EA035455B1

EA035455B1 - Способы и композиции для лечения расстройств с использованием фоллистатиновых полипептидов

Info

Publication number: EA035455B1
Application number: EA201692529A
Authority: EA
Inventors: Равиндра КУМАР; Ася ГРИНБЕРГ
Original assignee: Акселерон Фарма, Инк.
Priority date: 2014-06-04
Filing date: 2015-06-04
Publication date: 2020-06-18
Also published as: CN106795224A; JP2017518303A; EP3152237A4; JP2021095416A; AU2015269333A1; KR20200084064A; MA51074A; KR20210119546A; EP3152237A1; CA2950754C; JP6568110B2; EP3152237B1; AU2020210315A1; MA51075A; KR20200017548A; EP3721892A1; US10954279B2; EA202090632A1; EA201692529A1; CN106795224B

Abstract

Изобретение относится, в частности, к фоллистатиновым полипептидам, которые могут быть использованы для местного введения, и к способам их применения.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки с регистрационным № 62/007908, поданной 4 июня 2014 г. Содержание вышеуказанной заявки во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

Суперсемейство трансформирующего фактора роста-бета (TGF-бета) включает ряд факторов роста, которые имеют общие элементы последовательностей и структурных мотивов. Известно, что эти белки оказывают биологическое действие на большое число клеток различных типов у позвоночных и беспозвоночных. Члены такого суперсемейства обладают важными функциями, влияющими на развитие эмбриона и ответственными за образование структуры ткани и за тканеспецифичность, и могут оказывать влияние на ряд процессов дифференцировки, включая адипогенез, миогенез, хондрогенез, кардиогенез, гематопоэз, нейрогенез и дифференцировку эпителиальных клеток. Это семейство подразделяется на две основных ветви: BMP/GDF и TGF-бета/активин/ВМРЮ, члены которых обладают различными и часто взаимодополняющими функциями. При изменении активности члена семейства TGF-бета в организме часто могут происходить значительные физиологические изменения. Так, например, у крупного рогатого скота породы Пьемонт и Бельгийская голубая присутствует мутация гена GDF8 (также называемого миостатином) , ответственная за потерю функции, где указанная мутация приводит к значительному увеличению мышечной массы (Grobet et al., Nat. Genet. 1997, 17(1):71-4). Кроме того, у человека неактивные аллели GDF8 ассоциируются с увеличением мышечной массы и, как сообщалось, с исключительной мышечной силой (Schuelke et al., N. Engl. J. Med. 2004, 350:2682-8).

Изменения в мышцах, костях, хрящах и других тканях могут быть достигнуты путем передачи агонистического или антагонистического сигнала, опосредуемого соответствующим членом семейства TGFбета. Однако, поскольку члены этого семейства могут влиять более чем на одну ткань, то желательно, чтобы лечение некоторых пациентов было направлено на терапевтическое ингибирование членов этого семейства в отдельных органах, но не во всем организме. Таким образом, необходимо получить средства, которые функционировали бы как сильные регуляторы передачи сигнала TGF-бета и могли бы быть применены для местного введения.

Описание сущности изобретения

В частности, настоящее изобретение относится к фоллистатиновым полипептидам, которые были сконструированы так, чтобы они ингибировали лиганды фоллистатина (например, активин А, активин В, GDF8 и GDF11), находящиеся в непосредственной близости от ткани, в которую вводят такие фоллистатиновые полипептиды, где указанные полипептиды оказывают незначительное системное воздействие на пациента либо вообще не оказывают такого воздействия.

Описанные здесь фоллистатиновые полипептиды включают полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична любой из SEQ ID NOS: 1-4, 7-16 и 26-43. Фоллистатиновый полипептид может быть, но необязательно, сконструирован так, чтобы он димеризовался или образовывал мультимеры высшего порядка. Это может быть достигнуто путем присоединения фоллистатиновой последовательности фоллистатинового полипептида к домену, сообщающему димеризацию или мультимеризацию. Примером такого домена является константный домен иммуноглобулина, включающий, например, Fc-часть иммуноглобулина. Фоллистатиновая часть может быть непосредственно присоединена, но необязательно, к гетерологичной части, либо может быть использована промежуточная последовательность, такая как линкер. Примером линкера является последовательность TGGG. Фоллистатиновый полипептид может, но необязательно, обладать такой же гепаринсвязывающей активностью, как и человеческий фоллистатин-288. Альтернативно, фоллистатин может иметь маскированный гепаринсвязывающий домен, подобный домену, присутствующему в человеческом фоллистатине-315. В частности, настоящее изобретение относится к терапевтически оптимизированным фоллистатиновым полипептидам, содержащим часть константного домена иммуноглобулина человеческого IgG, который обладает более низкой ADCC- или CDC-активностью по сравнению с нативным человеческим IgG1. Примерами являются IgG2, IgG3, IgG4, гибрид IgG2/4 и варианты IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В частности, настоящее изобретение относится к оптимально активной форме фоллистатина, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15 или 16, или состоит, или, по существу, состоит из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:15 или 16, которые сообщают белку более высокое качество и активность по сравнению с нативными формами FST(288) и FST(315), где такими оптимально активными формами являются димерные гибридные белки, такие как белки фоллистатин-Fc.

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему первую аминокислотную последовательность и вторую аминокислотную последовательность, где первая аминокислотная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15 и 16, а вторая аминокислотная последовательность содержит константный домен иммуноглобулина. Между первой аминокислотной последовательностью и второй аминокислотной последовательностью может присутствовать, но необязательно, линкерный полипептид. Линкерный полипептид содержит, но необязательно, последовательность TGGG или состоит, или, по

- 1 035455 существу, состоит из этой последовательности. Вторая аминокислотная последовательность содержит, но необязательно, константный домен иммуноглобулина IgG или состоит, или, по существу, состоит из этого домена. Вторая аминокислотная последовательность содержит, но необязательно, константный домен иммуноглобулина IgG или состоит, или, по существу, состоит из константного домена иммуноглобулина IgG, который обладает пониженной ADCC-активностью по сравнению с человеческим IgG1. Вторая аминокислотная последовательность содержит, но необязательно, константный домен иммуноглобулина IgG или состоит, или, по существу, состоит из этого домена. Вторая аминокислотная последовательность содержит, но необязательно, константный домен иммуноглобулина IgG или состоит, или, по существу, состоит из константного домена иммуноглобулина IgG, который обладает пониженной CDCактивностью по сравнению с человеческим IgG1. Вторая аминокислотная последовательность содержит, но необязательно, константный домен иммуноглобулина IgG или состоит, или, по существу, состоит из константного домена иммуноглобулина IgG, выбранного из группы, состоящей из IgG1, IgG2 и IgG4. Вторая аминокислотная последовательность содержит, но необязательно, Fc-часть иммуноглобулина или состоит из Fc-части иммуноглобулина, такого как иммуноглобулин IgG, который может представлять собой иммуноглобулин, обладающий пониженной ADCC-активностью, CDC-активностью или той и другой активностью по сравнению с человеческим IgG1, и примерами таких IgG являются IgG2, IgG4 и гибрид IgG2/4 или любые IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 с различными мутациями. В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к фоллистатиновым полипептидам, которые содержат аминокислотную последовательность или состоят, или, по существу, состоят из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 38-43. В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к фоллистатиновым полипептидам, которые содержат аминокислотную последовательность или состоят, или, по существу, состоят из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 26-28 и 32-34. В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к фоллистатиновым полипептидам, которые содержат аминокислотную последовательность или состоят, или, по существу, состоят из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 29-31 и 35-37. Нужные фоллистатиновые полипептиды могут связываться с одним или более лигандами, выбранными из группы, состоящей из миостатина, GDF-11, активина А и активина В с KD менее чем 1 нМ, 100, 50 или 10 пМ. В некоторых аспектах изобретения любые из вышеупомянутых полипептидов могут представлять собой димеры, включая гетеродимеры или гомодимеры, или мультимеры высшего порядка. Любой из вышеупомянутых полипептидов может быть включен в фармацевтический препарат.

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим любые описанные здесь фоллистатиновые полипептиды, и к клеткам, содержащим такие нуклеиновые кислоты, где указанные клетки могут быть использованы для продуцирования фоллистатиновых полипептидов.

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способам лечения тканей или органов путем непосредственного введения в такую ткань фоллистатинового полипептида. Так, например, настоящее изобретение относится к способу увеличения размера мышц или мышечной силы у пациента, где указанный способ включает введение эффективного количества фоллистатинового полипептида путем внутримышечной инъекции такого полипептида в мышцы пациента, нуждающегося в этом, в результате чего происходит увеличение размера нужной мышцы или ее силы, где фоллистатиновый полипептид не оказывает какого-либо значительного воздействия на размер мышц или мышечную силу всего организма. Нужная мышца может быть повреждена, ослаблена или атрофирована, как это может происходить при различных мышечных расстройствах, включая мышечные дистрофии (такие как мышечная дистрофия Дюшенна, мышечная дистрофия Беккера и плече-лопаточно-лицевая мышечная дистрофия), воспалительные мышечные расстройства (такие как миозит, вызываемый тельцами включения), повреждения или травмы мышц, бездействие мышц (как это может происходить после длительного постельного режима или обездвиживания конечностей) и атрофию или слабость мышц в результате старения, раковых или хронических заболеваний различных типов. Эти способы могут быть также применены к здоровым мышцам, размер или силу которых желательно увеличить. Кроме того, введение фоллистатинового полипептида в мышцу может приводить к общему снижению жира в организме, а поэтому такой полипептид может быть использован для лечения ожирения или других расстройств, ассоциированных с избытком жира в организме, где такой фоллистатин может быть непосредственно введен, но необязательно, в жировую ткань. Фоллистатиновый полипептид может быть введен только в одну нужную мышцу или в более чем одну нужную мышцу. Эти способы и фоллистатиновые полипептиды могут быть применены для достижения желательного воздействия на нужную ткань, например мышцы, но без какого-либо значительного влияния на другие ткани, такие как мышцы или другие органы, не являющиеся мишенями. В результате этого системные эффекты фоллистатина могут не наблюдаться. Так, например, размер или сила мышцы, которая является контралатеральной по отношению к мышце-мишени, могут, в основном, не увеличиваться, либо у пациента может не наблюдаться какого-либо значительного изменения

- 2 035455 параметров, выбранных из группы, состоящей из уровней фолликулостимулирующих гормонов (FSH) в сыворотке, размера печени, гематокрита, уровней гемоглобина и ретикулоцитов.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена полная непроцессированная аминокислотная последовательность человеческого фоллистатина 315 (SEQ ID NO: 3). Лидерная последовательность показана курсивом и жирным шрифтом, N-концевая область фоллистатина (FSN) подчеркнута одной чертой, а три домена фоллистатина (FSD) подчеркнуты двойной чертой. В частности, фоллистатиновый домен I (FSDI) показан красным шрифтом, фоллистатиновый домен II (FSDII) показан синим шрифтом, а фоллистатиновый домен III (FSDIII) показан зеленым шрифтом.

На фиг. 2 проиллюстрировано влияние 4-недельной обработки мышей путем подкожной инъекции FST(288)-Fc, FST(315)-Fc или ActRIIB-Fc на массу истощенной ткани у мышей. В качестве носителя использовали забуференный трисом физиологический раствор. Данные представлены как среднее±ср. кв. откл. *, величина Р<0,05 была вычислена по сравнению с TBS-группами с помощью непарного tкритерия; #, величина Р<0,05 была вычислена по сравнению с FST-группами с помощью непарного tкритерия. Обработка белками FST(288)-Fc, FST(315)-Fc и ActRIIB-Fc приводила к значительному увеличению массы истощенной ткани по сравнению с контрольными мышами, обработанными носителем. Увеличение массы истощенной ткани у ActRIIB-Fc-обработанных мышей было значительно больше, чем увеличение массы истощенной ткани у мышей, обработанных белком FST(288)-Fc или FST(315)-Fc.

На фиг. 3 проиллюстрировано влияние 4-недельной обработки мышей, проводимой 2 раза в неделю путем подкожной инъекции FST (288)-Fc, FST(315)-Fc или ActRIIB-Fc, на силу лап у мышей. В качестве носителя использовали забуференный трисом физиологический раствор. Данные представлены как среднее±ср. кв. откл. *, величина Р<0,05 была вычислена по сравнению с TBS-группами с помощью непарного t-критерия; #, величина Р<0,05 была вычислена по сравнению с FST-группами с помощью непарного tкритерия. ActRIIB-Fc-обработка приводила к увеличению силы лап у мышей. У мышей, обработанных белком FST(288)-Fc или FST(315)-Fc, какого-либо увеличения силы лап не наблюдалось.

На фиг. 4 проиллюстрировано влияние 4-недельной обработки мышей, проводимой два раза в неделю путем подкожной инъекции FST (288)-IgG1, FST(315)-IgG1 или ActRIIB-Fc, на массу мышц грудной клетки (Pecs), передней большеберцовой кости (ТА), икроножной мышцы (Gastroc) и мышцы бедра у мышей. В качестве носителя использовали забуференный трисом физиологический раствор. Данные представлены как среднее±ср. кв. откл. *, величина Р<0,05 была вычислена по сравнению с TBSгруппами с помощью непарного t-критерия; #, величина Р<0,05 была вычислена по сравнению с FSTгруппами с помощью непарного t-критерия. ActRIIB-Fc-обработка приводила к значительному увеличению массы мышц грудной клетки, передней большеберцовой кости, икроножной мышцы и мышцы бедра у мышей, но приводила лишь к незначительному увеличению или вообще не приводила к увеличению мышечной массы у мышей, обработанных белком FST(288)-IgG1 или FST(315)-IgG1.

На фиг. 5 проиллюстрировано влияние 4-недельной обработки мышей, проводимой путем подкожной инъекции FST(288)-IgG1 или FST (315)-IgG1, на уровни фолликулостимулирующего гормона (FSH) в сыворотке. В качестве носителя использовали забуференный трисом физиологический раствор. Данные представлены как среднее±ср. кв. откл. *, величина Р<0,05 была вычислена по сравнению с TBS-группой с помощью непарного t-критерия. FST(315)-IgG1-обработка приводила к значительному снижению уровней FSH в сыворотке по сравнению с уровнями, наблюдаемыми у контрольных мышей, обработанных носителем. В противоположность этому FST(288)- IgG1-обработка не оказывала какого-либо влияния на уровни FSH в сыворотке.

На фиг. 6 проиллюстрировано влияние 4-недельной обработки мышей два раза в неделю белками FST(288)-Fc, FST(315)-Fc или ActRIIB-Fc на массу истощенной ткани у мышей. В качестве носителя использовали забуференный трисом физиологический раствор. Данные представлены как среднее±ср. кв. откл. *, величина Р<0,05 была вычислена по сравнению с TBS-группой с помощью непарного t-критерия. Обработка белком ActRIIB-Fc приводила к значительному увеличению массы истощенной ткани по сравнению с контрольными мышами, обработанными носителем. Увеличения массы истощенной ткани у мышей, обработанных FST(288)-IgG1 или FST(315)-IgG1, не наблюдалось.

На фиг. 7 проиллюстрировано влияние 4-недельной обработки мышей, проводимой два раза в неделю путем внутримышечной инъекции белками FST(288)-IgG1, FST(315)-IgG1 или ActRIIB-Fc в правую икроножную мышцу, на массу икроножной мышцы у мышей. В качестве носителя использовали забуференный трисом физиологический раствор. Данные представлены как среднее±ср. кв. откл. *, величина Р<0,05 была вычислена по сравнению с TBS-группой с помощью непарного t-критерия. #, величина Р<0,05 была вычислена для правой икроножной мышцы, в которую вводили инъекцию, по сравнению с левой икроножной мышцей, в которую не вводили инъекцию, с помощью непарного t-критерия. Обработка белками FST(288)-IgG1, FST(315)-IgG1 и ActRIIB-mFc приводила к значительному увеличению массы правой икроножной мышцы, в которую вводили инъекцию. ActRIIB-mFc-обработка также приводила к значительному увеличению массы левой икроножной мышцы, в которую не вводили инъекцию. В противоположность этому у мышей, обработанных белком FST(288)-IgG1 или FST(315)-IgG1, какого- 3 035455 либо увеличения массы левой икроножной мышцы, в которую не вводили инъекцию, не наблюдалось.

На фиг. 8 проиллюстрировано влияние 3-недельной обработки мышей, проводимой два раза в неделю путем внутримышечной инъекции различных доз FST(288)-IgG1 в правую икроножную мышцу, на массу икроножной мышцы у мышей, и результаты выражали как отношение к величинам, полученным для левой икроножной мышцы, в которую не вводили инъекцию. В качестве носителя использовали забуференный трисом физиологический раствор. Данные представлены как среднее±ср. кв. откл. *, величина Р<0,05 была вычислена по сравнению с PBS-группой с помощью непарного t-критерия. Увеличение доз FST(288)-IgG1 приводило к повышению гипертрофии икроножной мышцы, в которую вводили инъекцию, по сравнению с мышцей, в которую не вводили инъекцию.

На фиг. 9 проиллюстрировано влияние 4-недельной обработки мышей, проводимой два раза в неделю путем внутримышечной инъекции различных доз FST(291)-IgG1 в левую икроножную мышцу. В качестве носителя использовали забуференный трисом физиологический раствор. Данные представлены как среднее±ср. кв. откл. *, величина Р<0,05 была вычислена по сравнению с PBS-группой с помощью непарного t-критерия. Внутримышечное введение FST (291)-IgG2 приводило к значительному увеличению массы икроножной мышцы, в которую вводили инъекцию, по сравнению с массой мышцы, в которую не вводили инъекцию, и по сравнению с контролем.

Подробное описание изобретения

1. Общий обзор.

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к фоллистатиновым полипептидам. Используемый здесь термин фоллистатин означает семейство фоллистатиновых (FST) белков и родственных фоллистатину белков, происходящих от организмов любого вида. Фоллистатин представляет собой аутокринный гликопротеин, которые экспрессируется почти во всех тканях высших животных. Впервые он был выделен из фолликулярной жидкости и идентифицирован как белковая фракция, которая ингибирует секрецию фолликулостимулирующего гормона (FSH) из передней доли гипофиза, а поэтому он был назван FSH-ингибирующим белком (FSP). Впоследствии было определено, что основная его функция заключается в связывании и нейтрализации членов суперсемейства TGF-β, включающего, например, активин, то есть паракринный гормон, усиливающий секрецию FSH в передней доле гипофиза.

Используемый здесь термин фоллистатиновый полипептид означает полипептиды, включая любой природный полипептид, принадлежащий к семейству фоллистатинов, а также любые его варианты (включая мутанты, фрагменты, гибриды и пептидомиметики), которые сохраняют нужную активность, включая, например, активность связывания с лигандом (например, миостатином, GDF-11, активином А, активином В) или с гепарином. Так, например, фоллистатиновые полипептиды включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, происходящую от последовательности любого известного фоллистатина, имеющего последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80%, а предпочтительно по меньшей мере на 85, 90, 95, 97, 99% или более идентична последовательности фоллистатинового полипептида. Термин фоллистатиновый полипептид может означать гибридные белки, содержащие любые вышеупомянутые полипептиды вместе с гетерологичной (нефоллистатиновой) частью. Считается, что аминокислотная последовательность гетерологична фоллистатину, если только она не является более длинной формой (315 аминокислот) человеческого фоллистатина, представленного SEQ ID NO:3. В настоящей заявке представлено много примеров гетерологичных частей, и такие гетерологичные части могут быть непосредственно присоединены посредством аминокислотной последовательности к фоллистатиновой полипептидной части гибридного белка или разделены промежуточной аминокислотной последовательностью, такой как линкер или другая последовательность.

Фоллистатин представляет собой одноцепочечный полипептид с молекулярной массой в пределах от 31 до 49 кДа, образующийся в результате альтернативного сплайсинга мРНК и вариабельного гликозилирования белка. Альтернативно сплайсированные мРНК кодируют два белка, состоящих из 315 аминокислот (то есть FST315) и 288 аминокислот (то есть FST288); а фоллистатин 315 может также подвергаться протеолитическому расщеплению с образованием фоллистатина 303 (FST303) . Анализ аминокислотной последовательности показал, что нативный человеческий фоллистатиновый полипептид содержит пять доменов (начиная с N-конца), а именно пептидную сигнальную последовательность (аминокислоты 1-29 SEQ ID NO: 1), N-концевой домен (FSN) (аминокислоты 30-94 SEQ ID NO: 1), фоллистатиновый домен I (FSDI) (аминокислоты 95-164 SEQ ID NO: 1), фоллистатиновый домен II (FSDII) (аминокислоты (168-239 SEQ ID NO: 1) и фоллистатиновый домен III (FSDIII) (аминокислоты 245-316 SEQ ID NO: 1) (см. PNAS, U.S.A., 1988, Vol. 85, No 12, рр 4218-4222).

Предшественник человеческого фоллистатина-288 (FST288) имеет нижеследующую аминокислотную последовательность, где сигнальный пептид показан жирным шрифтом, N-концевой домен (FSN) подчеркнут одной чертой, а фоллистатиновые домены I-III (FSI, FSII, FSIII) подчеркнуты двойной чертой

- 4 035455

MVRARHOPGGLCLLLLLLCOFMEDRSAOAGNCWLRQAKNGRCOVLYKTELSKEECCSTG RLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCS NITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEOPELEVOYOGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDOTNNA YCVTCNRICPEPASSEOYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIOCT GGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGS CN (SEQ ID NO:1).

Процессированный (зрелый) вариант человеческого фоллистатина FST(288) имеет нижеследующую аминокислотную последовательность, где N-концевой домен подчеркнут одной чертой, а фоллистатиновые домены I-III подчеркнуты двойной чертой. Кроме того, следует отметить, что любые начальные аминокислоты G или N, находящиеся перед первым цистеином, могут быть удалены путем процессинга или искусственно элиминированы без каких-либо последствий, а также могут быть включены полипептиды, содержащие такие менее крупные полипептиды

GNCWLROAKNGRCOVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNC

IPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKE OPELEVOYOGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDOTNNAYCVTCNRICPEPASSEOYLCGNDGVTYSS ACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIOCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSD EPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN (SEQ ID NO:2).

Предшественник человеческого фоллистатина-315 (FST315) имеет нижеследующую аминокислотную последовательность, где сигнальный пептид показан жирным шрифтом, N-концевой домен (FSN) подчеркнут одной чертой, а фоллистатиновые домены I-III (FSI, FSII, FSIII) подчеркнуты двойной чертой (NCBI, регистрационный номер ААН04107.1; 344 аминокислоты)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCOFMEDRSAOAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTG

RLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCS NITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEOPELEVOYOGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDOTNNA YCVTCNRICPEPASSEOYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIОСТ GGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGS CNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW (SEQ ID NO:3).

Процессированный (зрелый) человеческий FST(315) имеет нижеследующую аминокислотную последовательность, где N-концевой домен подчеркнут одной чертой, а фоллистатиновые домены I-III подчеркнуты двойной чертой. Кроме того, следует отметить, что любые начальные аминокислоты G или N, находящиеся перед первым цистеином, могут быть удалены путем процессинга или искусственно элиминированы без каких-либо последствий, а также могут быть включены полипептиды, содержащие такие менее крупные полипептиды

GNCWLRQAKNGRCOVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNC

IPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKE OPELEVOYOGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDOTNNAYCVTCNRICPEPASSEOYLCGNDGVTYSS ACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIOCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSD Е РVCAS DNAT YAS Е СAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYS FPIS SILEW (SEQ ID NO:4).

Фоллистатиновые полипептиды согласно изобретению могут включать любой природный домен фоллистатинового белка, а также его варианты (включая мутанты, фрагменты и пептидомиметики), которые сохраняют нужную активность. Так, например, хорошо известно, что FST(315) и FST(288) обладают высокой аффинностью связывания с активином (активином А и активином В) и миостатином (и близкородственным GDF11), при этом считается, что фоллистатиновые домены (например, FSN и FSD IIII) участвуют в связывании лигандов TGF-β. Однако очевидно, что каждый из этих трех доменов может обладать различными аффинностями связывания с этими лигандами TGF-β. Так, например, недавно проведенные исследования показали, что полипептидные конструкции, содержащие только N-концевой домен (FSN) и два домена FSDI в тандеме, сохраняют высокую аффинность связывания с миостатином и низкую аффинность связывания с активином или вообще не обладают аффинностью связывания с активином, а также стимулируют рост мышц всего организма при введении таких полипептидных конструкций мышам посредством генной экспрессии (Nakatani et al., The FASEB Journal, Vol. 22477-487 (2008)).

Кроме того, домен FSDI содержит гепаринсвязывающий домен человеческого фоллистатина, который имеет аминокислотную последовательность KKCRMNKKNKPR (SEQ ID NO: 5). Этот гепаринсвязывающий домен может быть представлен как ВВХВХХВВХВХВ (SEQ ID NO: 6), где В означает основную аминокислоту, а в частности, лизин (K) или аргинин (R) . В соответствии с этим настоящее изобретение, в частности, охватывает варианты фоллистатиновых белков, которые в отличие от природного

- 5 035455 белка FST обладают способностью селективно связываться с данным лигандом TGF-β и/или ингибировать этот лиганд (например, сохранять высокую аффинность связывания с миостатином и значительно более низкую аффинность связывания с активином).

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение включает полипептиды, содержащие домен FSN, указанный ниже, и, например, один или более гетерологичных полипептидов, и при этом следует отметить, что любая из начальных аминокислот G или N, находящихся перед первым цистеином, могут быть делетированы, как показано, например, ниже (SEQ ID NO: 8)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNC

IPCKET (SEQ ID NO :7) .

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIP

CKET (SEQ ID NO:8).

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим домен FSDI, включающий минимальные активные центры, связывающиеся с миостатином (и/или GDF11), а также с гепарином, как показано ниже, и, например, один или более гетерологичных полипептидов

CENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQ

PELEVQYQGRC (SEQ ID NO:9).

Последовательность FSDI может преимущественно сохраняться в соответствующем структурном окружении благодаря его экспрессии как полипептида, который также содержит домен FSN. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим последовательность FSNFSDI, представленную ниже (SEQ ID NO:10), и, например, один или более гетерологичных полипептидов, и при этом следует отметить, что любые начальные аминокислоты G или N, находящиеся перед первым цистеином, могут быть удалены путем процессинга или искусственно элиминированы без какихлибо последствий, а также могут быть включены полипептиды, содержащие такие менее крупные полипептиды

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIP

CKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQP ELEVQYQGRC (SEQ ID NO:10).

Как продемонстрировано в публикации Nakani et al., конструкция FSN-FSDI-FSDI является достаточной для инициации роста мышц всего организма в том случае, если эта конструкция генетически экспрессируется у мышей, и в соответствии с этим настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотные последовательности, представленные ниже, и, например, один или более гетерологичных полипептидов

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIP

CKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQP ELEVQYQGRCKKTCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECAL LKARCKEQPELEVQYQGRC (SEQ ID NO:11).

Хотя последовательность FSDI сообщает активность связывания с миостатином и GDF11, однако было продемонстрировано, что активины, а в частности, активин А, а также активин В, также представляют собой негативные регуляторы мышц, а поэтому фоллистатиновый полипептид, который ингибирует группу миостатин/GDFH и группу активин А/активин В, может сообщать более сильный мышечный эффект. Кроме того, принимая во внимание представленные здесь данные исследования, указывающие на низкую системную доступность некоторых фоллистатиновых полипептидов, а в частности, полипептидов, содержащих гепаринсвязывающий домен, а более конкретно полипептидов в гомодимерной форме, такой как Fc-гибрид, можно решить проблемы безопасности, связанные с известным негативным влиянием ингибирования активина на функционирование репродуктивной системы и других тканей. Если учесть тот факт, что FSDII сообщает активность связывания с активином А и В, то в настоящее изобретение могут быть включены полипептиды, содержащие FSDI и FSDII (SEQ ID NO: 12), а также конструкции FSN-FSDI-FSDII (SEQ ID NOS: 13) и, например, один или более гетерологичных полипептидов

CENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQ

PELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSA CHLRKATCLLGRSIGLAYEGKC (SEQ ID NO:12).

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIP CKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQP ELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSAC HLRKATCLLGRSIGLAYEGKC (SEQ ID NO:13).

Как описано в примерах, фоллистатиновый полипептид, состоящий из 291 аминокислоты (и представляющий собой природный усеченный FST-315) , обладает преимущественными свойствами. В соот- 6 035455 ветствии с этим настоящее изобретение включает непроцессированный (SEQ ID NO: 14) и зрелый полипептиды FST(291) (SEQ ID NO: 15), которые могут быть объединены с гетерологичными белками. Кроме того, следует отметить, что любые начальные аминокислоты G или N, находящиеся перед первым цистеином, могут быть удалены путем процессинга или искусственно элиминированы без каких-либо последствий, а также могут быть включены полипептиды, содержащие менее крупные полипептиды, такие как, например, полипептиды, представленные ниже (SEQ ID NO: 16)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTG

RLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCS NITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNA YCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCT IGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGS CNSIS (SEQ ID NO:14).

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNC IPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKE QPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSS ACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSD EPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSIS (SEQ ID NO:15).

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIP CKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQP ELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSAC HLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEP VCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSIS (SEQ ID NO:16).

В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к ингибированию лиганда фоллистатина (также называемого фоллистатиновым лигандом) под действием рассматриваемого фоллистатинового полипептида (например, гибридного полипептида FST-IgG). Таким образом, композиции и способы согласно изобретению могут быть применены для лечения расстройств, ассоциированных с аномальной активностью одного или более лигандов фоллистатина. Репрезентативными лигандами фоллистатина являются некоторые члены семейства TGF-β, такие как активин А, активин В, миостатин (GDF8) и GDF11.

Описанные здесь фоллистатиновые белки могут здесь обозначаться как FST. Если за этим обозначением стоит цифра, например FST(288), то это означает, что белок представляет собой фоллистатин, имеющий 288 аминокислот. Если этот белок имеет обозначение FST (288)-Fc, то это указывает на то, что С-концевой Fc присоединен к FST(288), и такой белок может содержать, а может и не содержать промежуточный линкер. В этом случае Fc может представлять собой любую Fc-часть иммуноглобулина, определенную в настоящей заявке. Если этот белок имеет обозначение FST(288)-IgG2, то это указывает на то, что С-концевой Fc присоединен к FST(288) Fc-части человеческого IgG2.

Активины представляют собой димерные полипептидные факторы роста и принадлежат к суперсемейству TGF-β. Существует три вида активинов (А, В и АВ), которые представляют собой гомо/гетеродимеры, состоящие из двух близкородственных β-субъединиц (вдвл, eBeB и вдвА Были идентифицированы и другие активины С и Е, хотя функции этих белков пока еще точно неизвестны. Активины, принадлежащие к суперсемейству TGF-β, представляют собой уникальные и многофункциональные факторы, которые могут стимулировать продуцирование гормонов в клетках яичника и плаценты; поддерживать выживаемость нейронов; позитивно или негативно влиять на прохождение клеточного цикла в зависимости от типа клеток и индуцировать дифференцировку мезодермы, по меньшей мере, в эмбрионах амфибий (DePaolo et al., 1991, Proc. SocEp. Biol. Med. 198:500-512; Dyson et al. , 1997, Curr Biol. 7:8184; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55:953-963) . Кроме того, было обнаружено, что фактор дифференцировки эритроидов (EDF), выделенный из стимулированных клеток человеческого моноцитарного лейкоза, идентичен активину А (Murata et al., 1988, PNAS, 85:2434). Было высказано предположение, что активин А действует как природный регулятор эритропоэза в костном мозге. В некоторых тканях передача сигнала активина подавляется родственным ему гетеродимером, то есть ингибином. Так, например, в процессе высвобождения фолликулостимулирующего гормона (FSH) из гипофиза активин стимулирует секрецию и синтез FSH, а ингибин предотвращает секрецию и синтез FSH. Активин также рассматривается как негативный регулятор мышечной массы и функции, а антагонисты активина могут стимулировать мышечный рост или предотвращать потерю мышечной массы in vivo (Link and Nishi, Exp. Cell. Res. 1997 Jun 15;233 (2):350-62; He et al., Anat. Embryol. (Berl). 2005 Jun;209(5):401-7; Souza et al. Mol. Endocrinol. 2008 Dec; 22(12):2689-702; Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2009 Jul; 297 (1):E157-64; Gilson et al. Zhou et al. Cell. 2010 Aug. 20;142(4):531-43.

Фактор роста и дифференцировки-8 (GDF8) также известен как миостатин. GDF8 представляет со

- 7 035455 бой негативный регулятор массы скелетных мышц. GDF8 в высокой степени экспрессируется в скелетной мышце на стадии развития организма и у взрослых. У трансгенных мышей GDF8 с нулевой мутацией ассоциируется с тяжелой гипертрофией и гиперплазией скелетной мышцы (McPherron et al. , Nature, 1997, 387:83-90). Аналогичное увеличение массы скелетных мышц наблюдается у крупного рогатого скота с природными мутациями GDF8 (Ashmore et al., 1974, Growth, 38:501-507; Swatland and Kieffer, J. Anim. Sci., 1994, 38:752-757; McPherron and Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:12457-12461; и Kambadur et al., Genome Res., 1997, 7:910-915), и что удивительно, у человека (Schuelke et al., N. Engl. J. Med. 2004;350:2682-8). Исследования также показали, что истощение мышц, ассоциированное с ВИЧинфекцией у человека, сопровождается повышением уровня экспрессии белка GDF8 (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS, 1998, 95:14938-43). Кроме того, GDF8 может модулировать продуцирование мышцеспецифичных ферментов (например, креатин-киназы) и модулировать пролиферацию миобластов (WO 00/43781) . Пропептид GDF8 может нековалентно связываться со зрелым димером домена GDF8, что приводит к инактивации его биологической активности (Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654 and Brown et al. (1990) Growth Factors, 3: 35-43). Другими белками, которые связываются с GDF8 или со структурно родственными белками и ингибируют их биологическую активность, являются фоллистатин и, возможно, родственные фоллистатину белки (Gamer et al. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232).

Термины, используемые в описании настоящей заявки, имеют свои общепринятые значения, обычно употребляемые в литературе, в контексте настоящего изобретения и в конкретном контексте, где используется каждый из этих терминов. Для лучшего понимания описания композиций согласно изобретению и способов их получения и применения ниже или в других разделах данного описания объясняются некоторые термины. Объем или значения употребляемых здесь терминов будут понятны специалистам из конкретного контекста описания, в котором используются данные термины.

Термины около и приблизительно, по существу, означают приемлемую величину ошибки при количественных измерениях с учетом способа или точности измерений. Обычно репрезентативные величины ошибки составляют в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10%, а более предпочтительно в пределах 5% от данной величины или интервала величин.

Альтернативно, а в частности, в биологических системах, термины около и приблизительно могут иметь значения, которые находятся в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах значений, которые 5-кратно, а более предпочтительно 2-кратно превышают данную величину. Представленные здесь численные величины являются приблизительными, если это не оговорено особо, и это означает, что термины около и приблизительно могут иметь предположительные значения, если это не указано точно.

Способы согласно изобретению могут включать стадии сравнения двух последовательностей, включая сравнение последовательности дикого типа с одной или более последовательностями мутантов (вариантов последовательностей). Такие сравнения обычно включают выравнивание полимерных последовательностей, например, с использованием программ и/или алгоритмов выравнивания последовательностей, хорошо известных специалистам (например, BLAST, FASTA и MEGALIGN, помимо всех прочих). Для специалиста в данной области совершенно очевидно, что при выравнивании последовательностей, где мутация представляет собой инсерцию или делецию остатка, такое выравнивание предусматривает введение пробела (обычно представленного черточкой или буквой А) в полимерную последовательность, не содержащую встроенного или делетированного остатка.

Термин гомологичный, используемый во всех его грамматических формах и вариантах написания, указывает на общее эволюционное происхождение двух белков, включая белки, принадлежащие к суперсемействам, происходящим от организмов одного и того же вида, а также гомологичные белки, происходящие от организмов различных видов. Такие белки (и кодирующие их нуклеиновые кислоты) имеют гомологичные последовательности, на что указывает сходство их последовательностей, независимо от процента идентичности или независимо от того, присутствуют ли в этих последовательностях специфические остатки, мотивы или консервативные положения. Однако термин гомологичный, используемый в общепринятом смысле и в описании настоящей заявки, вместе с наречием, таким как в высокой степени, может означать сходство последовательностей и может указывать, а может и не указывать на их общее эволюционное происхождение.

Термин сходство последовательностей, используемый во всех его грамматических формах, означает степень идентичности или соответствия последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей, которые могут иметь, а могут и не иметь общее эволюционное происхождение.

2. Фоллистатиновые полипептиды.

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к фоллистатиновым полипептидам (например, к полипептидам FST-Fc) , а в частности, к усеченным формам, представленным полипептидами, содержащими SEQ ID NO: 2, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16, и их вариантам. Фрагменты, функциональные варианты и модифицированные формы имеют, но необязательно, подобную, одинаковую или улучшенную биологическую активность по сравнению с соответствующей активностью фолли

- 8 035455 статиновых полипептидов дикого типа. Так, например, фоллистатиновый вариант согласно изобретению может связываться с лигандом фоллистатина (например, активином А, активином АВ, активином В и GDF8) и ингибировать его функцию. Фоллистатиновый полипептид модулирует, но необязательно, рост тканей, а в частности мышц. Примерами фоллистатиновых полипептидов являются полипептиды, содержащие, состоящие или, по существу, состоящие из них: аминокислотные последовательности любых SEQ ID NN: 1-16 и 26-43, а также полипептиды, содержащие, состоящие или, по существу, состоящие из них: аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны аминокислотной последовательности любых SEQ ID NN: 1-16 и 26-43. Варианты этих полипептидов могут быть получены в соответствии с нижеследующими руководствами. Нумерация аминокислот в фоллистатиновых полипептидах начинается с последовательности SEQ ID NO: 1 независимо от того, присутствует ли нативная лидерная последовательность или нет.

Как описано выше, фоллистатин характеризуется тремя цистеинбогатыми областями (то есть FSдоменами I-III), которые, очевидно, опосредуют связывание фоллистатина с лигандом. Кроме того, исследования продемонстрировали, что полипептидные конструкции, содержащие только один из трех FSсвязывающих доменов (например, FSDI), сохраняют сильную аффинность по отношению к некоторым лигандам фоллистатина (например, к миостатину) и являются биологически активными in vivo (см. Nakatani et al., The FASEB Journal, Vol. 22477-487 (2008)). Поэтому варианты фоллистатиновых полипептидов согласно изобретению могут содержать одну или более активных частей фоллистатинового белка. Так, например, конструкции согласно изобретению могут начинаться с остатка, соответствующего аминокислотам 30-95 SEQ ID NO: 1, и заканчиваться в положении, соответствующем аминокислотам 316-344 SEQ ID NO: 1. Другими примерами являются конструкции, которые начинаются в положении, соответствующем аминокислотам 30-95 SEQ ID NO: 1, и заканчиваются в положении, соответствующем аминокислотам 164-167 или 238-244. Другие примеры могут включать любые из последовательностей SEQ ID NN: 716.

Описанные здесь фоллистатиновые варианты могут быть объединены друг с другом или с гетерологичными аминокислотными последовательностями различными способами. Так, например, варианты фоллистатиновых белков согласно изобретению включают полипептиды, содержащие один или более доменов FS, выбранных из FSDI (аминокислоты 95-164 SEQ ID NO: 1 (то есть SEQ ID NO: 2), FSDII (аминокислоты 168-239 SEQ ID NO: 1) или FSDIII (аминокислоты 245-316 SEQ ID NO: 1), а также белки, содержащие один или более доменов FS, выбранных из последовательностей, которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 92, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны FSDI (аминокислоты 95-164 SEQ ID NO: 1 (то есть SEQ ID NO: 2), FSDII (аминокислоты 168-239 SEQ ID NO: 1) или FSDIII (аминокислоты 245-316 SEQ ID NO: 1). Эти FS-домены могут быть объединены в любом порядке в варианте фоллистатинового полипептида согласно изобретению при условии, что такие рекомбинантные белки могут сохранять нужную активность, включая, например, активность связывания с лигандом фоллистатина (например, с миостатином) и биологическую активность (например, способность индуцировать увеличение мышечной массы или мышечной силы). Примерами таких вариантов фоллистатиновых полипептидов являются, например, полипептиды, имеющие доменные структуры, такие как FSDI-FSDII-FSDIII, FSDI-FSDIII, FSDI-FSDIFSDIII, FSDI-FSDII, FSDI-FSDI, FSN-FSDI-FSDII-FSDIII, FSN-FSDI-FSDII, FSN-FSDI-FSDI, FSN-FSDIFSDIII, FSN-FSDI-FSDI-FSDIII, и полипептиды, полученные путем присоединения других гетерологичных полипептидов к N-концу или С-концу этих полипептидов. Эти домены могут быть связаны непосредственно или посредством линкерного полипептида. Полипептидные линкеры могут представлять собой, но необязательно, любую последовательность и могут содержать 1-50, предпочтительно 1-10, а более предпочтительно 1-5 аминокислот. В некоторых аспектах изобретения предпочтительные линкеры содержат аминокислоты, не являющиеся цистеинами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фоллистатиновые варианты согласно изобретению обладают пониженной аффинностью связывания с одним или более лигандами фоллистатина или вообще не обладают такой аффинностью. В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к фоллистатиновым вариантам, которые обладают пониженной аффинностью связывания с активином или вообще не обладают такой аффинностью. В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к фоллистатиновым вариантам, которые обладают пониженной аффинностью связывания с активином или вообще не обладают такой аффинностью, но сохраняют высокую аффинность связывания с миостатином.

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к фоллистатиновым вариантам, которые не содержат последовательность, соответствующую домену FSDII или функционально активному домену FSDII. Так, например, фоллистатиновые полипептиды согласно изобретению могут включать вариант, полученный путем частичной или полной делеции домена FSDII. В некоторых аспектах изобретения такие фоллистатиновые варианты имеют делецию одного или более цистеиновых остатков в области FSDII или замену не-цистеиновыми аминокислотами.

Фоллистатиновые белки согласно изобретению могут содержать сигнальную последовательность. Сигнальной последовательностью может быть нативная сигнальная последовательность фоллистатинового белка (например, аминокислоты 1-29 SEQ ID NO:1) или сигнальная последовательность другого

- 9 035455 белка, такая как сигнальная последовательность тканевого активатора плазминогена (ТРА) или сигнальная последовательность меллитина пчелиного меда (НВМ).

К фоллистатиновому полипептиду могут быть присоединены дополнительные сайты N-связанного гликозилирования (N-X-S/T), что может приводить к увеличению времени полужизни гибридного белка FST-Fc в сыворотке. Последовательности N-X-S/T могут быть, в основном, введены в положения, находящиеся за пределами лигандсвязывающего кармана. Последовательности N-X-S/T могут быть введены в линкер между фоллистатиновой последовательностью и Fc или другого компонента гибрида. Такой сайт без каких-либо усилий может быть введен путем включения N в соответствующее положение по отношению к уже существующим S или Т или путем включения S или Т в соответствующее положение по отношению к уже существующему N. Любой S, который, предположительно, является гликозилированным, может быть заменен на Т без создания иммуногенного сайта, поскольку защита обеспечивается гликозилированием. Аналогичным образом любой Т, который, предположительно, является гликозилированным, может быть заменен на S. В соответствии с этим фоллистатиновый вариант может включать одну или более дополнительных не-эндогенных консенсусных последовательностей N-связанного гликозилирования.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рассматривается получение функциональных вариантов путем модификации структуры фоллистатинового полипептида в целях повышения терапевтической эффективности или стабильности (например, повышения срока хранения ex vivo и повышения резистентности к протеолитическому расщеплению in vivo) . Модифицированные фоллистатиновые полипептиды могут быть также получены, например, путем аминокислотных замен, делеций или добавлений. Так, например, есть основания предположить, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или аналогичная замена аминокислоты структурно родственной аминокислотой (например, консервативные замены) не будут оказывать значительного влияния на биологическую активность полученной молекулы. Консервативными заменами являются замены аминокислот одного семейства, которые имеют родственные боковые цепи. Тот факт, что замена в аминокислотной последовательности фоллистатинового полипептида приводит к образованию функционального гомолога, может быть легко подтвержден путем оценки способности варианта фоллистатинового полипептида вырабатывать ответ в клетках по механизму, аналогичному ответу, продуцируемому фоллистатиновым полипептидом дикого типа, или связываться с одним или более лигандами, такими как активин или миостатин, по механизму, аналогичному механизму, осуществляемому фоллистатином дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рассматриваются специфические мутации фоллистатиновых полипептидов, вводимые в целях модификации гликозилирования полипептида. Такие мутации могут быть выбраны так, чтобы они обеспечивали введение или элиминацию одного или более сайтов гликозилирования, таких как сайты О-связанного или N-связанного гликозилирования. Сайты распознавания аспарагинсвязанного гликозилирования обычно включают трипептидную последовательность аспарагин-Х-треонин (где X означает любую аминокислоту), которая специфически распознается соответствующими клеточными ферментами гликозилирования. Модификация может быть также осуществлена путем добавления одного или более сериновых или треониновых остатков или замены этими остатками в последовательности фоллистатинового полипептида дикого типа (для сайтов Освязанного гликозилирования). Различные аминокислотные замены или делеции в одном первом или третьем или в обоих аминокислотных положениях сайта распознавания гликозилирования (и/или аминокислотная делеция во втором положении) приводит к устранению гликозилирования в модифицированной трипептидной последовательности. Другим способом увеличения числа углеводных групп на фоллистатиновом полипептиде является химическое или ферментативное присоединение гликозидов к фоллистатиновому полипептиду. В зависимости от применяемого способа присоединения, сахар(а) может (могут) быть присоединен(ы) к (а) аргинину и гистидину; (b) свободным карбоксильным группам; (с) свободным гидрильным группам, таким как цистеиновые группы; (d) свободным гидроксильным группам, таким как сериновые, треониновые или гидроксипролиновые группы; (е) ароматическим остаткам, таким как фенилаланин, тирозин или триптофан; или (f) амидной группе глутамина. Эти методы описаны в заявке WO 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987 г., и в публикации Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Удаление одной или более углеводных групп, присутствующих на полипептиде ActRIIB, может быть осуществлено химическим и/или ферментативным методом. Химическое дегликозилирование может включать, например, обработку фоллистатинового полипептида соединением трифторметансульфоновой кислоты или эквивалентным соединением. Такая обработка приводит к расщеплению большинства или всех сахаров, за исключением линкерного сахара (N-ацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина), при этом аминокислотная последовательность остается интактной. Химическое дегликозилирование также описано в публикации Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 и Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131. Ферментативное расщепление углеводных групп на фоллистатиновых полипептидах может быть достигнуто с использованием ряда эндо- и экзогликозидаз, как описано Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. Последовательность фоллистатинового полипептида может быть скорректирована,

- 10 035455 если это необходимо, в зависимости от типа используемой экспрессионной системы, поскольку клетки млекопитающих, дрожжей, насекомых и растений могут иметь различные паттерны гликозилирования, на которые могут влиять аминокислотные последовательности пептида. Вообще говоря, фоллистатиновые белки, используемые для введения человеку, могут быть экспрессированы в клеточной линии млекопитающих, которая имеет нужный паттерн гликозилирования, такая как клеточная линия HEK293 или СНО, хотя предполагается, что могут быть также использованы и другие экспрессионные клеточные линии млекопитающих.

В настоящем изобретении также рассматривается способ получения вариантов, а в частности, наборов комбинаторных вариантов фоллистатинового полипептида, включая, но необязательно, усеченные варианты, где пулы комбинаторных мутантов являются особенно подходящими для идентификации последовательностей функциональных вариантов. Целью скрининга таких комбинаторных библиотек может быть, например, получение вариантов фоллистатинового полипептида, имеющих модифицированные свойства, такие как модифицированные фармакокинетические свойства или модифицированная активность связывания с лигандом. Ниже описан ряд скрининг-анализов, и такие анализы могут быть проведены для оценки вариантов. Так, например, вариант фоллистатинового полипептида может быть скринирован на его способность связываться с фоллистатиновым полипептидом и предупреждать связывание лиганда фоллистатина с фоллистатиновым полипептидом.

Активность фоллистатинового полипептида или его вариантов может быть также протестировано в клеточном анализе или в анализе in vivo. Так, например, может быть оценено влияние варианта фоллистатинового полипептида на экспрессию генов, участвующих в формировании мышц. Это может быть осуществлено, если это необходимо, в присутствии одного или более рекомбинантных белков-лигандов фоллистатина (например, активина А) , и клетки могут быть трансфецированы так, чтобы они продуцировали фоллистатиновый полипептид и/или его варианты, и необязательно, лиганд фоллистатина. Аналогичным образом, фоллистатиновый полипептид может быть введен мышам или другим животным, а затем могут быть оценены одно или более свойств мышц, таких как мышечная масса или мышечная сила. Такие анализы хорошо известны и являются рутинными процедурами. В таких клеточных линиях для мониторинга влияния на дальнейшую передачу сигнала может быть использован репортерный генреспондер.

Могут быть получены комбинаторные варианты, обладающие селективной активностью по сравнению с природным фоллистатиновым полипептидом. Такие варианты белков, если они экспрессируются из рекомбинантных конструкций ДНК, могут быть использованы в протоколах генотерапии. Аналогичным образом, в результате мутагенеза могут быть получены варианты, которые имеют внутриклеточное время полужизни, резко отличающееся от времени полужизни соответствующего фоллистатинового полипептида дикого типа. Так, например, модифицированный белок может сообщать большую или меньшую стабильность к протеолитическому расщеплению или инициировать другие процессы, приводящие к деструкции или к какой-либо другой инактивации нативного фоллистатинового полипептида. Такие варианты и гены, кодирующие эти варианты, могут быть использованы для изменения уровней фоллистатинового полипептида путем модуляции времени полужизни фоллистатиновых полипептидов. Так, например, чем короче время полужизни, тем более кратковременными являются биологические эффекты, и, если использовать индуцибельную экспрессионную систему, то можно осуществлять более жесткую регуляцию рекомбинантных уровней фоллистатинового полипептида в клетке.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фоллистатиновые полипептиды согласно изобретению могут также включать, помимо модификаций, которые обычно присутствуют в фоллистатиновых полипептидах, посттрансляционные модификации. Такими модификациями являются, но не ограничиваются ими, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизация и ацилирование. В результате этого модифицированные фоллистатиновые полипептиды могут содержать не-аминокислотные элементы, такие как полиэтиленгликоли, липиды, поли- или моносахарид и фосфаты. Влияние таких не-аминокислотных элементов на функциональные свойства фоллистатинового полипептида могут быть протестированы, как описано в настоящей заявке для других вариантов фоллистатинового полипептида. Если фоллистатиновый полипептид продуцируется в клетках в результате расщепления растущей формы фоллистатинового полипептида, то посттрансляционный процессинг может также играть важную роль в правильной укладке белка и/или в сообщении ему нужной функции. Различные клетки (такие как СНО, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 или HEK293) обладают специфическими клеточными и характеристическими механизмами, ответственными за сообщение таких посттрансляционных активностей, а поэтому они могут быть выбраны для гарантии правильной модификации и процессинга фоллистатиновых полипептидов.

В некоторых аспектах изобретения функциональными вариантами или модифицированными формами фоллистатиновых полипептидов являются гибридные белки, имеющие по меньшей мере часть фоллистатинового полипептида и один или более гибридных доменов. Хорошо известными примерами таких гибридных доменов являются, но не ограничиваются ими, полигистидин, Glu-Glu, глутатион-Sтрансфераза (GST) , тиоредоксин, белок А, G-белок, константная область тяжелой цепи иммуноглобулина (например, Fc) , белок, связывающийся с мальтозой (МВР), или альбумин человеческой сыворотки.

- 11 035455

Гибридный домен может быть выбран так, чтобы он сообщал желаемые свойства. Так, например, некоторые гибридные домены являются особенно подходящими для выделения гибридных белков с помощью аффинной хроматографии. Для проведения аффинной очистки используют релевантные матрицы для аффинной хроматографии, такие как смолы, конъюгированные с глутатионом, амилазой, никелем или кобальтом. Многие из таких матриц поставляются в виде набора, такого как система очистки Pharmacia GST и система QIAexpress™ (Qiagen), в которой используются партнеры по связыванию (HIS6). В качестве другого примера может быть выбран гибридный домен, облегчающий детектирование фоллистатиновых полипептидов. Примерами таких детектирующих доменов являются различные флуоресцентные белки (например, GFP), а также эпитопные метки, обычно представляющие собой короткие пептидные последовательности, для которых имеются специфичные антитела. Хорошо известными эпитопными метками, для которых имеются легко доступные специфические моноклональные антитела, являются FLAG, гемагглютинин вируса гриппа (НА) и метки c-myc. В некоторых случаях гибридные домены имеют сайт расщепления протеазой, такой как сайт расщепления фактором Ха или тромбином, где указанный сайт позволяет релевантной протеазе частично расщеплять гибридные белки и высвобождать рекомбинантные белки из указанных белков. Затем высвобождаемые белки могут быть выделены из гибридного домена путем хроматографического разделения. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фоллистатиновый полипептид присоединяют к домену, который стабилизирует этот фоллистатиновый полипептид in vivo (стабилизирующий домен). Термин стабилизирующий относится к любому увеличению времени полужизни в сыворотке независимо от того, происходит ли это в результате снижения уровня деструкции, снижения клиренса почками или другого фармакокинетического эффекта. Известно, что гибриды, содержащие Fc-часть иммуноглобулина, сообщают белкам широкого ряда нужные фармакокинетические свойства. Аналогичным образом, присоединение к альбумину человеческой сыворотки может сообщать нужные свойства. При этом могут быть выбраны гибридные домены других типов, и такими доменами являются мультимеризующие (например, димеризующие, тетрамеризующие) домены и функциональные домены (которые сообщают дополнительную биологическую функцию, такую как дополнительная стимуляция роста мышц).

В своих конкретных примерах настоящее изобретение относится к гибридным белкам, содержащим фоллистатиновые полипептиды, присоединенные к полипептиду, содержащему константный домен иммуноглобулина, такой как СН1-, СН2- или СН3-домен иммуноглобулина или Fc. Fc-домены, происходящие от человеческих IgG1 и IgG2, представлены ниже (SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 соответственно). Как описано в настоящей заявке, Fc-домен IgG2, IgG4 или IgG2/4 является особенно подходящим для его присоединения к фоллистатиновым полипептидам, которые сохраняют гепаринсвязывающую активность, поскольку эти Fc-молекулы обладают пониженной CDC- и/или ADCC-активностью, что может оказывать негативное воздействие на клетки, к которым могут быть присоединены эти гепаринсвязывающие полипептиды. В объем настоящего изобретения входят и другие мутации, которые, как известно, снижают CDC- или ADCC-активность, а в целом в настоящее изобретение входят любые из этих вариантов, которые могут быть использованы в качестве предпочтительных компонентов гибридного фоллистатинового белка. Fc-домен SEQ ID NO:17 имеет, но необязательно, одну или более мутаций в остатках, таких как Asp-265, Lys-322 и Asn-434 (пронумерованных в соответствии с нумерацией полноразмерного IgG1). В некоторых случаях мутантный Fc-домен, имеющий одну или более из этих мутаций (например, мутацию Asp-265), обладает пониженной способностью связываться с рецептором Fcy по сравнению с Fc-доменом дикого типа. В других случаях мутантный Fc-домен, имеющий одну или более из этих мутаций (например, мутацию Asn-434), обладает повышенной способностью связываться с Fc-рецептором, ассоциированным с МНС класса I (FcRN) по сравнению с Fc-доменом дикого типа.

Примеры аминокислотных последовательностей человеческих IgG1 и IgG2, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, представлены ниже

IqGl

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG

VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO :17).

IqG2

VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVE

VHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:18).

Следует отметить, что различные элементы гибридных белков могут быть расположены в любом порядке, при условии, что они будут сообщать нужные функциональные свойства. Так, например, фоллистатиновый полипептид может быть расположен у С-конца по отношению к гетерологичному домену,

- 12 035455 или, альтернативно, гетерологичный домен может быть расположен у С-конца по отношению к фоллистатиновому полипептиду. Домен фоллистатинового полипептида и гетерологичный домен необязательно должны быть смежными в гибридном белке, и в С- или N-концы любого домена или между этими доменами могут быть включены дополнительные домены или аминокислотные последовательности.

Используемый здесь термин Fc-домен иммуноглобулина или просто Fc означает карбоксиконцевую часть константной области цепи иммуноглобулина, а предпочтительно константной области тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части. Так, например, Fc-область иммуноглобулина может содержать 1) ОИ1-домен, СН2-домен и СН3-домен, 2) ОТЬдомен и СН2-домен, 3) ОИ1-домен и СН3-домен, 4) СН2-домен и СН3-домен или 5) комбинацию двух или более доменов и шарнирной области иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения Fc-область иммуноглобулина содержит, по меньшей мере, шарнирную область иммуноглобулина, СН2-домен и СН3-домен иммуноглобулина, а предпочтительно не содержит ОШ-домена. Следует также отметить, что фоллистатиновый полипептид может содержать только один домен иммуноглобулина, такой как CHI-домен, СН2-домен или СНЗ-домен. Многие из этих доменов сообщают нужные фармакокинетические свойства, а также способность образовывать димеры или мультимеры высшего порядка.

В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноглобулины, от которых происходит константная область тяжелой цепи, принадлежат к классу IgG (IgY) (γ-подкласса 1, 2, 3 или 4) . При этом могут быть использованы иммуноглобулины и других классов, а именно IgA (Iga), IgD (^δ), IgE (^ε) и IgM (Iqyi). Выбор соответствующей константной области тяжелой цепи иммуноглобулина подробно обсуждается в патентах США №№ 5541087 и 5726044. Выбор последовательностей конкретной константной области тяжелой цепи иммуноглобулина некоторых классов и подклассов для достижения конкретного результата может быть осуществлен самим специалистом в данной области. Часть конструкции ДНК, кодирующей Fc-область иммуноглобулина, предпочтительно включает по меньшей мере часть шарнирного домена, а более предпочтительно по меньшей мере часть СН₃-домена Fc-гамма или гомологичные домены любого из IgA, IgD, IgE или IgM.

Кроме того, предполагается, что для практического применения описанных здесь способов и композиций в константные области тяжелой цепи иммуноглобулина может быть введена аминокислотная замена или делеция. Одним из примеров является введение аминокислотных замен в верхнюю СН2область с получением Fc-варианта, обладающего пониженной аффинностью связывания с Fcрецепторами (Cole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613) . Кроме того, во многих случаях С-концевой лизин или K может быть удален, и таким образом, в любом из описанных здесь полипептидов может отсутствовать С-концевой K, присутствующий в Fc-домене, как показано в SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фоллистатиновые полипептиды согласно изобретению содержат одну или более модификаций, способных стабилизировать фоллистатиновые полипептиды. Так, например, такие модификации увеличивают время полужизни фоллистатиновых полипептидов in vitro, увеличивают время полужизни фоллистатиновых полипептидов в кровотоке или снижают уровень протеолитического расщепления фоллистатиновых полипептидов. Такими стабилизирующими модификациями являются, но не ограничиваются ими, гибридные белки (включая, например, гибридные белки, содержащие фоллистатиновый полипептид и домен-стабилизатор) , модификации сайта гликозилирования (включая, например, присоединение сайта гликозилирования к фоллистатиновому полипептиду) и модификации углеводной группы (включая, например, удаление углеводных групп из фоллистатинового полипептида). В случае гибридных белков фоллистатиновый полипептид присоединяют к домену-стабилизатору, такому как молекула IgG (например, Fc-домен). Используемый здесь термин домен-стабилизатор означает не только гибридный домен (например, Fc) , как в случае гибридных белков, но также и небелковые модификации, такие как углеводная группа или небелковый полимер, такой как полиэтиленгликоль.

В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к получению доступных выделенных и/или очищенных форм фоллистатиновых полипептидов, которые могут быть выделены из других белков или, по существу, не содержат эти белки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фоллистатиновые полипептиды (немодифицированные или модифицированные) согласно изобретению могут быть получены различными хорошо известными методами. Так, например, такие фоллистатиновые полипептиды могут быть синтезированы стандартными методами химии белков, такими как методы, описанные в публикациях Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) и Grant G.A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman and Company, New York (1992). Кроме того, автоматические синтезаторы пептидов являются коммерчески доступными (например, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). Альтернативно, фоллистатиновые полипептиды, их фрагменты или варианты могут быть рекомбинантно продуцированы с использованием различных экспрессионных систем (например, с использованием Е. coli, клеток яичника китайского хомячка, клеток COS, бакуловируса), хорошо известных специалистам (также см. ниже). В другом варианте осуществления изобретения модифицированные или немодифицированные фоллистатиновые полипептиды могут быть получены путем расщепления природных или ре- 13 035455 комбинантно продуцированных полноразмерных фоллистатиновых полипептидов с использованием, например, протеазы, например трипсина, термолизина, химотрипсина, пепсина, или фермента, конвертирующего парные основные аминокислоты (РАСЕ). Для идентификации сайтов протеолитического расщепления может быть проведен компьютерный анализ (с использованием коммерчески доступной программы, например, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.). Альтернативно, такие фоллистатиновые полипептиды могут быть получены из природных или рекомбинантно продуцированных полноразмерных фоллистатиновых полипептидов стандартными методами, известными специалистам, такими как химическое расщепление (например, бромцианом, гидроксиламином).

3. Нуклеиновые кислоты, кодирующие фоллистатиновые полипептиды.

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к выделенным и/или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим любой из описанных здесь фоллистатиновых полипептидов. Рассматриваемые нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Такими нуклеиновыми кислотами могут быть молекулы ДНК или РНК. Эти нуклеиновые кислоты могут быть использованы, например, в методах получения фоллистатиновых полипептидов.

Так, например, нижеследующая последовательность кодирует природный полипептидпредшественник человеческого фоллистатина (SEQ ID NO: 19) (NCBI, регистрационный номер ВС004107.2, 1032 п.о.) atggtccgcgcgaggcaccagccgggtgggctttgcctcctgctgctgctgctctgcca gttcatggaggaccgcagtgcccaggctgggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgc tgccaggtcctgtacaagaccgaactgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagca cctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacggggg cgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaa tgccgaatgaacaagaagaacaaaccccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacct ggaagggtccagtctgcgggctggatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggc aagatgtaaagagcagccagaactggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgg gatgttttctgtccaggcagctccacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtga cctgtaatcggatttgcccagagcctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagt cacctactccagtgcctgccacctgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggatta gcctatgagggaaagtgtatcaaagcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaa aatgtttatgggatttcaaggttgggagaggccggtgttccctctgtgatgagctgtgccctga cagtaagtcggatgagcctgtctgtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatg aaggaagctgcctgctcctcaggtgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaactcca tttcggaagacaccgaggaagaggaggaagatgaagaccaggactacagctttcctatatcttc tattctagagtgg.

Нижеследующая последовательность кодирует зрелый полипептид FST (315) (SEQ ID NO: 20) gggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgctgccaggtcctgtacaagaccga actgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtg aatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgta aagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaatgccgaatgaacaagaagaacaa accccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacctggaagggtccagtctgcgggctg gatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggcaagatgtaaagagcagccagaac tggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgggatgttttctgtccaggcagctc cacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtgacctgtaatcggatttgcccagag cctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagtcacctactccagtgcctgccacc tgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggattagcctatgagggaaagtgtatcaa agcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaaaatgtttatgggatttcaaggtt gggagaggccggtgttccctctgtgatgagetgtgccctgacagtaagtcggatgagcctgtct gtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatgaaggaagctgcctgctcctcagg tgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaactccatttcggaagacaccgaggaagag gaggaagatgaagaccaggactacagctttcctatatcttctattctagagtgg.

Нижеследующая последовательность кодирует полипептид FST (288) (SEQ ID NO: 21) gggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgctgccaggtcctgtacaagaccga actgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtg aatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgta aagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaatgccgaatgaacaagaagaacaa accccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacctggaagggtccagtctgcgggctg gatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggcaagatgtaaagagcagccagaac tggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgggatgttttctgtccaggcagctc cacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtgacctgtaatcggatttgcccagag cctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagtcacctactccagtgcctgccacc tgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggattagcctatgagggaaagtgtatcaa agcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaaaatgtttatgggatttcaaggtt gggagaggccggtgttccctctgtgatgagetgtgccctgacagtaagtcggatgagcctgtct gtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatgaaggaagctgcctgctcctcagg tgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaac.

- 14 035455

Нижеследующая последовательность кодирует зрелый полипептид FST (291) (SEQ ID NO: 22) gggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgctgccaggtcctgtacaagaccga actgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtg aatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgta aagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaatgccgaatgaacaagaagaacaa accccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacctggaagggtccagtctgcgggctg gatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggcaagatgtaaagagcagccagaac tggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgggatgttttctgtccaggcagctc cacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtgacctgtaatcggatttgcccagag cctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagtcacctactccagtgcctgccacc tgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggattagcctatgagggaaagtgtatcaa agcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaaaatgtttatgggatttcaaggtt gggagaggccggtgttccctctgtgatgagctgtgccctgacagtaagtcggatgagcctgtct gtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatgaaggaagctgcctgctcctcagg tgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaactccatttcgtgg.

Следует отметить, что в некоторых аспектах изобретения рассматриваемые нуклеиновые кислоты, кодирующие фоллистатиновые полипептиды, включают нуклеиновые кислоты, которые представляют собой варианты SEQ ID NN: 19-22. Вариантами нуклеотидных последовательностей являются последовательности, отличающиеся тем, что они имеют одну или более нуклеотидных замен, добавлений или делеций, таких как аллельные варианты, а поэтому такие последовательности включают кодирующие последовательности, отличающиеся от нуклеотидной последовательности кодирующей последовательности, представленной в SEQ ID NN: 19-22.

В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным последовательностям нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NN: 19-22, а в частности, к их частям, происходящим от фоллистатина (нуклеотидам, соответствующим аминокислотам 95-164 SEQ ID NO:1). Для среднего специалиста в данной области очевидно, что в объем настоящего изобретения также входят последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарные SEQ ID NN: 19-22, и варианты SEQ ID NN: 19-22. В других вариантах осуществления изобретения последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть выделенными, рекомбинантными и/или присоединенными к гетерологичной нуклеотидной последовательности либо они могут присутствовать в библиотеке ДНК.

В других вариантах осуществления изобретения нуклеиновые кислоты согласно изобретению также включают нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NN: 19-22, с комплементарной последовательностью SEQ ID NN: 19-22 или с их фрагментами (например, с нуклеотидами 19-22).

Для специалиста в данной области совершенно очевидно, что соответствующие условия жесткости, стимулирующие гибридизацию ДНК, могут варьироваться. Так, например, гибридизация может быть осуществлена с использованием 6,0 х хлорида натрия/цитрата натрия (SSC) приблизительно при 45 °С и последующей промывки 2,0х SSC при 50°С. Так, например, концентрация соли в стадии промывки может быть выбрана из концентраций, применяемых в условиях низкой жесткости, а именно приблизительно 2,0 х SSC при 50 °С, и концентраций, применяемых в условиях высокой жесткости, а именно приблизительно 0,2х SSC при 50°С. Кроме того, температура в стадии промывки может быть повышена от температуры, которая применяется в условиях низкой жесткости, а именно комнатной температуры приблизительно 22°С, до температуры, применяемой в условиях высокой жесткости, а именно приблизительно до 65 °С. Оба параметра, такие как температура и концентрация соли, могут варьироваться либо один из таких параметров может оставаться постоянным, а другой варьироваться. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются в условиях низкой жесткости, а именно с использованием 6х SSC при комнатной температуре и последующей промывки 2х SSC при комнатной температуре.

Выделенные нуклеиновые кислоты, которые отличаются от нуклеиновых кислот, представленных в SEQ ID NN: 19-22, что обусловлено вырожденностью генетического кода, также входят в объем настоящего изобретения. Так, например, число аминокислот представлено более чем одним триплетом. Кодоны, которые соответствуют одной и той же аминокислоте, или синонимичные кодоны (например, CAU и САС являются синонимичными кодонами гистидина) могут продуцировать молчащие мутации, которые не влияют на аминокислотную последовательность белка. Однако предполагается, что в клетках млекопитающих существует полиморфизм последовательностей ДНК, который не приводит к изменениям в аминокислотных последовательностях рассматриваемых белков. Для специалиста в данной области очевидно, что такие модификации одного или более нуклеотидов (приблизительно до 3-5% нуклеотидов) нуклеиновых кислот, кодирующих конкретный белок, могут присутствовать у индивидуумов данных видов вследствие природной аллельной вариации. Любые и все указанные нуклеотидные вариации и полиморфизм конечных аминокислотных последовательностей входят в объем настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть функционально присоединены к одной или более регуляторным нуклеотид

- 15 035455 ным последовательностям в экспрессионной конструкции. Регуляторные нуклеотидные последовательности обычно являются подходящими для клеток-хозяев, используемых для экспрессии. Специалистам известно множество типов экспрессионных векторов и регуляторных последовательностей, подходящих для различных клеток-хозяев. Обычно указанными одной или более регуляторными нуклеотидными последовательностями могут быть, но не ограничиваются ими, промоторные последовательности, лидерные или сигнальные последовательности, сайты связывания с рибосомой, последовательности инициации и терминации транскрипции, последовательности инициации и терминации трансляции и энхансерные последовательности или последовательности-активаторы. В объем настоящего изобретения также входят конститутивные или индуцибельные промоторы, известные специалистам. Промоторами могут быть природные промоторы или гибридные промоторы, содержащие комбинацию из более чем одного промоторного элемента. Экспрессионная конструкция может присутствовать в клетке на эписоме, такой как плазмида, либо такая экспрессионная конструкция может быть встроена в хромосому. В предпочтительном варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор содержит селективный маркерный ген, позволяющий проводить отбор трансформированных клеток-хозяев. Селективные маркерные гены хорошо известны специалистам и могут варьироваться в зависимости от типа используемых клетокхозяев.

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к рассматриваемой нуклеиновой кислоте, присутствующей в экспрессионном векторе, содержащем нуклеотидную последовательность, кодирующую фоллистатиновый полипептид и функционально присоединенную по меньшей мере к одной регуляторной последовательности. Регуляторные последовательности известны специалистам и выбраны так, чтобы они регулировали экспрессию фоллистатинового полипептида. В соответствии с этим термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии.

Репрезентативные регуляторные последовательности описаны в публикации Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Так, например, в этих векторах для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих фоллистатиновый полипептид, могут быть использованы любые последовательности регуляции экспрессии широкого ряда, которые регулируют экспрессию последовательности ДНК, в том случае, если она функционально присоединена к этим последовательностям. Такими подходящими последовательностями регуляции экспрессии являются, например, ранний и поздний промоторы SV40; промотор tet; предранний промотор аденовируса или цитомегаловируса; промоторы RSV; система lac; система trp; система ТАС или TRC; промотор Т7, экспрессия которого регулируется РНК-полимеразой Т7; главные операторные и промоторные области фага лямбда; регуляторные области оболочечного белка fd; промотор для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов; промоторы кислой фосфатазы, например Pho5; промоторы факторов скрещивания дрожжей-α; полиэдроновый промотор бакуловирусной системы и другие последовательности, которые, как известно, регулируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов и их различных комбинаций. Следует отметить, что конструкция экспрессионного вектора может зависеть от таких факторов, как тип трансформируемой клетки-хозяина и/или тип нужного экспрессируемого белка. Кроме того, также должны учитываться число копий вектора, возможность регулировать число копий и уровень экспрессии любого другого белка, кодируемого вектором, такого как маркеры-антибиотики.

Рекомбинантная нуклеиновая кислота согласно изобретению может быть получена путем лигирования клонированного гена или его части в вектор, подходящий для экспрессии в прокариотических клетках, эукариотических клетках (в клетках дрожжей, птиц, насекомых или млекопитающих) или в тех и других клетках. Экспрессионными носителями для продуцирования рекомбинантного фоллистатинового полипептида являются плазмиды и другие векторы. Так, например, векторами, подходящими для экспрессии в прокариотических клетках, таких как Е. coli, являются плазмиды следующих типов: плазмиды, происходящие от pBR322, плазмиды, происходящие от pEMBL, плазмиды, происходящие от рЕХ, плазмиды, происходящие от рВТас, и плазмиды, происходящие от pUC.

Некоторые экспрессионные векторы млекопитающих содержат прокариотические последовательности для облегчения репликации вектора в бактериях, и одну или более эукариотических транскрипционных единиц, которые экспрессируются в эукариотических клетках. Примерами экспрессионных векторов млекопитающих, подходящих для трансфекции эукариотических клеток, являются векторы, происходящие от pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo и pHyg. Некоторые из этих векторов модифицируют последовательностями, происходящими от бактериальных плазмид, таких как pBR322, для облегчения репликации и отбора на резистентность к лекарственным средствам в прокариотических и эукариотических клетках. Альтернативно, производные вирусов, таких как вирус бычьей папилломы (BPV-1), или вирус Эпштейна-Барра (рНЕВо, происходящий от pREP и р205) могут быть использованы для транзиентной экспрессии белков в эукариотических клетках. Примеры других вирусных экспрессионных систем (включая ретровирусные системы) приводятся ниже в описании систем доставки методами генотерапии. Различные методы получения плазмид и трансформации организмов-хозяев хорошо известны специалистам. Описание других

- 16 035455 подходящих экспрессионных систем для прокариотических и эукариотических клеток, а также описание общих рекомбинантных методов можно найти в руководстве Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) в главах 16 и 17. В некоторых случаях может оказаться желательной экспрессия рекомбинантных полипептидов с использованием бакуловирусной экспрессионной системы. Примерами таких бакуловирусных экспрессионных систем являются векторы, происходящие от pVL (такие как pVL1392, pVL1393 и pVL941); векторы, происходящие от pAcUW (такие как pAcUW1); и векторы, происходящие от pBlueBac (такие как β-galсодержащий вектор pBlueBac III).

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор может быть сконструирован для продуцирования рассматриваемых фоллистатиновых полипептидов в клетках СНО, и такими векторами являются вектор Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), векторы pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) и векторы pCI-neo (Promega, Madison, Wise). Очевидно, что рассматриваемые генные конструкции могут быть использованы для инициации экспрессии рассматриваемых фоллистатиновых полипептидов в клетках, размноженных в культуре, например, для продуцирования белков, включая гибридные белки или их варианты, применяемые для очистки.

Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, трансфецированным рекомбинантным геном, включающим кодирующую последовательность (например, SEQ ID NN: 19-22) для одного или более рассматриваемых фоллистатиновых полипептидов. Клетками-хозяевами могут быть любые прокариотические или эукариотические клетки. Так, например, фоллистатиновый полипептид согласно изобретению может экспрессироваться в бактериальных клетках, таких как Е. coli, в клетках насекомых (например, посредством бакуловирусной экспрессионной системы), в клетках дрожжей или в клетках млекопитающих. Специалистам известны и другие подходящие клетки-хозяева.

В соответствии с этим настоящее изобретение также относится к способам продуцирования рассматриваемых фоллистатиновых полипептидов. Так, например, клетки-хозяева, трансфецированные экспрессионным вектором, кодирующим фоллистатиновый полипептид, могут быть культивированы в условиях, подходящих для экспрессии фоллистатинового полипептида. Фоллистатиновый полипептид может быть секретирован и выделен из смеси клеток и среды, содержащей фоллистатиновый полипептид. Альтернативно, фоллистатиновый полипептид может оставаться в цитоплазме или в мембранной фракции клеток, которые затем собирают, подвергают лизису и выделяют белок. Клеточная культура включает клетки-хозяева, среду и другие побочные продукты. Среды, подходящие для культивирования клеток, хорошо известны специалистам. Рассматриваемые фоллистатиновые полипептиды могут быть выделены из среды для культивирования клеток, из клеток-хозяев или из того и другого с применением методов, известных специалистам в области очистки белков, включая ионообменную хроматографию, гельфильтрацию, ультрафильтрацию, электрофорез и иммуноаффинную очистку с использованием антител, специфичных к конкретным эпитопам фоллистатиновых полипептидов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фоллистатиновым полипептидом является гибридный белок, содержащий домен, облегчающий его очистку.

В другом варианте осуществления изобретения гибридный ген, кодирующий лидерную последовательность, используемую для очистки, такую как последовательность сайта расщепления поли(Ит)/энтерокиназой, присутствующая у N-конца нужной части рекомбинантного фоллистатинового полипептида, позволяет осуществлять очистку экспрессированного гибридного белка посредством аффинной хроматографии с использованием смолы, связанной с металлом Ni²⁺. Затем лидерная последовательность для очистки может быть удалена путем обработки энтерокиназой с получением очищенного фоллистатинового полипептида (см., например, Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177 и Janknecht et al., PNAS USA 88:8972).

Методы получения гибридных генов хорошо известны специалистам. Присоединение различных фрагментов ДНК, кодирующих различные полипептидные последовательности, осуществляют, в основном, стандартными методами посредством лигирования по тупым концам или липким концам; посредством гидролиза рестриктирующими ферментами с образованием соответствующих концов; достраивания липких концов, если это необходимо; обработки щелочной фосфатазой для предотвращения нежелательного связывания и ферментативного лигирования. В другом варианте осуществления изобретения гибридный ген может быть синтезирован стандартными методами, включая методы, осуществляемые на автоматических синтезаторах ДНК. Альтернативно, ПЦР-амплификация генных фрагментов может быть осуществлена с использованием якорных праймеров, образующих комплементарные висячие концы между двумя смежными генными фрагментами, которые могут быть затем гибридизованы с получением химерной генной последовательности (см., например, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).

4. Примеры терапевтического применения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции согласно изобретению, включающие, например, FST(288)-IgG1, FST(288)-IgG2, FST(291)-IgG1, FST(291)-IgG2, FST(315)-IgG1, FST (315)IgG2 и любые другие описанные здесь фоллистатиновые полипептиды, могут быть использованы для лечения или предупреждения заболевания или расстройства, описанного в этом разделе, включая заболе

- 17 035455 вания или расстройства, ассоциированные с аномальной активностью фоллистатинового полипептида и/или лиганда фоллистатина (например, GDF8). Эти заболевания, расстройства или состояния обычно называются здесь состояниями, ассоциированными с фоллистатином. В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к способам лечения или предупреждения заболевания у индивидуума, нуждающегося в этом, путем введения указанному индивидууму терапевтически эффективного количества фоллистатинового полипептида, описанного выше. Эти способы, в частности, применяются для терапии и профилактики заболеваний у животных, а более конкретно у человека.

Используемый здесь термин терапевтическое средство, которое предупреждает развитие расстройства или состояния, означает соединение, которое при статистической выборке снижает вероятность возникновения расстройства или состояния в лечебной группе по сравнению с необработанной контрольной группой либо задерживает наступление или уменьшает выраженность одного или более симптомов заболевания или состояния по сравнению с необработанной контрольной группой. Используемый здесь термин лечение означает ослабление тяжести или устранение состояния после его возникновения.

Комплексы фоллистатин-лиганд играют важную роль в росте ткани, а также на ранних стадиях развития, таких как правильное формирование различных структур, или в одном или нескольких процессах последующего развития организма, включая половое развитие, продуцирование гормонов гипофиза и образование мышц. Таким образом, состояния, ассоциированные с фоллистатином, включают аномальный рост ткани и дефекты развития.

Репрезентативными состояниями, которые могут быть подвергнуты лечению, являются нейромышечные расстройства (например, мышечная дистрофия и атрофия мышц), застойная обструктивная болезнь легких (и истощение мышц, ассоциированное с ХОБЛ), синдром истощения мышц, саркопения и кахексия. Другими репрезентативными состояниями являются мышечно-дегенеративные и нейромышечные расстройства, репарация ткани (например, заживление ран) и нейродегенеративные заболевания (например, амиотрофический боковой склероз).

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции (например, полипептиды FST-Fc) согласно изобретению используются в процессе лечения мышечной дистрофии. Термин мышечная дистрофия означает группу дегенеративных мышечных заболеваний, характеризующихся постепенным истощением и разрушением скелетных мышц, а иногда сердечных мышц и мышц дыхательных путей. Мышечные дистрофии представляют собой генетические расстройства, характеризующиеся прогрессирующим истощением и слабостью мышц, которые начинаются с микроскопических изменений в мышцах. В процессе дегенерации мышц происходит снижение мышечной силы у человека. Репрезентативными мышечными дистрофиями, которые могут быть подвергнуты лечению по схеме, включающей введение рассматриваемых фоллистатиновых полипептидов, являются мышечная дистрофия Дюшенна (МДД), мышечная дистрофия Беккера (МДБ), мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса (МДЭД), мышечная дистрофия тазового и плечевого поясов (МДТП), плече-лопаточная лицевая мышечная дистрофия (ПЛЛД или ПЛЛМД) (также известная как болезнь Ландузи-Дежерина), миотоническая дистрофия (МТД) (также известная как болезнь Стейнерта), окулофарингеальная мышечная дистрофия (OPMD), дистальная мышечная дистрофия (ДД), застойная мышечная дистрофия (ЗМД).

Мышечная дистрофия Беккера (МДБ) была впервые описана французским неврологом Гийомом Бенджамином Амандом Дюшенном в 1860-х годах. Мышечная дистрофия Беккера (МДБ) была названа по имени немецкого врача Петера Эмиля Беккера, который впервые описал этот вариант МДБ в 1950-е годы. МДБ является одним из наиболее распространенных наследственных заболеваний у мужчин, и такое заболевание встречается у каждого одного из 3500 подростков. МДБ возникает в результате разрушения гена дистрофина, локализованного на коротком плече хромосомы X. Поскольку у мужчин имеется только одна копия хромосомы X, то у них присутствует только одна копия гена дистрофина. В отсутствие белка дистрофина мышца легко разрушается в процессе циклов сокращения и релаксации. Хотя на ранней стадии развития мышечного заболевания происходит компенсация путем регенерации мышц, однако, впоследствии, мышечные клетки-предшественники не могут противостоять такому поражению, и здоровая мышца заменяется нефункциональной фиброжировой тканью.

МДБ возникает в результате различных мутаций в гене дистрофина. У пациентов с МДБ присутствует некоторое количество дистрофина, но этот дистрофии либо присутствует в недостаточном количестве, либо является низкокачественным. Как и у пациентов с МДД, присутствие некоторого количества дистрофина у пациентов с МДБ защищает мышцы от дегенерации либо на недостаточном уровне, либо на короткое время.

Так, например, проведенные недавно исследования показали, что блокирование или элиминация функции GDF8 (лиганда фоллистатина) in vivo могут быть эффективно достигнуты путем устранения, по меньшей мере, некоторых симптомов у пациентов с МДД и МДБ. Таким образом, рассматриваемые фоллистатиновые полипептиды могут действовать как ингибиторы (антагонисты) GDF8 и представляют собой альтернативные средства для блокирования функций GDF8 in vivo у пациентов с МДД и МДБ.

Аналогичным образом, рассматриваемые фоллистатиновые полипептиды представляют собой эффективное средство для увеличения мышечной массы при других патологических состояниях, для лече

- 18 035455 ния которых необходимо такое увеличение мышечной массы. Так, например, АБС, также называемый болезнью Луи Герига (болезнь двигательных нейронов), представляет собой хроническое, неизлечимое и прогрессирующее расстройство ЦНС, поражающее двигательные нейроны, которые являются компонентами ЦНС и осуществляют взаимодействие головного мозга со скелетными мышцами. При АБС двигательные нейроны разрушаются и, в конечном счете, погибают, и хотя головной мозг у такого человека обычно полностью сохраняет свою функцию и активность, однако его команды контроля двигательных функций никогда не передаются мышцам. АБС, в основном, страдают люди в возрасте от 40 до 70 лет. Двигательные нейроны, которые первыми подвергаются ослаблению, являются нейроны, ответственные за движения рук или ног. Пациенты с АБС могут испытывать затруднения при ходьбе, а также они могут ронять вещи и падать, при этом у них наблюдаются дефекты речи и непроизвольный смех или плач. В конечном счете, мышцы конечностей начинают атрофироваться в результате бездействия. Слабость этих мышц может усиливаться, в результате чего человек может передвигаться только на коляске или вообще не может встать с постели. Большинство пациентов с АБС умирает от респираторной недостаточности или от осложнений после искусственной вентиляции легких, протекающих подобно пневмонии, через 35 лет после начала заболевания.

Болезнь Шарко-Мари-Тута (ШМТ) может быть подвергнута лечению путем местного введения описанных здесь фоллистатиновых полипептидов. ШМТ принадлежит к группе наследственных расстройств, поражающих периферические нервы и приводящих к прогрессирующей, а чаще всего к локальной слабости и дегенерации мышц. Характерными признаками такого заболевания, которое может быть подвергнуто лечению, являются деформация стопы (очень сильно деформированная дугообразная стопа); отвислая стопа (неспособность поставить стопу в горизонтальное положение); шаркающая походка (шарканье ногами по полу при ходьбе из-за отвислости стопы); потеря мышечной массы нижней части голени; онемение стопы; трудности в поддержании равновесия или слабость в плечах и в руках.

Пациенты с различными системными мышечными расстройствами, включая миастенический синдром Ламберта-Итона (МСЛИ); метаболические дистрофии; атрофию мышц спинного мозга (АМСМ); дерматомиозит (ДМ); дистальную мышечную дистрофию (ДД); дистрофию Эмери-Дрейфуса (МДЭД); эндокринные миопатии; атаксию Фридриха (АФ) ; наследственные миопатии; митохондриальную миопатию; тяжелую миастению (ТМ) и полимиозит (ПМ), могут быть подвергнуты лечению описанными здесь фоллистатиновыми полипептидами.

Пациенты с послеоперационной или дисфункциональной атрофией одной или нескольких мышц, включая атрофию мышц после перелома бедра, общего протезирования тазобедренного сустава (ОПТС), общего протезирования коленного сустава (ОПКС) или хирургической операции на влагалище мышцвращателей, могут быть подвергнуты лечению описанными здесь фоллистатиновыми полипептидами.

Пациенты, страдающие различными другими заболеваниями, вызывающими потерю мышечной ткани или истощение мышц, включая мышечные расстройства у пациентов с такими заболеваниями, как саркопения; кахексия; раковые заболевания различных типов, включая рак легких, толстой кишки и яичника; длительное искусственное дыхание; диабет; хроническая обструктивная болезнь легких; почечная недостаточность; сердечная недостаточность; травмы; и расстройства периферических нервов, могут быть подвергнуты лечению описанными здесь фоллистатиновыми полипептидами.

Увеличение мышечной массы, индуцированное фоллистатиновым полипептидом, может также давать благоприятный эффект у пациентов, страдающих заболеваниями, ассоциированными с истощением мышц. При этом наблюдаются обратная корреляция экспрессии GDF8 и отсутствие жировой массы у человека, и такое повышение уровня экспрессии гена GDF8 ассоциируется с потерей массы у пациентов с синдромом истощения при СПИД'е. При ингибировании функции GDF8 у пациентов со СПИД'ом может наблюдаться ослабление, а то и полное устранение, по меньшей мере, некоторых симптомов СПИД'а, что способствует значительному улучшению качества жизни пациентов со СПИД'ом.

5. Фармацевтические композиции.

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединения (например, фоллистатиновые полипептиды) согласно изобретению получают в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Так, например, фоллистатиновый полипептид может быть введен отдельно или как компонент фармацевтического препарата (то есть терапевтической композиции). Рассматриваемые здесь соединения могут быть приготовлены для их введения человеку или животному любым стандартным способом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ терапии согласно изобретению включает местное или системное введение композиции или локальное введение посредством имплантата или другого приспособления. Очевидно, что терапевтическую композицию, используемую в настоящем изобретении, вводят в апирогенной физиологически приемлемой форме. Кроме того, желательно, чтобы такая композиция была инкапсулирована или введена в вязкой форме для доставки в нужный участок ткани (например, в кость, хрящ, мышцу, жировую ткань или нейроны), например в участок пораженной ткани. Местное введение может быть подходящим для заживления ран и репарации ткани. Помимо фоллистатиновых полипептидов, в описанную выше композицию могут быть также включены, но необязательно, терапевтически приемлемые агенты, и такие агенты могут, альтернативно или дополнительно, введены одновременно или последовательно вместе с рассматриваемыми соединениями (например, с

- 19 035455 фоллистатиновыми полипептидами), применяемыми в способах согласно изобретению.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции согласно изобретению могут включать матрицу, способную доставлять одно или более терапевтических соединений (например, фоллистатиновых полипептидов) в нужный участок ткани, с образованием структуры, необходимой для развития ткани и обладающей оптимальной способностью ресорбироваться в организме. Так, например, эта матрица может обеспечивать медленное высвобождение фоллистатиновых полипептидов. Такие матрицы могут состоять из материалов, которые в настоящее время используются в других методах терапии с использованием имплантатов.

Выбор материала матрицы зависит от ее биологической совместимости, биологической разлагаемости, механических свойств, косметически приемлемого внешнего вида и межфазных свойств. Соответствующая форма препарата зависит от конкретной цели применения рассматриваемых композиций. Матрицы, подходящие для получения композиций, могут быть биоразлагаемыми и могут включать среду определенного химического состава, такую как сульфат кальция, трифосфат кальция, гидроксиапатит, полимолочная кислота и полиангидриды. Другими подходящими материалами являются биоразлагаемые материалы определенного биологического состава, такие как костный или кожный коллаген. Другие матрицы состоят из чистых белков или компонентов внеклеточного матрикса. Другие подходящие матрицы являются биологически неразлагаемыми и могут включать среду определенного химического состава, такую как спеченный гидроксиапатит, биологическое стекло, алюминаты или другие керамические изделия. Матрицы могут состоять из комбинаций любых соединений вышеупомянутых типов, таких как полимолочная кислота и гидроксиапатит или коллаген и трифосфат кальция. Состав биокерамических материалов может быть изменен, например, они могут содержать фосфат кальция-алюминат и могут быть подвергнуты обработке для изменения размера пор, размера частиц, формы частиц и биологической разлагаемости.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции, применяемые в способах согласно изобретению, могут быть введены перорально, например в форме капсул, каше, гранул, таблеток, пастилок (полученных с добавлением ароматизаторов, а обычно сахарозы и аравийской или трагакантовой камеди) , порошков, гранул, растворов или суспензий в водной или безводной жидкости, эмульсий типа масло в воде или вода в масле, эликсира или сиропа, лекарственных конфеток (полученных на инертной основе, такой как желатин или глицерин или сахароза и аравийская камедь) и/или жидкости для полоскания рта и т.п., где каждый из этих компонентов содержит предварительно определенное количество агента, используемого в качестве активного ингредиента. Агент может быть также введен в виде болюса, лекарственной кашки или пасты.

В твердых лекарственных формах для перорального введения (в капсулах, таблетках, пилюлях, драже, порошках, гранулах и т.п.), одно или более терапевтических соединений согласно изобретению могут быть смешаны с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, такими как цитрат натрия или дифосфат кальция, и/или с любым из нижеследующих компонентов, таких как (1) наполнители или разбавители, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремниевая кислота; (2) связующие агенты, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или аравийская камедь; (3) увлажнители, такие как глицерин; (4) дезинтегрирующие агенты, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или крахмал тапиоки, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия; (5) агенты, замедляющие растворение, такие как парафин; (6) ускорители абсорбции, такие как четвертичные соединения аммония; (7) смачивающие агенты, такие как цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (8) абсорбенты, такие как каолин и бентонит; (9) замасливатели, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси; и (10) красители. В случае капсул, таблеток и пилюль фармацевтические композиции могут также содержать забуферивающие агенты. Твердые композиции аналогичного типа могут быть также использованы в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах, полученных с использованием наполнителей, таких как лактоза или молочные сахара, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли.

Жидкими лекарственными формами для перорального введения являются фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Жидкие лекарственные формы, помимо активного ингредиента, могут содержать инертные разбавители, обычно используемые для этих целей, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, масло из семян хлопчатника, арахисовое масло, кукурузное масло, масло из проросших семян, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирной кислоты и сорбитана и их смеси. Композиции для перорального введения, помимо инертных разбавителей, могут также содержать адъюванты, такие как смачивающие, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подсластители, отдушки, красители, ароматизаторы и консерванты.

Суспензии, помимо активных соединений, могут содержать суспендирующие агенты, такие как этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбитана, микро- 20 035455 кристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакантовая камедь и их смеси.

Некоторые описанные здесь композиции могут быть введены местно либо в кожу, либо в слизистую оболочку. Препараты для местного введения могут также включать один или более агентов широкого ряда, которые, как известно, являются эффективными в качестве усилителей пенетрации в кожу или в роговой слой. Примерами таких агентов являются 2-пирролидон, №метил-2-пирролидон, диметилацетамид, диметилформамид, пропиленгликоль, метиловый или изопропиловый спирт, диметилсульфоксид и азон. Для получения косметически приемлемого препарата в композицию могут быть также включены дополнительные агенты. Примерами таких агентов являются жиры, воски, масла, красители, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы и поверхностно-активные вещества. В композицию могут быть также включены кератолитические агенты, такие как агенты, известные специалистам. Примерами таких агентов являются салициловая кислота и сера.

Лекарственными формами для местного или чрезкожного введения являются порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляторы. Активное соединение может быть смешано в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, если это необходимо. Мази, пасты, кремы и гели, помимо рассматриваемого соединения согласно изобретению (например, фоллистатинового полипептида), могут содержать наполнители, такие как животные и растительные жиры, масла, воски, парафины, крахмал, трагакантовая камедь, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, кремниевая кислота, тальк и оксид цинка или их смеси.

Порошки и спреи, помимо рассматриваемого соединения, могут содержать наполнители, такие как лактоза, тальк, кремниевая кислота, гидроксид алюминия, силикаты кальция, полиамидный порошок или смеси этих веществ. Спреи могут также содержать специально приготовленные пропелленты, такие как хлорфторуглеводороды и летучие незамещенные углеводороды, такие как бутан и пропан.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, могут содержать один или более фоллистатиновых полипептидов в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или безводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями, или стерильными порошками, которые перед их применением могут быть разведены стерильными инъецируемыми растворами или дисперсиями, и которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты, растворенные вещества, сообщающие препарату изотоничность с кровью рассматриваемого реципиента, или суспендирующие агенты или загустители. Примерами подходящих водных и безводных носителей, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях согласно изобретению, являются вода, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Соответствующая текучесть может поддерживаться, например, с использованием материала для нанесения покрытий, такого как лецитин, путем сохранения требуемого размера частиц в случае дисперсий, и с использованием поверхностно-активных веществ.

Композиции согласно изобретению могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто путем включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и т.п. В композиции могут быть также включены изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, пролонгированная абсорбция инъецируемой фармацевтической формы может быть достигнута путем включения агентов, замедляющих абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Следует отметить, что схема введения доз может быть определена лечащим врачом с учетом различных факторов, модифицирующих действие рассматриваемых соединений согласно изобретению (например, фоллистатиновых полипептидов). Указанные различные факторы зависят от типа заболевания, подвергаемого лечению.

В некоторых своих вариантах настоящее изобретение также относится к генотерапии для in vivo продуцирования фоллистатиновых полипептидов или других соединений, описанных в настоящей заявке. Терапевтический эффект такой терапии достигается путем введения последовательностей фоллистатиновых полинуклеотидов в пораженные клетки или в ткани пациента с перечисленными выше расстройствами. Доставка последовательностей фоллистатиновых полинуклеотидов может быть достигнута с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, такого как химерный вирус или коллоидная дисперсионная система. Для терапевтической доставки последовательностей фоллистатиновых полинуклеотидов предпочтительно использовать липосомы для доставки.

Различными вирусными векторами, которые могут быть использованы для проведения рассматриваемой здесь генотерапии, являются аденовирус, вирус герпеса, вирус коровьей оспы или предпочтительно РНК-вирус, такой как ретровирус. Предпочтительно ретровирусным вектором является производное мышиного или птичьего ретровируса. Примерами ретровирусных векторов, в которые может быть встроен один чужеродный ген, являются, но не ограничиваются ими, вирус мышиного лейкоза Мо- 21 035455 лони (MoMuLV), вирус мышиной саркомы Харви (HaMuSV), мышиный вирус опухоли молочной железы (MuMTV) и вирус саркомы Рауса (RSV). Ряд дополнительных ретровирусных векторов могут включать множество генов. Все эти векторы могут переносить или встраивать ген селективного маркера для идентификации и продуцирования трансдуцированных клеток. Ретровирусные векторы могут быть сделаны мишеньспецифическим путем присоединения, например, сахара, гликолипида или белка. Предпочтительное нацеливание осуществляют с использованием антитела. Специалисту в данной области известно, что специфические полинуклеотидные последовательности могут быть встроены в ретровирусный геном или присоединены к вирусной оболочке для направленной специфической доставки ретровирусного вектора, содержащего фоллистатиновый полинуклеотид. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения вектор вводят в клетки/ткани костей, хряща, мышц или нейронов.

Альтернативно, клетки тканевой культуры могут быть непосредственно трансфецированы плазмидами, кодирующими ретровирусные структурные гены gag, pol и env, стандартным методом трансфекции, опосредуемой фосфатом кальция. Затем эти клетки трансфецируют векторной плазмидой, содержащей представляющие интерес гены. Полученные клетки высвобождают ретровирусный вектор в культуральную среду.

Другой системой направленной доставки фоллистатиновых полинуклеотидов является коллоидная дисперсионная система. Коллоидными дисперсионными системами являются макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, сферы и липидные системы, включающие эмульсии типа масло в воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой согласно изобретению являются липосома. Липосомы представляют собой искусственные мембранные везикулы, которые могут быть использованы в качестве носителей для доставки in vitro и in vivo. РНК, ДНК и интактные вирионы могут быть инкапсулированы в водном носителе и могут быть доставлены в клетки в биологически активной форме (см., например, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Методы эффективного переноса генов с использованием липосомного носителя известны специалистам (см., например, Mannino, et al. , Biotechniques, 6:682, 1988). В состав липосомы обычно входит комбинация фосфолипидов, а чаще всего комбинация фосфолипидов вместе со стероидами, а в частности с холестерином. При этом могут быть также использованы и другие фосфолипиды или липиды. Физические свойства липосом зависят от рН, ионной силы и присутствия двухвалентных катионов.

Примерами липидов, которые могут быть использованы для продуцирования липосом, являются фосфатидиловые соединения, такие как фосфатидилглицерин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, сфинголипиды, цереброзиды и ганглиозиды. Репрезентативными фосфолипидами являются яичный фосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин и дистеароилфосфатидилхолин. Нацеливание липосом может быть также осуществлено, например, посредством органоспецифического, клеткоспецифического и органеллоспецифического связывания, и такой метод известен специалистам.

Примеры

Настоящее изобретение будет более понятным из описания нижеследующих примеров, которые приводятся лишь в целях иллюстрации некоторых вариантов осуществления изобретения. Эти примеры не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.

Пример 1. Получение белков фоллистатин-Fc.

Известно, что фоллистатин (FST) обладает сложными фармакокинетическими свойствами. Сообщалось, что короткая форма FST(288) является более эффективной для блокирования лигандов и связывания с клеточными поверхностями, что частично обусловлено присутствием немаскированного гепаринсвязывающего домена. Считается, что FST(315) является менее эффективным и плохо связывается с клеточной поверхностью, что обусловлено присутствием богатой кислотными остатками С-концевой аминокислотной последовательности, которая нейтрализует гепаринсвязывающий домен. В литературе сообщается, что фоллистатин обычно обладает системным действием. Заявителями была сделана попытка определить, можно ли получить фоллистатиновую конструкцию, которая действовала бы только в тканях, в которые ее вводят путем инъекции (например, в мышечную ткань), и может ли димеризация фоллистатина способствовать повышению способности фоллистатина сохраняться в ткани. Известно, что Fc-домены иммуноглобулинов образуют димеры. Для исследования влияния гибридных белков фоллистатин-Fc на мышечные и другие ткани и для оценки влияния Fc-опосредуемой димеризации на фармакокинетические свойства фоллистатиновых полипептидов авторами настоящего изобретения были получены гибридные белки, содержащие FST(288) или FST(315), которые были присоединены к Fc-части IgG1. Для присоединения каждого фоллистатинового полипептида к Fc-части была выбрана линкерная последовательность TGGG.

Для каждой конструкции FST-IgG1 рассматриваются три нижеследующих лидерных последовательности:

(1) Лидерная последовательность фоллистатина

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQA (SEQ ID NO: 23) (2) Тканевый активатор плазминогена (ТРА)

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 24) (3) Меллитин пчелиного меда (HBML)

MKFLVNVALVFMWYISYIYA (SEQ ID NO: 25).

- 22 035455

Выбранные белки FST-Fc включают лидерную последовательность фоллистатина. Гибридный белок FST(288)-IgG1 имеет непроцессированные и зрелые аминокислотные последовательности, представленные ниже.

Непроцессированный FST(288)-IgG1 (SEQ ID NO: 26)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTG RLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCS NITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGS S TCWDQTNNA YCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCT GGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGS CNTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

Зрелый FST(288)-IgG1 (SEQ ID NO:27)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNC IPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKE QPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSS ACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSD EPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK.

Начальная последовательность GN может быть удалена с получением следующего полипептида (SEQ ID NO: 28):

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIP CKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQP IELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSAC HLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEP VCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPGK.

Гибрид FST(315)-IgG1 имеет непроцессированные и зрелые аминокислотные последовательности, представленные ниже.

Непроцессированный FST(315)-IgG1 (SEQ ID NO:29)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQEMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTG RLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCS NITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNA YCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCT GGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGS CNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEWTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK.

Зрелый FST(315)-IgG1 (SEQ ID NO:30)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNC IPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKE QPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSS ACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSD EPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW TGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

- 23 035455

Начальная последовательность GN может быть удалена с получением следующего полипептида (SEQ ID NO: 31):

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIP

CKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQP ELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSAC HLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEP VCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEWTG GGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

Белки были экспрессированы в клетках HEK-293 или СНО и очищены из кондиционирований среды путем фильтрации и хроматографии на белке А. В некоторых случаях может быть также проведена анионообменная и гидрофобная хроматография и/или гель-фильтрация.

Активность белка оценивали по связыванию с активином А или GDF11. В каждом случае белки связывались с KD менее чем 10 пМ.

Пример 2. Влияние системного введения белков фоллистатин-Fc на мышечную массу и силу у мышей.

Заявителями была определена способность белков фоллистатин-Fc повышать мышечную массу и мышечную силу у мышей дикого типа после системного введения. Гибридный белок ActRIIB-Fc, который, как хорошо известно, стимулирует значительное увеличение истощенной мышечной массы всего организма, использовали в качестве позитивного контроля.

Мышам C57BL/6 два раза в неделю в течение четырех недель вводили дозу (10 мг/кг; подкожно (s.c.)) белка FST(288)-IgG1, человеческого белка FST(315)-IgG1 или человеческого белка ActRIIB-Fc. Мышей подвергали сканированию всего организма методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для определения процента изменения массы истощенной ткани всего организма. У ActRIIB-Fc-обработанных мышей наблюдалось значительное (приблизительно 35%-ное) увеличение массы истощенной ткани по сравнению с контрольной группой, которой вводили носитель. У мышей, обработанных белком FST(288)-IgG1 или FST(315)-IgG1, наблюдалось небольшое увеличение массы истощенной ткани по сравнению с контрольной группой (см. фиг. 2). По окончании исследования мышцы грудной клетки, передней большеберцовой кости (ТА), икроножной мышцы и мышцы бедра иссекали и взвешивали. Как показано на фиг. 4, ActRIIB-Fc-обработка приводила к значительному увеличению мышечной массы у мышей каждой из этих групп. В противоположность этому в группах обработки белками FST(288)-IgG1 или FST(315)-IgG1 наблюдалось незначительное увеличение мышечной массы либо такого увеличения вообще не наблюдалось (см. фиг. 2).

Во время проведения данного исследования мышей также оценивали на изменение мышечной силы. Мышечную силу мышей измеряли по показанию растяжения датчика силы для оценки силы захвата передними конечностями. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что у мышей, обработанных белком ActRIIB-Fc, наблюдалось увеличение мышечной силы. В противоположность этому в группах обработки белками FST(288)-IgG1 или FST(315)-IgG1 такого увеличения мышечной силы не наблюдалось (см. фиг. 3).

В целом, полученные результаты подтвердили, что системное введение ActRIIB-Fc приводит к значительному увеличению мышечной массы и мышечной силы у мышей по сравнению с животными контрольной группы, обработанными носителем. В противоположность этому у мышей, обработанных гибридным белком фоллистатин-Fc, FST(288)-IgG1 или FST(315)-IgG1, наблюдалось незначительное увеличение мышечной массы или мышечной силы либо такого увеличения вообще не наблюдалось. Поэтому очевидно, что гибридные белки фоллистатин-Fc при их системном введении in vivo оказывают незначительное влияние или вообще не оказывают никакого влияния на мышечную массу или силу.

Пример 3. Влияние системного введения белков фоллистатин-Fc на уровни FSH.

Фоллистатин охарактеризовывали, главным образом, на его способность связываться с членами суперсемейства сигналпередающих белков TGF-бета. В частности, известно, что фоллистатин является сильным ингибитором активности активина. Активин представляет собой сильный индуктор продуцирования фолликулостимулирующего гормона (FSH). FSH синтезируется и секретируется гонадотрофами передней доли гипофиза и регулирует рост и развитие организма в процессе полового созревания и различные репродуктивные процессы в организме. Для оценки системных эффектов полипептидов фоллистатин-Fc определяли их влияние на уровни FSH.

Обработка (10 мг/кг; подкожно (s.c.) два раза в неделю) белком FST(288)-IgG1 давала уровни лекарственного средства в кровотоке, составляющие 3,836 (±5,22) мкг/мл. Аналогичная обработка белком FST(315)-IgG1 приводила к значительному повышению уровней лекарственного средства в сыворотке до 19,31 (±1,85) мкг/мл. Как показано на фиг. 5, FST(288)-IgG1 не оказывал какого-либо значительного вли- 24 035455 яния на уровни FSH в сыворотке, что позволяет предположить, что такая схема обработки белком FST(288)-IgG1 не оказывает значительного влияния на системную активность активина. В противоположность этому обработка белком FST(315)-IgG1 приводила к снижению уровней FSH в кровотоке, что указывало на то, что системное введение FST(315)-IgG1 оказывает влияние на системную передачу сигнала активина. В целом, эти данные показали, что использование фоллистатинового полипептида с немаскированным гепаринсвязывающим доменом, присоединенным к Fc-домену, который опосредует димеризацию, такому как FST(288)-IgG1, приводит к получению белка, обладающего минимальной системной активностью или вообще не обладающего такой активностью, тогда как FST(315)- IgG1, имеющий маскированный гепаринсвязывающий домен, может быть использован для достижения системных эффектов.

Пример 4. Влияние местного введения белков фоллистатин-Fc на мышечную массу и мышечную силу у мышей.

Хотя после системного введения не наблюдалось каких-либо значимых эффектов, однако авторами настоящего изобретения был проведен аналогичный эксперимент для того, чтобы определить, может ли фоллистатин использоваться для локального увеличения мышечной массы и мышечной силы у мышей дикого типа после внутримышечного (i.m.) введения.

Мышам C57BL/6 два раза в неделю в течение четырех недель вводили дозу (50 мкг; i.m., в правую икроножную мышцу) белка FST(288)-Fc, белка FST(315)-Fc или человеческого белка ActRIIB-Fc. В различные периоды времени после первой обработки мышей подвергали сканированию всего организма методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для определения процента изменения массы истощенной ткани всего организма. У ActRIIB-Fc-обработанных мышей наблюдалось значительное увеличение массы истощенной ткани по сравнению с контрольной группой, которой вводили носитель. В противоположность этому ни у мышей, обработанных белком FST(288)-IgG1, ни у мышей, обработанных белком FST(315)-IgG1, не наблюдалось какого-либо значимого увеличения массы истощенной ткани по сравнению с контрольной группой. По окончании исследования правую икроножную мышцу, в которую вводили инъекцию, и левую контралатеральную икроножную мышцу иссекали и взвешивали. Как показано на фиг, 6, ActRIIB-Fc-обработка приводила к значительному увеличению мышечной массы в правой и левой икроножных мышцах по сравнению с мышами, обработанными носителем. Следовательно, ActRIIB-Fc оказывал системное действие с увеличением мышечной массы даже при его местном введении в одну мышцу. В противоположность этому FST(288)-Fc и FST(315)-Fc способствовали значительному увеличению мышечной массы правой икроножной мышцы, но не оказывали какого-либо влияния на массу контралатеральной мышцы. Таким образом, было установлено, что в противоположность эффектам, наблюдаемым после системного введения, фоллистатиновый белок действует как сильный стимулятор мышечной массы при его непосредственном введении в мышцу. Кроме того, было обнаружено, что фоллистатин имеет явное преимущество по сравнению с другими агентами, подобными ActRIIB-Fc, и это преимущество заключается в его влиянии на мышечную массу в конкретном участке введения, что указывает на то, что фоллистатин может быть использован для направленной терапии выбранной мышцы или группы мышц, при которой он не будет оказывать какого-либо влияния на рост/активность нормальных окружающих мышц, не являющихся мишенями.

Заявителями был также проведен тщательный мониторинг уровней гибридного белка фоллистатин-Fc в сыворотке после i.m. введения. Обработка белком FST(288)-IgG1 давала уровни лекарственного средства в кровотоке, составляющие 0,156 (±0,245) мкг/мл. Аналогичная обработка белком FST(315)IgG1 давала немного более высокие уровни лекарственного средства в сыворотке, составляющие 3,58 (±1,73) мкг/мл, но эти уровни были значительно ниже, чем уровни, наблюдаемые после системного введения FST(315)-IgG1. Поскольку белки FST(288)-IgG1 и FST(315)-IgG1 присутствовали в сыворотке пациента на более низких уровнях после i.m.-инъекции, чем это наблюдалось после системного введения FST(288)-IgG1 (то есть 3,836 (±5,22) мкг/мл), то, как и ожидалось, ни один из белков FST(288)-IgG1 и FST(315)-IgG1 не оказывал какого-либо значительного влияния на уровни FSH в сыворотке, поскольку FST(288)-IgG1 вообще не давал такого эффекта после s.с.-введения (см. фиг. 5). В соответствии с этим эти данные показали, что белки FST(288)-IgG1 и FST(315)- IgG1 должны быть особенно подходящими для стимуляции увеличения мышечной массы у пациентов, которые являются репродуктивно активными или у которых желательно минимизировать влияние на репродуктивную систему.

Аналогичный эксперимент был проведен для построения дозозависимой кривой влияния FST(288)IgG1 на мышечную массу и ее качество. Мышам C57BL/6 в правую икроножную мышцу вводили i.m. различные дозы (1-100 мкг) два раза в неделю в течение четырех недель. Как показано на фиг. 8, селективное увеличение массы мышц, в которые вводили инъекцию, по сравнению с контралатеральной мышцей, становилось еще больше по мере повышения доз FST(288)-IgG1. Исследование поперечных срезов мышц показало, что увеличение мышечной массы является результатом гипертрофии мышечных волокон, но не гипоплазии.

Пример 5. Fc-оптимизация локально действующих гибридных белков фоллистатин-Fc.

Как описано в предыдущих примерах, гибридные белки фоллистатин-Fc, такие как FST(288)-IgG1

- 25 035455 и FST(315)-IgG1, обладают низким системным действием на мышцы и другие ткани, а в частности, FST(288)^opMbi белка являются активными на участке инъекции. Авторами настоящей заявки и другими авторами было установлено, что FST(288) связывается с клетками посредством гепаринсвязывающего домена, и такое связывание может быть устранено путем введения экзогенного гепарина. Впоследствии авторами настоящей заявки было определено, что домены иммуноглобулина, которые, как известно, опосредуют влияние CDC и ADCC на клетки-мишени, могут вызывать повреждение клеток, обработанных гепаринсвязывающими фоллистатиновыми конструкциями. Такое повреждение может проявляться как иммунная реакция в ткани-мишени или как снижение роста такой ткани. Поэтому авторами настоящей заявки были получены варианты фоллистатиновых полипептидов с использованием Fc-части человеческого IgG2, являющейся примером константного домена IgG, который, как известно, обладает пониженной способностью стимулировать CDC- и ADCC-активность. Этот эксперимент был проведен для того, чтобы определить, могут ли гибридные белки фоллистатин-Fc, полученные с использованием альтернативных Fc-доменов, сохранять свою активность.

Авторами настоящего изобретения были получены гибридные белки, содержащие FST(288) или FST(315), присоединенные к Fc-части IgG2. Для присоединения каждого фоллистатинового полипептида к Fc-части была выбрана линкерная последовательность TGGG.

Для каждой конструкции FST-IgG2 была использована лидерная последовательность фоллистатина.

Гибрид FST(288)-IgG2 имеет непроцессированные и зрелые аминокислотные последовательности, представленные ниже.

Непроцессированный FST(288)-IgG2 (SEQ ID NO:32)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTG RLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCS NITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNA YCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCT GGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGS CNTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

Этот белок кодируется нижеследующей последовательностью нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 44) atggtccgcgcgaggcaccagccgggtgggctttgcctcctgctgctgctgctctgcca gttcatggaggaccgcagtgcccaggctgggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgc tgccaggtcctgtacaagaccgaactgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagca cctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacggggg cgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaa tgccgaatgaacaagaagaacaaaccccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacct ggaagggtccagtctgcgggctggatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggc aagatgtaaagagcagccagaactggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgg gatgttttctgtccaggcagctccacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtga cctgtaatcggatttgcccagagcctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagt cacctactccagtgcctgccacctgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggatta gcctatgagggaaagtgtatcaaagcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaa aatgtttatgggatttcaaggttgggagaggccggtgttccctctgtgatgagctgtgccctga cagtaagtcggatgagcctgtctgtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatg aaggaagctgcctgctcctcaggtgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaacaccg gtggtggagtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctctt ccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcata atgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcac cgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctc ccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca ccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaagg cttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaag accacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacca ctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagaattc.

- 26 035455

Зрелый FST(288)-IgG2 (SEQ ID NO: 33)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNC

IPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKE

IQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSS

ACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSD

EPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKP

KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSWHEALHNHYTQK

SLSLSPGK.

Начальная последовательность GN может быть удалена с получением следующего полипептида (SEQ ID NO: 34):

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIP

CKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQP

ELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSAC HLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEP VCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL

SLSPGK.

Гибрид FST(315)-IgG2 имеет непроцессированные и зрелые аминокислотные последовательности, представленные ниже.

Непроцессированный FST(315)-IgG2 (SEQ ID NO: 35)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTG RLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCS

NITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNA YCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCT GGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGS

CNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEWTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Этот белок кодируется нижеследующей последовательностью нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 45):

atggtccgcgcgaggcaccagccgggtgggctttgcctcctgctgctgctgctctgcca gttcatggaggaccgcagtgcccaggctgggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgc tgccaggtcctgtacaagaccgaactgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagca cctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacggggg tgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaa tgccgaatgaacaagaagaacaaaccccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacct ggaagggtccagtctgcgggctggatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggc aagatgtaaagagcagccagaactggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgg gatgttttctgtccaggcagctccacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtga cctgtaatcggatttgcccagagcctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagt cacctactccagtgcctgccacctgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggatta gcctatgagggaaagtgtatcaaagcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaa aatgtttatgggatttcaaggttgggagaggccggtgttccctctgtgatgagctgtgccctga cagtaagtcggatgagcctgtctgtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatg aaggaagctgcctgctcctcaggtgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaactcca tttcggaagacaccgaggaagaggaggaagatgaagaccaggactacagctttcctatatcttc tattctagagtggaccggtggtggagtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcagga ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgagg tcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtgga cggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgt gtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaagg tctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccg agaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctg acctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagc cggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacag caagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcat gaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagaattc.

- 27 035455

Зрелый FST(315)-IgG2 (SEQ ID NO: 36)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNC IPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKE IQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSS ACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSD EPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW TGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

Начальная последовательность GN может быть удалена с получением следующего полипептида (SEQ ID NO: 37)

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIP CKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQP ELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSAC HLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEP VCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEWTG GGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

Активность белка оценивали по связыванию с активином А или GDF11. В каждом случае белки связывались с K_D менее чем 10 пМ. Эти данные показали, что могут быть получены и экспрессированы гибридные белки фоллистатин-IgG2, сохраняющие пикомолярную лигандсвязывающую активность.

Пример 6. Оптимизированные локально действующие гибридные белки фоллистатин-Fc.

Для оценки возможности получения оптимального гибридного белка фоллистатин-IgG2 был получен ряд белков от FST(288) и до FST(315) с различными С-концевыми усечениями. Один из этих белков с усечением аминокислот до положения 291, обозначаемый FST(291), обнаруживал превосходные экспрессионные свойства по сравнению с другими формами и сохранял нужную гепаринсвязывающую активность, несмотря на то, что он содержал небольшую часть маскирующего домена FST(315). Эта форма была присоединена к Fc-части человеческих IgG1 и IgG2 с получением FST (291)-IgG1 и FST(291)-IgG2.

Для присоединения каждого фоллистатинового полипептида к Fc-части была выбрана линкерная последовательность TGGG.

Для каждой конструкции FST-IgG1 была использована лидерная последовательность фоллистатина.

Гибрид FST(291)-IgG1 имеет непроцессированные и зрелые аминокислотные последовательности, представленные ниже.

Непроцессированный FST(291)-IgG1 (SEQ ID NO:38)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTG RLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCS NITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNA YCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCT GGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGS CNSISTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

Зрелый FST(291)-IgG1 (SEQ ID NO: 39)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNC IPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKE QPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSS ACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSD EPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK.

- 28 035455

Начальная последовательность GN может быть удалена с получением следующего полипептида (SEQ ID NO: 40)

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIP CKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQP IELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSAC HLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEP VCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK.

Гибрид FST(291)-IgG2 имеет непроцессированные и зрелые аминокислотные последовательности, представленные ниже.

Непроцессированный FST(291)-IgG2 (SEQ ID NO:41)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTG RLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCS NITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNA YCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCT GGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGS CNSISTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

Зрелый FST(291)-IgG2 (SEQ ID NO: 42)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNC IPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKE QPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSS ACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSD EPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTV VHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK.

Начальная последовательность GN может быть удалена с получением следующего полипептида (SEQ ID NO: 43):

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIP CKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQP ELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSAC HLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEP VCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWH QDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK.

Белки были экспрессированы в клетках HEK-293 или СНО и очищены из кондиционированной среды путем фильтрации и хроматографии на белке А. В некоторых случаях может быть также проведена анионообменная и гидрофобная хроматография и/или гель-фильтрация.

Активность белка оценивали по связыванию с активином А или GDF11. В каждом случае белки связывались с K_D менее чем 10 пМ.

Были проведены дополнительные эксперименты по усечению белков для идентификации конструкций фоллистатин-IgG2, содержащих линкер TGGG и обладающих оптимальной активностью связывания с лигандом и гепарином, в результате чего был получен полипептид, обладающий высокой активностью, значительной тенденцией к удерживанию в обработанной ткани и низкой тенденцией к продуцированию воспалительной или иммунной реакции в обработанной ткани. Для этих целей был получен ряд конструкций, обозначаемых FST(278)-IgG2, FST(284)-IgG2, FST(291)-IgG2 и FST(303)-IgG2, и эти конструкции сравнивали друг с другом и с FST(288)-IgG2 и FST-(315)-IgG2. Активность связывания с гепари- 29 035455 ном оценивали путем определения уровня высвобождения белка из клеток в присутствии или в отсутствие гепарина, а затем эту активность оценивали с помощью ELISA и выражали как отношение белка, высвобождаемого в присутствии гепарина, к белку, высвобождаемому в отсутствие гепарина. Как показано ниже в таблице, все FST(278)-IgG2, FST(284)-IgG2, FST(288)-IgG2 и FST(291)-IgG2 имели аналогичные отношения, составляющие 3,00-4,00, a FST(303)-IgG2 и FST(315)-IgG2 имели отношения 1,50 и 0,97 соответственно. Это означает, что при включении большего количества аминокислот в положения от 291 до 303 гепаринсвязывающая активность резко снижается.

Гепаринсвязывающая активность усеченных белков FST-IgG2

Конструкция FST-IgG2	Отношение (белок, высвобождаемый в присутствии гепарина/белок, высвобождаемый в отсутствии гепарина)
FST (278)-IgG2	4,18
FST (284)-IgG2	3,54
FST (288)-IgG2	3,34
FST (291)-IgG2	3, 00
FST (303)-IgG2	1,50
FST (315)-IgG2	0, 97

Были проведены клеточные анализы гена-репортера (анализ гена-репортера А-204, описанные в WO/2006/012627) для оценки ингибирования активина и GDF11. Как показано ниже в таблице, конструкции, последовательность которых простирается за положение аминокислоты 288, обладают повышенной способностью ингибировать лиганд.

Ингибирование лиганда усеченными белками FST-IgG2

Конструкция FST-IgG2	IC50 (нг/мл) для активина A	IC50 (нг/мл) для GDF-11
FST (278)-IgG2	521	91
FST (284)-IgG2	369	123
FST (288)-IgG2	30	41
FST (291)-IgG2	20	26
FST (303)-IgG2	2	18

FST (315)-IgG2	10	15

В целом, данные по связыванию с гепарином и ингибированию лиганда показали, что конструкции FST-IgG2, полученные с использованием линкера TGGG или линкеров аналогичной длины (например, линкеров размером 1-10 аминокислот и необязательно 3-8 аминокислот), которые заканчиваются аминокислотами в положении 291-302, обнаруживали повышенную способность ингибировать лиганд по сравнению с FST(288)-IgG2 и повышенную гепаринсвязывающую активность по сравнению с FST(315)-IgG2, и что FST(291)-IgG2 представляет собой белок, обладающий оптимальным эффектом при местном введении.

Пример 7. Эффективность действия белка FST(291)-IgG2 на мышечную массу и силу при его местном введении мышам.

Авторами настоящей заявки была оценена активность оптимизированного белка FST(291)-IgG2, используемого для локального увеличения мышечной массы и силы у мышей дикого типа после внутримышечного (i.m.) введения.

Мышам C57BL/6 два раза в неделю в течение четырех недель вводили дозу (100 мкг в 50 мкл; i.m., в правую икроножную мышцу) носителя (PBS), белка FST(291)-IgG2 или контрольного Fc, происходящего от IgG1. По окончании исследования левую икроножную мышцу, в которую вводили инъекцию, и правую контралатеральную икроножную мышцу иссекали и взвешивали. Как показано на фиг. 9, FST(291)-IgG2-обработка приводила к значительному увеличению мышечной массы в левой икроножной мышце по сравнению с мышами, обработанными носителем, причем в контралатеральной мышце, какого-либо эффекта не наблюдалось. Кроме того, мышцы грудной клетки и бедра взвешивали, и в этих мышцах после введения носителя или FST(291)-IgG2 каких-либо изменений не обнаруживалось. Следовательно, FST(291)-IgG2 имел ограниченное действие на группу мышц после инъекции этого белка, причем системный эффект был минимальным или вообще отсутствовал. Были проведены аналогичные эксперименты, но при этом инъекции вводили в другие группы мышц, включая трехглавую мышцу и переднюю мышцу большеберцовой кости. В каждом случае наблюдалась селективная гипертрофия мышцы, в которую вводили инъекцию.

Были проведены дополнительные эксперименты для непосредственного сравнения влияния FST(288)-IgG1 и FST(291)-IgG2 на рост мышечной массы. Хотя обе конструкции стимулировали значительное увеличение мышечной массы в мышце, в которую вводили инъекцию (в икроножную мышцу), однако FST(291)-IgG2 вызывал приблизительно 42%-е увеличение мышечной массы в мышце, в которую

- 30 035455 вводили инъекцию, по сравнению с контралатеральной мышцей, a FST(288)-IgG1 вызывал приблизительно 22%-е увеличение мышечной массы в мышце, в которую вводили инъекцию, по сравнению с контралатеральной мышцей.

В соответствии с этим полученные данные показали, что белок FST(291)-IgG2 представляет собой соединение, которое является оптимальным для стимуляции роста мышечной массы в мышце-мишени у пациентов, нуждающихся в этом.

Пример 8. Эффективность действия белка FST(291)-IgG2 на мышечную массу при его местном введении мышам с моделью мышечной дистрофии Дюшенна.

Влияние FST(291)-IgG2 на мышечную массу оценивали у мышей с моделью мышечной дистрофии Дюшенна. Мыши линии C57BL/10ScCN-Dmd^mdx/J (mdx) представляют собой хорошо известную модель человеческой мышечной дистрофии Дюшенна (Bulfield, Siller et al. 1984; Partridge 2013).

Два отдельных исследования были проведены на мышах mdx и на мышах дикого типа линии C57BL/10SnJ (WT). В первом исследовании обработку (либо белком FST (291)-IgG2, либо контрольным носителем) начинали, когда мыши достигли 6-недельного возраста. Во втором исследовании обработку начинали, когда мыши достигли 4-недельного возраста. В обоих исследованиях мышам внутримышечно вводили 100 мкг FST(291)-IgG2 в левую икроножную мышцу два раза в неделю в фиксированном объеме 50 мкл на инъекцию. 4-недельных мышей обрабатывали в течение 4 недель, а 6-недельных мышей обрабатывали в течение 6 недель.

После аутопсии икроножные мышцы голени (левой), в которую вводили инъекцию, и контралатеральной голени (правой), в которую не вводили инъекцию, вырезали и взвешивали. В обоих исследованиях икроножные мышцы животных дикого типа (WT), в которые были введены инъекции белка FST(291)-IgG2, имели значительно больший размер, чем мышцы контралатеральной голени, а также мышцы контрольного животного, которому вводили носитель (Р<0,001). В обоих исследованиях икроножная мышца, обработанная белком FST(291)-IgG2, имела значительно больший размер, нормализованный по массе тела, по сравнению с размером контралатеральной мышцы у животных, обработанных носителем, то есть у мышей WT и мышей mdx. Увеличение мышечной массы было несколько более выраженным у молодых животных, чем у старых животных. С точки зрения увеличения процента по отношению к контралатеральной мышце FST(291)-IgG2 давал увеличение мышечной массы на 34,2 и 16,4% у 6-недельных мышей WT и мышей mdx соответственно. Было обнаружено, что мышечная масса у 4недельных мышей WT и мышей mdx увеличивалась на 62,8 и 41,8% соответственно.

Эти данные свидетельствуют о том, что блокирование передачи сигнала активина/миостатина после внутримышечного введения FST(291)-IgG2 два раза в неделю приводило к увеличению мышечной массы у мышей с моделью мышечной дистрофии. Такое увеличение мышечной массы было локальным и наблюдалось только в мышце, в которую вводили инъекцию.

Введение посредством ссылки.

Все упомянутые здесь публикации и патенты во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки так, как если бы каждая отдельная публикация или каждый отдельный патент были конкретно и отдельно введены посредством ссылки.

Хотя в настоящем описании обсуждаются конкретные варианты осуществления изобретения, однако эти варианты приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения. Многие варианты будут более понятны специалистам исходя из данного описания и формулы изобретения, прилагаемой ниже. Полный объем настоящего изобретения определен в указанной формуле изобретения вместе с полным объемом эквивалентов и в описании изобретения вместе с указанными вариантами.

- 31 035455

Список последовательностей <110> ACCELERON PHARMA INC.

<120> Способы и композиции для лечения расстройств с использованием фоллистатиновых полипептидов <130> PHPH-065-WO1 <140> PCT/US2015/034245 <141> 2015-06-04 <150> 62/007,908 <151> 2014-06-04 <160> 47 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met Val Arg Ala Arg His Gin Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu

1015

Leu Leu Cys Gin Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gin Ala Gly Asn Cys 20 2530

Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Val Leu Tyr Lys Thr 35 4045

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser

5560

Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met lie 65 70 7580

Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 85 9095

Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn

100 105110

Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp Lys

115 120125

Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala

130 135140

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu Val Gin Tyr

145 150 155160

Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser

165 170175

Ser Thr Cys Val Val Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys

180 185190

Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys Gly

195 200205

Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

210 215220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys lie

225 230 235240

Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys

245 250255

Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu

260 265270

Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn

275 280285

Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser

290 295300

Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn 305 310315

- 32 035455 <210> 2 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gin Ala

5

Lys Asn Gly Arg Cys Gin Val Leu

15

Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu 20

Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu 25 30

Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp

40

Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 45

Trp Met lie Phe Asn Gly Gly Ala

55

Pro Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu 60

Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly 65 70

Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn

80

Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val 85

Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie

95

Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly

100

Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn

105 110

Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys

115 120

Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu

125

Val Gin Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys

130 135

Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys

140

Pro Gly Ser Ser Thr Cys Val Val Asp

145 150

Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys

155 160

Val Thr Cys Asn Arg lie Cys Pro

165

Leu Cys Gly Asn Asp Gly Val Thr

180

Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg

195 200

Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr

170 175 yr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg

185 190

Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly

205

Lys Cys lie Lys Ala Lys Ser Cys

210 215

Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly

220

Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys

225 230

Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu

235 240

Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser

245

Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala

250 255

Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser

260

Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala 265 270

Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu Glu

275 280

Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

285 <210> 3 <211> 344 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Met Val Arg Ala Arg His Gin Pro 1 5

Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu

15

Leu Leu Cys Gin Phe Met Glu Asp

Arg Ser Ala Gin Ala Gly Asn Cys 25 30

Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly

40

Arg Cys Gin Val Leu Tyr Lys Thr 45

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys

55

Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 60

Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp 65 70

Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met lie

80

- 33 035455

Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 85 9095

Asn Vai Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn

100 105110

Lys Pro Arg Cys Vai Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp Lys

115 120125

Gly Pro Vai Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala

130 135140

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu Vai Gin Tyr

145 150 155160

Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Vai Phe Cys Pro Gly Ser

165 170175

Ser Thr Cys Vai Vai Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Vai Thr Cys

180 185190

Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys Gly

195 200205

Asn Asp Gly Vai Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

210 215220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys lie

225 230 235240

Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys

245 250255

Leu Trp Asp Phe Lys Vai Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu

260 265270

Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Vai Cys Ala Ser Asp Asn

275 280285

Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser

290 295300

Gly Vai Leu Leu Glu Vai Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser lie 305 310315

Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gin Asp Tyr Ser

325 330335

Ser

Ser 320

Phe

Pro lie Ser Ser lie Leu Glu Trp

340 <210> 4 <211> 315 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Vai 15 1015

Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg 20 2530

Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Vai Asn Asp Asn Thr Leu Phe 35 4045

Trp Met lie Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys lie Pro Cys Lys

5560

Thr Cys Glu Asn Vai Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met 65 7075

Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Vai Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn 85 9095

Thr Trp Lys Gly Pro Vai Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg

100 105110

Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu

Leu

Lys

Glu

Asn 80

He

Asn

Glu

- 34 035455

115 120125

Vai Gin Туг Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Vai Phe Cys

130 135140

Pro Gly Ser Ser Thr Cys Vai Vai Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys

145 150 155160

Vai Thr Cys Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr

165 170175

Leu Cys Gly Asn Asp Gly Vai Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg

180 185190

Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly

195 200205

Lys Cys lie Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly

210 215220

Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys Vai Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu

225 230 235240

Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Vai Cys Ala

245 250255

Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala

260 265270

Cys Ser Ser Gly Vai Leu Leu Glu Vai Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

275 280285

Ser lie Ser Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gin Asp

290 295300

Tyr Ser Phe Pro lie Ser Ser lie Leu Glu Trp 305 310315 <210> 5 <211> 12 <212> PRT < 213> Homo sapiens < 400> 5

Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg 15 10 < 210> 6 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность < 220>

< 223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид < 220>

< 221> MOD_RES < 222> (1)..(2) < 223> Любая основная аминокислота, а в частности, Lys или Arg < 220>

< 221> MOD_RES < 222> (3)..(3) < 223> Любая аминокислота < 220>

< 221> MOD_RES < 222> (4)..(4) < 223> Любая основная аминокислота, а в частности, Lys или Arg < 220>

< 221> MOD_RES < 222> (5)..(6) < 223> Любая аминокислота < 220>

< 221> MOD_RES < 222> (7)..(8) < 223> Любая основная аминокислота, а в частности Lys или Arg < 220>

< 221> MOD_RES < 222> (9)..(9) < 223> Любая аминокислота < 220>

< 221> MOD_RES < 222> (10)..(10) < 223> Любая основная аминокислота, а в частности Lys или Arg <220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<223>

<400>

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

10

MOD_RES (11)--(11) Любая аминокислота

MOD_RES (12)-.(12)

Любая основная аминокислота, а в частности Lys или Arg <210> 7 <211> 65 <212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид < 400> 7

Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys 15 10

Gin Val Leu

Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr 20 25

Gly Arg Leu 30

Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr

40 45

Leu Phe Lys

Trp Met lie Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys lie Pro

55 60

Cys Lys Glu

Thr 65 <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400> Cys Tr

PRT

Искусственная последовательность

Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид 'р Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Val Leu Tyr Lys

10 15

Thr .u Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr

25 30

Ser

Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met 35 40 45

Ile

Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu Thr 55 60 <210> 9 <211> 70 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 9

Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg 15 10

Met Asn Lys 15

Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser 20 25

Asn lie Thr 30

Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr

40 45

Arg Asn Glu

Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu

55 60

Leu Glu Val

Gin Tyr Gin Gly Arg Cys 65 70 <210> 10 <211> 133 <212> PRT <213> Искусственная последовательность

- 36 035455 <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 10

Cys Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Val Leu Tyr Lys 15 1015

Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr

2530

Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met 35 4045 lie Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu Thr Cys

5560

Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys 65 70 7580

Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp 85 9095

Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys

100 105110

Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu Val Gin

115 120125

Tyr Gin Gly Arg Cys

130 <210> 11 <211> 206 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 11

Cys Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Val Leu Tyr Lys 15 10 15

Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys

Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr 25 30

Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn

40

Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met 45 lie Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn

55

Cys lie Pro Cys Lys Glu Thr Cys 60

Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly 65 70

Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys

80

Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala 85

Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp

95

Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp

100

Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys 105 110

Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys

115 120

Glu Gin Pro Glu Leu Glu Val Gin

125

Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr

130 135

Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro

140

Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys

145 150

Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys

155 160

Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr

165

Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu

170 175

Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu

180

Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys

185 190

Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu Val

195 200

Gin Tyr Gin Gly Arg Cys

205 <210> 12 <211> 145 <212> PRT

- 37 035455 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 12

Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys

1015

Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr

2530

Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu

4045

Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu Val

5560

Gin Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro 65 70 7580

Gly Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val 85 9095

Thr Cys Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr Leu

100 105110

Cys Gly Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys

115 120125

Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys

130 135140

Cys

145 <210> 13 <211> 208 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 13

Cys Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Val Leu Tyr Lys 15 1015

Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr 20 2530

5560

Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys 65 70 7580

Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp 85 9095

Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys

100 105110

Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu Val Gin

115 120125

Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly

130 135140

Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr

145 150 155160

Cys Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys

165 170175

Gly Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala

180 185190

Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys

195 200 205 <210> 14 <211> 320 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Met Val Arg Ala Arg His Gin Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 15 1015

Leu Leu Cys Gin Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gin Ala Gly Asn Cys 20 2530

Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Val Leu Tyr Lys Thr 35 4045

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser

5560

Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met lie 65 70 7580

Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 85 9095

Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn

100 105110

Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp Lys

115 120125

Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala

130 135140

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu Val Gin Tyr

145 150 155160

Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser 165 170175

Ser Thr Cys Val Val Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys 180 185190

Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys Gly

195 200205

Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

210 215220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile

225	230	235	240
Lys Ala Lys Ser	Cys Glu Asp lie Gin Cys 245 250	Thr Gly Gly	Lys Lys Cys 255
Leu Trp Asp Phe 260	Lys Val Gly Arg Gly Arg 265	Cys Ser Leu	Cys Asp Glu 270
Leu Cys Pro Asp 275	Ser Lys Ser Asp Glu Pro 280	Val Cys Ala 285	Ser Asp Asn
Ala Thr Tyr Ala 290	Ser Glu Cys Ala Met Lys 295	Glu Ala Ala 300	Cys Ser Ser
Gly Val Leu Leu 305	Glu Val Lys His Ser Gly 310	Ser Cys Asn 315	Ser lie Ser 320

<210> 15 <211> 291 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 15 Gly Asn 1

Cys

Trp

Leu 5

Arg

Gin

Ala

Lys

Asn 10

Gly

Arg

Cys

Gin

Val 15

Leu

Tyr

Lys

Thr

Glu 20

Leu

Ser

Lys

Glu

Glu 25

Cys

Ser

Thr

Gly 30

Arg

Leu

Ser

Thr

Ser

Trp

Thr

Glu

Asp

Val

Asn

Asp

Asn

Thr

Leu

Phe

Lys

4045

Trp Met He Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu

5560

Thr Cys Glu Asn Vai Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn 65 70 7580

Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Vai Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie 85 9095

Thr Trp Lys Gly Pro Vai Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn

100 105110

Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu

115 120125

Vai Gin Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Vai Phe Cys

130 135140

Pro Gly Ser Ser Thr Cys Vai Vai Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys

145 150 155160

Vai Thr Cys Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr

165 170175

Leu Cys Gly Asn Asp Gly Vai Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg

180 185190

Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly

195 200205

Lys Cys lie Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly

210 215220

Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys Vai Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu 225 230 235240

Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Vai Cys Ala

245 250255

Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala

260 265270

Cys Ser Ser Gly Vai Leu Leu Glu Vai Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

275 280285

Ser lie Ser

290 <210> 16 <211> 289 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Cys Trp 1

Leu Arg Gin Ala 5

Lys Asn Gly Arg Cys Gin Vai Leu Tyr Lys

15

Thr

Glu

Leu

Ser 20

Lys

Glu

Cys

Cys 25

Ser

Thr

Gly

Arg

Leu 30

Ser

Thr

Ser

Trp

Thr 35

Glu

Asp

Vai

Asn 40

Asp

Asn

Thr

Leu

Phe 45

Lys

Trp

Met

He

Phe 50

Asn

Gly

Ala

Pro 55

Asn

Cys

He

Pro

Cys 60

Lys

Glu

Thr

Cys

Glu 65

Asn

Vai

Asp

Cys

Gly 70

Pro

Gly

Lys

Cys 75

Arg

Met

Asn

Lys

Lys 80

Asn

Lys

Pro

Arg

Cys 85

Vai

Cys

Ala

Pro

Asp 90

Cys

Ser

Asn

He

Thr 95

Trp

Lys

Gly

Pro

Vai

100

Cys

Gly

Leu

Asp

Gly 105

Lys

Thr

Tyr

Arg

Asn

110

Glu

Cys

Ala

Leu

115

Lys

Ala

Arg

Cys

Lys 120

Glu

Gin

Pro

Glu

Leu

125

Glu

Vai

Gin

- 40 035455

Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro

130 135 140

Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val 145 150 155

Cys Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr Leu

165 170 175

Gly Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys

180 185 190

Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys

195 200 205 lie Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly Lys

210 215 220

Cys Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys 225 230 235

Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser

245 250 255

Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys

260 265 270

Ser Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser

275 280 285

Gly

Thr 160

Cys

Ala

Cys

Lys

Asp 240

Asp

Ser lie

Ser <210> 17 <211> 225 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

1015

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 20 2530

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 35 4045

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

5560

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 65 70 7580

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 85 9095

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys

100 105110

Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr

115 120125

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr

130 135140

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu

145 150 155160

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

165 170175

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

180 185190

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

195 200205

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215 220

Lys 225 <210> 18 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

1015

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

2530

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 4045

Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

5560

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 65 70 7580

Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 9095

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie

100 105110

Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro

115 120125

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155160

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 165 170175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185190

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200205

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215220 <210> 19 <211> 1032 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 19

atggtccgcg	cgaggcacca	gccgggtggg	ctttgcctcc	tgctgctgct	gctctgccag	60
ttcatggagg	accgcagtgc	ccaggctggg	aactgctggc	tccgtcaagc	gaagaacggc	120
cgctgccagg	tcctgtacaa	gaccgaactg	agcaaggagg	agtgctgcag	caccggccgg	180
ctgagcacct	cgtggaccga	ggaggacgtg	aatgacaaca	cactcttcaa	gtggatgatt	240
ttcaacgggg	gcgcccccaa	ctgcatcccc	tgtaaagaaa	cgtgtgagaa	cgtggactgt	300
ggacctggga	aaaaatgccg	aatgaacaag	aagaacaaac	cccgctgcgt	ctgcgccccg	360
gattgttcca	acatcacctg	gaagggtcca	gtctgcgggc	tggatgggaa	aacctaccgc	420
aatgaatgtg	cactcctaaa	ggcaagatgt	aaagagcagc	cagaactgga	agtccagtac	480
caaggcagat	gtaaaaagac	ttgtcgggat	gttttctgtc	caggcagctc	cacatgtgtg	540
gtggaccaga	ccaataatgc	ctactgtgtg	acctgtaatc	ggatttgccc	agagcctgct	600
tcctctgagc	aatatctctg	tgggaatgat	ggagtcacct	actccagtgc	ctgccacctg	660
agaaaggcta	cctgcctgct	gggcagatct	attggattag	cctatgaggg	aaagtgtatc	720
aaagcaaagt	cctgtgaaga	tatccagtgc	actggtggga	aaaaatgttt	atgggatttc	780
aaggttggga	gaggccggtg	ttccctctgt	gatgagctgt	gccctgacag	taagtcggat	840
gagcctgtct	gtgccagtga	caatgccact	tatgccagcg	agtgtgccat	gaaggaagct	900

- 42 035455

gcctgctcct	caggtgtgct	actggaagta	aagcactccg gatcttgcaa ctccatttcg	960
gaagacaccg	aggaagagga	ggaagatgaa	gaccaggact acagctttcc tatatcttct	1020
attctagagt	gg			1032
<210> 20
<211> 945
<212> ДНК
<213> Homo	sapiens
<400> 20
gggaactgct	ggctccgtca	agcgaagaac	ggccgctgcc aggtcctgta caagaccgaa	60
ctgagcaagg	aggagtgctg	cagcaccggc	cggctgagca cctcgtggac cgaggaggac	120
gtgaatgaca	acacactctt	caagtggatg	attttcaacg ggggcgcccc caactgcatc	180
ccctgtaaag	aaacgtgtga	gaacgtggac	tgtggacctg ggaaaaaatg ccgaatgaac	240
aagaagaaca	aaccccgctg	cgtctgcgcc	ccggattgtt ccaacatcac ctggaagggt	300
ccagtctgcg	ggctggatgg	gaaaacctac	cgcaatgaat gtgcactcct aaaggcaaga	360
tgtaaagagc	agccagaact	ggaagtccag	taccaaggca gatgtaaaaa gacttgtcgg	420
gatgttttct	gtccaggcag	ctccacatgt	gtggtggacc agaccaataa tgcctactgt	480
gtgacctgta	atcggatttg	cccagagcct	gcttcctctg agcaatatct ctgtgggaat	540
gatggagtca	cctactccag	tgcctgccac	ctgagaaagg ctacctgcct gctgggcaga	600
tctattggat	tagcctatga	gggaaagtgt	atcaaagcaa agtcctgtga agatatccag	660
tgcactggtg	ggaaaaaatg	tttatgggat	ttcaaggttg ggagaggccg gtgttccctc	720
tgtgatgagc	tgtgccctga	cagtaagtcg	gatgagcctg tctgtgccag tgacaatgcc	780
acttatgcca	gcgagtgtgc	catgaaggaa	gctgcctgct cctcaggtgt gctactggaa	840
gtaaagcact	ccggatcttg	caactccatt	tcggaagaca ccgaggaaga ggaggaagat	900
gaagaccagg	actacagctt	tcctatatct	tctattctag agtgg	945
<210> 21
<211> 864
<212> ДНК
<213> Homo	sapiens
<400> 21
gggaactgct	ggctccgtca	agcgaagaac	ggccgctgcc aggtcctgta caagaccgaa	60
ctgagcaagg	aggagtgctg	cagcaccggc	cggctgagca cctcgtggac cgaggaggac	120
gtgaatgaca	acacactctt	caagtggatg	attttcaacg ggggcgcccc caactgcatc	180
ccctgtaaag	aaacgtgtga	gaacgtggac	tgtggacctg ggaaaaaatg ccgaatgaac	240
aagaagaaca	aaccccgctg	cgtctgcgcc	ccggattgtt ccaacatcac ctggaagggt	300
ccagtctgcg	ggctggatgg	gaaaacctac	cgcaatgaat gtgcactcct aaaggcaaga	360
tgtaaagagc	agccagaact	ggaagtccag	taccaaggca gatgtaaaaa gacttgtcgg	420
gatgttttct	gtccaggcag	ctccacatgt	gtggtggacc agaccaataa tgcctactgt	480
gtgacctgta	atcggatttg	cccagagcct	gcttcctctg agcaatatct ctgtgggaat	540
gatggagtca	cctactccag	tgcctgccac	ctgagaaagg ctacctgcct gctgggcaga	600
tctattggat	tagcctatga	gggaaagtgt	atcaaagcaa agtcctgtga agatatccag	660
tgcactggtg	ggaaaaaatg	tttatgggat	ttcaaggttg ggagaggccg gtgttccctc	720
tgtgatgagc	tgtgccctga	cagtaagtcg	gatgagcctg tctgtgccag tgacaatgcc	780
acttatgcca	gcgagtgtgc	catgaaggaa	gctgcctgct cctcaggtgt gctactggaa	840
gtaaagcact	ccggatcttg	caac		864
<210> 22
<211> 876
<212> ДНК
<213> Homo	sapiens
<400> 22
gggaactgct	ggctccgtca	agcgaagaac	ggccgctgcc aggtcctgta caagaccgaa	60
ctgagcaagg	aggagtgctg	cagcaccggc	cggctgagca cctcgtggac cgaggaggac	120
gtgaatgaca	acacactctt	caagtggatg	attttcaacg ggggcgcccc caactgcatc	180
ccctgtaaag	aaacgtgtga	gaacgtggac	tgtggacctg ggaaaaaatg ccgaatgaac	240
aagaagaaca	aaccccgctg	cgtctgcgcc	ccggattgtt ccaacatcac ctggaagggt	300
ccagtctgcg	ggctggatgg	gaaaacctac	cgcaatgaat gtgcactcct aaaggcaaga	360
tgtaaagagc	agccagaact	ggaagtccag	taccaaggca gatgtaaaaa gacttgtcgg	420

- 43 035455 gatgttttct gtccaggcag ctccacatgt gtggtggacc agaccaataa tgcctactgt gtgacctgta atcggatttg cccagagcct gcttcctctg agcaatatct ctgtgggaat gatggagtca cctactccag tgcctgccac ctgagaaagg ctacctgcct gctgggcaga tctattggat tagcctatga gggaaagtgt atcaaagcaa agtcctgtga agatatccag tgcactggtg ggaaaaaatg tttatgggat ttcaaggttg ggagaggccg gtgttccctc tgtgatgagc tgtgccctga cagtaagtcg gatgagcctg tctgtgccag tgacaatgcc acttatgcca gcgagtgtgc catgaaggaa gctgcctgct cctcaggtgt gctactggaa gtaaagcact ccggatcttg caactccatt tcgtgg

480

540

600

660

720

780

840

876 <210> 23 <211> 29 <212> PRT <213> Неизвестная последовательность <220>

<223> Описание неизвестной последовательности: последовательность фоллистатинового полипептида <400> 23

Met Vai Arg Ala Arg His Gin Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu

10 15

Leu Leu Cys Gin Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gin Ala 20 25 <210> 24 <211> 22 <212> PRT <213> Неизвестная последовательность <220>

<223> Описание неизвестной последовательности: активатор тканевого плазминогена (ТРА) <400> 24 Met Asp Ala 1

Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu Leu Leu Cys Gly

10 15

Ala Vai Phe

Vai Ser Pro 20 <210> 25 <211> 21 <212> PRT <213> Apis <400> 25 Met Lys Ph< 1 mellifera

Leu Vai Asn Vai Ala Leu Vai Phe Met Vai Vai Tyr lie

10 15

Ser Tyr lie Tyr Ala <210> 26 <211> 546 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 26

Met Vai Arg Ala Arg His Gin Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu 15 10 15

Leu Leu Cys Gin Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gin Ala Gly Asn

25 30

Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Vai Leu Tyr Lys 35 40 45

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr

55 60

Trp Thr Glu Glu Asp Vai Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met 65 70 75

Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu Thr Cys 85 90 95

Asn Vai Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys

100 105 110

Leu

Cys

Thr

Ser

He 80

Glu

Asn

- 44 035455

Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp Lys

115 120125

Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala

130 135140

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu Val Gin Tyr

145 150 155160

Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser

165 170175

Ser Thr Cys Val Val Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys

180 185190

Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys Gly

195 200205

Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

210 215220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys lie

225 230 235240

Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys

245 250255

Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu

260 265270

Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn

275 280285

Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser

290 295300

Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Thr Gly Gly 305 310 315320

Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 325 330335

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie

340 345350

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

355 360365

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

370 375380

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

385 390 395400

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys

405 410415

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu

420 425430

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr

435 440445

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu

450 455460

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp

465 470 475480

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

485 490495

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

500 505510

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

515 520525

- 45 035455

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

530 535 540

Gly Lys 545 <210> 27 <211> 517 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический <400> 27

Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gin Ala Lys 1 5

Asn Gly Arg Cys Gin Vai Leu 10 15

Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu

25

Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu

Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Vai

40

Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 45

Trp Met lie Phe Asn Gly Gly Ala Pro

55

Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu 60

Thr Cys Glu Asn Vai Asp Cys Gly Pro 65 70

Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn

80

Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Vai Cys 85

Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie 90 95

Thr Trp Lys Gly Pro Vai Cys Gly Leu

100 105

Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn

110

Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys

115 120

Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu

125

Vai Gin Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys

130 135

Pro Gly Ser Ser Thr Cys Vai Vai

145 150

Thr Cys Arg Asp Vai Phe Cys

140

Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys

155 160

Vai Thr Cys Asn Arg lie Cys Pro

165

Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr

170 175

Leu Cys Gly Asn Asp Gly Vai Thr

180

Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg

185 190

Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg

195 200

Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly

205

Lys Cys lie Lys Ala Lys Ser Cys

210 215

Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly

220

Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys 225 230

Vai Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu

235 240

Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser

245

Lys Ser Asp Glu Pro Vai Cys Ala

250 255

Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser

260

Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala

265 270

Cys Ser Ser Gly Vai Leu Leu Glu

275 280

Vai Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

285

Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys

290 295

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

300

Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu

305 310

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

315 320

Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu

325

Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai

330 335

Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys

340

Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai

345 350

- 46 035455

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser

355 360365

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu

370 375380

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

385 390 395400

Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro

405 410415

Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin

420 425430

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

435 440445

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

450 455460

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

465 470 475480

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

485 490495

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser

500 505510

Leu Ser Pro Gly Lys

515 <210> 28 <211> 515 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 28

Cys Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Val Leu Tyr Lys 15 1015

Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr 20 2530

5560

Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys 65 70 7580

Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp 85 9095

Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys

100 105110

Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu Val Gin

115 120125

Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly

130 135140

Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr

145 150 155160

Cys Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys

165 170175

Gly Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala

180 185190

Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys

- 47 035455

195 200205 lie Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly Lys Lys

210 215220

Cys Leu Trp Asp Phe Lys Vai Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp

225 230 235240

Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Vai Cys Ala Ser Asp

245 250255

Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser

260 265270

Ser Gly Vai Leu Leu Glu Vai Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Thr Gly

275 280285

Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

290 295300

Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

305 310 315320 lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His

325 330335

Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai

340 345350

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr

355 360365

Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly

370 375380

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie

385 390 395400

Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai

405 410415

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser

420 425430

Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu

435 440445

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

450 455460

Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai

465 470 475480

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met

485 490495

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser

500 505510

Pro Gly Lys

515 <210> 29 <211> 573 <212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид < 400> 29

Met Vai Arg Ala Arg His Gin Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 15 1015

Leu Leu Cys Gin Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gin Ala Gly Asn Cys

2530

Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Vai Leu Tyr Lys Thr 35 4045

- 48 035455

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys

55

Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 60

Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp 65 70

Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met lie

80

Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys 85 lie Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu

95

Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys

100

Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn

105 110

Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro

115 120

Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp Lys

125

Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly

130 135

Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala

140

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu

145 150

Gin Pro Glu Leu Glu Val Gin Tyr

155 160

Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys

165

Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser

170 175

Ser Thr Cys Val Val Asp Gin Thr

180

Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys

185 190

Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala

195 200

Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys Gly

205

Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser

210 215

Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly

225 230

Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys lie

235 240

Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie

245

Gin Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys

250 255

Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu

260 265270

Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn

275 280285

Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser

290 295300

Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser lie Ser

305 310 315320

Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gin Asp Tyr Ser Phe

325 330335

Pro lie Ser Ser lie Leu Glu Trp Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys

340 345350

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

355 360365

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu

370 375380

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

385 390 395400

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

405 410415

Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

420 425430

Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

435 440445

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys

450 455460

- 49 035455

Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

465 470 475480

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys

485 490495

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin

500 505510

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly

515 520525

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin

530 535540

Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn

545 550 555560

His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

565570 <210> 30 <211> 544 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 30

Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gin	Ala Lys	Asn Gly Arg Cys Gin Vai Leu
1	5	10	15
Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys 20 Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu 35 Trp Met lie Phe Asn Gly Gly 50 55	Glu Glu 25 Asp Vai 40 Ala Pro	Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu 30 Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 45 Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu 60
Thr Cys 65	Glu Asn Vai Asp 70	Cys Gly	Pro Gly Lys 75	Lys Cys Arg Met Asn 80
Lys Lys	Asn Lys Pro Arg 85	Cys Vai	Cys Ala Pro 90	Asp Cys Ser Asn lie 95
Thr Trp	Lys Gly Pro Vai 100	Cys Gly	Leu Asp Gly 105	Lys Thr Tyr Arg Asn 110
Glu Cys	Ala Leu Leu Lys 115	Ala Arg 120	Cys Lys Glu	Gin Pro Glu Leu Glu 125
Vai Gin 130	Tyr Gin Gly Arg	Cys Lys 135	Lys Thr Cys	Arg Asp Vai Phe Cys 140
Pro Gly 145	Ser Ser Thr Cys 150	Vai Vai	Asp Gin Thr 155	Asn Asn Ala Tyr Cys 160
Vai Thr	Cys Asn Arg lie 165	Cys Pro	Glu Pro Ala 170	Ser Ser Glu Gin Tyr 175
Leu Cys	Gly Asn Asp Gly 180	Vai Thr	Tyr Ser Ser 185	Ala Cys His Leu Arg 190
Lys Ala	Thr Cys Leu Leu 195	Gly Arg 200	Ser lie Gly	Leu Ala Tyr Glu Gly 205
Lys Cys 210	lie Lys Ala Lys	Ser Cys 215	Glu Asp lie	Gin Cys Thr Gly Gly 220
Lys Lys 225	Cys Leu Trp Asp 230	Phe Lys	Vai Gly Arg 235	Gly Arg Cys Ser Leu 240
Cys Asp	Glu Leu Cys Pro 245	Asp Ser	Lys Ser Asp 250	Glu Pro Vai Cys Ala 255
Ser Asp	Asn Ala Thr Tyr 260	Ala Ser	Glu Cys Ala 265	Met Lys Glu Ala Ala 270

- 50 035455

Cys Ser Ser Gly Vai Leu Leu Glu Vai Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

275 280285

Ser lie Ser Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gin Asp

290 295300

Tyr Ser Phe Pro lie Ser Ser lie Leu Glu Trp Thr Gly Gly Gly Thr

305 310 315320

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

325 330335

Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg

340 345350

Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro

355 360365

Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala

370 375380

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai

385 390 395400

Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

405 410415

Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr

420 425430 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu

435 440445

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys

450 455460

Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser

465 470 475480

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp

485 490495

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser

500 505510

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala

515 520525

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

530 535540 <210> 31 <211> 542 <212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид < 400> 31

Cys Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Vai Leu Tyr Lys 15 1015

Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr

2530

Ser Trp Thr Glu Glu Asp Vai Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met 35 4045 lie Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu Thr Cys

5560

Glu Asn Vai Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys 65 70 7580

Asn Lys Pro Arg Cys Vai Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp 85 9095

Lys Gly Pro Vai Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys

100 105110

Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu Val Gin

115 120125

Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly

130 135140

Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr

145 150 155160

Cys Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys

165 170175

Gly Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala

180 185190

Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys

195 200205 lie Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly Lys Lys

210 215220

Cys Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp

225 230 235240

Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp

245 250255

Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser

260 265270

Ser Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser lie

275 280285

Ser Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gin Asp Tyr Ser

290 295300

Phe Pro lie Ser Ser lie Leu Glu Trp Thr Gly Gly Gly Thr His Thr 305 310 315320

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 325 330335

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro

340 345350

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

355 360365

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

370 375380

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

385 390 395400

Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

405 410415

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser

420 425430

Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro

435 440445

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

450 455460

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

465 470 475480

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

485 490495

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

500 505510

Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

515 520525

- 52 035455

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

530 535 540 <210> 32 <211> 544 <212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид < 400> 32

Met Val Arg Ala Arg His Gin Pro Gly 1 5

Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu

15

Leu Leu Cys Gin Phe Met Glu Asp Arg 20 25

Ser Ala Gin Ala Gly Asn Cys 30

Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg

40

Cys Gin Val Leu Tyr Lys Thr 45

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser

55

Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 60

Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn 65 70

Thr Leu Phe Lys Trp Met lie

80

Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys lie 85

Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu

95

Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys

100 105

Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn

110

Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp

115 120

Cys Ser Asn lie Thr Trp Lys

125

Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys 130 135

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin

145 150

Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys 165

Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 140

Pro Glu Leu Glu Val Gin Tyr

155 160

Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser

170 175

Ser Thr Cys Val Val Asp Gin Thr

180

Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys 185 190

Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala

195 200

Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys Gly

205

Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser

210 215

Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly

225 230

Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys lie

235 240

Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie

245

Gin Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys

250 255

Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg

260

Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu

265 270

Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp

275 280

Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn

285

Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala

290 295

Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser

300

Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His

305 310

Ser Gly Ser Cys Asn Thr Gly Gly

315 320

Gly Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

325

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

330 335

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

340

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg

345 350

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

- 53 035455

355 360365

Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala

370 375380

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai

385 390 395400

Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

405 410415

Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr

420 425430

He Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu

435 440445

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys

450 455460

Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Vai Glu Trp Glu Ser

465 470 475480

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp

485 490495

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser

500 505510

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala

515 520525

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

530 535540 <210> 33 <211> 515 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 33

Gly Asn Cys Trp Leu	Arg	Gin	Ala Lys Asn Gly Arg 10	Cys	Gin	Vai Leu 15
1	5
Tyr	Lys Thr Glu Leu 20	Ser	Lys	Glu Glu Cys Cys Ser 25	Thr	Gly 30	Arg Leu
Ser	Thr Ser Trp Thr 35	Glu	Glu	Asp Vai Asn Asp Asn 40	Thr 45	Leu	Phe Lys
Trp	Met He Phe Asn 50	Gly	Gly 55	Ala Pro Asn Cys lie 60	Pro	Cys	Lys Glu
Thr 65	Cys Glu Asn Vai	Asp 70	Cys	Gly Pro Gly Lys Lys 75	Cys	Arg	Met Asn 80
Lys	Lys Asn Lys Pro 85	Arg	Cys	Vai Cys Ala Pro Asp 90	Cys	Ser	Asn lie 95
Thr	Trp Lys Gly Pro 100	Vai	Cys	Gly Leu Asp Gly Lys 105	Thr	Tyr 110	Arg Asn
Glu	Cys Ala Leu Leu 115	Lys	Ala	Arg Cys Lys Glu Gin 120	Pro 125	Glu	Leu Glu
Vai	Gin Tyr Gin Gly Arg 130	Cys 135	Lys Lys Thr Cys Arg 140	Asp	Vai	Phe Cys
Pro 145	Gly Ser Ser Thr	Cys 150	Vai	Vai Asp Gin Thr Asn 155	Asn	Ala	Tyr Cys 160
Vai	Thr Cys Asn Arg 165	He	Cys	Pro Glu Pro Ala Ser 170	Ser	Glu	Gin Tyr 175
Leu	Cys Gly Asn Asp 180	Gly	Vai	Thr Tyr Ser Ser Ala 185	Cys	His 190	Leu Arg

- 54 035455

Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly

195 200205

Lys Cys lie Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly

210 215220

Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu

225 230 235240

Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala

245 250255

Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala

260 265270

Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

275 280285

Thr Gly Gly Gly Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

290 295300

Gly Pro Ser	Val Phe Leu	Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr	Leu Met
305	310	315	320

lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 325 330335

Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 340 345350

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe 355 360365

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 370 375380

Lys Glu	Tyi	~ Lys Cys Lys	Val	Ser	Asn	Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie
385		390				395 400
Glu Lys	Thr	lie Ser Lys Thr	Lys	Gly	Gin	Pro Arg Glu Pro Gin Val

405 410 415

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser

420 425430

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu

435 440445

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

450 455460

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

465 470 475480

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

485 490495

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser

500 505510

Pro Gly Lys

515 <210> 34 <211> 513 <212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид < 400> 34

Cys Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Val Leu Tyr Lys 15 1015

Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr 20 2530

Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met 35 4045

- 55 035455

He Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys He Pro Cys Lys Glu Thr Cys

5560

Glu Asn Vai Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys 65 70 7580

Asn Lys Pro Arg Cys Vai Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp 85 9095

Lys Gly Pro Vai Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys

100 105110

Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu Vai Gin

115 120125

Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Vai Phe Cys Pro Gly

130 135140

Ser Ser Thr Cys Vai Vai Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Vai Thr

145 150 155160

Cys Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys

165 170175

Gly Asn Asp Gly Vai Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala

180 185190

Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys

195 200205 lie Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly Lys Lys

210 215220

Cys Leu Trp Asp Phe Lys Vai Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp

225 230 235240

Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Vai Cys Ala Ser Asp

245 250255

Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser

260 265270

Ser Gly Vai Leu Leu Glu Vai Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Thr Gly

275 280285

Gly Gly Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro

290 295300

Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser

305 310 315320

Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp

325 330335

Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn

340 345350

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai

355 360365

Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

370 375380

Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys

385 390 395400

Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr

405 410415

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr

420 425430

Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu

435 440445

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu

450 455460

- 56 035455

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys

465 470 475480

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu

485 490495

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

500 505510

Lys <210> 35 <211> 571 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 35

Met Vai Arg Ala Arg His Gin Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 15 1015

Leu Leu Cys Gin Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gin Ala Gly Asn Cys

2530

Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Vai Leu Tyr Lys Thr 35 4045

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser

5560

Trp Thr Glu Glu Asp Vai Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met He 65 70 7580

Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys He Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 85 9095

Asn Vai Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn

100 105110

Lys Pro Arg Cys Vai Cys Ala Pro

115 120

Asp Cys Ser Asn He Thr Trp Lys

125

Gly Pro Vai Cys Gly Leu Asp Gly

130 135

Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala

140

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu

145 150

Gin Pro Glu Leu Glu Vai Gin Tyr

155 160

Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys

165

Arg Asp Vai Phe Cys Pro Gly Ser

170 175

Ser Thr Cys Vai Vai Asp Gin Thr

180

Asn Asn Ala Tyr Cys Vai Thr Cys

185 190

Asn Arg He Cys Pro Glu Pro Ala

195 200

Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys Gly

205

Asn Asp Gly Vai Thr Tyr Ser Ser

210 215

Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser He Gly

225 230

Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys He

235 240

Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie

245

Gin Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys

250 255

Leu Trp Asp Phe Lys Vai Gly Arg

260

Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu

265 270

Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp

275 280

Glu Pro Vai Cys Ala Ser Asp Asn

285

Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala

290 295

Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser

300

Gly Vai Leu Leu Glu Vai Lys His

305 310

Ser Gly Ser Cys Asn Ser He Ser

315 320

- 57 035455

Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gin Asp Tyr Ser Phe

325 330335

Pro lie Ser Ser lie Leu Glu Trp Thr Gly Gly Gly Vai Glu Cys Pro

340 345350

Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro

355 360365

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr

370 375380

Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn

385 390 395400

Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

405 410415

Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai

420 425430

Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser

435 440445

Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys

450 455460

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

465	470	475	480
Glu Met Thr	Lys Asn Gin Vai Ser	Leu Thr Cys	Leu Vai Lys Gly Phe

485 490 495

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu

500 505510

Asn Asn Tyr	Lys Thr Thr Pro Pro Met	Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
515	520	525

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly

530 535 540

Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

545 550 555560

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

565570 <210> 36 <211> 542 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 36

Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gin	Ala	Lys Asn Gly Arg Cys Gin Vai Leu
1	5	10	15
Tyr	Lys Thr Glu Leu Ser Lys 20	Glu	Glu Cys Cys Ser 25	Thr Gly Arg Leu 30
Ser	Thr Ser Trp Thr Glu Glu 35	Asp 40	Vai Asn Asp Asn	Thr Leu Phe Lys 45
Trp	Met lie Phe Asn Gly Gly 50 55	Ala	Pro Asn Cys lie 60	Pro Cys Lys Glu
Thr 65	Cys Glu Asn Vai Asp Cys 70	Gly	Pro Gly Lys Lys 75	Cys Arg Met Asn 80
Lys	Lys Asn Lys Pro Arg Cys 85	Vai	Cys Ala Pro Asp 90	Cys Ser Asn lie 95
Thr	Trp Lys Gly Pro Vai Cys 100	Gly	Leu Asp Gly Lys 105	Thr Tyr Arg Asn 110
Glu	Cys Ala Leu Leu Lys Ala	Arg	Cys Lys Glu Gin	Pro Glu Leu Glu

- 58 035455

115 120

125

Vai Gin Tyr Gin Gly Arg Cys Lys

130 135

Lys Thr Cys Arg Asp Vai Phe Cys

140

Pro Gly Ser Ser Thr Cys Vai Vai

145 150

Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys

155 160

Vai Thr Cys Asn Arg lie Cys Pro

165

Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr

170 175

Leu Cys Gly Asn Asp Gly Vai Thr

180

Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg

185 190

Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg

195 200

Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly

205

Lys Cys lie Lys Ala Lys Ser Cys

210 215

Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly

220

Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys

225 230

Vai Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu

235 240

Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser

245

Lys Ser Asp Glu Pro Vai Cys Ala

250 255

Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser

260

Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala 265 270

Cys Ser Ser Gly Vai Leu Leu Glu

275 280

Vai Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

285

Ser lie Ser Glu Asp Thr Glu Glu

290 295

Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gin Asp

300

Tyr Ser Phe Pro lie Ser Ser lie 305310

Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

325

Leu Glu Trp Thr Gly Gly Gly Vai

315320

Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe

330335

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro

340 345350

Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai

355 360365

Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr

370 375380

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai

385 390 395400

Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

405 410415

Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser

420 425430

Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro

435 440445

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai

450 455460

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly

465 470 475480

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp

485 490495

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp

500 505510

Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His

515 520525

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

- 59 035455

530 535 540 <210> 37 <211> 540 <212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид < 400> 37

Cys Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Val Leu Tyr Lys 15 1015

Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr

2530

Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met

4045 lie Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu Thr Cys

5560

Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys 65 70 7580

Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp 85 9095

Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys

100 105110

Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu Val Gin

115 120125

Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly 130 135140

Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr

145 150 155160

Cys Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys

165 170175

Gly Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala

180 185190

Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys

195 200205 lie Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly Lys Lys

210 215220

Cys Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp

225 230 235240

Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp

245 250255

Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala	Met	Lys	Glu Ala	Ala 270	Cys	Ser
260	265
Ser Gly Val Leu Leu Glu Val Lys	His	Ser	Gly	Ser Cys	Asn	Ser	lie

275 280 285

Ser Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gin Asp Tyr Ser

290 295300

Phe Pro lie Ser Ser lie Leu Glu Trp Thr Gly Gly Gly Val Glu Cys

305 310 315320

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

325 330335

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val

340 345350

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe

355 360365

- 60 035455

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

370 375380

Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr

385 390 395400

Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

405 410415

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr

420 425430

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

435 440445

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

450 455460

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro

465 470 475480

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser

485 490495

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin

500 505510

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

515 520525

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

530 535540 <210> 38 <211> 549 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 38

Met Val Arg Ala Arg His Gin Pro 1 5

Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu

15

Leu Leu Cys Gin Phe Met Glu Asp

Arg Ser Ala Gin Ala Gly Asn Cys 25 30

Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly

40

Arg Cys Gin Val Leu Tyr Lys Thr 45

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys

55

Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 60

Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp 65 70

Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met lie

80

Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys 85 lie Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu

95

Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys

100

Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn

105 110

Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro

115 120

Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp Lys

125

Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly

130 135

Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala

140

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu

145 150

Gin Pro Glu Leu Glu Val Gin Tyr

155 160

Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys

165

Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser

170 175

Ser Thr Cys Val Val Asp Gin Thr

180

Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys 185 190

Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala

195 200

Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys Gly

205

Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

210 215220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys lie

225 230 235240

Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys

245 250255

Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu

260 265270

Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn

275 280285

Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser

290 295300

Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser lie Ser

305 310 315320

Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

325 330335

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

340 345350

Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

355 360365

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

370 375380

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser

385 390 395400

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu

405 410415

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

420 425430

Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro

435 440445

Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin

450 455460

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala

465 470 475480

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

485 490495

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

500 505510

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

515 520525

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser

530 535540

Leu Ser Pro Gly Lys 545 <210> 39 <211> 520 <212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид < 400> 39

Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gin Val Leu 15 10 15

Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu 20 25 30

- 62 035455

Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Vai Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 35 4045

Trp Met He Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu

5560

Thr Cys Glu Asn Vai Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn 65 70 7580

Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Vai Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie 85 9095

Thr Trp Lys Gly Pro Vai Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn

100 105110

Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu

115 120125

Vai Gin Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Vai Phe Cys

130 135140

Pro Gly Ser Ser Thr Cys Vai Vai Asp Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys

145 150 155160

Vai Thr Cys Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr

165 170175

Leu Cys Gly Asn Asp Gly Vai Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg

180 185190

Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly

195 200205

Lys Cys lie Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly

210 215220

Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys Vai Gly Arg Gly Arg Cys SerLeu

225 230 235240

Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Vai CysAla

245 250255

Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala

260 265270

Cys Ser Ser Gly Vai Leu Leu Glu Vai Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

275 280285

Ser lie Ser Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

290 295300

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

305 310 315320

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai

325 330335

Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai

340 345350

Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin

355 360365

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin

370 375380

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala

385 390 395400

Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro

405 410415

Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

420 425430

Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

435 440445

- 63 035455

Искусственная

Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

290 295300

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

305 310 315320

Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

325 330335

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

340 345350

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn

355 360365

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp

370 375380

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

385 390 395400

Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu

405 410415

Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

420 425430

Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie

435 440445

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

450 455460

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

465 470 475480

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys

485 490495

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu

500 505510

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

515 <210> 41 <211> 547 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 41

Met Val Arg Ala 1	Arg His 5	Gin Pro Gly	Gly Leu 10	Cys	Leu	Leu	Leu 15	Leu
Leu Leu Cys Gin	Phe Met	Glu Asp Arg	Ser Ala	Gin	Ala	Gly	Asn	Cys
20		25				30
Trp Leu Arg Gin	Ala Lys	Asn Gly Arg	Cys Gin	Val	Leu	Tyr	Lys	Thr

40 45

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 50 55 60

Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met lie

65	70	75	80
Phe Asn Gly	Gly Ala Pro 85	Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu 90	Thr Cys Glu 95
Asn Val Asp	Cys Gly Pro 100	Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn 105	Lys Lys Asn 110
Lys Pro Arg 115	Cys Val Cys	Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie 120 125	Thr Trp Lys
Gly Pro Val 130	Cys Gly Leu	Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn 135 140	Glu Cys Ala

- 65 035455

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu

145 150

Gin Pro Glu Leu Glu Vai Gin Tyr

155 160

Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys

165

Arg Asp Vai Phe Cys Pro Gly Ser

170 175

Ser Thr Cys Vai Vai Asp Gin Thr

180

Asn Asn Ala Tyr Cys Vai Thr Cys

185 190

Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro Ala

195 200

Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys Gly

205

Asn Asp Gly Vai Thr Tyr Ser Ser

210 215

Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie Gly

225 230

Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys lie

235 240

Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp lie

245

Gin Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys

250 255

Leu Trp Asp Phe Lys Vai Gly Arg

260

Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu

265 270

Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp

275 280

Glu Pro Vai Cys Ala Ser Asp Asn

285

Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala

290 295

Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser

300

Gly Vai Leu Leu Glu Vai Lys His 305 310

Ser Gly Ser Cys Asn Ser lie Ser

315 320

Thr Gly Gly Gly Vai Glu Cys Pro

325

Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala

330 335

Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 340 lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr

355 360

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 345 350

Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His 365

Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn

370 375

Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai

380

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

385 390

Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe

395 400

Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai

405

Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly

410 415

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser

420

Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie

425 430

Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys

435 440

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai

445

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

450 455

Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser

460

Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe

465 470

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu

475 480

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu

485

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

490 495

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

500

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai

505 510

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly

515 520

Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met

525

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

530 535

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser

540

Pro Gly Lys 545 <210> 42 <211> 518 <212> PRT <213 Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 42

Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gin Ala Lys 1 5

Asn Gly Arg Cys Gin Vai Leu 10 15

Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu 20 25

Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu 30

Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Vai

40

Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 45

Trp Met He Phe Asn Gly Gly Ala Pro

55

Asn Cys lie Pro Cys Lys Glu 60

Thr Cys Glu Asn Vai Asp Cys Gly Pro 65 70

Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn

80

Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Vai Cys 85

Ala Pro Asp Cys Ser Asn lie 90 95

Thr Trp Lys Gly Pro Vai Cys Gly Leu

100 105

Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn

110

Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys

115 120

Lys Glu Gin Pro Glu Leu Glu

125

Vai Gin Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys

130 135

Thr Cys Arg Asp Vai Phe Cys

140

Pro Gly Ser Ser Thr Cys Vai Vai Asp

145 150

Gin Thr Asn Asn Ala Tyr Cys

155 160

Vai Thr Cys Asn Arg lie Cys Pro Glu 165

Leu Cys Gly Asn Asp Gly Vai Thr 180

Pro Ala Ser Ser Glu Gin Tyr

170 175

Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg

185 190

Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg

195 200

Ser lie Gly Leu Ala Tyr Glu Gly

205

Lys Cys He Lys Ala Lys Ser Cys

210 215

Glu Asp lie Gin Cys Thr Gly Gly

220

Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys 225 230

Vai Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu

235 240

Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser

245

Lys Ser Asp Glu Pro Vai Cys Ala

250 255

Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser

260

Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala

265 270

Cys Ser Ser Gly Vai Leu Leu Glu

275 280

Vai Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

285

Ser He Ser Thr Gly Gly Gly Vai

290 295

Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

300

Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe

305 310

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

315 320

Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro

325

Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp

330 335

Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai

340

Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly

345 350

Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr

355 360

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn

365

Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai

370 375

Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp

380

- 67 035455

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

385 390 395400

Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu

405 410415

Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

420 425430

Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie

435 440445

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

450 455460

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

465 470 475480

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys

485 490495

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu

500 505510

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

515 <210> 43 <211> 516 <212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид < 400> 43

Cys Trp Leu Arg Gin Ala Lys Asn Gly 1 5

Arg Cys Gin Val Leu Tyr Lys

15

Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys 20 25

Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn 35 40

Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr 30

Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met 45 lie Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn

55

Cys lie Pro Cys Lys Glu Thr Cys

Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly 65 70

Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys

80

Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala 85

Pro Asp Cys Ser Asn lie Thr Trp

95

Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp

100

Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys 105 110

Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys

115 120

Glu Gin Pro Glu Leu Glu Val Gin

125

Tyr Gin Gly Arg Cys Lys Lys Thr

130 135

Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly

140

Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gin

145 150

Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr

155 160

Cys Asn Arg lie Cys Pro Glu Pro

165

Ala Ser Ser Glu Gin Tyr Leu Cys

170 175

Gly Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser

180

Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala

185 190

Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser lie

195 200

Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys

205 lie Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp

210 215 lie Gin Cys Thr Gly Gly Lys Lys 220

Cys Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly

225 230

Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp

235 240

Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp

245 250255

Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser

260 265270

Ser Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser lie

275 280285

Ser Thr Gly Gly Gly Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

290 295300

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

305 310 315320

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

325 330335

His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

340 345350

Val	His	Asn Ala 355	Lys Thr Lys	Pro Arg Glu 360	Glu Gin	Phe 365	Asn	Ser	Thr
Phe	Arg 370	Val Val	Ser Val Leu 375	Thr Val Val	His Gin 380	Asp	Trp	Leu	Asn
Gly 385	Lys	Glu Tyr	Lys Cys Lys 390	Val Ser Asn	Lys Gly 395	Leu	Pro	Ala	Pro 400
Ile	Glu	Lys Thr	Ile Ser Lys	Thr Lys Gly	Gin Pro	Arg	Glu	Pro	Gin

405 410 415

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val

420 425430

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

435 440445

Glu Trp Glu	Ser Asn Gly Gin	Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
450	455	460

Pro Met	Leu Asp Ser Asp Gly Ser	Phe Phe Leu Tyr Ser Lys	Leu Thr
465	470	475	480

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

485 490495

Met His Glu Ala	Leu His Asn His Tyr Thr Gin	Lys Ser Leu Ser Leu
500	505	510

Ser Pro Gly Lys

515 <210> 44 <211> 1641 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность < 220>

< 223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 44

atggtccgcg	cgaggcacca	gccgggtggg	ctttgcctcc	tgctgctgct	gctctgccag	60
ttcatggagg	accgcagtgc	ccaggctggg	aactgctggc	tccgtcaagc	gaagaacggc	120
cgctgccagg	tcctgtacaa	gaccgaactg	agcaaggagg	agtgctgcag	caccggccgg	180
ctgagcacct	cgtggaccga	ggaggacgtg	aatgacaaca	cactcttcaa	gtggatgatt	240
ttcaacgggg	gcgcccccaa	ctgcatcccc	tgtaaagaaa	cgtgtgagaa	cgtggactgt	300
ggacctggga	aaaaatgccg	aatgaacaag	aagaacaaac	cccgctgcgt	ctgcgccccg	360
gattgttcca	acatcacctg	gaagggtcca	gtctgcgggc	tggatgggaa	aacctaccgc	420
aatgaatgtg	cactcctaaa	ggcaagatgt	aaagagcagc	cagaactgga	agtccagtac	480
caaggcagat	gtaaaaagac	ttgtcgggat	gttttctgtc	caggcagctc	cacatgtgtg	540
gtggaccaga	ccaataatgc	ctactgtgtg	acctgtaatc	ggatttgccc	agagcctgct	600
tcctctgagc	aatatctctg	tgggaatgat	ggagtcacct	actccagtgc	ctgccacctg	660

- 69 035455 agaaaggcta cctgcctgct gggcagatct attggattag cctatgaggg aaagtgtatc720 aaagcaaagt cctgtgaaga tatccagtgc actggtggga aaaaatgttt atgggatttc780 aaggttggga gaggccggtg ttccctctgt gatgagctgt gccctgacag taagtcggat840 gagcctgtct gtgccagtga caatgccact tatgccagcg agtgtgccat gaaggaagct900 gcctgctcct caggtgtgct actggaagta aagcactccg gatcttgcaa caccggtggt960 ggagtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc1020 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg1080 gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag1140 gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc1200 agcgtcctca ccgtcgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc1260 tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc1320 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc1380 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc1440 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc1500 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc1560 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg1620 tctccgggta aatgagaatt c1641 <210> 45 <211> 1722 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 45 atggtccgcg cgaggcacca gccgggtggg ctttgcctcc tgctgctgct gctctgccag60 ttcatggagg accgcagtgc ccaggctggg aactgctggc tccgtcaagc gaagaacggc120 cgctgccagg tcctgtacaa gaccgaactg agcaaggagg agtgctgcag caccggccgg180 ctgagcacct cgtggaccga ggaggacgtg aatgacaaca cactcttcaa gtggatgatt240 ttcaacgggg gtgcccccaa ctgcatcccc tgtaaagaaa cgtgtgagaa cgtggactgt300 ggacctggga aaaaatgccg aatgaacaag aagaacaaac cccgctgcgt ctgcgccccg360 gattgttcca acatcacctg gaagggtcca gtctgcgggc tggatgggaa aacctaccgc420 aatgaatgtg cactcctaaa ggcaagatgt aaagagcagc cagaactgga agtccagtac480 caaggcagat gtaaaaagac ttgtcgggat gttttctgtc caggcagctc cacatgtgtg540 gtggaccaga ccaataatgc ctactgtgtg acctgtaatc ggatttgccc agagcctgct600 tcctctgagc aatatctctg tgggaatgat ggagtcacct actccagtgc ctgccacctg660 agaaaggcta cctgcctgct gggcagatct attggattag cctatgaggg aaagtgtatc720 aaagcaaagt cctgtgaaga tatccagtgc actggtggga aaaaatgttt atgggatttc780 aaggttggga gaggccggtg ttccctctgt gatgagctgt gccctgacag taagtcggat840 gagcctgtct gtgccagtga caatgccact tatgccagcg agtgtgccat gaaggaagct900 gcctgctcct caggtgtgct actggaagta aagcactccg gatcttgcaa ctccatttcg960 gaagacaccg aggaagagga ggaagatgaa gaccaggact acagctttcc tatatcttct1020 attctagagt ggaccggtgg tggagtcgag tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca1080 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc1140 cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accccgaggt ccagttcaac1200 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccacggga ggagcagttc1260 aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc accgtcgtgc accaggactg gctgaacggc1320 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc1380 tccaaaacca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag1440 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac1500 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc1560 atgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg1620 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac1680 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatgagaat tc1722

- 70 035455 <210> 46 <211> 4 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 46

Thr Gly Gly Gly 1 <210> 47 <211> 6 <212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Описание искусственной последовательности: синтетическая

6хН15-метка < 400> 47

His His His His His His 1 5

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Полипептид, содержащий первую аминокислотную последовательность и вторую аминокислотную последовательность, где первая аминокислотная последовательность содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 15 или 16, где первая аминокислотная последовательность заканчивается на аминокислоте, соответствующей любой из аминокислот 291-302 последовательности SEQ ID NO:4, где вторая аминокислотная последовательность содержит константный домен иммуноглобулина; и где полипептид способен связывать один или более из миостатина, GDF11, активина А или активина В.
2. Полипептид по п.1, где полипептид необязательно содержит линкерный полипептид.
3. Полипептид по п.2, где линкерный полипептид расположен между первой аминокислотной последовательностью и второй аминокислотной последовательностью.
4. Полипептид по п.3, где линкерный полипептид содержит последовательность TGGG.
5. Полипептид по любому из пп.1-4, где вторая аминокислотная последовательность содержит константный домен иммуноглобулина IgG.
6. Полипептид по любому из пп.1-5, где вторая аминокислотная последовательность содержит константный домен иммуноглобулина IgG, который обладает пониженной ADCC-активностью по сравнению с человеческим IgG1.
7. Полипептид по любому из пп.1-6, где вторая аминокислотная последовательность содержит константный домен иммуноглобулина IgG, который обладает пониженной CDC-активностью по сравнению с человеческим IgG1.
8. Полипептид по любому из пп.1-7, где вторая аминокислотная последовательность содержит константный домен иммуноглобулина IgG, выбранного из группы IgG1, IgG2 и IgG4.
9. Полипептид по любому из пп.1-8, где вторая аминокислотная последовательность содержит Fcчасть иммуноглобулина.
10. Полипептид по любому из пп.1-9, где первая аминокислотная последовательность содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO:15 или 16.
11. Полипептид по любому из пп.1-10, где первая аминокислотная последовательность заканчивается на аминокислоте, соответствующей положению 291 последовательности SEQ ID NO:4.
12. Полипептид по любому из пп.1-11, в котором гибридный белок фоллистатин связывается с одним или несколькими лигандами, выбранными из группы, состоящей из миостатина, фактора дифференцировки роста 11 (GDF-11), активина А и активина В с константой диссоциации (KD) менее 1 нМ, 100, 50 или 10 пМ.
13. Полипептид по любому из пп.1-12, где константный домен IgG является константным доменом IgG1.
14. Полипептид по п.13, где константный домен IgG1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17.
15. Полипептид по любому из пп.1-12, где константный домен IgG является константным доменом IgG2.
16. Полипептид по п.15, где константный домен IgG2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18.
17. Полипептид по любому из пп.1-16, где линкер непосредственно соединяет С-концевую часть первой аминокислотной последовательности с N-концевой частью второй аминокислотной последовательности.
18. Полипептид по п.17, где линкер имеет длину 1-10 аминокислот.

- 71 035455
19. Полипептид по п.1, где первая аминокислотная последовательность содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:15 или 16; где линкер непосредственно соединяет С-концевую часть первой аминокислотной последовательности с N-концевой частью второй аминокислотной последовательности; где линкер имеет длину 1-10 аминокислот; где константный домен IgG является константным доменом IgG2, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18.
20. Полипептид по п.19, где линкер состоит из последовательности TGGG.
21. Полипептид по п.1, где полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:43.
22. Полипептид по п.21, где конечный (карбоксиконцевой) лизин (K) последовательности SEQ ID NO:43 отсутствует.
23. Полипептид по п.1, где полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:42.
24. Полипептид по п.23, где конечный (карбоксиконцевой) лизин (K) последовательности SEQ ID NO:42 отсутствует.
25. Полипептид по п.23, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO:42.
26. Димер, содержащий два полипептида по любому одному из пп.1-25.
27. Гомодимер, содержащий два полипептида по любому одному из пп.1-25.
28. Фармацевтический препарат для лечения пациента, имеющего мышечное заболевание или расстройство; где композиция содержит полипептид по любому из пп.1-25 или димер по п.26.
29. Фармацевтический препарат по п.28, где заболевание или расстройство представляет собой амиотрофический боковой склероз.
30. Фармацевтический препарат по п.28, где заболевание или расстройство представляет собой болезнь Шарко-Мари-Тута.
31. Фармацевтический препарат по п.28, где заболевание или расстройство представляет собой плече-лопаточную лицевую мышечную дистрофию.
32. Нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по любому одному из пп.1-25.
33. Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п.32.