EP0243437A1 - Als schutz gegen hagel geeignete komposition zur bildung von eiskristallkeimen - Google Patents

Als schutz gegen hagel geeignete komposition zur bildung von eiskristallkeimen

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Publication number
EP0243437A1
EP0243437A1 EP19860906422 EP86906422A EP0243437A1 EP 0243437 A1 EP0243437 A1 EP 0243437A1 EP 19860906422 EP19860906422 EP 19860906422 EP 86906422 A EP86906422 A EP 86906422A EP 0243437 A1 EP0243437 A1 EP 0243437A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cultures
ice
composition
bacterial mass
supernatant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP19860906422
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tibor Farkas
Valéria NEMETHNE MOLNAR
Endre Wirth
J-Zsef Zakocs
Zoltán KLEMENT
Anik- Nagyne Vanicsek
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ALLAMI BIZTOSITO
Original Assignee
ALLAMI BIZTOSITO
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Filing date
Publication date
Application filed by ALLAMI BIZTOSITO filed Critical ALLAMI BIZTOSITO
Publication of EP0243437A1 publication Critical patent/EP0243437A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G15/00—Devices or methods for influencing weather conditions

Definitions

  • the invention relates to a composition suitable as protection against hail, which leads to the formation of ice crystal nuclei, crystallization centers.
  • the clouds in the atmosphere are often in a colloidally unstable state.
  • the water droplets forming the cloud are "supercooled", they are still in a liquid (supercooled) state even at temperatures below 0oC.
  • the freezing process is facilitated by the presence of foreign particles. However, these particles are only present in the atmosphere in a concentration that is orders of magnitude lower than that in which the condensation of atmospheric water vapor takes place.
  • the essence of the microphysical influence is precisely that missing natural crystal nuclei are replaced artificially; If there are too few crystal nuclei, only a few ice crystals form in the critical areas of the cloud, and these cause the formation of hailstones.
  • the effectiveness of the artificially produced and brought into the cloud ice crystal forming germs depends to a large extent on their so-called activity threshold temperature.
  • This threshold temperature is the highest temperature at which the respective particles can still trigger the phase change of the water drops.
  • the best inorganic substance for forming ice crystal nuclei is silver iodide, the threshold temperature of which is -4.5 oC.
  • the threshold temperature of the lead iodide used in Hungary to ward off hailstones is approximately -7oC.
  • Hail damage can be prevented by the particles scattered into the atmosphere, because the particles increase the number of condensation nuclei and therefore only small, harmless ice granules are formed. These granules of ice melt as they fall through the atmosphere; they only reach the earth in the form of rain.
  • the "freezing”, ie crystallizing properties of the most frequently used inorganic reagents are based on the fact that the crystal lattice of these substances is very similar to the crystal lattice of ice.
  • the corresponding lattice constants of the ice crystals and the silver iodide crystals hardly differ by 1-2%.
  • the difference between the lattice constants of ice and lead iodide is somewhat larger; therefore the lead iodide threshold temperature is below -6oC.
  • Lead iodide is used in Hungary in an amount of about 2000 kg annually. This means an average lead iodide contamination of 200-250 g / ha, since the connection with the rainwater reaches the ground together and is then incorporated into plant and animal organisms.
  • the object of the invention was to provide a crystal nucleating agent for ice which does not pollute the environment because it degrades naturally within a short time and which also has a threshold temperature and an activity spectrum around 0 ° C.
  • bacterial mass obtained from cultures of Pseudomonas syringae, Erwinia herbicola and Pseudomonas fluorescens or mixtures thereof, or the cell membranes isolated therefrom or the supernatant of the culture is excellently suitable as an active ingredient for ice crystal-forming compositions.
  • the liquid composition produced from the active ingredients obtained by fermentation can be distributed by spraying in the airspace; solid preparations containing the active ingredients can be applied as pyrotechnic mixtures.
  • the liquid composition can be distributed on earth or in an airplane using generators. The former is less expensive; the particles distributed in the airspace reach the cloud level in the frequently occurring vertical air currents.
  • the method has the disadvantage that it can only be used under certain meteorological or geographical conditions. It is much easier to get the particles in the right place in the right concentration by plane.
  • the solid preparations can be brought to the desired location in the airspace with the aid of pyrotechnic cartridges attached to aircraft.
  • the composition according to the invention has the following advantages over the known solutions:
  • the microorganisms to be used in the sense of the invention are known. They are deposited in Great Britain under the following numbers: Pseudomonas syringae pv. Syringe van Hall NCPPB 2 507; Erwinia herbicola (Lohnis) dye NCPPB 2 281; Pseudomonas fluorescens migula NCPPB 1 598.
  • Pseudomonas syringae, Erwinia herbicola or Pseudomonas fluorescens or mixtures of these bacteria in a number of 10-10 6 / ml are inoculated in nutrient solution which is sterilized in a manner known per se.
  • the culture is fermented at 20-30 ° C for 24-36 hours.
  • the bacterial mass is separated from the liquid supernatant.
  • the bacterial mass can be diluted with 50-100 mass% of a 0.1-2 mass percent buffer solution, preferably an alkali dihydrogen phosphate with a pH of 6.5-7, and then with Be treated with ultrasound.
  • the disrupted cells are dewatered, preferably by lyophilization.
  • the bacterial mass can also be stirred with a glucose solution with a concentration of 10-80 mass% and the active substance can then be separated off by centrifugation or by chromatography.
  • the bacterial mass can also be treated with ultrasound and the undestroyed cells separated by centrifugation with 20,000 to 40,000 g; the cell membranes obtained in this way are washed and then separated from the washing liquid.
  • composition according to the invention preferably contains the active ingredient in concentrations of 0.001-95% by mass, in particular 0.5-90% by mass, in addition liquid carriers and extenders, preferably 0.1-1% by mass alkali metal chloride solution or 0.1-2% by mass alkali metal hydrogen phosphate solution , or solid supports, preferably silica, silica gel, zeolite or polymers. Culture media of known composition or nutrient solutions with special additives can be used to cultivate the bacteria.
  • DIFCO Nutrient, pH 7.1
  • the deposited bacterial mass (25 g / l culture) is taken up in 25 ml of 20 mM phosphate buffer (KH 2 PO 4 , pH 7.0). Both the bacterial mass and the cell-free supernatant are used to produce the composition which forms ice crystal nuclei according to the invention.
  • Example 3 The procedure described in Example 1 is followed, with the difference that the nutrient medium is inoculated with Pseudomonas fluorescens.
  • Example 4 The procedure described in Example 1 is followed, with the difference that the nutrient medium is inoculated with Pseudomonas fluorescens.
  • Bacterial mass produced according to example 1 is treated with ultrasound (power of the device: 250 W).
  • the duration of the treatment is 20 seconds, followed by a 20 second break, followed by another 20 seconds of sound, ten times in total.
  • the vessel is cooled with ice water from the outside because heating the material can damage the organic substances.
  • the suspension containing the disrupted cells is poured into a round bottom flask and cooled with liquid air in a New Brunswick brand and lyophilized at +4 ° C. and 2.6 kPa (20 torr) pressure.
  • a series of dilutions is made from the lyophilisate with 10 mM phosphate buffer in the range from 0.05 to 3 mg / l.
  • the samples and also 0.5 ml of buffer are placed in the tubes of an Ependorf centrifuge. The
  • the bacterial mass prepared according to Example 1 is diluted 1: 1 at room temperature with a two molar glucose solution and homogenized for 25-30 minutes.
  • the solid substance is centrifuged off and the centrifugate on a DEAE Sephadex
  • Example 6 Having concentration corresponds to the NaCl content of the test solutions.
  • the test solutions freeze at -5.8 to -6.0 ° C, while the controls freeze at -9.8 to -12.3 ° C.
  • the experiment shows that the substance treated with glucose is able to form crystal nuclei.
  • Example 4 The procedure is as described in Example 4, but the method of Example 2 is used Bacteria mass. The results of the freeze tests agree with the exercises described in Example 4.
  • Example 5 The procedure described in Example 5 is followed, except that the one prepared according to Example 3 is used
  • the cell membrane is isolated from the bacterial mass prepared in accordance with Example 1 in order to determine whether or not the cell membrane has a nucleating effect.
  • the mass isolated from 3 liters of culture liquid is suspended in 80 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.14 mass% of mercaptoethanol.
  • the cells are treated with ultrasound (power of the device: 250 W) for 30 seconds. After a minute's break, the treatment is repeated, a total of fifteen times. The digestion is about 70%.
  • the undestroyed cells are centrifuged at 1500 g. The supernatant is at 0 ° C with 30 000 g
  • Example 9 Centrifuge for 40 minutes. The sediment containing the cell membranes is washed twice with the phosphate buffer mentioned, then centrifuged and finally suspended in the buffer. After determining the solids content, a series of dilutions is prepared from the substance according to Example 4. Each link in this row freezes between -4.0 and -4.3 ° C under the conditions described in Example 4. The 10 mM phosphate buffer used as a control freezes at -10.8 ° C. Example 9
  • Example 10 The liquid supernatant, which is obtained by centrifuging off the bacterial mass prepared according to Example 1, is lyophilized in the manner described there. The white powder obtained is weighed. Then, according to Example 4, a series of dilutions prepares. All links in the dilution series freeze at -4.2 ° C. Culture medium and the lyophilized supernatant of a culture of Pseudomonas syringae ice- are used as controls (this manipulated Pseudomonas does not cause frost damage); the controls freeze at -10.2oC and -10.3oC, respectively. The experiment proves that the supernatant also contains substances that form crystal nuclei of the ice. Example 10 The supernatant of those obtained in Example 2
  • a sprayable formulation is produced from the moist bacterial mass prepared according to Example 1.
  • 0.01 kg of the bacterial mass is mixed with 1 kg of 0.1% NaCl solution.
  • the liquid mixture is sprayed.
  • Example 12 In a stirrer, 0.5 kg of the bacterial mass obtained according to Example 2 is mixed with 0.1 kg 0.1% NaCl solution.
  • the mixture is mixed with 0.5 kg of Aerosil (SiO 2 ), then homogenized and finally dried at room temperature.
  • the Preparation can be delayed by pyrotechnic means in the air.
  • Example 12 The procedure is as described in Example 12, but 0.7 kg of synthetic zeolite is used as the solid filler. This preparation can also be applied pyrotechnically.
  • Example 11 The procedure is as described in Example 11, but the mass of bacteria is mixed with 2 kg of 50% by weight aqueous cellulose acetate solution.
  • Solutions of a concentration of 0.1, 0.2 or 1.0 g / 1 are prepared from the bacterial mass isolated according to Example 1 with 0.1% NaCl solution by weight. Droplets with an average diameter of 1.2 mm are formed from these solutions.
  • the freezing properties of the droplets are studied in a diffusion chamber. In the chamber, the droplets are applied to a surface cooled with Peltier elements and treated with silicone grease. The temperature of the surface, which because of the considerable difference in mass essentially corresponds to the temperature of the drops, is measured with a platinum resistance thermometer and read off from a digital display with an accuracy of 0.1 degrees.
  • the cooling rate of the chamber and thus that of the drops can be regulated. In the range below 0 oC, which is important for the measurement, the cooling rate can be regulated within the range of 1-3 degrees / min.
  • the temperature t 50 is measured, ie the temperature at which half of the drops are frozen. This temperature is lower for the three samples different concentrations at -3.2 oC, -3.6 oC and
  • a NaCl solution with a concentration of 0.1 g / l is prepared as a control with distilled water. Half of the 4 mm diameter drops formed from this solution are frozen at -12 ° C. The entire freezing process starts at -10 ° C and ends at -14 ° C.
  • the composition according to the invention accordingly causes an increase in melting point of approximately 10 ° C.
  • a solution with a concentration of 0.1 g / l is prepared from the bacterial mass according to Example 1 using NaCl solution with a concentration of 0.1% by mass.
  • a dispersion of 0.1 g / l concentration is prepared from silver iodide and 0.1% NaCl solution.
  • the freezing behavior of the batches is investigated in the diffusion chamber described in Example 15.
  • the cooling rate used is 2 degrees / min in the range below 0 ° C. Drops of an average size of 1.2 mm are applied to the cooling surface.
  • the t 50 temperatures were: composition according to the invention -3.2 ° C, silver iodide: -4.9 ° C.
  • the experiment shows that the threshold temperature of the compositio ⁇ invention is closer to 0 ° C, that is, the composition rather prevents hypothermia.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Atmospheric Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Als Schutz gegen Hagel geeignete Komposition zur Bildung von Eiskristallkeimen
Die Erfindung betrifft eine als Schutz gegen Hagel geeignete Komposition, die zur Bildung von Eiskristallkeimen, Kristallisationszentren führt.
Es ist eine allgemein bekannte Tatsache, daß der Hagelschlag (Eisregen) im wirtschaftlichen Leben beträchtliche Schäden verursacht. Deswegen wird in steigendem Maße ein Verfahren zur künstlichen Beeinflussung des Wetters angewendet, bei dem als Schutz gegen Hagel gewisse anorganische Stoffe in die Atmosphäre gebracht werden. Am häufigsten werden für diesen Zweck Silberjodid und Bleijodid verwendet (DT-OS 25 38 861).
Die in der Atmosphäre befindlichen Wolken sind häufig in einem kolloidal instabilen Zustand. Die die Wolke bildenden Wassertropfen sind "unterkühlt", sie sind auch bei Temperaturen unter 0ºC noch im flüssigen (unterkühlten) Zustand.
In den natürlichen Wolken kann allgemein beobachtet werden, daß die Tropfen selbst bei Temperaturen zwischen -10 und -15 ºC noch nicht gefrieren. Der Grund dafür liegt darin, daß der Gefrierprozeß erst bei. einem bestimmten Niveau der inneren Energie beginnen kann; mit anderen Worten: die durch Kondensation entstandenen, reinen Wassertropfen können aus energetischen
Gründen erst beträchtlich unterhalb von 0ºC gefrieren.
Der Gefrierprozeß wird durch die Anwesenheit fremder Teilchen erleichtert. Diese Teilchen sind jedoch in der Atmosphäre nur in einer Konzentration vorhanden, die um Größenordnungen geringer ist als diejenige, in der die Kondensation des atmosphärischen Wasserdampfes verläuft. Das Wesen der mikrophysikalischen Beeinflussung besteht gerade darin, daß die fehlenden natürlichen Kristallkeime auf künstlichem Wege ersetzt werden; sind zu wenig Kristallkeime vorhanden, so entstehen in den kritischen Bereichen der Wolke nur einige wenige Eiskristalle, und diese verurSachen das Entstehen von Hagelkörnern.
Die Wirksamkeit der künstlich hergestellten und in die Wolke eingebrachten eiskristallbildenden Keime hängt in hohem Maße von ihrer sogenannten Aktivitätsschwellentemperatur ab. Diese Schwellentemperatur ist die höchste Temperatur, bei der die jeweiligen Teilchen die Phasenänderung der Wassertropfen noch auslösen können. Die beste anorganische Substanz zum Bilden von Eiskristallkeimen ist das Silberjodid, dessen Schwellentemperatur -4,5 ºC beträgt. Die Schwellen- temperatur des in Ungarn zur Abwehr von Hagelschlag verwendeten Bleijodids beträgt annähern -7 ºC.
Durch die in die Atmosphäre gestreuten Teilchen können Hagelschäden verhindert werden, weil die Teilchen die Anzahl der Kondensationskeime erhöhen und deshalb nur kleine, ungefährliche Eiskörnchen entstehen. Diese Eiskörnchen schmelzen, während sie durch die Lufthülle fallen; die Erde erreichen sie nur noch in Form von Regen.
Die "gefrierenden", d.h. Kristallisierenden Eigenschaften der am häufigsten angewendeten anorganischen Reagentien beruhen darauf-, daß das Kristallgitter dieser Stoffe dem Kristallgitter des Eises in hohem Maße ähnlich ist. Die entsprechenden Gitterkonstanden der Eiskristalle und der Silberjodidkristalle unterscheiden sich kaum um 1-2 % . Zwischen den Gitterkonstanten von Eis und Bleijodid ist der Unterschied etwas größer; deshalb liegt die Schwellentemperatur des Bleijodids auch unter -6 ºC. Auch in der Wasserlöslichkeit besteht ein beträchtlicher Unterschied zwischen den beiden Verbindungen: die des Silberjodids beträgt 8.10-6 g/100 ml, die des Bleijodids 4.10-4 g/100 ml. Bleijodid wird in Ungarn in einer Menge von jährlich etwa 2000 kg eingesetzt. Das bedeutet eine durchschnittliche Bleijodidverseuchung von 200-250 g/ha, da die Verbindung mit dem Regenwasser zusammen auf den Boden gelangt und dann in pflanzliche und tierische Organismen eingebaut wird.
Auch im Zusammenhang mit Silberjodid ergeben sich Umweltschutzprobleme. Die Anwendbarkeit wird ferner dadurch eingeschränkt, daß sich die Verbindung durch Lichteinwirkung zersetzt.
Die Anwendung anorganischer Reagentien hat folgende Nachteile: - sie verschmutzen die Umwelt,
- ihre Aktivitätsschwellentemperatur ist sehr niedrig, und ihr volles Aktivitätsspektrum nimmt im Bereich der Minustemperaturen einen breiten Streifen ein, (das Aktivitätsspektrum des Silberjodids beginnt bei -4,5 ºC und erstreckt sich bis zu -15, -20 °C),
- die Herstellungs- und Anwendungskosten sind hoch.
Ziel der Erfindung war es, einen Kristallkeimbildner für Eis bereitzustellen, der die Umwelt nicht verschmutzt, weil er innerhalb kurzer Zeit auf natürlichem Wege abgebaut wird, und der ferner eine Schwellentemperatur und ein Aktivitätsspektrum um 0 ºC hat.
Es wurde schon früher erkannt, daß bestimmte organische Stoffe ebenfalls als künstliche Kristallkeimbildner geeignet sind. Deshalb wurde nicht nur mit anorganischen Stoffen experimentiert, sondern auch organische Substanzen wurden als künstliche Kristallkeime erprobt, zum Beispiel Methaldehγd, Floroglucinol usw .
In den Siebziger Jahren wurde entdeckt, daß wenigstens ein Teil der natürlichen, in der Atmosphäre vorkommenden Kristallkeime aus organischen Substanzen biologischen Ursprungs besteht und aus sich zersetzender Vegetation und dem Plankton des Meeres stammt. In der Natur kommen die Bakterien Pseudomonas syringae, Erwinia herbicola und Pseudomonas fluorescens vor, die als Eiskeimbildner an Pflanzen Frostschäden verursachen (3. Bacteriol. 164/1, 359-366 /1985/). Deshalb waren Forschungen darauf gerichtet, diese Wirkung durch Clonbildung zu vermindern (europäische Pat ent a nmel dung N r . 138 426 ) .
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß aus Kulturen von Pseudomonas syringae, Erwinia herbicola und Pseudomonas fluorescens oder deren Gemischen gewonnene Bakterienmasse oder die daraus isolierten Zellmembranen oder der Oberstand (Supernatant)der Kultur als Wirkstoff für eiskristallbildende Kompositionen ausgezeichnet geeignet ist. Die aus den durch Fermentation gewonnenen Wirkstoffen hergestellte flüssige Komposition kann durch Sprühen im Luftraum verteilt werden; die Wirkstoffe enthaltende feste Zubereitungen können als pyrotechnische Gemische ausgebracht werden. Das Verteilen der flüssigen Komposition kann auf der Erde oder im Flugzeug mit Generatoren erfolgen. Ersteres ist weniger teuer; die im Luftraum verteilten Teilchen gelangen in den häufig auftretenden vertikalen Luftströmungen bis in die Wolkenebene. Das Verfahren hat den Nachteil, daß es nur unter bestimmten meteorologischen beziehungsweise geographischen Gegebenheiten anwendbar ist. Mit dem Flugzeug ist es viel einfacher, die Teilchen in entsprechender Konzentration an die richtige Stelle zu bringen. Die festen Zubereitungen können mit Hilfe von an Flugzeugen angebrachten pyrotechnischen Patronen an die gewünschte Stelle des Luftraumes gebracht werden. Die erfindungsgemäße Komposition hat gegenüber den bekannten Lösungen die folgenden Vorteile:
- sie verunreinigt die Umwelt nicht, sondern wird, nachdem sie auf den Boden gelangt ist, auf mikrobiologischem Wege abgebaut, - sie ist um Größenordnungen wirksamer als die bekannten anorganischen Stoffe,
- ihre Schwellentemperatur liegt bei -3 ºC, das Aktivitätsspektrum reicht bis -10 °C (AgJ: -4,5 bis -20 °C, PbJ2 -7,5 bis -20 °C), - die spezifischen Herstellungskosten der Komposition sind betrachtlich geringer als die der bisher verwendeten bekannten Stoffe. Die im Sinne der Erfindung zu verwendenden Mikroorganismen sind bekannt. Sie sind in Großbritannien unter den folgenden Nummern deponiert: Pseudomonas syringae pv. Syringe van Hall N.C.P.P.B. 2 507; Erwinia herbicola (Lohnis) dye N.C.P.P.B. 2 281; Pseudomonas fluorescens migula N.C.P.P.B. 1 598.
Zur Herstellung der Wirkstoffe der erfindungsgemäßen Komposition werden Pseudomonas syringae, Erwinia herbicola oder Pseudomonas fluorescens oder Gemische dieser Bakterien in einer Anzahl von 10-106/ml in Nährlösung geimpft, die in an sich bekannter Weise sterilisiert ist. Die Kultur wird bei 20-30 °C 24-36 Stunden lang fermentiert. Dann wird die Bakte rienmasse vom flüssigen Überstand abgetrennt. Die Bakterienmasse kann mit 50-100 Masse% einer 0,1-2 masseprozentigen Pufferlösung, vorzugsweise einem Alkalidihydrogenphosphat mit einem pH von 6,5-7, verdünnt und dann mit Ultraschall behandelt werden. Die aufgeschlossenen Zellen werden - vorzugsweise durch Lyophilisieren - entwässert. Zwecks Aufschluß der Zellen kann man die Bakterienmasse auch mit einer Glucoselösung der Konzentration 10-80 Masse% verrühren und die aktive Substanz dann durch Zentrifugieren oder chromatographisch abtrennen. Schließlich kann man die Bakterienmasse auch mit Ultraschall behandeln und durch Zent rifugieren mit 20 000 bis 40 000 g die unzerstörten Zellen abtrennen; die auf diese Weise gewonnenen Zellmembranen werden gewaschen und dann von der Waschflüssigkeit abgetrennt.
Die erfindungsgemäße Komposition enthält den Wirkstoff vorzugsweise in Konzentrationen von 0,001-95 Masse%, insbesondere 0,5-90 Masse%, daneben flüssige Träger- und Streckmittel, vorzugsweise 0,1-1 massepro- zentige Alkalichloridlösung oder 0,1-2 masseprozentige Alkalihydrogenphosphatlösung, oder feste Träger, vorzugsweise Kieselerde, Silikagel, Zeolith oder Polymere. Zur Kultivierung der Bakterien kann man Nährmedien bekannter Zusammensetzung oder Nährlösungen mit speziellen Zusätzen verwenden.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert. Beispiel 1 Zwei Liter Nährlösung (DIFCO Nutrient, pH = 7,1) werden 30 Minuten lang bei 110 ºC im Autoklav sterilisiert und dann unter sterilen Bedingungen mit 103/ml Pseudomonas syringae beimpft. Die Kultur wird bei 28 ºC 36 Stunden lang geschüttelt. In dieser Zeit steigt dieAnzahl der Bakterien auf 1016-1023/ml an. Zwecks Sauerstoffversorgung wird sterile Luft durch die Kultur geleitet. Die fertige Kultur wird für 24 Stunden in ein Eisbad gestellt und dann bei 0 ºC unter Einhaltung einer Drehzahl von 400 min-1 20 Minuten lang zentrifu giert. Die abgesetzte Bakterienmasse (25 g/l Kultur) wird in 25 ml 20 mM Phosphat puffer (KH2PO4, pH 7,0) aufgenommen. Sowohl die Bakterienmasse wie auch der zellfreie Überstand werden zur Herstellung der erfindungsgemäßen, Eiskristallkeime bildenden Komposition verwendet.
Beispiel 2
Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene
Weise mit dem Unterschied, daß man das Nährmedium mit 104/ml Erwinia herbicola Bakterien inokuliert.
Beispiel 3 Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß man das Nährmedium mit Pseudomonas fluorescens inokuliert. Beispiel 4
Gemäß Beispiel 1 hergestellte Bakterienmasse wird mit Ultraschall behandelt (Leistung des Gerätes: 250 W). Die Behandlungsdauer beträgt 20 Sekunden, daran schliessen sich 20 Sekunden Pause an, darn erneut 20 Sekunden Beschallung, insgesamt zehnmal. Dabei wird das Gefäß von außen mit Eiswasser gekühlt, weil eine Erwärmung des Materials die organischen Substanzen schädigen kann. Die die aufgeschlossenen Zellen enthaltende Suspension wird in einen Rundkolben gegossen und in einem Gerät der Marke New Brunswick mit flüssiger Luft gekühlt und bei +4 °C und 2,6 kPa (20 Torr) Druck lyophilisiert.
Aus dem Lyoohilisat wird mit 10 mM Phosphatpuffer im Bereich von 0,05 bis 3 mg/l eine Verdünnungsreihe angesetzt. Die Proben sowie auch 0,5 ml Puffer werden in die Röhrchen einer Ependorf-Zentrifuge gegeben. Die
Röhrchen werden dann mit einer Kühlgeschwindigkeit von 5 °C/h von 0 °C auf -20 °C gekühlt. Alle Glieder der Verdünnungsreihe aus der erfindungsgemäßen Kultur ge frieren einheitlich zwischen -4,0 und -4,3 ºC. Daraus läßt sich der Schluß ziehen, daß die mit Ultraschallbehandelte Bakterienmasse kristallkeimbildende Eigenschaften hat. Beispiel 5
Die gemäß Beispiel 1 hergestellte Bakterienmasse wird bei Raumtemperatur im Verhältnis 1:1 mit einer zweimolaren Glucoselösung verdünnt und 25-30 Minutenlang homogenisiert. Die Festsubstanz wird abzentrifugiert und das Zentrifugat auf eine mit DEAE Sephadex
A 50 gefüllte Säule aufgebracht. (Diese Sephadex-Füllung ist ein vernetztes Polysaccharid, das als funktionelle Gruppen Diäthyl-2-hydroxy-propyl-aminoäthyl-Gruppen trägt.) Es wird bei Raumtemperatur gearbeitet; das Zentrifugat fließt innerhalb von 2 Stunden durch die Säule. Dann wird die Säule mit dem zehnfachen Säulenvolumen 10 mM Tris-Acetatpuffer [tris-(Hydroxymethyl)-amino- methanacetat, pH 6,5] gewaschen. Schließlich wird die aktive Substanz mit je 200 ml 0,1 M und 1,0 M NaCl- Lösung von der Säule eluiert, wobei Fraktionen zu je
6 ml aufgefangen werden. Der Trockensubstanzgehalt eller Fraktionen wird auf 1 mg/ml eingestellt . Dann werden wie im Beispiel 4 beschrieben Verdünnungsreihen angefertigt, und es werden die im Beispiel 4 beschriebenen Gefrierversuche vorgenommen. Als Kontrolle dient eine NaCl-
Lösung, deren Konzentration dem NaCl-Gehalt der Versuchslösungen entspricht . Die Versuchslösungen gefrieren bei -5,8 bis -6,0 ºC, während die Kontrollen bei -9,8 bis -12,3 ºC erstarren. Der Versuch zeigt, daß die mit Glucose behandelte Substanz in der Lage ist, Kristallkeime zu bilden. Beispiel 6
Man arbeitet auf die im Beispiel 4 beschriebene Weise, verwendet jedoch nach Beispiel 2 hergestellte Bakte rienmasse . Die E rgeb nisse de r Ge f rie rversuche stimmen mit den im Beispiel 4 besch riebenen übe rein .
Beispiel 7
Man arbeitet auf die im Beispiel 5 beschriebene Weise, verwendet jedoch die nach Beispiel 3 hergestellte
Bakterienmasse. Die Ergebnisse der Gefrierversuche stimmen mit den im Beispiel 5 beschriebenen überein.
Beispiel 8
Aus der gemäß Beispiel 1 hergestellten Bakterienmasse wird die Zellmembran isoliert, um festzustellen, ob die Zellmembran eine kristallkeimbildende Wirkung hat oder nicht. Die aus 3 Liter Kulturflüssigkeit isolierte Masse wird in 80 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,14 Masse% Mercaptoäthanol enthält, suspendiert. Dann werden die Zellen mit Umtraschall (Leistung des Gerätes: 250 W) 30 Sekunden lang behandelt. Nach einer Minute Pause wird die Behandlung wiederholt, insgesamt fünfzehnmal. Der Aufschluß ist etwa 70 %ig. Dann werden die unzerstörten Zellen durch Zent rifugieren mit 1500 g abgesetzt. Der Überstand wird bei 0 °C mit 30 000 g
40 Minuten lang zent rif ugiert. Der die Zellmembranen enthaltende Bodensatz wird mit dem erwähnten Phosphatpuffer zweimal gewaschen, dann zent rifugiert und schließlich in dem Puffer suspendiert. Nach Bestimmung des Feststoffgehaltes wird aus der Substanz gemäß Beispiel 4 eine Verdünnungsreihe hergestellt. Jedes Glied dieser Reihe gefriert unter den im Be-lspiel 4 beschriebenen Bedingungen zwischen -4,0 und -4,3 ºC. Der als Kontrolle verwendete 10 mM Phosphat puffer gefriert bei -10,8 ºC. Beispiel 9
Der flüssige Überstand, der bei Abzent rifugieren der gemäß Beispiel 1 hergestellten Bakterienmasse anfällt, wird auf die dort beschriebene Weise lyophilisiert. Das dabei erhaltene weiße Pulver wird gewogen. Dann wird gemäß Beispiel 4 eine Verdünnungsreihe bereitet. Alle Glieder der Verdünnungsreihe gefrieren bei -4,2 °C. Als Kontrolle werden Kulturmedium sowie der lyophilisierte Überstand einer Kultur von Pseudomonas syringae ice- verwendet (dieser manipulierte Pseudomonas verursacht keine Frostschäden); die Kontrollen gefrieren bei -10,2 ºC beziehungsweise -10,3 ºC. Der Versuch beweist, daß auch der Überstand Stoffe enthält, die Kristallkeime des Eises bilden. Beispiel 10 Der Überstand der gemäß Beispiel 2 erhaltenen
Kultur wird mit dreifach destilliertem Wasser auf da Doppelte verdünnt und dann mit dem Anionenaustauscherharz DEAE Sephadex A 50 bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Dann wird das Gemisch auf eine SephadexSäule aufgegeben und die Säule mit dem zehnfachen Volumen 10 mM Tris-Acetat (pH = 6,5) gewaschen. Mit je 200 ml 0,1 M und 1,0 M NaCl-Lösung wird die Säule eluiert, wobei Fraktionen zu je 6 ml aufgefangen werden. Die Versuchslösungen gefrieren zwischen -5,3 und -6 ºC, während die entsprechenden, nur NaCl enthaltenden Kont rollösungen zwischen -9,8 und -12,3 ºC gefrieren.
Beispiel 11
Aus der gemäß Beispiel 1 hergestellten feuchten Bakterienmasse wird eine sprühbare Formulierung hergestellt. Zu diesem Zweck wird 0,01 kg der Bakterienmasse mit 1 kg 0,1 masseprozentiger NaCl-Lösung vermischt. Das flüssige Gemisch wird versprüht. Beispiel 12 In einem Rührgerät werden 0,5 kg der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Bakterienmasse mit 0,1 kg 0,1 masseprozentiger NaCl-Lösung vermischt. Das Gemisch wird mit 0,5 kg Aerosil (SiO2) versetzt, dann homogenisiert und schließlich bei Raumtemperatur getrocknet. Die Zube reit ung kann a uf pyrotechnischem Wege im Luft ra um ve rt eilt we rden .
Beis piel 13
Man arbeitet auf die im Beispiel 12 angegebene Weise, verwendet als festen Füllstoff jedoch 0,7 kg synthetischen Zeolith. Auch diese Zubereitung kann auf pyrotechnischem Wege ausgebracht werden.
Beispiel 14
Man arbeitet auf die im Beispiel 11 beschriebene Weise, vermischt die Bakterienmasse jedoch mit 2 kg 50 masseprozentiger wäßriger Celluloseacetatlösung.
Beispiel 15
Aus der gemäß Beispiel 1 isolierten Bakterienmasse werden mit 0,1 masseprozentiger NaCl-Lösung Lösungen der Konzentration von 0,1, 0,2 beziehungsweise 1,0 g/1 bereitet. Aus diesen Lösungen werden Tröpfchen eines durchschnittlichen Durchmessers von 1,2 mm geformt. Die Gefriereigenschaften der Tröpfchen werden in einer Diffusionskammer studiert. In der Kammer werden die Tröpfchen auf eine mit Peltierelementen gekühlte und mit Silikonfett behandelte Fläche aufgebracht. Die Temperatur der Fläche, die wegen des beträchtlichen Masseunterschiedes im wesentlichen mit der Temperatur der Tropfen übereinstimmt, wird mit einem Plat inwiderstand-Thermometer gemessen und von einer Digitalanzeige mit einer Genauigkeit von 0,1 Grad abgelesen. Die Abkühlungsgeschwindigkeit der Kammer und damit die der Tropfen kann reguliert werden. In dem für die Messung wichtigen βereich unterhalb Von 0 ºC kann die Kühlgeschwindigkeit innerhalb des Bereiches von 1-3 Grad/min geregelt werden.
Gemessen wird die Temperatur t50, d.h. diejenige Temperatur, bei der die Hälfte der Tropfen gefroren ist. Diese Temperatur liegt bei den drei Proben unter schiedlicher Konzentration bei -3,2 ºC, -3,6 ºC und
-1,5 °C.
Aus der Lösung der Konzentration 0,1 g/l werden
Tröpfchen der Größe 70-80 /um gebildet. Deren t50-Temperatur beträgt -4 ºC. Aus der gleichen Lösung gebildete Tropfen von 3-4 mm Durchmesser haben eine t50-Temperatur von -1,2 ºC.
Als Kontrolle wird mit destilliertem Wasser eine NaCl-Lösung der Konzentration von 0,1 g/l angesetzt. Die hälfte der aus dieser Lösung gebildeten Tropfen des Durchmessers 4 mm ist bei -12 ºC gefroren. Der gesamte Einfrierprozeß beginnt bei -10 °C und ist bei -14 ºC abgeschlossen. Die erfindungsgemäße Komposition bewirkt demnach einen Schmelzpunktsanstieg von etwa 10 °C.
Beispiel 16
Aus der Bakterienmasse gemäß Beispiel 1 wird mit NaCl-Lösuπg der Konzentration von 0,1 Masse% eine Lösung der Konzentration von 0,1 g/l bereitet. Aus Silberjodid und 0,1 %iger NaCl-Lösung wird eine Dispersion von 0,1 g/l Konzentration bereitet. Das Gefrierverhalten der Ansätze wird in der im Beispiel 15 beschriebenen Diffusionskammer untersucht. Die angewendete Kühlgeschwindigkeit beträgt im Bereich unter 0 °C 2 Grad/min. Auf die Kühlfläche werden Tropfen einer durchschnittlichen Größe von 1,2 mm aufgebracht. Die t50- Temperaturen betrugen: erfindungsgemäße Komposition -3,2 ºC, Silberjodid: -4,9 ºC. Der Versuch zeigt, daß die Schwellentemperatur der erfindungsgemäßen Kompositioπ dichter bei 0 ºC liegt, d.h. die Komposition eine Unterkühlung eher verhindert.

Claims

Patentansprüche
1. Als Schutz gegen Hagel geeignete Komposition zur Bildung von Eiskristallkeimen, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Kulturen von Pseudomonas syringae, Erwinia herbicola oder Pseudomonas fluorescens oder deren Gemischen gewonnene Bakterienmasse oder die daraus isolierten Zellmembranen oder den Überstand dieser Kulturen enthalten.
2. Komposition nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Kulturen von Pseudomonas syringae pv. Syringe van Hall N.C.P.P.B. 2 507, Erwinia herbicola (Lohnis) dye N.C.P.P.B. 2 281, Pseudomonas fluorescens migula N.C.P.P.B. 1 598 (hinterlegt in National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, Harpanden, Großbritannien) oder deren Gemischen gewonnene Bakterienmasse oder die daraus isolierten Zellmembranen oder den Überstand dieser Kulturen enthalten.
3. Komposition nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Wirkstoff in Natriumchloridlösung, vorzugsweise 0,1 %iger Natriumchloridlösung, verteilt enthält.
EP19860906422 1985-10-23 1986-10-21 Als schutz gegen hagel geeignete komposition zur bildung von eiskristallkeimen Withdrawn EP0243437A1 (de)

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