EA045001B1 - Клеточная суспензия для использования в лечении заболевания периферических артерий нижних конечностей - Google Patents
Клеточная суспензия для использования в лечении заболевания периферических артерий нижних конечностей Download PDFInfo
- Publication number
- EA045001B1 EA045001B1 EA201990583 EA045001B1 EA 045001 B1 EA045001 B1 EA 045001B1 EA 201990583 EA201990583 EA 201990583 EA 045001 B1 EA045001 B1 EA 045001B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cell suspension
- cells
- cell
- express
- white blood
- Prior art date
Links
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 title claims description 131
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 45
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 title claims description 27
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 17
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 title description 10
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 title description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 99
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 89
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 61
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 47
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 47
- 208000005764 Peripheral Arterial Disease Diseases 0.000 claims description 42
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 claims description 42
- 208000032064 Chronic Limb-Threatening Ischemia Diseases 0.000 claims description 41
- 206010034576 Peripheral ischaemia Diseases 0.000 claims description 41
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 claims description 38
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 claims description 37
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 35
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 23
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 claims description 20
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 19
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 claims description 19
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 18
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 18
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 17
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 claims description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 12
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 12
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 12
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 10
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 9
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 claims description 8
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 claims description 6
- 210000003137 popliteal artery Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 claims description 3
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 claims description 3
- 208000030613 peripheral artery disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 2
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 claims 1
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 51
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 50
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 22
- 238000002266 amputation Methods 0.000 description 21
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 16
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 16
- 230000008859 change Effects 0.000 description 15
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 15
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 15
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 14
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 13
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 12
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 12
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 12
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 11
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 10
- 206010017711 Gangrene Diseases 0.000 description 10
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 10
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 10
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 9
- 208000035901 Ischaemic ulcer Diseases 0.000 description 9
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 9
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 8
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 7
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 7
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 7
- 206010022562 Intermittent claudication Diseases 0.000 description 6
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 6
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 6
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 6
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 6
- 208000021156 intermittent vascular claudication Diseases 0.000 description 6
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 5
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 208000030175 lameness Diseases 0.000 description 5
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 5
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 4
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012282 endovascular technique Methods 0.000 description 4
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 4
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 4
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 230000035488 systolic blood pressure Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 0.000 description 3
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 3
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 3
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 3
- 208000031104 Arterial Occlusive disease Diseases 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 206010049927 Dry gangrene Diseases 0.000 description 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000004404 Intractable Pain Diseases 0.000 description 2
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 2
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000001872 metatarsal bone Anatomy 0.000 description 2
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 2
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 2
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000216 vascular lesion Toxicity 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 1
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 1
- 206010062542 Arterial insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000034048 Asymptomatic disease Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 101710082513 C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010013710 Drug interaction Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020565 Hyperaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010022095 Injection Site reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000008930 Low Back Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010053156 Musculoskeletal discomfort Diseases 0.000 description 1
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000014767 Myeloproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- CBENHWCORLVGEQ-HJOGWXRNSA-N Phe-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CBENHWCORLVGEQ-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 206010038934 Retinopathy proliferative Diseases 0.000 description 1
- 206010039897 Sedation Diseases 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010047281 Ventricular arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 201000007930 alcohol dependence Diseases 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007214 atherothrombosis Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002302 brachial artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011970 concomitant therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000004744 fore-foot Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002639 hyperbaric oxygen therapy Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000002697 interventional radiology Methods 0.000 description 1
- 230000007654 ischemic lesion Effects 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 238000011542 limb amputation Methods 0.000 description 1
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000011457 non-pharmacological treatment Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000002496 oximetry Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 108010065135 phenylalanyl-phenylalanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- -1 prefilled syringe Substances 0.000 description 1
- 238000009597 pregnancy test Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 208000022064 reactive hyperemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000036280 sedation Effects 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007892 surgical revascularization Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 229940124676 vascular endothelial growth factor receptor Drugs 0.000 description 1
- 230000004218 vascular function Effects 0.000 description 1
- 230000002227 vasoactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к клеточной суспензии зрелых клеток костномозгового происхождения, которые можно использовать при лечении или улучшении заболевания периферических артерий нижних конечностей, предпочтительно критически ишемизированной конечности.
Предпосылки изобретения
Заболевание периферических артерий нижних конечностей (PAD) включает широкий диапазон заболеваний сосудов, обусловленных атеросклеротическими, тромбоэмболическими и воспалительными процессами, которые измеряют структуру и функцию артерий нижних конечностей. Однако первопричиной PAD является атеросклероз.
Симптоматическое PAD нижних конечностей является результатом недостаточного потока крови, что ведет к недостаточному снабжению кислородом. PAD связано с атеротромбозом другого сосудистого русла, включая сердечнососудистую и цереброваскулярную системы. Наличие сахарного диабета (далее в настоящем описании DM) значительно увеличивает риск PAD, ускоряет течение заболевания, делая пациентов с диабетом более восприимчивыми к ишемическим эпизодам, ослабленной функции сосудов, увеличенной распространенности болезни и смертности, а также сниженному качеству жизни (QoL) (Thiruvoipati et al., 2015). В действительности, пациентов с PAD рассматривают в качестве гетерогенной группы пациентов в диапазоне от асимптоматических до пациентов с перемежающейся хромотой (IC) и пациентов с CLI (критической ишемией конечностей). CLI относится к состоянию артериальной недостаточности, которое снижает дистальное перфузионное давление до такой степени, что происходит тяжелое нарушение микроциркуляции и потока крови к тканям, а также питания. Незначительная травма, образование язв и инфекция могут сопутствовать возрастающим метаболическим потребностям пораженной ткани, что часто ведет к хроническим незаживающим язвам. Это представляет собой прогрессирующее заболевание, отличающееся многоуровневым заболеванием, тяжелым бременем сопутствующего заболевания и ограниченным сроком жизни.
Несмотря на то, что лодыжечно-плечевой индекс (ABI) используют для того, чтобы диагностировать PAD, и он является показателем тяжести PAD, он не полностью коррелирует с клинической тяжестью заболевания. Следовательно, более широкий диапазон клинических симптомов используют для того, чтобы классифицировать тяжесть PAD, используя две системы классификации, которые обычно применяют в клинической практике: Rutherford и Fontaine (Hirsch AT, 2006). Клиническая тяжесть PAD варьирует от асимптоматической до гангрены и ишемии конечностей, которые требуют ампутации. PAD представляет собой прогрессирующее заболевание с тяжестью состояния, возрастающей с течением времени. Прогрессирование заболевания протекает более быстро у пациентов с DM.
Ранжирование симптомов PAD и анатомических повреждений, отвечающих за эти симптомы, предоставляет объективную меру, с помощью которой можно наблюдать субъектов клинически и, что важно, обеспечивает согласованность при сравнении медицинских и интервенционных стратегий лечения в клинических исследованиях.
Классификацию Rutherford представляет собой обычно используемую клиническую систему определения стадии для описания PAD, которая схожа с классификацией Fontaine, но более широко цитируется в более новых публикациях в области сосудистой медицины. Окклюзионное заболевание периферических артерий обычно подразделяют на стадии по Fontaine, которые ввел Rene Fontaine в 1954 году, от стадии I (асимптоматической) до стадии IV (образование язв или гангрена). Классификация, введенная Rutherford в 1986 году и пересмотренная в 1997 году, состоит из четырех степеней и семи категорий, в диапазоне от категории 0 (асимптоматическая) до категории 6 (тяжелые ишемические язвы или гангрена) (табл. 1).
- 1 045001
Таблица 1. Классификация PAD по Fontaine и Rutherford
Классификация по Rutherford
Классификация по Fontaine
| Степень по Fontaine | Клиническое описание | Степень по Rutherford | Категория по Rutherford | Клиническое описание | Объективные критерии |
| I | Асимптематическая | 0 | 0 | Асимптематическая — без гемодинамически значимого окклюзионного заболевания | Нормальный тест на беговой дорожке или на реактивную гиперемию |
| 11-а | Перемежающаяся хромота после больше чем 200 метров безболезненной ходьбы | I | 1 | Умеренная хромота | Выполняет упражнение на беговой дорожке1; АР после упражнения >50 мм Нд, но по меньшей мере на 2 0 мм Нд ниже, чем значение в покое |
| II-b | Перемежающаяся хромота после меньше чем 200 метров ходьбы | I | 2 | Умеренная хромота | Между категориями 1 и 3 |
| 3 | Тяжелая хромота | Не может выполнить стандартное упражнение на беговой дорожке1 и АР после упражнения < 50 мм Нд | |||
| III | Боль в покое | II* | 4 | Ишемическая боль в покое | АР в покое < 4 0 мм Нд, спокойная или едва пуль сирующая лодыжка или метатарзальная PVR; ТР <30 мм Нд |
| IV | Образование язв или гангрена | III* | 5 | Незначительная утрата ткани — не заживающая язва, очаговая гангрена с диффузной ишемией стопы | АР в покое < 60 мм Нд, лодыжечная или метатарзальная PVR спокойная или едва пульсирующая; ТР < 40 мм Нд |
| 6 | Существенная утрата ткани — выходит выше уровня ТМ, более не возможно восстановление функциональной стопы | То же, что и категория 5 |
*Степени II и III, категории 4, 5 и 6 включены в термин хронической критической ишемии.
|5 мин при скорости 2 мили/ч с уклоном 12%.
AP = лодыжечное давление;
PVR = регистрация пульсового наполнения;
TP = давление в пальце ноги;
TM = трансметатарзальн.
CLI представляет собой прогрессирующее заболевание, отличающееся многоуровневым заболеванием, тяжелым бременем сопутствующего заболевания и ограниченным сроком жизни. В Trans-Atlantic Inter-Society Consensus (TASC) Document on Management of Peripheral Arterial Disease II, 2007 (TASCII, 2007) даны рекомендации о том, что термин CLI следует использовать для всех субъектов с хронической ишемической болью в покое, язвами или гангреной, свойственными объективно доказанному артериальному окклюзионному заболеванию. Текущее определение CLI включает субъектов с болью в нижних
- 2 045001 конечностях в покое, язвами или гангреной, вторичными по отношению к тяжело нарушенному потоку крови в конечности, сохраняющемуся в течение больше чем двух недель. Оно составляет категории 4-6 по Rutherford (ишемическая боль в покое, незначительная утрата ткани и существенная утрата ткани соответственно) или степени III и IV по Fontaine.
Единственным лечением основного заболевания при CLI является реваскуляризация. Однако значимая доля популяции (по оценкам, между 50 и 90% популяции) не подходит для ручной реваскуляризации (хирургический шунт или эндоваскулярная процедура) вследствие отсутствия жизнеспособных кровеносных сосудов, неудачи при предыдущих ручных процедурах реваскуляризации или сопутствующих заболеваний. Многие пациенты с CLI имеют множество состояний, которые могут препятствовать прохождению ими ручной реваскуляризации. В конечном итоге, для большой доли этих пациентов ампутация часто является единственным остающимся вариантом, целью которого является лечение некупируемой боли, предотвращение прогрессирования гангрены или борьба с инфекцией. Следовательно, остро необходима новая терапия.
В настоящее время начальное лечение пациентов с CLI обычно состоит в оценке пораженной (индекс) конечности на пригодность к реваскуляризации с использованием или хирургического шунта или эндоваскулярных способов. Всех пациентов следует лечить от существующих симптомов заболевания, в частности боли, язв и инфекций. Однако лечение боли очень часто является неэффективным и поскольку ишемические язвы заживают редко, лечение ран обычно сосредоточено на контроле инфекции, предотвращении ухудшения и спасении конечности.
Общие цели лечения для CLI включают лечение боли, заживление ран, спасение конечности, усовершенствование QoL, включая поддержание амбулаторного состояния, снижение общего кардиологического риска.
Клеточная суспензия по настоящему изобретению, в частности, показана для пациентов с CLI, в частности для пациентов с CLI и DM, которым не доступна реваскуляризация с использованием хирургического шунта или эндоваскулярных способов. Для этих пациентов неудовлетворенная потребность является наивысшей, поскольку отсутствуют терапевтические возможности для лечения основного заболевания. Любое лечение, используемое у этих пациентов, является симптоматическим: уход за раной, контроль инфекции и лечение боли. Для таких пациентов, не подходящих для ручной реваскуляризации, по мере прогрессирования заболевания, единственной клинической возможностью может быть ампутация в ответ на прогрессирующую гангрену, неконтролируемую инфекцию или некупируемую боль. Среди пациентов с PAD, у которых развивается CLI, приблизительно 25% погибают в течение года (NICE, 2012). В зависимости от тяжести CLI, годичные уровни первичных ампутаций варьируют от 5 до 40%, причем самые высокие уровни у пациентов, которые не подходят для реваскуляризации, которые имеют неврологические нарушения или являются лежачими.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - блок-схема изготовления клеточной суспензии по изобретению;
фиг. 2 - классификация по Rutherford через 3, 6, 9 и 12 месяцев после введения клеточной суспензии по изобретению, контроль в сравнении с лечением (включая ампутации и смерть), LOCF;
фиг. 3 - классификация по Rutherford через 3, 6, 9 и 12 месяцев после введения клеточной суспензии по изобретению, эффект трех возрастающих доз (включая ампутации и смерть), LOCF;
фиг. 4 - улучшение классификации по Rutherford (процентная доля субъектов) через 3, 6, 9 и 12 месяцев для контрольной группы и трех групп (доз) клеточной суспензии по изобретению;
фиг. 5 - доля субъектов, классифицированных по числу язв в пораженной конечности через 3, 6, 9 и 12 месяцев (левая часть: контрольная группа; правая часть: группа клеточной суспензии по изобретению);
на фиг. 6 представлены ангиографические изображения для трех из 24 случаев возникавшего васкулогенеза по сравнению с базовым уровнем на фиг. 6: продольный рост артерий (фиг. 6A), возникновение новых сосудов (фиг. 6B) и поперечный рост коллатерали, которая направлена к коже (фиг. 6C);
фиг. 7 - блок-схема процесса изготовления продукта клеточной суспензии по изобретению.
Краткое описание изобретения
Проблема, на которую направлено настоящее изобретение, состоит в том, чтобы предоставить пациентам, страдающим заболеванием периферических артерий нижних конечностей (PAD), предпочтительно пациентам с CLI, более предпочтительно пациентам с CLI и DM, которые не имеют возможности реваскуляризации с использованием хирургического шунта или эндоваскулярных способов, усовершенствованную терапевтическую альтернативу. Такая терапевтическая усовершенствованная альтернатива предусмотрена настоящим изобретением в форме клеточной суспензии аутологичных или аллогенных зрелых клеток костномозгового происхождения, как определено аспектами и предпочтительными вариантами осуществления, на которые ссылаются ниже.
Следовательно, первый аспект изобретения относится к клеточной суспензии (далее в настоящем
- 3 045001 описании клеточная суспензия по изобретению) аутологичных или аллогенных, предпочтительно аутологичных, зрелых белых клеток крови костномозгового происхождения, предпочтительно происходящих из гребня подвздошной кости (или подвздошного гребня), обогащенных мононуклеарными клетками, что обозначает, что больше чем 25% белых клеток крови (WBC), присутствующих в клеточной суспензии, представляют собой мононуклеарные клетки, которая содержит:
A. Мононуклеарные клетки (MNC), выбранные из списка, содержащего или состоящего из:
i) популяции лимфоцитов;
ii) популяции моноцитов и iii) популяции гематопоэтических стволовых клеток, экспрессирующих CD34;
и где клеточная суспензия дополнительно содержит:
B. гранулоциты;
для использования в лечении или улучшении заболевания периферических артерий нижних конечностей.
Следует отметить, что, вообще говоря, популяции клеток A) и B) в свою очередь содержат популяцию клеток, которая экспрессирует CXCR4, рецептор для фактора миграции SDF1, из этой популяции важно отметить присутствие субпопуляции гематопоэтических стволовых клеток, экспрессирующих CD34 и CXCR4. Кроме того, популяции клеток A) и B) в свою очередь содержат дополнительную популяцию клеток, которая экспрессирует VEGFR2, рецептор для фактора ангиогенеза VEGF, который вовлечен в ангиогенез и васкулогенез.
Наконец, популяция клеток A, iii) в свою очередь содержит популяцию клеток, которая не экспрессирует CD38, которые представляют собой ранние не коммитированные гематопоэтические стволовые клетки.
Следует отметить, что мононуклеарные клетки (MNC) считают основным активным компонентом клеточной суспензии по изобретению. В частности, активные компоненты или ингредиенты клеточной суспензии по настоящему изобретению представляют собой MNC, выбранные из списка, состоящего из лимфоцитов, моноцитов и гематопоэтических стволовых клеток, которые экспрессируют CD34, более конкретно субпопуляций ранних не коммитированных гематопоэтических стволовых клеток, которые экспрессируют CD34 и не экспрессируют CD38, белых клеток крови, способных к опосредованной SDF1 миграции, которые экспрессируют CXCR4, стволовых клеток, способных к опосредованной SDF-1 миграции, которые экспрессируют CD34 и CXCR4, и белых клеток крови, способных к ангиогенезу, которые экспрессируют VEGFR2. Все эти мононуклеарные клетки представляют собой клетки костномозгового происхождения, предпочтительно происходящие из гребня подвздошной кости (или подвздошного гребня).
Кроме того, дополнительно отмечено, что суспензия белых клеток крови по изобретению дополнительно содержит гранулоциты, которые представляют собой нейтрофилы, эозинофилы и/или базофилы. В связи с этим важно отметить, что конечный продукт клеточной суспензии по изобретению, как проиллюстрировано в примерах, дозируют, исходя из жизнеспособных белых клеток крови костномозгового происхождения, включая не только фракцию MNC белых клеток крови (лимфоциты и моноциты и стволовые клетки), но также гранулоциты.
В предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту изобретения, клеточная суспензия по изобретению, в конечном составе, который обогащен мононуклеарными клетками, что обозначает, что больше чем 25% от общего числа белых клеток крови (WBC), присутствующих в клеточной суспензии, представляют собой мононуклеарные клетки, содержит приблизительно от 4x108 приблизительно до 2x109 аутологичных или аллогенных белых клеток крови костномозгового происхождения, предпочтительно аутологичных, предпочтительно происходящих из гребня подвздошной кости (или подвздошного гребня), где из общего числа приблизительно от 4x108 приблизительно до 2x109 белых клеток крови
i) приблизительно от 20% приблизительно до 51% представляют собой лимфоциты и приблизительно от 3,9% приблизительно до 22,3% представляют собой моноциты;
ii) приблизительно от 1,4% приблизительно до 10% представляют собой гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют CD34;
iii) приблизительно от 25,3% приблизительно до 83,3%, предпочтительно приблизительно от 32,3% приблизительно до 80,0%, от общего числа белых клеток крови представляют собой мононуклеарные клетки, предпочтительно выбранные из списка, состоящего из лимфоцитов, моноцитов и CD34 клеток;
iv) приблизительно от 16,7% приблизительно до 74,7%, предпочтительно приблизительно от 20,0% приблизительно до 67,7%, представляют собой гранулоциты
v) из общего числа гематопоэтических стволовых клеток, которые экспрессируют CD34, приблизительно от 7,7% приблизительно до 55,5% представляют собой ранние не коммитированные гематопоэтические стволовые клетки, которые не экспрессируют CD38;
vi) приблизительно от 5,4% приблизительно до 38,8% белых клеток крови экспрессируют CXCR4;
vii) из общего числа гематопоэтических стволовых клеток, которые экспрессируют CD34, прибли
- 4 045001 зительно от 0,7% приблизительно до 10,3% представляют собой стволовые клетки, которые экспрессируют CD34 и CXCR4;
viii) приблизительно от 0,07% приблизительно до 24,7% белых клеток крови экспрессируют VEGFR2 и ix) максимальное соотношение красных клеток крови и лейкоцитарных клеток составляет 6,7 и максимальное соотношение тромбоцитов и лейкоцитарных клеток составляет 32.
В другом предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту изобретения клеточная суспензия по изобретению, в конечном составе, как определено в предшествующем абзаце, содержит приблизительно от 4x108 приблизительно до 1,2x109 белых клеток крови, более предпочтительно приблизительно от 5x108 приблизительно до 2x109 белых клеток крови, еще более предпочтительно приблизительно от 5x108 приблизительно до 1,2x109 белых клеток крови, и все значения доз между каждым из вышеперечисленных значений.
Определенные варианты осуществления можно выбирать в виде поддиапазонов из этих значений белых клеток крови в конечном составе. Например, конкретный вариант осуществления можно выбирать в виде содержания белых клеток крови, в конечном составе, от 8x108 приблизительно до 1,2x109 белых клеток крови. Другой пример того, как диапазон можно отбирать в одном из вариантов осуществления, состоит в выборе содержания приблизительно от 9x108 приблизительно до 1,1x109 белых клеток крови. Третий пример диапазонов, которые можно выбирать для конкретного варианта осуществления, состоит в выборе приблизительно от 9,5x108 приблизительно до 1,05x109 белых клеток крови. Четвертый пример диапазонов, которые можно выбирать для конкретного варианта осуществления, состоит в выборе содержания, такого как от 9,8x108 приблизительно до 1,02x109 белых клеток крови.
Другие примеры того, как можно выбирать диапазон по варианту осуществления для содержания или дозы, включают диапазон от 6x108 приблизительно до 2x109, предпочтительно приблизительно до 1,2x109, белых клеток крови, охватывая все значения доз между ними. Другой пример состоит в выборе диапазона от 7x108 приблизительно до 2x109, предпочтительно приблизительно до 1,2x109, белых клеток крови, охватывая все значения доз между ними. Другой пример состоит в выборе диапазона от 8x108 приблизительно до 2x109, предпочтительно приблизительно до 1,2x109, белых клеток крови, охватывая все значения доз между ними. Другой пример состоит в выборе диапазона от 8,5x108 приблизительно до 2x109, предпочтительно приблизительно до 1,2x109, белых клеток крови, охватывая все значения доз между ними. Другой пример состоит в выборе диапазона от 9x108 приблизительно до 2x109, предпочтительно приблизительно до 1,2x109, белых клеток крови, охватывая все значения доз между ними. Другой пример состоит в выборе диапазона от 9,5x108 приблизительно до 2x109, предпочтительно приблизительно до 1,2x109, белых клеток крови, охватывая все значения доз между ними. Таким образом, все диапазоны доз, которые можно выбирать из значений в настоящем описании и как поймут средние специалисты в данной области, находятся в объеме данного изобретения.
Способы измерения каждой из популяций клеток, указанных выше, четко определены в подробном описании изобретения.
Следует отметить, что такая клеточная суспензия может содержать фармацевтически приемлемые носители и/или эксципиенты.
В другом предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту изобретения или любых из его предпочтительных вариантов осуществления, заболевание периферических артерий нижних конечностей представляет собой критическую ишемию конечностей.
В другом предпочтительном варианте осуществления по первому аспекту изобретения или любых из его предпочтительных вариантов осуществления клетки суспендируют в объеме от 5 до 30 мл гепаринизированного солевого раствора или лактатного раствора Рингера, предпочтительно содержащего приблизительно 1% HSA и приблизительно 2,5% глюкозы.
Второй аспект изобретения относится к клеточной суспензии, как определено в первом аспекте изобретения или любых из его предпочтительных вариантов осуществления, для использования в способе лечения заболевания периферических артерий нижних конечностей, предпочтительно критической ишемии конечностей, через внутриартериальное введение, в котором поток крови низкого давления вплоть до 4 атмосфер получают посредством расположения надуваемого баллона проксимально от окклюзионного повреждения сосудов в дистальной бедренной или подколенной артерии, и инфузию указанной клеточной суспензии внутриартериально.
Третий аспект изобретения относится к одному или нескольким предварительно заполненным шприцам, содержащим клеточную суспензию, как определено в первом аспекте изобретения или любых из его предпочтительных вариантов осуществления.
Четвертый аспект изобретения относится к шприцу (предварительно заполненному шприцу), как определено в третьем аспекте изобретения, для использования в лечении или улучшении заболевания периферических артерий нижних конечностей, предпочтительно критической ишемии конечностей. Следует отметить, что один или несколько предварительно заполненных шприцов можно использовать у
- 5 045001 одного пациента.
Пятый аспект изобретения относится к шприцу (предварительно заполненному шприцу), как определено в третьем аспекте изобретения, для использования в способе лечения заболевания периферических артерий нижних конечностей, предпочтительно критической ишемии конечностей, через внутриартериальное введение, где поток крови низкого давления вплоть до 4 атмосфер получают посредством расположения надуваемого баллона проксимально от окклюзионного повреждения сосудов в дистальной бедренной или подколенной артерии, и инфузию указанной клеточной суспензии внутриартериально.
В предпочтительном варианте осуществления с первого до пятого аспектов изобретения клеточную суспензию или шприцы предоставляют в виде однократной дозы.
В предпочтительном варианте осуществления второго и пятого аспектов изобретения индуцирование потока низкого давления получают между 1 и 6 мин и инфузию указанной клеточной суспензии выполняют между 2 и 10 мин.
Шестой аспект изобретения относится к процессу изготовления клеточной суспензии по изобретению, как определено в первом аспекте изобретения или в любом из его предпочтительных вариантов осуществления, который включает:
1. Взятие костного мозга (ВМ) осуществляют посредством повторных аспираций, предпочтительно из заднего подвздошного гребня субъекта под местной или общей анестезией. Затем аспираты ВМ собирают предпочтительно в мешок для переноса, содержащий антикоагулянт раствор, более предпочтительно раствор A цитрата декстрозы (ACD-A).
2. ВМ фильтруют, предпочтительно под действием гравитации, чтобы удалять любые мелкие костные фрагменты и предотвращать засорение в ходе последующих стадий.
3. Начальный объем ВМ уменьшают, предпочтительно приблизительно до 50-100 мл, предпочтительно с использованием программы SmartRedux на устройстве Sepax 2.0 и ассоциированного стерильного одноразового набора SmartRedux (CS-490.1). Эта стадия, которая включает удаление плазмы и красных клеток крови (RBC), что предпочтительно ведет к приблизительно 50-100 мл продукта лейкотромбоцитарного слоя, также вносит вклад в чистоту конечного продукта.
4. Необязательно, стадию уменьшения объема осуществляют за один или два цикла в зависимости от объема исходного материала, подлежащего обработке. Образцы ВМ объемами вплоть до 220 мл обрабатывают за один цикл и образцы больше чем 220 мл обрабатывают за два цикла с использованием того же набора. Предпочтительно для уменьшения объема как за один, так и за два цикла, конечный объем устанавливают приблизительно 50-100 мл.
5. Стерильный промежуточный мешок для образца, содержащий ВМ уменьшенного объема, как установлено на стадиях 3 или 4, проходит через автоматизированное центрифугирование в градиенте плотности, после чего следуют два промывания суспензии мононуклеарных клеток (MNC) с использованием раствора для промывания, предпочтительно состоящего из 2-4% HSA в солевом растворе (и то и другое фармацевтической степени чистоты). Приблизительно 45 мл продукта BM-MNC собирают в выходной мешок, а другие компоненты удаляют в мешок для отходов. Предпочтительно стерильный промежуточный мешок для образца, содержащий ВМ уменьшенного объема, проходит через центрифугирование в градиенте плотности NeatCell, после чего следуют два промывания суспензии мононуклеарных клеток (MNC) с использованием раствора для промывания, предпочтительно состоящего из 2-4% HSA в солевом растворе (и то и другое фармацевтической степени чистоты). Приблизительно 45 мл продукта BMMNC собирают в выходной мешок, а другие компоненты удаляют в мешок для отходов.
6. BM-MNC собирают из мешка для продукта, предпочтительно используя 50 мл шприц, и фильтруют, предпочтительно через 50 мкм фильтр, предпочтительно в стерильную пробирку Falcon. Мешок для продукта споласкивают раствором для промывания и фильтруют для усовершенствования извлечения MNC. Конечный объем лекарственного вещества BM-MNC корректируют до 40-60 мл.
Лекарственное вещество центрифугируют и осадок ресуспендируют в смеси для конечного формулирования, предпочтительно солевом растворе с гепарином или лактатном растворе Рингера с предпочтительно 1% HSA и предпочтительно 2,5% глюкозы в объеме предпочтительно 5-30 мл.
Как уже установлено выше, следует отметить, что конечный продукт клеточной суспензии, получаемый по шестому аспекту изобретения, дозируют на основе жизнеспособных белых клеток крови, включающих не только фракцию MNC, но также гранулоциты. Поскольку MNC представляют собой активный компонент, процентную долю MNC в конечном продукте считают признаком качества.
Седьмой аспект изобретения относится к продукту клеточной суспензии или контейнеру продукта, предпочтительно одному или нескольким шприцам, которые получают или можно получать способом по шестому аспекту изобретения. Следует отметить, что такой продукт клеточной суспензии или контейнер продукта можно использовать, как установлено в любом от первого до пятого аспектов изобретения.
Описание изобретения
Определения
Как используют в настоящем описании, аутологичный понимают как относящийся к клеточному препарату, где донор и реципиент представляют собой одного и того же индивидуума.
Как используют в настоящем описании, аллогенный понимают как относящийся к клеточному
- 6 045001 препарату, где донор и реципиент не представляют собой одного и того же индивидуума.
Как используют в настоящем описании, зрелые клетки костномозгового происхождения понимают как препарат, содержащий клетки, которые не являются эмбриональными и происходят из костного мозга, полученного у донора-человека.
Как используют в настоящем описании, клеточную суспензию понимают как препарат клеток, суспендированных в жидкой среде.
Как используют в настоящем описании, клеточную суспензию зрелых клеток костномозгового происхождения понимают как препарат клеток, не являющихся эмбриональными и происходящих из костного мозга, полученного у донора-человека, которые суспендированы в жидкой среде.
Как используют в настоящем описании, гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют CD34 понимают как гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют поверхностный маркер CD34 и идентифицируют как CD34-положительные с помощью окрашивания антителом к CD34 и проточной цитометрии.
Как используют в настоящем описании ранние не коммитированные гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют CD34 и не экспрессируют CD38 понимают как гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют поверхностный маркер CD34 и идентифицируют как CD34положительные с помощью окрашивания антителом к CD34 и проточной цитометрии, но идентифицируют как отрицательные по поверхностному маркеру CD38 с помощью окрашивания антителом к CD38 и проточной цитометрии.
Как используют в настоящем описании, белые клетки крови, которые экспрессируют CXCR4 понимают как клетки, которые экспрессируют поверхностный маркер CD45 и CXCR4 и идентифицируют как CD45- и CXCR4-положительные с помощью окрашивания антителами к CD45 и CXCR4 и проточной цитометрии. CXCR4 представляет собой рецептор для фактора миграции SDF-1.
Как используют в настоящем описании, стволовые клетки, которые экспрессируют CD34 и CXCR4 понимают как клетки, которые экспрессируют поверхностный маркер CD45, CD34 и CXCR4 и идентифицируют как CD45-, CD34- и CXCR4-положительные с помощью окрашивания антителами к CD45, CD34 и CXCR4 и проточной цитометрии. CXCR4 представляет собой рецептор для фактора миграции SDF-1.
Как используют в настоящем описании, белые клетки крови, которые экспрессируют VEGFR2 понимают как клетки, которые экспрессируют поверхностные маркеры CD45 и VEGFR2 и идентифицируют как CD45- и VEGFR2-положительные с помощью окрашивания антителами к CD45 и VEGFR2 и проточной цитометрии. VEGFR2 представляет собой рецептор VEGF, который вовлечен в ангиогенез и васкулогенез.
Как используют в настоящем описании, мононуклеарные клетки понимают как любые кровяные или костномозговые белые клетки крови (также обозначаемые как лейкоциты), которые имеют круглое ядро, тем самым исключая гранулоциты.
Как используют в настоящем описании, заболевание периферических артерий нижних конечностей понимают как сужение артерий, отличных от тех, которые снабжают сердце или головной мозг. Заболевание периферических артерий обычно затрагивает нижние конечности, но могут быть вовлечены другие артерии.
Как используют в настоящем описании, критическую ишемию конечностей понимают как частный случай заболевания периферических артерий, где состояние отличается хронической ишемической болью в покое, язвами или гангреной в одной или обеих ногах, что свойственно для объективно доказанного артериального окклюзионного заболевания.
Термин приблизительно по отношению к числовому значению обозначает +/- 20% от этого числового значения. Термин приблизительно по отношению к числовому значению также включает +/10% от этого числового значения. Термин приблизительно по отношению к числовому значению также включает +/- 5% от этого числового значения. Термин приблизительно по отношению к числовому значению также включает +/- 1% от этого числового значения.
Термины содержать и содержащий используют во включающем открытом смысле, что обозначает, что могут быть включены дополнительные элементы. Термин содержит также охвачен и может быть использован взаимозаменяемо с терминами состоит из и состоит по существу из.
Как используют в настоящем описании, термин зрелый обозначает, что стволовые клетки не являются эмбриональными. В одном из вариантов осуществления зрелый обозначает постэмбриональный или постнатальный. В отношении стволовых клеток по настоящему изобретению, термин зрелая стволовая клетка обозначает, что стволовая клетка выделена из ткани или органа животного на стадии роста, наступающей позже эмбриональной стадии. Зрелые стволовые клетки отличаются от эмбриональных стволовых клеток, которые определяются их происхождением, внутренней клеточной массой бластоцисты. Зрелые стволовые клетки в соответствии с изобретением можно выделять из любой не эмбриональной ткани, и они включают младенцев, детей, подростков и зрелых субъектов. В целом, стволовую клетку по настоящему изобретению выделают у млекопитающего не младенца и, например, у человека не младенца. Предпочтительно, стволовые клетки по настоящему изобретению выделяют у человека.
- 7 045001
Термин выделенный указывает на то, что клетка или популяция клеток, к которой он относится, не находится в своем естественном окружении. Клетка или популяция клеток по существу отделена от окружающей ткани.
Профиль маркеров нового продукта клеточной суспензии, упоминаемого в настоящем изобретении, дополнительно можно определять по присутствию и/или отсутствию дополнительных маркеров или по конкретному профилю из комбинации присутствующих и отсутствующих маркеров. В каждом случае конкретная комбинация маркеров может присутствовать в виде конкретного профиля в популяции клеток и/или конкретного профиля маркеров на индивидуальных клетках в популяции.
Термин маркер, как используют в настоящем описании, охватывает любую биологическую молекулу, присутствие, концентрация, активность или состояние фосфорилирования которой можно обнаруживать и использовать для того, чтобы идентифицировать фенотип клетки.
Тогда клетки по изобретению являются положительными по определенным фенотипическим маркерам и отрицательными по другим. Под положительным понимают, что маркер экспрессирован в клетке. Для того чтобы считаться экспрессируемым, маркер должен присутствовать на поддающемся обнаружению уровне. Под поддающимся обнаружению уровнем понимают, что маркер можно обнаруживать с использованием одного из стандартных лабораторных способов, таких как анализ ПЦР, блоттинга или проточной цитометрии, как описано.
Термин экспрессированный используют для того, чтобы описывать присутствие маркера на поверхности или внутри клетки. Для того чтобы считаться экспрессированным, маркер должен присутствовать на поддающемся обнаружению уровне. Под поддающимся обнаружению уровнем понимают, что маркер можно обнаруживать с использованием одного из стандартных лабораторных способов, таких как анализ ПЦР, блоттинга, иммунофлуоресценции, ELISA или FACS. Экспрессированный может относиться, но не ограничиваясь этим, к поддающемуся обнаружению присутствию белка, состояния фосфорилирования белка или мРНК, кодирующей белок. Ген считают экспрессируемым клеткой по изобретению или клеткой из популяции по изобретению, если экспрессию можно обоснованно обнаруживать после 30 циклов ПЦР, предпочтительно после 37 циклов ПЦР, что соответствует уровню экспрессии в клетке по меньшей мере приблизительно 100 копий на клетку. Термины экспрессирует и экспрессия имеют соответствующие значения. При уровне экспрессии ниже этого порога маркер считают не экспрессированным.
Подробное описание
Продукт клеточной суспензии
Клеточная суспензия в соответствии с настоящим изобретением представляет собой продукт, подходящий для лечения или улучшения заболевания периферических артерий нижних конечностей, в частности для лечения критической ишемии конечностей (CLI), более конкретно для лечения критической ишемии конечностей (CLI) у пациентов с DM, которые не имеют возможности реваскуляризации с использованием хирургического шунта или эндоваскулярных способов, в качестве усовершенствованной терапевтической эффективной альтернативы. В этом смысле, к удивлению обнаружено, что клеточная суспензия в соответствии с настоящим изобретением, когда используют при лечении или улучшении заболевания периферических артерий нижних конечностей, ведет ко многим клинически релевантным усовершенствованиям, таким как изменение в классификации по Rutherford с CLI степени II (категория 4) или III (категория 5) на степень I (категория 1-3) или степень 0 (категория 0); усовершенствованный процесс заживления не только для язв, но даже для больших ампутаций; и увеличение протяженности сосудов и/или плотности сосудов. Все вышеуказанные преимущества можно получать даже при одном введении клеточной суспензии, и они ясно проиллюстрированы в примере 2.
В целом, клеточная суспензия по изобретению относится к клеточной суспензии аутологичных или аллогенных, предпочтительно аутологичных, зрелых клеток костномозгового происхождения, предпочтительно происходящих из гребня подвздошной кости (или подвздошного гребня), которая содержит:
A. Мононуклеарные клетки (MNC), выбранные из списка, содержащего или состоящего из:
i) популяции лимфоцитов;
ii) популяции моноцитов и iii) популяции гематопоэтических стволовых клеток, экспрессирующих CD34;
и где клеточная суспензия дополнительно содержит:
B. Гранулоциты.
Следует отметить, что популяции клеток A) и B), в свою очередь, содержат популяцию клеток, которая экспрессирует CXCR4, рецептор для фактора миграции SDF1, из этой популяции важно отметить присутствие субпопуляции гематопоэтических стволовых клеток, экспрессирующих CD34 и CXCR4. Кроме того, популяции клеток A) и B) в свою очередь содержат популяцию клеток, которая экспрессирует VEGFR2, рецептор для фактора ангиогенеза VEGF, который вовлечен в ангиогенез и васкулогенез.
Наконец, популяция клеток A iii) в свою очередь содержит популяцию клеток, не экспрессирующую CD38, которые представляют собой ранние не коммитированные гематопоэтические стволовые клетки.
Следовательно, в частности, суспензия в соответствии с настоящим изобретением представляет со- 8 045001 бой клеточную суспензию аутологичных или аллогенных, предпочтительно аутологичных, зрелых клеток костномозгового происхождения, которая содержит: i) гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют CD34; ii) ранние не коммитированные гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют CD34 и не экспрессируют CD38; iii) белые клетки крови, которые экспрессируют CXCR4, который представляет собой рецептор для фактора миграции SDF-1; iv) гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют CD34 и CXCR4, который представляет собой рецептор для фактора миграции SDF-1; v) белые клетки крови, которые экспрессируют VEGFR2, который представляет собой рецептор для (VEGF), и vi) моноциты, гранулоциты и лимфоциты.
Важно отметить, что конечный продукт клеточной суспензии по изобретению дозируют на основе жизнеспособных белых клеток крови костномозгового происхождения, включающих не только мононуклеарную фракцию белых клеток крови (лимфоциты и моноциты и стволовые клетки), но также гранулоциты.
Следовательно, клеточная суспензия по изобретению относится к аутологичным или аллогенным, предпочтительно аутологичным, зрелым клеткам костномозгового происхождения, содержащим: i) гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют CD34, ii) ранние не коммитированные гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют CD34 и не экспрессируют CD38; iii) белые клетки крови, которые экспрессируют CXCR4, который представляет собой рецептор для фактора миграции SDF-1, т.е.; iv) гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют CD34 и CXCR4, который представляет собой рецептор для фактора миграции SDF-1, v) белые клетки крови, которые экспрессируют VEGFR2, который представляет собой рецептор для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), и vi) моноциты, гранулоциты и лимфоциты.
В предпочтительном варианте осуществления клеточная суспензия, в конечном составе, который обогащен мононуклеарными клетками, что обозначает, что больше чем 25% белых клеток крови (WBC), присутствующих в клеточной суспензии, представляют собой мононуклеарные клетки, содержит приблизительно от 4x108 приблизительно до 2x109 аутологичных или аллогенных белых клеток крови костномозгового происхождения, предпочтительно аутологичных, предпочтительно происходящих из гребня подвздошной кости (или подвздошного гребня), где из общего числа приблизительно от 4x108 приблизительно до 2x109 белых клеток крови:
i) приблизительно от 20% приблизительно до 51% представляют собой лимфоциты и приблизительно от 3,9% приблизительно до 22,3% представляют собой моноциты;
ii) от 1,4 до 10% представляют собой гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют CD34;
iii) приблизительно от 25,3% приблизительно до 83,3% от общего числа белых клеток крови представляют собой мононуклеарные клетки;
iv) приблизительно от 16,7% приблизительно до 74,7% представляют собой гранулоциты;
v) приблизительно от 5,4% приблизительно до 38,8% от общего числа белых клеток крови экспрессируют CXCR4;
vi) приблизительно от 0,07% приблизительно до 24,7% от общего числа белых клеток крови экспрессируют VEGFR2;
vii) из общего числа гематопоэтических стволовых клеток, которые экспрессируют CD34, приблизительно от 7,7% приблизительно до 55,5% представляют собой ранние не коммитированные гематопоэтические стволовые клетки, которые не экспрессируют CD38, и приблизительно от 0,7% приблизительно до 10,3% представляют собой стволовые клетки, которые экспрессируют CD34 и CXCR4; и viii) максимальное соотношение красных клеток крови и лейкоцитарных клеток составляет 6,7 и максимальное соотношение тромбоцитов и лейкоцитарных клеток составляет 32.
В другом предпочтительном варианте осуществления из общего числа белых клеток крови от 32,3% до 80,0% представляют собой мононуклеарные клетки, выбранные из списка, состоящего из лимфоцитов, моноцитов и гематопоэтических стволовых клеток, которые экспрессируют CD34 клетки, и от 20,0 до 67,7%, представляют собой гранулоциты.
В еще одном другом предпочтительном варианте осуществления, клеточная суспензия по изобретению, в конечном составе, как определено в предшествующем абзаце, содержит приблизительно от 4x108 приблизительно до 1,2x109 белых клеток крови, более предпочтительно приблизительно от 5x108 приблизительно до 2x109 белых клеток крови, еще более предпочтительно приблизительно от 5x108 приблизительно до 1,2x109 белых клеток крови и все значения доз между каждым из вышеперечисленных значений.
Определенные варианты осуществления можно выбирать в виде поддиапазонов из этих значений белых клеток крови в конечном составе. Например, конкретный вариант осуществления можно выбирать в виде содержания белых клеток крови от 8x108 приблизительно до 1,2x109 белых клеток крови. Другой пример того, как диапазон можно выбирать в одном из вариантов осуществления, состоит в выборе содержания приблизительно от 9x108 приблизительно до 1,1 x 109 белых клеток крови. Третий пример диапазонов, которые можно выбирать для конкретного варианта осуществления, состоит в выборе прибли
- 9 045001 зительно от 9,5 х108 приблизительно до 1,05 х109 белых клеток крови. Четвертый пример диапазонов, которые можно выбирать для конкретного варианта осуществления, состоит в содержании, таком как от 9,8х108 приблизительно до 1,02х109 белых клеток крови.
Другие примеры того, как по варианту осуществления диапазон содержания или концентрации можно выбирать, включают диапазон от 6х108 приблизительно до 2х109, предпочтительно приблизительно до 1,2х109, белых клеток крови, охватывая все значения доз между ними. Другой пример состоит в выборе диапазона от 7х108 приблизительно до 2х109, предпочтительно приблизительно до 1,2 х109, белых клеток крови, охватывая все значения доз между ними. Другой пример состоит в выборе диапазона от 8х108 приблизительно до 2х109, предпочтительно приблизительно до 1,2 х109, белых клеток крови, охватывая все значения доз между ними. Другой пример состоит в выборе диапазона от 8,5*108 приблизительно до 2х109, предпочтительно приблизительно до 1,2х109, белых клеток крови, охватывая все значения доз между ними. Другой пример состоит в выборе диапазона от 9х108 приблизительно до 2х109, предпочтительно приблизительно до 1,2 х109, белых клеток крови, охватывая все значения доз между ними. Другой пример состоит в выборе диапазона от 9,5х108 приблизительно до 2х109, предпочтительно приблизительно до 1,2х109, белых клеток крови, охватывая все значения доз между ними. Таким образом, все диапазоны доз, которые можно выбирать из значений в настоящем описании и как поймут средние специалисты в данной области, находятся в объеме данного изобретения.
Способы измерения каждой из популяций клеток, указанных выше, ясно изложены в подробном описании изобретения. В частности, способы измерения каждого из лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов, тромбоцитов и RBC проводят с использованием общего и дифференциального числа клеток и автоматизированного гематологического счетчика клеток (ABX Pentra 60, Horiba Medical). Процентные доли клеток-предшественников, процентные доли экспрессирующих CXCR4 клеток и процентные доли экспрессирующих VEGFR2 клеток определяли с использованием проточного цитометра (MACS Quant Analyzer 10, Miltenyi Biotec).
Следует отметить, что такая клеточная суспензия может содержать фармацевтически приемлемые носители и/или эксципиенты.
В другом предпочтительном варианте осуществления клетки клеточной суспензии по изобретению суспендируют в объеме от 5 до 30 мл гепаринизированного солевого раствора или лактатного раствора Рингера, предпочтительно содержащего приблизительно 1% HSA и приблизительно 2,5% глюкозы.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей клеточную суспензия по изобретению, как определено выше, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель может содержать среду, которая поддерживает жизнеспособность и функциональность клеток. Такая среда может быть бессывороточной во избежание провокации иммунного ответа у реципиента. Носитель должен быть буферным и апирогенным.
Фармацевтически приемлемые носители и разбавители включают солевой раствор, водные буферные растворы и/или дисперсионные среды. Использование таких носителей и разбавителей хорошо известно в данной области. Раствор стерилен и имеет достаточно низкую вязкость для того, чтобы сделать возможным использование шприца для введения.
Примеры материалов и растворов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, также хорошо известны в данной области.
Следует отметить, что в предпочтительном варианте осуществления раствор конечного фармацевтического состава продукта клеточной суспензии, как проиллюстрировано в примерах в данном описании, состоит из гепаринизированного солевого раствора (см. табл. 4). Можно использовать лактатный раствор Рингера (2,7 мг/100 мл дигидрата хлорида кальция, 320 мг/100 мл лактата натрия, 40 мг/100 мл хлорида калия и 600 мг/100 мл хлорида натрия) с добавлением 2,5% глюкозы и 1% HSA также (см. табл. 2).
Среду конечного состава, как проиллюстрировано в примерах изобретения, получали свежей для каждой партии в день обработки, в BSC класса A, посредством добавления 10 мл глюкозы (2,5%) и 1 мл HSA (20%) в 9 мл лактатного раствора Рингера.
Буфер для составов*
| Компонент | Концентрация | Степень |
| Раствор Рингера | ЕР, USP для инфузии | |
| Глюкоза | 2,5% | ЕР USP для инфузии |
| Альбумин человека | 1% | ЕР USP для инфузии |
| Солевой раствор (0,9% NaCl) | ЕР USP для инфузии | |
| Гепарин | 20 Ед/мл | ЕР USP для инфузии |
Сокращения: EP = Европейская фармакопея;
USP = Фармакопея США * см. также таблицу
- 10 045001
Следовательно, особенно предпочтительные эксципиенты представляют собой лактатный раствор Рингера, предпочтительно с добавлением глюкозы и HSA.
В другом предпочтительном варианте осуществления клеточную суспензию по изобретению или фармацевтическую композицию по изобретению можно замораживать в среде для заморозки. Любая среда, которая сохраняет жизнеспособность клеток при температурах между -135 и -190°C, подходит в качестве среды для заморозки. Например, среда для заморозки может содержать от 2,5 до 10% DMSO. Более конкретно, среда для заморозки может содержать 5-10% DMSO.
Среда для заморозки может быть основана на среде для культивирования или среде для размножения, описанных в настоящем описании, которая дополнительно содержит сыворотку человека или любой другой белок или смесь белков, способных поддерживать целостность клеток после оттаивания клеток.
После оттаивания клетки по изобретению можно промывать для того, чтобы удалять DMSO или другие компоненты среды для заморозки переде введением или повторным суспендированием в растворе для введения. Раствор для введения представляет собой любой физиологический раствор, который можно инъецировать пациентам без токсичности. Раствор для введения может содержать 1-15% белка, такого как сывороточный альбумин человека.
Фармацевтические композиции по изобретению также можно использовать в любом из способов лечения или терапевтических использований, описанных в настоящем описании.
Как уже установлено, клеточная суспензия по настоящему изобретению ускоряет (ре)генерацию новых и существующих кровеносных сосудов и усовершенствует поток крови в существующих сосудах, как проиллюстрировано в примере 2. Таким образом, клеточная суспензия по изобретению, в частности, благоприятна при лечении заболевания периферических артерий нижних конечностей (PAD), предпочтительно CLI, более предпочтительно CLI с DM у пациентов, которые не имеют возможности реваскуляризации с использованием хирургического шунта или эндоваскулярных способов. Пример 2 осуществляли с использованием конкретного лекарственного продукта клеточной суспензии, подпадающего под определение клеточной суспензии по изобретению, как определено в первом аспекте изобретения. Такой лекарственный продукт клеточной суспензии получали из лекарственного вещества BM-MNC, сформулированного в 10-30 мл гепаринизированного солевого раствора. Такой лекарственный продукт клеточной суспензии использовали в различных дозах, предпочтительные дозы составляли приблизительно от 5x108 приблизительно до 1x109. Конечный контейнер, который использовали, представлял собой 1-3 шприцов для введения. Данные об этом продукте клеточной суспензии собирали во II фазе (исследование CMMo/ICPD/2008) для 32 рассматриваемых партий. Далее в табл. 2 сведены данные от автоматизированного счетчика клеток для каждого индивидуального субъекта, включая WBC и дифференциальные (лимфоциты, моноциты) подсчеты. Связанные с продуктом примеси также перечислены для каждого субъекта, включая концентрацию RBC и тромбоцитов, а также процентную долю гранулоцитов.
Фенотипический анализ тех же продуктов также представлен в табл. 3, включая анализ следующих типов клеток:
| CD34 + | Гематопоэтические стволовые клетки |
| CD34+CD38- | Ранние не коммитированные HSC |
| CD133+ | Эндотелиальная содержащая предшественников популяция клеток |
| CD90 + | Ранние гематопоэтические стволовые клетки |
| CXCR4+ | Клетки, экспрессирующие рецептор SDF-1 |
| VEGFR2+ | Клетки, экспрессирующие рецептор фактора роста эндотелия сосудов 2-го типа |
| CD31+CD146+CD133- | Зрелые клетки эндотелия |
| CD34+VEGFR2+CD133+ | Поздние потомки эндотелиальных клеток- предшественников |
| CD34-CD105+CD90+CD73+ | MSC |
Данные, собранные для лекарственного вещества, представлены в табл. 2 и 3.
- 11 045001
Таблица 2. Автоматизированный подсчет клеток и дифференциал для лекарственного вещества CMMo/ICPD/2008. Представлены данные для средней дозы (5x108 WBC или лейкоцитов) _______________и высокой дозы . (1,0x109 WBC или лейкоцитов) _____
| Партия пациентов | LEU (х103) | RBC (х106) | PLA (х103) | LYMPH (%) | MONO (%) | CD34 + (%) | MNC | NEU (%) | EOS (%) | BAS (%) | GRA (%) |
| Способ | АС С | АС С | АС С | ACC | ACC | PHE | MNC | ACC | ACC | ACC | SUM |
| F01 | 19,59 | 0,05 | 259 | 48,5 | 6, 4 | N/A | 45 | 33 | 0,1 | 3, 0 | 55, 0 |
| F03 | 19,43 | 0,11 | 603 | 42,5 | 12,2 | 1,44 | 45,2 | 33, 9 | 0,1 | 1,2 | 54,8 |
| F04 | 20,59 | 0,04 | 69 | 24,1 | 7,2 | 3,77 | 68,6 | 57,7 | 0,1 | 3, 1 | 31,4 |
| F05 | 16, 87 | 0,04 | 56 | 20, 1 | 6, 4 | 7,23 | 73,4 | 62 | 0,1 | 2,5 | 26, 6 |
| F07 | 8,96 | 0,06 | 242 | 42,2 | 12,6 | N/A | 44,8 | 31,2 | 0,4 | 3, 1 | 55,2 |
| F08 | 21,94 | 0,06 | 310 | 36,4 | 7,5 | 3, 69 | 56,1 | 42,6 | 0 | 2,7 | 43, 9 |
| F09 | 43,29 | 0,06 | 329 | 37,4 | 5, 4 | 4,34 | 57,2 | 47,2 | 0 | 4,1 | 42,8 |
| F10 | 8,75 | 0,04 | 277 | 45, 1 | 22,1 | 2,54 | 32,7 | 25,3 | 0,1 | 2,3 | 67,3 |
| F11 | 17,28 | 0,02 | 38 | 28,1 | 7, 0 | 10,05 | 64,8 | 54 | 0,1 | 4,9 | 35,2 |
| F14 | 30,74 | 0,07 | 232 | 47,4 | 10,5 | 4,20 | 42,1 | 27,3 | 0 | 7,1 | 57,9 |
| F15 | 23,12 | 0,06 | 280 | 47,1 | 11, 1 | 6,50 | 41,7 | 30,4 | 0,1 | 4,2 | 58,3 |
| F16 | 14,39 | 0,04 | 153 | 26, 6 | 11 | 4,75 | 62,3 | 51,2 | 0,1 | 4,6 | 37,7 |
| F17 | 25,31 | 0,06 | 235 | 36,2 | 6, 7 | 3, 68 | 57,1 | 49 | 0 | 2,3 | 42,9 |
| F18 | 22,89 | 0,07 | 191 | 30,2 | 8,2 | 3, 00 | 61,6 | 48,9 | 0 | 3,3 | 38,4 |
| F2 0 | 16,46 | 0,06 | 229 | 51, 1 | 11,2 | N/A | 37,7 | 21, 8 | 0 | 4,1 | 62,3 |
| F21 | 31,55 | 0,05 | 153 | 48,2 | 9,4 | 2,20 | 42,2 | 32,5 | 0,2 | 2,9 | 57,8 |
| F22 | 10,46 | 0, 05 | 157 | 42,0 | 17,4 | 1,67 | 40,5 | 31,1 | o, 1 | 3,4 | 59,5 |
| F23 | 18,36 | 0, 03 | 144 | 40,2 | 6,2 | 3,30 | 53,5 | 42,9 | o, 1 | 2,9 | 46,5 |
| F25 | 27,86 | 0, 06 | 239 | 36,5 | 6, 0 | 3,30 | 57,5 | 51,7 | 0 | 6,4 | 42,5 |
| F2 6 | 25, 83 | 0, 08 | 337 | 43, 0 | 14,3 | 4,28 | 42,7 | 28,4 | 0 | 2,8 | 57,3 |
| F27 | 23, 8 | 0, 06 | 538 | 38,1 | 7, 0 | 2,06 | 54,9 | 39,9 | 0 | 3,2 | 45, 1 |
| F2 8 | 19,56 | 0, 04 | 93 | 46,4 | 5, 9 | 3,67 | 47,7 | 33,5 | 0 | 2,2 | 52,3 |
| F30 | 20,74 | 0, 09 | 246 | 45,4 | 7,7 | 2,19 | 46, 9 | 31,7 | 0 | 4,1 | 53, 1 |
| F31 | 15, 67 | 0, 06 | 230 | 41, 6 | 14,6 | 4,68 | 43,7 | 32,2 | o, 1 | 4,8 | 56,3 |
| F32 | 26, 34 | 0, 15 | 489 | 50, 6 | 16, 9 | 5,40 | 32,3 | 17,5 | 0,2 | 4,5 | 67,7 |
| F33 | 35,3 | 0, 1 | 370 | 40,7 | 3, 9 | 3,59 | 55,4 | 44,7 | 0 | 4,7 | 44,6 |
| F34 | 56, 97 | 0, 11 | 398 | 26, 5 | 5, 7 | 2,73 | 67,8 | 56,1 | 0 | 5, 1 | 32,2 |
| F35 | 28,94 | 0, 05 | 107 | 25, 6 | 6,4 | 9,24 | 67,8 | 60,5 | 0,2 | 3,2 | 32,2 |
| F37 | 19,71 | 0, 04 | 201 | 26,7 | 10,7 | 3,92 | 62,5 | 51,2 | o, 1 | 3, 6 | 37,5 |
| F38 | 29,41 | 0, 07 | 504 | 30, 0 | 20, 8 | 4,12 | 49, 1 | 39,5 | o, 1 | 2,7 | 50, 9 |
| F39 | 26, 03 | 0, 03 | 174 | 31,7 | 22,3 | 4,44 | 45, 9 | 40,6 | o, 1 | 3, 6 | 54,1 |
| F40 | 24,72 | 0, 07 | 304 | N/M | 19, 9 | 3,18 | 80 | 48,9 | o, 1 | 2,7 | 20, 0 |
| Мин. | 8,75 | 0, 02 | 38 | 20, 1 | 3, 9 | 1,44 | 32,3 | 17,5 | 0 | 1,2 | 20, 0 |
| Макс. | 56, 97 | 0, 15 | 603 | 51, 1 | 22,3 | 10, 05 | 80, 0 | 62,0 | 0,4 | 7,1 | 67,7 |
Используемые способы: ACC = композицию лекарственного вещества оценивали с использованием автоматизированного счетчика клеток (ABX Pentra 60); PHE = фенотипический анализ лекарственного вещества (MACS Quant Analyzer 10, Miltenyi Biotec); MNC = вычисляли как долю белых клеток крови не гранулоцитов; SUM = вычисляли по числу составляющих клеток.
Сокращения: LEU = лейкоциты; RBC = красные клетки крови; PLT = тромбоциты; LYMPH = лимфоциты; MONO = моноциты; CD34+ = клетки, экспрессирующие CD34; MNC = мононуклеарные клетки; NEU = нейтрофилы; BAS = базофилы; EOS = эозинофилы; GRA = гранулоциты; N/A = не доступно; N/M = не имеет значения.
Таблица 3. Фенотипический анализ лекарственного вещества CMMo/ICPD/2008. В фазе II (исследование CMMo/ICPD/2008) данные собраны для 32 субъектов
| Партия пациентов | CD34+ (%) | CD34+/CD38(%) | CXCR4+ (%) | CD34+/CXCR4 (%) | VEGFR2+ (%) |
| Способ | PHE | PHE | PHE | PHE | PHE |
| F01 | N/A | ||||
| F03 | 1, 44 | 18,05 | 15,10 | 0,69 | 24,73 |
| F04 | 3,77 | 26,25 | 5,38 | 1,06 | 2,23 |
| F05 | 7,23 | 7,74 | 18,63 | 1,10 | 0,30 |
| F07 | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A |
| F08 | 3, 69 | 14,9 | 22,59 | 9,48 | 0,25 |
| F09 | 4,34 | 22,11 | 31,93 | 9,44 | 0,19 |
- 12 045001
| F10 | 2,54 | 20,47 | 32,00 | 2,75 | 0,25 |
| F11 | 10,05 | 25,77 | 31,56 | 4,87 | 0,40 |
| F14 | 4,20 | 18,33 | 20,27 | 6, 66 | 0,30 |
| F15 | 6,50 | 41,84 | 21,93 | 0,92 | 0,53 |
| F16 | 4,75 | 22,1 | 38,79 | 4,00 | 0,28 |
| F17 | 3, 68 | 28,53 | 25,62 | 5,43 | 0,76 |
| F18 | 3, 00 | 34 | 21,10 | 3,33 | 0,07 |
| F2 0 | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A |
| F21 | 2,20 | 55,45 | 11,20 | 6,81 | 0,13 |
| F22 | 1, 67 | 19,16 | 16, 00 | 3,59 | 0,64 |
| F23 | 3,30 | 10, 00 | 27,10 | 10,3 | 0,47 |
| F2 5 | 3, 30 | 18,48 | 20,05 | 3,33 | 0,36 |
| F2 6 | 4,28 | 21,26 | 26, 66 | 5,84 | 0,65 |
| F2 7 | 2,06 | 17,47 | 23,79 | 1,45 | 0,21 |
| F2 8 | 3, 67 | 18,52 | 14,55 | 5,17 | 0,56 |
| F30 | 2,19 | 23,74 | 29,44 | 10,04 | 0,33 |
| F31 | 4,68 | 42,73 | 32,06 | 9,61 | 0,66 |
| F32 | 5,40 | 24,07 | 22,88 | 5,37 | 0,45 |
| F33 | 3, 59 | 11,14 | 15,62 | 1,94 | 0,37 |
| F34 | 2,73 | 34,43 | 7,69 | 1,83 | 0,46 |
| F35 | 9,24 | 20,23 | 21,53 | 2,59 | 1,07 |
| F37 | 3, 92 | 33,92 | 35,21 | 4,84 | 0,65 |
| F38 | 4,12 | 35,92 | 30,42 | 2,66 | 1,78 |
| F39 | 4,44 | 18,01 | 27,51 | 1,80 | 0,99 |
| F4 0 | 3, 18 | 30,50 | 15,88 | 2,83 | 1,37 |
| Мин. | 1,44 | 7,74 | 5,38 | 0,69 | 0,07 |
| Макс. | 10,05 | 55,45 | 38,8 | 10,3 | 24,7 |
Используемые способы: РНЕ = фенотипический анализ лекарственного вещества (MACS Quant Analyzer 10, Miltenyi Biotec);
Сокращения: CD34+ = гематопоэтические стволовые клетки, экспрессирующие CD34; CD34+/CD38- = доля гематопоэтических стволовых клеток, экспрессирующих CD34, которые не экспрессируют CD38; CD45+/CXCR4+ = доля лейкоцитов, которые экспрессируют CD45 и также экспрессируют CXCR4; CD34+/CXCR4 = доля гематопоэтических стволовых клеток экспрессирующих CD34, которые также экспрессируют CXCR4; CD45+/VEGF+ = доля белых клеток крови, экспрессирующих; N/A = не доступно. Все клетки также экспрессируют CD45.
На основе результатов, собранных в фазе II (исследование CMMo/ICPD/2008) для 32 рассматриваемых партий, проиллюстрированных выше в табл. 2 и 3, авторы изобретения обеспечили определение характеристик продукта клеточной суспензии по настоящему изобретению.
Следует отметить, что настоящее изобретение, кроме того, охватывает 1-3 (предварительно заполненных) шприцов, содержащих клеточную суспензию по изобретению.
Кроме того, при желании, клетки клеточной суспензии по изобретению по изобретению можно модифицировать генетически любым стандартным способом, включая, в качестве иллюстрации, но неограничивающей, процессы переноса трансгенов, делеции или инсерции в их геном и т.д.
Процесс изготовления продукта клеточной суспензии
Продукт клеточной суспензии по изобретению можно изготавливать многими путями, однако предпочтительно его изготавливают, как подробно изложено в примере 1, чтобы клеточную суспензию по изобретению можно было считать минимально подверженным манипуляциям продуктом BM-MNC (мононуклеарные клетки костного мозга), поскольку процесс изготовления состоит только из стадий разделения на основе плотности, размеров частиц и гравитации, которые предназначены для того, чтобы обогащать фракцию MNC в аспирате ВМ посредством удаления плазмы, тромбоцитов, RBC и гранулоцитов.
Процесс изготовления, как описано в примере 1, в кратком изложении сводится к следующему:
Стадия 0. Взятие костного мозга (ВМ) осуществляют посредством повторных аспираций, предпочтительно из заднего подвздошного гребня субъекта под местной анестезией. Затем аспираты ВМ собирают, предпочтительно в мешок для переноса, содержащий антикоагулянтный раствор А цитрата декстрозы (ACD-A).
Стадия 1: фильтрование - ВМ фильтруют, предпочтительно под действием гравитации, чтобы удалять любые мелкие костные фрагменты и чтобы предотвращать засорение в ходе последующих стадий.
Стадия 2: уменьшение объема SmartRedux - начальный объем ВМ уменьшают приблизительно до 50-100 мл, предпочтительно с использованием программы SmartRedux на устройстве Sepax 2.0 и ассо
-13045001 циированного стерильного одноразового набора SmartRedux (CS-490.1), придерживаясь инструкций производителя. Эта стадия, включающая удаление плазмы и красных клеток крови (RBC), которая ведет приблизительно к 50-100 мл продукта лейкотромбоцитарного слоя, также вносит вклад в чистоту конечного продукта.
Стадию уменьшения объема осуществляют один или два раза в зависимости от объема исходного материала, подлежащего обработке. Образцы ВМ объемов вплоть до 220 мл обрабатывают за один цикл и образцы больше 220 мл обрабатывают за два цикла с использованием того же набора.
Для уменьшения объема как за один, так и за два цикла, конечный объем устанавливают приблизительно равным 50-100 мл.
Стадии 3-4: градиент плотности NeatCell - стерильный промежуточный мешок для образца, содержащий ВМ уменьшенного объема, проходит через центрифугирование в градиенте плотности, после чего следуют два промывания суспензии мононуклеарных клеток (MNC) с использованием раствора для промывания, предпочтительно состоящего из 2-4% HSA в солевом растворе (и то и другое фармацевтической степени чистоты). Приблизительно 45 мл продукта BM-MNC собирают в выходной мешок и другие компоненты удаляют в мешок для отходов.
Стадия 5: фильтрование BM-MNC -BM-MNC собирают из мешка для продукта с использованием 50 мл шприца и фильтруют через 50 мкм фильтр в стерильную пробирку Falcon. Мешок для продукта споласкивают раствором для промывания и фильтруют для того, чтобы усовершенствовать извлечение MNC. Конечный объем лекарственного вещества BM-MNC корректируют до 40-60 мл.
Конечная стадия (стадия 6) состоит в получении конечного продукта клеточной суспензии по изобретению. Такой конечный продукт дозируют на основе жизнеспособных белых клеток крови, включая не только фракцию MNC, но также гранулоциты. Поскольку MNC представляют собой активный компонент, процентная доля MNC в конечном продукте считают признаком качества. В этом смысле, имеют место некоторые параметры процесса, которые могут влиять на признаки качества конечного продукта. В связи с этим, стадии, способные влиять на процентную долю MNC в конечном продукте, которые считают важными для изготовления продукта, представлены в табл. 5.
Таблица 5. Стадии и параметры, ассоциированные с процессом изготовления
| Стадия | Параметр | Критичность |
| Фильтрование | Размер | Присутствие костных фрагментов может влиять на эффективность очистки и может мешать процедуре введения |
| SmartRedux | Центрифугирование: скорость и длительность | Эта стадия разделения на основе гравитации вносит вклад непосредственно в чистоту конечного продукта. Следовательно, настройки параметров, необходимые для выполнения разделения, являются критическими. |
| NeatCell | Плотность Ficoll, объем Ficoll | Определяет популяции клеток, которые будут очищены. Используемая плотность составляет 1,077 г/мл, вызывает извлечение MNC |
| Скорость и длительность центрифугирования в Ficoll | Вызывает извлечение MNC | |
| Скорость и длительность промывания центрифугированием | Вызывает извлечение MNC |
Сокращения: MNC = мононуклеарные клетки
Стадия SmartRedux - эта стадия предназначена для того, чтобы снижать начальный объем ВМ до объема, который достаточно мал для обработки в процедуре Neatcell (NeatCell имеет максимальный входной объем 120 мл). Кроме того, стадия SmartRedux включает фракционирование на RBC, плазму и
- 14 045001 продукт лейкотромбоцитарного слоя, что вносит вклад в чистоту продукта NeatCell.
Важными параметрами, связанными с этой стадией, являются скорость и длительность центрифугирования, поскольку эти параметры будут непосредственно влиять на извлечение MNC из аспирата ВМ.
Стадия NeatCell - используемый автоматизированный способ обогащения MNC разработан и стандартизован производителем, и предназначен для обогащения аспирата ВМ по MNC и, следовательно, является важным. Hct исходного материала для NeatCell является важным свойством материала, поскольку он влияет на эффективность очистки MNC. Важные параметры процесса зафиксированы в программе NeatCell, включая скорость и длительность центрифугирования, а также плотность и объем Ficoll.
Полагают, что в компартменте MNC несколько популяций клеток играют важные роли в механизме действия конечного продукта. Таким образом, присутствие и функциональность этих клеток считают признаками качества (CQA).
Фракция MNC, полученная после центрифугирования в градиенте плотности Ficoll, содержит те клетки, которые имеют более низкую плотность, чем Ficoll, и, следовательно, не достаточно плотные для того, чтобы проникать в слой Ficoll в течение центрифугирования. Следовательно, плотность Ficoll, используемого в процессе, непосредственно влияет на композицию популяции MNC и, следовательно, считается важным параметром процесса. Используемая плотность составляет 1,077 г/мл.
Изготовление является непрерывным процессом и не включает какие-либо стадии активации или другие экстенсивные манипуляции с клетками, которые могут влиять на функциональность конкретных популяций клеток в фракции MNC. Длительность процесса может влиять на функциональность клеток и, следовательно, время задержки не включено в процесс, а весь процесс предпочтительно завершают в пределах 4-5 ч в условиях чистой комнаты. На функциональность также может влиять состояние заболевания субъекта и общая физиологическая вариабельность субъекта.
На основе вышеуказанного, дополнительный аспект изобретения относится к процессу изготовления клеточной суспензии по изобретению, который включает:
1. Взятие костного мозга (ВМ) осуществляют посредством повторных аспираций, предпочтительно из заднего подвздошного гребня субъект**а под местной или общей анестезией. Затем аспираты ВМ собирают, предпочтительно в мешок для переноса, содержащий антикоагулянтный раствор, более предпочтительно раствор A цитрата декстрозы (ACD-A).
2. ВМ фильтруют, предпочтительно под действием гравитации, чтобы удалять любые мелкие костные фрагменты и чтобы предотвращать засорение в ходе последующих стадий.
3. Начальный объем ВМ уменьшают, предпочтительно приблизительно до 50-100 мл, предпочтительно с использованием программы SmartRedux на устройстве Sepax 2.0 и ассоциированного стерильного одноразового набора SmartRedux (CS-490.1). Эта стадия, включающая удаление плазмы и красных клеток крови (RBC), предпочтительно ведущее к приблизительно 50-100 мл продукта лейкотромбоцитарного слоя, также вносит вклад в чистоту конечного продукта.
4. Необязательно, стадию уменьшения объема осуществляют за один или два цикла в зависимости от объема исходного материала, подлежащего обработке. Образцы ВМ объемом вплоть до 220 мл обрабатывают за один цикл и образцы больше 220 мл обрабатывают за два цикла с использованием того же набора. Предпочтительно, для уменьшения объема как за один цикл, так и за два цикла, конечный объем устанавливают приблизительно равным 50-100 мл.
5. Стерильный промежуточный мешок для образца, содержащий ВМ уменьшенного объема, как установлено на стадиях 3 или 4, проходит через центрифугирование в градиенте плотности, после чего следуют два промывания суспензии мононуклеарных клеток (MNC) с использованием раствора для промывания, предпочтительно состоящего из 2-4% HSA в солевом растворе (и то и другое фармацевтической степени чистоты). Приблизительно 45 мл продукта BM-MNC собирают в выходной мешок, а другие компоненты удаляют в мешок для отходов. Более предпочтительно, стерильный промежуточный мешок для образца, содержащий ВМ уменьшенного объема, проходит через центрифугирование в градиенте плотности NeatCell, после чего следуют два промывания суспензии мононуклеарных клеток (MNC) с использованием раствора для промывания, предпочтительно состоящего из 2-4% HSA в солевом растворе (и то и другое фармацевтической степени чистоты). Приблизительно 45 мл продукта BM-MNC собирают в выходной мешок, а другие компоненты удаляют в мешок для отходов.
6. BM-MNC собирают из мешка для продукта, предпочтительно с использованием 50 мл шприца, и фильтруют, предпочтительно через 50 мкм фильтр, в стерильную пробирку Falcon. Мешок для продукта споласкивают раствором для промывания и фильтруют для того, чтобы усовершенствовать извлечение MNC. Конечный объем лекарственного вещества BM-MNC корректируют до 40-60 мл.
Также важно отметить, что изготовление клеточной суспензии по изобретению предпочтительно представляет собой непрерывный процесс, включающий обогащение мононуклеарных клеток, где процесс не включает возможность повторной обработки.
После получения лекарственного вещества, центрифугирование MNC предпочтительно осуществляют при 760xg в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки ресуспендируют в конечном составе (предпочтительно гепаринизированном солевом растворе или лактатном растворе Рингера с добавлением 2,5% глюкозы и 1% HSA и переносят в стерильный апирогенный пластмассовый шприц(ы) в сте
- 15 045001 рильных условиях).
2-3 мл конечного продукта можно необязательно переносить во флакон для тестирования контроля качества (QC) и предпочтительно от 8 до 12 мл переносят в каждый стерильный апирогенный пластмассовый шприц в стерильных условиях. У шприца закрывают конус, чтобы предотвращать контаминацию, затем упаковывают в стерильный одноразовый пластмассовый мешок с застежкой-молнией и транспортировочную коробку для транспортировки в участвующее отделение интервенционной радиологии для введения субъекту.
Обзор процесса изготовления приведен на чертеже.
Применимость продукта клеточной суспензии
Результаты, ясно проиллюстрированные в примере 2, показывали, что в пределах первых 12 месяцев после введения клеточной суспензии по изобретению, субъекты достигали клинически релевантного ответа, как продемонстрировано снижением их классификации до категории 1-3 по Rutherford (степень 1) (29 (64%) субъектов), которое благоприятно сравнивать с контрольной группой, в которой отвечали только 2 (13%) субъекта.
При визите базового уровня, 25 (56%) субъектов в группе лечения, которые получали инфузию клеточной суспензии по изобретению, обладали незаживающими ишемическими язвами, но к визиту последующего наблюдения через 12 месяцев после введения, 18 (75%) субъектов более не имели язв (одна большая ампутация), причем 24 (60%) субъектов демонстрировали увеличение TcPO2 > 40 мм рт.ст., что является надежным предсказанием заживления. Васкулогенез оценивали через 6 месяцев после введения клеточной суспензии по изобретению. У субъектов, которых лечили клеточной суспензией по изобретению, васкулогенез имел место у 26 (62%) субъектов: 7, 8 и 9 субъектов в наименьшей, средней, наибольшей группах, соответственно.
Ни один субъект не испытывал Suspected Unexpected Serious Adverse Reaction (SUSAR) в течение лечения или в течение наблюдения. Три AE считали связанными с путем введения, и они представляли собой небольшие реакции в месте инъекции. Ни один субъект не прерывал исследование преждевременно в результате AE и ни один субъект не испытывал AE, связанные с клеточной суспензией по изобретению. SAE не возникали перед введением Rexmyelocel-T и SAE не возникали в течение первых 24 ч после введения Rexmyelocel-T. Всего 41 SAE регистрировали у 23 субъектов в течение периода наблюдения (12 месяцев), 17 SAE (9 субъектов) в контрольной группе и 24 SAE (14 субъектов) в группах лечения Rexmyelocel-T: более низкая доза 1х108 BM-MNC: четыре субъекта; средняя доза 5х108 BM-MNC: четыре субъекта; наибольшая доза 1х109 BM-MNC: 6 субъектов. Два субъекта погибли в результате сердечнососудистого заболевания.
Следовательно, таким образом, ясно, что клеточная суспензия по изобретению, в частности, благоприятна при лечении заболевания периферических артерий нижних конечностей (PAD), предпочтительно CLI, более предпочтительно CLI с DM у пациентов, которые не имеют возможности реваскуляризации с использованием хирургического шунта или эндоваскулярных способов.
Таким образом, дополнительный аспект изобретения относится к клеточной суспензии, предварительно заполненному шприцу или фармацевтической композиции, как определено в разделе с названием Продукт клеточной суспензии, представляет собой использование при лечении или улучшении заболевания периферических артерий нижних конечностей, предпочтительно у человеческого субъекта.
Предпочтительно заболевание периферических артерий нижних конечностей представляет собой критическую ишемию конечностей.
Более предпочтительно, клеточная суспензия, предварительно заполненный шприц или фармацевтическая композиция, как определено в разделе с названием Продукт клеточной суспензии, представляет собой использование в способе лечения заболевания периферических артерий нижних конечностей, предпочтительно критической ишемии конечностей, через внутриартериальное введение, где поток крови низкого давления вплоть до 4 атм получают посредством расположения надуваемого баллона проксимально к окклюзионному повреждению сосудов в дистальной бедренной или подколенной артерии, и инфузию указанной клеточной суспензии внутриартериально.
Примеры
Пример 1. Материалы и способы
1. Клеточная суспензия и способ ее получения.
Для того чтобы иллюстрировать настоящее изобретение, в следующих примерах использовали клеточную суспензию в соответствии с настоящим изобретением, полученную из аутологичной клеточной суспензии BM-MNC, состоящей из нескольких зрелых типов клеток, а также гематопоэтических клетокпредшественников. Состав конечного продукта основан на числе присутствующих жизнеспособных WBC.
Определение характеристик клеточной суспензии по изобретению проводили с использованием общего и дифференциального числа клеток с использованием автоматизированного гематологического счетчика клеток (ABX Pentra 60, Horiba Medical). Процентные доли клеток-предшественников и WBC (CD45+ клетки), экспрессирующих рецептор CXCR4 фактора миграции SDF-1, или WBC, экспресси
- 16 045001 рующих рецептор фактора ангиогенеза VEGF 2-го типа, определяли с использованием проточного цитометра (MACS Quant Analyzer 10, Miltenyi Biotec).
Концентрация белых клеток крови (WBC), доля лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов и клетокпредшественников, а также общие WBC, экспрессирующие CXCR4 или VEGFR2, из 32 клинических партий представлены в табл. 6.
Таблица 6. Клеточная композиция из 32 клинических партий из CMMo/ICPD/2008
| Тип клеток | Прием/ поверхностный клеточный маркер | Число клеток/доля |
| Лейкоциты (белые клетки крови) | АС С | 1хЮ8-1хЮ9 |
| Красные клетки крови/белые клетки крови | Соотношение | 1,15-6, 7х |
| Тромбоциты/белые клетки крови | Соотношение | 2,2-31,7х |
| Нейтрофилы | АС С | 2,5χ107-5, 6χ108 |
| Лимфоциты | АС С | 2,4χ107-5, 1х108 |
| Моноциты | АС С | 6, 4χ106-2, ОхЮ8 |
| Эозинофилы | АС С | 0-7,1х107 |
| Базофилы | АС С | 1,2χ106-7, 1х107 |
| Гранулоциты | АС С | 2,8х107-6, 1х108 |
| Мононуклеарные клетки | WBC - гранулоциты | 3, 6х107-7 , 8х108 |
| Гематопоэтические стволовые клетки | Проточная цитометрия CD34+ | 1,4χ106-5, 4χ107 |
| Клетки, экспрессирующие CXCR4, который представляет собой рецептор для маркера миграции SDF-1 | Проточная цитометрия CXCR4+ | 5, 4х 106-3,2х 108 |
| Стволовые клетки, экспрессирующие CXCR4, который представляет собой рецептор для маркера миграции SDF-1 | Проточная цитометрия CD34+/CXCR4+ | 1,0χ104-4, 1х106 |
| Клетки, экспрессирующие рецептор VEGFR2 для фактора ангиогенеза VEGF | Проточная цитометрия VEGFR2 | 7,0χ104-2,5χ107 |
Сокращения: ACC = автоматизированный счетчик клеток, WBC = белые клетки крови.
Данные представлены от минимума до максимума.
Клеточную суспензию по изобретению изготавливали согласно требованиям GMP. Все стадии процесса осуществляли в чистой комнате класса В, где полузакрытые манипуляции (прокалываемое соединение и люэровские блокирующие соединения) и открытые манипуляции осуществляли в BSC класса A.
Вкратце костный мозг фильтровали асептически для того, чтобы удалять костные фрагменты, после чего следовала автоматизированная стадия уменьшения объема для получения объема, который достаточно мал для дальнейшей обработки.
Затем клетки подвергали автоматизированному центрифугированию в градиенте плотности Ficoll, включающему стадии промывания. Продукт фильтровали, что давало 50 мл фракции BM-MNC, которая представляет собой лекарственное вещество.
Весь процесс изготовления лекарственного вещества был закрытым, за исключением прокалываемых и люэровских блокирующих соединений. Стадии разделения клеток осуществляли в автоматизированной системе для того, чтобы обеспечивать стандартизацию процесса.
Блок-схема процесса изготовления клеточной суспензии по изобретению представлена на фиг. 1. Кроме того, процесс изготовления подробно описан далее:
Стадия 0: взятие костного мозга (ВМ) осуществляли посредством повторных аспирации из заднего подвздошного гребня субъекта под местной анестезией, используя 5 мл шприцы, соединенные с аспира
- 17 045001 тором для ВМ. Аспираты ВМ собирали в 600 мл мешок для переноса, содержащий антикоагулянтный раствор A цитрата декстрозы (A ACD-A), пока не достигали объема приблизительно 250-350 мл. Мешок для переноса, содержащий свежий ВМ, упаковывают в соответствии с инструкциями и подготавливают к отгрузке. ВМ отгружают при комнатной температуре (15-21°C) в Rexgenero за одну погрузку для незамедлительной обработки
Стадия 1: фильтрование - ВМ фильтровали под действием гравитации через 200 мкм встроенный фильтр для того, чтобы удалять любые мелкие костные фрагменты и предотвращать засорение в ходе последующих стадий. После фильтрования образец собирали для тестов в процессе изготовления и взвешивали мешок для сбора, с переводом массы в объем, что дает входной объем в настройках для обработки клеток.
Стадия 2: уменьшение объема SmartRedux - начальный объем ВМ приблизительно 300 мл уменьшали до 50 мл с использованием программы SmartRedux на устройстве Sepax 2.0 и ассоциированного стерильного одноразового набора SmartRedux (CS-490.1), придерживаясь инструкций производителя. Эта стадия, включающая удаление плазмы и красных клеток крови (RBC), ведущее к 50 мл продукта лейкотромбоцитарного слоя, также вносит вклад в чистоту конечного продукта. Стадию уменьшения объема осуществляли один или два раза в зависимости от объема исходного материала, подлежащего обработке. Образцы ВМ объемом вплоть до 220 мл обрабатывали за один цикл, а образцы больше чем 220 мл обрабатывали за два цикла с использованием того же набора. Для уменьшения объема как за один цикл, так и за два цикла, конечный объем устанавливали равным 50 мл.
Стадии 3-4: градиент плотности NeatCell - стерильный мешок для промежуточного образца, содержащий ВМ уменьшенного объема, соединяли с набором Neatcell (CS-900.2) и обрабатывали с использованием программы NeatCell на устройстве Sepax 2.0, придерживаясь инструкций производителя. Эта стадия состояла из центрифугирования в градиенте плотности Ficoll 1077, после чего следовало два промывания суспензии мононуклеарных клеток (MNC) с использованием раствора для промывания, состоящего из 2,5% или 4% HSA в солевом растворе (и то и другое фармацевтической степени чистоты). Приблизительно 45 мл продукта BM-MNC собирали в выходной мешок, а другие компоненты удаляли в мешок для отходов.
Стадии 5: фильтрование BM-MNC - BM-MNC собирали из мешка для продукта с использованием 50 мл шприца и фильтровали через 50 мкм фильтр в стерильную пробирку Falcon. Мешок для продукта споласкивали раствором для промывания и фильтровали для того, чтобы усовершенствовать извлечение MNC. Конечный объем лекарственного вещества BM-MNC корректировали до 50 мл.
2. Отбор популяции исследования
Всего 60 субъектов с CLI II степени (категория 4) или III степени (категория 5) по Rutherford и DM, которые не могли проходить хирургическую или эндоваскулярную реваскуляризацию (50 мужчин (83%) и 10 женщин (17%)) с усредненным возрастом 64,3 (±9,5) (диапазон: 46-80 лет) вводили и случайным образом распределяли в соотношении 1:1:1:1 для того, чтобы принимать одно введение клеточной суспензии по изобретению (с одним из трех уровней доз; 1х108, 5х108 или 1x109 BM-MNC; 15 субъектов на группу лечения) в дополнение к стандарту лечения или для лечения в соответствии со стандартом лечения отдельно (15 субъектов). Клеточную суспензию по изобретению вводили внутриартериально одной инфузией. Для этого исследования применяли стратифицированную рандомизацию и страты конструировали для CLI II и III степени по Rutherford (категории 4 и 5) без возможности эндоваскулярной или хирургической реваскуляризации в соответствии с Transatlantic Inter-Society Consensus Document on Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II). В том случае, если CLI присутствовала в обеих ногах, инфузию вводили в ногу, определяемую исследователем, чтобы иметь более запущенное/тяжелое заболевание при условии, что на ногах ранее не проводили хирургическую ампутацию пальцев или выше. Испытуемых субъектов оценивали при визите базового уровня (визит 1), через 24 ч и 1, 3, 6, 9, 12 месяцев после введения Rexmyelocel-T (визиты 3, 4, 5, 6, 7 и 8, соответственно). Субъекты, которых распределяли в контрольную группу, не должны были присутствовать на визитах 2 и 3.
3. Критерии включения
Субъекты подходили для включения в исследование, если они отвечали всем из следующих критериев включения:
1. Субъекты обоих полов в возрасте > 18 и < 80 лет.
2. Субъекты, получающие лечение для DM I или II типа.
3. CLI II и III степени (категория 4 и 5) по Rutherford.
4. Неспособность к хирургической или эндоваскулярной реваскуляризации согласно рекомендациям TASC II.
5. Ожидаемая продолжительность жизни больше двух лет.
6. Больше не ожидают ампутацию в конечности, подлежащей лечению в следующие 12 месяцев после включения.
7. Нормальные биохимические параметры, определяемые по следующему: лейкоциты > 3000/мл, нейтрофилы > 1500/мл, тромбоциты > 100000/мм3, AST/ALT < 2,5 х стандартный диапазон, креатинин <
- 18 045001
2,5 мг/дл
8. Субъекты предоставляли письменное информированное согласие на участие в исследовании.
9. Женщины с репродуктивным потенциалом должны иметь отрицательные результаты теста на беременность, придерживаясь стандартных процедур каждой больницы, выполняемых в момент включения в исследование, и придерживаться использования одобренного медициной контроля рождаемости в течение исследования.
4. Критерии исключения
Субъектов исключали из участия в исследовании, если они отвечали любому из следующих критериев исключения:
1. В анамнезе неоплазия или гематологическое заболевание (миелопролиферативное заболевание, лейкоз или миелодиспластический синдром).
2. Субъекты неконтролируемой гипертензии (определяемой как кровяное давление > 180 мм рт. ст./110 мм рт. ст. больше чем в одном эпизоде).
3. Тяжелая сердечная недостаточность (IV стадия по New York Heart Association).
4. Субъекты со злокачественными желудочковыми аритмиями или нестабильной стенокардией.
5. Диагноз тромбоза глубоких вен за три месяца до скрининга.
6. Активная инфекция или гангрена, имеющая место в те же сутки, когда планируют введение Rexmyelocel-T.
7. Сопутствующая терапия, включающая гипербарическую кислородную терапию, вазоактивные вещества, ингибиторы Cox-II.
8. BMI > 40 кг/м2.
9. Субъекты с диагнозом алкоголизма в момент включения.
10. Пролиферативная ретинопатия.
11. Сопутствующее заболевание, которое уменьшает ожидаемую продолжительность жизни до меньше чем одного года.
12. ВИЧ-инфекция, гепатит B или гепатит C.
13. Субъекты, которые не желают или не способны соответствовать всем аспектам протокола.
14. Сердечная недостаточность или фракция выброса < 30%.
15. Инсульт или инфаркт миокарда за три месяца до скринингового визита.
16. Анемия (гемоглобин < 10 г/дл).
17. Лейкопения.
18. Тромбоцитопения (< 100000 тромбоцитов/мм3).
19. Беременные женщины или женщины в репродуктивном возрасте, которые не используют достаточную контрацепцию.
20. Субъекты, которые участвовали в клиническом исследовании в пределах трех месяцев до скрининга для этого исследования.
5. Удаление субъектов из исследования.
Субъектов можно удалять из исследования по любой из следующих причин:
Невозможность достигать оптимальной конечной концентрации клеточной суспензии на основе результата при рандомизации. В этом случае, PI следует принимать решение о том, будет ли введен продукт.
Присутствие серьезного нежелательного явления (SAE) между информированным согласием до планируемой даты введения.
Значительное отклонение от протокола. Обнаружение после рандомизации, что субъект не может соответствовать критериям включения в протокол или не придерживается требований протокола и продолжение исследования влечет неприемлемый риск для здоровья субъектов.
Субъект испытывал AE или явление перед лечением, которое требовало раннего завершения, поскольку продолжение участия влекло неприемлемый риск для здоровья субъекта или субъект не желал продолжать по причине AE или явления перед лечением.
Добровольное прекращение. Субъект (или законный представитель субъекта) желал прекратить участие в исследовании.
Утрата возможности наблюдения. Субъект не возвращался в клинику, а попытки связаться с субъектом не принесли успеха. Попытки связаться с субъектом задокументированы. Если субъект прекращал участие в исследовании, осуществляли все процедуры, запланированные для визита раннего завершения, если возможно.
В соответствии с надлежащей клинической практикой все субъекты, которые прекращали участие в исследовании, преждевременно получали рекомендации по альтернативному лечению. Если прекращение было обусловлено возникновением значимых AE (нежелательных эффектов), исследователь должен был осуществлять мониторинг субъекта до завершения, т.е. до разрешения AE или до тех пор, пока не определяли, что оно является постоянным явлением. Основную причину прекращения исследования регистрировали в CRF.
- 19 045001
6. Вводимое лечение
Исследуемый продукт
Под местной анестезией и успокоением объем ВМ (90-420 мл) собрали посредством последовательных аспираций из подвздошного гребня. ВМ собирали в мешок для переноса, содержащий раствор ACD-A в качестве антикоагулянта в соотношении 1:5 объем ВМ (см. п.1 выше)
Суспензию BM-MNC получали посредством центрифугирования в градиенте плотности, без модификации или добавления любого продукта, вероятно влияющего на ее биологическую функцию.
Клеточную суспензию по изобретению вводили в однократных дозах:
1х108 BM-MNC.
5х108 BM-MNC.
1x109 BM-MNC.
Клеточную суспензию по изобретению вводили с использованием внутриартериального катетера. Целевые артерии конечности канюлировали через доступ через бедренную артерию с использованием баллона на проволочном катетере (адаптированного к подколенному диаметру), который продвигали настолько дистально насколько возможно, но во всех случаях ниже колена, и располагали проксимально к окклюзионным повреждениям сосудов, обычно в дистальной бедренной или подколенной артерии. В этой точке баллон надували для того, чтобы блокировать поток крови, и медленно инфузировали клеточную суспензию по изобретению в течение минут (мин). После введения баллон сдували и восстанавливали антеградный поток крови.
Между тремя и пятью часами после взятия ВМ специалист по сосудам (интервенционный радиолог или сосудистый хирург) осуществлял введение клеточной суспензии по изобретению, доставляемой непосредственно из подразделения клеточной терапии.
Всех субъектов лечили по существующему стандарту лечения от тяжелого атеросклеротического заболевания сосудов ниже подколенной области, как описано в руководстве по лечению TASC II.
7. Изменение классификации по Rutherford
Критическая ишемия конечностей включает пациентов с болью в нижних конечностях в покое, ишемическими язвами или гангреной, вторичной по отношению к тяжелому нарушению потока крови в пораженной конечности, сохраняющемуся в течение больше чем двух недель. Классификацию субъектов по PAD проводили на всем протяжении исследования с помощью специалистов по сосудам, используя степени по Rutherford вместо категорий, поскольку не осуществляли стандартное упражнение на беговой дорожке и, следовательно, не было возможно формально различать легкую, умеренную или тяжелую IC.
IC (степень I, категории 1-3) определяли как мышечную боль, дискомфорт или слабость в конечности, вызванные упражнением (выполняемым посредством ходьбы или мышечной активности) и быстро снимаемые посредством прекращения активности, в отличие от боли в покое, которая является непрерывной у пациентов с CLI.
Степень 0 по Rutherford использовали для того, чтобы идентифицировать тех субъектов, которые не имели симптомов или лишь имели ощущение холода или не имели клинических признаков окклюзионного заболевания или умеренное уменьшение пульса.
Незаживающая ишемическая язва подразумевает, что имеет место недостаточная артериальная перфузия в нижней конечности, чтобы поддерживать воспалительную реакцию, необходимую для заживления. Обычно с этим ассоциирована ишемическая боль в покое и объективное свидетельство диффузной ишемии стопы (CLI степени III-IV по Rutherford, категории 5-6).
Ишемическая боль в покое указывает диффузную ишемию стопы (степень II-IV, категории 4-6) и не поддается простому контролю с помощью аналгетиков. Боль локализована в переднем отделе стопы и пальцах или вблизи очаговых ишемических повреждений. Это усугубляется поднятием конечности. Диффузная ишемия стопы с ишемической болью в покое обычно связана с давлением в лодыжке < 40 мм рт.ст. и ABI <0,8.
Субъектов классифицировали на основе присутствия ишемической боли в покое (с незаживающими ишемическими язвами или без них), ишемической мышечной боли, вызываемой упражнением (IC), или бессимптомного заболевания. Для того чтобы классифицировать испытуемых субъектов, клинические симптомы комбинировали с объективным свидетельством диффузной ишемии стопы через измерение ABI (если это поддавалось надежной оценке.
Оценивали изменение классификации по Rutherford относительно базового уровня до 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев.
Клиническое усовершенствование определяли как усовершенствование на одну степень по Rutherford (категорию) относительно базового уровня. Клинически релевантное усовершенствование определяли как изменение классификации по Rutherford с CLI категории 4 или 5 на IC категории 3 или ниже, через 3, 6, 9 или 12 месяцев после введения Rexmyelocel-T.
8. Изменение числа язв и размера язв
Размер самой большой язвы в целевой нижней конечности, а также общее число язв в обеих ногах регистрировали в Case Report Form (CRF). Оценивали заживление язв и изменения в размерах язв от ба
- 20 045001 зового уровня до месяцев 1, 3, 6, 9 и 12.
9. Васкулогенез
Васкулогенез оценивали через 6 месяцев после введения клеточной суспензии по изобретению с помощью оценочного комитета, образованного двумя интервенционными радиологами, которые выполняли независимую, слепую оценку посредством сравнения ангиограммы базового уровня, которую получали до лечения, с ангиограммой, которую получали через 6 месяцев после введения Rexmyelocel-T.
Васкулогенез считали имеющим место, если был представлен продольный рост ранее существовавших артерий, поперечный рост ранее существовавших артерий, увеличение числа коллатеральных кровеносных сосудов, увеличение числа коллатеральных кровеносных сосудов, увеличение размера и/или плотности коллатеральных кровеносных сосудов или увеличение размера и/или плотности основных сосудов ниже подколенных.
10. Большие ампутации (целевая конечность)
Большой ампутацией считали ампутацию нижней конечности выше лодыжки.
11. Изменение ABI
ABI определяют как соотношение систолического кровяного давления, измеряемого в лодыжке, и систолического давления, измеряемого в плечевой артерии. Субъект получал указание отдохнуть в течение 5-10 мин в положении лежа на спине, в расслабленном состоянии, с опорой для головы и пяток, в помещении с температурой 19-22°C. Выбирали манжету для измерения кровяного давления надлежащего размера, чтобы измерять кровяное давление как в лодыжке, так и в руке. На лодыжку и руку манжету помещали вокруг конечности способом прямого оборачивания. Использовали допплеровский зонд 8-10 МГц и доплеровский гель наносили на датчик. Допплеровский зонд также использовали для обнаружения потока крови в плече в ходе измерения давления в руке. Измеряли систолическое давление в плечах обеих рук и систолическое давление в передней голени и задней голени рассматриваемой конечность.
Изменение ABI от базового уровня к месяцу 1, 3, 6, 9 и 12 регистрировали у субъектов, у которых можно было надежно оценивать давление в лодыжке.
12. Изменения чрескожного давления кислорода
Чрескожная оксиметрия, TcPO2, представляет собой местное неинвазивное измерение, отражающее количество O2, который диффундировал из капилляров, через эпидермис. TcPO2 измеряли с использованием TCM3 (Radiometer Medical ApS, Copenhagen, Denmark).
Регистрировали изменение TcPO2 от базового уровня до месяца 1, 3, 6, 9 и 12.
13. Определения нежелательных явлений
Нежелательные явления (AE) определяли как любой нежелательный опыт, переносимый субъектом в течение исследования, независимо от связи с исследуемым продуктом. Следовательно, AE может представлять собой любой неблагоприятный и непредусмотренный признак (включая аномальные лабораторные находки), симптом или заболевание, связанные во времени с использованием медицинского (исследуемого) продукта, независимо от его связи с медицинским (исследуемым) продуктом. Это включает обострение уже существующих состояний или явлений, сопутствующее заболевание, взаимодействие лекарственных средств или значимое ухудшение показания, используемого в исследовании, которое не регистрировали в другом месте в Case Report Form при оценке конкретных эффектов. Предполагаемые колебания уже существующих состояний, включая заболевание, используемое в исследовании, которые не представляют клинически значимое обострение или ухудшение, не рассматривали в качестве AE.
Для каждого AE документировали следующие данные:
Описание эпизода симптома.
Классификация серьезное или несерьезное.
Тяжесть: легкая (AE, которое легко переносится субъектом, вызывает минимальный дискомфорт и не мешает ежедневной активности), умеренная (AE, которое причиняет достаточный дискомфорт, чтобы мешать нормальной ежедневной активности; может требоваться вмешательство), тяжелая (AE, которое препятствует нормальной ежедневной активности; обычно необходимо лечение или другое вмешательство).
Дата первого возникновения и дата разрешения (если применимо).
Предпринятые действия: любое действие, безвозвратное прекращение исследуемого лечения, введение сопутствующего лекарственного лечения, проведение нефармакологического лечения или госпитализация/длительная госпитализация (SAE).
Причинная связь. Каждая попытка, предпринятая исследователем для того, чтобы оценивать связь AE, если уместно, с Rexmyelocel-T. Причинность оценивали с использованием следующих категорий:
Маловероятно, если имели место незначительные свидетельства, указывающие на причинную связь (например, явление не возникало в оправданный период времени после введения Rexmyelocel-T или если имело место другое обоснованное объяснение явления (например, клиническое состояние субъекта, другое сопутствующее лечение). Возможно, если имеет место свидетельство, указывающее на возможную причинную связь (например, потому что явление возникало в пределах оправданного времени после введения Rexmyelocel-T, даже несмотря на то, что другие факторы могут вносить вклад в явление (например, клиническое состояние субъекта, другое сопутствующее лечение). Правдоподобно, если имеет ме
- 21 045001 сто свидетельство, указывающее на причинную связь, а влияние других факторов маловероятно.
Определенно, если имеет место четкое свидетельство, указывающее на причинную связь, а возможный вклад других факторов можно исключить.
Неопределенно, если имеют место недостаточные или неполные свидетельства для клинического суждения о причинной связи.
Исход явления (неизвестно, выздоровление, выздоровление пока не наступило, выздоровление с осложнениями, смерть (с датой и приведенной причиной)).
14. Определение серьезных нежелательных явлений
SAE определяли как AE, которые отвечают одному или нескольким из следующих критериев серьезного исхода:
приводило к смерти;
угрожало жизни;
требовало немедленной госпитализации или продления уже случившейся госпитализации;
приводило к персистирующей или значимой нетрудоспособности или недееспособности;
представляло собой врожденную аномалию или порок развития;
представляло собой важное медицинское явление, которое на основе медицинского и научного суждения несло потенциальную угрозу субъекту или требовало вмешательства для того, чтобы предотвращать один из исходов, которые перечислены выше.
AE считали угрожающим жизни, если субъект имел риск смерти во время явления. Не рассматривали явления, которые в теории могли быть причиной смерти, будь они более тяжелыми.
Пример 2. Результаты
1. Изменение классификации по Rutherford
Изменение категории PAD no Rutherford у контрольных субъектов и у субъектов, которых лечили клеточной суспензией по изобретению, находится на базовом уровне и после 3, 6, 9 и 12 месяцев представлено далее в табл. 7.
При визите базового уровня субъекты в группах лечения клеточной суспензией по изобретению классифицировали как CLI категории 4 по Rutherford (степень II) или категорию 5 по Rutherford (степень III) (20 (44%) субъектов и 25 (56%) субъектов, соответственно. Результаты показывали, что в пределах первых 12 месяцев большинство субъектов, которых лечили клеточной суспензией по изобретению, достигали клинически релевантного ответа, как продемонстрировано с помощью усовершенствования, т. е. понижения их классификации до категории 0-3 по Rutherford (степени 0 и 1) у 28 (68%) субъектов.
Таблица 7. Классификация по Rutherford на базовом уровне и через 3, 6, 9 и 12 месяцев __________________ после введения Rexmyelocel-T________________
| Категория | Степень | Контроль (п, %) | Наименьшая доза 1х108 BM-MNC (п, %) | Средняя доза 5х108 BM- MNC (η, %) | Наибольшая доза 1х109 BM-MNC (η, %) | Все субъекты которых лечили (п, %) |
| Базовый уровень | ||||||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1-3 | I | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 4 | II | 6 (40) | 7 (47) | 7 (47) | 6 (40) | 20 (44) |
| 5 | III | 9 (60) | 8 (53) | 8 (53) | 9 (60) | 25 (56) |
| 6 | IV | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Всего | 15 | 15 | 15 | 15 | 45 | |
| 3 месяца | ||||||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1-3 | I | 0 | 3 (20) | 6 (40) | 6 (40) | 15 (33) |
| 4 | II | 7 (50) | 6 (40) | 3 (20) | 1 (7) | 10 (22) |
| 5 | III | 6 (43) | 6 (40) | 6 (40) | 8 (53) | 20 (44) |
| 6 | IV | 1 (7) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Всего | 14 | 15 | 15 | 15 | 45 | |
| 6 месяцев | ||||||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 1 (7) | 0 | 1 (2) |
| 1-3 | I | 1 (8) | 7 (47) | 6 (40) | 7 (47) | 20 (44) |
| 4 | II | 7 (58) | 5 (33) | 3 (20) | 0 (0) | 8 (18) |
| 5 | III | 3 (25) | 3 (20) | 5 (33) | 8 (53) | 16 (36) |
- 22 045001
| 6 | IV | 1 (8) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Всего | 12 | 15 | 15 | 15 | 45 | |
| 9 месяцев | ||||||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1-3 | I | 1 (8) | 9 (69) | 8 (57) | 7 (47) | 24 (57) |
| 4 | II | 7 (58) | 2 (15) | 2 (14) | 2 (13) | 6 (14) |
| 5 | III | 3 (25) | 2 (15) | 4 (29) | 6 (40) | 12 (29) |
| 6 | IV | 1 (8) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Всего | 12 | 13 | 14 | 15 | 42 | |
| 12 месяцев | ||||||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 2 (14) | 0 | 2 (5) |
| 1-3 | I | 2 (18) | 10 (77) | 9 (64) | 7 (50) | 26 (63) |
| 4 | II | 5 (46) | 0 | 2 (14) | 5 (36) | 7 (17) |
| 5 | III | 4 (36) | 3 (23) | 1 (7) | 2 (14) | 6 (15) |
| 6 | IV | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Всего | 11 | 13 | 14 | 14 | 41 |
Сокращения: BMNC = мононуклеарные клетки костномозгового происхождения
Через 3 месяца после введения 15 (33%) субъектов, которых лечили клеточной суспензией по изобретению, и 12 (40%) субъектов в группах средней и высокой дозы более не страдали от боли в покое или утраты ткани, и их классифицировали как категорию 0-3 по Rutherford (степень 0 и I), которые затем возрастали до 21 (46%) субъекта, 24 (57%) и 28 (68%) через 6, 9 и 12 месяцев после введения, соответственно. Для субъектов в группах средней и высокой дозы это составляло 13 (43%), 15 (50%) и 18 (64%) через 6, 9 и 12 месяцев после введения, соответственно. Это дает благоприятное сравнение с контрольной группой, в которой 0 (0%), 1 (8%), 1 (8%) и 2 (18%) субъекта усовершенствовались до категории 1-3 по Rutherford (степень I) после 3, 6, 9 и 12 месяцев соответственно.
Один субъект, отнесенный к контрольной группе, отозвал информированное согласие после рандомизации, один субъект погиб из-за сердечно-сосудистого заболевания перед визитом последующего наблюдения через 6 месяцев, один пациент подвергся большой ампутации перед визитом последующего наблюдения через 6 месяцев и один субъект вышел из-под наблюдения перед визитом через 12 месяцев. Два субъекта, которые получали более низкую дозу Rexmyelocel-T, подверглись большой ампутации после 6 месяцев после введения в целевой конечности.
Всего 28 из 45 (62%) субъектов в группах лечения клеточной суспензией по изобретению через 12 месяцев после введения, из которых 18 из 30 (63%) в группах средней и высокой дозы, не имели ишемическую боль в покое или ишемические язвы, по сравнению с контрольной группой, где 9 из 11 (82%) субъектов сообщали о боли в покое или присутствии незаживающих ишемических язв (4 (36%) субъекта).
Когда применяли перенос последнего наблюдения вперед (LOCF) (за исключением субъектов с большой ампутацией конечности; этих субъектов считали пациентами с отсутствием клинического ответа), результаты показывали, что в пределах первых 12 месяцев после введения клеточной суспензии по изобретению, клинически релевантного ответа достигали, как продемонстрировано с помощью понижения их классификации по Rutherford. Категория 0-3 (степень 0 и I) у 28 (64%) из всех субъектов, получавших лечение, и 18 (63%) в группах средней и высокой дозы (см. табл. 8 и фиг. 2 и 3).
Через 3 месяца после введения Rexmyelocel-T, 15 (33%) субъектов, которых лечили с использованием Rexmyelocel-T, из которых 12 (40%) в группах средней и высокой дозы, более не страдали от боли в покое или утраты ткани, и их классифицировали как категорию 0-3 по Rutherford (степень 0 и I), которые дополнительно возрастали до 21 (46%) субъекта и 24 (53%) субъектов через 6 и 9 месяцев после введения, соответственно, для всех пациентов, получавших лечение. В группах средней и высокой дозы 14 (47%) и 15 (50%) субъектов классифицировали как категорию 0-3 по Rutherford через 6 и 9 месяцев соответственно. Это дает благоприятное сравнение с контрольной группой, в которой только 0 (0%), 1 (8%), 1 (7%) и два (13%) субъекта усовершенствовались до категории 1-3 по Rutherford (степень I) после 3, 6, 9 и 12 месяцев соответственно.
- 23 045001
Таблица 8. Классификация по Rutherford при базовом уровне и через 3, 6, 9 и 12 месяцев после введения Rexmyelocel-T (включая ампутации и смерть) . - LOCF
| Категория | Степень | Контроль (П, %) | Низкая доза 1х108 BM-MNC | Средняя доза 5χ108 BM-MNC (N, %) | Высокая доза 1х109 BM-MNC (N, %) | Все субъекты, которых лечили (п, %) | |
| (N | , %) | ||||||
| Базовый уровень | |||||||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 1-3 | I | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 4 | II | 6 (40) | 7 | (47) | 7 (47) | 6 (40) | 20 (44) |
| 5 | III | 9 (60) | 8 | (53) | 8 (53) | 9 (60) | 25 (56) |
| 6 | IV | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Ампутации | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Смерть | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Всего | 15 | 15 | 15 | 15 | 45 | ||
| 3 месяца | |||||||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 1-3 | I | 0 | 3 | (20) | 6 (40) | 6 (40) | 15 (33) |
| 4 | II | 7 (47) | 6 | (40) | 3 (20) | 1 (7) | 10 (22) |
| 5 | III | 7 (47) | 6 | (40) | 6 (40) | 8 (53) | 20 (44) |
| 6 | IV | 1 (б) | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Ампутации | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Смерть | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Всего | 15 | 15 | 15 | 15 | 45 | ||
| 6 месяцев | |||||||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 1 (7) | 0 | 1 (2) | |
| 1-3 | I | 1 (7) | 7 | (47) | 6 (40) | 7 (47) | 20 (44) |
| 4 | II | 7 (47) | 5 | (33) | 3 (20) | 0 | 8 (18) |
| 5 | III | 4 (27) | 3 | (20) | 5 (33) | 8 (53) | 16 (36) |
| 6 | IV | 1 (7) | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Ампутации | 1 (7) | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Смерть | 1 (7) | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Всего | 15 | 15 | 15 | 15 | 45 | ||
| 9 месяцев | |||||||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 1-3 | I | 1 (7) | 9 | (60) | 8 (53) | 7 (47) | 24 (53) |
| 4 | II | 7 (47) | 2 | (20) | 3 (20) | 2 (13) | 8 (18) |
| 5 | III | 4 (27) | 2 | (20) | 4 (27) | 6 (40) | 13 (29) |
| 6 | IV | 1 (7) | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Ампутации | 1 (7) | 2 | (13) | 0 | 0 | 2 (4) | |
| Смерть | 1 (7) | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Всего | 15 | 15 | 15 | 15 | 45 | ||
| 12 месяцеь | |||||||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 2 (13) | 0 | 2 (4) | |
| 1-3 | I | 2 (13) | 10 | (67) | 9 (60) | 7 (50) | 26 (58) |
| 4 | II | 6 (40) | 0 | (7) | 3 (20) | 5 (36) | 8 (18) |
| 5 | III | 5 (33) | 3 | (27) | 1 (7) | 2 (14) | 6 (13) |
| 6 | IV | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Ампутации | 1 (7) | 2 | (13) | 0 | 0 | 2 (4) | |
| Смерть | 1 (7) | 0 | 0 | 1 (7) | 1 (2) | ||
| Всего | 15 | 15 | 15 | 15 | 45 |
Сокращения: BMNC = мононуклеарные клетки костномозгового происхождения
На фиг. 4 и в табл. 9 показан клинически релевантный ответ у большего числа субъектов в группах
- 24 045001 лечения клеточной суспензией по изобретению по сравнению с контрольной группой во все визиты последующего наблюдения после введения. Через 12 месяцев после введения Rexmyelocel-T, большинство субъектов во всех группах Rexmyelocel-T демонстрировали клинически релевантный ответ по сравнению с контрольной группой: 34 (76%) субъектов (10, 13 и 11 субъектов в наименьшей, средней, наибольшей группах Rexmyelocel-T, соответственно) против 2 (13%) субъектов.
Таблица 9. Классификация по Rutherford через 3, 6, 9 и 12 месяцев после введения Rexmyelocel-T - LOCF
Сокращения: BMNC = мононуклеарные клетки костномозгового происхождения
2. Изменение числа язв в пораженной конечности
Изменение числа язв в пораженной конечности представлено в табл. 10 и на фиг. 5. При визите базового уровня 25 субъектов (56%) в группах лечения клеточной суспензией по изобретению и 9 субъектов (60%) в контрольной группе классифицировали как категорию 5 по Rutherford, и они имели незаживающие ишемические язвы. Большинство субъектов имели одну язву, и отсутствовали существенные различия между группами лечения и контрольной группой (5, 7 и 6 субъектов в наименьшей, средней, наибольшей группах клеточной суспензии по изобретению, соответственно, и 6 субъектов в контрольной группе). Четыре субъекта в наименьшей, средней, наибольшей группах лечения клеточной суспензией по изобретению (1, 1 и 2 субъекта, соответственно) и один субъект в контрольной группе имели > 3 язв.
Несмотря на то, что усредненный размер язв на базовом уровне у субъектов в группе лечения клеточной суспензией по изобретению выше такового у субъектов в контрольной группе (39,9±23,0 мм против 26,3±23,5 мм в группах лечения и контрольной группе, соответственно), результаты показывали, что у субъектов, язвы которых не заживали, размер язв уменьшался (29,7±13,5 мм), при этом средний размер язв в контрольной группе возрастал (43,8±29,3 мм) (табл. 11).
- 25 045001
Таблица 10. Изменение числа язв в пораженной конечности
| Контроль (п, %) | Наименьшая доза 1х108 BM-MNC (п, %) | Средняя доза 5χ108 BM-MNC (п, %) | Наибольшая доза 1х109 BM-MNC (η, %) | Все субъекты, которых лечили (п, %) | |
| Базовый уровень | |||||
| 0 язв | |||||
| 1 язва | 6 (67) | 5 (63) | 7 (88) | 6 (67) | 18 (72) |
| 2 язвы | 2 (22) | 2 (25) | 0 | 1 (11) | 3 (12) |
| >3 язвы | 1 (11) | 1 (12) | 1 (12) | 2 (22) | 4 (16) |
| Всего | 9 | 8 | 8 | 9 | 25 |
| 3 месяца после введения Rexmyelocel-T | |||||
| 0 язв | 1 (13) | 2 (25) | 2 (25) | 1 (11) | 5 (20) |
| 1 язва | 4 (50) | 4 (50) | 5 (63) | 4 (44) | 13 (52) |
| 2 язвы | 1 (12) | 0 | 0 | 3 (33) | 3 (12) |
| >3 язвы | 2 (25) | 2 (25) | 1 (12) | 1 (11) | 4 (16) |
| Всего | 8 | 8 | 8 | 9 | 25 |
| 6 месяцев после введения Rexmyelocel-T | |||||
| 0 язв | 2 (33) | 4 (57) | 3 (38) | 2 (22) | 9 (38) |
| 1 язва | 4 (67) | 1 (14) | 4 (50) | 6 (67) | 11 (46) |
| 2 язвы | 0 | 2 (29) | 0 | 0 | 2 (8) |
| >3 язвы | 0 | 0 | 1 (12) | 1 (11) | 2 (8) |
| Всего | 6 | 7 | 8 | 9 | 24 |
| 9 месяцев после введения Rexmyelocel-T |
| 0 язв 2 (33) 5 (71) 4 (50) 4 (44) 13 (54 1 язва 4 (67) 2 (29) 3 (38) 4 (44) 9 (38) 2 язвы 0 0 0 1(11) 1(4) >3 язвы 0 0 1 (12) 0 1 (4) Всего 6 7 8 9 24 12 месяцев после введения Rexmyelocel-T | |||||
| 0 язв | 2 (33) | 4 (57) | 7 (88) | 7 (78) | 18 (75) |
| 1 язва | 4 (66) | 3 (43) | 0 | 2 (22) | 5 (21) |
| 2 язвы | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| >3 язвы | 0 | 0 | 1 (12) | 0 | 1 (4) |
| Всего | 6 | 7 | 8 | 9 | 24 |
- 26 045001
Таблица 11. Размер язв в пораженной конечности (наибольший диаметр)
| Контроль (п = 15) Базовый уровень | Наименьшая | Средняя доза 5х108 | Наибольшая | Все субъекты, которых | |||||||
| доза 1> BM-MNC = 15) 8 41,5 29, 1 | <108 (п + | доза 1> BM-MNC = 15) 8 45, 6 19,2 | <109 (п + | ||||||||
| BM-MNC (п 15) 7 31,4 19, 7 | + | лечили 45) 23 39,9 ± | (п = 23, 0 | ||||||||
| N Среднее SD | + | 9 26, 3 23,5 | + | ||||||||
| 3 месяца | |||||||||||
| N | 5 | 6 | 6 | 7 | 19 | ||||||
| Среднее | ± | 21,8 | 51,7 | ± | 23,7 | + | 27,9 | + | 34,1 + | 27,4 | |
| SD | +17, 9 | 39, 7 | 19, 5 | 12,9 | |||||||
| 6 месяцев | |||||||||||
| N | 3 | 4 | 5 | 7 | 16 | ||||||
| Среднее | ± | 36, 7 | + | 42,5 | ± | 24,0 | + | 24,3 | + | 28,8 + | 25, 0 |
| SD | 15, 3 | 43,5 | 19, 8 | 13,7 | |||||||
| 9 месяцев | |||||||||||
| N | 3 | 2 | 4 | 5 | 11 | ||||||
| Среднее | ± | 26, 7 | + | 27,5 | ± | 12,5 | + | 23, 0 | + | 20,0 + | 13, 0 |
| SD | 5, 8 | 17,7 | 6, 5 | 14, 8 | |||||||
| 12 месяцев | |||||||||||
| N | 4 | 3 | 1 | 2 | 6 | ||||||
| Среднее | ± | 43, 8 | + | 31,7 | + | 15, 0* | 34,0 | + | 29,7 ± | 13,5 | |
| SD | 29, 3 | 17, 6 | 35, 7 |
*Через 12 месяцев один субъект со средней дозой имел язву на пораженной конечности. Представлен фактический размер этой язвы.
3. Изменение TcPO2
Изменение TcPO2 представлено в табл. 12.
При базовом уровне 35 (79%) субъектов в группах лечения клеточной суспензией по изобретению имели TcPO2 < 4 0 мм рт.ст. (12, 12 и 11 субъектов в трех группах доз (наименьшая, средняя, наибольшая группы, соответственно) по сравнению с 6 (43%) субъектами в контрольной группе.
Результаты показывали, что при визите последующего наблюдения через 12 месяцев уровни TcPO2 возрастали до > 40 мм рт.ст. у большинства субъектов, которых лечили с использованием Rexmyelocel-T (24 (60%) субъектов) по сравнению с 5 (46%) субъектами в контрольной группе.
Таблица 12. Изменение чрескожного давления кислорода
| Контроль (п, %) | Наименьшая доза 1х108 BM-MNC (N, %) | Средняя доза 5χ108 BM-MNC (N, %) | Наибольшая доза 1х109 BM-MNC (N, %) | Все субъекты, которых лечили (п, %) | |
| Базовый уровень | |||||
| ТсО2 > 40 мм рт. ст. | 8 (57) | 2 (14) | 3 (20) | 4 (27) | 9 (21) |
| ТсО2 < 40 мм рт. ст. | 6 (43) | 12 (86) | 12 (80) | 11 (73) | 35 (79) |
| Всего | 14 | 14 | 15 | 15 | 44 |
| 3 месяца после введения Rexmyelocel-T | |||||
| ТсО2 > 40 мм | 7 (64) | 6 (43) | 6 (43) | 8 (53) | 20 (47) |
- 27 045001
| рт. ст. | |||||
| ТсО2 < 40 мм рт. ст. | 4 (36) | 8 (57) | 8 (57) | 7 (47) | 23 (53) |
| Всего | 11 | 14 | 14 | 15 | 43 |
| 6 месяцев после введения Rexmyelocel-T | |||||
| ТсО2 > 40 мм рт. ст. | 6 (55) | 7 (47) | 5 (39) | 8 (53) | 20 (47) |
| ТсО2 < 40 мм рт. ст. | 5 (45) | 8 (53) | 8 (61) | 7 (47) | 23 (53) |
| Всего | 11 | 15 | 13 | 15 | 43 |
| 12 месяцев после введения Rexmyelocel-T | |||||
| ТсО2 > 40 мм рт. ст. | 5 (46) | 9 (69) | 7 (54) | 8 (57) | 24 (60) |
| ТсО2 < 40 мм рт. ст. | 6 (54) | 4 (31) | 6 (46) | 6 (43) | 16 (40) |
| Всего | 11 | 13 | 13 | 14 | 40 |
4. Васкулогенез
Васкулогенез оценивали через 6 месяцев после введения клеточной суспензии по изобретению. Среди субъектов, которых лечили клеточной суспензией по изобретению, васкулогенез присутствовал у 26 (62%) субъектов: 7, 8 и 9 субъектов в наименьшей, средней, наибольшей группах, соответственно (см. табл. 13).
Таблица 13. Васкулогенез
| Наименьшая Средняя Наибольшая Все доза 1х108 доза 5χ108 доза 1*109 субъекты, BM-MNC (n, BM-MNC BM-MNC (п, которых %) (п, %) %) лечили (п, %) 6 месяцев после введения Rexmyelocel-T | ||||
| Васкулогенез | 7 (58) | 8 (62) | 9 (64) | 24 (62) |
| Нет васкулогенеза | 5 (42) | 5 (38) | 5 (36) | 15 (38) |
| Всего | 12 | 13 | 14 | 39 |
Ангиографические изображения для 3 из 24 случаев васкулогенеза, который возникал, представлены по сравнению с базовым уровнем на фиг. 6: продольный рост артерий (фиг. 6A), возникновение новых сосудов (фиг. 6B) и поперечный рост коллатерали, которая направлена к коже (фиг. 6C).
Claims (15)
1. Клеточная суспензия, содержащая от 4х108 до 1,2х109 аутологичных или аллогенных белых клеток крови, происходящих из костного мозга человеческого субъекта, где из общего числа от 4х108 до 1,2х109 белых клеток крови:
i) от 20 до 51% представляют собой лимфоциты и от 3,9% до 22,3% представляют собой моноциты;
ii) от 1,4 до 10% представляют собой гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют CD34;
iii) от 25,3 до 83,3% от общего числа белых клеток крови представляют собой мононуклеарные клетки;
iv) от 16,7 до 74,7% представляют собой гранулоциты;
v) от 5,4 до 38,8% от общего числа белых клеток крови экспрессируют CXCR4;
vi) от 0,07 до 24,7% от общего числа белых клеток крови экспрессируют VEGFR2;
vii) из общего числа гематопоэтических стволовых клеток, которые экспрессируют CD34, от 7,7 до 55,5% представляют собой ранние не коммитированные гематопоэтические стволовые клетки, которые не экспрессируют CD38, и от 0,7 до 10,3% представляют собой стволовые клетки, которые экспрессируют CD34 и CXCR4; и viii) максимальное соотношение красных клеток крови и лейкоцитарных клеток составляет 6,7 и максимальное соотношение тромбоцитов и лейкоцитарных клеток составляет 32, для лечения или улучшения заболевания периферических артерий нижних конечностей.
2. Клеточная суспензия по п.1, где из общего числа белых клеток крови от 32,3 до 80,0% представляют собой мононуклеарные клетки, выбранные из списка, состоящего из лимфоцитов, моноцитов и гематопоэтических стволовых клеток, которые экспрессируют CD34 клетки, и от 20,0 до 67,7% представляют собой гранулоциты.
- 28 045001
3. Клеточная суспензия по п.1 или 2, где клеточная суспензия содержит от 5х108 до 1,2х109.
4. Клеточная суспензия по п.1 или 2, где клеточная суспензия содержит от 8х108 до 1,2х109.
5. Клеточная суспензия по п.1 или 2, где клеточная суспензия содержит от 9х108 до 1,1 х109.
6. Клеточная суспензия по п.1 или 2, где клеточная суспензия содержит от 9,5 х108 до 1,05 х109.
7. Клеточная суспензия по п.1 или 2, где клеточная суспензия содержит от 9,8х108 до 1,02х109.
8. Клеточная суспензия в соответствии с любым из пп.1-7, где заболевание периферических артерий нижних конечностей представляет собой критическую ишемию конечностей.
9. Клеточная суспензия в соответствии с любым из пп.1-8, где клетки такой клеточной суспензии суспендируют в объеме от 5 до 30 мл гепаринизированного солевого раствора или лактатного раствора Рингера, предпочтительно содержащего приблизительно 1% HSA и приблизительно 2,5% глюкозы.
10. Клеточная суспензия, как определено в любом из пп.1-7, где указанное заболевание периферических артерий нижних конечностей представляет собой критическую ишемию конечностей, и указанное лечение или улучшение включает внутриартериальное введение, где поток крови низкого давления вплоть до 4 атм получают посредством расположения надуваемого баллона проксимально от окклюзионного повреждения сосудов в дистальной бедренной или подколенной артерии, и инфузию указанной клеточной суспензии внутриартериально.
11. Шприц для лечения или улучшения заболевания периферических артерий нижних конечностей, который содержит клеточную суспензию, как определено в любом из пп.1-7.
12. Шприц по п.11, где указанное заболевание периферических артерий нижних конечностей представляет собой критическую ишемию конечностей.
13. Шприц 11, где указанное лечение включает внутриартериальное введение, где поток крови низкого давления вплоть до 4 атм получают посредством расположения надуваемого баллона проксимально от окклюзионного повреждения сосудов в дистальной бедренной или подколенной артерии, и инфузию указанной клеточной суспензии внутриартериально.
14. Клеточная суспензия по любому одному из пп.1-7 или шприц по любому одному из пп.12, 13, где указанную суспензию предоставляют в виде однократной дозы.
15. Клеточная суспензия по любому одному из пп.1-7 или шприц по любому одному из пп.10 или 13, где индукцию потока низкого давления достигают между 1 и 6 мин и где инфузию указанной клеточной суспензии выполняют между 2 и 10 мин.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP16382405.5 | 2016-08-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045001B1 true EA045001B1 (ru) | 2023-10-26 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210161960A1 (en) | Cell suspension for use in the treatment of lower extremity peripheral artery disease | |
| Lasala et al. | Combination stem cell therapy for the treatment of severe limb ischemia: safety and efficacy analysis | |
| Ripa et al. | Stem cell mobilization induced by subcutaneous granulocyte-colony stimulating factor to improve cardiac regeneration after acute ST-elevation myocardial infarction: result of the double-blind, randomized, placebo-controlled stem cells in myocardial infarction (STEMMI) trial | |
| JP6731004B2 (ja) | 富化体液の調製のための方法および装置 | |
| US20160106779A1 (en) | Neutrophil-depleted whole blood and platelet rich plasma compositions | |
| JP2011529706A (ja) | 間充織間質細胞集団、ならびにそれを単離および使用する方法 | |
| US20120100108A1 (en) | Compositions and methods of treating no-option critical limb ischemia (cli) | |
| Skóra et al. | Transplantation of autologous bone marrow mononuclear cells with VEGF gene improves diabetic critical limb ischaemia | |
| JP6525889B2 (ja) | 自己骨髄由来の幹細胞の迅速な注入 | |
| JP7246366B2 (ja) | 虚血性疾患の治療及び／又は予防の為の細胞製剤、及び、その細胞製剤のスクリーニング方法 | |
| Alsousou et al. | Platelet-rich plasma in regenerative medicine | |
| EA045001B1 (ru) | Клеточная суспензия для использования в лечении заболевания периферических артерий нижних конечностей | |
| NZ791839A (en) | Cell suspension for use in the treatment of lower extremity peripheral artery disease | |
| Huang et al. | Use of a transjugular intrahepatic portosystemic shunt combined with autologous bone marrow cell infusion in patients with decompensated liver cirrhosis: an exploratory study | |
| KR20200132550A (ko) | 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지를 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 조성물 | |
| US20220331370A1 (en) | Treatment of cardiovascular diseases | |
| Alsousou et al. | Therapeutic platelet-rich plasma in wound healing | |
| Akar et al. | Therapeutic angiogenesis by autologous transplantation of bone marrow mononuclear cells for Buerger’s patients with retractable limb ischaemia: a preliminary report | |
| Caradonna et al. | Different methods of bone marrow harvesting influence cell characteristics and purity, affecting clinical outcomes | |
| US20180271908A1 (en) | Intramuscular administraton of autologous bone marrow for treatment | |
| CN104622899A (zh) | Cd133+内皮前体细胞的用途 | |
| JP2017206476A (ja) | 血小板接着促進剤及び血管内皮細胞修復促進剤のスクリーニング方法 | |
| US20130252257A1 (en) | Quantification of circulating stem and progenitor cells as a means of assessing efficacy of naturopathic interventions |