EP0314746A1 - Structure d'inclusion de substances actives - Google Patents

Structure d'inclusion de substances actives

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Publication number
EP0314746A1
EP0314746A1 EP88904551A EP88904551A EP0314746A1 EP 0314746 A1 EP0314746 A1 EP 0314746A1 EP 88904551 A EP88904551 A EP 88904551A EP 88904551 A EP88904551 A EP 88904551A EP 0314746 A1 EP0314746 A1 EP 0314746A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
film
water
envelope
granules
microorganisms
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP88904551A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Bernard Digat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP0314746A1 publication Critical patent/EP0314746A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/26—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests in coated particulate form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K30/00—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
    • A23K30/10—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder
    • A23K30/15—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging
    • A23K30/18—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging using microorganisms or enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a structure for the inclusion of an active substance, in particular constituted by microorganisms, by living cells of animal or vegetable origin, or by cell assemblies constituting functional organisms and individuals, said structure constituting in particular an inoculum.
  • the microorganisms, cells or cell assemblies are conditioned in a formulation allowing their very good conservation in dry environment and their release in wet environment.
  • These inoculums find their application in particular in the fields of agriculture, as microbiological fertilizers and indirectly for the microbiological coating of seeds; horticulture and market gardening, by incorporation into natural and artificial substrates and in soilless cultivation; livestock, to replenish the flora of the digestive system of animals; and in animal feed, in the manufacture of silages.
  • the inocula offered so far which are constituted by microorganisms, can be packaged in various formulations.
  • the type of formulation chosen largely determines the effectiveness of the inoculum: - Liquid formulations are the easiest to make, but they are not always satisfactory.
  • microorganisms appear naked and in dispersed order during inoculation in the soil or in the substrates.
  • the balance of power is often in favor of the resident flora and the results of the inoculation can be all the more disappointing as the antagonism of the indigenous flora is powerful.
  • - Solid formulations, in the form of powders sometimes give better results.
  • the microorganisms are more or less dehydrated, sometimes even lyophilized.
  • the addition of an inert but hydrophilic protective support, of the clay type, is necessary in order to obtain good effectiveness.
  • One of the problems is that the microorganisms, before entering into activity, must be rehydrated, which generally causes a loss of viability by osmotic shock.
  • the clay particles do not seem to offer a sufficient protective bulwark against the multitude of resident telluric aggressors.
  • gel formulations in solid form have been used, in which the microorganisms are immobilized and which have the advantage of being able to be hydrated according to what one wishes to obtain.
  • the inclusion structure which has been developed in accordance with the invention applies, in an equivalent manner, to living cells of plant or animal origin and to cell assemblies constituting functional organisms and individuals.
  • the inclusion structure according to the invention which is generally formed of at least one active substance included in a support and which is in the form of granules meets all of these objectives.
  • This inclusion structure in particular of the inoculum type, is characterized in that the granules comprise: a) a core consisting of a matrix coating the active substance to be inoculated, said matrix being composed: (1) of at least one coating agent in which said active substance is coated; and
  • the granules of the inclusion structure according to the invention further comprise:
  • the structure according to the invention generally constitutes an inoculum.
  • the coating agent (a1) then consists of at least one nutritive substance, in particular by a complete nutritive extract, the matrix being a nourishing matrix.
  • the inocula that can thus be prepared differ from pearls of dimensions of the order of a millimeter described in French patent application No. 2,599,639, the role of which is to immobilize bacteria, fungi, etc. in a matrix of polymer (polyacrylamide), not biodegradable, this matrix being protected by an alginate envelope.
  • the present invention does not aim to immobilize microorganisms, cells or the like, but on the contrary, their conservation in a living state, by provisional encapsulation, then their release at the desired time out of the matrix, after the envelope has burst, in the environment in which they must develop.
  • the hydroretenting agent by definition absent in the pearls of the aforementioned patent application, plays, during the release of microorganisms, cells or the like, an important role in helping the development of these substances in their inoculation medium.
  • the microorganisms, cells or cell assemblies are brought into the nucleus (a) preferably in the form of a more or less concentrated suspension.
  • the feed matrix can constitute a culture medium for said microorganisms or others before the formation of the granules, in which case the resulting inoculum has a very high concentration of microorganisms or others, for example, for bacteria, which can range up to 3 ⁇ 10 10 bacteria per ml.
  • the complete nutritive extract (a1) can be of vegetable or animal origin. In the first case, it can be an extract based on algae, which are chosen in particular from the Fucus, Lamina ria and Ascaphyll um species, said extract being brought to pH 7, for example by magnesium oxide.
  • the hydroretentants (a2) or (b2) advantageously consist of clays, such as bentonite, kaolin, talc, vermiculite and montmarillonite.
  • the film-forming agents (b1) they can in particular be constituted by alginates, polypectates, chitosan, carrageenans, or other biopolymers.
  • the envelope (b) can also contain at least one phytostimulating substance chosen in particular from nitrates, hydrating substances, various mineral salts, etc., and / or a phytosanitary substance , chosen in particular from fungicides, insecticides and herbicides compatible with microorganisms, living cells or coated cell groups.
  • phytostimulating substances mention may be made of indol acetic acid and Cytokinin.
  • fungicides and insecticides will be used in the case where the coated microorganisms are bacteria, and bactericides and insecticides when the coated microorganisms are fungi.
  • the film (c) advantageously consists of a very hydrophilic clay, such as bentonite.
  • the feeder matrix (a) can comprise from 5 to 10 g of the extract (a1) and from 1 to 5 g of the hydroretenting agent (s) (a2), for 10 to 15 ml of water
  • the envelope (b) can comprise from 1 to 5 g of the agent (s) ( s) film-forming agent (s) (b1) and from 5 to 20 g of the hydroretenting agent (s) (b2), for 10 to 15 ml of water.
  • the granules of the invention can be in the form of spherical elements whose core (a) has an average diameter of between 2 and 5 mm and whose thickness of the envelope (b) is between 0.5 and 3 mm, the external film, when present, may have a thickness of between 1 and 3 mm.
  • micro-organisms that the year can introduce into the nucleus.
  • Mention may be made of bacteria such as Rhizobacleria, and mushrooms like Mycarhizes. Particular examples of these bacteria will be given below with reference to the applications of the inoculum according to the invention.
  • the present invention also relates to a process for preparing the inclusion structure which has just been defined, in which a film-forming agent capable of passing from the soluble state to the insoluble state is used, characterized in that:
  • step (E) an alginate in the form of sodium olginate in pure water is used as film-forming agent, and in step (D), an aqueous medium is used granule formation, a calcium salt bath, such as succinate or gluconate, so that realize the displacement of Na + ions by Ca ++ ions.
  • a calcium salt bath such as succinate or gluconate
  • the present invention also relates to an apparatus for implementing the process which has just been defined, this apparatus being characterized by the fact that it comprises three superposed elements, namely: a first element crossed by a supply channel core material, and through a channel for supplying the shell material;
  • a second element comprising a plurality of cones for injecting the core material, along channels perpendicular to the mean plane of said element, these injection zones being in fluid communication with the channel for supplying the core material, said element being traversed by the channel for supplying the envelope material;
  • a third element comprising injection zones in a number identical to that of the injection zones of the second element and arranged opposite these latter, these injection zones being traversed by the aforementioned channels conveying the material of core, and comprising annular zones of passage of the envelope material surrounding the associated channel, and being in fluid communication with the supply channel of the envelope material.
  • the three aforementioned elements are in the form of discs.
  • the wall of the third element, through which the drops of the core material surrounded by the envelope material exit, may be a plane wall or a hemispherical wall.
  • the injection zones are distributed over a circle or over several concentric circles.
  • injection zones can be constituted for example by removable injectors, capable of being received in sealed manner in corresponding openings of the second and third elements, the injectors associated with the second element receiving axial tubes in fluid communication with the supply channel of the core material and extending beyond the end facing the third element in the mounting position , and the injectors associated with the third element comprising a central bore crossed by the aforementioned end of the tubing associated with the injectors intended to be received in the second element, the annular cylindrical space surrounding said tubing being in fluid communication with the channel d '' of the envelope material.
  • the injectors associated with the third element protrude from the outlet wall of said element; the communication between the outlet end of the inlet channels of the core and shell materials respectively and the inlet of the respective injection zones takes place via distribution spaces formed by cavities formed in at least one of the three elements; the channel for supplying the casing material is arranged along the axis of the three elements and the channel for supplying the core material is arranged eccentrically; the apparatus comprises means to be able to be maintained at constant temperature thanks to. a circulation of water or thermostatic liquid, carried out for example at the periphery of each of the three aforementioned elements; and it also includes means for pressurizing the core and shell materials in the corresponding supply channels.
  • the applications envisaged for the inocula according to the invention are as follows: - Introduction into the substrates and in the soils of populations beneficial for plants such as bacteria (Rhizobacteria, Rbizobium, Agrobac trri um “K84", etc. to fungi ( Mycorrhizae,
  • Trichoderma among other things to regenerate "tired" soils and, correspondingly, constitute soils or substrates resistant to pathogens.
  • pathogenic bacteria Pseudamanas solanacearum, Agrobacterium tumefaciens, Erwinia carotova ..
  • pathogenic fungi Fusari um, Phytophthora, Verti ci ll ium, Pythi uzm
  • the nutritive extract in which the microorganisms are coated, can also serve as a coating for seeds.
  • FIG. 1 represents a bottom view of an apparatus for the manufacture of inclusion structures according to the present invention, according to a particular embodiment
  • FIG. 2 is a sectional view along II-II of Figure 1;
  • Figure 3 is a schematic representation illustrating the release of microorganisms encapsulated in the inoculated medium; and Figures 4 and 5 are curves illustrating the conservation of the inoculum according to the invention manufactured in accordance with the above example.
  • a paste based on sterilized seaweed cream is prepared.
  • creams with different properties are obtained. It is also possible to use algae powders which are already commercially available.
  • the pH is adjusted to 7 with magnesium oxide.
  • a prepares a concentrated suspension of raicraarganlsmes, to which or adds a little sterile bentonite.
  • this medium ensures an excellent multiplication of microorganisms.
  • the dehydrated state (10 to 20% residual moisture), it allows very good survival of microorganisms.
  • it rehydrates easily and, during rehydration, micro- organisms find all the ingredients necessary for their multiplication. If one wishes to obtain a matrix highly concentrated in microorganisms, it is possible to cultivate them in this medium in agitation and at an optimal temperature (25 to 28 ° C for example for soil bacteria).
  • a sterile mixture of sodium alginate and kaolin is also prepared in the following proportions:
  • This apparatus designated as a whole by the reference numeral 1, consists of three superimposed elements respectively 2, 3 and 4, made for example of stainless steel and assembled in a sealed manner.
  • the first element 2 is constituted by a disc traversed by an axial cylindrical passage 5 and comprising on its face intended to come into contact with the second element 3, an annular recess 6, centered on the axis of the disc 2 and delimited by a wall internal cylindrical 7, by a bottom wall 8, and by a cylindrical external wall 9.
  • the wall 8 comprises an internal annular part 8a and an external annular part 8b, perpendicular to the internal wall 7 and separated by a setback of angle bracket 8c .
  • a cylindrical bore 12, carrying a thread, is made, parallel to the passage 5, so as to debauch in the part 8a.
  • the disc 3 carries, on its face intended to come into contact with the disc 2, a cylindrical projection 14 of the same diameter and the same height as the passage 5.
  • the disc 3 has an axial cylindrical passage 15, passing through the projection 14, and opening into the face of said disc 3 opposite to said projection 14, along a frustoconical wall 16.
  • the passage 15 comprises, in its end region projection side 14, an outward annular recess 17, from which it carries a thread intended to cooperate with a complementary thread carried by the end of a tube 18 for supplying the pasty consistency system intended to constitute the envelope.
  • the second element 3 is also in the form of a disc of the same diameter as the element 2. Furthermore, the disc 3 has thirty cylindrical openings 19 with an axis parallel to that of the passage 15 and regularly distributed over two concentric circles , twelve at the inner circle and eighteen at the outer circle. In the assembly position of the discs 2 and 3, the openings 19 arranged on the inner circle terminate in the groove 10, and those disposed on the outer circle terminate in the groove 11.
  • each opening 19 opens, on the side of the projection 14, along a flared part bordered by an annular recess 20, and on the opposite side., All of the openings 19 debauchery in the same shallow annular groove 21, centered on the axis of the disc 3. This groove 21 is substantially the same width as the recess 8 formed in the disc 2.
  • Each opening 19 serves as a housing for an injector 22 which consists of a cylindrical part traversed by an axial channel 23 and carrying externally, at one end a rim 24 for hooking the injector 22 on the bearing surface which constitutes the abovementioned recess 20.
  • the opposite outer edge 25 of the Injector 22 is chamfered. In the assembly position of the injectors 22 - which is that shown in FIG.
  • each injector 22 projects from the bottom of the groove 21 by this chamfered edge.
  • the axial channel 23 of each injector 22 is for example threaded, so as to cooperate with a fine tube 26 which, in the assembly position, protrudes greatly from the injector 22 on the side of the disc 3 opposite to the disc 2.
  • the disc 4 comprises, on the side intended to come to bear against the disc 3, an annular groove 27 roughly similar to the groove 21 and intended to come opposite it with in the assembly position, thirty openings 28, passing through the disc 4, opening into said groove 21, in correspondence with the openings 19 of the disc 3, and, in the same way as the latter, following an annular step 29.
  • the latter constitutes a bearing surface for the rim peripheral 30 of an injector 31, of general shape identical to that of the injectors 22.
  • the injectors 31 have an axial passage 32 of larger diameter, and not carrying a thread.
  • This passage is cylindrical in the body of the injector 31, and it tapers slightly gradually towards the frustoconical end portion 33 of the injector 31, which projects out of the free face of the disc 4 in the assembly position. In this position, the tubing 20 of each injector 22 enters axially into the opening 32 of the associated injector 31.
  • Each of the discs 2, 3 and 4 has an annular peripheral groove 35 in which is housed a water or thermostatic liquid pipe 34, the inlet and outlet of which are symbolized by arrows in FIG. 1.
  • the apparatus which has just been described operates in the following manner: Thanks to a double pump with gearmotor and electronic regulator, the pasty system intended to constitute the core arrives, under pressure, through the distribution channel 13 of the disc 2, distributed in the recess 8 and, from there, in the pipes 26 of the injectors 22.
  • the double pump also sends the pasty system intended to constitute the envelope under pressure, via the distribution channel 10, this system being transmitted, via the spacing between the frustoconical wall 16 of the disc 3 and the opposite wall of the disc 4, at the space between the grooves affixed respectively 21 and 27 of the discs 3 and 4. From there, the material intended to constitute the envelope flows in the annular spaces of the injectors 31, around the pipes 26. During its the apparatus is kept at. constant temperature thanks to the circulation of water or thermostatic liquid in the pipes 34.
  • All injectors are removable and interchangeable.
  • the diameter of the central and cooxioux channels of the injectors, as well as their respective position are a function of the type of granules that one wants to obtain. We can indeed vary the dimensions of the core and the envelope.
  • the pressure can be finely regulated separately depending on the viscosity of the materials used, so as to obtain the essential synchronization during the formation of the drops up to the outlet of the injectors.
  • the whole apparatus can be disinfected using common products, although it can be sterilized. the heat.
  • the assembly exits at the base of the injection device in the form of drops, which fall into a bath of succinate or calcium gluconate (concentration 0.1M) contained in a container.
  • the sodium alginate used in the formulation of the envelope material which is a substance soluble in water, is then transformed into calcium alginate, insoluble in water, constituting, with the kaolin which also composes the envelope, a resistant layer.
  • the granules After leaving the bath, the granules are left to dry for a few hours at room temperature. Then, they are rolled in a very hydrophilic clay like bentonite. so as to form a film around each granule. This operat i allows to keep a residual humidity and dampens the crushing inside the matrix, which could be caused by a brutal dehydration.
  • Figure 3 illustrates the release of microorganisms in the inoculated medium.
  • the dry granules are introduced (FIG. 3A) into a humid environment (soil, substrate, digestive system, etc.).
  • the film P of the granules absorbs the available water, which then passes through the porous envelope E.
  • the rehydration of the matrix, puls of the microorganisms of the nucleus N (FIG. 3B) then takes place slowly and gradually.
  • the envelope E tears under the pressure of the matrix and the content of the granule is released into the medium (FIG. 3C).
  • the rehydrated micra-organisms absorb. the nutrients of the matrix which are nearby, so they acquire their autonomy and disperse in the environment.
  • bacterial granules based on Pseudomonas fluorescens were produced by the process which has just been described above.
  • Khizobacteria Pseudosnanas fluorescens group - P. pu tlda
  • Khizobacteria When you germinate the root system of lettuce, for example, you can get a significant growth and yield gain. All the results obtained for various plants tested are shown in the table:

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Abstract

Cette structure d'inclusion d'au moins une substance active (micro-organismes, cellules ou ensembles cellulaires) se présente sous la forme de granulés comprenant un noyau (N) consistant en une matrice enrobant la substance active, ladite matrice étant composée: (1) d'au moins un agent d'enrobage; et (2) d'au moins un agent hydrorétenteur; et une enveloppe protectrice poreuse (E) composée: (1) d'au moins un agent filmogène susceptible de subir une dégradation biologique; et (2) d'au moins un agent hydrorétenteur, une pellicule hydrophile protectrice (P) entourant généralement l'enveloppe. Cette structure permet notamment d'assurer une conservation des éléments inclus ainsi qu'une multiplication immédiate des micro-organismes suivie d'une libération progressive de l'inoculum dès les premiers contacts avec un milieu hydraté, ce qui permet d'obtenir une bonne colonisation de la cible (système racinaire, sol, appareil digestif suivant l'application particulière de l'inoculum).

Description

STRUCTURE D' INCLUSION DE SUBSTANCES ACTIVES
La présente invention porte sur une structure d' inclusion d'une substance active, notamment constituée par des microorganismes, par des cellules vivantes d'origine animale ou végétale, ou par des ensembles cellulaires constituant des organismes et des individus fonctionnels, ladite structure constituant notamment un inoculum. Dans le s structures d' inclusion de l' invention, les microorganismes, cellules ou ensembles cellulaires sont conditionnés dans une formulation permettant leur très bonne conservation en milieu sec et leur libération en milieu humide. Ces inoculums trouvent leur application notamment dans les domaines de l'agriculture, comme engrais microbiologiques et indirectement pour l'enrobage microbiologique des semences; de l'horticulture et du maraîchage, par incorporation dans des substrats naturels et artificiels et en culture hors-sol; de l'élevage, pour reconstituer la flore de l'appareil digestif des animaux; et en alimentation animale, dans la fabrication des ensilages.
Les inoculums proposés jusqu' ici, qui sont constitués par des microorganismes, peuvent être conditionnés s o u s diverses formulations. Cependant, dans la plupart des cas, le type de formulation choisi détermine une grande partie l'efficacité de l' inoculum: - Les formulations liquides sont les plus faciles à réaliser, mais elles ne donnent pas toujours satisfaction. En effet, dans les milieux liquides, les microorganismes se présentent nus et en ordre dispersé lors de l' inoculation dans le sol ou dans les substrats. Dans ces conditions, le rapport de force est souvent en faveur de la flore résidente et les résultats de l' inoculation peuvent être d'autant plus décevants que l'antagonisme de la flore autochtone est puissant. On sait que du reste que dans un gramme de sol fertile, on peut trouver plus d'un milliard de bactéries. - Les formulations solides, se présentant sous la forme de poudres, donnent parfois de meilleurs résultats.
Dans ce cas, les microorganismes sont plus ou moins déshydratés, parfois même lyophilisés. L'adjonction d'un support protecteur inerte mais hydrophile, du type argile, est nécessaire pour obtenir une bonne ef ficacité. L'un des problèmes est que les microorganismes, avant d'entrer en activité, doivent être réhydratés, ce qui provoque généralement une perte de viabilité par choc osmotique. De plus, les particules d'argile ne semblent pas offrir un rempart protecteur suf fisant vis-à-vis de la multitude d'agresseurs telluriques résidents. Afin d'éviter ces problèmes, on a utilisé des formulations gélifiées sous forme solide, dans lesquelles les microorganismes sont immobilisés et qui présentent I' intérêt de pouvoir être hydratées selon ce que l'on veut obtenir. Certains gels, constitués par des polymères tels que le polyuréthanne, les polysaccharides, comme le xanthane et les dérivés cellulosiques, ou encore les polyacrylamides, ont été proposés. Toutefois, les techniques d'inclusion directe des microorganismes dans les gels de polymère apparaissent comme étant délicates. Ainsi, dans le brevet français N° 2.501.229, on propose par exemple d'apporter un milieu de culture ensemencé par le microorganisme ou une suspension de microorganismes obtenue par centrifugation ou filtration dudit milieu, dans une solution chauffée de polysaccharide, et de former le gel par refroidissement. Ce traitement thermique assurant la réticulation du gel peut être remplacé par l'action d'un sel métallique ou par traitement de synergie par un autre polymère. Duns le brevet français N° 2.519.022, on préconise d'abaisser l'activité de l'eau dans l' inoculum en-dessous de sa valeur critique à une valeur inférieure à 0,5. A cet ef fet, on réalise un séchage par atomisation par f lux d'air chaud et sec ou encore on utilise une solution saturée en un composé présentant l'activité de l'eau requise évoluant vers l'équilibre avec l' inoculum. Par ailleurs, on peut souligner que les polyacrylamudes ne sont pas biodégradables et jouissent d'une très mauvaise réputation concernant la toxicité.
Jusqu' à présent, on avait proposé des techniques d' inclusion faisant appel à un enrobage direct, par exemple par un polymère, des éléments cellulaires. 11 s'agissait donc d'une inclusion directe. La présente invention implique non seulement un enrobage de l'élément mais aussi un autre revêtement, et il s'agit donc d'une technique d' inclusion indirecte, aboutissant à une structure que l'on peut qualifier de structure d' inclusion indirecte. La présente invention vise à remédier à l'ensemble de ces inconvénients. On a en ef fet recherché à assurer une bonne conservation de l' inoculum sélectionné dans des structures stables, faciles à fabriquer, à commercialiser et à utiliser dans les domaines précités, également à assurer une multiplication immédiate des microorganismes et une libération progressive de l' inoculum dès les premiers contacts avec un milieu hydraté, et enfin à obtenir une bonne colonisation de la cible (système racinaire, sol, appareil digestif suivant l'application particulière de l' inoculum) et, en conséquence, les ef fets bénéfiques attendus.
La structure d' inclusion qui a été mise au puint selon l' invention s'applique, de façon équivalente, aux cellules vivantes d'origine végétale ou animale et aux ensembles cellulaires constituant des organismes et individusfonctionnels.
La structure d' inclusion selon l' invention, qui est, de façon générale, formée d'au moins une substance active incluse dans un support et qui se présente sous la forme de granulés répond à l'ensemble de ces objectifs. Cette structure d' inclusion, notamment de type inoculum, est caractérisée par le fait que les granulés comprennent: a) un noyau consistant en une matrice enrobant la substance active à inoculer, ladite matrice étant composée: ( 1 ) d' au moins un agent d' enrobage dans lequel ladite subs tance active est enrobée; et
( 2 ) d ' au moins un agent hydrorétenteur ; et
(b ) une enveloppe protectrice poreuse entourant ledit noyau ( a ) et composée:
(l)d'au moins un agent filmogène susceptible de subir une dégradation biologique ; et
(2) d'au moins un agent hydrorétenteur.
De préférence, les granulés de la structure d'inclusion selon l'invention comportent en outre:
(x) une pellicule hydrophile protectrice entourant l'enveloppe (b) .
Dans le cas où la substance active est choisie parmi les microorganismes , cellules vivantes ou ensembles cellulaires, la structure selon l'invention constitue généralement un inoculum. L'agent d'enrobage (al) est alors constitué par au moins une substance nutritive , notamment par un extrait nutritif complet, la matrice étant une matrice nourricière . Les inoculums que l'on peut ainsi préparer se distinguent des perles de dimensions de l'ordre du millimètre décrites dans la demande de brevet français n° 2.599.639, dont le rôle est d'immobiliser des bactéries , champignons etc dans une matrice de polymère (polyacrylamide), non biodégradable , cette matrice étant protégée par une enveloppe d'alginate .
La présente invention ne vise pas l'immobilisation de microorganismes , cellules ou similaires , mais au contraire, leur conservation à l'état vivant, par encapsuIation provisoire, puis leur libération au moment voulu hors de la matrice, après éclatement de l'enveloppe, dans le milieu dans lequel elles doivent se développer . L'agent hydrorétenteur , par définition absent dans les perles de la demande de brevet précité , joue, lors de la libération des microorganismes, cellules ou similaires, un rôle important d'aide au développement de ces substances dans leur milieu d'inoculation. Les microorganlsmes, cellules ou ensembles cellulaires, sont apportés dans le noyau (a) de préfèrence sous la forme d'une suspension plus ou moins concentrée. La matrice nourriclère peut constituer un milieu de culture desdits microorganismes ou autres avant la formation des granulés, auquel cas l'inoculum résultant présente une concentration trés élevée en microorganismes ou autres, par exemple, pour les bactéries, pouvant aller jusqu'à 3 x 1010 bactéries par ml. L'extrait nutritif complet (a1) peut être d'origine végétale ou d'origine animale. Dans le premier cas, ce peut être un extrait à base d'algues, lesquelles sont choisies notamment parmi les espèces Fucus, Lamina ria et Ascaphyll um, ledit extrait étant amené à pH 7, par exemple par de l'oxyde de magnésium.
Les agents hydrorétenteurs (a2) ou (b2) sont constitués avantageusement par des argiles, comme la bentonite, le kaolin, le talc, la vermiculite et la montmarillonite. Quant aux agents filmogènes (b1), ils peuvent notamment être constitutés par des alginates, des polypectates, du chitosan, des carraghènanes, ou d'autres biopolymères.
Conformément â une autre caractéristique intéressante de l'invention, l'enveloppe (b) peut renfermer en outre au moins une substance phytostimulante choisie notamment parmi les nitrates, les substances de crolssance, les sels minéraux divers, etc, et/ou une substance phytosanitaire, choisie notamment parmi les fongicides, les insecticides et les herbicides compatibles avec les microorganismes, cellules vivantes ou ensembles cellulaires enrobés. Comme substances phytostimulantes, on peut mentionner l'acide indol acétique et la Cytokinine. A propos des substances phytosanltaires, on utilisera les fongicides et les insecticides dans le cas au les microorganismes enrobés sont des bactéries, et des bactéricides et insecticides lorsque les microorganismes enrobés sont des champignons.
En ce qui concerne la pellicule (c), elle est constituée avantageusement par une argile très hydrophile, comme la bentonite.
Concernant les proportions des différents composants des granulés qui constituent l'inoculum selon l'invention (après déshydratation), on peut indiquer que la matrice nourricière (a) peut comprendre de 5 à 10 g de l'extrait (a1) et de 1 à 5 g du (ou des) agent (s) hydrorétenteur(s) (a2), pour 10 à 15 ml d'eau, et que l'enveloppe (b) peut comprendre de 1 à 5 g du (ou des) agent(s) filmogène(s) (b1) et de 5 a 20 g du (ou des) agent(s) hydrorétenteur(s) (b2), pour 10 à 15 ml d'eau. Ceci correspond à une formulation initiale suivante dans le cas des microorganismes :
- pour la matrice nourricière (a), 5 à 10 g de l'extrait
(a1) et de 1 à 5 g du (ou des) agent(s) hydrorétenteur(s) (a2) pour 100 ml d'eau, le (ou les) microorganisme(s) étant présent(s) dans ladite matrice par exemple à une concentration de l'ordre de 107 à 1010 bactéries par ml d'eau pour les bactéries, et de l'ordre de 103 à 106 propagules par ml d'eau pour les champignons ;
- pour l'enveloppe (b) , 1 à 5 g- du (ou des) agent (s) filmogène (s) (bl) et 5 à 20 g du (ou des) agent (s) hydrorétenteur (s) (b2) pour 100 ml d'eau.
Ea particulier, les granulés de l'invention peuvent se présenter sous la forme d'éléments parasphériques dont le noyau (a) présente un diamètre moyen compris entre 2 et 5 mm et dont l'épaisseur de l'enveloppe (b) est comprise entre 0,5 et 3 mm, la pellicule externe, lorsqu'elle est présente, pouvant avoir une épaisseur comprise entre 1 et 3 mm.
11 n'y a pas de limitation particulière quant aux micraarganismes que l'an peut intraduire dans le noyau. On peut citer les bactéries comme les Rhizobacléries, et les champignons comme les Mycarhizes. Des exemples particullers de ces bactéries seront donnés ci-après en référence aux applications de l'inoculum selon l'invention.
La présente invention concerne également un procédé de préparation de la structure d'inclusion qui vient, d'être définie, dans laquelle on utilise un agent filmogène capable de passer de l'état soluble a l'état insoluble, caractérisé par le fait que :
(A) on associe entre eux, dans un milieu aqueux, les composant du noyau (a) des granulés de façon à obtenir un premier système de consistance pâteuse ;
(B) on associe entre eux, dans un milieu aqueux, les composants de l'enveloppe (b), de façon a obtenir un second système de consistance pâteuse, dans lequel l'agent filmogène est à l'état soluble ;
(C) on fait passer les premier et second système précités dans deux ajutages coaxiaux, le premier système, dans l'ajutage central, et le second système, dans l'espace annulaire délimité par les deux ajutages précités, de façon qu'à la sortie de ce double ajutage, an obtienne des gouttes de la matière de noyau entourée de la matière d'enveloppe ; (D) on fait tomber ces gouttes dans un second milieu aqueux dans lequel l'agent filmogène passe à l'état insoluble, de façon à obtenir, par suite du durcissement dudit agent filmogène, des granulés dispersés dans ledit milieu ;
(E) on recueille lesdits granulés et, le cas échéant, on les sèche ; et
(F) si on le souhaite, on enrobe ces granulés dans de la matière de pellicule.
En particulier, a l'étape (E), on utilise comme agent filmogène, un alginate sous forme d'olginate de sodium dans de l'eau pure, et qu'à l'étape (D), on utilise, comme milieu aqueux de formation des granulés, un bain de sel de calcium, comme le succinate ou le gluconate, de façon à réaliser le déplacement des ions Na+ par les ions Ca++.
La présente invention porte également sur un appareillage pour la mise en oeuvre du procédé qui vient d'être défini, cet appareillage étant caractérisé par le fait qu'il comporte trois éléments superposés, à savoir : un premier élément traversé par un canal d'amenée de la matière de noyau, et par un canal d'amenée de la matière d'enveloppe ;
- un second élément comportant une pluralité de cones d'injection de la matière de noyau, suivant des canaux perpendiculaires au plan moyen dudit élément, ces zones d'injection étant en communication de fluide avec le canal d'amenée de la matière de noyau, ledit élément étant traversé par le canal d'amenée de la matière d' enveloppe ; et
- un troisième élément comportant des zones d'injection en nombre identique à celui des zones d'injection du second élément et disposées en vis-à-vis de ces dernières, ces zones d'injection étant traversées par les canaux précités acheminant la matière de noyau, et comportant des zones annulaires de passage de la matière d'enveloppe entourant le canal associé, et se trouvant en communication de fluide avec le canal d'amenée de la matière d'enveloppe.
De préférence, les trois éléments précités sont en forme de disques.
La paroi du troisième élément, par laquelle sortent les gouttes de la matière de noyau entourée par la matière d'enveloppe, peut être une paroi plane ou une paroi hémisphèrique.
Egalement, dans un mode de réalisation particulier, les zones d'injection sont réparties sur un cercle ou sur plusieurs cercles concentriques.
Ces zones d'injection peuvent être constituées par exemple par des injecteurs amovibles, capables d'être reçus de manière étanche dans des ouvertures correspondantes du deuxième et du troisième éléments, les injecteurs associés au deuxième élément recevant des tubulures axiales en communication de fluide avec le canal d'amenée de la matière de noyau et se prolongeant au-delà de l'extrémité tournée vers le troisième élément en position de montage, et les injecteurs associés au troisième élément comportant un alésage central traversé par l'extrémité précitée de la tubulure associée aux injecteurs destinés à être reçus dans le second élément, l'espace cylindrique annulaire entourant ladite tubulure étant en communication de fluide avec le canal d'amenée de la matière d'enveloppe.
Conformément à d'autres caractéristiques de cet appareillage : les injecteurs associés au troisième élément font saillie hors de la paroi de sortie dudit élément ; la communication entre l'extrémité de sortie des canaux d'amenée des matières respectivement de noyau et d'enveloppe et l'entrée des zones d'injection respectives s'effectue par l'intermédiaire d'espaces de distribution formés par des cavités pratiquées dans au moins l'un des trois éléments ; le canal d'amenée de la matière d'enveloppe est disposé selon l'axe des trois éléments et le canal d'amenée de la matière de noyau est disposé de façon excentrée ; l'appareillage comporte des moyens pour pouvoir être maintenu a température constante grâce à. une circulation d'eau ou de liquide thermostatique, effectuée par exemple à la périphérie de chacun des trois éléments précités ; et il comporte également des moyens pour faire parvenir sous pression les matières de noyau et d'enveloppe dans les canaux d'amenée correspondants. Les applications envisagées pour les inoculums selon l'invention sont les suivantes : - Introduction dans les substrats et dans les sols de populations bénéfiques pour les plantes telles que des bactéries (Rhizobactéries, Rbizobium, Agrobac trri um "K84", etc au des champignons (Mycorhizes,
Trichoderma , etc.), entre autres pour régénérer des sols "fatigués" et, corrélativement, constituer des sols ou substrats résistant aux agents pathogènes.
- Inoculation de sols et de substrats à l'aide de bactéries pathogènes (Pseudamanas solanacearum, Agrobacterium tumefaciens, Erwinia carotova ..) au de champignons pathogènes (Fusari um, Phytophthora, Verti ci l l ium, Pythi uzm) utiles dans les études de résistance variétale par exemple.
- Inoculation de bactéries fermentatives dans les ensilages afin d'accélérer les processus de fermentation.
- Introduction de bactéries et/ou de levures dans différents types de milieux agro-alimentaires ; reconstitution de microflores des appareils digestifs par incorporation dans les aliments (très bonne compatibilité et facile biodégradabilité) ou par ingestion directe, les inoculums de l'Invention ayant, par un choix judicieux de ses composants, une très bonne compatibilité avec les aliments et étant facilement biodégradables ;
- Conservation des cellules vivantes d'origine végétale, telles que des embryons pouvant conduire à l'obtention de semences artificielles, ou des cals pouvant conduire a l'obtention de tissus végétaux ou de plantules ; et - Conservation des ensembles cellulaires constituant des organismes et des individus fonctionnels, tels que des protozoaires et des nématodes, & activité mycophage. Conformément à. une autre application de l'invention, l'extrait nutritif, dans lequel les microorganismes sont enrobés, peut également servir d' enrobage à des semenees.
Pour mieux illustrer l'objet de la présente invention, on décrira ci-après, de façon plus détaillée, Ia préparation d'un inoculum selon l'invention, en référence au dessin annexé. Sur ce dessin : la figure 1 représente une vue de dessous d'un appareillage pour la fabrication de structures d'inclusion conforme a la présente invention, selon un mode de réalisation particulier ;
- la figure 2 est une vue en coupe selon II-II de la figure 1 ;
- la figure 3 est une représentation schématique illustrant la libération des microorganismes encapsulés dans le milieu inoculé ; et les figures 4 et 5 sont des courbes illustrant la conservation de l'inoculum selon l'invention fabriqué conformément à l'exemple susindiqué.
I - Préparation de la matrice nourricière chargée de micro- organismes.
A l'aide d'eau distillée stérile, on prépare une pâte à base de crème stérilisée d'algues. Selon les algues utilisées, on obtient des crèmes possédant des propriétés différentes. On peut également utiliser des poudres d'algues existant déjà dans le commerce. On ajuste le pH à 7 par de l'oxyde de magnésium.
Parallèlement, an prépare une suspension concentrée de raicraarganlsmes, à laquelle ou ajoute un peu de bentonite stérile.
On mélange ces deux préparations durant plusieurs heures dans les proportions suivantes :
- crème d' algues à pH 7 ............................ 90 g
- bentonite ........................................ 10 g
- suspension concentrée de microorganismes ....... 1000 ml
A l'état hydraté, ce milieu assure une excellente multiplication des microorganismes. A l'état déshydraté (10 à 20% d'humidité résiduelle), il permet une très bonne survie des microorganismes. De plus, il se réhydrate facilement et, lors de la réhydratation, les micro- organismes y trouvent tous les ingrédients nécessaires à leur multiplication. Si l'on veut obtenir une matrice très concentrée en microorganismes, il est passible de cultiver ceux-ci dans ce milieu en agitation et à une température optimale (25 à. 28ºC par exemple pour les bactéries du sol).
Il - Préparation de l'enveloppe protectrice
On prépare par ailleurs un mélange stérile d'alginate de sodium et de kaolin dans les proportions suivantes :
- alginate de sodium .............................. 15 g
- kaolin ......................................... 100 g
- eau distillée ................................. 1000 ml
III - Obtention des granulés frais
On utilise l'appareillage représenté sur les figures 1 et 2.
Cet appareillage, désigné dans son ensemble par le chiffre de référence 1, se compose de trais éléments superposés respectivement 2, 3 et 4, réalisés par exemple en acier inoxydable et assemblés de manière étanche.
Le premier élément 2 est constitué par un disque traversé par un passage cylindrique axial 5 et comportant sur sa face destinée à venir en contact avec le second élément 3, un évidement annulaire 6, centré sur l'axe du disque 2 et délimité par une parai interne cylindrique 7, par une paroi de fond 8, et par une paroi externe cylindrique 9. La paroi 8 comporte une partie annulaire interne 8a et une partie annulaire externe 8b, perpendiculaires a la paroi interne 7 et séparées par un décrochement d' équerre 8c. Se trouvent ainsi constituées une rainure distributrice intérieure 10, plus profonde, et une rainure distributrice extérieure 11, moins profonde, en communication avec la première. Un alésage cylindrique 12, portant un filetage, est pratiqué, parallèlement au passage 5, de façon a débaucher dans la partie 8a. du fond 8, le diamètre dudit alésage 12 étant égal a la largeur de ladite partie annulaire 8a mesurée dans le sens radial. Dans ledit alésage 12, est adaptée par vissage l'extrémité d'une tubulure 13 d'amenée du système de consistance pâteuse, destiné à constituer le noyau. Le disque 3 porte, sur sa face destinée à venir en contact avec le disque 2, une saillie cylindrique 14 de même diamètre et de même hauteur que le passage 5. Le disque 3 comporte un passage cylindrique axial 15, traversant la saillie 14, et débouchant dans la face dudit disque 3 opposée a ladite saillie 14, suivant une paroi tronconique 16. Le passage 15 comporte, dans sa région d'extrémité côté saillie 14, un décrochement annulaire vers l'extérieur 17, à partir duquel il porte un filetage destiné a coopérer avec un filetage complémentaire porté par l'extrémité d'une tubulure 18 d'amenée du système de consistance pâteuse destiné à constituer l'enveloppe.
Le second élément 3 se présente également sous la forme d'un disque de même diamètre que l'élément 2. Par ailleurs, le disque 3 comporte trente ouvertures cylindriques 19 d'axe parallèle à celui du passage 15 et régulièrement réparties sur deux cercles concentriques, à raison de douze sur le cercle intérieur et dix-huit sur le cercle extérieur. En position d'assemblage des disques 2 et 3, les ouvertures 19 disposées sur le cercle intérieur aboutissent dans la rainure 10, et celles disposées sur le cercle extérieur aboutissent dans la rainure 11.
En outre, chaque ouverture 19 débouche, du côté de la saillie 14, suivant une partie évasée bordée par un décrochement annulaire 20, et du côté opposé., l'ensemble des ouvertures 19 débauche dans une même rainure annulaire 21 peu profonde, centrée sur l'axe du disque 3. Cette rainure 21 est sensiblement de même largeur que l'évidement 8 pratiqué dans le disque 2. Chaque ouverture 19 sert de logement à un injecteur 22 qui consiste en une pièce cylindrique traversée par un canal axial 23 et portant extérieurement, a une extrémité un rebord 24 d'accrochage de l'Injecteur 22 sur la portéed' appui que constitue le décrochement précité 20. La bordure externe opposée 25 de l'Injecteur 22 est chanfreinée. En position d'assemblage des injecteurs 22 - qui est celle représentée sur la figure 2 -, chaque injecteur 22 dépasse du fond de la rainure 21 par cette bordure chanfreinée. Le canal axial 23 de chaque injecteur 22 est par exemple fileté, de façon à coopérer avec une fine tubulure 26 qui, en position d'assemblage, dépasse très largement de l'injecteur 22 du côté du disque 3 opposé au disque 2. Le disque 4 comporte, du côté destiné a venir s'appliquer contre le disque 3, une rainure annulaire 27 à peu près analogue a la rainure 21 et destinée à venir en vis-à-vis d'avec elle en position d'assemblage, trente ouvertures 28, traversant le disque 4, débouchant dans ladite rainure 21, en correspondance avec les ouvertures 19 du disque 3, et, de la même façon que ces dernières, suivant un décrochement annulaire 29. Ce dernier constitue une portée d'appui pour le rebord périphérique 30 d'un injecteur 31, de forme générale identique à celle des Injecteurs 22. Cependant, a la différence des injecteurs 22, les injecteurs 31 comportent un passage axial 32 de plus grand diamètre, et ne portant pas de filetage. Ce passage est cylindrique dans le corps de l'injecteur 31, et il se rétrécit légèrement progressivement en direction de la partie terminale tronconique 33 de l'Injecteur 31, qui fait saillie hors de la face libre du disque 4 en position d'assemblage. Dans cette position, la tubulure 20 de chaque injecteur 22 pénètre axialement dans l'ouverture 32 de l'injecteur 31 associé.
Chacun des disques 2, 3 et 4 comporte une gorge périphérique annulaire 35 dans laquelle est logée une canalisation d'eau ou de liquide thermostatique 34 dont l'entrée et la sortie sont symbolisées par des flèches sur la figure 1.
L'appareillage qui vient d'être décrit fonctionne de la façon suivante : Grâce à une double pompe à motoréducteur et régulateur électronique, le système pâteux destiné à constituer le noyau parvient, sous pression, par le canal de distribution 13 du disque 2, pour se répartir dans l'évidement 8 et, de la, dans les tubulures 26 des injecteurs 22.
La double pompe envoie également sous pression le système pâteux destiné à constituer l'enveloppe, par le canal de distribution 10, ce système étant transmis, par l'intermédiaire de l'espacement entre la paroi tronconique 16 du disque 3 et la paroi opposée du disque 4, à l'espace entre les rainures apposées respectivement 21 et 27 des disques 3 et 4. De 1à, la matière destinée a constituer l'enveloppe s'écoule dans les espacements annulaires des injecteurs 31, autour des tubulures 26. Pendant son fonctionnement, l'appareillage est maintenu à. température constante grâce à une circulation d'eau ou de liquide thermostatique se faisant dans les canalisations 34.
Tous les injecteurs sont démontables et interchangeables. Le diamètre des canaux centraux et cooxioux des injecteurs, ainsi que leur position respectifs sont fonction du type de granulés que l'on veut obtenir. On peut en effet faire varier les dimensions du noyau et de l'enveloppe. Par ailleurs, dans chaque canal de distribution, la pression peut être finement régulée de façon séparée en fonction de la viscosité des matières utilisées, de façon à obtenir la synchronisation indispensable durant la formation des gouttes jusqu'à la sortie des injecteurs.
L'ensemble de l'appareillage peut être désinfecté à l'aide des produits courants, au bien il peut être stérilisé à. la chaleur.
De plus, on peut prévoir d'assembler plusieurs appareillages de ce type pour augmenter la capacité de production des granulés. Egalement, on peut prévoir que le disque 4 soit remplacé par une pièce hémisphérique, ce qui permet d'augmenter le nombre des injecteurs.
Ainsi, en fonctionnement, la matière de noyau et la matière d'enveloppe parviennent aux injecteurs de sortie
31, de façon que la première soit entourée par la seconde. L'ensemble sort à la base du dispositif d'injection sous la forme de gouttes, lesquelles tombent dans un bain de succinate ou de gluconate de calcium (concentration 0,1M) contenu dans un récipient . L'alginate de sodium entrant dans la formulation de la matière d'enveloppe, qui est une substance soluble dans l'eau, est alors transformé en alginate de calcium, insoluble dans l'eau, constituant, avec le kaolin qui compose également l'enveloppe, une couche résistante.
Plus le temps de séjour des billes obtenues dans le sel de calcium est long, plus l'enveloppe est chargée en ions Ca++ et sera solide.
IV - Pelliculage des granulés
A la sortie du bain, on laisse ressuyer quelques heures les granulés à la température ambiante. Puis, on les roule dans une argile très hydrophile comme la bentonite. de manière à former une pellicule autour de chaque granulé. Cette opérat i on permet de conserver une humidité résiduelle et amortit l'écrasement à l'intérieur de la matrice, lequel pourrait être provoqué par une brutale déshydratation.
Comme indiqué ci-dessus, la figure 3 illustre la libération des microorganismes dans le milieu inoculé.
On introduit les granulés secs (figure 3A) dans un milieu humide (sol, substrat, appareil digestif, etc.). Au contact de ce milieu, la pellicule P des granulés absorbe l'eau disponible, laquelle passe ensuite a travers l'enveloppe poreuse E. La réhydratation de la matrice, puls des micro-organismes du noyau N (figure 3B) se fait alors lentement et progressivement. Ensuite, l'enveloppe E se déchire sous la pression de la matrice et le contenu du granulé est libéré dans le milieu (figure 3C) . Dans un premier temps, les micra-organismes réhydratés absorbent. les éléments nutritifs de la matrice qui sont a proximité, puls ils acquièrent leur autonomie et se dispersent dans le milieu. Pour illustrer la bonne conservation de l'inoculum selon l'invention, on a fabriqué, par le procédé qui vient d'être décrit ci-dessus, des granulés bactériens a base de Pseudomonas fluorescens.
Durant la fabrication, la viabilité des cellules de Pseudamanas fl uorescens descend jusqu'à environ 50 000 à 100 000 cellules viables par granulé sec lorsque l'on utilise une concentration de départ de 10 bactéries par millilitre. C'est ce qui est illustré par la figure 4 qui est la courbe de viabilité a 25ºC±2ºC de ces cellules
(souche L 26-1), les granulés ayant été dissous à +4ºC dans du tampon phosphate 0.02M ; pH 6,4. Légende de la figure 4 :
A : avant mélange ;
B : après mélange ;
C : après formation des billes
(noyau + enveloppe) ; et D : après pelliculage et séchage.
Par leo suite, la conservation de l'inoculum apparaît être satisfaisante puisqu'au 60ème jour, a la température du laboratoire 25ºC±2°C, le nombre de bactéries par granulé étant encore de 5000 à. 10 000, suivant ce qui est illustré par la figure 5, les granulés étant dans les mêmes conditions que dans le cas de la figure 4.
Certaines souches de Khizobactéries (groupe Pseudosnanas fluorescens - P. pu tlda) ont un effet stimulateur de la croissance et de la protection des plantes. Lorsque l'on bactérlse le système racinalre de la laitue par exemple, on peut obtenir un gain important de croissance et de rendement. L'ensemble des résultats obtenus pour diverses plantes expérimentées est indiqué dans le tableau :
TABLEAU
BACTERISATION DES SUBSTRATS
Amélioration des rendements en fonction de l'âge de la plante
PLANTE SUBSTRAT1 % GAIN AGE MAX. /TEMOIN (Jours)
PELARGONIUM
Poids frais de la plante T66% +S33% 16,0 100
Nombre de boutures id 31,4 100
Nombre de boutures T20% + E60% + HF20% 47,4 100
LAITUE
Poids frais de la feuille T100% 21,0 45 Poids frais de la feuille Te 50% + Tr 50% 19,0 53 Précocité de la pommaison id 113,0 53
CHRYSANTHEME
Hauteur de la plante E45% + t 35% + T20% 30,4 36 Nombre de feuilles étalées id 26,9 36
POMMIER (Malus Evereste')
Hauteur de la plante T 75% + S 25% 44,0 45 Hauteur de la plante id 73,0 102 Hauteur de la plante id 12,0 430
Nombre de ramifications 20,4 480
POMIER 'Golden Sraothee'
Poids de fruits sol naturel 11,5 1460
1 LEGENDE : T : Tourbe brune E : Ecorce de pin S : Sable de Loire t : Tourbe blonde Te : Terreau maraîcher HF : Fibre de bais ("Hortlfibre") Tr : Terre franche.

Claims

REVENDICATIONS 1 - Structure d'inclusion d'au moins une substance active, qui se présente sous la forme de granulés, caractérisée par le fait que les granulés comprennent : (a) un noyau consistant en une matrice enrobant la substance active, ladite matrice étant composée : (1) d' au moins d'un agent d'enrobage dans lequel ladite substance active est enrobée ; et (2) d'au moins un agent hydrorétenteur ; et (b) une enveloppe protectrice poreuse entourant ledit noyau (a) et composée : (l) d' au moins un agent filmogène susceptible de subir une dégradation biologique ; et (2) d'au moins un agent hydrorétenteur. 2 - Structure selon la revendication 1, caractérisée par le fait que les granulés comportent en outre : (e) une pellicule hydrophile protectrice entourant l'enveloppe (b). 3 - Structure selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que la substance active est constituée par des microorganismes, par des cellules vivantes d'origine animale ou végétale, ou par des ensembles cellulaires constituant des organismes et des individus fonctionnels, ladite structure constituant un inoculum. 4 - Structure selon la revendication 3 caractérisée par le fait que l'agent d'enrobage (a1) est constitué par au moins une substance nutritive, notamment par un extrait nutritif complet, la matrice étant une matrice nourricière. 5 - Structure selon la revendication 4, caractérisée par le fait que l'extrait nutritif complet (a1) est d'origine végétale. 6 - Structure selon la revendication 5, caractérisée par le fait que l'extrait nutritif complet (a1) est un extrait à base d'algues, lesquelles sont choisies notamment parmi les espèces Fucus, Laminari a et Ascophyl l um, ledit extrait étant amené à pH 7. 7 - Structure selon la revendication 4, caractérisée par le fait que l'extrait nutritif complet (a1) est un 'extrait d'origine animale. 8 - Structure selon l'une des revendications 4 à 7. présentant une concentration très élevée en substance active, caractérisée par le fait que la matrice nourricière a constitué un milieu de culture de ladite substance active avant la formation des granulés. 9 - Structure selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée par le fait que la substance active est apportée dans le noyau (a) sous la forme d'une suspension. 10 - Structure selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée par le fait que les agents hydrorétenteurs (a2) et (b2) sont constitués par des argiles, comme la bentonite, le kaolin, le talc, la vermiculite et la montmorillonite. 11 - Structure selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée par le fait que les agents filmogènes (b1) sont choisis parmi les alginates, les polypectates, le chitosan, les carraghénanes, et d'autres biopolymères. 12 - Structure selon l'une des revendications 2 à 11, caractérisée par le fait que la pellicule (e) est constituée par une argile très hydrophile, comme la bentonite. 13 - Structure selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée par le fait que les granulés se présentent sous forme d'éléments parasphériques dont le diamètre moyen du noyau (a) est compris entre 2 et 6 mm et dont l'épaisseur de l'enveloppe (b) est comprise entre 0, 5 et 3 mm, la pellicule externe, lorsqu' elle est présente, ayant une épaisseur comprise entre 1 et 3 mm. 14 - Structure-inoculum selon l'une des revendications 3 à 13, caractérisée par le fait que l'enveloppe (b) renferme en outre au moins une substance phytost imulante et/ou au moins une substance phytosanitaire compatible avec les microorganismes, les cellules vivantes et les ensembles cellulaires présents dans le noyau (a). 15 - Structure-inoculum selon la revendication 1 consistant en un inoculum de microorganismes, caractérisée par le fait que, dans les granulés, après déshydratation, matrice nourricière comprend de 5 à 10 g de l'extrait (a1) et de 1 à 5 g du (ou des) agent(s) hydrorétenteur(s) (a2), pour 10 à 15 ml d'eau, et que l'enveloppe (b) comprend de 1 à 5 g du (ou des) agent (s) filmogène(s) (bl) et de 5 à 20 g du (ou des) agent(s) hydro-rétenteur (s) (b2), pour 10 à 15 ml d'eau. 16 - Structure-inoculum selon la revendication 15, caractérisée par le fait que sa formulation initiale est 1a suivante : - pour la matrice nourricière (a) , 5 à 10 g de l'extrait
(a1) et 1 à 5 g du (ou des) agent (s) hydrorétenteur (s)
(a2) pour 100 ml d'eau, les microorganisme (s) étant présents dans ladite matrice notamment à une concentration de l'ordre de 107 à 1010 bactéries par d' eau pour les bactéries, et de l'ordre de 103 à 106 propagules par ml d' eau pour les champignons ;
- pour l'enveloppe (b), 1 à 5 g du (ou des) agent(s) filmogène(s) (b1) et 5 à 20 g du (ou des) agent(s) hydrorétenteur(s) (b2) pour 100 ml d'eau.
17 - Structure-inoculum selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisée par le fait que les microorganismes sont choisis parmi les bactéries, comme Rhizobactéries, et les champignons, comme les Mycorhizes.
18 - Structure-inoculum selon l'une des revendications 3 à 17, caractérisée par le fait que l'extrait nutritif dans lequel les microorganismes sont enrobés, sert également d'enrobage à des semences. 19 - Procédé de préparation de la structure telle que définie à l'une des revendications 1 à 18, dans lequel on utilise un agent filmogène capable de passer de l' état soluble à l'état insoluble, caractérisé par le fait que : (A) on associe entre eux, dans un milieux aqueux, les composants du noyau (a) des granulés de façon à obteni un premier système de consistance pâteuse ;
(B) on associe entre eux, dans un milieu aqueux, les composants de l'enveloppe (b), de façon à obtenir un second système dé consistance pâteuse, dans lequel l'agent filmogène est à l'état soluble ;
(C) on fait passer les premier et second système précités dans deux ajutages coaxiaux, le premier système, dans l'ajutage central, et le second système, dans l'espace annulaire délimité par les deux ajutages précités, de façon qu'à la sortie de ce double ajutage, on obtienne des gouttes de la matière de noyau entourée de la matière d'enveloppe ;
(D) on fait tomber ces gouttes dans un milieu aqueux dans lequel l' agent filmogène passe à l'état insoluble, de façon à obtenir, par suite du durcissement dudit agent filmogène, des granulés dispersés dans ledit milieu ;
(E) on recueille lesdits granulés et, le cas échéant, on les sèche ; et (F) si on le souhaite, on enrobe ces granulés dans de la matière de pellicule.
20 - Procédé selon la revendications 19, caractérisé par le fait qu'à l'étape (B), on utilise, comme agent filmogène, un alginate sous forme d'alginate de sodium dans de l'eau pure, et qu'à l'étape (D), on utilise, comme milieu aqueux de formation des granulés, un bain d'un sel de calcium, comme le succinate ou le gluconate, de façon à réaliser le déplacement des ions Na+ par les ions Ca++. 21 - Procédé selon l'une des revendications 19 et 20, destiné à la préparation d'un inoculum de microorganismes, caractérisé par le fait qu'avant de réaliser l'association de l'étape (A), on cultive les micro-organismes dans le milieu constitué par l'extrait nutritif
(a1), en agitation, et à une température optimale pour les microorganismes considérés. 22 - Appareillage pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini à l'une des revendications 19 à 21, caractérisé par le fait qu'il comporte trois éléments superposés, à savoir :
- un premier élément (2) traversé par un canal d'amenée (13) de la matière de noyau, et par un canal d'amenée (18) de la matière d' enveloppe ; - un second élément (3> comportant une pluralité de zones d' injection (22) de la matière de noyau, suivant des canaux (23) perpendiculaires au plan moyen dudit élément (3), ces zones d'injection (22) étant en communication de fluide avec le canal d' amenée (13) de la matière de noyau, ledit élément (3) étant traversé par le canal d'amenée (18) de la matière d'enveloppe ; et
- un troisième élément (4) comportant des zones d'injection (31) en nombre identique à celui des zones d'injection (22) du second élément (3) et disposées en vis-à-vis de ces dernières, ces zones d'injection (31) étant traversées par les canaux précités (23) acheminant la matière de noyau, et comportant des zones annulaires de passage de la matière d'enveloppe entourant le canal associé (23), et se trouvant en communication de fluide avec le canal d'amenée (18) de la matière d'enveloppe.
23 - Appareillage selon la revendication 22, caractérisé par le fait -que les éléments (2 ; 3 ; 4) sont forme de disques. 24 - Appareillage selon la revendication 23, caractérisé par le fait que la paroi du troisième élément
(4), par laquelle sortent les gouttes de la matière de noyau entourée par la matière d'enveloppe, est une paroi plane. 25 - Appareillage selon la revendication 23, caractérisé par le fait que la paroi du troisième élément (4), par laquelle sortent les gouttes de la matière de noyau entourée par la matière d'enveloppe, est une paroi hémisphérique. 26 - Appareillage selon l'une des revendications
22 à 24, caractérisé par le fait que les zones d'injection
(22 ; 31) sont réparties sur un cercle ou sur plusieurs cercles concentriques.
27 - Appareillage selon l'une des revendications 22 à 26, caractérisé par le fait que les zones d'injection
(22 ; 31) sont constituées par des injecteurs amovibles, capables d'être reçus de manière étanche dans des ouvertures correspondantes (19 ; 28) des éléments (3 ; 4) ceux (22) associés au second élément (3) recevant des tubulures axiales (23) en communication de fluide avec le canal d'amenée (13) de la matière de noyau et se prolongeant au-delà de l'extrémité tournée vers le troisième élément (4) en position de montage, et ceux (31) associés au troisième élément (4) comportant un alésage central (32) traversé par l'extrémité précitée de la tubulure (23) associée aux injecteurs (22) destinés à être reçus dans le second élément
(3), l'espace cylindrique annulaire entourant ladite tubulure (23) étant en communication de fluide avec le canal d'amenée (18) de la matière d'enveloppe. 28 - Appareillage selon la revendication 27, caractérisé par le fait que les injecteurs (31) associés au troisième élément (4) font saillie hors de la paroi de sortie dudit élément (4). 29 - Appareillage selon l' une des revendications 22 à 28, caractérisé par le fait que la communication entre l'extrémité de sortie des canaux d'amenée (13 ; 18) des matières respectivement de noyau et d'enveloppe et l'entrée des zones d'injection respectives (22 ; 31) s'effectue par l'intermédiaire d'espaces de distribution formés par descavités (6 ; 21-27) pratiquées dans au moins l'un des éléments (2 ; 3 ; 4).
30 - Appareillage selon l'une des revendications 22 à 29, caractérisé par le fait que le canal d'amenée (18) de la matière d'enveloppe est disposé selon l'axe des éléments (2 ; 3 ; 4) et le canal d'amenée (13) de la matière de noyau est disposé de façon excentrée.
31 - Appareillage selon l'une des revendications 22 à 30, caractérisé par le fait qu' il comporte des moyens pour pouvoir être maintenu à température constante grâce à une circulation d'eau ou de liquide thermostatique (34), effectuée par exemple à la périphérie de chacun desdits éléments (2 ; 3 ; 4). 32 - Appareillage selon l'une des revendications
22 à 31, caractérisé par le fait qu' il comporte des moyens pour faire parvenir sous pression les matières de noyau et d'enveloppe dans les canaux d'amenée correspondants (13 ; 15). 33 - Utilisation de la structure telle que définie à l'une des revendications 1 à 18, pour introduire dans les substrats et dans les sols, notamment pour les régénérer, des bactéries et champignons bénéfiques pour les plantes.
34 - Utilisation de la structure telle que définie à l'une des revendications 1 à 18, pour inoculer des sols et des substrats à l'aide de bactéries ou de champignons pathogènes, par exemple pour étudier la résistance variétale. 35 - Utilisation de la structure telle que définie à l' une des revendications 1 à 18, pour inoculer des bactéries fermentât ives dans les ensilages afin d'accélérer les processus de fermentation. 36 - Utilisation de la structure telle que définie à l'une des revendications 1 à 18, pour introduire des bactéries ou des levures dans des milieux agro-alimentaires ou pour reconst ituer des microflores des appareils digestifs par incorporation dans les aliments ou par ingestion directe.
37 - Utilisation de la structure telle que définie à l'une des revendications 1 à 18, pour conserver des cellules vivantes d'origine végétale, telles que des embryons pouvant conduire à l'obtention de semences artificielles, ou des cals pouvant conduire à l'obtention de tissus végétaux ou de plantules.
38 - Utilisation de la structure telle que définie à l'une des revendications 1 à 18, pour conserver des ensembles cellulaires constituant des organismes et des individus fonctionnels, tels que des protozoaires et des nématodes, à activité mycophage.
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