanze.
11. Verwendung eines Regulons nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Expression von Genen.
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