EP0689595B1 - Promoteur vegetal, microorganismes et cellules vegetales contenant une unite d'expression d'une proteine d'interet comprenant ledit promoteur - Google Patents

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EP0689595B1
EP0689595B1 EP94911205A EP94911205A EP0689595B1 EP 0689595 B1 EP0689595 B1 EP 0689595B1 EP 94911205 A EP94911205 A EP 94911205A EP 94911205 A EP94911205 A EP 94911205A EP 0689595 B1 EP0689595 B1 EP 0689595B1
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EP
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plant
promoter
seq
plants
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Michel Schneider
Alain Toppan
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Biogemma SAS
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Definitions

  • the subject of the present invention is a new plant promoter and microorganisms and plant cells containing a unit expression of a protein of interest comprising said promoter.
  • the promoter according to the invention is a strong constitutive promoter allowing an expression of said protein in microorganisms and plant cells whatever the stage of development of the plant.
  • the promoter according to the invention finds an application particular in the field of plant protection by engineering genetics and in particular that of the defense of plants under stress.
  • the genes that were introduced by genetic engineering in plants are chimerical, combining regulatory elements of different origins. This is how very often the gene encoding a protein of interest is placed under the control of a strong constitutive promoter allowing expression of said protein throughout the plant (or most of it) throughout its life, whatever the stage of development.
  • the promoter of the cauliflower mosaic virus 35S transcript (35S CaMV) the most used in the construction of chimeric genes, fits this description.
  • a plant promoter isolated from tobacco has been described by Takahashi and al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 8013-8016.
  • the present invention relates to a promoter, which is expressed to a sustained level in the various organs and tissues of a plant and in particular the roots and meristem of a plant and that is very highly inducible in stressful situations, such as in particular after thermal shock, injury, hormonal shock, elicitor biotic or abiotic or a bacterial, fungal or viral infection.
  • the invention also relates to plant cells with the exception naturally occurring plant cells, microorganisms (bacteria) and cells of microorganisms that have integrated a unit expression of a protein of interest, said unit comprising the promoter according to the invention.
  • It also relates to plants or parts of plants as well as the seeds which include the plant cells of the invention.
  • the promoter according to the invention comprises the DNA sequence (B) [SEQ ID NO: 4] or a sequence with a degree of homology of at least minus 80% with the sequence (B).
  • the promoter according to the invention comprises, in upstream of the sequence (B), a sequence (C) [SEQ ID NO: 5] or a sequence having a high degree of homology with the sequence (C).
  • the promoter of the invention comprises, upstream of the sequence (B), a sequence (D) [SEQ ID NO: 6] or a sequence with a high degree of homology with the sequence (D).
  • a high degree of homology here means a homology (relation between identical nucleotides and the total number of nucleotides) of at least minus 70%. and preferably at least 80%, sequences of nucleotides, when aligned according to maximum homology, according to the optimal alignment method of the sequences of Needleman and Wunsch. 1970; J. Mol. Biol., 48, 443-453. This method is notably used in UWGCG software from the University of Wisconsin: Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 387-395 - GAP option.
  • This promoter The elements necessary for the operation of this promoter and the expression of its characteristics (transactivating factors, etc.) are present in other plants, dicots or monocots. Their presence therefore allows the use of this promoter in many cultivated plants, such as in particular plants (tobacco, potato, tomato, corn, sunflower, barley and rapeseed) or other plants, such as yeasts and mushrooms.
  • Any DNA sequence encoding proteins of interest can be placed under the control of the promoter according to the invention, in particular sequences coding for proteins which allow protect a plant, for example a plant against viral, bacterial or fungal infections and against other conditions of stress.
  • sequences coding for proteins which allow protect a plant for example a plant against viral, bacterial or fungal infections and against other conditions of stress.
  • tomato-tobacco endochitinases such as that described in EP-A-493 581 whose coding sequence is [SEQ ID NO: 16].
  • the promoter according to the invention was obtained by screening for a tobacco genomic library using a DNA probe having the sequence [SEQ ID NO: 1].
  • a clone corresponding to the sequence [SEQ ID NO: 1] was obtained by differential screening of cDNA clones derived from poly (A) + mRNA, specifically synthesized during the infection of Nicotiana tabacum tobacco leaves by strain of Pseudoaonas solanacearum GMI 1000. This bacterial strain is well known to cause a hypersensitivity reaction on tobacco of the special Bottom variety . For this purpose, one can refer to the work Message et al, 1978. Proc. 4th. Intl. Conf. of plant Pathogenic Bacteria pp. 823-833. The clone containing the sequence [SEQ ID NO: 1] will hereinafter be called "clone 246".
  • Clone 246 then made it possible, by screening a genomic library tobacco to isolate a clone, hereinafter called clone 246 C [SEQ ID NO: 7]. which contains the DNA sequence (D) [SEQ ID NO: 6], the DNA sequence (C) [SEQ ID NO: 5], the DNA sequence (B) [SEQ ID NO: 4] and a sequence containing 2 open reading frames separated by an intron.
  • sequences B + C + D By association of the promoter (sequences B + C + D) with the gene for ⁇ -glucuronidase was obtained, according to the procedure described in section 9 below, the expression vector pSG 123.
  • the promoter consisting of B + C + D sequences is called the 246C promoter.
  • the expression vector pSG 123 was used to test the transient expression in tobacco protoplasts of the glucuronidase gene, said protoplasts being placed under stress either by infection with Pseudomonas solanacearum or by treatment using 'an elicitor or hormone.
  • This binary vector pSG 246 was transferred into cells of Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes, which were then used to obtain transgenic plants of tobacco, rapeseed and sunflower.
  • Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes were then used to obtain transgenic plants of tobacco, rapeseed and sunflower.
  • the expression vector pSG 123 was used for the transformation of monocotyledonous tissues (barley and corn). We studied the behavior of these plants or tissues under stress.
  • the promoter according to the invention comprising the sequence (B), (C) and (D) has also been associated with the gene coding for tomato-tobacco chitinase.
  • the resulting chimeric genes were used to transform Agrobacterium cells .
  • the DNA sequence [SEQ ID NO: 1] can easily be synthesized according to techniques well known to those skilled in the art (L.J. Mac PRIDE and H.M. CARUTHURS Tetrahydron letters (1983) vol. 24: 245).
  • transgenic plants obtained by transformation of plants using Agrobacterium cells obtained above made it possible to demonstrate the basic promoter activity of the promoter according to the invention as well as the overexpression of the proteins of interest ( ⁇ -glucuronidase and chitinase) in stressful situations.
  • the promoter according to the invention has an activity basic promoter which is greatly increased when plants transgenics containing this promoter and a gene coding for a protein of interest, are placed under stress conditions: thermal shock, injury, infection by pathogens (fungi, bacteria), elicitors (biotics and abiotics).
  • the vectors pSG 251 and pSG 33 including the sequences are respectively the sequence (B) (pSG 33) [SEQ ID NO: 4] or the sequence (B) including upstream the sequence (C) (pSG 251) [SEQ ID NO: 5].
  • Plants have defense mechanisms against aggression and especially parasitic aggressions (fungi, bacteria, viruses or insects) ; these mechanisms depend on induction phenomena are little known and often set up too late to be effective. Their early onset (Roby et al. 1988, Physiol. Molec. Plant. Pathol., 33. 409) in particular by elicitor-type compounds in cascade reactions allows the plant to resist assaults.
  • Second generation fungicides active on the defenses of the plant while being inactive on the parasite have already been put on the market.
  • FIG. 1 represents the mapping of the genomic DNA clone 246C, established using the restriction enzymes shown.
  • Figure 2 shows alignment using the alignment method optimal de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol., BIol., 48, 443-453 work by UWGCG software from the University of Wisconsin (Devereux and al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 387-395) GAP option, from part 3 'of 700 bp of the promoter of the 246C gene and of the promoter described by Takahashi and al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8013).
  • FIG. 3 represents the different expression vectors tested comprising, with respect to the full-length plasmid pSG123, a deletion promoter part variable 5 '.
  • Section 1 Nicotiana tabacum tobacco infection with two strains of the pathogenic bacteria Pseudomonas solanacearum
  • the bacteria of the Pseudomonas solanacearum strain are cultivated for 72 h on agar BG medium (Boucher et al. 1985. J. Gen Microbiol 131, 2449); a colony is taken to inoculate 40 ml of the same medium. After 16 to 24 h incubation at 28 ° C. the bacterial suspension is centrifuged for 10 min at 6000 g and 4 ° C; the supernatant is removed while preserving the layer of polysaccharides present on the surface of the pellet. After washing with sterile water, the bacteria are resuspended in 20 ml of water. Their concentration is then determined by densitometry.
  • Young leaves of tobacco plants are detached from the plant. washed with distilled water and immersed in a desiccator containing 1.2 l of bacterial suspension at the concentration of 3 x 10 6 bacteria / ml. The vacuum is created for 10 min using a vacuum pump, then it is slowly broken. Each infiltrated leaf is then placed in a beaker containing 10 mM sodium phosphate buffer pH 6.0 and transferred to a culture chamber. The leaves are removed after different incubation times and stored at - 70 ° C.
  • Section 2 Extraction and isolation of total RNA from Nicotiana tabacum infected with Pseudomonas solanacearum strains
  • the pellet obtained is dissolved in 5 ml of sterile water containing 0.1% of diethylpyrocarbonate (DEPC) then the RNAs are precipitated for 12 h at 4 ° C after addition of 5 ml of 4M LiCl. After a 20 min centrifugation at 6000 g, the RNA pellet is washed with 75% ethanol. dried and taken up in 800 ⁇ l of sterile distilled water containing 0.1% DEPC. The solution is precipitated for 2 h at -20 ° C. after the addition of 0.1 vol of 3M sodium acetate pH 5.5 and 2.5 vol of absolute ethanol.
  • DEPC diethylpyrocarbonate
  • RNA pellet After centrifugation for 15 min at 12,000 g, the RNA pellet is washed with 75% ethanol and dissolved in 200 ⁇ l of distilled water containing 0.1% DEPC. The total RNAs are then assayed by spectrophotometry at 260 nm.
  • Section 3 Preparation of poly (A) + messenger RNAs
  • oligo-d (T) cellulose gel (Collaborative Research Inc.) is resuspended in 2 ml of 10 mM Tris-HCl buffer pH 7.4, 1 mM EDTA, 0.4 M NaCl, 0.1% SDS, This gel is introduced into a Pasteur pipette, the end is plugged with glass wool. The RNA solution is brought to 65 ° C for 4 min and then allowed to cool slowly at ambient temperature. A final concentration of 0.4 M in NaCl is obtained by addition of 5M NaCl solution.
  • RNA solution is then deposited on the oligo-d gel (T) cellulose. This is then rinsed with approximately 12 ml of buffer.
  • composition 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% SDS.
  • the poly (A) + RNAs are then eluted using 7 ml of 10 mM Tris-HCl composition buffer, pH 7.4, 0.1 X SDS, then precipitated overnight at -20 ° C after addition of 2, 5 volumes of 95% ethanol and 0.1 volumes of 3.3 M sodium acetate pH 5.5.
  • the poly (A) + RNA pellet obtained by centrifugation at 35,000 g for 1 h, is washed 3 times with 75% ethanol, dried, taken up in 0.5 ml of sterile distilled water and subjected to a new precipitation under the conditions described above. After centrifugation, the pellet is then washed with 75% ethanol, dried and dissolved in sterile distilled water.
  • the poly (A) + RNAs are then assayed by spectrophotometry at 260 nm.
  • Section 4 Synthesis of double-stranded DNA from poly (A) + messenger RNA isolated from tobacco leaves infected with the GMI 1000 strain of Pseudomonas solanacearum and cloning in E. coli .
  • RNA isolated from tobacco leaves infected with the GMI 1000 strain of Pseudomonas solanacearum and collected 6 h after inoculation are incubated at 44 ° C. for 30 to 60 min in the presence of : Tris HCl 40 mM, pH 8.3, NaCl 80 mM, MgCl 2 6 mM, DTT 5 mM, dATP 0.5 mM, dTTP 0.5 mM, dGTP 0.5 mM, dCTP 0.5 mM, 1, 5 ⁇ g of oligo d (pT) 12-18 and 10 to 15 units of reverse transcriptase of AMV (airplane myeloblastosis virus) in a total volume of 25 ⁇ l.
  • AMV airplane myeloblastosis virus
  • the reaction medium resulting from the synthesis of the first strand is diluted to 100 ⁇ l using the composition buffer Tris HCl 40 mM pH 7.5, MgCl 2 10 mM, NaCl 80 mM; 2 units of RNase H are added and the mixture is incubated at 37 ° C for 5 min.
  • the reaction is stopped by adding EDTA and SDS in concentrations 20 mM and 1% final, respectively, followed by 2 min heating at 60 ° C.
  • the precipitate obtained is washed with 75% ethanol, dried and taken up in sterile water.
  • the cDNA is then treated with nuclease S1 in a total volume of 300 ⁇ l, at 30 ° C. for 10 min, in the presence of 20 U of enzyme in the buffer of composition 30 mM sodium acetate pH 4.4, NaCl 0.25 M, ZnCl 2 1 mM.
  • the mixture is extracted once by a mixture of Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (50-48-2. V: V) then three times with ethyl ether before being subjected to precipitation with ethanol.
  • the DNA precipitate obtained after centrifugation is then dried and taken up in 20 ⁇ l of sterile water.
  • terminal transferase buffer of potassium cacodylate composition 70 mM pH 7.2, CoCl 2 0.5 mM, dithiothreitol 0.5 mM, 2 ⁇ l of ⁇ dCTP 0.25 mM, 5 ⁇ l of ⁇ 32P dCTP (370 MBq / ml), 12 ⁇ l of H 2 O and 1.2 ⁇ l of terminal transferase (18 units).
  • the tailing reaction is carried out by incubation at 37 ° C. for 30 min, then stopped by adding 30 ⁇ l of EDTA, 0.25M pH 8.0.
  • the mixture from dC tailing is precipitated with ethanol and then centrifugal.
  • the cDNA pellet is taken up in 10 ⁇ l of buffer of composition Tris HCl 10 mM pH 7.5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 5% glycerol, 0.02% bromophenol blue. This solution is deposited on a column of Biogel A 0.5 M (1 ml of support). The column is eluted with the 10 mM Tris HCl composition buffer, pH 7.5, 100 mM NaCl, EDTA 1 mM; fractions are collected, their radioactivity measured, and the size of the cDNAs they contain is analyzed by electrophoresis on agarose gel. Fractions containing cDNAs larger than 500 base pairs are combined and the cDNA is precipitated by ethanol.
  • the cDNA collected after precipitation is redissolved in 50 ⁇ l of circularization buffer with 20 mM Tris-HCl composition, pH 7.5. 100 mM NaCl, 1 mM EDTA. 4 ⁇ l of pBR 322-dG solution (21 ng, Clontech) and 46 ⁇ l of water are added.
  • the double-stranded cDNA obtained is inserted at the PstI site of the plasmid pBR 322. After ligation, the DNA obtained is used to transform competent cells of the E. coli HB101 strain. Colonies of recombinant bacteria are obtained after spreading and culture on dish. Petri dishes of transformed competent cells.
  • Section 5 Selection by differential screening of cDNA clones derived from poly (A) + mRNA specifically synthesized during bacterial infection with the strain of Pseudomonas solanacearum GMI 1000.
  • the DNA of the recombinant bacterial colonies obtained by cloning of cDNA synthesized from poly (A) messenger RNA + from tobacco leaves infected with the GMI 1000 strain was transferred onto a Biodyne nylon membrane (Pall Corporation, EUA) following the manufacturer's instructions. These DNAs are successively hybridized using 2 radioactive probes obtained by cDNA synthesis, in the presence of alpha-32P dCTP, from purified messenger RNAs from plants infected with the strains GMI 1000 and GMI 1178 respectively.
  • the bacterial colonies with a stronger hybridization signal with the probe synthesized from leaves inoculated with the strain GMI 1000 are selected.
  • the plasmid DNA of these colonies is prepared, the cDNA inserts of these plasmids are isolated and then labeled with alpha 32-dCTP and are used as a probe to reveal according to the dot-blot technique then Northern blot the equivalent quantities of corresponding mRNA purified from total RNA, tobacco leaves inoculated with the GMI 1000 or GMI 1178 strain.
  • 14 bacterial clones were isolated from the cDNA library constructed from messenger RNA from tobacco leaves infected with the Pseudomonas solanacearum GMI 1000 strain.
  • a clone called 246. having a length 750 base pair insert allows Northern Blot to reveal a transcribed of approximately 800 nucleotides. The accumulation of this transcript begins 4 to 9 hours after inoculation, and reaches a maximum between 12 and 3 p.m. In tobacco leaves infected with the GMI 1178 strain, observe a slight accumulation of the transcript between 12 and 3 p.m.
  • the study of the cDNA sequence of clone 246 [SEQ ID NO: 1] highlights the existence of a first incomplete open reading frame. encoding a peptide of 59 amino acids and a second potential framework encoding a peptide of 88 amino acids. The sequence of these two peptides is represented by [SEQ ID NO: 2]. Between these two reading frames, consensus sequences of intron splicing (Brown, 1986, Nucl. Ac. Res., 14, 9549) are present. There was therefore probably cloning of a cDNA from an immature messenger RNA. The cDNA sequence of clone 246 without the intron is the sequence A 1 [SEQ ID NO: 3].
  • a tobacco DNA genomic library was obtained by partial digestion using the DNA enzyme MboI isolated from germination of Nicotiana tabacum variety NK 326, and cloning of the restriction fragments in the phage EMBL-3 (Clontech ). 500,000 recombinant phages were screened, after spreading at the rate of 10,000 phages per Petri dish according to the technique known to those skilled in the art and described in Sambrook et al (Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • the phage DNA is transferred onto a nitrocellulose membrane (BA 85 Schleicher and Schüll), denatured for 2 min in NaOH solution 0.5 M, 1.5 M NaCl, then soaked in NaCl neutralization solution 1.5 M, Tris HCl 0.5 M pH 7.4 for 5 min. After rapid rinsing in 2 SSC (0.3 M NaCl, 30 mM sodium citrate) the filters are dried 30 min at 37 ° C and the DNA is then fixed by treatment at 80 ° C under vacuum for 1h30.
  • a nitrocellulose membrane BA 85 Schleicher and Schüll
  • the membranes are then prehybridized for 4 h at 37 ° C. in a composition buffer 5 SSC (0.75 M NaCl, 75 mM sodium citrate), 50% formamide, 0.3% skim milk.
  • Hybridization is carried out in the same buffer, for 18 h at 37 ° C. after addition of the probe labeled with alpha 32P-dCTP, consisting of the 750 base pair insert of cDNA clone 246.
  • the membranes are then washed 3 times for 20 min at 37 ° C. in a solution 5 SSC, SDS 0.1%, then 2 times for 30 min at 37 ° C in a 2 SSC solution, 0.1% SDS and finally 30 min at 42 ° C in a 2 SSC solution, 0.1% SDS; they are then autoradiographed.
  • phages are eluted in SM medium (100 mM NaCl, 50 mM Tris HCl, pH 7.5, 5 mM SO4 Mg, gelatin 0.01%) then purified by a new screening carried out in the same conditions.
  • SM medium 100 mM NaCl, 50 mM Tris HCl, pH 7.5, 5 mM SO4 Mg, gelatin 0.01%
  • Section 8 Sequencing and sequence analysis of the genomic DNA clone 246C
  • This insert called 246C genes, of 3046 base pairs, is consisting of an 853 bp coding region starting with an ATG in position 2146 and terminated by a TGA codon at position 2998; this region is interspersed with an intron beginning at position 2464 and ending in position 2653.
  • Three potential sites for initiating transcription were determined by primer extension according to the technique described in Sambrook et al. (opus cited, 1989), the most likely site is in position 2068.
  • the promoter region of the 246C gene upstream of position 2146 is called promoter 246C.
  • Study of the 246C promoter sequence shows the presence of several reasons known to be involved in the gene regulation.
  • Two TATAA consensus sequences are present at positions 2089 and 2111 as well as an AATAT complementary sequence at position 2020. These three patterns are all located between 10 and 50 base pairs downstream of the CAAT assets and 30 to 50 base pairs upstream of the potential transcription.
  • TGACG sequence has been identified at position 1950; this sequence demonstrated in the CaMV 35S promoter, seems responsible for the expression of chimeric genes in the roots and in the leaves (LAM et al. 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86, 7890).
  • HSE Heat Shock Elements
  • TTCNNTTCNNGAANNGAA Three regions show significant homogeneity with the patterns HSE (Heat Shock Elements) of plants (GURLEY and KEY, 1991, Biochemistry, 30. 1). These regions are homologous with the consensus sequence GAANNGAANNTTCNNTTC or TTCNNTTCNNGAANNGAA; they are close to the boxes TATA and CAAT and duplicated [SEQ ID NO: 17 and NO: 18].
  • FIG. 2 shows the alignment of the DNA sequence of this promoter [SEQ ID NO: 9, 10 and 11] (top line) with the part corresponding to the DNA sequence of the promoter of the invention [SEQ ID NO: 12 and 13] (bottom line).
  • Section 9 Construction of the expression vector pSG123 associating the promoter of the 246C gene to the ⁇ -glucuronidase gene.
  • the plasmid pBI 101.3 (Clontech) is digested with the enzymes HindIII and EcoRI; the fragment of approximately 2100 base pairs, containing the ⁇ -glucuronidase gene encoded by the uidA locus of E. coli , followed by the terminator of the nopaline synthase of Agrobacterium tumefaciens, is ligated in the plasmid pUC 19, open to the same sites, giving a plasmid called plasmid pBI 201.3.
  • the HindIII-BalI insert carrying the promoter sequences of the gene 246C is cloned into the plasmid pBI201.3 open to the HindIII and Smal.
  • the vector obtained called pSG 123 therefore contains the gene for glucuronidase under the control of the promoter of the 246C gene.
  • the sequence nucleotide of the complete chimeric gene is the sequence [SEQ ID NO: 14].
  • Section 10 Protocol of transient expression in protoplasts tobacco of the glucuronidase gene under the control of promoter of the 246C gene.
  • Leaves from tobacco plants ( Nicotiana tabacum , var Samsun NN), 4 to 5 weeks old are removed, cut into strips and incubated in TO medium (Table 1, adapted from Chupeau et al., 1974, CR Acad Sci ( Paris), 278 D, 1565) containing 1 g / liter of cellulase R 100 Onozuka, 200 mg / l of macerozyme Onozuka (Yakult Honsha, Nishinoniya, Japan) and 500 mg / l of pectolyase Y23 (Sheishin Pharmaceutical Ind. Japan) for 3 p.m. at 22 ° C.
  • the protoplasts are separated from the cell debris by sieving on a 85 ⁇ m mesh nylon sieve followed by centrifugation for 5 min at 50 g on a 19% sucrose solution (weight / volume).
  • the protoplasts floating on this medium are washed once in the TO medium, counted and their number adjusted to the density of 1.5 ⁇ 10 6 protoplasts / ml.
  • the E. coli strain containing the vector pSG 123 is cultured on Luria medium (Gibco) containing 50 mg / l of ampicillin. Amplification of the plasmid is carried out according to the protocol described in Sambrook et al., 1989 (opus cited). The plasmid pSG 123 is then purified by centrifugation on a cesium chloride gradient and by two successive precipitations with ethanol. The plasmid pellet is then redissolved in 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0.
  • the protoplast suspensions (320 ⁇ l per aliquot) are incubated at 45 ° C for 5 min, then quickly cooled on ice. Then 50 ⁇ g of plasmid pSG123, 160 ⁇ l of a polyethylene glycol solution (40% polyethylene glycol, 0.4 M mannitol, 30 mM MgCl 2 , 0.1% My pH 5.8) are then added. After 10 min, the protoplasts are collected by centrifugation and resuspended by gentle agitation in 500 ⁇ l of T0 buffer and incubated in the dark & 28 ° C.
  • a polyethylene glycol solution 50% polyethylene glycol, 0.4 M mannitol, 30 mM MgCl 2 , 0.1% My pH 5.8
  • protoplasts are lysed after addition of 50 ⁇ l of 10X extraction buffer for ⁇ -glucuronidase per freezing at -80 ° C followed by thawing at 37 ° C (Jefferson, 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5, 387).
  • the supernatant obtained after centrifugation at 10,000 g is used to measure ⁇ -glucuronldase activity by fluorimetry (Jefferson, 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5, 387).
  • the quantity of proteins present in the extracts is measured according to the Bradford method using the Bio Rad kit (Bio Rad. Lab.).
  • Composition of TO medium for 1 liter) NH 4 NO 3 825 mg K NO 3 950 mg CaCl 2 , 2H 2 O 220 mg Mg SO 4 , 7H 2 O 185 mg KH 2 PO 4 85 mg H 3 BO 3 1 mg Mn SO 4 , 4H 2 O 100 ⁇ g Zn SO 4 , 7H 2 O 1 mg Kl 100 ⁇ g AlCl 3 30 ⁇ g NiCl 2 , 6H 2 O 30 ⁇ g CuSO 4 , 5H 2 O 30 ⁇ g Fe SO 4 , 7H 2 O 27.8 mg Na 2 EDTA, 2H 2 O 37.2 mg thiamin 100 ⁇ g Ac.
  • MES ethanesulfonic acid
  • Section 11 Transient expression of the glucuronidase gene under the control of the promoter of the 246C gene in tobacco protoplasts infected with Pseudomonas solanacearum.
  • This transient expression is measured after incubation for 24 h of the protoplasts prepared according to the above protocol in the TO medium (described in section 10) containing a suspension of bacteria Pseudomonas solanacearum (10 bacteria / protoplast) obtained as described in section 1.
  • ⁇ -glucuronidase activity is expressed in pmoles of methylumbelliferone formed / min / mg protein.
  • the promoter of the 246C gene therefore allows basal expression important of the glucuronidase gene, expression more important than that ordered by the CaMV 35S promoter, which serves here as a control.
  • This promoter also has strong inducibility since ⁇ -glucuronidase expression increases by 40% after infection with the bacterial strain GMI 1000.
  • Section 12 Transient expression of the glucuronidase gene under control of the promoter of the 246 C gene of protoplasts tobacco treated by an elicitor (heptasaccharides chitin) or a hormone.
  • Expression is measured after incubation of protoplasts for 24 h as described above in the TO medium containing an elicitor at the concentration of 25 ⁇ M or a hormone, 2-4-D (2-4 acid dichlorophenoxyacetic) at a concentration of 4 ⁇ M.
  • the elicitors used are chitin heptasaccharides having the property of inducing defense reactions in plants (Roby et al., 1987, BBRC, 143, 885).
  • Protoplasts which have received DNA from the vector pSG 123 have an activity of 450 pmol / min / mg of protein; this activity is increased 50% if the protoplasts are treated with the 2-4-D hormone and 70% if the protoplasts are treated with chitin heptasaccharide.
  • Section 13 Construction of a stable expression vector in plant cells: the binary vector pSG246
  • the vector obtained is cloned into the strain E. coli DH5 ⁇ .
  • Section 14 Transfer into Agrobacteriu m of the plasmid pSG246 containing the ⁇ -glucuronidase under the control of the promoter of the tobacco 246C gene
  • Competent cells of Agrobacterium tumefaciens (strain LBA 4404, Clontech) are prepared by rapid cooling in ice of a culture in the exponential growth phase. The bacteria are then resuspended in 20 mM CaCl 2 . Aliquots of this suspension are distributed in Eppendorf tubes, then frozen in liquid nitrogen.
  • plasmid pSG246 1 ⁇ g of plasmid pSG246 is added to the frozen cells, contained in an Eppendorf tube. The suspension is then incubated at 37 ° C for 5 min; 1 ml of Luria medium (Gibco) is then added and the tube is incubated at 28 ° C for 4 h. Aliquots are spread on Petri dishes containing a minimum agar medium, described in Plant Molecular Biology Manual (op. Cited) in the presence of 100 mg of rifan-picine and 25 mg / l of kanamycin. Under these conditions, only the colonies of Agrobacterium tumefaciens which have integrated the plasmid pSG246 grow. These contain the chimeric gene in a context allowing its replication.
  • the resistance to the two antibiotics of the selected colonies is checked by subculturing them on the same selection medium twice in succession.
  • the presence of the chimeric gene associate the promoter 246 C with the coding part of ⁇ -glucuronidase in Agrobacterium tumefaciens is verified by the method of Southern Blot on a preparation of total DNA (Lysis of cells, purification of DNA by extraction with using the phenol / chloroform mixture, according to the protocol described by Gelvin in the work cited above, cutting the purified DNA using restriction enzymes, electrophoresis on agarose gel, transfer to membrane and hybridization according to techniques well known to those skilled in the art).
  • Section 15 Obtaining tobacco plants transformed with Agrobacterium tumefaciens containing the plasmid pSG246.
  • Nicotiana tabacum tobacco grown in vitro was infected with Agrobacterium tumefaciens containing the plasmid pSG246 according to the procedure of Horsch et al., Well known to those skilled in the art (Horsch RB et al., 1985, Science 227, 1229-1231) , the main steps of which are set out below.
  • Discs of leaves of axenic tobacco plants Nicotiana tabacum are incubated in a culture of A. tumefaciens hosting the plasmid pSG246.
  • the discs drained on Whatman paper are transferred to culture media in Petri dishes in order to multiply the transformed cells so as to obtain calluses (Murashige and Skoog, 1962, Physiol., Plant., 15, 473), then produce buds in the presence of cefotaxime (500 ⁇ g / ml) intended to eliminate Agrobacterium tumefaciens and kanamycin (100 ⁇ g / ml).
  • the kanamycin-resistant buds were then transferred on a medium allowing the induction of the roots in the presence of carbenicillin and kanamycin.
  • the seedlings are then transplanted in terrines in a substrate composed of peat and potting soil and grow in a greenhouse. All transformed plants (RO generation) having survived the stages of greenhouse regeneration and acclimatization shown to be morphologically normal and fertile. They have been self-fertilized and gave seeds (generation R1).
  • Section 16 Analysis of the genomic DNA of tobacco plants transformed by Agrobacterium tumefaciens containing the plasmid pSG246 (generation RO), according to the technique of Southern Blot.
  • High molecular weight tobacco genomic DNA was isolated from from mature leaves of transgenic plants of the RO generation according to the extraction method using bromide cetyltrimethylammonium and purification by precipitation, described in the work "Plant Molecular Biology Manual” already cited.
  • a localized bacterial infection is carried out by depositing a drop of bacterial suspension of Pseudomonas solanacearum (3 ⁇ l containing 3 ⁇ 10 5 bacteria obtained as described in section 1) on a wound obtained by perforating a sheet using a syringe needle.
  • the 246C promoter is activated around the lesion created by Infection and also in all parts of the infected plant (inoculated leaf, upper leaves and lower leaves of the plant and roots). This systemic activation occurs as soon as first hours after Inoculation.
  • 20 mm diameter leaf discs from plants expressing the construction pSG246 are placed in survival on an appropriate liquid medium.
  • On each of these discs is placed an agar cube of approximately 5mm side and containing mycelium of Sclerotinia Sclerotiorum .
  • Glucuronidase activity measured as a function of time, reveals that the presence of mycelium induces glucuronidase activity after 7 hours of contact. After 24 hours, the activity is multiplied by 4 compared to that of leaf discs not brought into contact with the mycelium.
  • the same experiment carried out on leaf discs obtained from control tobaccos (not expressing the construction pSG246) reveals only a glucuronidase activity comparable to a background noise.
  • Two types of elicitor were used, one of the biotic type corresponding to molecules derived from molecules or macromolecules natural, the other of abiotic type corresponding to molecules chemical.
  • the growers used are harp which is a protein isolated from Erwinia amylovora and a protein isolated from the culture supernatant of Pseudomonas solanacearum.
  • protein elicitors such as cryptogeine isolated from Pseudomonas cryptogea and capsicin isolated from Pseudomanas capsict (Ricci et al. 1989, Eur. J. Biochem. 183; 555-563) were tested.
  • induction activity in all cases is induced by the presence of elicitor in a ring of approximately 5mm immediately adjacent to the infiltration zone. The stimulation is very apparent 24 hours after the infiltration but visible from 6 a.m. Activity after 24 hours is often multiplied by 5 to 6 compared to those of control plants (plants expressing the construction pSG246 but without elicitors injected under the epidermis).
  • Tobacco leaves expressing the construction pSG246 and detached of the plant are immersed in solutions of concentration 1 to 10 ⁇ g / ml salicylic acid or 0.025 to 0.25 mM copper sulfate.
  • glucuronidase activity is multiplied by 5 after 6 hours and by 10 after 24 hours.
  • glucuronidase activity is multiplied by 17 at 0.025 mM and 11 at 0.25 mM when compared to plant leaves untreated witnesses.
  • auxin in the form of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) was performed at concentrations of 1.5 and 10 ⁇ M.
  • Glucuronidase activity is measured at the onset of symptoms of the disease, approximately 15 days after inoculation.
  • Tobacco plants, generation R1, containing the construction pSG246, about 5 weeks old and previously selected for their resistance to kanamycin are transferred for 2 or 4 h in an enclosure at 40 ° C in order to cause a thermal shock.
  • the plants are immediately frozen in liquid nitrogen and their ⁇ -glucuronidase activity determined over the whole of the part Aerial.
  • plants containing the pSG246 construct have a strong increase in glucuronidase activity after heat shock; the average stimulation factor, determined on several plants, is close to 12.
  • Section 18 Obtaining rapeseed plants transformed by Agrobacterium rhizogenes containing the plasmid pSG246.
  • Stem segments are taken from the apex of rapeseed plants ( Brassica napus : spring varieties Brutor and Westar and winter variety) about 1 m high. These segments are surface sterilized, rinsed in sterile water, cut into segments approximately 1.5 cm long and placed in a tube containing medium A.
  • the end of this segment is inoculated by depositing a suspension of the Agrobacterium rhizogenes strain containing the plasmid psG 246.
  • Transformed roots appear on the stem segment at after 1 to 2 weeks, they are removed and placed on medium B agar (15 g / l) and supplemented with 500 ⁇ g of cefotaxime / ml.
  • Root fragments are incubated for 15 days in medium D containing 3 mg / l of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, then placed on the RCC medium for induction of buds. Rooted plants are then obtained by passing the buds over media F and G.
  • the leaves of R1 generation rapeseed plants, containing the glucuronidase under the control of the 246C promoter were excised or excised and lacerated.
  • R1 generation rapeseed plants having the construction pSG246, are cultivated for about 3 weeks in pots on potting soil. The plants are then inoculated locally using a spore suspension (10 ml, containing 1000 spores obtained after culture on the PDA agar medium) of the pathogenic fungus Alternaria brassicae , deposited on a wound produced using a needle. A necrosis then develops around this wound.
  • a strong stimulation of glucuronidase activity is then observed (detected by test using X-gluc, Section 17e) in the sheet inoculated, around the necrotic area.
  • Root pest Rhizoctonia solani
  • R1 generation rapeseeds transformed by the construction pSG246 are sown on a substrate made of a mixture of peat, vermiculite and sand (10: 10: 5. v: v) contained in a 1 liter pot.
  • the seeds are covered with a layer of 1 cm of substrate containing 10 000 viable propagules of Rhizoctonia solani per gram. These propagules are obtained by culture for 15 days of a strain of Rhizoctonia in a Roux flask on rice grains, followed by grinding to a particle size less than 1 mm.
  • rapeseed plants are attacked at the root level.
  • R1 generation rapeseed plants containing the construction pSG246, about 5 weeks old, are transferred for 2 or 4 h in an enclosure at 40 ° C to cause thermal shock.
  • the plants are immediately frozen in liquid nitrogen and their ⁇ -glucuronidase activity determined over the whole of the part Aerial.
  • plants containing the pSG246 construct have a strong increase in glucuronidase activity after heat shock; the average stimulation factor, determined on several plants, is close to 12.
  • Section 20 Obtaining sunflower calluses transformed with Agrobacterium rhisogenes containing the plasmid pSG246.
  • Sunflower hypocotyls are obtained by germination for 7 10 days of seeds on vermiculite. These seeds are placed in a culture chamber, the conditions 16 h of lighting at 20 ° C / 8 h darkness at 17 ° C. The hypocotyls are surface sterilized, rinsed in sterile water and placed in a tube containing medium Murashige and Skoog, whose concentration of macroelements is reduced by half.
  • the end of this segment is inoculated by depositing a suspension of the Agrobacterium rhisogenes strain containing the plasmid pSG246.
  • Transformed roots appear after a month, they are taken and placed on agar medium B (15 g / l) and supplemented per 500 ⁇ g cefotaxime / ml for 4 weeks with transplanting weekly. They are then cultivated in the same liquid medium in shaking (100 rpm) and transplanted every month. The passage of these roots in medium D, allows the formation of calluses from transformed roots.
  • the glucuronidase activity of the roots cultivated in liquid medium B and of calli cultivated on medium D estimated by fluorimetry, has very high values, ranging between 10 4 and 10 5 pmoles of methylumbelliferone formed / min / mg of proteins.
  • Section 21 Transient expression of the glucuronidase gene under 246C promoter control in embryos immature sunflower.
  • Immature embryos of mother plants in the field of genotype 105 were collected and cultured for 14 days on medium I (Table 3) at 25 ° C and in the dark. These embryos are then cultivated for 3 days on Mileu II at 25 ° C under a photoperiod of 16 hours per day / 8 hours per night. About twenty embryos are then placed side by side on the middle III.
  • Plasmid DNA is adsorbed on tungsten microparticles at a rate of 4 ⁇ g / mg of tungsten. 2.5mg of tungsten / DNA mixture are then deposited on a macroprojectile which is accelerated by the explosion of a cartridge.
  • Macroprojectile crushing on a stop plate pierced with a hole projects tungsten microparticles and DNA into cells.
  • Counting the number of blue cells obtained per box of Petri dish during a transient expression experiment allows count the number of transformed cells and estimate the expression of the chimeric construction tested.
  • the transient expression measured using the substrate X-gluc., 48 hours after the bombardment using the microparticle cannon shows that the ⁇ -glucuronidase gene is expressed in embryos immature sunflower.
  • the intensity is stronger than that induced by the use of plasmid pBI221 (Clontech), in which the glucuronidase gene is placed under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter.
  • the number of transformed cells expressing the gene for glucuronidase under the control of the promoter of the 246C gene is close to 140 per box (average value of 4 experiments) while the number of transformed cells is 60 per box (average value of 4 experiments) in the presence of the plasmid pBI221 in which the gene for glucuronidase is placed under the control of the 35 S promoter of the cauliflower mosaic.
  • the embryos are then drained on sterile filter paper, then returned to culture on medium II in the dark for 3 days.
  • the embryos are then briefly rinsed with Murashige and Skoog medium liquid (Murashige and Skoog, 1962, Physiol. Plant 15: 473) containing 500 mg / l of the cefotaxime antibiotic. They are then drained on sterile filter paper and cultured on medium III containing 250 mg / l cefotaxime. 250 mg / l of carbenicillin and 50 mg / l of paromomycin. This culture is carried out at 25 ° C. under a photoperiod of 16 h day / 8 h night; plant tissues are transplanted every 21 days on this same medium.
  • the newly formed buds from these tissues are transferred to medium IV, under the same temperature and photoperiod conditions.
  • the rooted plants are then grown in the greenhouse.
  • Section 22 Expression of ⁇ -glucuronidase, under the control of the promoter 246C in transformed Sunflower plants.
  • Plants expressing the construction pSG246 have an expression of glucuronidase at least equal to that obtained with plants transformed using the construction pBI121.
  • nicotinic 1 - 1 0.5 0.5 Thiamine HCl 10 10 0.1 0.1 Pyridoxine HCl 1 1 0.1 0.5 Myo-inositol 4000 4000 100 100 L-glycine - - - 2 L-alanine 1000 1000 - - L-glutamine 800 800 - - L-serine 160 160 - - L-tryptophan 50 50 - - L-cysteine 10 10 - - Ca-D-pantothenate - - 0.8 - Ac. folic - - 0.1 - Chl.
  • Section 23 Protocol of expression in monocot tissues of the ⁇ -glucuronidase gene, under the control of the promoter 246C
  • GERBEL barley genotype seeds are germinated in a greenhouse on vermiculite. After 7 days, the leaves and roots were removed and placed on a Petri dish containing medium Murashige and Skoog agar for transient expression experiments.
  • Immature corn embryos are removed 10 to 14 days after pollination from mother plants (line LH132) grown in the greenhouse. The embryos are placed on the embryonic axis side in contact with the medium induction (composition given in table 4 below) then on the maintenance medium (Table 5), 3 weeks later. Calls obtained are transplanted every week. Expression experiences transient are carried out a few hours after transplanting.
  • Plasmid DNA is adsorbed on tungsten microparticles at a rate of 4 ⁇ g / mg tungsten. 2.5 mg of tungsten / DNA mixture are then deposited on a macroprojectile which is accelerated by the explosion of a cartridge.
  • Macroprojectile crushing on a stop plate pierced with a hole projects tungsten microparticles and DNA into cells.
  • Section 24 Transient expression of the ⁇ -glucuronidase gene under 246C promoter control in barley tissue and corn calluses
  • the transient expression measured using the X-gluc substrate, 48 hours after the bombardment using the microparticle cannon shows that the ⁇ -glucuronidase gene is expressed in the leaves and barley roots and also in corn calluses.
  • the intensity of the expression is as strong as that induced by the use of the plasmid pBI 221 (Clontech), in which the gene for glucuronidase is placed under the control of the 35S promoter of the cauliflower mosaic.
  • the promoter of the tobacco 246C gene is therefore capable of directing gene expression in monocots.
  • Section 25 Construction of a plasmid placing the chitinase gene tomato-tobacco under the control of the inducible promoter and expression of it in tobacco
  • the plasmid pSG123 described above is digested using the endonucleases Hind III and Sca I. After electrophoresis on agarose gel, the Hind III - Sca I fragment of 2088 base pairs containing all of the inducible promoter with the exception of the 57 base pairs located immediately upstream of the ATG is purified.
  • the promoter sequence was ligated using DNA ligase T4 (cf. above) the sequence coding for chitinase and the sequence terminator. in the binary vector pBIN 19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res., 12, 8711-8721), opened using the endonucleases Hind III and EcoRI.
  • This vector carries two genes for resistance to kanamycin, one can be expressed in bacteria, the other located immediately in upstream of the complete recombinant gene which can be transferred to cells plant.
  • the vector obtained is cloned into the strain E. coli HB 101 (Clontech).
  • Nicotiana tabacum tobacco cultivated in vitro was infected with Agrobacterium tumefaciens containing the plasmid pBR 20 according to the procedure of Horsch et al., Well known to those skilled in the art (Horsch RB et al., 1985 Science 227, 1229-1231) , the main steps of which are set out below.
  • Discs of leaves of axenic tobacco plants Nicotiana tabacum (variety Wisconsin Havana 38) are incubated in a culture of A. tumefaciens hosting the plasmid pBR 20.
  • the discs drained on Whatman paper are cultured on culture media in boxes of Petri in order to multiply the transformed cells so as to obtain calluses.
  • These calluses are then transferred to medium containing cefotaxime at 500 mg / ml intended to decontaminate plant tissues (elimination of Agrobacterium tumefaciens ) and kanamycin at 100 mg / ml to select the transgenic material.
  • the crude protein extracts were prepared from different plant tissues (root, stem, leaf, etc.).
  • the tissue fragments were frozen in liquid nitrogen, reduced to powder and stored at -20 ° C.
  • the powder was extracted at 4 ° C in the presence 0.1 M ammonium acetate buffer pH 5.2 and subjected to centrifugation at 10,000 g.
  • the concentration of total protein was determined on the supernatants, hereinafter called the crude extracts of proteins using the Bradford technique (Bradford, M.M., 1976 Anal. Biochem., 72, 248-254).
  • the crude protein extracts are subjected to a Western blot, technique well known to those skilled in the art and described by H. Towbin et al. (Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 76, 1979, 4350-4354).
  • the immunodetection of the protein of interest is carried out thanks to a immuniserum containing polyclonal antibodies recognizing the protein hybrid with chitinase activity (cf. EP-493 581, section 5).
  • the antigen-antibody complex is then revealed using a streptavidin-biotin system conjugated to alkaline phosphatase with Amersham RPN 23 kit ("Blotting detection kit”), used according to manufacturer's instructions.
  • the print obtained shows, for the leaves of tobacco plants transformed by the plasmid pBR 20, the presence of a weight protein apparent molecular of about 26 ⁇ 6kDa recognized by the antibodies polyclonal and absent from the leaves of control tobacco plants.
  • This protein has the same apparent molecular weight as the hybrid protein to chitinase activity described in application EP-493,581.
  • the vectors pSG 251 and pSG 33 corresponding respectively to the promoters comprising the sequence (B) [vector pSG 33] and the sequence (C) [vector pSG 251] respectively.
  • the chimeric gene associating the promoter (complete or truncated) with the coding part of the glucuronidase and the NOS terminator was purified on agarose gel after cleavage with restriction endonucleases Hind III and EcoRI.
  • the chimeric gene has been introduced and ligated into the binary vector pBIN19 (Clontech) previously opened at Hind III sites and EcoRI (Section 13).
  • Nicotiana tabacum cultivated in vitro was infected with Agrobacterium tumefaciens containing the various constructs described above. The procedure followed is that described in Section 15.
  • the glucuronidase activity is the average of the measurements carried out on 10 to 20 independent transformants. In the absence of an inducer, the activity basic glucuronidase of different genotypes is not significantly affected by deletions for constructs ranging from pSG251 to pSG451: it is substantially identical to that of genotypes containing construction pSG123 (fig. 3). On the other hand, for pSG2 constructions, pSG24, pSG3, pSG1, the expression is lower as the length of the promoter is short: the expressions for pSG3 and pSG1 being zero.
  • the expression is however unchanged for genotypes containing the constructions pSG29 and pSG23 with respect to the genotypes containing the constructions pSG123.
  • the inducibility is systematically lower than that of genotypes containing the pSG123 construction: it is all the more weak that the promoter is short and cancels for plants containing the constructions pSG3 and psG1.
  • sequence D [SEQ. ID No. 6] includes "silencer" type information which partially inhibits inducibility of the complete promoter (sequences B + C + D).

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Description

La présente invention a pour objet un nouveau promoteur végétal et les microorganismes et cellules végétales contenant une unité d'expression d'une protéine d'intérêt comprenant ledit promoteur. Le promoteur selon l'invention est un promoteur constitutif fort permettant une expression de ladite protéine dans les microorganismes et les cellules végétales quelque soit le stade de développement du végétal.
De plus, le promoteur selon l'invention trouve une application particulière dans le domaine de la protection des végétaux par génie génétique et notamment celui de la défense des plantes en état de stress.
Au cours des dernières années, les applications de la transformation des végétaux se sont multipliées. De nombreux gènes d'origine procaryote ou eucaryote (animale ou végétale) codant notamment pour des protéines conférant lors de leur expression un caractère agronomique nouveau, ont été isolés puis transférés aux plantes.
Dans de très nombreux cas, les gènes qui ont été introduits par génie génétique dans les plantes, sont chimériques, associant des éléments de régulation de différentes origines. C'est ainsi que très souvent le gène codant pour une protéine d'intérêt est placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif fort permettant une expression de ladite protéine dans toute la plante (ou la majeure partie de celle-ci) durant toute sa vie, quel que soit le stade de développement. Le promoteur du transcrit 35S du virus de la mosaïque du choux-fleur (35S CaMV), le plus utilisé dans les constructions de gènes chimériques, correspond à cette description.
Or pour un certain nombre d'applications, il n'est pas nécessaire que le gène codant pour la protéine d'intérêt, support du caractère agronomique, ait une expression continue ou répartie dans toute la plante. De telles caractéristiques peuvent même dans certains cas amoindrir ou annuler les effets bénéfiques du gène transféré. En effet, l'expression continue à un niveau élevé d'une protéine peut détourner une partie du métabolisme vers cette expression, et finalement entraíner une perte de rendement.
Très tôt, la recherche d'une expression génique plus spécifique a été engagée ; elle a conduit par exemple à isoler des promoteurs tissus- ou organes-spécifiques.
Il peut être intéressant d'induire l'expression d'un gène donné uniquement dans une situation précise, ou mieux d'assurer un niveau d'expression de base tout au long de la vie d'un végétal, tout en permettant la surexpression du gène dans une situation donnée.
Plusieurs promoteurs inductibles ont déjà été décrits, certains répondant à la fois à l'infection par des microorganismes pathogènes et à des composés chimiques ou des hormones végétales comme l'éthylène (Roby et al, 1990, Plant Cell 2, 999) ou l'auxine.
Un promoteur végétal isolé du tabac a été décrit par Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 8013-8016.
Ces auteurs, dans une autre publication précisent que ce promoteur ne réagit spécifiquement qu'aux auxines et non aux autres hormones ou aux stress (Takahashi et al., The Plant Journal, 1991, 1(3), 327-332).
La présente invention a pour objet un promoteur, qui s'exprime à un niveau soutenu dans les différents organes et tissus d'un végétal et notamment les racines et le méristème d'une plante et qui est très fortement inductible dans les situations de stress, telles que notamment après un choc thermique, une blessure, un choc hormonal, un éliciteur biotique ou abiotique ou une infection bactérienne, fongique ou virale.
L'invention concerne également les cellules végétales à l'exception de cellules végétales présentes à l'état naturel, les microorganismes (bactéries) et les cellules de microorganismes ayant intégré une unité d'expression d'une protéine d'intérêt, ladite unité comprenant le promoteur selon l'invention.
Elle a également pour objet les végétaux ou parties de végétaux ainsi que les semences qui comprennent les cellules végétales de l'invention.
Enfin, elle concerne aussi l'utilisation d'un végétal ou d'une partie d'un végétal ci-dessus pour sélectionner des molécules à activité phytosanitaire susceptibles d'induire des réactions de défense naturelles des végétaux contre les agressions d'organismes phytopathogènes ou phytophages (champignons, bactéries, virus, insectes et nématodes).
Le promoteur selon l'invention comprend la séquence d'ADN (B) [SEQ ID NO : 4] ou une séquence présentant un degré d'homologie d'au moins 80% avec la séquence (B).
Selon une variante, le promoteur selon l'invention comporte, en amont de la séquence (B), une séquence (C) [SEQ ID NO : 5] ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (C).
Enfin, selon une variante préférée de l'invention, le promoteur de l'invention comporte, en amont de la séquence (B), une séquence (D) [SEQ ID NO : 6] ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (D).
Un degré d'homologie élevé. signifie ici une homologie (rapport entre les nucléotides identiques et le nombre total de nucléotides) d'au moins 70 %. et de préférence d'au moins 80 %, des séquences de nucléotides, lorsqu'elles sont alignées d'après l'homologie maximale, selon la méthode d'alignement optimal des séquences de Needleman et Wunsch. 1970; J. Mol. Biol., 48, 443-453. Cette méthode est notamment utilisée dans le logiciel UWGCG de l'Université du Wisconsin : Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 387-395 - option GAP.
Les éléments nécessaires au fonctionnement de ce promoteur et à l'expression de ses caractéristiques (facteurs transactivateurs, etc) sont présents dans d'autres végétaux, dicotylédones ou monocotylédones. Leur présence permet donc l'utilisation de ce promoteur dans de nombreux végétaux cultivés, tels que notamment les plantes (tabac, pomme de terre, tomate, maïs, tournesol, orge et colza) ou d'autres végétaux, tels que les levures et les champignons.
Toutes séquences d'ADN codant pour des protéines d'intérêt peuvent être placées sous le contrôle du promoteur selon l'invention, en particulier des séquences codant pour des protéines qui permettent d'assurer la protection d'un végétal, par exemple une plante contre les infections virales, bactériennes ou fongiques et contre les autres états de stress. A titre d'exemples de telles protéines, on peut citer notamment les endochitinases de tomate-tabac, telles que celle décrite dans EP-A-493 581 dont la séquence codante est [SEQ ID NO : 16].
Le promoteur selon l'invention a été obtenu par criblage d'une banque génomique de tabac à l'aide d'une sonde d'ADN ayant la séquence [SEQ ID NO : 1].
Un clone correspondant à la séquence [SEQ ID NO : 1 ] a été obtenu par screening différentiel de clones d'ADNc issus d'ARNm poly(A)+, spécifiquement synthétisés au cours de l'infection de feuilles de tabac Nicotiana tabacum par la souche de Pseudoaonas solanacearum GMI 1000. Cette souche bactérienne est bien connue pour provoquer une réaction d'hypersensibilité sur le tabac de la variété Bottom spécial. A cet effet, on peut se référer à l'ouvrage Message et al, 1978. Proc. 4th. Intl. Conf. of plant Pathogenic Bacteria pp. 823-833. Le clone contenant la séquence [SEQ ID NO : 1] sera dénommé ci-après "clone 246".
Le clone 246 a permis ensuite, par criblage d'une banque génomique de tabac d'isoler un clone, dénommé ci-après clone 246 C [SEQ ID NO : 7]. qui contient la séquence d'ADN (D) [SEQ ID NO : 6], la séquence d'ADN (C) [SEQ ID NO : 5 ], la séquence d'ADN (B) [SEQ ID NO : 4 ] et une séquence renfermant 2 cadres de lectures ouverts séparés par un intron.
Par association du promoteur (séquences B+C+D) avec le gène de la β-glucuronidase on a obtenu, selon le mode opératoire décrit a la section 9 ci-après, le vecteur d'expression pSG 123. Le promoteur constitué des séquences B+C+D est appelé promoteur 246C.
Le vecteur d'expression pSG 123 a été utilisé pour tester l'expression transitoire dans des protoplastes de tabac, du gène de la glucuronidase, lesdits protoplastes étant mis en situation de stress soit par infection par Pseudomonas solanacearum soit par traitement à l'aide d'un éliciteur ou d'une hormone.
A partir du vecteur d'expression pSG 123 on a préparé, selon le mode opératoire décrit à la section 13, un vecteur d'expression stable dans les cellules végétales, le vecteur binaire pSG 246.
Ce vecteur binaire pSG 246 a été transféré dans des cellules d'Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes, lesquelles ont été utilisées ensuite pour obtenir des plantes transgéniques de tabac, de colza et de tournesol. Pour la transformation des tissus de monocotylédones (orge et maïs) le vecteur d'expression pSG 123 a été utilisé. On a étudié le comportement de ces plantes ou tissus en état de stress.
Le promoteur selon l'invention, comprenant la séquence (B), (C) et (D) a aussi été associé au gène codant pour la chitinase tomate-tabac. Les gènes chimériques résultants ont été utilisés pour transformer des cellules d'Agrobacterium.
La séquence d'ADN [SEQ ID NO : 1] peut aisément être synthétisée selon les techniques bien connues de l'homme de métier (L.J. Mac PRIDE et H.M.CARUTHURS Tetrahydron letters (1983) vol. 24 : 245).
L'étude des plantes transgéniques obtenues par transformation de plantes à l'aide de cellules d'Agrobacterium obtenues ci-dessus a permis de mettre en évidence l'activité promotrice de base du promoteur selon l'invention ainsi que la surexpression des protéines d'intérêt (β-glucuronidase et chitinase) dans des situations de stress.
Les résultats figurant dans la partie illustrative ci-après montrent clairement que le promoteur selon l'invention a une activité promotrice de base qui est fortement augmentée lorsque les plantes transgéniques contenant ce promoteur et un gène codant pour une protéine d'intérêt, sont placées dans des conditions de stress : choc thermique, blessure, infection par des pathogènes (champignons, bactéries), éliciteurs (biotiques et abiotiques).
Par différentes délétions du plasmide pSG 123, effectuées dans la région 5' du promoteur à l'aide d'enzymes de restriction et/ou de la nucléase Exo3 on a mis en évidence les vecteurs pSG 251 et pSG 33 dont les séquences sont respectivement la séquence (B) (pSG 33) [SEQ ID NO : 4 ] ou la séquence (B) comportant en amont la séquence (C) (pSG 251) [SEQ ID NO : 5].
La visualisation aisée de l'expression de la glucuronidase (Jefferson et al., 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5. 387) ou de sa surexpression dans le cas d'une induction du promoteur de l'invention, permet d'utiliser des plantes qui expriment ce gène chimérique pour la sélection de molécules inductrices.
Les plantes possèdent des mécanismes de défense aux agressions et notamment aux agressions parasitaires (champignons, bactéries, virus ou insectes) ; ces mécanismes dépendant de phénomènes d'induction sont peu connus et se mettent souvent en place trop tardivement pour être efficaces. Leur déclenchement précoce (Roby et al.. 1988, Physiol. Molec. Plant. Pathol., 33. 409) notamment par des composés de type éliciteur dans des réactions en cascade permet à la plante de résister aux agressions.
Des fongicides de seconde génération, actifs sur les défenses de la plante, tout en étant inactifs sur le parasite ont déjà été mis sur le marché.
Les plantes exprimant la glucuronidase, sous contrôle du promoteur de l'invention, précocement et spécifiquement induit lors d'une réaction d'hypersensibilité à une infection bactérienne, constituent un outil de choix pour sélectionner des molécules capables d'induire l'expression ou la surexpression de gène de défense.
L'invention sera mieux comprise à l'aide de l'exposé ci-après, divisé en sections, qui comprend des résultats expérimentaux et une discussion de ceux-ci. Certaines de ces sections concernent des expériences effectuées dans le but de réaliser l'invention, d'autres des exemples de réalisation de l'invention, donnés bien sûr à titre purement illustratif.
Une grande partie de l'ensemble des techniques ci-après, bien connues de l'homme du métier, est exposée en détail dans l'ouvrage de Sambrook et al. : "Molecular Cloning : a Laboratory manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New-York (2ème édition).
Le matériel biologique (souches, phages, plasmides ou plantes) utilisé dans les sections ci-après est disponible dans le commerce et/ou décrit respectivement dans les documents ci-après :
- vecteur binaire pBIN 19 BEVAN et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12. 8711-8721 ; obtenu auprès de Clontech (Palo Alto Californie USA)
- vecteur 101.3 JEFFERSON, 1987, Plant. Molec. Biol.Reporter 5, 387 - 405 obtenu auprès de Clontech
- vecteur pBI 221    "
- vecteur pBI 121    "
- Souche Pseudomonas solanacearum MESSAGE et al., 1978, Proc. 4th Intl. Conf.of Plant Pathogenic Bacteria pp 823-833
- Souche Pseudomonas solanacearum    "
GMI 1178    "
- Souche Pseudomonas solanacearum    "
K 60    "
- terminateur NOS terminateur nopaline synthase
- vecteur pTZ 19R obtenu auprès de Pharmacia
- souche E. coli MC1061 MANIATIS et al., 1982, Molecular cloning : A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New-York, obtenue auprès Clontech
- souche E. coli HB101    "
- souche Agrobacterium tumefaciens LBA4404 obtenue auprès de Clontech HOEKEMA et al.. 1983, NATURE. 303, 179-180 ;
- souche Agrobacterium rhizogenes pRIA4
- plante Nicotiana tabacum Variété Wisconsin Havana 38 : SCHNEIDER M., 1990, Plant Molec. Biol., 14, 935-947 ;
- champignon Chalara elegans RAWLINGS R.E, 1940. Ann. Mo. Bot. Gdn., 27, 561-598 ;
- champignon Alternaria brassicae BAINS et TEWARI, 1987, Physiol. Mol. Plant. Pathol. 30 : 259 ;
- plante Nicotiana tabacum Variété Paraguay 49 obtenue auprès de l'institut du tabac, Bergerac, France.
- plante Brassica napus variétés de printemps Brutor et Westar et lignée d'hiver (lignée de sélection Rustica Semences)
- pathogène Rhzizoctonia Solani ACHARYA et al., 1984, Can. J. Plant. Pathol, 6, 325-328
- plantes de tournesol genotype 2603B (lignée de sélection, Rustica semences)
- maïs lignée LH 132
- orge variété GERBEL obtenue auprès de l'Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Paris, France
  • Les souches GMI 1000 et K 60 peuvent être obtenues auprès de la Collection Nationale des Bactéries Phytopathogènes (CNBP) INRA. Pathologie Végétale. Rue Georges MOREL, 49070 BEAUCOUZE, FRANCE
  • La souche GMI 1178 peut être obtenue auprès de l'INRA, Pathologie Végétale, Chemin de Borde-Rouge AUZEVILLE BP 27, 31326 CASTANET TOLOSAN Cedex, FRANCE
Les abréviations suivantes sont utilisées dans les exemples ci-après :
  • 32P-dCTP: déoxycytidine 5'-32P-triphosphate commercialisé par AMERSHAM sous la référence 10205 ;
  • 2 SSC : NaCl 0,3M, citrate trisodique 30 mM ; pH 7,0 (décrit par MANIATIS et al., op. cit.) ;
  • SDS : dodécylsulfate de sodium ;
  • FPLC : chromatographie liquide rapide de protéines
  • PVDF : difluorure de polyvinylidène ;
  • EDTA : acide éthylènediaminetétraacétique
  • DEPC : diéthylpyrocarbonate.
  • NAD : nicotinamide adénine dinucléotide
    • La description ci-après sera mieux comprise en se rapportant aux figures 1 à 3.
    La figure 1 représente la cartographie du clone d'ADN génomique 246C, établie à l'aide des enzymes de restriction représentés.
    La figure 2 représente l'alignement selon la méthode d'alignement optimal de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol., BIol., 48, 443-453 mise en oeuvre par le logiciel UWGCG de l'Université du Wisconsin (Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 387-395) option GAP, de la partie 3' de 700 pb du promoteur du gène 246C et du promoteur décrit par Takahashi et al., 1989,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8013).
    La figure 3 représente les différents vecteurs d'expression testés comportant, par rapport au plasmide pleine longueur pSG123, une délétion variable de la partie 5' du promoteur.
    Section 1 : Infection de tabac Nicotiana tabacum par deux souches de la bactérie pathogène Pseudomonas solanacearum
    Les bactéries de la souche de Pseudomonas solanacearum sont cultivées pendant 72 h sur le milieu BG gélosé (Boucher et al. 1985. J. Gen Microbiol 131, 2449) ; une colonie est prélevée pour ensemencer 40 ml du même milieu. Après de 16 à 24 h d'incubation à 28°C. la suspension bactérienne est centrifugée pendant 10 min à 6000 g et 4°C ; le surnageant est éliminé en conservant la couche de polysaccharides présente à la surface du culot. Après un lavage à l'eau stérile, les bactéries sont remises en suspension dans 20 ml d'eau. Leur concentration est alors déterminée par densitométrie.
    Des jeunes feuilles de plantes de tabac sont détachées de la plante. lavées à l'eau distillée et immergées dans un dessicateur contenant 1,2 l de suspension bactérienne à la concentration de 3 x 106 bactéries/ml. Le vide est réalisé pendant 10 min à l'aide d'une trompe à vide, puis il est lentement cassé. Chaque feuille infiltrée est alors placée dans un bêcher contenant du tampon phosphate de sodium 10 mM pH 6,0 et transférée dans une chambre de culture. Les feuilles sont prélevées après différents temps d'incubation et conservées à - 70°C.
    Deux souches bactériennes ont été utilisées : la souche GMI 1000 provoquant une réaction d'hypersensibilité sur le tabac de la variété Bottom Spécial et la souche GMI 1178 (Message et al, 1978, Proc. 4th. Intl. Conf. of Plant Pathogenic Bacteria pp. 823-833), mutant issu de la souche précédente et ayant perdu la capacité d'induire la réaction d'hypersensibilité chez le tabac.
    Section 2 : Extraction et isolement des ARN totaux de Nicotiana tabacum infectés par les souches de Pseudomonas solanacearum
    10 g de matériel végétal sont broyés en présence d'azote liquide puis repris dans un mélange de 3 ml de phénol, 3 ml de chloroforme-alcool isoamylique (24 : 1, V : V) et 6 ml de tampon de lyse de composition Tris-HCl 200 mM pH 7,0. EDTA 200 mM, SDS 1 %.
    Après agitation au vortex, une centrifugation pendant 10 min à 6000 g à 4°C permet de séparer les phases. La phase aqueuse est prélevée et reextraite à l'aide de 6 ml de mélange de phénol-chloroforme-alcool isoamylique (25 : 24 : 1, V : V). puis à l'aide de 6 al de phénol. 16 ml d'éthanol absolu et 400 µl d'acétate de sodium 3M pH 5.5 sont ajoutés à la phase aqueuse ; le mélange est précipité pendant 2 h à - 20°C. Le culot obtenu est dissous dans 5 ml d'eau stérile contenant 0.1 % de diethylpyrocarbonate (DEPC) puis les ARN sont précipités pendant 12 h à 4°C après addition de 5 ml de LiCl 4M. Après une centrifugation de 20 min à 6000 g, le culot d'ARN est lavé par de l'éthanol à 75 %. séché et repris dans 800 µl d'eau distillée stérile contenant 0.1 % de DEPC. La solution est précipitée pendant 2 h à - 20°C après addition de 0.1 vol d'acétate de sodium 3M pH 5,5 et 2,5 vol d'éthanol absolu. Après centrifugation pendant 15 min à 12 000 g, le culot d'ARN est lavé à l'éthanol à 75 % et dissous dans 200 µl d'eau distillée contenant 0,1 % de DEPC.
    Les ARN totaux sont alors dosés par spectrophotométrie à 260 nm.
    Section 3 : Préparation des ARN messagers poly(A)+
    1 g de gel d'oligo-d(T) cellulose (Collaborative Research Inc.) est remis en suspension dans 2 ml de tampon Tris-HCl 10 mM pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl 0,4 M, SDS 0,1 %, Ce gel est introduit dans une pipette Pasteur dont l'extrémité est bouchée à l'aide de laine de verre. La solution d'ARN est portée à 65°C pendant 4 min puis laissée refroidir lentement à la température ambiante. Une concentration finale de 0.4 M en NaCl est obtenue par addition d'une solution de NaCl 5M.
    La solution d'ARN totaux est ensuite déposée sur le gel d'oligo-d(T) cellulose. Celui-ci est ensuite rincé par 12 ml environ de tampon de composition Tris-HCl 10 mM pH 7.4, NaCl 0,4 M, EDTA 1 mM, SDS 0,5 %.
    Les ARN poly(A)+ sont ensuite élues à l'aide de 7 ml de tampon de composition Tris-HCl 10 mM pH 7,4, SDS 0.1 X, puis précipités pendant 1 nuit à -20°C après addition de 2,5 volumes d'éthanol à 95 % et 0,1 volume d'acétate de sodium 3,3 M pH 5,5. Le culot d'ARN poly(A)+, obtenu par centrifugation à 35 000 g pendant 1 h est lavé 3 fois par de l'éthanol à 75 %, séché, repris dans 0,5 ml d'eau distillée stérile et soumis à une nouvelle précipitation dans les conditions décrites ci-dessus. Après centrifugation, le culot est alors lavé par de l'éthanol à 75 %, séché et dissous dans de l'eau distillée stérile. Les ARN poly(A)+ sont alors dosés par spectrophotométrie à 260 nm.
    Section 4 : Synthèse de l'ADN double brin à partir d'ARN messagers poly(A)+ isolés de feuilles de tabac infecté par la souche GMI 1000 de Pseudomonas solanacearum et clonage dans E. coli.
    Cette synthèse est réalisée selon la méthode de Gubler et Hoffman (1983, Gene, 25, 263), à l'aide du kit D. Scribe de la société Genofit (Genève, Suisse) et en suivant les instructions du fabricant.
    Synthèse du premier brin :
    2,5 µg d'ARN poly(A)+ isolés de feuilles de tabac infectées par la souche GMI 1000 de Pseudomonas solanacearum et prélevées 6 h après inoculation, sont mis à incuber à 44°C pendant de 30 à 60 min en présence de : Tris HCl 40 mM, pH 8,3, NaCl 80 mM, MgCl2 6 mM, DTT 5 mM, dATP 0,5 mM, dTTP 0,5 mM, dGTP 0,5 mM, dCTP 0,5 mM, 1,5 µg d'oligo d (pT) 12-18 et 10 à 15 unités de transcriptase inverse d'AMV (avion myeloblastosis virus) dans un volume total de 25 µl.
    Synthèse du deuxième brin :
    Le milieu réactionnel issu de la synthèse du premier brin est diluée à 100 µl à l'aide du tampon de composition Tris HCl 40 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, NaCl 80 mM ; 2 unités de RNase H sont ajoutées et le mélange est incubé à 37°C pendant 5 min.
    Après refroidissement à 12°C, 25 unités de DNA polymérase I, 0,5 unités Weiss de ligase de E. coli et du NAD en concentration finale de 0,1 mM, sont ajoutés.
    Après une incubation de 60 min à 12°C puis de 60 min à 18°C, la réaction est arrêtée par l'addition de EDTA et de SDS en concentrations finales de 20 mM et 1 %, respectivement, suivie d'un chauffage de 2 min à 60°C.
    Purification de l'ADNc :
    Celle-ci est réalisée par chromatographie sur une colonne de Sephadex G100, dans le tampon Tris HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, EDTA 1mM. L'addition d'alpha 32P dCTP lors de l'étape de synthèse permet de repérer plus facilement les fractions issues de la chromatographie renfermant l'ADN double brin. Celui-ci est précipité par addition d'acétate d'ammonium (concentration finale 0,3 M) et de 2,5 vol d'éthanol absolu.
    Digestion à l'aide de la nucléase S1 :
    Le précipité obtenu est lavé par de l'éthanol à 75 %, séché et repris par de l'eau stérile. L'ADNc est traité ensuite par la nucléase S1 dans un volume total de 300 µl, à 30°C pendant 10 min, en présence de 20 U d'enzyme dans le tampon de composition acétate de sodium 30 mM pH 4,4, NaCl 0,25 M, ZnCl2 1 mM.
    A la fin de la réaction, le mélange est extrait une fois par un mélange de Phénol-chloroforme-alcool isoamylique (50-48-2. V : V) puis trois fois par l'éther éthylique avant d'être soumis à une précipitation par l'éthanol.
    Le précipité d'ADN obtenu après centrifugation est ensuite séché et repris dans 20 µl d'eau stérile.
    Addition en 3' d'une terminaison Poly dC (dC Tailing)
    A la solution d'ADNc sont ajoutés successivement 10 µl de tampon de terminal-transférase de composition potassium cacodylate 70 mM pH 7,2, CoCl2 0,5 mM, dithiothréitol 0,5 mM, 2 µl d'α dCTP 0,25 mM, 5 µl d'α 32P dCTP (370 MBq/ml), 12 µl d'H2O et 1,2 µl de terminal transférase (18 unités).
    La réaction de tailing est réalisée par incubation à 37°C pendant 30 min, puis arrêtée par l'addition de 30 µl d'EDTA, 0,25M pH 8.0.
    Purification après Tailing des ADNc double brin :
    Le mélange issu du dC tailing est précipité par l'éthanol puis centrifugé. Le culot d'ADNc est repris dans 10 µl de tampon de composition Tris HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 5 % glycérol, 0,02 % bleu de bromophénol. Cette solution est déposée sur une colonne de Biogel A 0,5 M (1 ml de support). L'élution de la colonne est réalisée par le tampon de composition Tris HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM ; des fractions sont recueillies, leur radioactivité mesurée, et la taille des ADNc qu'elles renferment est analysée en électrophorèse sur gel d'agarose. Les fractions contenant des ADNc de taille supérieure à 500 paires de bases sont réunies et l'ADNc est précipité par l'éthanol.
    Hybridation avec pBR 322-dG
    L'ADNc recueilli après précipitation est remis en solution dans 50 µl de tampon de circularisation de composition Tris-HCl 20 mM pH 7.5. NaCl 100 mM, EDTA 1mM. 4 µl de solution de pBR 322-dG (21 ng, Clontech) et 46 µl d'eau sont rajoutés.
    Après incubation pendant 15 min à 65°C puis 2 h à 57°C. l'hybridation est contrôlée par électrophorèse sur gel d'agarose.
    L'ADNc double brin obtenu est inséré au site PstI du plasmide pBR 322. Après ligation, l'ADN obtenu est utilisé pour transformer des cellules compétentes de la souche E. coli HB101 Des colonies de bactéries recombinantes sont obtenues après étalement et culture sur boite de Pétri des cellules compétentes transformées.
    Section 5 : Sélection par screening différentiel de clones d'ADNc issus d'ARNm poly(A)+ spécifiquement synthétisés au cours de l'infection bactérienne par la souche de Pseudomonas solanacearum GMI 1000.
    L'ADN des colonies bactériennes recombinantes obtenues par clonage d'ADNc synthétisé à partir d'ARN messagers poly(A)+ de feuilles de tabac infectées par la souche GMI 1000 a été transféré sur une membrane de nylon Biodyne (Pall Corporation, EUA) suivant les indications du fabricant. Ces ADN sont hybridés successivement à l'aide de 2 sondes radioactives obtenues par synthèse d'ADNc, en présence d'alpha-32P dCTP, à partir d'ARN messagers purifiés de plantes infectées par les souches GMI 1000 et GMI 1178 respectivement.
    Après lavage et exposition autoradiographique des membranes, les colonies bactériennes qui présentent un signal d'hybridation plus fort avec la sonde synthétisée à partir de feuilles inoculées par la souche GMI 1000 sont sélectionnées. L'ADN plasmidique de ces colonies est préparé, les inserts d'ADNc de ces plasmides sont isolés puis marqués à l'alpha 32-dCTP et sont utilisés comme sonde pour révéler selon la technique de dot-blot puis de Northern blot les quantités équivalentes d'ARNm correspondant purifié à partir d'ARN total, de feuilles de tabac inoculées par la souche GMI 1000 ou GMI 1178.
    Les colonies dont l'insert utilisé comme sonde donne un signal plus intense lors de la révélation des ARN totaux purifiés à partir de feuilles de tabac inoculées par la souche GMI 1000 sont conservées.
    Section 6 : Caractérisation d'un clone d'ADNc issu d'un ARNm spécifiquement synthétisé au cours de l'infection bactérienne par la souche de Pseudomonas solanacearum GMI 1000.
    14 clones bactériens ont été isolés à partir de la banque d'ADNc construite à partir d'ARN messagers de feuilles de tabac infectées par la souche de Pseudomonas solanacearum GMI 1000.
    Parmi ceux-ci, un clone appelé 246. présentant une longueur d'insert de 750 paires de bases, permet de révéler en Northern Blot un transcrit de 800 nucléotides environ. L'accumulation de ce transcrit commence 4 à 9 h après l'inoculation, et atteint un maximum entre 12 et 15 h. Dans les feuilles de tabac infectées par la souche GMI 1178, on observe une légère accumulation du transcrit entre 12 et 15 h.
    L'étude de la séquence de l'ADNc du clone 246 [SEQ ID NO : 1] met en évidence l'existence d'un premier cadre de lecture ouvert incomplet. codant pour un peptide de 59 acides aminés et d'un second cadre potentiel codant pour un peptide de 88 acides aminés. La séquence de ces deux peptides est représentée par [SEQ ID NO : 2]. Entre ces deux cadres de lecture des séquences consensus d'épissage d'un intron (Brown, 1986, Nucl. Ac. Res., 14, 9549) sont présentes. Il y a donc probablement eu clonage d'un ADNc à partir d'un ARN messager immature. La séquence d'ADNc du clone 246 sans l'intron est la séquence A1 [SEQ ID NO : 3].
    Section 7 : Criblage d'une banque génomique de tabac à l'aide de l'ADNc caractérisé.
    Une banque génomique d'ADN de tabac a été obtenue par digestion partielle à l'aide de l'enzyme MboI d'ADN isolé de germination de Nicotiana tabacum variété NK 326, et clonage des fragments de restriction dans le phage EMBL-3 (Clontech). 500 000 phages recombinants ont été criblés, après étalement à raison de 10 000 phages par boíte de Petri selon la technique connue de l'homme de l'art et décrite dans Sambrook et al (Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
    L'ADN phagique est transféré sur membrane de nitrocellulose (BA 85 Schleicher et Schüll), dénaturé pendant 2 min dans une solution NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M, puis trempé dans une solution de neutralisation NaCl 1,5 M, Tris HCl 0,5 M pH 7,4 pendant 5 min. Après rinçage rapide dans du 2 SSC (NaCl 0,3 M, citrate de sodium 30 mM) les filtres sont séchés 30 min à 37°C et l'ADN est ensuite fixé par traitement à 80°C sous vide pendant 1h30.
    Les membranes sont ensuite préhybridées pendant 4 h à 37°C dans un tampon de composition 5 SSC (NaCl 0,75 M, citrate de sodium 75 mM), 50 % formamide, 0,3 % lait écrémé.
    L'hybridation est réalisée dans le même tampon, pendant 18 h à 37°C après addition de la sonde marquée à l'alpha 32P-dCTP, constituée de l'insert de 750 paires de bases du clone d'ADNc 246.
    Les membranes sont ensuite lavées 3 fois pendant 20 min à 37°C dans une solution 5 SSC, SDS 0,1 %, puis 2 fois pendant 30 min à 37°C dans une solution 2 SSC, SDS 0,1 % et enfin 30 min à 42°C dans une solution 2 SSC, SDS 0,1 % ; elles sont ensuite autoradiographiées.
    Après révélation des autoradiogrammes, chaque plage de lyse présentant un signal positif est isolée, les phages sont élués dans du milieu SM (NaCl 100 mM, Tris HCl 50 mM, pH 7,5, Mg SO4 5mM, gélatine 0,01 %) puis purifiés par un nouveau criblage réalisé dans les mêmes conditions.
    12 clones ont ainsi été isolés et purifiés. L'ADN de chaque clone a été produit et purifié, selon la technique bien connue de l'homme de l'art, puis digéré par l'enzyme SalI qui permet d'isoler après électrophorèse sur gel d'agarose l'insert d'ADN génomique.
    Le transfert sur membrane de nylon suivi d'une hybridation avec la sonde constituée de l'ADNc du clone 246, montre un signal positif, confirmant la présence dans cet ADN génomique d'une séquence complémentaire de l'ADNc 246.
    Ces clones ont ensuite été cartographiés en utilisant une série d'enzymes de restriction. Un clone a été retenu parmi ceux-ci, qui présente un signal d'hybridation dans la région centrale du fragment inséré dans l'ADN phagique. Ce clone a été nommé 246C.
    Section 8 : Séquençage et analyse de la séquence du clone d'ADN génomique 246C
    Un fragment de l'insert contenu dans ce phage a été isolé par digestion à l'aide de l'enzyme SstI, puis cloné dans le phage pBluescript ® 11 KS +/- (Stratagène) donnant le phagemide pKS246. Sa cartographie a été établie, elle est présentée sur la Figure 1. La séquence de cet insert [SEQ ID NO 7] a ensuite été déterminée par la méthode de Sanger et al (PNAS-USA, 14, 5463. 1977) après création de délétions progressives à l'aide des enzymes Exo III, mung bean et nucléase S1 selon la technique de Henikoff (Gene,-28, 351, 1984).
    Cet insert, appelé gènes 246C, de 3046 paires de bases, est constitué d'une région codante de 853 pb débutant par un ATG en position 2146 et terminée par un codon TGA en position 2998 ; cette région est entrecoupée d'un intron commençant en position 2464 et terminant en position 2653. Trois sites potentiels d'initiation de la transcription ont été déterminés par extension d'amorce selon la technique décrite dans Sambrook et al. (opus cité, 1989), le site le plus probable est en position 2068.
    La région promotrice du gène 246C en amont de la position 2146 est appelée promoteur 246C. L'étude de la séquence du promoteur 246C montre la présence de plusieurs motifs connus pour être impliqués dans la régulation des gènes.
    Deux séquences consensus CAAT correspondant à cet élément régulateur de la transcription des gènes eucaryotes ainsi qu'une séquence complémentaire et inverse ATTG sont présentes aux positions 2051, 2101 et 1967.
    Deux séquences consensus TATAA sont présentes aux positions 2089 et 2111 ainsi qu'une séquence complémentaire AATAT à la position 2020. Ces trois motifs sont tous situés entre 10 et 50 paires de bases en aval des actifs CAAT et 30 à 50 paires de bases en amont des sites de transcription potentiels.
    Une séquence TGACG a été identifiée à la position 1950 ; cette séquence mise en évidence dans le promoteur 35S du CaMV, semble responsable de l'expression de gènes chimériques dans les racines et dans les feuilles (LAM et al. 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86, 7890).
    Trois régions présentent une homogénéité importante avec les motifs HSE (Heat Shock Elements) des plantes (GURLEY et KEY, 1991, Biochemistry, 30. 1). Ces régions sont homologues avec la séquence consensus GAANNGAANNTTCNNTTC ou TTCNNTTCNNGAANNGAA ; elles sont proches des boites TATA et CAAT et dupliquées [SEQ ID NO : 17 et NO : 18].
    Une séquence homologue au motif CCGTCC caractérisé comme étant impliqué dans la réponse à des éliciteurs d'origine fongique (LOIS et al, 1989, EMBO J., 8, 1641) a été localisée à la position 1822.
    Le promoteur du gène 246 C présente sur environ 30% de sa longueur une homologie élevée (> à 90 %) sur 700 paires de bases avec le promoteur végétal isolé du tabac ayant la séquence [SEQ ID NO : 8] décrit par TAKAHASHI et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 87 pp 8013-8016. Sur la figure 2, on a représenté l'alignement de la séquence d'ADN de ce promoteur [SEQ ID NO : 9, 10 et 11] (ligne du haut) avec la partie correspondante de la séquence d'ADN du promoteur de l'invention [SEQ ID NO : 12 et 13] (ligne du bas).
    Section 9 : Construction du vecteur d'expression pSG123 associant le promoteur du gène 246C au gène de la β-glucuronidase.
    A partir du phagemide pKS 246, la digestion par les enzymes HindIII et Ball permet d'isoler un insert de 2200 paires de bases environ, contenant la partie promotrice du gène 246C, le codon d'initiation de traduction et 11 codons codant pour la partie amino-terminale de la protéine.
    Le plasmide pBI 101.3 (Clontech) est digéré par les enzymes HindIII et EcoRI ; le fragment de 2100 paires de bases environ, contenant le gène de la β-glucuronidase codée par le locus uidA de E. coli, suivi du terminateur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens, est ligué dans le plasmide pUC 19, ouvert aux mêmes sites, donnant un plasmide appelé plasmide pBI 201.3.
    L'insert HindIII-BalI portant les séquences promotrices du gène 246C est cloné dans le plasmide pBI201.3 ouvert aux sites HindIII et SmaI.
    Le vecteur obtenu appelé pSG 123 contient donc le gène de la glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246C. La séquence nucléotidique du gène chimérique complet est la séquence [SEQ ID NO : 14].
    Section 10 : Protocole de l'expression transitoire dans des protoplastes de tabac du gène de la glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246C. Préparation de protoplastes de tabac
    Des feuilles de plantes de tabac (Nicotiana tabacum, var Samsun NN), âgées de 4 à 5 semaines sont prélevées, découpées en lanières et incubées dans du milieu T.O (tableau 1, adapté de Chupeau et al., 1974, C.R. Acad Sci (Paris), 278 D, 1565) contenant 1 g/litre de cellulase R 100 Onozuka, 200 mg/l de macerozyme Onozuka (Yakult Honsha, Nishinoniya, Japon) et 500 mg/l de pectolyase Y23 (Sheishin Pharmaceutical Ind. Japon) pendant 15 h à 22°C.
    Les protoplastes sont séparés des débris cellulaires par tamisage sur un tamis de nylon de maille 85 µm suivi par une centrifugation de 5 min à 50 g sur une solution de saccharose à 19 % (poids/volume). Les protoplastes flottant sur ce milieu sont lavés une fois dans le milieu T.O, comptés et leur nombre ajusté à la densité de 1.5 x 106 protoplastes/ml.
    Préparation du vecteur pSG 123
    La souche E. coli contenant le vecteur pSG 123 est cultivée sur milieu Luria (Gibco) contenant 50 mg/l d'ampicilline. L'amplification du plasmide est réalisée selon le protocole décrit dans Sambrook et al., 1989 (opus cité). Le plasmide pSG 123 est ensuite purifié par centrifugation sur un gradient de chlorure de césium et par deux précipitations successives par l'éthanol. Le culot plasmidique est ensuite remis en solution dans du Tampon Tris-HCl 10 mM pH 8,0.
    Transformation par le polyéthylèneglycol
    Les suspensions de protoplastes (320 µl par aliquote) sont incubées à 45°C pendant 5 min, puis rapidement refroidis sur la glace. Puis 50 µg de plasmide pSG123, 160 µl d'une solution de polyéthylèneglycol (40 % polyéthylèneglycol, 0,4 M mannitol, 30 mM MgCl2, 0.1 % Mes pH 5.8) sont alors ajoutés. Au bout de 10 min, les protoplastes sont collectés par centrifugation et remis en suspension par agitation douce dans 500 µl de tampon T0 et incubés à l'obscurité & 28°C.
    Mesure de l'expression transitoire
    Au bout de 24 h d'incubation. les protoplastes sont lysés après addition de 50 µl de tampon d'extraction 10X de la β-glucuronidase par une congélation à - 80°C suivie d'une décongélation à 37°C (Jefferson, 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5, 387).
    Le surnageant obtenu après centrifugation à 10 000 g est utilisé pour mesurer l'activité β-glucuronldase par fluorimétrie (Jefferson, 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5, 387).
    Parallèlement, la quantité de protéines présente dans les extraits est mesurée selon la méthode de Bradford à l'aide du kit Bio Rad(Bio Rad. Lab.).
    Composition du milieu TO (pour 1 litre)
    NH4 NO3 825 mg
    K NO3 950 mg
    CaCl2, 2H2O 220 mg
    Mg SO4, 7H2O 185 mg
    KH2 PO4 85 mg
    H3 BO3 1 mg
    Mn SO4, 4H2O 100 µg
    Zn SO4, 7H2O 1 mg
    Kl 100 µg
    AlCl3 30 µg
    NiCl2, 6H2O 30 µg
    CuSO4, 5H2O 30 µg
    Fe SO4, 7H2O 27,8 mg
    Na2 EDTA, 2H2O 37,2 mg
    Thiamine 100 µg
    Ac. nicotinique 200 µg
    Pyridoxine 1 mg
    Biotine 10 µg
    Panthoténate de Ca 1 mg
    Saccharose 20 g
    Inositol 100 mg
    Mannitol 80 g
    Acide 2-[N-Morpholino] ethanesulfonique (MES) 200 mg
    pH ajusté à 5,8 avant autoclavage
    Section 11 : Expression transitoire du gène de la glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246C dans des protoplastes de tabac infectés par Pseudomonas solanacearum.
    Cette expression transitoire, déterminée selon le protocole de la section 10, est mesurée après incubation pendant 24 h des protoplastes préparés selon le protocole ci-dessus dans le milieu TO (décrit dans la section 10) contenant une suspension de bactéries Pseudomonas solanacearum (10 bactéries/protoplaste) obtenues comme décrit en section 1.
    L'activité β-glucuronidase est exprimée en pmoles de méthylumbélliférone formée/min/mg de protéine.
    Aucune activité n'est décelée dans les protoplastes de plantes n'ayant pas reçu d'ADN du vecteur pSG123. Une activité de 450 pmol/min/mg de protéine est mesurée sur des protoplastes traitées par du vecteur pBI221 (Clontech) contenant le gène de la β-glueuronidase sous contrôle du promoteur constitutif 35S CaMV ; cette activité est réduite à 300 pmol/min/mg de protéine après infection par les souches de Pseudomonas solanacearum GMI 1000 et GMI 1178.
    Une activité de 600 pmol/min/mg de protéine est mesurée sur des protoplastes traités par du plasmide pSG 123 ; cette activité est peu modifiée après inoculation par la souche GMI 1178, elle augmente jusqu'à une valeur de 1000 pmol/min/mg de protéine après inoculation par la souche GMI 1000.
    Le promoteur du gène 246C permet donc une expression basale importante du gène de la glucuronidase, expression plus importante que celle commandée par le promoteur 35S du CaMV, qui sert ici de contrôle. Ce promoteur présente de plus une forte inductibilité puisque l'expression de la β-glucuronidase augmente de 40 % après infection par la souche bactérienne GMI 1000.
    Section 12 : Expression transitoire du gène de la glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246 C de protoplastes de tabac traités par un éliciteur (heptasaccharides de chitine) ou une hormone.
    L'expression est mesurée après incubation des protoplastes pendant 24 h comme décrit ci-dessus dans le milieu TO contenant un éliciteur à la concentration de 25 µM ou une hormone, le 2-4-D (acide 2-4 dichlorophénoxyacétique) à la concentration 4 µM. Les éliciteurs utilisés (composés glycosidiques issus de la paroi des champignons pathogènes) sont des heptasaccharides de chitine ayant la propriété d'induire des réactions de défense dans les plantes (Roby et al., 1987, BBRC, 143, 885).
    Aucune activité n'est détectée dans des protoplastes non traités et qui servent de contrôle. Une activité de l'ordre de 400 pmol de méthylumbélliférone formée/min/mg de protéine est mesurée à partir des protoplastes ayant reçu de l'ADN du vecteur pBI 221, cette activité n'est pas affectée par le traitement (éliciteurs ou hormone).
    Les protoplastes ayant reçu de l'ADN du vecteur pSG 123 présentent une activité de 450 pmol/min/mg de protéine ; cette activité est accrue de 50 % si les protoplastes sont traités par l'hormone 2-4-D et de 70 % si les protoplastes sont traités par l'heptasaccharide de chitine.
    Les caractéristiques de ce promoteur mises en évidence lors de l'infection de protoplastes par la souche bactérienne GMI 1000 (niveau de base élevé et inductibilité), peuvent être reproduites en utilisant un inducteur issu de la paroi de champignons phytopathogénes.
    Section 13 : Construction d'un vecteur d'expression stable dans les cellules végétales : le vecteur binaire pSG246
    A partir du vecteur pSG 123, une coupure par les endonucléases de restriction HindIII et EcoRI, suivie d'une électrophorèse sur gel d'agarose, permet d'isoler le gène chimérique associant le promoteur 246C à la partie codante de la β-glucuronidase et le terminateur NOS. Le gène chimérique est introduit et ligué dans le vecteur binaire pBIN 19 (Clontech) préalablement ouvert aux sites HindIII et EcoRI donnant le vecteur pSG246. Ce vecteur binaire possède deux gènes de résistance à la kanamycine, l'un pouvant s'exprimer dans les bactéries, l'autre situé immédiatement en amont du gène recombinant complet (Bevan, 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711) pouvant être transféré aux cellules végétales. Le gène de résistance à la kanamycine servira de marqueur de sélection au cours des étapes de transformation et d'analyse de la descendance des plantes transformées.
    Le vecteur obtenu, appelé pSG246, est cloné dans la souche E. coli DH5 α.
    Section 14 : Transfert dans Agrobacterium du plasmide pSG246 contenant la β-glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246C du tabac a) Transfert dans Agrobacterium tumefaciens
    Ce transfert est réalisé par transformation selon la méthode de congélation-décongélation décrite dans Plant Molecular Biology Manual (Gelvin et al eds. , Kluwer Academic Publishers, 1988) et résumé ci-après.
    Des cellules compétentes d'Agrobacterium tumefaciens (souche LBA 4404, Clontech) sont préparées, par refroidissement rapide dans la glace d'une culture en phase exponentielle de croissance. Les bactéries sont alors remises en suspension dans du CaCl2 20 mM. Des aliquotes de cette suspension sont distribuées dans des tubes Eppendorf, puis congelées dans l'azote liquide.
    1 µg de plasmide pSG246 est ajouté aux cellules congelées, contenues dans un tube Eppendorf. La suspension est ensuite incubée à 37°C pendant 5 min ; 1 ml de milieu Luria (Gibco) est alors rajouté et le tube est incubé & 28°C pendant 4 h. Des parties aliquotes sont étalées sur des boites de Petri contenant un milieu minimum gélosé, décrit dans Plant Molecular Biology Manual (op. cité) en présence de 100 mg de rifan-picine et 25 mg/l de kanamycine. Dans ces conditions, seules poussent les colonies d'Agrobacterium tumefaciens ayant intégré le plasmide pSG246. Celles-ci contiennent le gène chimérique dans un contexte permettant sa replication.
    La résistance aux deux antibiotiques des colonies sélectionnées est vérifiée en repiquant celles-ci sur le même milieu de sélection deux fois de suite. La présence du gène chimérique associent le promoteur 246 C à la partie codante de la β-glucuronidase dans Agrobacterium tumefaciens est vérifiée par la méthode de Southern Blot sur une préparation d'ADN total (Lyse des cellules, purification de l'ADN par extraction à l'aide du mélange phénol/chloroforme, selon le protocole décrit par Gelvin dans l'ouvrage cité ci-dessus, coupure de l'ADN purifié à l'aide d'enzymes de restriction, électrophorèse sur gel d'agarose, transfert sur membrane et hybridation selon les techniques bien connues de l'homme de l'art).
    b) Transfert dans Agrobacterium rhizogenes
    Ce transfert est réalisé de la même façon que le transfert dans Agrobacterium tumefaciens décrit en a), avec la souche Agrobacterium rhizogenes A4 décrite par Guerche et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 206, 382.
    Section 15 : Obtention de plantes de tabac transformées par Agrobacterium tumefaciens contenant le plasmide pSG246.
    Le tabac Nicotiana tabacum cultivé in vitro a été infecté par Agrobacterium tumefaciens contenant le plasmide pSG246 selon la procédure de Horsch et al., bien connue de l'homme du métier (Horsch R.B. et al., 1985, Science 227, 1229-1231), dont les principales étapes sont exposées ci-après.
    Des disques de feuilles de plantes axéniques de tabac Nicotiana tabacum (variété Bottom Spécial) sont incubés dans une culture d'A. tumefaciens hébergeant le plasmide pSG246. Les disques égouttés sur papier Whatman sont transférés sur des milieux de culture en boites de Pétri afin de multiplier les cellules transformées de façon à obtenir des cals (Murashige et Skoog, 1962, Physiol., Plant., 15, 473), puis produire des bourgeons en présence de céfotaxime (500 µg/ml) destinée à éliminer Agrobacterium tumefaciens et de kanamycine (100 µg/ml).
    Parallèlement, des transformations ont été réalisées avec des souches d'Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 contenant les vecteurs :
    • pBI 101 (Clontech), constitué de la partie codante de la glucuronidase précédant le terminateur de la nopaline synthase dans le vecteur binaire pBIN 19. Cette construction, dénommée ci-après construction pBI 101, est dépourvue de promoteur.
    • pBI 221 (Clontech), constitué d'un fragment de 800 paires de bases du promoteur 35S du virus de la mosaïque du choux fleur inséré devant la partie codante de la glucuronidase dans le vecteur pBI 101. Cette construction sera dénommée ci-après construction pBI 221.
    Les bourgeons résistants à la kanamycine ont été ensuite transférés sur un milieu permettant l'induction des racines en présence de carbenicilline et de kanamycine. Les plantules sont ensuite repiquées en terrines dans un substrat composé de tourbe et de terreau et mises à croítre en serre. Toutes les plantes transformées (génération RO) ayant survécu aux étapes de régénération et d'acclimatation en serre se sont révélées morphologiquement normales et fertiles. Elles ont été autofécondées et ont donné des graines (génération R1).
    Section 16 : Analyse de l'ADN génomique des plantes de tabac transformées par Agrobacterium tumefaciens contenant le plasmide pSG246 (génération RO), selon la technique de Southern Blot.
    L'ADN génomique de tabac de haut poids moléculaire a été isolé à partir de feuilles matures de plantes transgéniques de la génération RO selon la méthode d'extraction à l'aide de bromure de cétyltriméthylammonium et de purification par précipitation, décrite dans l'ouvrage "Plant Molecular Biology Manual" déjà cité.
    10 µg de cet ADN génomique ont été digérés pendant une nuit à 37°C avec 20 unités des enzymes de restriction HindIII et EcoRI. Les fragments de restriction obtenus ont été séparés par électrophorése sur gel d'agarose (1 %). L'ADN a été transféré selon la méthode de Southern Blot sur un filtre de Nylon (Hybond N+ Amersham), et hybridé avec une sonde nucléotidique comprenant une partie de la séquence du gène recombinant, marqué par couplage à la peroxydase (kit ECL, Amersham). Les membranes sont ensuite lavées et révélées selon le protocole recommandé par Amersham.
    L'analyse des films permet de tirer les conclusions suivantes :
    • certaines plantes ne possèdent pas de copies du gène recombinant transféré (absence de signal),
    • la plupart des plantes testées contiennent au moins une copie sans réarrangement de la construction : promoteur 246C - séquence codante de la β-glucuronldsse-terminateur NOS, dénommée ci-après construction pSG 246
    • certains profils suggèrent qu'il existe des réarrangements internes dans cette construction, mais ces événements sont rares.
    Section 17 : Etude des caractéristiques d'activation du promoteur 246 C dans les plantes de tabac transgéniques
    Cette étude a été réalisée sur des plantes de la génération R1 qui ont été préalablement sélectionnées in vitro sur le milieu de Murashige et Skoog gélose renfermant 500 µg/ml de kanamycine.
    10 plantes par descendance de transformant sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine sont repiquées sur du terreau puis cultivées pendant 4 à 5 semaines en chambre de culture.
    a) Activation par la bactérie phytopathogène Pseudomonas solanacearum Inoculation par infiltration
    Des tests d'inoculation sont conduits selon le protocole décrit en section 1 sur quatre feuilles appartenant à 2 plantes différentes. Les mesures d'activité glucuronidase effectuées selon la méthode décrite par Jefferson (Plant Molecular Biology Reporter, 5, 387, 1987) en utilisant le 4-méthylumbelliféryl β-D-glucuronide comme substrat.
    Les résultats montrent que :
    • les plantes renfermant la construction pBI 101 ne présentent pas d'activité glucuronidase détectable,
    • les plantes renfermant la construction pBI 121 présentent une activité glucuronidase comprise entre 5000 et 70 000 pmoles de méthylumbélliférone/min/mg de protéine correspondant à une expression constitutive attendue pour cette construction. Une légère activation de ce promoteur en réponse au stress d'infiltration a été constatée pour certains transformants,
    • les plantes contenant la construction pSG246 présentent une activité glucuronidase faible dans les plantes non inoculées, comprise entre 2000 et 5000 pmol/mg de protéine. Une forte induction est mesurée en réponse à l'infection bactérienne, et ce quelle que soit la souche bactérienne utilisée (GMI 1000 ou K60 (Sequeira et al, Physiol. Plant. Pathol., 10, 43, 1977). souche compatible provoquant des symptômes). Le facteur d'induction (rapport entre l'activité mesurée après inoculation et l'activité mesurée avant inoculation) est de l'ordre de 20 fois et les valeurs d'activité dépassent parfois celles obtenues avec les plantes exprimant la construction pBI 121.
    Infection bactérienne localisée :
    Une infection bactérienne localisée est réalisée par dépôt d'une goutte de suspension bactérienne de Pseudomonas solanacearum (3 µl renfermant 3 x 105 bactéries obtenues comme décrit en section 1) sur une blessure obtenue par perforation d'une feuille à l'aide d'une aiguille de seringue.
    Le promoteur 246C est activé autour de la lésion créée par l'Infection et également dans toutes les parties de la plante infectée (feuille inoculée, feuilles supérieures et feuilles inférieures de la plante et racines). Cette activation systémique se produit dès les premières heures après Inoculation.
    Aucune activation n'a été observée dans des plantes de génération R1 issues de plantes transformées par les constructions pBI 101 et pBI 121.
    Le même type d'infection localisée, réalisée au niveau de racines de plantes de tabacs cultivées in vitro conduit également à une activation forte du promoteur au site d'inoculation mais également dans l'ensemble de la racine et dans la partie aérienne de la plante.
    b) Activation par le champignon pathogène Chalara elegans Etude in vitro
    10 à 15 ml de milieu Murashige et Skoog liquide sont versés dans une boite de Petri contenant une culture de 3 semaines de Chalara elegans en cours de sporulation (culture sur milieu gélosé Potato dextrose Agar PDA, Difco).
    Le grattage de la surface de la culture permet de recueillir les spores. Après comptage, une dilution appropriée permet d'obtenir des suspensions de 104 et 105 spores par ml.
    Des aliquotes de 7 ml sont distribuées dans des boites Magenta (sigma). Une plante de tabac transgénique (âgée de 3 semaines environ et cultivée en milieu stérile) transformée par le gène de β-glucuronidase sous contrôle du promoteur 246C est introduite dans chaque boíte, leurs racines trempant dans la suspension de spores. Les plantes sont ensuite prélevées, congelées et l'activité glucuronidase déterminée. Au moment de l'infection l'activité spécifique est de- 20 000 pmoles de méthylumbélliférone par mg de protéine. Comparativement à des témoins non inoculés placés dans les mêmes conditions, cette activité est multipliée par des facteurs de 8 et 8,5 pour les infections à 104 et 105 spores par ml, respectivement, dès 4 jours après l'inoculation.
    Etude en serre
    10 plantes par descendance de transformant, sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine sont repiquées en godets de dimension 3 x 3 cm. A l'apparition de la 5éme feuille, les plantes sont inoculées en déposant au niveau du collet une suspension de 5 x 105 endoconidies de Chalara elegans.
    c) Activation par le champignon pathogène Sclerotinia sclerotiorum Etude sur disques foliaires
    Des disques foliaires de 20 mm de diamètre provenant de plantes exprimant la construction pSG246 sont placées en survie sur un milieu liquide approprié. Sur chacun de ces disques est placé un cube de gélose de 5mm de côté environ et contenant du mycélium de Sclerotinia Sclerotiorum. L'activité glucuronidase, mesurée en fonction du temps révèle que la présence de mycélium induit l'activité glucuronidase après 7 heures de contact. Au bout de 24 heures, l'activité est multipliée par 4 par rapport à celle de disques foliaires non mis en contact avec le mycélium. La même expérience réalisée sur des disques de feuille issus de tabacs témoins (n'exprimant pas la construction pSG246) ne révèle qu'une activité glucuronidase assimilable à un bruit de fond.
    d) Activation par des éliciteurs
    Deux types d'éliciteurs ont été utilisés l'un de type biotique correspondant à des molécules issus de molécules ou de macromolécules naturelles, l'autre de type abiotique correspondant à des molécules chimiques.
    d1. Eliciteurs biotiques d'origine bactérienne ou fongique
    Les élicileurs utilisés sont l'harpin qui est une protéine isolée de Erwinia amylovora et une protéine isolée du surnageant de culture de Pseudomonas solanacearum. De même des éliciteurs protéiques tels que la cryptogéine isolée de Pseudomonas cryptogea et la capsicéine isolée de Pseudomanas capsict (Ricci et al. 1989, Eur. J. Biochem. 183 ; 555-563) ont été testés.
    Dans tous les cas, des concentrations appropriées d'éliciteurs ont été infiltrés à l'aide d'une seringue sous l'épidémie inférieur des feuilles de tabac exprimant la construction pSG246. L'induction d'activité, dans tous les cas est induit par la présence d'éliciteur dans un anneau de 5mm environ immédiatement adjacent à la zone d'infiltration. La stimulation est très apparente 24 heures après l'infiltration mais visible dès 6 heures. L'activité au bout de 24 heures est souvent multipliée par 5 à 6 par comparaison à celles des plantes témoin (plantes exprimant la construction pSG246 mais sans éliciteurs injectés sous l'épiderme).
    d2. Eliciteurs abiotiques : acide salicylique, sulfate de cuivre
    Des feuilles de tabac exprimant la construction pSG246 et détachées de la plante sont immergées dans des solutions de concentration 1 à 10 µg/ml d'acide salicylique ou de 0,025 à 0.25 mM de sulfate de cuivre.
    En présence d'acide salicylique l'activité glucuronidase est multipliée par 5 au bout de 6 heures et par 10 après 24 heures. Dans le cas du sulfate de cuivre, l'activité glucuronidase est multipliée par 17 à 0,025 mM et 11 à 0,25 mM si l'on compare à des feuilles de plantes témoins non traitées.
    d3. Induction par des régulateurs de croissance
    L'application d'une auxine sous la forme d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D) a été réalisée aux concentrations de 1,5 et 10 µM. L'application réalisée par immersion de pétioles des feuilles détachées de tabac exprimant la construction pSG246 montre que l'induction dans la feuille commence 6 heures après l'application de l'auxine à la concentration de 5 µM, pour être stimulée 18 fois après 12 heures comparée aux feuilles de plantes témoins, non traitées par l'auxine.
    L'activité glucuronidase est mesurée lors de l'apparition des symptômes de la maladie soit 15 jours environ après l'inoculation.
    Les résultats de l'activité mesurée au niveau de la partie aérienne de la plante entière montrent que :
    • les plantes renfermant la construction pBI 101 ne présentent pas d'activité glucuronidase détectable,
    • les plantes transformées par la construction pBI 121 présentent une activité de 12 000 à 60 000 pmoles de méthylumbélliférone/min/mg de protéine. Cette activité varie peu après inoculation,
    • les plantes transformées à l'aide de la construction pSG246 présentent une activité glucuronidase faible chez les plantes saines. Cette activité augmente considérablement dans les plantes présentant des symptômes, atteignant des vecteurs de 85 000 pmoles de méthylumbelliferone formée/min/mg de protéine.
    e) Activation par une blessure
    Cette activation a été recherchée sur des feuilles de plantes de génération R1 contenant la construction pSG246, âgées de 5 semaines environ et préalablement sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine.
    L'excision simple d'une feuille entraíne une activation lente et faible du promoteur, à la fois dans la feuille et dans la plante ; cependant, la lacération d'une feuille entraíne une augmentation très forte (5 fois) et extrêmement rapide (30 min) de l'activité glucuronidase de la feuille lacérée.
    f) Activation par un choc thermique
    Des plantes de tabac, de génération R1, contenant la construction pSG246, âgées de 5 semaines environ et préalablement sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine sont transférées pendant 2 ou 4 h dans une enceinte à 40°C afin de provoquer un choc thermique. A la fin du traitement, les plantes sont immédiatement congelées dans l'azote liquide et leur activité β-glucuronidase déterminée sur l'ensemble de la partie aérienne.
    Le même protocole est appliqué à des plantes transformées par la construction pBI 121 ; l'activité de ces dernières n'est pas modifiée par le choc thermique.
    Par contre, les plantes contenant la construction pSG246 présentent une forte augmentation d'activité glucuronidase après le choc thermique ; le facteur moyen de stimulation, déterminé sur plusieurs plantes, est voisin de 12.
    g) Expression au cours du développement et répartition spatiale de l'expression dans la plante
    L'utilisation du substrat histochimique de révélation de l'activité glucuronidase, le 5-brome-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide de cyclohexylammonium (X-gluc) selon la méthode décrite par Jefferson (Plant Molecular Biology Reporter, 5, 387, 1987), permet de visualiser la localisation de l'activité dans les tissus de la plante.
    Germination des graines :
    Au cours de la germination des graines de tabac de génération R1 exprimant la glucuronidase sous contrôle du promoteur 246C, l'expression est non détectable dans les cotylédons, élevée dans toute la racine et très forte dans les méristèmes racinaires et caulinaires. Dans la plante développée la détection de l'activité glucuronidase a été relevée dans tous les tissus testés, y compris dans la graine sèche.
    Section 18 : Obtention de plantes de colza transformées par Agrobacterium rhizogenes contenant le plasmide pSG246.
    La transformation est réalisée selon le protocole de P. Guerche et al. (P. Guerche et al., 1987, Mol. Gen. Genet., 206, 382). Les différents milieux de culture sont ceux décrits par Pelletier et al. (Pelletier et al., 1983, Mol. Gen. Genet., 191, 244). Leur composition sera explicitée par la suite (tableau 2).
    a) Obtention de racines transformées
    Des segments de tige sont prélevés sur l'extrémité apicale de plantes de colza (Brassica napus : variétés de printemps Brutor et Westar et variété d'hiver) de 1 m de haut environ. Ces segments sont stérilisés en surface, rincés dans de l'eau stérile, découpés en segments de 1,5 cm de long environ et placés dans un tube contenant le milieu A.
    L'inoculation de l'extrémité de ce segment est effectuée par dépôt d'une suspension de la souche d'Agrobacterium rhizogenes contenant le plasmide psG 246.
    Des racines transformées apparaissent sur le segment de tige au bout de 1 à 2 semaines, elles sont prélevées et placées sur le milieu B gélosé (15 g/l) et complémenté par 500 µg de céfotaxime/ml.
    b) Régénération de plantes transformées
    Des fragments de racines sont incubés pendant 15 jours dans le milieu D contenant 3 mg/l d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique, puis placés sur le milieu RCC d'induction de bourgeons. Des plantes racinées sont ensuite obtenues par passage des bourgeons sur les milieux F et G.
    Figure 00340001
    Figure 00350001
    Section 19 : Caractéristiques de l'expression du gène de glucuronidase sous contrôle du promoteur 246C dans les plantes de colza a) Activation par une blessure
    Les feuilles de plantes de colza de génération R1, renfermant la glucuronidase sous contrôle du promoteur 246C ont été excisées ou excisées et lacérées.
    Une activation faible d'activité glucuronidase est observée dans les feuilles excisées ; une activation très forte (6 fois l'activité basale) et extrêmement rapide (30 min environ) est consécutive à la lacération.
    b) Infection par les champignons phytopathogènes Parasite foliaire (Alternaria brassicae) :
    Des plantes de colza de génération R1, possédant la construction pSG246 sont cultivées pendant 3 semaines environ en pot sur du terreau. Les plantes sont alors inoculées localeaent à l'aide d'une suspension de spores (10 ml, contenant 1000 spores obtenues après culture sur le milieu gélosé PDA) du champignon pathogène Alternaria brassicae, déposées sur une blessure réalisée à l'aide d'une aiguille. Une nécrose se développe alors autour de cette blessure.
    On observe alors une forte stimulation de l'activité glucuronidase (détectée par test à l'aide de X-gluc, Section 17e) dans la feuille inoculée, autour de la zone nécrotique.
    Parasite racinaire (Rhizoctonia solani)
    Des graines de colza de génération R1, transformées par la construction pSG246 sont semées sur un substrat constitué d'un mélange de tourbe, vermiculite et sable (10: 10: 5. v : v) contenu dans un pot de 1 litre. Les graines sont recouvertes d'une couche de 1 cm de substrat contenant 10 000 propagules viables de Rhizoctonia solani par gramme. Ces propagules sont obtenus par culture pendant 15 jours d'une souche de Rhizoctonia en fiole de Roux sur des grains de riz, suivi d'un broyage à une granulométrie inférieure à 1 mm.
    Au cours de leur développement, les plantes de colza sont attaquées au niveau racinaire.
    On observe une forte stimulation de l'activité glucuronidase (détectée par test à l'aide de X-gluc, Section 17e) dans les racines de plantes infectées, comparativement à l'activité mesurée dans les racines de plantes contrôles (même descendance R1 de plantes transformées mais non infectées). De plus, une forte stimulation de l'activité glucuronidase est induite de façon systémique dans les parties aériennes.
    c) Activation par un choc thermique des plantes de colza de génération R1
    Des plantes de colza, de génération R1, contenant la construction pSG246, âgées de 5 semaines environ sont transférées pendant 2 ou 4 h dans une enceinte à 40°C afin de provoquer un choc thermique. A la fin du traitement, les plantes sont immédiatement congelées dans l'azote liquide et leur activité β-glucuronidase déterminée sur l'ensemble de la partie aérienne.
    Le même protocole est appliqué à des plantes transformées par la construction pBI 121 ; l'activité de ces dernières plantes n'est pas affectée par le choc thermique.
    Par contre, les plantes contenant la construction pSG246 présentent une forte augmentation d'activité glucuronidase après le choc thermique ; le facteur moyen de stimulation, déterminé sur plusieurs plantes, est voisin de 12.
    d) Expression au cours du développement
    Au cours de la germination de graines de colza de génération R1 renfermant la glucuronidase sous contrôle du promoteur 246C. on observe une expression de cette protéine dans les cotylédons ; une expression élevée dans toute la racine et très forte dans les méristèmes racinaires et caulinaires.
    Une très forte expression a également été mesurée dans les racines et cals transformés, au cours des étapes de régénération de plantes transgéniques ainsi que dans les diverses parties de la plante (y compris les graines matures).
    Section 20 : Obtention de cals de tournesol transformés par Agrobacterium rhisogenes contenant le plasmide pSG246.
    La transformation est réalisée selon le protocole de Guerche et al (Mol. Gen. Genet., 206, 382, 1987) initialement mis au point pour la transformation du colza. Les différents milieux de culture sont ceux décrits par Pelletier et al. (Mol. Gen. Genet. 191, 244, 1983) leur composition a été explicitée (tableau 2).
    Des hypocotyles de tournesol sont obtenus par germination pendant 7 à 10 jours de graines sur de la vermiculite. Ces graines sont placées dans une chambre de culture, les conditions 16 h d'éclairement à 20°C/8 h d'obscurité à 17°C. Les hypocotyles sont stérilisés en surface, rincés dans de l'eau stérile et placés dans un tube contenant du milieu Murashige et Skoog, dont la concentration en macroéléments est réduite de moitié.
    L'inoculation de l'extrémité de ce segment est effectuée par dépôt d'une suspension de la souche d'Agrobacterium rhisogenes contenant le plasmide pSG246.
    Des racines transformées apparaissent au bout de un mois, elles sont prélevées et placées sur le milieu B gélose (15 g/l) et complémenté par 500 µg de cefotaxime/ml pendant 4 semaines avec un repiquage hebdomadaire. Elles sont ensuite cultivées dans le même milieu liquide en agitation (100 tours/min) et repiquées tous les mois. Le passage de ces racines dans le milieu D, permet la formation de cals à partir des racines transformées.
    L'activité glucuronidase des racines cultivées dans le milieu B liquide et de cals cultivés sur le milieu D, estimée par fluorimétrie, présente des valeurs très importantes, comprises entre 104 et 105 pmoles de methylumbelliferone formée/min/mg de protéines.
    Section 21 : Expression transitoire du gène de la glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246C dans des embryons immatures de Tournesol.
    Les embryons immatures des plantes mères au champ du génotype 105 ont été prélevés et mis en culture pendant 14 jours sur le milieu I (tableau 3) à 25° C et à l'obscurité. Ces embryons sont ensuite cultivés pendant 3 jours sur le mileu II à 25° C sous une photopériode de 16 heures par jour/ 8 heures par nuit. Une vingtaine d'embryons sont ensuite déposés côte-à-côte sur le milieu III.
    Préparation du vecteur pSG123 :
    Celle-ci est réalisée selon le protocole décrit en Section 10.
    Transformation du matériel végétal :
    L'introduction de l'ADN plasmidique (vecteur pSG123) dans les cellules végétales est réalisé par utilisation du canon à particules construit sur le principe décrit par Zumbrunn (Zumbrunn et al. 1989 Technique 1(3) 204-216). L'ADN plasmidique est adsorbé sur des nicroparticules de tungstène à raison de 4µg/mg de tungstène. 2,5mg du mélange tungstène/ADN sont alors déposés sur un macroprojectile qui est accéléré par l'explosion d'une cartouche.
    L'écrasement du macroprojectile sur une plaque d'arrêt percée d'un trou permet de projeter les microparticules de tungstène et l'ADN dans les cellules.
    Mesure de l'expression transitoire :
    L'ADN adsorbé sur les microparticules de tungstène qui ont pénétré dans les cellules végétales est libéré ; le gène chimérique associant le promoteur du gène 246C à la glucuronidase est alors transcrit puis traduit. La glucuronidase obtenue est alors visualisée par le test histochimique décrit par JEFFERSON et al, 1987 Plant Molecular BIology Reporter 5,387, en utilisant le substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide de cyclohexylammonium (X-gluc). Les cellules exprimant le gène présentent alors une coloration bleue.
    Le comptage du nombre de cellules bleues obtenues par boite de Petri au cours d'une expérience d'expression transitoire permet de compter le nombre de cellules transformées et d'estimer l'expression de la construction chimérique testée.
    L'expression transitoire mesurée en utilisant le substrat X-gluc., 48 heures après le bombardement à l'aide du canon à microparticules montre que le gène de β-glucuronidase s'exprime dans les embryons immatures de Tournesol.
    L'intensité est plus forte que celle induite par l'utilisation du plasmide pBI221 (Clontech), dans lequel le gène de glucuronidase est placé sous contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du choux-fleur.
    Le nombre de cellules transformées exprimant le gène de glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246C est voisin de 140 par boite (valeur moyenne de 4 expériences) alors que le nombre de cellules transformées est de 60 par boite (valeur moyenne de 4 expériences) en présence du plasmide pBI221 dans lequel le gène de glucuronidase est placé sous contrôle du promoteur 35 S du virus de la mosaïque du choux-fleur.
    Les embryons sont ensuite égouttés sur du papier filtre stérile, puis remis en culture sur le milieu II à l'obscurité pendant 3 jours. Les embryons sont alors brièvement rincés par du milieu Murashige et Skoog liquide (Murashige et Skoog, 1962, Physiol. Plant 15 : 473) contenant 500 mg/l de l'antibiotique céfotaxime. Ils sont ensuite égouttés sur du papier filtre stérile et mis en culture sur du milieu III contenant 250 mg/l de céfotaxime. 250 mg/l de carbenicilline et 50 mg/l de paromomycine. Cette culture s'effectue à 25°C sous une photopériode de 16 h jour / 8 h nuit ; les tissus végétaux sont repiqués tous les 21 jours sur ce même milieu.
    Les bourgeons néoformés à partir de ces tissus sont transférés sur le milieu IV, sous les mêmes conditions de température et photopériode. Les plantes enracinées sont ensuite mises à pousser en serre.
    Section 22 : Expression de la β-glucuronidase, sous contrôle du promoteur 246C dans les plantes de Tournesol transformées.
    Les plantes exprimant la construction pSG246 ont une expression de la glucuronidase au moins égale à celle obtenue avec des plantes transformées à l'aide de la construction pBI121.
    Composition des différents milieux utilisés pour l'obtention de plantes de tournesol transformées
    Milieux I II III IV
    KNO3 2500 2500 1900 1900
    NH4 NO3 - - 1650 1650
    CaCl2, 2H2O 150 150 440 440
    MgSO4,7H2O 250 250 370 370
    KH2 PO4 - - 170 170
    (NH4)2 SO4 134 134 - -
    NaH2PO4,H2O 150 150 - -
    ZnSO4,7H2O 2 2 8,6 8,6
    H3 BO3 3 3 6,2 6,2
    KI 0,75 0,75 0,83 0,83
    CuSO4,5H2O 0,025 0,025 0,025 0,025
    Na2MoO4,2H2O 0,25 0,25 0,25 0,25
    CoCl2, 6H2O 0,025 0,025 0,025 0,025
    Mn SO4, 4H2O 10 10 22,3 22,3
    Na2 EDTA 37,3 37,3 37,3 37,3
    FeSO4 ,7H2O 27,8 27,8 27,8 27,8
    Ac. nicotinique 1 - 1 0,5 0,5
    Thiamine HCl 10 10 0,1 0,1
    Pyridoxine HCl 1 1 0,1 0,5
    Myo-inositol 4000 4000 100 100
    L-glycine - - - 2
    L-alanine 1000 1000 - -
    L-glutamine 800 800 - -
    L-serine 160 160 - -
    L-tryptophane 50 50 - -
    L-cystéine 10 10 - -
    Ca-D-panthoténate - - 0.8 -
    Ac. folique - - 0.1 -
    Chl. de choline - - 0,1 -
    Ac p-Aminobenzoïque - - 0.05 -
    Riboflavine - - 0.05 -
    Saccharose 120 000 60 000 30 000 30 000
    Ac.Dichloro-2-4-phenoxyacétique 2 - - -
    6-Benzylaminopurine - 0.4 - -
    Kinétine - - 1 -
    Ac.indoleacetique - - - 0,05
    Agar 7000 7000 7000 8000
    pH 5.7 5.8 5.7 5.7
    Section 23 : Protocole de l'expression dans les tissus de monocotylédones du gène de la β-glucuronidase, sous contrôle du promoteur 246C Obtention du matériel végétal :
    Des graines du génotype d'orge GERBEL sont mises à germer en serre sur de la vermiculite. Au bout de 7 jours, les feuilles et les racines ont été prélevées et placées sur une boite de Petri contenant du milieu Murashige et Skoog gélosé pour les expériences d'expression transitoire.
    Des embryons immatures de Maïs sont prélevés 10 à 14 jours après pollinisation à partir de pieds mères (lignée LH132) cultivés en serre. Les embryons sont placés côté axe embryonnaire en contact avec le milieu d'induction (composition donnée dans le tableau 4 ci-après) puis sur le milieu d'entretien (tableau 5), 3 semaines plus tard. Les cals obtenus sont repiqués toutes les semaines. Les expériences d'expression transitoire sont réalisées quelques heures après le repiquage.
    Préparation du vecteur pSG123 :
    Celle-ci est réalisée selon le protocole décrit en Section 10.
    Transformation du matériel végétal :
    L'introduction de l'ADN plasmidique (vecteur pSG123) dans les cellules végétales est réalisé par utilisation du canon à particules construit sur le principe décrit par Zumbrunn (Zumbrunn et al. 1989 Technique 1 (3) 204-216). L'ADN plasmidique est adsorbé sur des microparticules de tungstène à raison de 4 µg/mg de tungstène. 2,5 mg du mélange tungstène/ADN sont alors déposés sur un macroprojectile qui est accéléré par l'explosion d'une cartouche.
    L'écrasement du macroprojectile sur une plaque d'arrêt percée d'un trou permet de projeter les microparticules de tungstène et l'ADN dans les cellules.
    Mesure de l'expression transitoire :
    L'ADN adsorbé sur les microparticules de tungstène qui ont pénétré dans les cellules végétales est libéré ; le gène chimérique associant le promoteur du gène 246C à la glucuronidase est alors transcrit puis traduit. La glucuronidase obtenue est alors visualisée par le test histochimique décrit par JEFFERSON et al, 1987 Plant Molecular Biology Reporter 5,387, en utilisant le substrat 5-brome-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide de cyclohexylammonium (X-gluc). Les cellules exprimant le gène présentent alors une coloration bleue.
    Le comptage du nombre de cellules bleues obtenues par boíte de Petri au cours d'une expérience d'expression transitoire permet de compter le nombre de cellules transformées et d'estimer l'expression de la construction chimérique testée.
    Milieu d'induction de cals de Maïs à partir d'embryons immatures (en mg pour 1 litre)
    MgSO4, 7H2O 370
    CaCl2, 2H2O 440
    KNO3 1 900
    NH4NO3 1 650
    KH2PO4 170
    Na2MoO4, 2H2O 0,25
    CuSO4, 5H2O 0,025
    MnSO4, H2O 16,75
    H3BO3 6,2
    ZnSO4, 7H2O 8,6
    KI 0,83
    CoCl2, 6H2O 0,025
    FeEDTA 65,1
    Saccharose 20 000
    Hydrolysat de caséine 100
    L-proline 5 800
    Glycine 2
    Acide nicotinique 0,5
    Pyridoxine HCl 0,5
    Inositol 100
    Thiamine HCl 0,1
    Acide abscissique 0,06
    Chloramben 4,12
    Phytagel 3000
    pH = 5.7 Autoclavage 20 min à 120°C
    Milieu d'entretien des cals de Maïs (en mg pour 1 litre)
    MgSO4, 7H2O 370
    CaCl2, 2H2O 440
    KNO3 1 900
    NH4NO3 1 650
    KH2PO4 170
    Na2MoO4, 2H2O 0,25
    CuSO4, 5H2O 0,025
    MnSO4, H2O 16,75
    H3BO3 6,2
    ZnSO4, 7H2O 8,6
    KI 0,83
    CoCl2, 6H2O 0,025
    FeEDTA 65,1
    Saccharose 20 000
    Hydrolysat de caséine 100
    L-proline 2 900
    Glycine 2
    Acide nicotinique 0,5
    Pyridoxine HCl 0,5
    Inositol 100
    Thiamine HCl 0,1
    Dicamba (Banvel®) 0,002
    Gelrite 3 000
    pH = 5,7 Autoclavage 20 min à 120°C
    Section 24 : Expression transitoire du gène de la β-glucuronidase sous contrôle du promoteur du gène 246C dans les tissus d'orge et les cals de Maïs
    L'expression transitoire mesurée en utilisant le substrat X-gluc, 48 heures après le bombardement à l'aide du canon à microparticules montre que le gène de β-glucuronidase s'exprime dans les feuilles et les racines d'orge et également dans les cals de Maïs.
    L'intensité de l'expression est aussi forte que celle induite par l'utilisation du plasmide pBI 221 (Clontech), dans lequel le gène de glucuronidase est placé sous contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du choux-fleur.
    Le promoteur du gène 246C du tabac est donc capable de diriger l'expression d'un gène dans les monocotylédones.
    Section 25 : Construction d'un plasmide plaçant le gène de la chitinase tomate-tabac sous le contrôle du promoteur inductible et expression de celui-ci dans le tabac a) Préparation de la séquence promotrice
    Le plasmide pSG123 décrit précédemment est digéré à l'aide des endonucléases Hind III et Sca I. Après électrophorèse sur gel d'agarose, le fragment Hind III - Sca I de 2088 paires de bases contenant tout le promoteur inductible à l'exception des 57 paires de bases situées immédiatement en amont de l'ATG est purifié.
    La ligation de ce fragment purifié, de l'oligonucléotide de synthèse Sca I - Bam HI de 62 paires de bases de séquence [SEQ ID NO : 15] et d'un vecteur pTZ 19R (Pharmacia) linéarisé grâce aux endonucléases Hind III et Bam HI a donné naissance au plasmide pPH 111.
    A partir de ce plasmide pPH 111 par coupure à l'aide des endonucléases Hind III - Bam HI, puis électrophorèse sur gel d'agarose, le fragment Hind III - Bam HI de 2150 paires de bases contenant le promoteur inductible dans son entier est isolé.
    b) Préparation du fragment portant un gène hybride codant pour une protéine à activité endochitinase
    Le fragment BamHI - EcoRI provenant du plasmide pBR1 décrit dans la demande de brevet EP-493 581, Exemple 1 et contenant un gène chimérique codant pour une protéine à activité endochitinase [SEQ ID NO : 16], qui comprend la séquence codant pour une endochitinase hybride tomate-tabac (en position 438-1587) et le terminateur NOS, est purifié.
    c) Clonage dans le vecteur binaire pBIN 19
    On a ligué à l'aide de l'ADN ligase T4 la séquence promotrice (cf. ci-dessus) la séquence codant pour la chitinase et la séquence terminatrice. dans le vecteur binaire pBIN 19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res., 12, 8711-8721), ouvert à l'aide des endonucléases Hind III et EcoRI. Ce vecteur porte deux gènes de résistance à la kanamycine, l'un pouvant s'exprimer dans les bactéries, l'autre situé immédiatement en amont du gène recombinant complet pouvant être transféré aux cellules végétales.
    Le vecteur obtenu, appelé pBR 20, est cloné dans la souche E. coli HB 101 (Clontech).
    2) Transformation d'Agrobacterium tumefaciens
    La transformation de la souche d'Agrobacterium tumefaciensLBA 4404 (Clontech) est réalisée selon la méthode de congélation-décongélation décrite dans Plant Molecular Biology Manual (Gelvin et al, op. cité) (résumé en section 14) à partir de 1 mg de plasmide pBR20.
    3) Transformation du tabac
    Du tabac Nicotiana tabacum cultivé in vitro a été infecté par Agrobacterium tumefaciens contenant le plasmide pBR 20 selon la procédure de Horsch et al., bien connue de l'homme du métier (Horsch R.B. et al., 1985 Science 227, 1229-1231), dont les principales étapes sont exposées ci-après.
    Des disques de feuilles de plantes axéniques de tabac Nicotiana tabacum (variété Wisconsin Havana 38) sont incubés dans une culture d'A. tumefaciens hébergeant le plasmide pBR 20. Les disques égouttés sur papier Whatman sont mis en culture sur des milieux de culture en boites de Pétri afin de multiplier les cellules transformées de façon à obtenir des cals. Ces cals sont ensuite transférés sur du milieu contenant de la céfotaxime à 500 mg/ml destinée à décontaminer les tissus végétaux (élimination des Agrobacterium tumefaciens) et de la kanamycine à 100 mg/ml pour sélectionner le matériel transgénique.
    Mise en évidence de l'expression de la protéine à activité endochitinase dans les tabacs transgéniques a) Préparation des extraits bruts de protéines de tabac transformé
    Les extraits bruts de protéines ont été préparés à partir de différents tissus de la plante (racine, tige, feuille, etc ...). Les fragments de tissus ont été congelés dans l'azote liquide, réduits en poudre et stockés à -20°C. La poudre a été extraite à 4°C en présence d'un tampon acétate d'ammonium 0,1 M pH 5,2 et soumise à une centrifugation à 10 000 g. La concentration des protéines totales a été déterminée sur les surnageants, appelés ci-après les extraits bruts de protéines en suivant la technique de Bradford (Bradford, M.M., 1976 Anal. Biochem., 72. 248-254).
    b) Mise en évidence de la chitinase hybride par immuno-empreinte (Western Blot)
    On soumet les extraits bruts de protéines à un Western blot, technique bien connue de l'homme de l'art et décrite par H. Towbin et al. (Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 76, 1979, 4350-4354).
    L'immunodétection de la protéine d'intérêt se réalise grâce à un immunsérum contenant des anticorps polyclonaux reconnaissant la protéine hybride à activité chitinase (cf. EP-493 581, section 5).
    Le complexe antigène-anticorps est ensuite révélé à l'aide d'un système streptavidine-biotine conjugué à la phosphatase alcaline avec le kit RPN 23 d'Amersham ("Blotting détection kit"), utilisé selon les indications du fabricant.
    L'empreinte obtenue montre, pour les feuilles de plantes de tabac transformées par le plasmide pBR 20, la présence d'une protéine de poids moléculaire apparent d'environ 26 ± 6kDa reconnue par les anticorps polyclonaux et absente des feuilles des plantes de tabac témoins. Cette protéine a le même poids moléculaire apparent que la protéine hybride à activité chitinase décrite dans la demande EP-493 581.
    Section 26 : Localisation des séquences minimales du promoteur 246C responsables des caractéristiques décrites
    A partir du vecteur pSG123, associant le promoteur du gène 246C au gène de la β-glucuronidase, différentes délétions ont été effectuées dans la région 5' de ce promoteur. Celles-ci ont été obtenues soit par utilisation d'enzymes de restriction et/ou de la nucléase Exo3. L'extension précise des délétions a été déterminée par séquençage selon la méthode de Sanger. La figure 3 présente les différents vecteurs obtenus à l'aide de ces délétions de la partie 5' du promoteur, comptées à partir du site d'initiation de la transcription en position 2068.
    a. Etude de la force du promoteur 246C par expression transitoire dans des protoplastes de tabac.
    Ces vecteurs ont été utilisés en expression transitoire sur des protoplastes de tabac qui ne reçoivent aucun effecteur. L'analyse des résultats montre que l'expression maximale est obtenue avec les vecteurs pSG 251 et pSG 33. atteignant 30 000 pmol de méthylumbellifèrone formée/min/mg protéine. Des délétions plus importantes effectuées dans ce promoteur (correspondant aux vecteurs PSG29, pSG23, pSG451, pSG2, pSG24, pSG3, pSG1 ont pour conséquence une réduction de l'expression de la glucuronidase d'autant plus grande que la délétion est importante (tableau ci-dessous).
    Délétions successives de pSG123 Activité GUS (pMoles/min/mg)
    Témoin 0
    pBI221 ≈ 1000
    pSG123 5000
    pSG251 29000
    PSG33 31000
    PSG29 26000
    PSG23 22000
    pSG451 10000
    pSG2 4000
    PSG14 1000
    pSG3 0
    pSG1 0
    Les vecteurs pSG 251 et pSG 33 correspondant respectivement aux promoteurs comprenant la séquence (B) [vecteur pSG 33] et la séquence (C) [vecteur pSG 251] respectivement.
    b. Etude de la force du promoteur par expression stable de constructions chimériques renfermant des promoteurs délétés, dans des tabacs transgéniques.
    Pour chacun des vecteurs décrits par la figure 3 le gène chimérique associant le promoteur (complet ou tronqué) à la partie codante de la glucuronidase et le terminateur NOS a été purifié sur gel d'agarose après coupure par des endonucléases de restriction Hind III et EcoRI. Dans chacun des cas. le gène chimérique a été introduit et ligué dans le vecteur binaire pBIN19 (Clontech) préalablement ouvert aux sites Hind III et EcoRI (Section 13).
    Le tabac, Nicotiana tabacum cultivé in vitro a été infecté par Agrobactérium tumefaciens contenant les différentes constructions décrites ci-dessus. La procédure suivie est celle décrite à la Section 15.
    L'activité glucuronidase est la moyenne des mesures effectuées sur 10 à 20 transformants indépendants. En l'absence d'inducteur, l'activité glucuronidase de base des différents génotypes n'est pas sensiblement affectée par les délétions pour les constructions allant de pSG251 à pSG451 : elle est sensiblement identique à celle de génotypes renfermant la construction pSG123 (fig.3). Par contre, pour les constructions pSG2, pSG24, pSG3, pSG1, l'expression est d'autant plus faible que la longueur du promoteur est courte : les expressions pour pSG3 et pSG1 étant nulles.
    En présence d'inducteurs bactériens (voir section 17), les plantes contenant les constructions pSG251 et pSG33 ont une expression stimulée par un facteur 3 par rapport à la construction pSG123. Ceci indique que la partie délétée correspondant à la séquence D [SEQ. ID No. 6] contient une séquence diminuant l'inductibilité du promoteur 246 C par contre la séquence B [SEQ. ID No. 4] seul, ou en présence de la séquence C [SEQ. ID No. 5] autorise une inductibilité supérieure à celle de la séquence du promoteur 246 C (séquences B+C+D).
    L'expression est par contre inchangée pour les génotypes contenant les constructions pSG29 et pSG23 par rapport aux génotypes renfermant les constructions pSG123.
    Pour les génotypes contenant les constructions pSG451, pSG2, pSG24, pSG3, pSG1, l'inductibilité est systématiquement inférieure à celles des génotypes renfermant la construction pSG123 : elle est d'autant plus faible que le promoteur est court et s'annule pour les plantes renfermant les constructions pSG3 et psG1.
    Ces résultats indiquent que la séquence D [SEQ. ID No. 6] comporte une information de type "silencer" qui inhibe partiellement l'inductibilité du promoteur complet (séquences B+C+D).
    LISTE DE SEQUENCES
  • (1) INFORMATIONS GENERALES:
  • (i) DEPOSANT:
  • (A) NOM : BIOGEMMA
  • (B) RUE: 1, rue Edouard Colonne
  • (C) VILLE : PARIS
  • (E) PAYS : France
  • (F) CODE POSTAL : 75001
  • (G) TELEPHONE : 01 55 34 94 06
  • (ii) TITRE DE L' INVENTION: PROMOTEUR VEGETAL, MICROORGANISMES ET CELLULES VEGETALES CONTENANT UNE UNITE D'EXPRESSION D'UNE PROTEINE D'INTERET COMPRENANT LEDIT PROMOTEUR
  • (lii) NOMBRE DE SEQUENCES: 18
  • (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
  • (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
  • (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
  • (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 631 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (vii) SOURCE IMMEDIATE:
  • (B) CLONE: 246
  • (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
  • (A) NOM/CLE CDS
  • (B) EMPLACEMENT: join(1..177, 368..631)
  • (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
  • (A) NOM/CLE: intron
  • (B) EMPLACEMENT: 178..367
  • (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
  • (A) NOM/CLE: mise-signal
  • (B) EMPLACEMENT: 175..182
  • (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /fonction= "séquences consensus d'épissage"
  • (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
  • (A) NOM/CLE: misc-signal
  • (B) EMPLACEMENT: 323..333
  • (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /fonction= "séquences consensus d'épissage"
  • (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
  • (A) NOM/CLE: mise-signal
  • (B) EMPLACEMENT: 363..368
  • (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /fonction= "séquence consensus d'épissage"
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
    Figure 00520001
    Figure 00530001
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 147 acides aminés
  • (B) TYPE: acide aminé
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
    Figure 00540001
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 441 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (vii) SOURCE IMMEDIATE:
  • (B) CLONE: 246
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE; SEQ ID NO: 3:
    Figure 00540002
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 1096 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génonique)
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
    Figure 00550001
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 236 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
    Figure 00560001
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 813 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
    Figure 00560002
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 3046 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (vii) SOURCE IMMEDIATE:
  • (B) CLONE: 246C
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
    Figure 00570001
    Figure 00580001
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 809 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
    Figure 00580002
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 331 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
    Figure 00590001
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 314 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
    Figure 00590002
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 161 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
    Figure 00600001
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
  • (1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 307 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
    Figure 00600002
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 538 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
    Figure 00610001
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
  • (1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 4284 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génonique)
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
    Figure 00610002
    Figure 00620001
    Figure 00630001
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15;
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 58 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génonique)
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
    Figure 00630002
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 1863 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
    Figure 00630003
    Figure 00640001
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 18 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
    Figure 00640002
  • (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18:
  • (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
  • (A) LONGUEUR: 18 paires de bases
  • (B) TYPE: acide nucléique
  • (C) NOMBRE DE BRINS: simple
  • (D) CONFIGURATION: linéaire
  • (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
  • (iii) HYPOTHETIQUE: NON
  • (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
    Figure 00650001

    • Claims (8)

    1. Promoteur végétal, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence (B) [SEQ ID NO : 4] ci-après :
      Figure 00660001
      ou une séquence ayant un degré d'homologie d'au moins 80 % avec la séquence (B).
    2. Promoteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en amont de la séquence (B), la séquence (C) [SEQ ID NO : 5] ci-après :
      Figure 00660002
      ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (C).
    3. Promoteur selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend en amont de la séquence (B), la séquence (D) [SEQ ID NO : 6] ci-après :
      Figure 00670001
      ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (D).
    4. Utilisation d'un promoteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour obtenir en situation de stress, la surexpression dans un végétal d'une protéine d'intérêt , cette protéine pouvant être destinée à aider les végétaux à surmonter un état de stress.
    5. Cellules végétales, à l'exception des cellules végétales présentes à l'état naturel, microorganismes (bactéries) ou cellules de microorganismes ayant intégré une unité d'expression d'une protéine comprenant le promoteur végétal selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
    6. Végétal ou partie de végétal, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules végétales selon la revendication 5.
    7. Semence caractérisée en ce qu'elle comprend des cellules végétales selon la revendication 5.
    8. Utilisation d'un végétal ou d'une partie de végétal selon les revendications 6 et 7 pour sélectionner des molécules à activité phytosanitaire susceptibles d'induire des réactions de défense naturelles des végétaux contre des organismes phytopathogènes ou phytophages (champignons, bactéries, virus, insectes et nématodes).
    EP94911205A 1993-03-23 1994-03-23 Promoteur vegetal, microorganismes et cellules vegetales contenant une unite d'expression d'une proteine d'interet comprenant ledit promoteur Expired - Lifetime EP0689595B1 (fr)

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    FR9303299 1993-03-23
    FR9303299A FR2703054B1 (fr) 1993-03-23 1993-03-23 Promoteur vegetal inductible au stress et cellules vegetales contenant une unite d'expression d'une proteine d'interet comprenant ledit promoteur.
    PCT/FR1994/000316 WO1994021793A1 (fr) 1993-03-23 1994-03-23 Promoteur vegetal, microorganismes et cellules vegetales contenant une unite d'expression d'une proteine d'interet comprenant ledit promoteur

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    EP94911205A Expired - Lifetime EP0689595B1 (fr) 1993-03-23 1994-03-23 Promoteur vegetal, microorganismes et cellules vegetales contenant une unite d'expression d'une proteine d'interet comprenant ledit promoteur

    Country Status (8)

    Country Link
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    EP (1) EP0689595B1 (fr)
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    AU (1) AU6378994A (fr)
    DE (1) DE69433238T2 (fr)
    ES (1) ES2210251T3 (fr)
    FR (1) FR2703054B1 (fr)
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    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    ATE278027T1 (de) * 1996-02-01 2004-10-15 Ca Minister Agriculture & Food Promotor aus tabak
    FR2775001B1 (fr) * 1998-02-13 2000-05-12 Lvmh Rech Acide nucleique comprenant la sequence d'un promoteur inductible par un stress et une sequence d'un gene codant pour une stilbene synthase, cellule et plante transformees par cet acide nucleique
    FR2775000B1 (fr) * 1998-02-13 2002-02-08 Lvmh Rech Promoteur inductible dans les plantes, sequence incorporant ce promoteur et produit obtenu
    US7094953B2 (en) 1998-05-29 2006-08-22 Iowa State University Research Foundation, Inc. Plant retroelements and methods related thereto
    US6720479B1 (en) * 1998-05-29 2004-04-13 Iowa State University Research Foundation, Inc. Plant retroelements and methods related thereto
    US6774282B1 (en) 1999-03-08 2004-08-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize metallothionein gene and promoter
    US7122721B1 (en) 1999-10-05 2006-10-17 Basf Aktiengesellschaft Plant gene expression under the control of constitutive plant V-ATPase promoters
    US7119192B2 (en) * 2002-12-26 2006-10-10 Bio-Oriented Technology Research Advancement Institution Stress-induced promoter derived from rice
    CN1795267B (zh) * 2003-03-24 2010-10-06 独立行政法人国际农林水产业研究中心 胁迫-诱导的启动子及其使用方法
    US9580695B2 (en) * 2004-12-23 2017-02-28 Philip Morris Usa Inc. Reduction of tobacco-specific nitrosamines using genetic modification to elevate production of native antioxidants in tobacco
    RU2014151361A (ru) * 2012-05-18 2016-07-10 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Последовательности индуцируемого промотора для регулируемой экспрессии и способы применения

    Family Cites Families (2)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    NL9000773A (nl) * 1990-04-02 1991-11-01 Rijkslandbouwhogeschool Werkwijze voor het beschermen van planten tegen pathogenen.
    CA2132323A1 (fr) * 1992-03-20 1993-09-30 Gunter Strittmatter Gene chimerique a propriete antifongique

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