JPH0768268B2 - バクテリオロドプシンを含有する紫膜の製法 - Google Patents
バクテリオロドプシンを含有する紫膜の製法Info
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- JPH0768268B2 JPH0768268B2 JP2174654A JP17465490A JPH0768268B2 JP H0768268 B2 JPH0768268 B2 JP H0768268B2 JP 2174654 A JP2174654 A JP 2174654A JP 17465490 A JP17465490 A JP 17465490A JP H0768268 B2 JPH0768268 B2 JP H0768268B2
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/215—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Halobacteriaceae (F)
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Description
に関する。
クテリウム・ハロビウム(Halobacterium halobium)に
より形成される色素蛋白質である。これは、蛋白質部分
(バクテリオオプシン:Bacterioopsin)及び発色団(レ
チナール)よりなり、ハロバクテリアの細胞膜中に、い
わゆる紫膜(以後これをPMとも略記する)の形で存在す
る。バクテリオロドプシンは、PM中に、2次元結晶性で
六方格子の形で配置されている。その物理特性に基づ
き、バクテリオロドプシンは、ビオコンピュータ中で
(Biosystems1986,19,223−236参照)又は、光学的情報
作業におけるホログラフイ供給材料として(Biophysics
1985,30(5)、962〜967参照)使用できる。しかしな
がら、このためには、多量の紫膜を取得できることが必
要である。紫膜とバクテリオロドプシンを含有しない汚
染膜フラグメントとの僅かな物理的差異に基づき、紫膜
を汚染フラグメントから分離するのは困難である。
(Stoeckenius)によるネイチユア(Nature)1971,233,
149〜154もしくは、メソツズ・イン・エンツイモロジイ
(Methos in Enzymogy)1974,31,667〜678によれば、サ
ツカロース比重勾配0.5〜1.5Mもしくはサツカロース30
〜50重量%中で紫膜の遠心による製造を実施することは
公知である。B.M.ベツヒヤー(Becher)J.Y.カシム(ca
ssim)のプレパラテイブ・ビオケミストリイ(Preparat
ive Biochemistry)1975,5(2),161〜178には、サツ
カロース45,40,38,36及び16重量%を有するサツカロー
ス段階的勾配液を用いる紫膜の遠心が記載されている。
遠心が必要であり、バクテリオロドプシンの所望量に関
連する変動性の規模拡大は不可能であり、これにより、
1操作当りの比較的少量のPMのみが単離される。
使用サツカロースの除去は、時間集中性の操作工程であ
る。
であり、これは a) 公知方法でハロバクテリアの細胞から細胞膜を取
得し、 b) この細胞膜から紫膜を単離するために、ゲル濾過
クロマトグラフイを実施する ことよりなる。
濾過クロマトグラフィ上に装入し、カラムからの水性流
出液を用いて紫膜を粒子懸濁液として取得する。
バクテリウム・ハロビウムを公知方法で、紫膜形成に好
適な条件例えば培地の低い酸素含分及び光の条件下に培
養する(D.Oesterhelt.W.Stoeckenius,Methods in Enzy
mology1974,31,667〜678参照)。適当な培養時間の後
に、細胞を例えば遠心により収穫する。得られる細胞か
ら公知方法で細胞膜を取得する。脱イオン水に対する透
析及び引続く遠心による細胞膜の収集を実施するのが有
利である。引続きこの紫膜を含有する膜フラクシヨンを
有利に脱イオン水で洗浄する。
ラフイカラム(有利に2.106〜109、殊に107〜109の分子
量に関する排除限界を有するゲル濾過質が充填されてい
る)にかけ、有利に水(これは特に0.05〜5μS/cm、殊
に0.1〜1.0μS/cmの有利な比導電率及び有利に6.0〜7.5
殊に6.3〜6.7のpH値を示す)を用い、有利に1〜30℃殊
に4〜10℃の温度で溶離させる。
えることができ、精製すべき細胞膜の量と関連する。例
えば細胞膜10〜100mgの量に対しては、長さ50〜100cm及
び直径1.5〜5cmのカラムが効を奏する。
当り5〜15ml、殊に9〜11ml/mgである。
り、この際0〜5バールの過圧殊に0〜500mバールの過
圧範囲で操作するのが有利である。
するのが有利である。
過のために使用されていたものである。架橋された又は
されていないデキストラン、アガロース誘導体又は、オ
リゴエチレングリコール、グリシジルメタクリレート及
びペンタエリスリトールジメタクリレートのコポリマー
を使用するのが有利である。
l)S1000(これはFirma Pharmacia A B,Uppsala.Schwed
en社の登録商標である)、ビオゲル(BioGel)A150m
(これは、Firma BioRad Laboratories.Richmond.Kalif
ornia.USA社の登録商標である)及びフラクトゲル(Fra
ctogel)TSK HW75(これは、Firma Merck.Darmstadt.BR
D社の登録商標である)である。
l250g/、MgSO4・7H2O 20g/、クエン酸三ナトリウム
3g/及びKCl2g/からなる溶液90mlで再懸濁させ、デ
ソキシリボヌクレアーゼ5mgを加え、1時間撹拌した。
この細胞懸濁液を引続き16時間脱イオン水に対して透析
させた。透析物を7600qで10分間遠心し、膜の製造のた
めの上澄みを38000qで30分間遠心した。得られた膜沈
殿物を比導電率0.1μS/cmを有する水80mlで洗浄し、改
めて38000qで遠心する。PM20mgを含有する沈殿を脱イ
オン水3mlに入れ、サツカロース含有率30〜50(w/v)%
の各28mlの量のサツカロース比重勾配液を合計5個以上
に装入した。この比重勾配液を次いで100000qで16時間
超遠心により遠心した。次いでこの比重勾配液を分別
し、PM含有フラクシヨンを集め、2培量の脱イオン水で
稀釈した。稀PM懸濁液を、38000qで30分間遠心し、得
られるPMsを再度脱イオン水100mlで洗浄し、改めて3800
0qで30分間遠心した。これから得られる沈殿を少量の
脱イオン水中に入れた。PM14mgを得ることができた。
l250g/、MgSO4・7H2O 20g/、クエン酸三ナトリウム
3g/及びKCl2g/からなる溶液270mlで再懸濁させ、デ
ソキシリボヌクレアーゼ15mgを加え、1時間撹拌した。
引続き、この細胞懸濁液を脱イオン水に対して16時間透
析させた。透析物を7600qで10分間遠心し、膜製造用上
澄みを38000qで30分間遠心した。得られた膜沈殿物
を、比導電率0.1μS/cm及びpH6.7を有する水240mlで洗
浄し、改めて38000qで遠心した。PM80mgを含有するこ
の沈殿を前記の純度及びpH値を有する水7ml中に入れ、
比導電率0.1μS/cm及びpH6.7の水で平衡化されたセフア
クリルS1000の充填された長さ75cm及び直径5.0cmのカラ
ム上に装入した。溶離は、5℃で1時間当り2cmの溶離
速度で実施した。PM−含有フラクシヨンを集め、PMを38
000qで30分間の遠心することにより取得した。紫膜60m
gを得ることができた。この膜の光学的スペクトルは、
バクテリオロドプシンのそれと一致し、汚染物を認める
ことはできなかつた。
ける溶離速度は1時間当り5.7mlであつた。カラムクロ
マトグラフイで90%の収率に相当する紫膜72mgを得るこ
とができた。
l 250g/、MgSO4・7H2O 20g/、クエン酸三ナトリム
ム3g/及びKCl 2g/からの溶液90mlで再懸濁させ、デ
ソキシリボヌクレアーゼ5mgを加え、1時間撹拌した。
この細胞懸濁液を引続き脱イオン水に対して16時間透析
させた。透析物を7600qで10分間遠心し、膜製造用の上
澄みを38000qで30分間遠心させた。得られた膜沈殿物
を比導電率0.1μS/cmを有する水80mlで洗浄し、改めて3
8000qで遠心した。PM20mgを含有する沈殿を前記純度及
びpH値の水2.5ml中に入れ、比導電率0.1μS/cm及びpH値
6.6を有する水で平衡化されたセフアクリルS1000の充填
された長さ60cm及び直径2.5cmのカラムに装入した。5
℃で溶離速度4.6cm/hで溶離を行なつた。PM含有フラク
シヨンを集め、このPMを38000qで30分間の遠心により
取得した。紫膜15mgを得ることができた。この膜の光学
スペクトルは、バクテリオロドプシンのそれと一致し、
汚染物を認めることができなかつた。
10℃で実施した。紫膜18mgを得ることができ、これはカ
ラムクロマトグラフイで80%の収率に相当した。
μS/cmでありpH値は6.5であつた。PM16mgが得られ、こ
れはカラムクロマトグラフイで82%の収率に相当した。
れた長さ80cm及び直径25cmのカラムでクロマトグラフイ
にかけた。紫膜15mgを得ることができ、これは、カラム
クロマトグラフイで85%の収率に相当した。
rma Merck.Darmstadt.BRD)のTSK HW75を使用した。紫
膜17mgを得ることができた。カラムクロマトグラフイで
の収率は60%であつた。
塩緩衝液50μmを使用した。紫膜18mgが得られた。収率
は85%であつた。
Claims (1)
- 【請求項1】ハロバクテクアの細胞からバクテリオロド
プシンを含有する紫膜を製造する場合に、 a) 公知方法でハロバクテクアの細胞の細胞膜を取得
し、 b) この細胞膜から紫膜を単離するために、ゲル濾過
クロマトグラフィを実施し、この際、a)で得られた細
胞膜の水性粒子懸濁液をゲル濾過クロマトグラフィ上に
装入し、カラムからの水性流出液を用いて紫膜を粒子懸
濁液として取得することを特徴とする、バクテリオロド
プシンを含有する紫膜の製法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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DE3922133.4 | 1989-07-05 |
Publications (2)
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JPH0344400A JPH0344400A (ja) | 1991-02-26 |
JPH0768268B2 true JPH0768268B2 (ja) | 1995-07-26 |
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-
1990
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- 1990-07-03 JP JP2174654A patent/JPH0768268B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-05 EP EP90112805A patent/EP0406850B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-05 DE DE90112805T patent/DE59004588D1/de not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
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MethodsEnzymol.Vol.31(1974)P.667−678 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0344400A (ja) | 1991-02-26 |
EP0406850A1 (de) | 1991-01-09 |
EP0406850B1 (de) | 1994-02-16 |
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