EA041542B1

EA041542B1 - COMPOSITION FOR HANGOVER RELIEF CONTAINING SESAMOL AND PEPTIDE CONJUGATE AS ACTIVE INGREDIENT

Info

Publication number: EA041542B1
Application number: EA202090950
Authority: EA
Inventors: Йонг Джи Чунг; Эюн Ми Ким; Эюнг Джи Ли
Original assignee: Кареджен Ко., Лтд.
Priority date: 2017-10-16
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2022-11-03

Description

Уровень техники, к которой относится изобретениеThe level of technology to which the invention relates

Настоящее изобретение относится к конъюгату сезамола и пептида и к композиции для облегчения похмелья, содержащей конъюгат в качестве активного ингредиента.The present invention relates to a sesamol peptide conjugate and a hangover relief composition containing the conjugate as an active ingredient.

ВведениеIntroduction

Уровень Потребления алкоголя в Корее является одним из самых высоких в мире, а социальноэкономические и медицинские риски, связанные с употреблением алкоголя, быстро растут. Сообщалось, что чрезмерное употребление алкоголя затрагивает почти все системы организма, вызывая многочисленные заболевания, такие как заболевания печени, гастрит, панкреатит, повышение давления (гипертония), инсульт, диабет и болезни сердца.Korea's alcohol consumption rate is one of the highest in the world, and the socioeconomic and health risks associated with alcohol consumption are rising rapidly. Excessive alcohol consumption has been reported to affect almost every system in the body, causing numerous diseases such as liver disease, gastritis, pancreatitis, high blood pressure (hypertension), stroke, diabetes, and heart disease.

Согласно недавним результатам Национального опроса состояния здоровья и питания нации, проведенного Корейским институтом Здравоохранения и Социального Обеспечения при Министерстве Здравоохранения и Благосостояния, количество дней употребления алкоголя для взрослых старше 20 лет в Корее в среднем составляет около 8 дней в месяц, около 11 дней для мужчин и 4 дней для женщин. В то же время было установлено, что количество случаев опьянения составило приблизительно 4,7%, по крайней мере, один раз в неделю, приблизительно 10,7% от 1 до 3 раз в месяц и приблизительно 13,2% от 1 до 3 раз каждые 3 месяца, что, таким образом, представляет собой проблему с точки зрения национального здравоохранения.According to recent results from the National Health and Nutrition Survey conducted by the Korea Institute of Health and Welfare under the Ministry of Health and Welfare, the number of drinking days for adults over the age of 20 in Korea averages about 8 days per month, about 11 days for men and 4 days for women. At the same time, it was found that the incidence of intoxication was approximately 4.7% at least once a week, approximately 10.7% from 1 to 3 times a month and approximately 13.2% from 1 to 3 times every 3 months, which is thus a national health problem.

Таким образом, в настоящее время люди склонны выпивать чрезмерное количество алкоголя, превышающее норму, которая может контролироваться организмом человека, и интерес к медицинским препаратам или напиткам, способным устранять похмелье, неуклонно растет, в связи с чем рынок сбыта таких лекарственных препаратов в настоящее время по объему продаж превышает 100 млрд вон, что замечено даже зарубежными рынками сбыта.Thus, at present, people tend to drink excessive amounts of alcohol, more than the amount that can be controlled by the human body, and interest in drugs or drinks that can cure a hangover is steadily growing, and therefore the market for such drugs is currently sales volume exceeds 100 billion won, which is noticed even by overseas markets.

Похмелье определяют такие симптомами, как головная боль, диарея, анорексия, тошнота, рвота, озноб и холодный пот, появляющиеся после употребления алкоголя, а объективные симптомы включают снижение когнитивной и двигательной способности, гематологические и гормональные изменения. Известно, что причиной похмелья являются обезвоживание, токсикоз, вызываемый алкоголем и его метаболитами (ацетальдегид, формальдегид, ацетон и т.д.), и дефицит питательных веществ (дефицит сахара в крови, витаминов и минералов), вызванный нарушением абсорбции питательных веществ. Степень похмелья сильно варьируется в зависимости от индивидуальной предрасположенности (в зависимости от наследственности и образа жизни (степень упитанности/качество питания, состояние моторики, степень обезвоживания и общее состояние здоровья).Hangovers are defined by symptoms such as headache, diarrhea, anorexia, nausea, vomiting, chills, and cold sweats that appear after drinking alcohol, while objective symptoms include decreased cognitive and motor ability, hematological and hormonal changes. Hangovers are known to be caused by dehydration, toxicosis caused by alcohol and its metabolites (acetaldehyde, formaldehyde, acetone, etc.), and nutritional deficiencies (deficiency of blood sugar, vitamins and minerals) caused by impaired absorption of nutrients. The degree of hangover varies greatly depending on individual predisposition (depending on heredity and lifestyle (degree of fatness / quality of nutrition, motor status, degree of dehydration and general health).

После употребления алкоголь метаболизируется в организме тремя путями, в которых алкоголь метаболизируется до ацетальдегида и уксусной кислоты под действием алкогольдегидрогеназы и ацетальдегиддегидрогеназы, присутствующих в желудочно-кишечном тракте или печени при условии, что концентрация этанола низка, этанол метаболизируется в ацетальдегид и уксусную кислоту с помощью микросомальной системы окисления этанола (MEOS), присутствующей в эндоплазматической сети при условии что концентрация этанола высока, а затем на последнем этапе разлагается на диоксид углерода (СО₂) и воду (Н₂О) под действием каталазы, присутствующей в пероксисомах. При введении допустимого количества алкоголя вышеописанная метаболическая система действует плавно (скоординированно), так что симптомы, вызываемые алкогольным токсикозом, не возникают, но при введении большого количества алкоголя система метаболизма алкоголя выходит из сбалансированного состояния и не может поддерживать биогомеостаз, в результате чего возникает головная боль или чувство тяжести в голове, потеря концентрации, изжога и расстройство желудка как краткосрочные симптомы, а дисфункция печени может возникнуть в долгосрочной перспективе.After consumption, alcohol is metabolized in the body in three ways, in which alcohol is metabolized to acetaldehyde and acetic acid by the action of alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase present in the gastrointestinal tract or liver, provided that the concentration of ethanol is low, ethanol is metabolized into acetaldehyde and acetic acid by microsomal ethanol oxidation system (MEOS), present in the endoplasmic reticulum, provided that the concentration of ethanol is high, and then at the last stage decomposes into carbon dioxide (CO ₂ ) and water (H ₂ O) under the action of catalase present in peroxisomes. When an acceptable amount of alcohol is administered, the above metabolic system operates smoothly (coordinated) so that the symptoms caused by alcohol toxicosis do not occur, but when a large amount of alcohol is administered, the alcohol metabolism system becomes out of balance and cannot maintain biohomeostasis, resulting in headache. or a feeling of heaviness in the head, loss of concentration, heartburn, and indigestion as short-term symptoms, while liver dysfunction may occur in the long term.

Между тем, в настоящее время напитки от похмелья, содержащие экстракты астрагала, семян лотоса, зародышей риса и ховении, а также напитки от похмелья, содержащие ферментированный рисосоевый экстракт и порошок экстракта расторопши в качестве основного ингредиента, напитки от похмелья, содержащие экстракты ольхи и рябины в качестве активного ингредиента, являются коммерчески доступными, но, поскольку большинство из этих напитков содержат экстракты в качестве активных ингредиентов, обеспечение исходного сырья осуществляется с перебоями, а создание процессов или закупка оборудования, необходимого для экстракции в массовом производства является дорогостоящим. Кроме того, существует множество проблем, связанных с тем, что из-за самой природы экстрактов наблюдается значительная разница в степени уменьшения похмелья в зависимости от индивидуума, кроме того, для устранения похмелья требуется длительное время. По этой причине существует необходимость в разработке продукта, который был бы прост и эффективен как в области обеспечения исходного сырья, так и возможности массового производства, и мог бы одновременно решить проблему быстрой деградации алкоголя и облегчения похмелья за короткое время.Meanwhile, at present, hangover drinks containing astragalus, lotus seed, rice germ, and hovenia extracts, as well as hangover drinks containing fermented rice soy extract and milk thistle extract powder as the main ingredient, hangover drinks containing alder and rowan extracts as an active ingredient are commercially available, but since most of these drinks contain extracts as active ingredients, the supply of raw materials is intermittent, and it is costly to create the processes or purchase the equipment needed for mass production extraction. In addition, there are many problems that, due to the very nature of the extracts, there is a significant difference in the degree of hangover reduction depending on the individual, in addition, it takes a long time to eliminate the hangover. For this reason, there is a need to develop a product that is both simple and efficient in both raw material supply and mass production capability, and can simultaneously solve the problem of rapid alcohol degradation and hangover relief in a short time.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Задачей настоящего изобретения является создание конъюгата сезамола и пептида для облегчения состояния похмелья.The object of the present invention is to provide a sesamol-peptide conjugate for the relief of a hangover.

Другой задачей настоящего изобретения является создание композиции для снятия похмелья, содержащей конъюгат в качестве активного ингредиента.Another object of the present invention is to provide an anti-hangover composition containing a conjugate as an active ingredient.

- 1 041542- 1 041542

Еще одной задачей настоящего изобретения является создание способа снятия похмелья, включающего введение конъюгата или композиции, содержащей конъюгат в качестве активного ингредиента субъекту, нуждающемуся в этом.Another object of the present invention is to provide a method for relieving a hangover comprising administering a conjugate or a composition containing the conjugate as an active ingredient to a subject in need thereof.

Техническое решениеTechnical solution

Для решения вышеуказанных задач в одном аспекте настоящего изобретения предоставлена фармацевтическая композиция для предотвращения или облегчения похмелья, содержащая конъюгат сезамола и пептида в качестве активного ингредиента.In order to achieve the above objects, in one aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing or alleviating hangovers containing a sesamol-peptide conjugate as an active ingredient.

В другом аспекте настоящего изобретения предоставлены питательные вещества/пищевые добавки для предотвращения или облегчения похмелья, содержащие конъюгат сезамол и пептид в качестве активного ингредиента.In another aspect of the present invention, there are provided nutrients/food supplements for the prevention or relief of hangovers containing a sesamol-peptide conjugate as an active ingredient.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения представлен способ предотвращения или облегчения похмелья, включающий введение конъюгата сезамола и пептида или композиции, содержащей конъюгат, в качестве активного ингредиента субъекту, нуждающемуся в этом.In yet another aspect of the present invention, there is provided a method for preventing or alleviating a hangover comprising administering a sesamol conjugate and a peptide or composition containing the conjugate as an active ingredient to a subject in need thereof.

Преимущества изоретенияAdvantages of the invention

Согласно настоящему изобретению конъюгат сезамола и пептида предоставляет преимущества, заключающиеся в значительном улучшении активности алкогольдегидрогеназы (ADH) и альдегиддегидрогеназы (ALDH), участвующих в процессе деградации алкоголя и обеспечивающих быструю деградацию алкоголя в организме, а также улучшение состояния моторики, нарушенное алкоголем, в организме, благодаря чему данный конъюгат может быть с пользой применен в качестве активного ингредиента в композиции для облегчения похмелья.According to the present invention, the sesamol-peptide conjugate provides the advantages of significantly improving the activity of alcohol dehydrogenase (ADH) and aldehyde dehydrogenase (ALDH) involved in the process of alcohol degradation and ensuring the rapid degradation of alcohol in the body, as well as improving the state of alcohol-impaired motility in the body, whereby the conjugate can be usefully used as an active ingredient in a hangover relief composition.

Однако эффекты настоящего изобретения не ограничиваются вышеупомянутыми эффектами, и другие эффекты, не упомянутые здесь, будут понятны специалистам в данной области техники из следующего описания.However, the effects of the present invention are not limited to the above effects, and other effects not mentioned here will be understood by those skilled in the art from the following description.

Краткое описание фигурBrief description of the figures

Фиг. 1 представляет собой график, результаты которого подтверждают эффект увеличения активности альдегиддегидрогеназы (ALDH) при введении конъюгата сезамола и пептида, имеющего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1.Fig. 1 is a graph whose results confirm the effect of increasing aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity by administering a sesamol conjugate and a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

Фиг. 2 представляет собой график, результаты которого подтверждают эффект увеличения активности альдегиддегидрогеназы (ALDH) при введении конъюгата сезамола и пептида, имеющего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2.Fig. 2 is a graph whose results confirm the effect of increasing aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity by administering a sesamol conjugate and a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

Фиг. 3 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую результат подтверждения эффекта увеличения экспрессии мРНК алкогольдегидрогеназы (ADH) и ALDH при введении конъюгата сезамола и пептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и конъюгата сезамола и пептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 соответственно.Fig. 3 is a graph illustrating the result of confirming the effect of increasing expression of alcohol dehydrogenase (ADH) and ALDH mRNA by administering a sesamol-peptide conjugate having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a sesamol-peptide conjugate having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, respectively.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий результат подтверждения эффекта улучшения двигательной способности на модели мыши при введении конъюгатного комплекса, смешанного с конъюгатом сезамола и пептида в соответствии с настоящим изобретением.Fig. 4 is a graph showing the result of confirming the effect of improving locomotor ability in a mouse model by administering a conjugate complex mixed with a sesamol-peptide conjugate according to the present invention.

Фиг. 5 представляет собой график, показывающий результат подтверждения эффекта снижения концентрации альдегида в сыворотке на модели мыши при введении комплекса конъюгата, смешанного с конъюгатом сезамола и пептида в соответствии с настоящим изобретением.Fig. 5 is a graph showing the result of confirming the effect of lowering serum aldehyde concentration in a mouse model by administration of a complex of a conjugate mixed with a sesamol conjugate and a peptide according to the present invention.

Фиг. 6 представляет собой график, показывающий результат подтверждения эффекта снятия похмелья при введении комплекса конъюгата, смешанного с конъюгатом сезамола и пептида в соответствии с настоящим изобретением.Fig. 6 is a graph showing the confirmation result of the hangover-relieving effect of administering the complex of the conjugate mixed with the sesamol-peptide conjugate according to the present invention.

На фиг. 1-3 обозначение SEQ ID NO: 1 подразумевает группу, обработанную конъюгатом сезамола и пептида, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, а обозначение SEQ ID NO: 2 подразумевает группу, обработанную конъюгатом из сезамола и пептида, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. На фиг. 4-6 обозначение конъюгатный комплекс представляет собой группу, обработанную комплексом, смешанным с конъюгатом сезамола и пептида, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и конъюгатом сезамола и пептида, имеющим аминокислоту последовательность SEQ ID NO: 2 в массовом соотношении 1:1.In FIG. 1-3, SEQ ID NO: 1 refers to a group treated with a sesamol-peptide conjugate having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 2 refers to a group treated with a sesamol-peptide conjugate having the amino acid sequence of SEQ ID NO. : 2. In FIG. 4-6, the designation conjugate complex is a group treated with a complex mixed with a sesamol-peptide conjugate having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a sesamol-peptide conjugate having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in a 1:1 weight ratio.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Далее настоящее изобретение будет описано подробно.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

1. Фармацевтическая композиция для предотвращения или облегчения похмелья1. Pharmaceutical composition for the prevention or relief of a hangover

В одном аспекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция для предотвращения или облегчения похмелья, содержащая конъюгат сезамола и пептида в качестве активного ингредиента.In one aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for the prevention or relief of hangovers, comprising a sesamol-peptide conjugate as an active ingredient.

Сезамол представляет собой соединение с химической формулой С7Н₆О₃ и имеет химическую структуру, соответствующую следующей химической формуле 1.Sesamol is a compound with the chemical formula C7H ₆ O ₃ and has a chemical structure corresponding to the following chemical formula 1.

Химическая формула 1Chemical formula 1

Пептид относится к полимеру, состоящему из двух или более аминокислот, связанных пептиднымиA peptide refers to a polymer composed of two or more amino acids linked by peptide

- 2 041542 связями, и имеет недостаток, заключающийся в том, что пептид не может быть эффективно введен в ткань или клетку-мишень из-за слишком большого размера самого пептида, или пептид исчезает из организма за короткое время, имея короткий период полужизни. Соответственно пептид по настоящему изобретению содержит 20 или менее, предпочтительно 15 или менее, более предпочтительно 10 или менее аминокислот.- 2 041542 bonds, and has the disadvantage that the peptide cannot be effectively introduced into the target tissue or cell due to the too large size of the peptide itself, or the peptide disappears from the body in a short time, having a short half-life. Accordingly, the peptide of the present invention contains 20 or less, preferably 15 or less, more preferably 10 or less amino acids.

Пептид по настоящему изобретению может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 и может представлять собой варианты или фрагменты аминокислот, имеющих различающиеся последовательности вследствие делеций, инсерций и замен аминокислотных остатков или комбинации таковых, в пределах диапазона, не влияющего на функцию облегчения похмелья по настоящему изобретению. Аминокислотные замены на уровне пептида, которые не изменяет активность пептида в целом по ослаблению похмелья, известны в данной области техники. В некоторых случаях аминокислотные замены(модификации) могут быть осуществлены путем фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования и тому подобного. Соответственно, настоящее изобретение включает пептид, имеющий аминокислотную последовательность, по существу идентичную пептиду, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, варианты или активные фрагменты таковых. По существу, идентичный пептид представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую гомологию последовательности 75% или более, предпочтительно 80% или более, более предпочтительно 90% или более и наиболее предпочтительно 95% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 соответственно. Кроме того, пептид может дополнительно включать аминокислотную последовательность, предназначенную для определенной цели, например для удлинения целевой последовательности, увеличения периода полужизни или стабильности пептида, маркер или меченые остатки.The peptide of the present invention may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, and may be variants or fragments of amino acids having different sequences due to deletions, insertions, and substitutions of amino acid residues, or a combination thereof, within a range that does not affect hangover relief function of the present invention. Amino acid substitutions at the peptide level that do not alter hangover-relieving activity of the peptide as a whole are known in the art. In some cases, amino acid substitutions (modifications) can be made by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, and the like. Accordingly, the present invention includes a peptide having an amino acid sequence substantially identical to a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, variants or active fragments thereof. A substantially identical peptide is an amino acid sequence having a sequence homology of 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 respectively. In addition, the peptide may further include an amino acid sequence designed for a specific purpose, such as to extend the target sequence, increase the half-life or stability of the peptide, a marker, or labeled residues.

Кроме того, пептид по настоящему изобретению может быть получен различными способами, хорошо известными в данной области техники. В качестве примера пептид может быть получен с использованием рекомбинации полинуклеотида и белковой экспрессионой системы или получен методом синтеза in vitro с помошью химического синтеза, такого как пептидный синтез, метод синтеза белка в бесклеточных системах и тому подобное.In addition, the peptide of the present invention can be obtained by various methods well known in the art. As an example, a peptide can be produced using the recombination of a polynucleotide and a protein expression system, or produced by an in vitro synthesis method using chemical synthesis such as peptide synthesis, a cell-free protein synthesis method, and the like.

Кроме того, для улучшения химической стабильности и улучшенния фармакологических свойств (таких как период полужизни, абсорбция, титр, эффективность и т.д.), модификации специфичности (например, расширение спектра биологической активности) и сниженной антигенности N-конец пептида связывается с защитной группой, выбранной из списка, состоящего из ацетильной группы, флуоренилметоксикарбонильной группы, формильной группы, пальмитоильной группы, миристильной группы, стеарильной группы и полиэтиленгликоля (ПЭГ) для улучшения стабильности. При этом стабильность означает стабильность при хранении (например, стабильность при хранении при комнатной температуре), а также стабильность in vivo, которая обеспечивается защитой пептида по настоящему изобретению от атаки фермента, расщепляющего белок in vivo.In addition, to improve chemical stability and improve pharmacological properties (such as half-life, absorption, titer, potency, etc.), specificity modification (such as broadening the spectrum of biological activity) and reduced antigenicity, the N-terminus of the peptide is associated with a protective group selected from a list consisting of an acetyl group, a fluorenylmethoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group, a stearyl group, and polyethylene glycol (PEG) to improve stability. Here, stability means storage stability (eg, storage stability at room temperature) as well as in vivo stability, which is provided by protecting the peptide of the present invention from attack by an in vivo protein-cleaving enzyme.

Сезамол и пептид могут быть связаны друг с другом линкером. Линкер может представлять собой алифатическую, алициклическую или ароматическую дикарбоновую кислоту, предпочтительно алифатическую или алициклическую дикарбоновую кислоту и, более предпочтительно, алифатическую дикарбоновую кислоту. Более конкретно, алифатическая дикарбоновая кислота может представлять собой дикарбоновую кислоту, имеющую химическую структуру приведенной ниже химической формулы 2.Sesamol and the peptide may be linked to each other by a linker. The linker may be an aliphatic, alicyclic or aromatic dicarboxylic acid, preferably an aliphatic or alicyclic dicarboxylic acid, and more preferably an aliphatic dicarboxylic acid. More specifically, the aliphatic dicarboxylic acid may be a dicarboxylic acid having the chemical structure of the chemical formula 2 below.

Химическая Формула 2Chemical Formula 2

В химической формуле 2 R может представлять собой алкиленовую группу, имеющую от 1 до 12 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 10 атомов углерода и более предпочтительно от 1 до 6 атомов углерода; алкениленовую группу, имеющую от 2 до 12 атомов углерода, предпочтительно от 2 до 10 атомов углерода и более предпочтительно от 2 до 6 атомов углерода; или алкиниленовую группу, имеющую от 2 до 12 атомов углерода, предпочтительно от 2 до 10 атомов углерода и более предпочтительно от 2 до 6 атомов углерода.In the chemical formula 2, R may be an alkylene group having 1 to 12 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms, and more preferably 1 to 6 carbon atoms; an alkenylene group having 2 to 12 carbon atoms, preferably 2 to 10 carbon atoms, and more preferably 2 to 6 carbon atoms; or an alkynylene group having 2 to 12 carbon atoms, preferably 2 to 10 carbon atoms, and more preferably 2 to 6 carbon atoms.

В частности, линкер может представлять собой алифатическую насыщенную дикарбоновую кислоту, имеющую химическую структуру приведенной ниже химической формулы 3.In particular, the linker may be an aliphatic saturated dicarboxylic acid having the chemical structure of the chemical formula 3 below.

Химическая формула 3Chemical formula 3

О О но^снхЧэнOh Oh no^snhchen

В химической формуле 3 n представляет собой целое число от 1 до 12, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6 и наиболее предпочтительно от 1 до 4.In chemical formula 3, n is an integer from 1 to 12, preferably from 1 to 10, more preferably from 1 to 6, and most preferably from 1 to 4.

Карбоксильная группа на одной стороне дикарбоновой кислоты образует сложноэфирную связь с гидроксильной группой (-ОН) сезамола, а карбоксильная группа на другой стороне дикарбоновой кислоты образует пептидную связь с аминогруппой (-NH2), расположенной на N-конце пептида, таким обраThe carboxyl group on one side of the dicarboxylic acid forms an ester bond with the hydroxyl group (-OH) of sesamol, and the carboxyl group on the other side of the dicarboxylic acid forms a peptide bond with the amino group (-NH2) located at the N-terminus of the peptide, thus

- 3 041542 зом, что сезамол и пептид связаны друг с другом, образуя конъюгат по настоящему изобретению.- 3 041542 that sesamol and the peptide are linked to each other, forming a conjugate of the present invention.

Кроме того, конъюгат сезамола и пептида по настоящему изобретению может быть получен путем i) приготовления пептида, ii) связывания линкера с пептидом путем взаимодействия линкера с пептидом и iii) связывания сезамола с линкером посредством взаимодействия сезамола с линкером, связанным с пептидом.In addition, the sesamol-peptide conjugate of the present invention can be prepared by i) preparing a peptide, ii) linking a linker to a peptide by reacting a linker with a peptide, and iii) linking sesamol to a linker by reacting sesamol with a linker coupled to a peptide.

Кроме того, конъюгат сезамола и пептида может представлять собой конъюгат сезамола и пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, конъюгат сезамола и пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или смесь таковых.In addition, the sesamol-peptide conjugate may be a sesamol-peptide conjugate containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a sesamol-peptide conjugate containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a mixture thereof.

Для подтверждения эффекта увеличения активности альдегиддегидрогеназы (ALDH) при введении конъюгата сезамола и пептида по настоящему изобретению в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения клетки карциномы печени обрабатывали конъюгатом сезамола и пептида, представленного аминокислотной последовательностьи SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 соответственно, и затем проводили анализ активности ALDH. В результате было подтверждено, что активность ALDH возрастала зависимым от концентрации образом в клетках, обработанных конъюгатом сезамола и пептида по настоящему изобретению (см. фиг. 1 и 2).In order to confirm the effect of increasing aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity upon administration of the sesamol-peptide conjugate of the present invention, in a specific embodiment of the present invention, liver carcinoma cells were treated with the sesamol-peptide conjugate represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, respectively, and followed by analysis of ALDH activity. As a result, it was confirmed that ALDH activity increased in a concentration-dependent manner in cells treated with the sesamol-peptide conjugate of the present invention (see FIGS. 1 and 2).

В дополнение к этому, чтобы подтвердить эффект увеличения экспрессии алкогольдегидрогеназы (ADH) и ALDH, участвующих в процессе деградации алкоголя, наблюдаемый при применении конъюгата сезамола и пептида по настоящему изобретению, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения клетки карциномы печени обрабатывали конъюгатом сезамола и пептида, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 соответственно, и затем уровни экспрессии ADH и ALDH определяли с помощью ОТ-ПЦР. В результате исследований было подтверждено, что экспрессия мРНК ADH4, ALDH1 и ALDH2 значительно возрастала в клетках, обработанных конъюгатом сезамола и пептида по настоящему изобретению, по сравнению с необработанной контрольной группой (см. фиг. 3).In addition, in order to confirm the effect of increasing the expression of alcohol dehydrogenase (ADH) and ALDH involved in the process of alcohol degradation observed when using the sesamol-peptide conjugate of the present invention, in a specific embodiment of the present invention, liver carcinoma cells were treated with a sesamol-peptide conjugate having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, respectively, and then the expression levels of ADH and ALDH were determined by RT-PCR. As a result of the studies, it was confirmed that the expression of ADH4, ALDH1 and ALDH2 mRNA was significantly increased in cells treated with the sesamol-peptide conjugate of the present invention compared to the untreated control group (see Fig. 3).

Кроме того, для подтверждения эффекта улучшения двигательной способности, наблюдаемого при введении конъюгата сезамола и пептида по настоящему изобретению, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат сезамола и пептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, смешивали в массовом соотношении 1:1 и затем вводили мышиной модели, обработанной алкоголем, после чего проводили поведенческий тест. В результате было подтверждено, что группа, которой вводили комплекс конъюгата, значительно улучшала двигательную способность, сниженную при введении алкоголя (см. фиг. 4).In addition, in order to confirm the effect of improving the locomotor ability observed by the administration of the sesamol-peptide conjugate of the present invention, in a specific embodiment of the present invention, the sesamol-peptide conjugate having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 was mixed by weight 1:1 ratio and then administered to an alcohol-treated mouse model followed by a behavioral test. As a result, it was confirmed that the group administered with the conjugate complex significantly improved the locomotor ability reduced by the administration of alcohol (see FIG. 4).

Далее для подтверждения эффекта деградации алкоголя при введениии конъюгата сезамола и пептида по настоящему изобретению в конкретном воплощении настоящего изобретения комплекс конъюгата вводили мышиной модели, обработанной алкоголем, а затем проводили анализ альдегида в сыворотке мыши. В результате было подтверждено, что группа, которой вводили комплекс конъюгата, демонстрировала сниженную концентрацию альдегида в сыворотке (см. фиг. 5).Further, in order to confirm the effect of alcohol degradation upon administration of the sesamol-peptide conjugate of the present invention, in a specific embodiment of the present invention, the conjugate complex was administered to an alcohol-treated mouse model, and then the mouse serum aldehyde was analyzed. As a result, it was confirmed that the group administered with the conjugate complex showed a reduced serum aldehyde concentration (see FIG. 5).

Кроме того, чтобы подтвердить эффект снятия синдрома похмелья при введении конъюгата сезамола и пептида по настоящему изобретению, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения субъектов клинического испытания просили принять комплекс конъюгата вместе с алкоголем, а затем концентрацию алкоголя в крови измеряли через 1 и 2 ч. В результате было подтверждено, что е группа, которой вводили комплекс конъюгата, демонстрировала значительно сниженную концентрацию алкоголя в крови (см. фиг. 6).In addition, in order to confirm the hangover-relieving effect of administration of the sesamol-peptide conjugate of the present invention, in a specific embodiment of the present invention, the subjects of the clinical trial were asked to take the complex of the conjugate together with alcohol, and then the blood alcohol concentration was measured after 1 and 2 hours. As a result, it was confirmed that the e group, which was administered the conjugate complex, showed a significantly reduced blood alcohol concentration (see Fig. 6).

Соответственно конъюгат сезамола и пептида по настоящему изобретению значительно увеличивает активность алкогольдегидрогеназы или альдегиддегидрогеназы, участвующих в процессе деградации алкоголя, быстро снижает концентрацию алкоголя в организме и улучшает вызванное алкоголем расстройство моторики, тем самым демонстрируя пригодность для использования в качестве активного ингредиента в композиции для снятия похмелья.Accordingly, the sesamol-peptide conjugate of the present invention significantly increases the activity of alcohol dehydrogenase or aldehyde dehydrogenase involved in the process of alcohol degradation, rapidly reduces the concentration of alcohol in the body, and improves alcohol-induced dysmotility, thereby demonstrating suitability for use as an active ingredient in a hangover relief composition.

Между тем, конъюгаты сезамола и пептидов по настоящему изобретению можно вводить в фармацевтически приемлемых носителях, таких как коллоидные суспензии, порошки, физиологический раствор, липиды, липосомы, микросферы или наносферические частицы. Эти конъюгаты могут формировать комплекс или быть связаны в комплексе с носителем и могут доставляться in vivo с использованием систем транспортировки, известных в данной области, таких как липиды, липосомы, микрочастицы, золото, наночастицы, полимеры, реагенты для конденсации, полисахариды, полиаминокислоты, дендримеры, сапонин, вещества, улучшающие адсорбцию, или жирные кислоты.Meanwhile, the sesamol-peptide conjugates of the present invention can be administered in pharmaceutically acceptable vehicles such as colloidal suspensions, powders, saline, lipids, liposomes, microspheres or nanospherical particles. These conjugates may complex or be complexed with a carrier and may be delivered in vivo using transport systems known in the art such as lipids, liposomes, microparticles, gold, nanoparticles, polymers, condensation reagents, polysaccharides, polyamino acids, dendrimers. , saponin, adsorption enhancers or fatty acids.

Кроме того, фармацевтически приемлемый носитель может включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, камедь акации, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензат, метилгидроксибензоат тальк, стеарат магния и минеральное масло, которые обычно используются при приготовлении средств, но не ограничиваться таковыми. Кроме того, фармацевтическая композиция может дополнительно включать смазывающий агент, смачивающий агент, подслащивающий агент, ароматизатор, эмульгирующий агент, суспендирующий агент, консервант и тому подобное, в дополнение к вышеуказанным ингредиентам.In addition, a pharmaceutically acceptable carrier may include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, methylhydroxybenzoate talc , magnesium stearate and mineral oil, which are commonly used in the preparation of funds, but are not limited to. In addition, the pharmaceutical composition may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above ingredients.

- 4 041542- 4 041542

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться перорально или парентерально (например, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, внутрикожно или местно) в соответствии с протоколом желаемого способа, и доза варьируется в зависимости от состояния и веса пациента, степени заболевания, лекарственной формы, а также способа и времени введения, но может быть соответствующим образом определена специалистами в данной области техники.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (for example, intramuscularly, intravenously, intraperitoneally, subcutaneously, intradermally or topically) according to the protocol of the desired method, and the dose varies depending on the condition and weight of the patient, the degree of disease, dosage form, and also the method and time of administration, but may be determined by those skilled in the art as appropriate.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в фармацевтически эффективной дозе. В настоящем изобретении термин фармацевтически эффективная доза относится к достаточному количеству для лечения заболеваний, обладает приемлемым соотношением польза/риск, принятым в медицине, а эффективный уровень дозы может быть определен в соответствии с факторами, включающими тип и серьезность заболевания пациента, активность лекарственного средства, чувствительность к лекарственному средству, время введения, способ введения, скорость высвобождения, продолжительность лечения и учет одновременно используемых лекарственных средств, а также других факторов, хорошо известных в этой области медицины. Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может вводиться в виде отдельного терапевтического агента или в комбинации с другими средствами, способствующими ослаблению похмелья, и может вводиться одновременно, по отдельности или последовательно, или вместе с обычными средствами, снимающими похмелье, а также может вводиться однократно или многократно. Важно вводить количество, позволяющее получить максимальный эффект с минимальным количеством побочных эффектов, учитывая все факторы, что может быть легко определено специалистами в данной области техники.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective dose. In the present invention, the term pharmaceutically effective dose refers to a sufficient amount to treat diseases, has an acceptable benefit/risk ratio accepted in medicine, and the effective dose level can be determined in accordance with factors including the type and severity of the patient's disease, drug activity, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration, release rate, duration of treatment and consideration of concomitantly used drugs, as well as other factors well known in this field of medicine. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as a single therapeutic agent or in combination with other hangover alleviators, and may be administered simultaneously, singly or sequentially, or together with conventional hangover alleviators, and may also be administered singly or repeatedly. It is important to enter the amount that allows you to get the maximum effect with a minimum number of side effects, taking into account all factors that can be easily determined by experts in this field of technology.

В частности, эффективная доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению может варьироваться в зависимости от возраста, пола, состояния и веса пациента, степени абсорбции активного ингредиента in vivo, степени инактивации, степени экскреции, типа заболевания и лекарственных средств, которые должны использоваться в комбинации, и может быть увеличена или уменьшена в зависимости от пути введения, степени ожирения, пола, веса, возраста и тому подобного. Например, пептид по настоящему изобретению можно вводить в дозе от примерно 0,0001 мкг до 500 мг, предпочтительно от 0,01 мкг до 100 мг на 1 кг веса тела пациента в день.In particular, the effective dose of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, condition and weight of the patient, the degree of absorption of the active ingredient in vivo, the degree of inactivation, the degree of excretion, the type of disease and drugs to be used in combination, and may be increased or decreased depending on the route of administration, degree of obesity, sex, weight, age, and the like. For example, the peptide of the present invention can be administered at a dose of from about 0.0001 μg to 500 mg, preferably from 0.01 μg to 100 mg per kg of patient body weight per day.

2. Пищевая добавка для предотвращения или облегчения похмелья2. Food supplement to prevent or relieve hangovers

Другой аспект настоящего изобретения относится к пищевой добавке для предотвращения или облегчения похмелья, содержащей конъюгат сезамол и пептид в качестве активного ингредиента.Another aspect of the present invention relates to a food supplement for the prevention or relief of hangovers containing a sesamol-peptide conjugate as an active ingredient.

Конъюгат сезамола и пептида является тем же самым, что и конъюгат сезамола и пептида, описанный в разделе № 1. Фармацевтическая композиция для предотвращения или облегчения похмелья и, таким образом, для подробного описания см. раздел № 1. Фармацевтическая композиция для предотвращения или облегчения похмелья и далее будет описана только конкретная конфигурация пищевой добавки.The sesamol-peptide conjugate is the same as the sesamol-peptide conjugate described in section No. 1. Pharmaceutical composition for preventing or alleviating a hangover and thus see section No. 1 for a detailed description. Pharmaceutical composition for preventing or alleviating a hangover and hereinafter, only the specific configuration of the nutritional supplement will be described.

Как и фармацевтическая композиция конъюгат сезамола и пептида по настоящему изобретению значительно повышает активность алкогольдегидрогеназы или альдегиддегидрогеназы, участвующих в процессе деградации алкоголя, быстро снижает концентрацию алкоголя в организме и улучшает вызванное алкоголем расстройство моторики, тем самым являясь выгодным для использования в качестве активного ингредиента в пищевой добавке для облегчения похмелья.Like the pharmaceutical composition, the sesamol-peptide conjugate of the present invention significantly increases the activity of alcohol dehydrogenase or aldehyde dehydrogenase involved in the process of alcohol degradation, rapidly reduces the concentration of alcohol in the body, and improves alcohol-induced dysmotility, thereby being beneficial for use as an active ingredient in dietary supplement to relieve a hangover.

В пищевой добавке по настоящему изобретению активный ингредиент может быть добавлен к пищевому продукту, как есть, или употребляться вместе с другими пищевыми продуктами или пищевыми ингредиентами, а также может быть соответствующим образом использован в соответствии с общим способом. Количество смешиваемых активных ингредиентов может быть подходящим способом определено в соответствии с целью их использования (для предотвращения или улучшения симптома). В общем, при приготовлении пищевых продуктов или напитков композицию по настоящему изобретению можно добавлять в количестве предпочтительно 15 мас.% или менее, более предпочтительно 10 мас.% или менее по отношению к основному сырьевому материалу. Тем не менее, в случае длительного приема с целью охраны здоровья и гигиены или соответствия медицинским нормам количество может быть равно или ниже, чем вышеупомянутый диапазон.In the dietary supplement of the present invention, the active ingredient can be added to the food product as it is, or consumed together with other food products or food ingredients, and can also be appropriately used in accordance with the general method. The amount of active ingredients to be mixed can be suitably determined according to the purpose of their use (to prevent or improve a symptom). In general, in the preparation of foodstuffs or beverages, the composition of the present invention can be added in an amount of preferably 15 wt.% or less, more preferably 10 wt.% or less, relative to the main raw material. However, in the case of long-term use for the purpose of health and hygiene or medical compliance, the amount may be equal to or lower than the above range.

Пищевая добавка по настоящему изобретению может содержать другие ингредиенты в качестве основных ингредиентов без особых ограничений, в дополнение к активным ингредиентам. Например, в обычных напитках в качестве дополнительного ингредиента могут содержаться различные вкусовые агенты или натуральные углеводы. Примеры вышеупомянутых природных углеводов могут включать обычные сахара, такие как моносахариды, такие как глюкоза, фруктоза и тому подобное; дисахариды, такие как мальтоза, сахароза и т.п.; и полисахариды, такие как декстрин, циклодекстрин и тому подобное, и сахарные спирты, такие как ксилит, сорбит, эритрит и тому подобное. В качестве ароматизирующих агентов, отличных от описанных выше, могут быть выгодно использованы натуральные ароматизирующие агенты (тауматин, экстракт стевии (например, ребаудиозид А, глициргинин и т.д.) и синтетические ароматизирующие агенты (сахарин, аспартам и т.д.). Соотношение природных углеводов может быть соответствующим образом определено специалистом в данной области техники.The nutritional supplement of the present invention may contain other ingredients as main ingredients without particular limitation, in addition to the active ingredients. For example, conventional beverages may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as an additional ingredient. Examples of the above natural carbohydrates may include common sugars such as monosaccharides such as glucose, fructose and the like; disaccharides such as maltose, sucrose and the like; and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, erythritol and the like. As flavoring agents other than those described above, natural flavoring agents (thaumatin, stevia extract (eg rebaudioside A, glycyrginine, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. The ratio of natural carbohydrates can be appropriately determined by a person skilled in the art.

Кроме того, пищевая добавка по настоящему изобретению может содержать различные питательные вещества, витамины, минералы (электролиты), ароматизаторы, такие как синтетические и натуральIn addition, the nutritional supplement of the present invention may contain various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic and natural

- 5 041542 ные ароматизаторы, красители и усилители (сыр, шоколад и т.д.), пектиновую кислоту и соли таковой, альгиновую кислоту и соли таковой, органическая кислота, защитный коллоидный загуститель, регулятор рН, стабилизатор, консервант, глицерин, спирт, агент углекислоты, используемый в газированном напитке, и тому подобное. Эти ингредиенты могут быть использованы независимо или в комбинации, и соотношение этих добавок может быть легко определено специалистом в данной области техники.- 5 041542 flavors, colors and enhancers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acid, protective colloidal thickener, pH regulator, stabilizer, preservative, glycerin, alcohol, a carbonic acid agent used in a carbonated beverage; and the like. These ingredients can be used independently or in combination, and the ratio of these additives can be easily determined by a person skilled in the art.

3. Способ предотвращения или облегчения похмелья3. A way to prevent or alleviate a hangover

Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет способ предотвращения или облегчения похмелья, включающий введение конъюгата сезамола и пептида или композиции, содержащей конъюгат, в качестве активного ингредиента субъекту, нуждающемуся в этом.Another aspect of the present invention provides a method for preventing or alleviating a hangover comprising administering a sesamol conjugate and a peptide or composition containing the conjugate as an active ingredient to a subject in need thereof.

Конъюгат сезамола и пептида является тем же самым, что конъюгат сезамола и пептида, раскрытый в разделе № 1. Фармацевтическая композиция для предотвращения или облегчения похмелья и, таким образом, подробное описание см. в разделе № 1. Фармацевтическая композиция для предотвращения или облегчения похмелья.The sesamol-peptide conjugate is the same as the sesamol-peptide conjugate disclosed in section No. 1. Pharmaceutical composition for preventing or alleviating hangovers and thus see section No. 1 for detailed description. Pharmaceutical composition for preventing or alleviating hangovers.

Как описано выше, конъюгат сезамола и пептида по настоящему изобретению или композиция, содержащий конъюгат в качестве активного ингредиента, например, фармацевтическая композиция или пищевая добавка, может быстро деградировать алкоголь в организме и улучшать вызванное алкоголем расстройство моторики, тем самым обеспечивая значительный эффект снятия похмелья при введении конъюгата или композиции субъекту, например, человеку, нуждающийся в этом.As described above, the sesamol-peptide conjugate of the present invention or a composition containing the conjugate as an active ingredient, such as a pharmaceutical composition or a dietary supplement, can quickly degrade alcohol in the body and improve alcohol-induced dysmotility, thereby providing a significant effect of relieving hangover in administering the conjugate or composition to a subject, such as a human, in need thereof.

Далее настоящее изобретение будет подробно описано с помощью примеров приготовления и экспериментальных примеров.Hereinafter, the present invention will be described in detail using preparation examples and experimental examples.

Тем не менее, последующие примеры приготовления и экспериментальные примеры просто иллюстрируют настоящее изобретение, поэтому содержание настоящего изобретения не может быть ограничено следующими примерами приготовления и экспериментальными примерами.However, the following preparation examples and experimental examples merely illustrate the present invention, so the content of the present invention cannot be limited to the following preparation examples and experimental examples.

Пример получения 1. Получение сукцинилированного пептида.Production Example 1. Production of a succinylated peptide.

Пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, раскрытые в последующей табл. 1, соответственно, синтезировали с помощью автоматического пептидного синтезатора (Milligen 9050, Millipore, США) и каждый пептид (1 ммоль) и янтарный ангидрид (200 мг, 2,0 экв.) растворяли в N, N-диметилформамиде (ДМФА, 10 мл) и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (DIEA) (388 мг, 3,0 экв.), реакцию проводили при комнатной температуре в течение 2 ч для сукцинилирования каждого пептида. Эти синтезированные сукцинилированные пептиды были очищены по-отдельности с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой С18 (HLPC) (Waters Associates, США). Использовалась колонка ACQUITY UPLC BEH300 С18 (2,1 на 100, 1,7 мкм, Waters Co, США).A peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are disclosed in the following table. 1, respectively, was synthesized using an automatic peptide synthesizer (Milligen 9050, Millipore, USA) and each peptide (1 mmol) and succinic anhydride (200 mg, 2.0 eq.) was dissolved in N,N-dimethylformamide (DMF, 10 ml ) and N,N-diisopropylethylamine (DIEA) (388 mg, 3.0 eq.) was added, the reaction was carried out at room temperature for 2 h to succinylate each peptide. These synthesized succinylated peptides were individually purified using C18 reverse phase high performance liquid chromatography (HLPC) (Waters Associates, USA). An ACQUITY UPLC BEH300 C18 column (2.1 per 100, 1.7 µm, Waters Co, USA) was used.

Таблица 11Table 11

№ Последовательности Sequence No. Аминокислотная последовательность Amino acid sequence 1 1 SIPCKLQSG SIPCKLQSG 2 2 WLNRRAN WLNRRAN

Пример приготовления 2. Приготовление конъюгата сезамола и пептида по настоящему изобретению.Preparation Example 2 Preparation of the sesamol-peptide conjugate of the present invention.

В пептидном реакторе к сукцинилированному пептиду (1 ммоль), полученному в примере получения 1, растворенному в диметилформамиде (ДМФ, 10 мл), добавляли 1-гидроксибензотриазол (HOBt, 270 мг, 2,0 экв.), (бензотриазол-1-илокси)трипирролидинофосфонийгексафторфосфат (РуВОР, 1,04 г, 2,0 экв.) и сезамол (277 мг, 2,0 экв.) и перемешивали в течение 30 мин. К смеси добавляли N,Nдиизопропилэтиламин (DIEA, 388 мг, 3 экв.) и проводили реакцию в течение 4 ч при комнатной температуре, а затем подвергали процессам перекристаллизации, фильтрации и сушки с использованием диэтилового эфира (10 мл, 10 ммоль) с целью получения конъюгата сезамола и пептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и конъюгата сезамола и пептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 соответственно.In the peptide reactor, to the succinylated peptide (1 mmol) obtained in Preparation Example 1, dissolved in dimethylformamide (DMF, 10 ml), was added 1-hydroxybenzotriazole (HOBt, 270 mg, 2.0 eq.), (benzotriazol-1-yloxy ) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP, 1.04 g, 2.0 eq.) and sesamol (277 mg, 2.0 eq.) and stirred for 30 minutes. N,N-diisopropylethylamine (DIEA, 388 mg, 3 eq.) was added to the mixture and reacted for 4 hours at room temperature, and then subjected to recrystallization, filtration and drying processes using diethyl ether (10 ml, 10 mmol) to obtain a sesamol-peptide conjugate having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and a sesamol-peptide conjugate having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, respectively.

Экспериментальный пример 1. Подтверждение эффекта повышения активности альдегиддегидрогеназы.Experimental Example 1 Confirmation of the effect of increasing the activity of aldehyde dehydrogenase.

Алкоголь конвертировали в ацетальдегид с помощью алкогольдегидрогеназы (ADH), фермента деградации алкоголя и полученный ацетальдегид конвертировали и окисляли до ацетата с помощью альдегиддегидрогеназы (ALDH). Поэтому, чтобы подтвердить эффект увеличения активности ALDH, участвующей в процессе деградации алкоголя, клетки карциномы печени обрабатывали конъюгатами сезамола и пептидов обоих типов, полученных в примере приготовления 2, и затем проводился анализ активности ALDH.Alcohol was converted to acetaldehyde using alcohol dehydrogenase (ADH), an alcohol degradation enzyme and the resulting acetaldehyde was converted and oxidized to acetate using aldehyde dehydrogenase (ALDH). Therefore, in order to confirm the effect of increasing the activity of ALDH involved in the process of alcohol degradation, liver carcinoma cells were treated with the conjugates of sesamol and peptides of both types prepared in Preparation Example 2, and then the ALDH activity was analyzed.

В частности, клетки гепатоцеллюлярной карциномы печени (HepG2), представляющие собой клетки карциномы печени человека, инокулировали в 6-луночный планшет с плотностью 4х10⁵ клеток/на лунку и затем инкубировали в течение ночи. После этого оба типа конъюгатов сезамола и пептидов, полученных в примере получения 2, применяли в концентрации 50 или 100 мкМ соответственно, и инкубировали в течение 24 ч, затем клетки собирали и анализировали активность ALDH с использованием наSpecifically, liver hepatocellular carcinoma (HepG2) cells, which are human liver carcinoma cells, were inoculated into a 6-well plate at a density of 4×10 ⁵ cells/well, and then incubated overnight. After that, both types of sesamol and peptide conjugates obtained in Preparation Example 2 were used at a concentration of 50 or 100 μM, respectively, and incubated for 24 h, then the cells were collected and analyzed for ALDH activity using

- 6 041542 бора для анализа активности ALDH (abcam, ab155893). Тем временем группу позитивного контроля обрабатывали 5 мкМ сульфолафаном.- 6 041542 boron for the analysis of ALDH activity (abcam, ab155893). Meanwhile, the positive control group was treated with 5 μM sulfolaphane.

Для анализа активности ALDH каждую из собранных клеток обрабатывали буфером для анализа активности ALDH, включенным в набор, а затем лизировали гомогенизатором во льду. После этого клетки центрифугировали при условиях 4°С и 13000 об/мин в течение 10 мин, а затем собирали супернатант. Собранный супернатант обрабатывали буфером для анализа ALDH, субстратом ALDH и ацетальдегидом и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 ч, затем измеряли оптическую плотность спектрофотометром при 450 нм в течение 20 мин с интервалами в 2 мин. После этого активность ALDH рассчитывали по следующей формуле уравнения 1.To assay ALDH activity, each of the harvested cells was treated with the ALDH activity assay buffer included in the kit and then lysed with an on-ice homogenizer. After that, the cells were centrifuged at 4°C and 13,000 rpm for 10 min, and then the supernatant was collected. The collected supernatant was treated with ALDH assay buffer, ALDH substrate and acetaldehyde and reacted at room temperature for 1 hour, then measured absorbance with a spectrophotometer at 450 nm for 20 minutes at 2 minute intervals. Thereafter, ALDH activity was calculated using the following formula of Equation 1.

Уравнение 1 кEquation 1 to

Активность ALDH= X Увеличение разведения=нмоль/мин/мл=мЕ/мл гдеALDH activity= X Dilution increase=nmol/min/ml=mU/ml where

B - количество NADH (нмоль), полученное в экспериментальной группе;B is the amount of NADH (nmol) obtained in the experimental group;

АТ - время реакции (мин);AT - reaction time (min);

V - объем (мл) экспериментальной группы, используемой в реакционной лунке.V is the volume (ml) of the experimental group used in the reaction well.

В результате, как показано на фиг. 1 и 2, было подтверждено, что оба типа конъюгатов сезамола и пептида по настоящему изобретению значительно увеличивали активность ALDH по сравнению с необработанной контрольной группой соответственно (фиг. 1 и 2).As a result, as shown in FIG. 1 and 2, it was confirmed that both types of sesamol and peptide conjugates of the present invention significantly increased ALDH activity compared to the untreated control group, respectively (FIGS. 1 and 2).

Экспериментальный пример 2. Подтверждение эффекта увеличения экспрессии ADH и ALDH.Experimental Example 2 Confirmation of the effect of increasing the expression of ADH and ALDH.

С целью подтверждения эффекта увеличения экспрессии ADH и ALDH, участвующих в процессе деградации алкоголя, клетки карциномы печени обрабатывали конъюгатами сезамола и пептидов обоих типов, полученных в примере получения 2 соответственно, а затем проводили ОТ-ПЦР.In order to confirm the effect of increasing the expression of ADH and ALDH involved in the process of alcohol degradation, liver carcinoma cells were treated with conjugates of sesamol and peptides of both types obtained in Preparation Example 2, respectively, and then RT-PCR was performed.

В частности, клетки HepG2 инокулировали в 6-луночный планшет при плотности 4 х10⁵ клеток/на лунку и затем инкубировали в течение ночи. После этого оба типа конъюгатов сезамола и пептидов, полученных в примере получения 2, применяли для обработки в концентрации 10 или 50 мкМ соответственно и инкубировали в течение 6 ч, затем клетки собирали. После этого из собранных клеток выделяли общую РНК в соответствии с протоколом производителя, используя Trizol (Invitrogen, США), а затем 1 мкг выделенной РНК использовали для синтеза кДНК в соответствии с протоколом производителя, используя набор для синтеза кДНК (Intron, Корея), к ДНК подвергали ПЦР с использованием праймеров, представленных в приведенной ниже табл. 2, и затем подвергали электрофорезу в 5% агарозном геле для определения уровней экспрессии мРНК ADH4, ALDH1 и ALDH2.Specifically, HepG2 cells were inoculated into a 6-well plate at a density of 4 x 10 ⁵ cells/well and then incubated overnight. Thereafter, both types of sesamol-peptide conjugates prepared in Preparation Example 2 were treated at a concentration of 10 or 50 μM, respectively, and incubated for 6 hours, then the cells were harvested. After that, total RNA was isolated from the collected cells according to the manufacturer's protocol using Trizol (Invitrogen, USA), and then 1 µg of the isolated RNA was used for cDNA synthesis according to the manufacturer's protocol using a cDNA synthesis kit (Intron, Korea), DNA was subjected to PCR using the primers shown in the table below. 2 and then subjected to 5% agarose gel electrophoresis to determine the expression levels of ADH4, ALDH1 and ALDH2 mRNA.

Таблица 2table 2

Праймер primer Последовательность (5’—>3’) Sequence (5'—>3') № последовательности No. sequences ADH4 ADH4 Прямой Straight CTGAAACCATGAAAGCAGCC CTGAAACCATGAAAGCAGCC 3 3 Обратный Back GCCGATTATTAGCTCCTCTGG GCCGATTATTAGCTCCTCTGG 4 4 ALDH1 ALDH1 Прямой Straight GGAGCCAAAAGGGTCATCAT GGAGCCAAAAGGGTCATCAT 5 5 Обратный Back GTGATGGCATGGACTGTGGT GTGATGGCATGGACTGTGGT 6 6 ALDH2 ALDH2 Прямой Straight CAAATTACAGGGTCAACTGCT АТ CAAATTACAGGGTCAACTGCT AT 7 7 Обратный Back CCACACTCACAGTTTTCACTT С CCACACTCACAGTTTTTCACTT WITH 8 8

В результате, как показано на фиг. 3, было подтверждено, что оба типа конъюгатов сезамола и пептида по настоящему изобретению значительно увеличивали экспрессию мРНК ADH4, ALDH1 и ALDH2 по сравнению с независимой контрольной группой соответственно (см. фиг. 3). Для быстрой деградации алкоголя необходимо индукция этого процесса путем увеличения активности ADH и ALDH, которые являются ферментами, участвующими в деградации алкоголя, и, таким образом, по результатам Экспериментального примера 1 и Экспериментального примера 2, можно видеть, что конъюгаты сезамола и пептидов по настоящему изобретению значительно увеличивают активность и экспрессию ADH и ALDH, что способствует быстрой деградации алкоголя.As a result, as shown in FIG. 3, it was confirmed that both types of sesamol-peptide conjugates of the present invention significantly increased the expression of ADH4, ALDH1 and ALDH2 mRNA compared to an independent control group, respectively (see FIG. 3). Rapid alcohol degradation requires the induction of this process by increasing the activity of ADH and ALDH, which are enzymes involved in alcohol degradation, and thus, from the results of Experimental Example 1 and Experimental Example 2, it can be seen that the sesamol-peptide conjugates of the present invention significantly increase the activity and expression of ADH and ALDH, which contributes to the rapid degradation of alcohol.

Экспериментальный пример 3. Подтверждение эффекта улучшения двигательной моторики на модели мышей, получавших алкогольExperimental Example 3 Confirmation of the effect of improving motor skills in a mouse model treated with alcohol

Для подтверждения эффекта улучшения двигательной моторики на модельном животном, которому вводили алкоголь, после того как в животное были введены конъюгат сезамола и пептида, полученного в примере получения 2, и алкоголь, был проведен поведенческий тест с использованием устройства Rotarod.To confirm the effect of improving locomotor skills in a model animal administered with alcohol after the sesamol-peptide conjugate obtained in Preparation Example 2 and alcohol were administered to the animal, a behavioral test was performed using a Rotarod device.

В частности, 8-недельных самцов мышей Balb/c использовавшихся в качестве мышиной модели, подготавливали в течение 1 недели при свободном кормлении твердым кормом и водопроводной водой, а затем использовали для теста. Кроме того, мышей разделили на (1) обычную контрольную группу, (2) группу, получавшую алкоголь, и (3) экспериментальную группу и использовали для эксперимента в количестве 5 мышей на группу.In particular, 8-week-old male Balb/c mice, used as a mouse model, were prepared for 1 week on free-fed solid food and tap water, and then used for the test. In addition, mice were divided into (1) normal control group, (2) alcohol treated group, and (3) experimental group, and used for the experiment in the amount of 5 mice per group.

- 7 041542- 7 041542

Для проведения поведенческого теста мышей помещали на устройство Rota-rod и подвергали адаптивной тренировке три или более раза.For the behavioral test, mice were placed on the Rota-rod device and subjected to adaptive training three or more times.

Перед проведением поведенческого теста мышей, которых держали натощак в течение 4 ч, помещали в устройство Rota-rod перед введением алкоголя, где те ходили/передвигались в условиях постепенного увеличения числа оборотов в минуту с 4 до 40 об/мин, до потери двигательной способности и падения; время, прошедшее до падения на нижнюю подставку, было измерено и преобразовано во вторичные единицы для получения значения времени сопротивляемости падению (с).Prior to the behavioral test, mice that had been fasted for 4 h were placed in a Rota-rod device prior to alcohol administration, where they walked/walked under conditions of gradual increase in RPM from 4 to 40 RPM, until loss of locomotor ability and falls; the time elapsed before falling onto the bottom stand was measured and converted into secondary units to obtain a fall resistance time value (s).

После этого конъюгат сезамола и пептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и конъюгат сезамола и пептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, смешивали в массовом соотношении 1:1, для получения комплекса (далее называемого конъюгатный комплекс), а затем комплекс растворяли в воде и вводили мышам экспериментальной группы перорально в дозе 100 мг/кг и затем оставляли на 30 мин. Параллельно тот же самый объем воды вводился перорально контрольной группе. Впоследствии 20% алкоголь вводили перорально каждой мыши в группе, получавшей алкоголь, и в экспериментальной группе по 400 мкл на субъекта, и через 30 мин, 1 и 2 ч были получены значения сопротивляемости падению (в секундах) для каждой группы при использовании устройство Rota-rod так, как описано выше.Thereafter, a sesamol-peptide conjugate having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a sesamol-peptide conjugate having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 were mixed in a 1:1 mass ratio to obtain a complex (hereinafter referred to as a conjugate complex), and then the complex was dissolved in water and administered to mice of the experimental group orally at a dose of 100 mg/kg and then left for 30 minutes. In parallel, the same volume of water was administered orally to the control group. Subsequently, 20% alcohol was orally administered to each mouse in the alcohol treated group and in the experimental group at 400 μl per subject, and after 30 min, 1 and 2 h, fall resistance values (in seconds) were obtained for each group using the Rota- rod as described above.

В результате, как показано на фиг. 4, до проведения поведенческого теста нормальная контрольная группа, группа, получавшая алкоголь, и экспериментальная группа имели среднее значение сопротивляемости падению (с) около 250, и все три группы имели одинаковые значения сопротивляемости падению (с).As a result, as shown in FIG. 4, before the behavior test, the normal control group, the alcohol-treated group, and the experimental group had an average fall resistance (c) value of about 250, and all three groups had the same fall resistance (c) values.

С другой стороны, в результате проведения поведенческого теста после 30 мин, 1 и 2 ч после введения алкоголя было подтверждено, что группа, получившая алкоголь, значительно уменьшила значение сопротивляемости падению (сек), в то время как экспериментальная группа, которой вводили конъюгатный комплекс по настоящему изобретению вместе с алкоголем, значительно увеличивала значение сопротивляемости падению (с) по сравнению с группой, которой вводили алкоголь (фиг. 4).On the other hand, as a result of conducting a behavioral test after 30 minutes, 1 and 2 hours after alcohol administration, it was confirmed that the group receiving alcohol significantly reduced the value of the resistance to falling (sec), while the experimental group that was administered the conjugate of the present invention, together with alcohol, significantly increased the fall resistance value (c) compared to the alcohol-administered group (FIG. 4).

Из приведенных выше результатов видно, что конъюгаты сезамола и пептидов по настоящему изобретению значительно улучшают двигательную моторику, снижающуюся при употреблении алкоголя.From the above results, it can be seen that the sesamol-peptide conjugates of the present invention significantly improve alcohol-decreased motor skills.

Экспериментальный пример 4. Подтверждение эффекта деградации алкоголя на мышиной модели с введением алкоголя.Experimental example 4. Confirmation of the effect of alcohol degradation in a mouse model with the introduction of alcohol.

Чтобы подтвердить эффект деградации алкоголя на животных моделях, которым вводили алкоголь, проводили анализ содержания альдегида в мышиной сыворотке.To confirm the effect of alcohol degradation in animal models injected with alcohol, an analysis of the content of aldehyde in mouse serum was performed.

В частности, были взяты пробы крови в ® нормальной контрольной группе, в @ группе, получавшей алкоголь, и в ® экспериментальной группе после завершения поведенческого теста в течение 2 ч в Экспериментальном примере 3 соответственно. Затем извлеченную кровь затвердевали при комнатной температуре в течение 20 мин, а затем центрифугировали при 3000 об/мин для получения сыворотки в виде супернатанта. Анализ альдегида в полученной сыворотке проводили с использованием набора для количественного определения альдегида (abcam, ab112113). Более конкретно 2xYellos реакционную смесь, состоящую из полученной сыворотки и реактива набора, смешивали в соотношении 1:1, а затем проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего измеряли оптическую плотность при 550 нм с использованием спектрофотометра.Specifically, blood samples were taken from the ® normal control group, the @ alcohol treated group, and the ® experimental group after completion of the behavioral test for 2 hours in Experimental Example 3, respectively. The extracted blood was then solidified at room temperature for 20 minutes and then centrifuged at 3000 rpm to obtain serum as a supernatant. Aldehyde analysis of the resulting serum was performed using an aldehyde quantification kit (abcam, ab112113). More specifically, a 2xYellos reaction mixture consisting of the obtained serum and kit reagent was mixed in a ratio of 1:1, and then reacted at room temperature for 1 hour, after which the optical density was measured at 550 nm using a spectrophotometer.

В результате, как показано на фиг. 5, было подтверждено, что группа, которой вводили алкоголь, имела более высокую концентрацию альдегида в сыворотке, чем группа контроля, тогда как экспериментальная группа, которой вводили комплекс конъюгата по настоящему изобретению вместе с алкоголем, имела значительно более низкую концентрацию альдегида в сыворотке, чем группа, получавшая алкоголь (фиг. 5).As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the group administered alcohol had a higher serum aldehyde concentration than the control group, while the experimental group administered the complex of the conjugate of the present invention together with alcohol had a significantly lower serum aldehyde concentration than group treated with alcohol (Fig. 5).

Из приведенных выше результатов можно заключить, что конъюгаты сезамола и пептидов по настоящему изобретению значительно увеличивают активность и экспрессию ADH и ALDH, вызывая быструю деградацию алкоголя.From the above results, it can be concluded that the sesamol-peptide conjugates of the present invention significantly increase the activity and expression of ADH and ALDH, causing rapid alcohol degradation.

Экспериментальный пример 5. Подтверждение эффекта снятия похмелья.Experimental example 5. Confirmation of the effect of relieving a hangover.

Для подтверждения эффекта снятия похмелья были проведены клинические испытания с использованием комплекса конъюгатов.To confirm the effect of relieving a hangover, clinical trials were conducted using a complex of conjugates.

В частности, для проведения клинических испытаний было привлечено 4 взрослых мужчин и 4 взрослых женщины в возрасте от 20 до 40 лет. После этого был проведен контрольный тест с целью исследования основных закономерностей абсорбции алкоголя у субъектов. Более конкретно, после того, как субъекты съели одинаковую еду, субъектов держали натощак в течение 3 ч, после чего субъекты выпивали коммерческую бутылку с 20% ликером (соджу) в течение 30 мин. Концентрации алкоголя в крови после 1 и 2 ч питья измеряли с помощью алкотестера (Sentek Korea, AL-9000).In particular, 4 adult men and 4 adult women aged 20 to 40 years were involved in clinical trials. Thereafter, a control test was performed to investigate the underlying patterns of alcohol absorption in the subjects. More specifically, after the subjects ate the same meal, the subjects were kept on an empty stomach for 3 hours, after which the subjects drank a commercial bottle of 20% liquor (soju) for 30 minutes. Blood alcohol concentrations after 1 and 2 hours of drinking were measured using a breathalyzer (Sentek Korea, AL-9000).

После этого с целью подтверждения эффекта снятия похмелья комплексом конъюгата, выждав 3 дня после контрольного теста, 100 мл напитка, содержащего 100 частей/млн (100 ppm) каждого из двух типов конъюгатов сезамола и пептидов, полученных в примере получения 2, были даны тем же субъектам, и через 30 мин алкоголь был введен тем же способом, что и в методе, описанном выше, а затем была измерена концентрация алкоголя в крови, после чего концентрации алкоголя в крови были сравнены сThereafter, in order to confirm the hangover-relieving effect of the conjugate complex, after waiting 3 days after the control test, 100 ml of a drink containing 100 ppm (100 ppm) of each of the two types of sesamol and peptide conjugates obtained in Preparation Example 2 were given the same subjects, and after 30 min alcohol was administered in the same way as in the method described above, and then the blood alcohol concentration was measured, after which the blood alcohol concentrations were compared with

- 8 041542 результатом контрольного теста и проанализированы для построения графиков.- 8 041542 the result of the control test and analyzed for plotting.

В результате, как показано на фиг. 6, было подтверждено, что группа, принимавшая конъюгатный комплекс по настоящему изобретению, имела значительно сниженную концентрацию алкоголя в крови после 1 и 2 ч приема алкоголя по сравнению с группой, которой был предложен только алкоголь (фиг. 6).As a result, as shown in FIG. 6, it was confirmed that the group treated with the conjugate complex of the present invention had a significantly reduced blood alcohol concentration after 1 and 2 hours of alcohol intake compared to the group given only alcohol (FIG. 6).

Следовательно, из приведенных выше результатов можно видеть, что конъюгат сезамола и пептида по настоящему изобретению индуцирует быструю деградацию алкоголя и уменьшает похмелье.Therefore, it can be seen from the above results that the sesamol-peptide conjugate of the present invention induces rapid alcohol degradation and reduces hangover.

Claims

CLAIM

1. Pharmaceutical composition for the prevention or relief of a hangover, containing a sesamol-peptide conjugate as an active ingredient, where the peptide consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.

2. The hangover prevention or alleviation pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the sesamol and the peptide are linked to each other by a linker.

3. The hangover prevention or alleviation pharmaceutical composition according to claim 2, wherein the linker is a dicarboxylic acid.

4. Pharmaceutical composition for the prevention or relief of a hangover according to any one of claims 1 to 3, in which the conjugate is a conjugate of sesamol and a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a conjugate of sesamol and a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 2 or a mixture of those.

5. A pharmaceutical composition for preventing or alleviating a hangover according to any one of claims 1 to 3, wherein the composition increases the activity of alcohol dehydrogenase (ADH) or aldehyde dehydrogenase (ALDH).

6. The pharmaceutical composition for preventing or alleviating a hangover according to any one of claims 1 to 3, wherein the composition improves alcohol-induced dysmotility.

7. A pharmaceutical composition for the prevention or relief of hangovers according to any one of claims 1 to 3, wherein the composition is in a form selected from the group consisting of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, topicals, suppositories, and sterile injection solutions.

8. Food supplement for the prevention or relief of hangovers, containing a sesamol-peptide conjugate as an active ingredient, where the peptide consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.

9. The hangover prevention or alleviation food supplement according to claim 8, wherein the conjugate is a sesamol-peptide conjugate of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a sesamol-peptide conjugate of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a mixture of those.