EP0406850A1 - Verfahren zur Herstellung von Purpurmembran enthaltend Bacteriorhodopsin - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Purpurmembran enthaltend Bacteriorhodopsin Download PDF

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EP0406850A1 EP90112805A EP90112805A EP0406850A1 EP 0406850 A1 EP0406850 A1 EP 0406850A1 EP 90112805 A EP90112805 A EP 90112805A EP 90112805 A EP90112805 A EP 90112805A EP 0406850 A1 EP0406850 A1 EP 0406850A1
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purple
carried out
bacteriorhodopsin
cell membrane
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/215—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Halobacteriaceae (F)
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    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Definitions

  • the invention relates to a method for producing purple membrane containing bacteriorhodopsin.
  • Bacteriorhodopsin is a chromoprotein that is produced by halobacteria such as Halobacterium halobium. It consists of a protein part (bacterioopsin) and a chromophore (retinal) and occurs in the cell membrane of the halobacteria in the form of the so-called purple membrane (hereinafter also referred to as PM). Bacteriorhodopsin is arranged in the PM in a two-dimensional crystalline, hexagonal lattice.
  • bacteriorhodopsin could be used in biocomputers (see Biosystems 1986, 19, 223 236) or as a holographic storage material for optical information processing (see Biophysics 1985, 30 (5), 962 - 967). To do this, however, it is necessary to be able to obtain large quantities of purple membranes. Due to the small physical differences between purple membranes and contaminating membrane fragments that do not contain bacteriorhodopsin, it is difficult to separate the purple membrane from the contaminating fragments.
  • the purple crystals can be produced by centrifugation bran in a sucrose density gradient 0.5 to 1.5 M or from 30 to 50 wt .-% sucrose.
  • BM Becher, JY Cassim, Preparative Biochemistry 1975, 5 (2), 161-178 describe centrifugation of the purple membrane using a sucrose step gradient with steps of 45, 40, 38, 36 and 16% by weight sucrose.
  • variable scale enlargement with respect to the amounts of bacteriorhodopsin to be achieved is not possible, as a result of which only comparatively small amounts of PM are isolated per workup.
  • the preparation of the sucrose gradient and the removal of the sucrose used from the PM obtained represent time-consuming work steps.
  • halobacteria such as Halobacterium halobium are cultivated in a manner known per se under conditions which favor the formation of purple membranes, such as, for example, low oxygen content of the medium and light (see D. Oesterhelt, W. Stoeckenius, Methods in Enzymology 1974, 31, 667-678).
  • the cells are harvested, for example, by centrifugation.
  • the cell membrane is obtained from the cell mass obtained in a manner known per se. Dialysis against deionized water and subsequent collection of the cell membrane was carried out by centrifugation. This membrane fraction containing purple membrane is then preferably washed with deionized water.
  • cell membrane fractions are applied according to the method of the invention to a chromatography column filled with a filtration material which has an exclusion limit with regard to molecular weight of preferably 2 ⁇ 106 to 109, in particular 107-109, and preferably with water, which has a preferred, specific conductivity of preferably 0.05 to 5 ⁇ S / cm, in particular 0.1 to 1.0 ⁇ S / cm, and shows a pH of preferably 6.0 to 7.5, in particular 6.3 - 6.7, at one temperature of preferably 1 to 30 ° C, in particular 4 to 10 ° C, eluted.
  • a filtration material which has an exclusion limit with regard to molecular weight of preferably 2 ⁇ 106 to 109, in particular 107-109, and preferably with water, which has a preferred, specific conductivity of preferably 0.05 to 5 ⁇ S / cm, in particular 0.1 to 1.0 ⁇ S / cm, and shows a pH of preferably 6.0 to 7.5, in particular 6.3 -
  • the length or the diameter of the chromatography column can vary as desired and depends on the amount of the cell membrane to be cleaned. For example, columns with a length of 50 to 100 cm and a diameter of 1.5 to 5 cm have proven effective for amounts of 10 to 100 mg of cell membrane.
  • the amount of the separating material to be used is preferably 5-15 ml per mg of cell membrane to be cleaned, in particular 9 to 11 ml / mg.
  • the elution rate is preferably 0.25 to 16 cm / h, in particular 0.5 to 6 cm / h, preferably with a pressure range of 0-5 bar overpressure, in particular 0-500 mbar overpressure.
  • Gel filtration materials with a particle size of 20-150 ⁇ m, in particular 40-105 ⁇ m, are preferably used.
  • the gel filtration materials used according to the invention are those that have also been used for gel filtration up to now.
  • Crosslinked or uncrosslinked dextrans, agarose derivatives or copolymers of oligoethylene glycol, glycidyl methacrylate and pentaerythritol dimethacrylate are preferably used.
  • Gel filtration materials are Sephacryl S 1000 (this should be a registered trademark of Pharmacia AB, Uppsala, Sweden), BioGel A 150m (this should be a registered trademark of BioRad Laboratories, Richmond, California, USA) ) and Fractogel TSK HW 75 (this should be a registered trademark of Merck, Darmstadt, Germany).
  • the membrane sediment obtained was washed with 80 ml of water with a specific conductivity of 0.1 ⁇ S / cm and centrifuged again at 38000 q.
  • the precipitate containing 20 mg PM was taken up with 3 ml deionized water and applied to a total of 5 sucrose density gradients of 28 ml volume with a sucrose content of 30-50% (w / w).
  • the density gradients were then centrifuged for 16 hours at 100,000 q in an ultracentrifuge.
  • the Density gradients were then fractionated, the PM-containing fractions combined and diluted with 2 volumes of deionized water.
  • the diluted PM suspension was then centrifuged at 38,000 q for 30 minutes, the resulting PMs washed again with 100 ml deionized water and centrifuged again at 38,000 q for 30 minutes. The resulting precipitate was taken up with a little deionized water. 14 mg PM could be obtained.
  • Halobacterium halobium cell paste 35 g were resuspended with 270 ml of a solution of 250 g / l NaCl, 20 g / l MgSO4.7H2O, 3 g / l trisodium citrate and 2 g / l KCl, mixed with 15 mg deoxyribonuclease and stirred for one hour.
  • the cell suspension was then dialyzed against deionized water for 16 hours. The dialysate was centrifuged at 7600 q for 10 minutes and the supernatant was centrifuged at 38000 q for 30 minutes to prepare the membranes.
  • the membrane sediment obtained was washed with 240 ml of water with a specific conductivity of 0.1 ⁇ S / cm and pH 6.7 and centrifuged again at 38000 q.
  • the precipitate containing 80 mg PM was then taken up with 7 ml of water of the above purity and pH and placed on a column filled with Sephacryl S 1000 75 cm long and 5.0 cm in diameter, which with water with a specific conductivity of 0, 1 ⁇ S / cm and pH 6.7 had been equilibrated. Elution was carried out at 5 ° C with an elution rate of 2 cm per hour.
  • the PM-containing fractions were pooled and the PM recovered by centrifugation at 38,000 q for 30 minutes. 60 mg of purple membrane could be obtained.
  • the optical spectrum of these membranes matched that of bacteriorhodopsin, no impurities could be found.
  • Halobacterium halobium cell paste 14 g were resuspended with 90 ml of a solution of 250 g / l NaCl, 20 g / l MgSO4.7H2O, 3 g / l trisodium citrate and 2 g / l KCl, mixed with 5 mg deoxyribonuclease and stirred for one hour.
  • the cell suspension was then dialyzed against deionized water for 16 hours. The dialysate was centrifuged at 7600 q for 10 minutes and the supernatant was centrifuged at 38000 q for 30 minutes to prepare the membranes.
  • the membrane sediment obtained was washed with 80 ml of water with a specific conductivity of 0.1 ⁇ S / cm and centrifuged again at 38000 q.
  • the precipitate containing 20 mg of PM was then taken up with 2.5 ml of water of the above purity and pH and placed on a column filled with Sephacryl S 1000 60 cm long and 2.5 cm in diameter, which with water with a specific conductivity of 0.1 ⁇ S / cm and pH 6.6 had been equilibrated. Elution was carried out at 5 ° C with an elution rate of 4.6 cm per hour.
  • the PM-containing fractions were pooled and the PM recovered by centrifugation at 38,000 q for 30 minutes. 15 mg of purple membrane could be obtained.
  • the optical spectrum of these membranes matched that of bacteriorhodopsin, and no impurities could be found.
  • Example 4 The experiment was carried out as in Example 4, but the specific conductivity of the water was 0.8 ⁇ S / cm and the pH was 6.5. 16 mg of PM were obtained, which corresponds to a yield of 82% in column chromatography.
  • Example 4 The experiment was carried out as in Example 4, but chromatography was carried out on a column filled with Sephacryl S 1000, 80 cm long and 2.5 cm in diameter. 15 mg of purple membrane could be obtained, which corresponds to a yield of 85% in column chromatography.
  • Example 4 The experiment was carried out as in Example 4, except that TSK HW 75 from Merck, Darmstadt, Germany was used as the separating material. 17 mg of purple membrane could be obtained. The yield on column chromatography was 60%.
  • Example 4 The experiment was carried out as in Example 4, but a 50 ⁇ m phosphate buffer with pH 6.5 was used as the eluent. 18 mg of purple membrane were obtained. The yield here was 85%.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Purpurmembran enthaltend Bacteriorhodopsin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß a) in an sich bekannter Weise die Zellmembran von Zellen von Halobakterien gewonnen wird und b) zur Isolierung der Purpurmembran aus der Zellmembran eine Gelfiltrationschromatographie durchgeführt wird.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Purpurmembran enthaltend Bacteriorhodopsin.
  • Bacteriorhodopsin ist ein Chromoprotein, das von Halobakte­rien wie Halobacterium halobium gebildet wird. Es besteht aus einem Proteinteil (Bacterioopsin) und einem Chromophor (Retinal) und kommt in der Zellmembran der Halobakterien in Form der sogenannten Purpurmembran (nachfolgend auch PM ge­nannt) vor. Bacteriorhodopsin ist in der PM in einem zweidimensional-kristallinen, hexagonalen Gitter angeordnet. Auf Grund seiner physikalischen Eigenschaften könnte Bacte­riorhodopsin in Biocomputern (vgl. Biosystems 1986, 19, 223 236) oder als holographisches Speichermaterial bei der opti­schen Informationsverarbeitung (vgl. Biophysics 1985, 30(5), 962 - 967) eingesetzt werden. Dazu ist es allerdings nötig, große Mengen von Purpurmembranen gewinnen zu können. Auf Grund der geringen physikalischen Unterschiede von Purpur­membranen und kontaminierenden Membranfragmenten, die kein Bacteriorhodopsin enthalten, ist es schwierig, die Purpur­membran von den kontaminierenden Fragmenten abzutrennen.
  • Gemäß D. Oesterhelt, W. Stoeckenius, Nature 1971, 233, 149 - 154 bzw. Methods in Enzymology 1974, 31, 667 - 678 ist es bekannt, die Herstellung durch Zentrifugation der Purpurmem­ bran in einem Saccharosedichtegradienten 0,5 bis 1,5 M bzw. von 30 bis 50 Gew.-% Saccharose durchzuführen.
    B.M. Becher, J.Y. Cassim, Preparative Biochemistry 1975, 5(2), 161 - 178, beschreiben eine Zentrifugation der Purpur­membran mittels eines Saccharosestufengradienten mit Stufen von 45, 40, 38, 36 und 16 Gew.-% Saccharose.
  • Wegen des hohen apparativen Aufwands bei diesen Gradienten­zentrifugationen, so sind beispielweise Ultrazentrifugen nö­tig, ist die variable Maßstabsvergrößerung bezüglich der zu erzielenden Mengen an Bacteriorhodopsin nicht möglich, wo­durch nur vergleichsweise geringe Mengen an PM pro Aufarbei­tung isoliert werden.
    Weiter stellen die Herstellung der Saccharosegradienten und die Entfernung der eingesetzten Saccharose von der erhalte­nen PM zeitintensive Arbeitsschritte dar.
  • Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Purpurmembran enthaltend Bacteriorhodopsin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
    • a) in an sich bekannter Weise die Zellmembran von Zellen von Halobakterien gewonnen wird und
    • b) zur Isolierung der Purpurmembran aus der Zellmembran eine Gelfiltrationschromatographie durchgeführt wird.
  • Zur Herstellung der Zellmembran werden Halobakterien wie Ha­lobacterium halobium in an sich bekannter Weise unter Be­dingungen kultiviert, die die Ausbildung von Purpurmembranen begünstigen, wie beispielsweise niedriger Sauerstoffgehalt des Mediums und Licht ( siehe D. Oesterhelt, W. Stoeckenius, Methods in Enzymology 1974, 31, 667 - 678). Nach entspre­chender Kultivationszeit werden die Zellen beispielsweise durch Zentrifugation geerntet. Aus der erhaltenen Zellmasse wird in an sich bekannter Weise die Zellmembran gewonnen. Bevorzugt wird eine Dialyse gegen deionisiertes Wasser und nachfolgendes Sammeln der Zellmembran durch Zentrifugation durchgeführt. Anschließend wird diese Purpurmembran ent­haltende Membranfraktion vorzugsweise mit deionisiertem Wasser gewaschen.
  • Diese Zellmembranfraktionen werden nach dem erfindungsge­mäßen Verfahren auf eine Chromatographiesäule, gefüllt mit einem Gefiltrationsmaterial, welches eine Ausschlußgrenze bezüglich Molekulargewicht von vorzugsweise 2·10⁶ bis 10⁹, insbesondere 10⁷-10⁹, aufweist, aufgetragen und vorzugsweise mit Wasser, welches eine bevorzugte, spezifische Leitfähig­keit von vorzugsweise 0,05 bis 5 µS/cm, insbesondere 0,1 bis 1,0 µS/cm, und einen pH-Wert von vorzugsweise 6,0 bis 7,5, insbesondere von 6,3 - 6,7 zeigt, bei einer Temperatur von vorzugsweise 1 bis 30 °C, insbesondere 4 bis 10°C, eluiert.
  • Die Länge bzw. der Durchmesser der Chromatographiesäule kann beliebig variieren und ist abhängig von der Menge der zu reinigenden Zellmembran. So haben sich beispielweise für Mengen von 10 bis 100 mg Zellmembran Säulen mit einer Länge von 50 bis 100 cm und einem Durchmesser von 1,5 bis 5 cm be­währt.
  • Die Menge des zu verwendenden Trennmaterials beträgt vor­zugsweise 5 - 15 ml pro mg zu reinigende Zellmembran, insbe­sondere 9 bis 11 ml/mg.
  • Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt vorzugsweise 0,25 bis 16 cm/h, insbesondere 0,5 bis 6 cm/h, wobei vorzugsweise bei einem Durckbereich von 0-5 bar Überdruck, insbesondere 0-500 mbar Überdruck gearbeitet wird.
  • Vorzugsweise werden Gelfiltrationsmaterialien mit einer Teilchengröße von 20 - 150 µm, insbesondere 40 - 105 µm, eingesetzt.
  • Die erfindungsgemäß eingesetzten Gelfiltrationsmaterialien sind solche, die auch bisher zur Gelfiltration verwendet wurden. Vorzugsweise finden vernetzte oder unvernetzte Dex­trane, Agarose-Derivate oder Copolymere von Oligoethylengly­col, Glycidylmethacrylat und Pentaerythroldimethacrylat Verwendung.
  • Besonders bevorzugte Gelfiltrationsmaterialien sind Sepha­cryl S 1000 (hierbei dürfte es sich um ein eingetragenes Warenzeichen der Firma Pharmacia AB, Uppsala, Schweden handeln), BioGel A 150m (hierbei dürfte es sich um ein eingetragenes Warenzeichen der Firma BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornien, USA handeln) und Fractogel TSK HW 75 (hierbei dürfte es sich um ein eingetragenes Warenzeichen der Firma Merck, Darmstadt, BRD handeln).
    • Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel)
  • 13 g Zellpaste von Halobacterium halobium wurden mit 90 ml einer Lösung aus 250 g/l NaCl, 20 g/l MgSO₄.7H₂O, 3 g/l Tri­natriumcitrat und 2 g/l KCl resuspendiert, mit 5 mg Desoxy­ribonuclease versetzt und eine Stunde gerührt. Die Zell­suspension wurde anschließend 16 Stunden gegen deionisiertes Wasser dialysiert. Das Dialysat wurde 10 Minuten bei 7600 q zentrifugiert und der Überstand zur Herstellung der Membra­nen 30 Minuten bei 38000 q zentrifugiert. Das erhaltene Membransediment wurde mit 80 ml Wasser mit einer spezifi­schen Leitfähigkeit von 0,1 µS/cm gewaschen und erneut bei 38000 q zentrifugiert. Der 20 mg PM enthaltende Niederschlag wurde mit 3 ml deionisiertem Wasser aufgenommen und auf ins­gesamt 5 Saccharose-Dichtegradienten von jeweils 28 ml Volu­men mit einem Saccharosegehalt von 30-50 % (w/w) aufgetra­gen. Die Dichtegradienten wurden anschließend für 16 Stunden bei 100000 q in einer Ultrazentrifuge zentrifugiert. Die Dichtegradienten wurden dann fraktioniert, die PM-haltigen Fraktionen vereinigt und mit 2 Volumina deionisiertem Wasser verdünnt. Die verdünnte PM-Suspension wurde alsdann für 30 Minuten bei 38000 q zentrifugiert, die erhaltenen PMs nochmals mit 100 ml deionisiertem Wasser gewaschen und er­neut für 30 Minuten bei 38000 q zentrifugiert. Die hieraus erhaltene Niederschlag wurde mit wenig deionisiertem Wasser aufgenommen. Es konnten 14 mg PM gewonnen werden.
    • Beispiel 2
  • 35 g Zellpaste von Halobacterium halobium wurden mit 270 ml einer Lösung aus 250 g/l NaCl, 20 g/l MgSO₄.7H₂O, 3 g/l Tri­natriumcitrat und 2 g/l KCl resuspendiert, mit 15 mg Desoxy­ribonuclease versetzt und eine Stunde gerührt. Die Zell­suspension wurde anschließend 16 Stunden gegen deionisiertes Wasser dialysiert. Das Dialysat wurde 10 Minuten bei 7600 q zentrifugiert und der Überstand zur Herstellung der Membranen 30 Minuten bei 38000 q zentrifugiert. Das erhalte­ne Membransediment wurde mit 240 ml Wasser mit einer spezi­fischen Leitfähigkeit von 0,1 µS/cm und pH 6,7 gewaschen und erneut bei 38000 q zentrifugiert. Der 80 mg PM enthaltende Niederschlag wurde sodann mit 7 ml Wasser obiger Reinheit und pH-Wertes aufgenommen und auf eine Säule, gefüllt mit Sephacryl S 1000 von 75 cm Länge und 5,0 cm Durchmesser, die mit Wasser mit einer spezifischen Leitfähigkeit von 0,1 µS/cm und pH 6,7 äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Elution erfolgte bei 5°C mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 2 cm pro Stunde. Die PM-haltigen Fraktionen wurden ver­einigt und die PM durch Zentrifugation für 30 Minuten bei 38000 q gewonnen. Es konnten 60 mg Purpurmembran erhalten werden. Das optische Spektrum dieser Membranen stimmte mit dem des Bacteriorhodopsins überein, es konnten keine Verun­reinigungen gefunden werden.
    • Beispiel 3
  • Es wurde wie in Beispiel 2 verfahren, jedoch betrug die Elutionsgeschwindigkeit bei der Säulenchromatographie 5,7 ml pro Stunde. Es konnten 72 mg Purpurmembranen erhalten wer­den entsprechend einer Ausbeute von 90% bei der Saulenchro­matographie.
    • Beispiel 4
  • 14 g Zellpaste von Halobacterium halobium wurden mit 90 ml einer Lösung aus 250 g/l NaCl, 20 g/l MgSO₄.7H₂O, 3 g/l Tri­natriumcitrat und 2 g/l KCl resuspendiert, mit 5 mg Desoxy­ribonuclease versetzt und eine Stunde gerührt. Die Zellsuspension wurde anschließend 16 Stunden gegen deioni­siertes Wasser dialysiert. Das Dialysat wurde 10 Minuten bei 7600 q zentrifugiert und der Überstand zur Herstellung der Membranen 30 Minuten bei 38000 q zentrifugiert. Das erhalte­ne Membransediment wurde mit 80 ml Wasser mit einer spezi­fischen Leitfähigkeit von 0,1 µS/cm gewaschen und erneut bei 38000 q zentrifugiert. Der 20 mg PM enthaltende Niederschlag wurde sodann mit 2,5 ml Wasser obiger Reinheit und pH-Wertes aufgenommen und auf eine Säule, gefüllt mit Sephacryl S 1000 von 60 cm Länge und 2,5 cm Durchmesser, die mit Wasser mit einer spezifischen Leitfähigkeit von 0,1 µS/cm und pH-Wert 6,6 äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Elution er­folgte bei 5°C mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 4,6 cm pro Stunde. Die PM-haltigen Fraktionen wurden vereinigt und die PM durch Zentrifugation für 30 Minuten bei 38000 q ge­wonnen. Es konnten 15 mg Purpurmembran erhalten werden. Das optische Spektrum dieser Membranen stimmte mit dem des Bacteriorhodopsins überein, es konnten keine Verunreinigun­gen gefunden werden.
    • Beispiel 5
  • Die Versuchsdurchführung entsprach Beispiel 4, wobei die Chromatographie bei 10°C durchgeführt wurde. Es konnten 18 mg Purpurmembranen gewonnen werden, was einer Ausbeute von 80% bei der Säulenchromatographie entspricht.
    • Beispiel 6
  • Die Versuchsdurchführung entsprach Beispiel 4, jedoch betrug die spezifische Leitfähigkeit des Wassers 0,8 µS/cm und der pH-Wert 6,5. Es wurden 16 mg PM erhalten, was einer Ausbeute von 82% bei der Säulenchromatographie entspricht.
    • Beispiel 7
  • Die Versuchsdurchführung entsprach Beispiel 4, jedoch wurde an einer Säule, gefüllt mit Sephacryl S 1000, von 80 cm Län­ge und 2,5 cm Durchmesser chromatographiert. Es konnten 15 mg Purpurmembran gewonnen werden, was einer Ausbeute von 85% bei der Säulenchromatographie entspricht.
    • Beispiel 8
  • Die Versuchsdurchführung entsprach Beispiel 4, jedoch wurde als Trennmaterial TSK HW 75 der Firma Merck, Darmstadt, BRD, verwendet. Es konnten 17 mg Purpurmembran erhalten werden. Die Ausbeute bei der Säulenchromatographie betrug 60%.
    • Beispiel 9
  • Die Versuchsdurchführung entsprach Beispiel 4 jedoch wurde als Eluens ein 50 µm Phosphat-Puffer mit pH 6,5 verwendet. Es wurden 18 mg Purpurmembran erhalten. Die Ausbeute betrug hier 85%.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung von Purpurmembran enthaltend Bacteriorhodopsin aus Zellen von Halobakterien, dadurch gekennzeichnet, daß
a) in an sich bekannter Weise die Zellmembran von Zellen von Halobakterien gewonnen wird und
b) zur Isolierung der Purpurmembran aus der Zellmembran eine Gelfiltrationschromatographie durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Eluens mit einer spezifischen Leitfähigkeit von 0,05 - 5 µS/cm eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­net, daß ein Eluens mit einen pH-Wert von 6,0 bis 7,5 eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Wasser als Eluens einge­setzt wird.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographie bei einer Temperatur von 1 bis 30 °C erfolgt.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gelfiltrationsmate­rial eine Ausschlußgrenze bezüglich Molekulargewicht von 2·10⁶ bis 10⁹ aufweist.
EP90112805A 1989-07-05 1990-07-05 Verfahren zur Herstellung von Purpurmembran enthaltend Bacteriorhodopsin Expired - Lifetime EP0406850B1 (de)

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DE3922133 1989-07-05
DE3922133A DE3922133A1 (de) 1989-07-05 1989-07-05 Verfahren zur herstellung von purpurmembran enthaltend bacteriorhodopsin

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EP0406850A1 true EP0406850A1 (de) 1991-01-09
EP0406850B1 EP0406850B1 (de) 1994-02-16

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EP (1) EP0406850B1 (de)
JP (1) JPH0768268B2 (de)
DE (2) DE3922133A1 (de)

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