EA044422B1 - Способ очистки ифр-1 - Google Patents
Способ очистки ифр-1 Download PDFInfo
- Publication number
- EA044422B1 EA044422B1 EA202390485 EA044422B1 EA 044422 B1 EA044422 B1 EA 044422B1 EA 202390485 EA202390485 EA 202390485 EA 044422 B1 EA044422 B1 EA 044422B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- protein
- buffer
- folding
- igf
- mixture
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 64
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 title 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 67
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 67
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 59
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 54
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims description 53
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 49
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 14
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 12
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 11
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 claims description 11
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 10
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- -1 sulfopropyl Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 6
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 claims description 5
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 5
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 5
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 claims description 2
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 8
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 8
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 8
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 7
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 7
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 7
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 7
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 108010000594 mecasermin Proteins 0.000 description 6
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 6
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 5
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 5
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 5
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 229960001311 mecasermin Drugs 0.000 description 4
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 4
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MQHUHNALGOSWPX-QIFMNYRTSA-N (2r)-2-amino-3-[[(2r)-2-amino-2-carboxyethyl]disulfanyl]propanoic acid;(2r)-2-amino-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CSSC[C@H](N)C(O)=O MQHUHNALGOSWPX-QIFMNYRTSA-N 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 2
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 2
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 229940023383 increlex Drugs 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZQRPGFWGRMBUQW-QLAMLYEZSA-N (2s)-2-amino-5-[[(2r)-3-[[(2r)-2-[[(4s)-4-amino-4-carboxybutanoyl]amino]-3-(carboxymethylamino)-3-oxopropyl]disulfanyl]-1-(carboxymethylamino)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid;(2s)-2-amino-5-[[(2r)-1-(carboxymethylamino)-1-oxo-3-sulfanylpropan- Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O ZQRPGFWGRMBUQW-QLAMLYEZSA-N 0.000 description 1
- TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 10H-phenoxazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3OC2=C1 TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SKIIKRJAQOSWFT-UHFFFAOYSA-N 2-[3-[1-(2,2-difluoroethyl)piperidin-4-yl]oxy-4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound FC(CN1CCC(CC1)OC1=NN(C=C1C=1C=NC(=NC=1)NC1CC2=CC=CC=C2C1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2)F SKIIKRJAQOSWFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N Gly-Pro-Glu Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N Ribitol Natural products OCC(C)C(O)C(O)CO JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N Trichloroethylene Chemical compound ClC=C(Cl)Cl XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N benzenecarboximidamide;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].NC(=[NH2+])C1=CC=CC=C1 LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- CDQSJQSWAWPGKG-UHFFFAOYSA-N butane-1,1-diol Chemical compound CCCC(O)O CDQSJQSWAWPGKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012733 comparative method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 108700001680 des-(1-3)- insulin-like growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- AHRQMWOXLCFNAV-UHFFFAOYSA-O ethylammonium nitrate Chemical compound CC[NH3+].[O-][N+]([O-])=O AHRQMWOXLCFNAV-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 239000008214 highly purified water Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000012153 long-term therapy Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000005527 methyl sulfate group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000004090 neuroprotective agent Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical compound OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000002824 redox indicator Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000001554 selenocysteine group Chemical group [H][Se]C([H])([H])C(N([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000009759 skin aging Effects 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к производству белка ИФР-1 для нужд фармацевтической и ветеринарной промышленности и других сфер, где требуется высококачественный чистый белок ИФР-1. В частности, раскрывается способ очистки белка ИФР-1 и препарат белка, получаемый этим способом.
Сведения о предшествующем уровне техники
ИФР-1 (инсулиноподобный фактор роста 1, соматомедин С, IGF1, insulin-like growth factor 1) является гормоном из семейства инсулиноподобных факторов роста, по структуре и функциям похожий на инсулин. Он участвует в эндокринной, аутокринной и паракринной регуляции процессов роста, развития и дифференцировки клеток и тканей организма, прежде всего костной и мышечной тканей, а также имеет различные иные функции. Белок применяется в качестве маркера, позволяющего диагностировать нарушения роста у детей и акромегалию и контролировать заместительное лечение гормоном роста. Кроме этого, ИФР-1 применяется в качестве лекарственного средства для длительной терапии при нарушении роста у детей и подростков (Increlex, Ipsen Biopharmaceuticals, Inc), а также показана возможность его применения в качестве нейропротективного средства при инсульте (RU2711111, WO 93/08828) и для лечения сложных для ведения ран (Garoufalia Z, et al. Insulin-like growth factor-I and wound healing, a potential answer to non-healing wounds: A systematic review of the literature and future perspectives. Biomed Rep. 2021 Aug; 15(2):66).
Препараты ИФР-1 применяются спортсменами для набора мышечной массы и увеличения силовых показателей и используют в ветеринарии, например для повышения привеса крупного и мелкого рогатого скота, свиней. ИФР-1 включают в состав космецевтических средств, предназначенных для борьбы с признаками старения кожи (DermaHeal Cosmeceutical Mask Pack, YBK Investment, Inc.).
В современной индустрии имеется все возрастающая потребность в получении белка ИФР-1 в больших количествах при приемлемом качестве.
В промышленности ИФР-1 получают методами биотехнологии с помощью различных экспрессионных систем и с использованием рекомбинантных нуклеиновокислотных молекул. Как правило, используют бактерии, например Escherichia coli, и дрожжи, например Pichia pastoris, трансформированные плазмидой, кодирующей ИФР-1. Преследуя цель максимизировать выход белка, обеспечивают сверхэкспрессию ИФР-1 в бактериях, что приводит к агрегированию белка в тельцах включения, которые содержат плотно упакованный целевой белок (и небольшое количество других белков) и легко отделяются от клеток. Проблема заключается в том, что белок в составе телец включения не имеет правильной третичной структуры, а сами тельца включения нерастворимы, в связи с чем их необходимо солюбилизировать в условиях, которые приводят к денатурации белка, а затем подвергнуть фолдингу (рефолдингу, укладке), т. е. сворачиванию в правильную третичную структуру.
В отличие от бактерий, дрожжи, как правило, секретируют продуцируемый белок в культуральную среду, что уменьшает проблемы с неправильно свернутым белком. Однако, это более сложный для оптимизации продуцент, дающий в среднем меньший выход целевого белка.
Технологии денатурации (солюбилизации) и фолдинга разнятся по общему выходу, по выходу белка требуемой конформации, по возможности масштабировать процесс, по экономичности. Не существует универсального подхода для всех целевых белков; в процессе фолдинга помимо корректного сворачивания может наблюдаться некорректное сворачивание и агрегация белка, а, следовательно, требуется тонкая настройка этого процесса для повышения эффективности и выхода (Eiberle M., Jungbauer A. Technical refolding of proteins: Do we have freedom to operate? Biotechnology Journal, 2010, 5 (6), pp. 547).
Солюбилизация достигается за счет использования, например, хаотропных агентов, например мочевины или солей гуанидина, в высоких концентрациях. Далее следует фолдинг, при котором создают условия, способствующие правильной укладке и образованию дисульфидных связей между целевыми аминокислотными остатками. Для этой цели применяют различные агенты, в том числе мочевину и соли гуанидина (но в более низких концентрациях), циклодекстрины, нитрат этиламмония и т. п. Буфер для фолдинга должен содержать окислительно-восстановительный компонент (редокс-пару) для обеспечения образования дисульфидных связей, например глутатион окисленный-восстановленный, цистеин-цистин и т. п.
Известен способ получения рекомбинантного ИФР-1 в Escherichia coli, при котором бактерию трансформируют кодирующей ИФР-1 плазмидой рЕТ15, культивируют бактерию, выделяют тельца включения, солюбилизируют их в буфере с мочевиной в течение 12 ч, и проводят фолдинг с буфером, содержащим редокс-пару глутатион-глутатиондисульфид, затем центрифугируют и очищают с помощью гель-фильтрации (Jafari S. et ai., Recombinant production of mecasermin in E. coli expression system. Res Pharm Sci. 2014 Nov-Dec;9(6):453-61). В этом документе не раскрыты детали относительно выхода и активности полученного белка.
В патенте US5650496 раскрыто получение правильно свернутого ИФР-1 в дрожжах Pichia pastoris с помощью способа, включающего очистку белка на катионообменной смоле, разворачивание/фолдинг, хроматографию гидрофобных взаимодействий, очистку белка на катионообменной смоле, обращеннофазовую хроматографию, гель-проникающую хроматографию, диафильтрацию. Предпочтительный состав буфера для разворачивания/фолдинга включает 2 М мочевины, 1,5 мМ хлорида натрия, 15% этано- 1 044422 ла, 5 мМ бората натрия и 0,2 мМ дитиотрейтола при рН 9,0-9,5. Этот способ является трудоемким и затратным; кроме того, неясна эффективность этого способа при работе с тельцами включения.
Остается потребность в способах очистки рекомбинантного ИФР-1 с более высокой эффективностью, высоким общим выходом белка, высоким выходом правильно уложенного функционального белка, экономичностью и масштабируемостью, универсальностью в отношении сырья. Кроме того, необходим способ, который бы подходил для очистки белка, продуцируемого в бактериальной клетке.
Сущность изобретения
Вышеуказанные проблемы решаются настоящим изобретением, а именно способом очистки белка ИФР-1, включающим:
a) денатурацию белка с помощью солюбилизирующего буфера, содержащего 7-8 М мочевины и 210 мМ дитиотрейтола, с рН не менее 12,5;
b) фолдинг белка;
c) хроматографическую очистку;
d) смену буферного раствора;
причем стадия фолдинга (b) включает:
b1) смешивание полученной на стадии (а) смеси с фолдирующим буфером в соотношении 1:2-1:3 об.:об., причем фолдирующий буфер содержит воду, стабилизатор, представляющий собой сахар или полиол, и пропанол; и с окислительно-восстановительным компонентом, представляющим собой цистеин и цистамин, который содержится в указанном фолдирующем буфере или добавляется отдельно; и инкубирование полученной смеси в течение не менее 5 суток;
b2) разведение полученной на стадии (b1) смеси ацетатным буфером в соотношении 1:3-1:3,5 об.:об. таким образом, чтобы рН составлял 5,4-5,7;
b3) добавление пероксида водорода к полученной на стадии (b2) смеси в концентрации 0,03-1,96 ммоль/л, инкубирование в течение не менее 30 мин;
b4) центрифугирование полученной смеси и фильтрацию супернатанта, который затем направляют на стадию (с).
Предложенный способ обеспечивает следующие преимущества:
больший выход продукта;
продукт характеризуется меньшим количеством неправильно уложенных форм ИФР-1, т. е. большей долей правильно уложенного ИФР-1;
возможно получение белка в высоких концентрациях;
сниженное содержание примеси продуцента (белков, ДНК и/или ЛПС).
Помимо указанного выше, способ очистки является экономически выгодным, поскольку позволяет при имеющемся выходе белка тратить меньшее количество реактивов, использовать менее ценные реагенты (например, избегать использования аргинина), проводить процесс при комнатной температуре.
В частности, высокий выход достигается за счет снижения потерь, прежде всего выпадения осадка, на стадиях денатурации, фолдинга и хроматографической очистки, а высокий выход правильно уложенной формы ИФР-1 достигается за счет указанных выше существенных условий проведения фолдинга.
В предпочтительных воплощениях способ характеризуется одним или несколькими из указанных ниже признаков:
пропанол представляет собой изопропанол;
сахар представляет собой сахарозу;
стадия (с) включает хроматографическую очистку на сульфопропилсефарозе и на бутилсефарозе;
стадию (d) смены буферного раствора выполняют методом ультрафильтрации, сайз-эксклюзионной хроматографии или диализа;
концентрация каждого из цистеина и цистамина в образуемой на стадии (b1) смеси составляет 1-4 мМ;
рН на стадии (b1) составляет 10,5.
Изобретение также относится к продукту ИФР-1, который получен способом по изобретению и представляет собой, без ограничения, фармацевтическую, ветеринарную и/или космецевтическую субстанцию или лабораторный реагент; и к применению указанного продукта по медицинскому, ветеринарному, и/или космецевтическому назначению, или для научных исследований.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения продукта ИФР-1, включающему продуцирование ИФР-1 в клетке-продуценте, например в бактериальной, дрожжевой, растительной или животной клетке, и очистке с помощью охарактеризованного выше способа очистки. Предпочтительной клеткой-продуцентом является бактериальная клетка, наиболее предпочтительно Escherichia coli.
Перечень графических материалов
Фиг. 1: Диаграмма, показывающая выход белка (вертикальная ось, г) в зависимости от времени фолдинга (горизонтальная ось, сутки) для способа по изобретению в сравнении со способом, в котором
- 2 044422 не используют пару цистеин-цистамин, и способом, в котором не используют перекись водорода. Исходная масса белка, подававшаяся на очистку, составляла 10 г.
Фиг. 2: Хроматограмма ВЭЖХ для продукта, полученного способом по изобретению (по горизонтальной оси - время удержания, мин; по вертикальной - миллиоптические единицы).
Фиг. 3: Хроматограмма ВЭЖХ для продукта, полученного сравнительным способом (по горизонтальной оси - время удержания, мин; по вертикальной - миллиоптические единицы).
Фиг. 4: Исследование активности белка, очищенного способом по изобретению. А и Б: эксперимент с конверсией резазурина в резофурин, Б - визуально, А - оценка с помощью флуориметра (вертикальная ось - ОЕ, оптические единицы); В - оценка ускорения клеточного роста (порядок образцов на Фиг. 4А-4В одинаковый).
Подробное описание изобретения
Синтез ИФР-1.
Для осуществления изобретения подходит неочищенный ИФР-1, полученный любым способом. Как правило, ИФР-1 получают в экспрессионных системах, например в бактериях (Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis и т. д.), дрожжах (Pichia pastoris, Saccharomices cerevisiae и т. д.), клетках животных (СНО (клетки яичника китайского хомячка) и т. д.) и даже растений (растение Nicotiana tabacum, суспензия каллуса риса Oryza sativa и т. д.). Экспрессионные системы различаются по выходу белка, его активности (определяемой, прежде всего правильностью третичной структуры), трудоемкости процесса. Способ очистки, предложенный в заявке, принципиально подходит для очистки ИФР-1, полученного в любой из экспрессионных систем, поскольку проводится эффективный фолдинг с получением правильной третичной структуры вне зависимости от исходного состояния экспрессированного белка.
Различные способы получения ИФР-1 раскрыты, без ограничения, в US5324639, US5650496, RU2372941, RU2711111. Дополнительные средства и методы получения рекомбинантных белков известны специалисту в данной области, например, из Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); и Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003).
Способом по изобретению можно очищать различные варианты ИФР-1, обладающие биологической активностью ИФР-1 и, следовательно, пригодные для применения в медицине, ветеринарии, космецевтике и в научных исследованиях. Предпочтительно, ИФР-1 представляет собой человеческий ИФР-1 (hIGF-1), имеющий 70 аминокислотных остатков (7,6 кДа), также известный как мекасермин (Increlex): GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGIGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMY CAPLKPAKSA (DB01277; также известны варианты мекасермина с I в положении 4 или с Y в положении 43 относительно указанной последовательности, которые могут применяться для очистки). Может быть использован, например, вариант из 71 аминокислотных остатков с добавленной первой аминокислотой М (GenBank: САА01954.1), или des(1-3)IGF-1, представляющий собой укороченный вариант (67 аминокислотных остатков), в котором отсутствуют первые три аминокислоты (GPE). В неограничивающих воплощениях может быть использован ИФР-1 с селеноцистеином в положениях 4, 29, 41, 43, как известно из WO2018204764; или с аланином, глицином или серином в одном или нескольких положениях 3, 4, 5, 10, 14, 17, 23, 24, 25, 43, 49 или 63 и любой аминокислотой в положении 7, как известно из WO2000040612; или с метионином в положении 43 и, необязательно, с добавленной первой аминокислотой М, как известно из RU2711111; с изолейцином в положении 4 и любые иные варианты, которые можно применять в качестве биологически активного ИФР-1.
При решении о том, какой организм использовать для производства ИФР-1, склоняются, как правило, к бактерии, в частности Escherichia coli, поскольку простота работы с ней, а также высокий выход белка, по-видимому, перевешивают остальные недостатки, такие как необходимость избавляться от бактериальных токсинов и отсутствие правильной третичной структуры экспрессируемого в бактерии белка. Именно в Escherichia coli получают мекасермин.
Как отмечалось ранее, сверхэкспрессия в бактериях приводит к накоплению белка в тельцах включения, которые можно достаточно просто выделить путем лизиса клеток, центрифугирования и отмывки, как известно специалистам (Palmer I, Wingfield PT. Preparation and extraction of insoluble (inclusion-body) proteins from Escherichia coli. Curr Protoc Protein Sci. 2004 Nov; Chapter 6:6.3.1-6.3.18). Лизис можно осуществить, например, ультразвуком, давлением, ферментативно, химически и другими способами, а также их комбинациями. Предпочтительно использовать ультразвуковой гомогенизатор или гомогенизатор высокого давления, еще более предпочтительно в комбинации с химическим или ферментативным лизисом. Лизирующий буфер может содержать, например, бензамидина гидрохлорид, ДТТ, Трис и ЭДТА; в состав буфера необязательно могут быть включены один или несколько ингибиторов протеаз.
После лизиса и центрифугирования осадок промывают растворами детергентов и хаотропов в низкой концентрации (мочевина или гидрохлорид гуанидина) с дальнейшим центрифугированием и получением осадка, содержащего тельца включения, который далее можно подавать в способ очистки по изо- 3 044422 бретению.
В случае, когда неочищенный препарат ИФР-1 представляет собой раствор, например культуральную среду в случае секреторной экспрессии, предварительно проводят концентрирование белка, например осаждением, в частности добавлением сульфата аммония, или любыми другими известными специалистам методами. Осадок может быть отмыт известными способами перед подачей в способ очистки по изобретению. Наиболее предпочтительно для реализации изобретения в качестве исходного препарата ИФР-1, подлежащего очистке, использовать тельца включения. При дальнейшем изложении тельца включения упоминаются только для удобства изложения, при этом подразумевается, что их можно заменить на другой препарат ИФР-1. Солюбилизацию проводят, добавляя солюбилизирующий буфер, представляющий собой концентрированный раствор мочевины (7-9 М, предпочтительно не менее 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 М и/или не более 8,9, 8,8, 8,7, 8,6, 8,5, 8,4, 8,3, 8,2, 8,1 М, предпочтительно 7-8 М, наиболее предпочтительно приблизительно 8 М) в буфере с рН не менее 12,5 (в разных воплощениях может составлять примерно 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13 или выше), а также ДТТ (дитиотреитол) в эффективном количестве, предпочтительно 2-10 мМ. В частности нижняя граница диапазона содержания ДТТ может составлять не менее 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8,4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6 мМ; верхняя граница - не более 9,9, 9,8, 9,7, 9,6, 9,5, 9,4, 9,3, 9,2, 9,1, 9, 8,9, 8,8, 8,7, 8,6, 8,5, 8,4, 8,3, 8,2, 8,1, 8, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, 7,1, 7, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1 или 5. В предпочтительном воплощении содержание ДТТ в буфере составляет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мМ. ДТТ может быть добавлен в солюбилизирующий буфер до того, как подлежащий очистке препарат ИФР1 будет смешан с этим буфером; в альтернативном воплощении сначала смешивают указанный препарат с буфером, содержащим мочевину, а затем после тщательного ресуспендирования добавляют ДТТ. Основу буфера может составлять водный раствор Трис HCl или иное известное специалистам для таких целей вещество. рН буфера регулируют до указанного выше значения с помощью подходящей щелочи, например гидроксида натрия или калия, не ограничиваясь указанным.
Соотношение белкового препарата и солюбилизирующего буфера принципиально не ограничено и выбирается таким, чтобы достичь эффективной солюбилизации, например не менее 10,15,20, 25, 30, 35,40 мл на 1 г препарата.
Смесь препарата ИФР-1 с солюбилизирующим буфером инкубируют при перемешивании не менее получаса, например не менее 45 мин, 1, 1,5, 2, 2,5 или 3 ч. Цель данной стадии (стадия денатурации) состоит в как можно более полном растворении препарата белка с разрушением его пространственного строения.
На следующей стадии (стадия фоддинга) смешивают полученный на предыдущей стадии раствор с фолдирующим буфером в соотношении 1:2-1:3 (по объему). Фолдирующий буфер содержит воду, стабилизатор, представляющий собой сахар или полиол, и пропанол.
Сахар может быть выбран из моносахаридов или дисахаридов, например сахарозы, трегалозы, галактозы, лактозы, глюкозы, или их смесей. Полиол может представлять собой диол, триол, тетраол, пентаол, гексаол или их смеси; в неограничивающих воплощениях полиол выбран из, например, глицерина, пропиленгликоля, бутандиола эритрита, пентаэритрита, ксилита, сорбита, маннита, рибита или их смесей. Предпочтительно, стабилизатор выбран из глицерина, сахарозы, глюкозы, трегалозы или их смеси, наиболее предпочтительно представляет собой сахарозу. Стабилизатор используется в эффективном количестве, известном специалисту (Butler SL, Falke JJ. Effects of protein stabilizing agents on thermal backbone motions: a disulfide trapping study. Biochemistry. 1996 Aug 20; 35(33): 10595-600). Количество стабилизатора в фолдирующем буфере предпочтительно составляет от 1 мМ до 5 М, например не менее 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300,400, 500, 600, 700, 800 или 900 мМ, 1,2 или 3 М; например не более 4, 3, 2 или 1 М; и наиболее предпочтительно составляет 1 М. Пропанол может представлять собой изопропанол, н-пропанол или их смесь. Количество пропанола может составлять 30-50% (об./об.), например не менее 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50%; например не более 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31%.
Окислительно-восстановительный (редокс) компонент выбран из пары цистеин-цистамин. Концентрация каждого вещества в смеси фолдирующего буфера с раствором, полученным на стадии солюбилизации, составляет обычно 0,1-10 мМ, например от 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2 мМ или выше; например 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1 или 1 мМ или ниже.
Предпочтительно, используется по 1-4 мМ каждого, наиболее предпочтительно - по 1 мМ каждого. Соотношение между цистеином и цистамином не является принципиальным и может составлять от 1:4 до 4:1, например 1:4,1:3, 1:2,1:1,2:1,3:1 или 4:1. Пара цистеин-цистамин может быть заранее добавлена в фолдирующий буфер, который затем смешивают с раствором, полученным на стадии солюбилизации. Как правило, в таком варианте осуществления буфер используют сразу после изготовления. В альтернативном воплощении пару цистеин-цистамин добавляют во время или после смешивания раствора, полученного на стадии солюбилизации, с фолдирующим буфером. рН фолдирующего буфера регулируют так, чтобы он находился в щелочном диапазоне, предпочтительно более 10, например 10-11, в частности,
- 4 044422
10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8 или 10,9. Если цистеин-цистамин добавляют в фолдирующий буфер отдельно, в одном воплощении рН подводят, при необходимости, перед добавлением цистеинацистамина.
Полученную на стадии фолдинга смесь инкубируют в течение не менее 5 суток. В частности, продолжительность инкубирования может составлять 5, 6, 7, 8, 9 или 10 суток. Инкубирование предпочтительно проводят при комнатной температуре и постоянном перемешивании.
После инкубирования полученную смесь разводят ацетатным буфером в соотношении смесь:буфер, составляющем 1:3-1:3,5 (по объему). При этом контролируют рН таким образом, чтобы он составлял не более 5,7, предпочтительно в диапазоне 5,4-5,7, например 5,4, 5,5, 5,6 или 5,7, регулируя его добавлением, например, уксусной кислоты после смешивания смеси и буфера. Ацетатный буфер может быть изготовлен, например, на основе водного раствора ацетата натрия. Предпочтительно в буфер дополнительно добавляют поверхностно-активное вещество (ПАВ), предпочтительно неионное ПАВ, в частности этоксилаты жирных спиртов, этоксилаты жирных кислот, алкилфенолэтоксилаты, этоксилированные амины или амиды жирных кислот, эфиры жирных кислот и сорбита, эфиры жирных кислот и глицерина, эфиры жирных кислот и полигидроксисоединений, полоксамеры и т. п. ПАВ. Неограничивающие примеры ПАВ включают семейство Tween (твин, Polysorbate, полисорбат), например полисорбат-20 (твин-20), или Triton X, например Triton Х-100. Наиболее предпочтителен полисорбат-20. Количество ПАВ в ацетатном буфере может составлять, не ограничиваясь указанным, 0,05-5%, например 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2,0% или в пределах любого поддиапазона, образуемого любыми из указанных значений.
После стадии разведения к смеси добавляют пероксид водорода в количестве, при котором в смеси обеспечивается концентрация перексида водорода 0,03-1,96 ммоль/л. В частности, эта концентрация может составлять от 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1, 1,05, 1,1, 1,15, 1,2, 1,25, 1,3, 1,35, 1,4, 1,45, 1,5, 1,55, 1,6, 1,65, 1,7, 1,75, 1,8, 1,85 или 1,9; и/или до 1,9, 1,85, 1,8, 1,75, 1,7, 1,65, 1,6, 1,55, 1,5, 1,45, 1,4, 1,35, 1,3, 1,25, 1,2, 1,15, 1,1, 1,05, 1, 0,95, 0,9, 0,85, 0,8, 0,75, 0,7, 0,65, 0,6, 0,55, 0,5, 0,45, 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15 или 0,1. При использовании 30%-го водного раствора пероксида водорода можно руководствоваться соотношением раствор перекиси водорода:смесь, составляющим от 1:250000 до 1:5000 (об./об.), например 1:250000, 1:240000, 1:230000, 1:220000, 1:210000, 1:200000, 1:190000, 1:180000,1:170000, 1:160000, 1:150000, 1:140000, 1:130000, 1:120000, 1:110000, 1:100000, 1:90000, 1:80000, 1:70000, 1:60000, 1:50000, 1:40000, 1:30000, 1:20000, 1:10000 или 1:5000 или находящимся в любом поддиапазоне, образованном любыми из указанных значений. Использование раствора другой концентрации пероксида водорода входит в объем настоящего изобретения, и вышеуказанное соотношение будет пропорционально изменено, как известно специалистам в данной области. После добавления пероксида водорода инкубируют полученную смесь в течение не менее 30 мин; в некоторых воплощениях продолжительность может составлять не менее 45 мин, 1, 1,5, 2, 2,5 или 3 ч. Представляется, что добавление пероксида водорода позволяет избежать залипания белка на колонке, что позволяет дополнительно увеличить выход.
После инкубирования полученную смесь центрифугируют, а супернатант отделяют и фильтруют.
Полученный раствор направляют на стадию хроматографической очистки (ВЭЖХ). Выбор методов хроматографической очистки не принципиален для осуществления способа по изобретению и остается на усмотрение специалиста. Виды хроматографических методов очистки рекомбинантных белков, используемые реагенты и оборудование хорошо известны специалистам в данной области; практические аспекты этих методов раскрыты, например, в Protein Purification Handbook. GE Healthcare Bio-Sciences AB 18-1132-29 AD 02/2007. Общий подход в очистке белка заключается в минимизации количества стадий (поскольку на каждой стадии неизбежны потери целевого белка) и использовании различных методик, если используется более одной стадии. Следует учесть, что подбор методов очистки может зависеть от: (а) природы примесей, что в свою очередь зависит от исходного препарата белка, подаваемого на очистку в способ; и (б) области применения очищенного белка. Так, например, при продуцировании белка в бактериальных системах получаемый препарат может содержать пирогены - бактериальные экзо- и эндотоксины, содержание которых необходимо контролировать, если белок будет использоваться в медицине или ветеринарии, особенно в виде форм для парентерального введения. Как правило, контролируют уровень липополисахаридов (ЛПС) с помощью, например, LAL-теста (ОФС. 1.2.4.0006.15 Бактериальные эндотоксины).
В различных воплощениях способа по изобретению могут быть использованы следующие хроматографические методики: ионообменная (ИОХ, IEX), гель-фильтрационная (или (сайз-)эксклюзионная; GF или SEC), гидрофобного взаимодействия (ГХ, HIC), обращенно-фазовая (ОФХ, RPC), аффинная (АС, АХ) и другие типы. В объем изобретения входят 1 или более одного (2, 3 или 4) этапов хроматографической очистки, и/или 1 или более одного (2, 3 или 4) типов хроматографической очистки. Предпочтительно, количество этапов и/или типов хроматографической очистки минимизировано, например 1 или 2 этапа/типа. Наиболее предпочтительно, используется 2 этапа очистки, представляющие собой 2 типа хроматографической очистки, например ионообменную хроматографию й хроматографию гидрофобного взаимодействия или любую комбинацию из любых двух вышеуказанных методик. Еще более предпочтитель- 5 044422 но, сначала проводят ИОХ, затем ГХ. Под указанным выше одним типом хроматографической очистки понимается также использование различных видов подвижной и/или неподвижной фаз, например, в случае ИОХ, - использование разных ионообменников (например, сильный/слабый).
В случае ИОХ, неподвижная фаза может быть выбрана, без ограничения, из диэтиламиноэтилцеллюлозы (DEAE целлюлоза), сефадекса с группами четвертичного аминоэтила (QAE сефадекс), сефарозы с группами четвертичного аммония (Q сефароза), карбоксиметилцеллюлозы (СМ целлюлоза), сульфопропилсефарозы (SP сефароза), полимера полистирола/дивинилбензола с метилсульфатными группами (SOURCE С) и т. п. Предпочтительно, используется SP сефароза.
В случае ГХ, неподвижная фаза имеет, без ограничения, группы фенил, октил, бутил и т. п., предпочтительная неподвижная фаза - бутилсефароза.
Различные примеры хроматографической очистки ИФР-1 известны специалистам в данной области (см., например, Ищук С. А. с соавт. Получение рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-1 и его действие на клетки нейробластомы in vitro. Медицинский академический журнал. 2018. Том 18. № 4).
После стадии хроматографической очистки проводят смену буферного раствора, в котором находится ИФР-1, любым известным специалистам способом с получением раствора ИФР-1, пригодного для использования в любых целях. В неограничивающих воплощениях может применяться любой из указанных методов: ультрафильтрация, диализ, эксклюзионная хроматография или иной метод и их комбинации (Flickinger, M.C., Reis, R.V. and Zydney, A.L. (2010). Protein Ultrafiltration. In Encyclopedia of Industrial Biotechnology, M.C. Flickinger (Ed.); Size Exclusion Chromatography. Principles and methods. Cytiva. CY12707-03Dec20-HB; Andrew, S.M., Titus, J.A. and Zumstein, L. (2001), Dialysis and Concentration of Protein Solutions. Current Protocols in Toxicology, 10: A.3H.1-A.3H.5). Конечный состав раствора ИФР-1 зависит от назначения получаемого белка, и может состоять из (помимо белка) воды или подходящего буфера (фосфатный, ацетатный и т. д.). В различных воплощениях, раствор ИФР-1 может также необязательно содержать ПАВ (например, твин-20) и/или консервант (например, бензиловый спирт). ИФР-1 (т.е. препарат, раствор, продукт, композиция ИФР-1), полученный способом очистки по изобретению пригоден для любых целей, например хранения, переработки, изготовления фармацевтических, ветеринарных, космецевтических, лабораторных и прочих препаратов, в том числе путем лиофилизации; или непосредственного использования в качестве биологически активного вещества. Настоящее изобретение также относится к препарату ИФР-1, полученному способом очистки по изобретению, и к применению этого препарата в медицине, спортивной индустрии, ветеринарии, космецевтике, лабораторных исследованиях.
Если в данной заявке не определено иное, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, имеют обычные для данной области техники значения, которые понятны специалистам. В общем, используемые номенклатура и методы клеточной и тканевой культуры, молекулярной биологии, микробиологии и химии белков и нуклеиновых кислот, гибридизации, аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описанные в данной заявке, представляют собой номенклатуру и методы, хорошо известные и обычно использующиеся в данной области.
Используемая здесь терминология предназначена для целей описания конкретных вариантов воплощения изобретения и не является ограничивающей. Когда в настоящем описании и формуле изобретения встречаются формы единственного числа, они также должны пониматься как альтернативно подразумевающие множественное число, если контекст явным образом не указывает на иное.
Любые раскрытые здесь числовые значения предусматривают варьирование в пределах погрешности измерений, обусловленной обычно применяемыми методами и оборудованием для каждого конкретного параметра. Таким образом, числовые значения также могут рассматриваться как характеризуемые термином приблизительно, около или примерно.
Термины включающий, содержащий, имеющий и т. п. означают, что помимо указанных элементов (например, ингредиентов) могут содержаться иные неоговоренные (несущественные) элементы. В каждом случае данные термины также охватывают значение состоящий из, т. е. в одном из воплощений подразумевают, что описываемый объект характеризуется наличием только указанных элементов.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.
Представленные далее примеры не ограничивают объем притязаний, который определяется формулой изобретения. Специалист будет понимать, что с учетом ограничений, накладываемых формулой, изобретение предполагает различные варианты воплощений, все из которых включены в объем защиты, обеспечиваемой патентом.
Пример 1. Получение и очистка рекомбинантного ИФР-1.
Получение биомассы, содержащей ИФР-1.
Получали ИФР-1 (GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGMVDE CCFRSC DLRRLEMYCAPLKPAKSA) способом, описанным в RU2711111: трансформировали клетки Е. coli BL21 Star (DE3) (Invitrogen, USA) вектором на основе плазмиды рЕТ28а(+), содержащей вставку, кодирующую ИФР-1; биомассу культивировали в биореакторах объемом 40 и 300 л. В ходе культивирования отслеживали показатели оптической плотности, рН, рО2. Клетки осаждают проточным центрифугированием. Проверяли количество целевого белка в биомассе методом электрофореза и в работу допускали только
- 6 044422 биомассу, имеющую удовлетворительные результаты анализа.
Выделение и отмывка телец включения.
Для всех работ использовали высокоочищенную воду с кондуктивностью менее ОД мкСм/см. Все процедуры взвешивания производили с помощью лабораторных весов с точностью измерения 0,01 г.
При приготовлении растворов объемы добавляемых реактивов измеряли с помощью мерных цилиндров.
Помещали навеску биомассы в емкость, содержащую первый отмывочный буфер (в соотношении биомасса:буфер, составляющем 1:10 (г:мл)), и ресуспендировали до однородного состояния с помощью миксера погружного типа, избегая вспенивания. Проводили дезинтеграцию клеток при помощи соникатора. Суспензию центрифугировали при 12000 об/мин, и по окончании центрифугирования осадок телец поместили в емкость, содержащую второй отмывочный буфер (в соотношении тельца:буфер, составляющем 1:10 (г:мл)), и гомогенизировали с помощью погружного миксера до однородности.
Отмывочные буферы содержат 2 М мочевины, 100 мМ TpucHCI, рН 7,0, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ, 2% Triton Х-100.
Солюбилизация и фолдинг.
Взвешивали отмытые тельца и затем тщательно ресуспендировали в солюбилизирующем растворе, содержащем 8 М мочевины и 25 мМ TpucHCI при рН 12,5, в соотношении тельца:буфер, составляющем 1:20 (г:мл). Затем к смеси добавляли 5 мМ ДТТ и инкубировали при перемешивании не менее получаса до полного растворения. К полученной смеси добавляли фолдирующий буфер, содержащий 1 М сахарозы, 40% изопропанола в соотношении 1:3 (млгмл), подводили рН до 10,5 гидроксидом натрия, затем добавляли 1 мМ цистеина и 1 мМ цистамина в порошке (концентрация относительно конечного объема смеси). Полученную фолдирующую смесь инкубировали при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение не менее 5 суток (общая продолжительность эксперимента - 8 суток), при этом отбирали пробу для ВЭЖХ раз в сутки для контроля процесса фолдирования.
По окончании фолдирования смесь при перемешивании разводили буфером для разведения, содержащим 15 мМ ацетата натрия, 1% полисорбата-20, в соотношении смесь:буфер, составляющем 1:3 (мл:мл). рН полученной смеси доводили до значения в диапазоне 5,4-5,7 с помощью уксусной кислоты. Затем добавили 30%-й пероксид водорода в соотношении 1:5000 (мл:мл) и инкубировали при комнатной температуре и перемешивании 30 мин.
Параллельно проводили контрольные эксперименты: в одном из них фолдинг проводили без использования редокс-пары, а в другом осуществляли способ согласно изобретению, но без добавления пероксида водорода. Выход в каждом случае посуточно показан на Фиг. 1. Как видно, добавление пероксида водорода существенным образом влияет на выход белка, по-видимому, обеспечивая обратимость связывания белка с неподвижной фазой колонки и его более эффективное элюирование. Время фолдинга (более 5 сут) существенно уменьшает потери белка на последующих стадиях, обеспечивая высокий выход. Использование цистеина-цистина позволяет повысить выход белка в большей степени.
Полученную суспензию центрифугировали при 3700 об/мин, супернатант отделяли и фильтровали через тканевый и капсульный фильтры.
Хроматография.
Очищали ИФР-1 на хроматографической колонке, содержащей SP Sepharose Fast Flow следующим образом. Колонку (объем сорбента SP Sepharose Fast Flow составляет 270 мл, 1 мл сорбента связывает 50 мг белка) при скорости потока 40 мл/мин промывали 300 мл очищенной воды для удаления раствора этанола, затем 1 М NaOH, затем опять водой. Промывали колонку 200 мл элюирующего буфера (буфер В (15 мМ ацетат натрия, 1% Твин-20, 1 М NaCl, pH 5,4) при скорости потока 40 мл/мин. Уравновешивали колонку 300 мл стартового буфера (буфер А (15 мМ ацетат натрия, 1% Твин-20, рН 5,4), при скорости потока 40 мл/мин. Наносили раствор белка (фильтрованный супернатант с предыдущей стадии) на колонку при скорости потока 40 мл/мин с помощью пробоотборного насоса. Промывали колонку 300 мл стартового буфера при скорости потока 40 мл/мин. Затем проводили элюирование в градиенте от 0 до 50% элюирующего буфера В за 35 минут при скорости потока 40 мл/мин. Собирали пик, соответствующий целевому белку, в емкость объемом 500 мл и измеряли полученный объем. Отбирали образец на анализ методом спектрофотометрии и оценивали количество полученного белка. Колонку регенерировали по программе CIP для SP Sepharose (2 М NaCl, 1 M NaOH) и консервировали. Измерение оптической плотности проводилось при длине волны 280 нм.
Далее проводили депирогенизацию белка на хроматографической колонке, содержащей бутилсефарозу, следующим образом. Колонку (объем сорбента составляет 314 мл) промывали при скорости потока 20 мл/мин 400 мл очищенной воды, затем 30%-м изопропанолом и водой, затем 1 М NaOH, потом опять водой и уравновешивали колонку 500 мл буфера А (1 М сульфата аммония, 50 мМ TpucHCl, рН 8) при скорости потока 20 мл/мин. Перед нанесением на колонку разводили раствор белка, полученный на предыдущем этапе, до концентрации 5 мг/мл 3 М сульфатом аммония и 1 М TpucHCl (рН 8) так, чтобы в конечном растворе было 1 М сульфата аммония и 50 мМ TpucHCI. Наносили полученный раствор белка на колонку при скорости потока 20 мл/мин с помощью пробоотборного насоса. Промывали колонку 400 мл стартового буфера (А) при скорости потока 20 мл/мин. Смывали белок 100% элюирующим буфером В (15 мМ ацетат натрия, 1% Твин-20, рН 5,4) за 35 минут при скорости потока 20 мл/мин. Собирали пик,
- 7 044422 соответствующий целевому белку, в емкость объемом 500 мл и измеряли объем полученного белка. Отбирали образец на анализ методом спектрофотометрии и оценивали количество полученного белка. Колонку регенерировали по программе CIP для бутилсефарозы (1М NaOH) и консервировали. Измерение оптической плотности проводилось при длине волны 280 нм.
Смена буфера.
Помещали раствор белка, полученный на предыдущем этапе, в диализный мешок с диаметром пор не менее чем в 2 раза меньше размера белка. Мешок с белком помещали в крупную ёмкость с буфером, содержащим 15 мМ ацетата натрия, 1% твина. Оставляли на 6 ч (из них 3 ч при перемешивании). Повторяли указанные манипуляции 3-4 раза и получали белковый раствор, по существу не содержащий сульфат аммония. Образцы разводили в буфере, содержащем 15 мМ ацетате натрия, 1% твин, 0,5% бензилового спирта, до концентрации 5 мг/мл, затем фильтровали через антибактериальный фильтр в чистые банки тёмного цвета. Полученный препарат хранили при +4°С. Отбирали образец для проведения контроля качества согласно ФСП, включающего в себя определение концентрации белка методом ВЭЖХ, определение количества белков штамма продуцента, определение количества ДНК штамма продуцента, определение остаточного количества ЛПС LAL-тестом. Продукт, полученный способом по изобретению, соответствует следующим показателям:
содержание ДНК штамма продуцента не более 3 нг/мл, содержание белков штамма продуцента не более 8 нг/мл, уровень ЛПС не более 12,5 ЕЭ/мл;
и, следовательно, пригоден для использования по назначению.
Хроматограммы ВЭЖХ для продукта, полученного по изобретению, и продукта, полученного традиционным способом, показаны на Фиг. 2 и 3, соответственно. На Фиг. 3 можно видеть множество изоформ белка, представленных в приблизительно равных соотношениях, что говорит о неоптимальности фолдирования; напротив, на Фиг. 2, соответствующей продукту по изобретению, можно видеть преобладание одного пика нативной формы белка, для подтверждения чего далее проверяли его активность.
Пример 2. Исследование активности очищенного белка.
В первую очередь проводили оценку ускорения клеточного роста. Оценивали влияние описанных в литературе низких концентраций гормона (разводили образцы до 4 нг/мл) на рост и дифференцировку клеток линии нейробластомы мыши Neuro2a. Как видно на микрофотографиях (Фиг. 4В) низкая концентрация гормона влияет на рост клеток: видно увеличение объема клеток, изменение строения (появляются характерные для нейронов отростки), но добавление 10% фетальной сыворотки, содержащей все необходимые для роста и дифференцировки гормоны и вещества, усиливает эффект. Поэтому в дальнейших экспериментах увеличивали концентрации гормона до 100 нг/мл. Далее проводили эксперимент с конверсией резазурина в резоруфин. Резазурин представляет собой феноксазиновый окислительновосстановительный индикатор. Имея синий или фиолетовый цвет, при восстановлении становится розовым флуоресцирующим резоруфином. Клетки, в том числе линии Neuro2a, во время метаболизма восстанавливают резазурин, а активность метаболизма пропорциональна уровню восстановления резазурина в флуоресцирующий резоруфин. Таким образом, по интенсивности свечения клеток в ультрафиолете можно определить активность добавленного гормона. В планшет с клетками в среде без сыворотки вносили одинаковое количество образца гормона, разведенного в 10000 раз. После инкубации клеток добавляли резазурин и инкубировали 4 ч для конверсии. Оценивали свечение визуально.
Как видно из фотографии (Фиг. 4Б), образец гормона активирует метаболизм клеток по отношению к образцу без добавления сыворотки, что видно даже невооруженным взглядом.
Для более точной оценки влияния продукта на клетки переносили культуральную среду без клеток в другой планшет и измеряли светимость на флуориметре BMG Clariostar по стандартному протоколу Resarufin. Как видно из полученных данных (Фиг. 4А), продукт имеет высокую активность (выше, чем в образце с добавлением сыворотки), и имеет активность, сравнимую со стандартом от Sigma.
Claims (6)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ очистки белка ИФР-1, включающий:а) денатурацию белка с помощью солюбилизирующего буфера, содержащего 7-8 М мочевины и 210 мМ дитиотреитола, с рН не менее 12,5;b) фолдинг белка;c) хроматографическую очистку;d) смену буферного раствора;причем стадия фолдинга (b) включает:b1) смешивание полученной на стадии (а) смеси с фолдирующим буфером в соотношении 1:2-1:3 об.:об., причем фолдирующий буфер содержит воду, стабилизатор, представляющий собой сахар или полиол, и пропанол; и с окислительно-восстановительным компонентом, представляющим собой цистеин и пистамин, который содержится в указанном фолдирующем буфере или добавляется отдельно; и инкубирование полученной смеси в течение не менее 5 суток;b2) разведение полученной на стадии (b1) смеси ацетатным буфером в соотношении 1:3-1:3,5 об.:об. таким образом, чтобы рН составлял 5,4-5,7;b3) добавление пероксида водорода к полученной на стадии (b2) смеси в концентрации 0,03-1,96 ммоль/л, инкубирование в течение не менее 30 мин;b4) центрифугирование полученной смеси и фильтрацию супернатанта, который затем направляют на стадию (с).
- 2. Способ по п.1, где пропанол представляет собой изопропанол, а сахар представляет собой сахарозу.
- 3. Способ по п.1 или 2, где стадия (с) включает хроматографическую очистку на сульфопропилсефарозе и на бутилсефарозе.
- 4. Способ по любому из пп.1-3, где стадию (d) смены буферного раствора выполняют методом ультрафильтрации, сайз-эксклюзионной хроматографии или диализа.
- 5. Способ по любому из пп.1-4, где концентрация каждого из цистеина и цистамина в образуемой на стадии (b1) смеси составляет 1-4 мМ.
- 6. Способ по любому из пп.1-5, где рН на стадии (b1) составляет 10,5.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044422B1 true EA044422B1 (ru) | 2023-08-25 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6903092B2 (ja) | 組換え産生ポリペプチドの精製 | |
| RU2698392C2 (ru) | Способ очистки фактора свертывания крови viii | |
| DE69635076T3 (de) | Verfahren zur kontrollierung der sialylierung von durch säugetierzellkultur hergestelltem protein | |
| JP2021193103A (ja) | ボツリヌス神経毒素を得るためのプロセスおよびシステム | |
| HUE029110T2 (en) | Cell culture medium for ADAMTS protein expression | |
| CN104540846B (zh) | 重新折叠来自包涵体的g‑csf的方法 | |
| JP4644604B2 (ja) | ２価陽イオン存在下加熱処理によるヒト血清アルブミンの製造方法 | |
| AU2008217189B2 (en) | Method of purification of hydrophobic proteins | |
| CN108642030A (zh) | 新重组因子c、其制造方法、及内毒素的测定法 | |
| CA2702048A1 (en) | Methods of manufacturing a biologic using a stable storage intermediate | |
| JP2016538267A (ja) | 抗体精製 | |
| EA022821B1 (ru) | Способ получения биологически активного рекомбинантного г-ксф человека | |
| TW201514197A (zh) | 類毒素、組合物及相關方法 | |
| JP2007039454A (ja) | ベジタリアンプロテインａ調製物およびその方法 | |
| WO2004045540A2 (en) | Method for continuous, automated blending of solutions from acids and bases | |
| CN105820232B (zh) | 单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及其制品和应用 | |
| Kachhawaha et al. | Bioprocessing of recombinant proteins from Escherichia coli inclusion bodies: insights from structure-function relationship for novel applications | |
| JP4399615B2 (ja) | トロンビンの安定化手段および組成物 | |
| EA044422B1 (ru) | Способ очистки ифр-1 | |
| Kadir et al. | Production and downstream processing of biotech compounds | |
| Luitjens et al. | Production and Purification of Recombinant Proteins | |
| Kadir et al. | Production and purification of recombinant proteins | |
| WO2018222723A1 (en) | C3 fusion protein and methods of making and using thereof | |
| Wistrand et al. | A Method for Removal of Endotoxin from Pharmaceutical Formulation | |
| Foster | The Effect of Downstream Processing Steps on Process Yield and Protein Quality |