EA031812B1 - Новая вакцина из живых ослабленных shigella - Google Patents

Abstract

Предложены вакцина из живых ослабленных Shigella, которая основывается на шероховатой колонии штамма Shigella, лишенного О-антигенных липополисахаридов (ЛПС), и является неинвазивной посредством мутации плазмиды инвазии, в частности, для применения в целях иммунопрофилактики субъекта для предотвращения распространения инфекционных заболеваний, предпочтительно энтеральных заболеваний; штамм Shigella, который представляет собой штамм S. flexneri 2а с делецией генов rfbF, ipaB и/или ipaC; а также рекомбинантный плазмидный вектор на основе мутантной плазмиды Shigella инвазии, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере один гетерологический антиген, в котором плазмида мутирована по меньшей мере в одном из генов ipaB и/или ipaC.

Description

Изобретение относится к вакцине из живых ослабленных штаммов Shigella, произведенных специфическими целевыми мутациями, для индуцирования серотип независимого перекрестного иммунитета и экспрессии гетерологичных (не-Shigella) антигенов.

Уровень техники изобретения

Shigella является грамотрицательной энтеробактерией, вызывающей бактериальную дизентерию, которой подвержены широкие круги населения. Болезнь распространяется исключительно посредством прямого личного контакта или фекального загрязнения человеком пищи и воды. В итоге бактериальная дизентерия является эндемичной в регионах с близкими к оптимальным гигиеническими условиями. По оценкам специалистов в мире существует 165 млн. случаев заражения патогенами, среди которых 1 млн. летальных исходов приходится в основном на детей в возрасте до пяти лет, при этом Shigella, как установлено, является одним из наиболее распространенных бактериальных патогенов, выделенных в случаях острой диареи среди детей в возрасте от 1 до 5 лет в Юго-Восточной Азии и странах Африки южнее Сахары (Kotloff et al., Bull. W.H.O. 77: 651-666, 1999). Бактериальная дизентерия также широко распространена среди путешественников и военнослужащих, пребывающих в эндемичных странах. Давно признано, что вакцины имеют решающее значение для контролирования распространения дизентерии, но разработке вакцин против Shigella мешает серотипический иммунный ответ, т.е. после воздействия Shigella (природной или опосредованной вакциной) иммунная защита обычно ограничивается данным серотипом. Четыре вида рода Shigella включают в сумме 50 серотипов и подсеротипов, которые различаются их О-антигенными липополисахаридами (ЛПС, LPS).

Hong и др. (Molecular Microbiology 24: 779-91, 1997) описывают действие мутаций в хромосомных и кодированных плазмидой липополисахаридных генах на инвазию и устойчивость сыворотки Shigella flexneri. Мутации в генах rfb и rfaL ликвидируют все боковые цепи О-антигена или производят цепи значительно меньшей длины.

Nagy и др. (J. Infect. Diseases 198: 1699-706, 2008) описывают потенциальную вакцину из Salmonella enterica, регулирующую липополисахаридный мутант. Потеря транскрипционного антитерминатора RfaH приводит к гетерогенной длины цепям ЛПС, слегка шероховатого (gently rough) фенотипа.

Регулирующий белок RfaH, как показано, участвует в зависящей от фазы роста повышенной регуляции длинноцепочечных (т.е. большое число повторов О-антигенов) ЛПС молекул S. flexneri (Carter et al. Microbiology. 2007 Oct; 153 (Pt 10): 3499-507).

Главные факторы вирулентности Shigella, кроме О-антигенных ЛПС, удивительным образом сохраняются. Это подразумевает отсутствие иммунно-опосредованного эволюционного давления на эти антигены, обосновывающие принятое представление об О-антигене, являющемся единственным защитным антигеном. Тем не менее, существует заметный ответ антител против так называемых антигенов плазмиды инвазии (Ipa-s), особенно после многократного воздействия. Эти антигены кодируются на больших компонентах вирулентной формы плазмиды системы типа три секреции (T3SS), которая является необходимым условием для инвазии и, следовательно, вирулентности.

Структурно-функциональный анализ антигена В плазмиды инвазии фактора вирулентности Shigella (ipaB) раскрывают Guichon и др. (J. Bacteriol. 183: 1269-76, 2001). Мутанты ipaB были получены для корреляции функции белковыми субдоменами.

Menard и др. (J. Bacteriol. 17518: 5899-5906, 1993) раскрывают, что мутагенез генов ipa: ipaB, ipaC и ipaD Shigella flexneri, приводит к потере потенциала инвазии Shigella.

Антитела против белков ipa (например, незначительно консервативных антигенов) считаются незащитными, поскольку в противном случае может быть запущена перекрестная защита среди серотипов. Современные технологии изготовления вакцины полагаются почти исключительно на О-антиген опосредованный иммунитет, используя тот факт, что пять или шесть серотипов обеспечат высокую степень защиты от большинства эндемичных и эпидемиологических случаев дизентерии. Тем не менее, учитывая тот факт, что большинство из предложенных поливалентных вакцин основываются на очищенных субъединицах (О-антигенах) или нескольких живых ослабленных бактериях с различными типами Оантигенных ЛПС, они, скорее всего, будут слишком сложными и, следовательно, более дорогими. Кроме того, частичное покрытие серотипа, как ожидается, вызовет замену серотипов за счет коллективного иммунитета на основе иммунного давления на вакцинные серотипы и отсутствие и увеличение распространенности не-вакцинных серотипов, как показано в других мульти-серотипных патогенах, таких как Streptococcus pneumoniae. Таким образом, идеальная вакцина Shigella, как ожидается, обеспечит существенную перекрестную защиту от всех распространенных серотипов.

Кроме того, Shigella, энтеротоксигенная кишечная палочка (Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) является основным бактериальным возбудителем, ответственным за диарею путешественников, и является одной из основных причин смерти среди детей в эндемичных странах. Поэтому предпринимаются усилия по разработке вакцин, воздействующих одновременно на эти два патогена.

Диарея путешественников в настоящее время лечится антибиотиками; однако, наблюдается увеличение скорости устойчивости лечению среди штаммов Shigella, что делает контроль за заболеванием все более трудным. Кроме того, инфекции ЕТЕС могут иметь долгосрочные последствия, связанные с синдромом раздраженного кишечника. Общепризнано, что вакцинация была бы наиболее эффективным спо

- 1 031812 собом решения этой высоко неудовлетворенной медицинской потребности; тем не менее, в настоящее время не существует вакцин, доступных для профилактики этих заболеваний.

Два типа энтеротоксинов были идентифицированы в штаммах ЕТЕС, термолабильный токсин (LT) и термостабильный токсин (ST), или как ST, сопутствующий заболеванию свиней (STp) или ST, сопутствующий заболеванию человека (STa). LT является высоко гомологичным по своей структуре к холерному токсину. Субъединица А является активным компонентом токсина, которая воздействует на повышение активности аденилатциклазы. Она доставляется в клетки-хозяева субъединицами В, которые связываются с ганглиозидами на поверхности клеток. STa является небольшим (19 аминокислотным) неиммуногенным полипептидом, который обладает гуанилатциклазу стимулирующим действием. STm является мутантной формой ST, которая является нетоксичной, но все же иммуногенной. Такая STm считается безопасной для использования в качестве вакцинного антигена (Taxt et al. Infect. Immun. 78:1824-31, 2010).

Известно, что штаммы ЕТЕС также производят EAST1, термостойкий токсин, подобный по размерам и способу действия на ST, но имеющий другую последовательность нуклеотидов, первоначально идентифицированный в энтероаггегантных штаммах E.coli (Nataro and Kaper, Clin Microbiol Rev. 11: 142201, 1998; Zhang et al., Vet Microbiol. 123: 145-152, 2007).

Zheng и др. (World J. Gastroeneterol 11: 3411-18, 2005) раскрывают мутант asd штамма Shigella, коэкспрессирующий CS3 и LTB/STm энтеротоксигенной E.coli. Иммунизация мышей при пероральном введении вызывает антитела против липополисахарида CS3, LTB, ST и Shigella.

Xu и др. (Vaccine 21: 664-648, 2003) описывают живой ослабленный инвазивный мутант 2а rfbF серотипа Shigella flexneri в качестве носителя для вакцины рвотного ВИЧ (HIV gag) на основе ДНК.

Noriega и др. (Infection and Immunity 67(2): 782-788, 1999) раскрывают стратегию перекрестной защиты от 14 серотипов Shigella flexneri, связанную с использованием двух серотипов 2а и 3a. Описанные ослабленные штаммы являются штаммом S. flexneri 2а CVD1207 (AguaB-A Aset1 Asen) и штаммом S. flexneri 3a CVD 1211 (AguaB-A AvirG Asen).

Bemardini и др. (Infection and Immunity 69(2): 1072-1083, 2001) описывают мутантов Shigella flexneri 5, которые являются aroC мутантом и двойным мутантом purE aroC.

Levine и др. (Behring Institute Mitteilungen 98: 120-123, 1997) описывают ослабленный штамм S. flexneri 2a CVD 1203, который несет мутации в хромосомном гене aroA и гене плазмиды virG, а также вакцинного кандидата S. flexneri 2a CVD 1205, который несет мутацию делеции в guaB-A, делая его дефектным в синтезе нуклеиновой кислоты, и мутацию делеции в virG.

Задачей настоящего изобретения является обеспечение улучшенных вакцин Shigella, в частности, для профилактики желудочно-кишечных заболеваний, которые являются весьма актуальными для путешественников в эндемичных странах и детей младшего возраста, живущих в развивающихся странах. Такие вакцины могут основываться на вакцинном живом ослабленном штамме Shigella flexneri, способном гетерогенно экспрессировать антигены, полученные из различных патогенов, и индуцировать широкую защиту от бактериальных патогенов, в частности, шигеллез.

Сущность изобретения

Эта задача решается с помощью предмета, как заявлен ниже.

В соответствии с изобретением предлагается вакцина из живых ослабленных Shigella, которая основывается на шероховатой колонии штамма Shigella, лишенного О-антигенных липополисахаридов (ЛПС).

В частности, штамм Shigella является неинвазивным путем мутагенеза, в частности, мутации плазмиды инвазии.

В частности, вакцина по данному изобретению ослабляется мутагенезом одного или нескольких генов, участвующих в синтезе, транспорте и экспрессии ЛПС, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из генов в кластере оперона rfb, например расположенного на хромосоме между генами Gnd (6фосфоглюконатдегидрогеназы, 2089155-2090561) и GalF (UTP-глюкоза-1-фосфатуридилтрансферазы, 2101928-2102821) штамма Shigella flexneri 2а 2457T (Wei et al. Complete genome sequence and comparative genomics of Shigella flexneri serotype 2a strain 2457T. Infect Immun. 2003 May;71(5): 2775-86.) или находящегося на плазмиде вирулентности (Shigella sonnei). Особенно предпочтительным является мутагенез одного или нескольких генов в кластере генов rfb/wbb, кодирующих синтез О-антигенов, waaL, кодирующего О-антиген лигазу, wzx, кодирующего О-антиген флиппазу, участвующую в транспорте Оантигена, wzy/rfc, участвующих в полимеризации О-антигенов, генов в кластере генов rfa/waa, кодирующих синтез ядер ЛПС, регуляторных генов, вызывающих экспрессию О-антигенов, таких как rfaH, или потерю функции(й), которая приводит по меньшей мере к 90% снижению экспрессии О-антигенов.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления указанный мутагенез осуществляется путем делеции одного или более генов из rfb F, D, С, Е, J и/или I, или делеции их части или соответствующих генов в различных серотипах Shigella. Кроме того, может производиться мутагенез посредством инактивации, например, переходной, условной или конститутивной инактивации.

Указанный штамм Shigella предпочтительно выбирают из рода Shigella, например любой серотип

- 2 031812 или вид Shigella, в частности S. flexneri, S. sonnei, S. dysentheriae и S. boydii.

В частности, указанный штамм Shigella экспрессирует белки наружной мембраны, которые могут индуцировать перекрестно-реактивные антитела, в частности консервативные белки, в том числе OmpC, OmpA и OmpX, или антитела, кодированные на плазмиду инвазии.

Вакцина в соответствии с изобретением предназначается, в частности, для перекрестной защиты от различных серотипов и видов Shigella, в частности, в отношении любого из S. flexneri 2a, S. flexneri 6 и S. sonnei или энтероинвазивной кишечной палочки (Escherichia coli).

В соответствии с конкретным аспектом, указанная Shigella является неинвазивной путем дальнейшего мутагенеза плазмиды инвазии, в частности мутации плазмиды инвазии, которая содержит делецию генов ipaB и/или ipaC и/или других генов ipa.

Конкретно, указанная Shigella включает рекомбинантную эндогенную плазмиду инвазии, включающую по меньшей мере один ген, кодирующий гетерологичный антиген, для секреции или экспрессии указанного антигена на поверхности бактериальной клетки.

Предпочтительные варианты осуществления относятся к такой вакцине, в которой указанный антиген является защитным антигеном, полученным из патогена, например выбранного из группы, состоящей из бактериального антигена, предпочтительно токсина или фактора колонизации, вирусного антигена, предпочтительно из патогена, вызывающего энтеральные и мукозальные инфекции, грибкового антигена, предпочтительно из патогена, вызывающего энтеральные и мукозальные инфекции, и паразитарного антигена, предпочтительно из патогена, вызывающего энтеральные инфекции.

В частности, бактериальный антиген происходит из энтеропатогенных бактерий, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из

a) антигенов E.coli, в частности энтеротоксин, выбранный из группы, состоящей из LTB, мутантного LTA и ST штамма ЕТЕС, их субъединиц или слияний, антигенов из энтероагрегативной E.coli (EAEC), или Шига(Shiga)-подобного токсина 1 или 2,

b) антигенов Campylobacter jejuni,

c) антигенов Clostridium difficile, в частности токсины А и В,

d) антигенов Vibrio cholera, в частности антиген СТ-В, и

e) мутантов или гибридных белков а), b) с) или d).

В частности, бактериальным антигеном является энтеротоксин (ЕТЕС), содержащий В-субъединицу термолабильного токсина (LTB), термостойкого токсина (ST) или их субъединицы или слияния, предпочтительно LTB/STm, содержащий STm с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO. 1, которая произвольно исключает последовательность дикого типа человеческого ST.

В частности, указанный антиген ЕТЕС представляет собой слитый белок В-субъединицы LT и мутантного ST, предпочтительно LTB/STm слитый белок с аминокислотной последовательностью, как показано на фиг. 7, SEQ ID NO. 11-18 (LTA-промотор-LTB-ST-LTB терминатор нуклеотид и LTB-ST аминокислотные последовательности для 4 конструкций), например, с мутациями ST в положении 13 и/или 12, такие как P13F или P13G и/или N12R или N12K).

В частности, вирусный антиген происходит из желудочно-кишечных вирусов, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из ротавирусов и вируса Norwalk (калицивирусов).

В частности, антиген-паразит происходит из вызывающих диарею простейших, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из видов Giardia lamblia, Cryptosporidium и Entameba histolytica.

В частности, грибковый антиген происходит из вызывающих диарею грибов, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из Blastomyces dermatiditis и Histoplasma spp.

Согласно конкретному аспекту настоящего изобретения, вакцинный штамм Shigella дополнительно содержит делецию незаменимого хромосомного гена и вставку указанного гена в плазмиду инвазии, в частности гена рра или любого из accD, acpS, dapE, era, frr, ftsI, ftsL, ftsN, ftsZ, infA, lgt, lpxC, msbA, murA, murl, nadE, parC, proS, pyrB, rpsB, trmA, rho и rhoL.

Тем не менее, в соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения, вакцина предназначается для применения с целью профилактики или иммунопрофилактики субъекта для предупреждения инфекционных заболеваний, в частности энтеральных заболеваний, например, желудочно-кишечных заболеваний. В частности, заболевание выбирают из группы, состоящей из шигеллеза, дизентерии и диареи.

В соответствии с изобретением дополнительно предлагается способ предупреждения инфекционного заболевания субъекта, в частности, энтерального заболевания, в частности, посредством вакцинации и иммунизации указанного субъекта соответственно.

В частности, указанное энтеральное заболевание вызывается любым серотипом или видом Shigella.

Предпочтительно указанная (иммунная) профилактика включает введение вакцины в мукозальный или пероральный препарат.

В частности, вакцину вводят перорально или интраназально.

- 3 031812

Конкретный вариант осуществления относится к вакцине для применения в соответствии с изобретением, в которой используется поливалентная вакцина для экспрессии защитных антигенов Shigella и по меньшей мере одного патогена видов, отличающихся от Shigella, посредством включения защитного антигена указанного патогена в эндогенную плазмиду инвазии, причем указанное инфекционное заболевание вызвано любым серотипом или видом Shigella и/или указанного патогена.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен штамм Shigella, который является штаммом S. flexneri 2а, например S. flexneri 2а 2457Т, с делецией rfbF и, по меньшей мере один из генов ipaB и/или ipaC, или делецией их незаменимых частей.

В частности, указанный штамм Shigella может дополнительно содержать делеции незаменимого хромосомного гена и вставку указанного гена в плазмиду инвазии.

Предпочтительно указанный штамм Shigella включает рекомбинантную плазмиду инвазии, включающую по меньшей мере один ген, кодирующий гетерологичный антиген, для экспрессии и/или секреции указанного антигена.

Тем не менее, в соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предложен рекомбинантный плазмидный вектор на основе мутантной плазмиды Shigella инвазии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один гетерологичный антиген, отличающийся тем, что плазмида является мутированной по меньшей мере в один из генов ipaB и/или ipaC. В частности, это относится к мутации для делеции и/или инактивации некодирующей или кодирующей области, такой как регуляторные последовательности, функционально связанные с геном и геном, соответственно, предпочтительно делеции генов, которые делают бактериальную клетку-хозяина неинвазивной, в частности, делеции генов ipaB и/или ipaC, или делеции (незаменимой) их части.

Дополнительный особый аспект настоящего изобретения относится к бактериальной клеткехозяину, содержащей вектор в соответствии с изобретением, в которой указанная клетка-хозяин специально выбрана из родов Shigella, Escherichia, Salmonella, Campylobacter или Yersinia.

Указанная клетка-хозяин в частности содержит мутацию в эндогенной плазмиде инвазии. В частности, вектор в соответствии с настоящим изобретением является эндогенной плазмидой инвазии, т.е. плазмидой, эндогенной или гомологичной клетке-хозяину.

Фигуры чертежей

Фиг. 1. Способность перекрестной защиты живых ослабленных неинвазивных штаммов S. flexneri и S. Sonnei, не участвующих в синтезе О-антигенных ЛПС.

Группы 8-недельных BALB/c мышей иммунизируют интраназально вариантами CRP (10⁶ КОЕ) и CRN (10⁸ КОЕ) (а и b) мутантов S. flexneri 2a или альтернативно вариантами I фазы (10^5,5 КОЕ) и II фазы (10^7,5 КОЕ) S. sonnei (с) дважды с двух недельными интервалами. Контрольные группы ложно вакцинируют солевым раствором. Потом мышей заражают 10⁶ КОЕ S. flexneri 6 (а и с) дикого типа или 10^6,5 КОЕ S. sonnei (б) дикого типа тем же путем. Затем выживание контролируют в течение 14 дней. Фигуры показывают объединенные данные трех (b) или двух (а и с) независимых экспериментов с 5 мышами в каждой группе и повтор. Статистический анализ кривых выживаемости проводят с помощью теста Log-rank (Mantel-Cox). В случае, если выживаемость значительно отличается от ложно вакцинированных мышей, значение p показывается на графике.

Фиг. 2. Схематическое представление антигенных фенотипов различных используемых мутантов, а также предлагаемого различия в уровнях антител, которые они могут индуцировать.

Показаны О-антигены, их генетические детерминанты и антитела, вызванные ими. Представлены ipa и незначительные консервативные поверхностные антигены. Мутанты, экспрессирующие ipa, так и О-антигены (S. flexneri AaroC CRP и S. sonnei Фаза I), вызывают гуморальный иммунный ответ (образование антител), в основном против этих основных антигенов. В отличие от этого, потеря этих антигенов в вакцинных штаммах дает более высокий ответ на незначительные консервативные антигены. ip: плазмиды инвазии, chr.: хромосома, T3SS: система типа секреции дерево, ЛПС: липополисахарид.

Фиг. 3. Широко-реактивный мукозальный IgA, полученный от мышей, вакцинированных живыми ослабленными штаммами S. flexneri 2a.

Иммунологическая реакционная способность sIgA в образцах BAL (бронхоальвеолярного лаважа), собранных после 2 прививок гладкого ipa-положительного штамма (AaroC CRP) и двойного мутанта (ArfbF CRN) определяют посредством ELISA (иммуноферментного сорбционного анализа) на различных бактериальных клетках-мишенях. Реакционная способность выражается как отношение (реакционной способности образца AaroC CRP, деленной на реакционную способность образца ArfbF CRN), при том же самом разведении, чтобы сделать повторы сравнимыми. График показывает средние величины ± стандартная ошибка средних величин четырех экспериментов, проведенных образцами BAL, полученными из независимых прививок. Данные статистически сопоставляют анализом непараметрических критериев Манна-Уитни (Mann-Whitney) с значением, полученным на двойной (ipa и О-антиген) положительной цели (AaroC CRP, черный столбец).

- 4 031812

Фиг. 4. Дополнительная таблица 1: Олигонуклеотиды, используемые для генерации и подтверждения делеции мутантов. (SEQ ID NO. 3-10)

Фиг. 5. Схематическое представление ослабленного штамма Shigella flexneri 2а 2457Т.

A. Shigella flexneri 2a 2457T полностью секвестрированный штамм. О-антиген является серотипным детерминантом Shigella. Ген rfbF на хромосоме Shigella кодирует фактор, необходимый для синтеза Оантигенного компонента ЛПС. Плазмида инвазии, присутствующая во всех патогенных штаммах Shigella, кодирует антигены плазмиды инвазии (IpaA-D), которые являются важными молекулярными компонентами системы секреции III типа (T3SS). T3SS является посредником ключевых процессов целевых взаимодействий клеток Shigella и в конечном итоге приводит к передаче факторов Shigella в клеткумишень, которая позволяет патогену вторгнуться и распространиться. IpaB и ipaC являются ключевыми и незаменимыми компонентами этой системы.

B. В мутант Shigella flexneri 2а Т2457 rfbF-ipaB/C вводятся две делеции. Делеция гена rfbF из хромосомы исключает синтез О-антигена и приводит к шероховатому штамму, который ослабляется и индуцирует серотип независимый иммунитет после вакцинации. Делеция генов ipaB и С на плазмиды инвазии нарушает T3SS, таким образом делая мутант Shigella неинвазивным (и конго красный (Congo Red) отрицательным).

C. С целью стабилизации плазмиды инвазии из мутантного штамма Shigella, незаменимый хромосомный ген (неорганическая пирофосфатаза, рра (фиг. 7 SEQ ID NO. 24)) удаляется из хромосомы и повторно вводится в виде части синтетической конструкции в плазмиды инвазии.

Фиг. 6: Схематическое изображение плазмиды инвазии рСР301 штамма Shigella flexneri 2a 301 с кластером ipa, позиции праймеров для делеции ipaB/C (pKD1,2), и контрольные праймеры для мониторинга делеции ipaB/C (ko1,2). Положение места введения синтетического гена также показано между ipaJ и элементом IS100.

Фиг. 7. Последовательности

Ген слитого белка LT-B/mST, кодирующего ST с мутацией в положении 13 аминокислоты (от Pro до Phe) вместе с промотором eltAB и концевыми последовательностями GP-P13F (нуклеотидная последовательность, SEQ ID NO. 11),

Слитый белок LT-B/mST с мутацией в ST в положении 13 аминокислоты (от Pro до Phe) GP-P13F (аминокислотная последовательность, SEQ ID NO. 12),

Ген слитого белка LT-B/mST, кодирующий ST с мутацией в положении 13 аминокислоты (от Pro до Gly) вместе с промотором eltAB и концевыми последовательностями

GS-P13G (нуклеотидная последовательность, SEQ ID NO. 13),

Слитый белок LT-B/mST с мутацией в ST в положении 13 аминокислоты (от Pro до Gly)

GS-P13G (аминокислотная последовательность, SEQ ID NO. 14),

Ген слитого белка LT-B/mST, кодирующий ST с мутацией в положении 12 аминокислоты (от Asn до Arg) вместе с промотором eltAB и концевыми последовательностями

GS-N12R (нуклеотидная последовательность, SEQ ID NO. 15),

Слитый белок LT-B/mST с мутацией в ST в положении 12 аминокислоты (от Asn до Arg)

GS-N12R (аминокислотная последовательность, SEQ ID NO. 16),

Ген слитого белка LT-B/mST, кодирующий ST с мутацией в положении аминокислоты 12 (от Asn до Lys) вместе с промотором eltAB и концевыми последовательностями

GS-N12K (нуклеотидная последовательность, SEQ ID NO. 17),

Слитый белок LT-B/mST с мутацией в ST в положении 12 аминокислоты (от Asn до Lys)

GS-N12K (аминокислотная последовательность, SEQ ID NO. 18),

Прямой контрольный ПЦР-праймер для подтверждения мутантных штаммов ipa делеции ipa co1 (SEQ ID NO. 19),

Обратный контрольный ПЦР-праймер для подтверждения мутантных штаммов ipa делеции ipa co2 (SEQ ID NO. 20),

Прямой ПЦР-праймер для создания мутантных штаммов ipa делеции ipa pKD1 (SEQ ID NO.21),

Прямой ПЦР-праймер для создания мутантных штаммов ipa делеции ipa pKD2 (SEQ ID NO. 22),

Нуклеотидная последовательность генов ipaB и ipC, выделенных из плазмиды инвазии ipaBC (SEQ ID NO. 23).

Нуклеотидная последовательность гена ppa, имплантированного из хромосомы в плазмиду инвазии Ген ppa Shigella (SEQ ID NO. 24).

Прямой ПЦР-праймер для создания мутантных штаммов рра делеции ppa pKD-F (SEQ ID NO. 25)

Обратный ПЦР-праймер для получения мутантных штаммов рра делеции рра pKD-R (SEQ ID NO. 26)

Прямой контрольный ПЦР-праймер для подтверждения мутантных штаммов рра делеции

- 5 031812 ppa koi (SEQ ID NO. 27)

Обратный контрольный ПЦР-праймер для подтверждения мутантных штаммов рра делеции рра ko2 (SEQ ID NO. 28)

Линкерный пептид, введенный между LT-B и mST для гибкого складывания

GGGGS (SEQ ID NO. 29)

Фиг. 8. ПЦР-амплификация хромосомной области, где ген rfbF удален.

М: маркер размера ДНК; WT: Shigella flexneri 2a 2457T дикого типа, ген rfbF с фланговой областью, фрагмент 1100 п.н. (bp); mt: мутант ArfbF, замена гена геном хлорамфеникол, 1300 bp.

Фиг. 9. ПЦР-амплификация области плазмиды инвазии, где удалены гены ipaC и ipaB.

М: маркер размера ДНК; WT: Shigella flexneri 2a 2457T дикого типа, гены ipaB и ipaC с фланговыми областями, фрагмент 1600 п.н.; mt: мутант AipaBC плазмиды инвазии, замена гена геном канамицина, 2570 bp.

Фиг. 10.

A. Структура полигенных конструкций, кодирующих незаменимый ген Рра, слитый белок LTBmST и белок устойчивости к канамицину.

Экспрессия слитого белка LTB-mST приводится посредством LTA-промотера и транскрипция прекращается терминатором LTB. Указываются аминокислотные последовательности LTB-ST 4 конструкций с детоксифицирующей мутацией ST (P13F, P13G, N12R, N12K) (мутированные кодоны подчеркнуты). Сокращения: CS: сайт клонирования; H1 и Н2: гомологичные регионы 1 и 2 на плазмиде инвазии, чтобы помочь гомологичной рекомбинации; рра: неорганический ген пирофосфатаза; pro: промотер; term: терминатор; GGGGS: Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO. 29 линкер пента-аминокислоты между LTB и mST); kan: ген устойчивости к канамицину.

B. Введение генов ЕТЕС в плазмиды инвазии Shigella.

М: маркер размера ДНК; WT: Shigella flexneri 2a 2457T дикого типа, межгенная область плазмиды инвазии, фрагмент 450 п.н. (bp); mt: генный мутант LT-B + STm плазмиды инвазии, замена гена геном канамицина, 2800 bp,

C. Анализ иммуноблоттинга для обнаружения LTB.

Рекомбинантный LT-B, а также фракции супернатанта культуры E.coli и Shigellla (секретируемых белков) разделяют посредством SDS-PAGE, белки переносят на нитроцеллюлозные мембраны и детектируют моноклональными антителами анти-LTB. Дорожка 1: Shigella flexneri дикого типа (отрицательный контроль); дорожка 2: Shigella flexneri, несущая ген слияния в плазмиде инвазии; дорожка 3: DH5a E.coli, трансформированные вектором pGET, содержащим синтетическую конструкцию, как показано на фиг. 10А, дорожка 4: штамм ЕТЕС, экспрессирующий LT (положительный контроль).

Фиг. 11. Г етерологическая защита, индуцированная вакцинным штаммом Shigella flexneri 2а с инженерной комбинированной мутацией rfbF и ipaClipaB.

Группы из 5 мышей иммунизируют интраназально сублетальными дозами штаммом Shigella flexneri 2а 2457Т (5 х 10⁵ КОЕ/мышь) дикого типа или его изогенными мутантами делеции 2457TArfb, 2457TAipaBC, 2457TArfbAipaBC (все при 108 КОЕ/мышь), или ложно иммунизируют фосфатно-солевым буфером (PBS). Три одинаковые прививки проводят с 2-недельными интервалами. Через неделю после последней booster иммунизации мышей заражают летальной дозой штамма S. sonnei (2 х 10 КОЕ/мышь). Выживание животных наблюдают ежедневно.

Подробное описание изобретения

Специфические термины, используемые в данном описании, имеют следующие значения.

Термин ослабленный используется для описания вирулентного штамма Shigella, который модифицирован таким образом, что он больше не способен вызвать заболевание, т.е. модифицированный штамм является авирулентным.

Термин живой в отношении ослабленной Shigella используется для описания Shigella, которая способна расти и размножаться. Соответственно, живой штамм Shigella по настоящему изобретению используется в ослабленной живой вакцине и в особенности способен колонизировать толстый кишечник субъекта, но не вызывает клинические симптомы, связанные с энтеральными заболеваниями, вызванными энтеральными или желудочно-кишечными патогенами. Кроме того, живой штамм по настоящему изобретению является особенно способным ограниченно реплицироваться в вакцинированный субъект и индуцировать защитный иммунный ответ, который является защитным от вирулентных штаммов Shigella. Ослабленные бактерии согласно изобретению могут быть генетически сконструированы для экспрессии гетерологичных антигенов, не экспрессируются природной бактерией, так что ослабленная бактерия действует в качестве носителя гетерологичного антигена.

Термин антиген, используемый в соответствии с настоящим изобретением, в частности, относится к любому антигенному детерминанту, который может быть возможно распознанным сайтом связывания антитела. Особенно предпочтительными антигенами являются те молекулы или структуры, которые уже доказали, что они являются или способны быть иммунологически или терапевтически релевантными, особенно те, для которых клиническая эффективность была протестирована. Используемый термин,

- 6 031812 в частности, включает молекулы или структуры, выбранные из антигенов, содержащих иммунодоступные и иммунорелевантные эпитопы, в частности консервативные антигены, найденные в одном или нескольких видах или серотипе. Иммунодоступные эпитопы, как правило, представлены или включены в антигены, экспрессированные на поверхности клеток.

Используемый термин защитный антиген обозначает такие антигены, которые вызывают иммунный ответ in vivo, так, чтобы вызвать антитела, нейтрализующие антигена. Это обеспечивает эффективную защиту при активной иммунизации антигеном. Белковые антигены являются предпочтительными антигенами из-за присущей им способности вызывать как клеточные, так и гуморальные иммунные реакции.

Термин гетерологичный используется в данном документе в частности в отношении антигена, и понимается как антиген, чужеродный к клетке, экспрессирующей указанный гетерологичный антиген. Что касается клетки или штамма Shigella, в частности, термин относится к антигенам, чужеродным для клетки или штамма Shigella соответственно. Таким образом, такой гетерологичный или чужеродный антиген не будет экспрессирован в клетке или штамме дикого типа, но рекомбинантным содержащему гетерологичный ген, кодирующий указанный антиген. Таким образом, указанная рекомбинантная клетка или штамм будет экспрессировать гетерологичный антиген, например, на поверхности клетки. Клетки по настоящему изобретению могут быть генетически сконструированы для экспрессии гетерологичного антигена, например, нетоксичный компонент или форма LT и/или ST или STm. Такие клетки индуцируют иммунный ответ против гетерологичного антигена, а также нативных антигенов и, следовательно, улучшают защиту, обеспечиваемую вакциной.

Термин перекрестно-реактивный по отношению к используемым антигенам означает антигены с общими эпитопами между различными патогенами, в том числе, например, различные серотипы одного вида или различных видов бактерий. Перекрестно-реактивные антигены, как правило, являются консервативными структурами. Перекрестно-реактивные эпитопы могут происходить из одних и тех же антигенов, экспрессируемых различными патогенами или из различных антигенов с похожей структурой.

Специфические перекрестно-реактивные антигены распознаются перекрестно-реактивными антителами, например антитела антисыворотки, изолированные или рекомбинантные антитела. Такие перекрестно-реактивные антитела могут распознавать перекрестно-реактивные антигены различных патогенов. Специфические перекрестно-реактивные антитела являются нейтрализующими антителами.

Перекрестно-защитный вакцинный или иммунный ответ понимается как реакция, которая защищает от инфекции, по крайней мере, посредством одного другого патогена, например других видов или серотипа, который не совпадает с используемыми для вызывания реакции. Перекрестно-защитная эффективность, как правило, может быть испытана с разной антисывороткой от субъектов, которые подверглись воздействию различных патогенных микроорганизмов.

Когда перекрестно-реагирующий антиген предназначается для вызвания перекрестно-защитного иммунитета, он может быть испытан на модели животных, например путем иммунизации животных перекрестно-реактивным антигеном, полученным из одного патогена, вызывающего иммунный ответ, и заражение животных посредством по меньшей мере одного патогена с другой формой по отношению к той, которая используется, чтобы вызвать реакцию. В качестве примера, такой перекрестно-защитный иммунитет против более чем одного серотипа Shigella или других энтероинвазивных бактерий с перекрестно-реактивными антигенами, таких как E.coli, в особенности относится к защите от различных вариаций в пределах видов бактерий различных индивидуумов, например, изменения на уровне подвида. Группа сероваров с общими антигенами называется серогруппой или серотипом.

Основой для развития широкого спектра, например, мульти-штамма и/или мульти-серотипа и/или мульти-видов вакцин Shigella является выявление перекрестно-реактивных антигенов, которые широко распространены в сероварах Shigella. Это, в частности включает изоляты, связанные с инфекциями человека.

Когда поливалентная вакцина предназначается для индуцирования перекрестно-защитного иммунитета против различных патогенов, иммунный ответ, как правило, вызывается несколькими антигенами, например отдельными антигенами из различных патогенов. В качестве примера, такие поливалентные вакцины могут основываться, по меньшей мере, на двух различных защитных антигенах из различных видов, таких как полученных из Shigella и Escherichia, а также и на других бактериальных, вирусных, грибковых или паразитарных антигенах. Перекрестно-защитная, поливалентная вакцина может, например, быть испытана на модели животных путем иммунизации животных вакциной, содержащей различные защитные антигены, полученные из по меньшей мере двух различных патогенов, вызывающих иммунный ответ, и заражение животных одним, двумя или более патогенами.

Основой для развития кандидата вакцины в нескольких видах на основе специфических ослабленных бактерий Shigella согласно изобретению является идентификация защитных антигенов, или перекрестно-реактивной для воздействия или отсутствия действия на ряд разных серотипов, которые широко распространены в различных патогенных видах, против которых испрашивается охрана.

Использованный термин энтеральный, также известный как энтеросолюбильный, в особенности в связи с заболеванием или патогеном, относится к состоянию или патогену заболевания, относящегося к

- 7 031812 или влияющего на кишечник, например дизентерия или диарея. В частности, такое энтеральное заболевание относится к инфекционным заболеваниям толстой кишки. Специфические симптомы включают кровавую, заполненную слизью диарею; боль в животе; лихорадку и потерю жидкости организмом. Диарейные заболевания относятся к условиям, приводящим к трем или более частому жидкому или жидкому стулу в день, или более частому стулу, по сравнению с обычным для этого человека. Энтеральный патоген понимается как вызывающий энтеральное заболевание субъекта, или при инфицировании указанным патогеном интоксикацию субъекта токсином, в частности энтеротоксином.

Существует множество причин инфекционного кишечного заболевания, такие как дизентерия или диарея, которые включают в себя вирусы, бактерии, грибки и паразиты. Примерами являются следующее: Norovirus является наиболее распространенной причиной вирусной диареи у взрослых, а ротавирусная инфекция является наиболее частой причиной у детей в возрасте до пяти лет. Типы 40 и 41 аденовирусов и астровирусы вызывают значительное количество инфекций. Бактерия Campylobacter является распространенной причиной бактериальной дизентерии или диареи, но загрязнения Salmonellae, Shigellae и некоторыми штаммами Escherichia coli (E. coli) являются частыми на некоторых территориях. У пожилых людей, особенно тех, которых лечили антибиотиками для несвязанных инфекций, токсин, произведенный Clostridium difficile, часто вызывает сильный понос. Примеры паразитов включают Giardia lamblia, которые могут вызвать хронические инфекции, и Entamoeba histolytica. Примером энтерального заболевания, на которое может быть направлена вакцина по изобретению, являются шигеллез (Shigellosis) и ЕТЕС-связанная диарея.

Термин эндогенный, используемый по отношению к плазмиде, означает плазмиду, которая возникает в определенной клетке-хозяине. Эндогенная плазмида может быть создана генной инженерией для получения рекомбинантной эндогенной плазмиды, например рекомбинантными способами, чтобы спроектировать плазмиду in situ, т.е. внутри клетки-хозяина, несущей родную эндогенную плазмиду, или после удаления из клетки-хозяина, подвергая ее лабораторной манипуляции, а затем вновь введенную в клетку-хозяина того же типа. Инвазивный фенотип Shigella специально присваивается эндогенной плазмидой вирулентности220-kb, которая также называется плазмидой инвазии, или родной или эндогенной плазмидой инвазии. Эндогенная плазмида Shigella инвазии является специально предложенной в соответствии с настоящим изобретением для целей рекомбинации, или в виде изолированных плазмды инвазии или рекомбинации in situ.

Термин незаменимый, используемый по отношению к гену, понимается как относящийся к гену, необходимому для живого организма, чтобы выжить, например для бактериальных клеток для репликации. Мутация незаменимого гена, например делеция и/или инактивация, вызовет смертельный фенотип или не-воспроизводимую клетку. Незаменимые гены Shigella могут быть мутированы для удаления гена(ов) в хромосоме Shigella, и, кроме того, чтобы включить ген(ы) в плазмиды инвазии для стабилизации плазмиды инвазии. Это обеспечивает выращивание Shigella со стабильной рекомбинантной эндогенного плазмидой инвазии. Среди основных генов Shigella существуют гены рра, accD, acpS, dapE, era, frr, ftsI, ftsL, ftsN, ftsZ, infA, lgt, lpxC, msbA, murA, murI, nadE, parC, proS, pyrB, rpsB, trmA, rho и rhoL.

Инактивация гена всегда понимается, как относящийся к переходной, индуцируемой или конститутивно понижающей модуляции гена так, чтобы уменьшить или ингибировать экспрессию генного продукта. Это может быть сделано в частности мутацией генной или регуляторной последовательности, функционально связанной с геном, таким как промоторы, гены-усилители и т.д., которые регулируют экспрессию гена. Среди инактивирующих мутаций существуют в частности те, которые приводят к снижению или подавлению экспрессии полинуклеотидов или генов, например, генов, кодирующих факторы вирулентности, или приводят к экспрессии соответствующих нефункциональных белков, например нефункциональных факторов вирулентности.

Термин инвазивный или неинвазивный, используемый по отношению к гену, следует понимать следующим образом, инвазивные патогенные бактерии способны к инвазии эукариотических клеток. Например, после инвазии Shigella может размножаться внутри клеток и распространиться на соседние эпителиальные клетки, что приводит к разрушению тканей и характерной патологии шигеллез. Среди генов, опосредующих инвазивность Shigella, существуют, например, гены ipa, кодирующие антигены плазмиды инвазии. Делеция и/или инактивация по меньшей мере одного из таких генов может привести к неинвазивной Shigella.

Тест Серени (Sereny) является стандартным тестом для определения инвазивности организмов, таких как Shigella или Escherichia coli. (Wood et al. J. Clin. Microbiol. 24: 498-500, 1986). Тест проводится путем инокуляции суспензии бактерий в глаза морской свинки. Тяжелый слизисто-гнойный конъюнктивит и тяжелый кератит указывают на положительный тест.

Термин выделенный или выделение, используемый по отношению к нуклеиновой кислоте, и, в частности, по отношению к вектору, плазмиде и, в частности плазмиде Shigella инвазии, относятся к такому соединению, которое в достаточной степени отделено от окружающей среды, с которой оно естественно было связано с тем, чтобы существовать в по существу, чистой форме. Термин по существу чистый или очищенный, как используется в данном описании, относятся к препарату, содержащему, по меньшей мере 50% (вес./вес.), предпочтительно по меньшей мере 60, 70, 80, 90 или 95% соединения,

- 8 031812 такого как молекулы или плазмиды нуклеиновой кислоты. Чистота измеряется с помощью методов, пригодных для соединения (например, хроматографических методов, электрофореза в полиакриламидном геле, анализа ВЭЖХ (HPLC) и т.п.).

Выделенный не обязательно означает исключение искусственных или синтетических смесей с другими соединениями или материалами, или присутствие примесей, которые не мешают основной активности, и которые могут присутствовать, например, вследствие неполной очистки. В частности, выделенные молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также включают и химически синтезированные.

При ссылке на изолированную плазмиду инвазии настоящего изобретения, этот термин относится к плазмиде, которая отделена от цитоплазмы, в которой она появилась. Выделенная плазмида может дополнительно представлять собой плазмиду, полученную непосредственно биологическими или синтетическими способами и отделенную от других компонентов, присутствующих в процессе ее производства.

Термин мутагенез по отношению к используемому гену, означает мутацию генетической последовательности, в частности, любую из делеции, замены, вставки по меньшей мере одного нуклеотида или любые их комбинаций для получения мутантного гена. В частности это относится ко всему гену(ам) или его значительной части, например делеции по меньшей мере 50% гена. Термины мутагенеза и мутация в данном описании являются взаимозаменяемыми.

Термин шероховатый по отношению к грамотрицательным бактериям, таким как Shigella, означает другие кроме гладкой и, в частности, включают слегка шероховатые (т.е. O-ag синтез подавляется) или глубоко шероховатые бактерии. Используемый термин шероховатый может включать такие характеристики, как колонии неправильной морфологии, и может включать, например, волнистую и/или дольчатую морфологии. Термин в частности, означает, что штамм не способен и/или, по существу, не может производить О-полисахарид. Повторяющиеся полимеры гликанов, содержащиеся внутри ЛПС, упоминаются как О-антиген, О-полисахарид или О-(боковые) цепи бактерии. О-антиген присоединяется к основным олигосахаридам и содержит наиболее удаленный домен молекулы ЛПС. Наличие или отсутствие О-цепей определяет, считается ли ЛПС шероховатой или гладкой. Бактериальные штаммы, которые изменили О-антигенные структуры, меняют свой облик из гладкой в матовый при выращивании на чашках с агаром. Полноразмерные О-цепочки дают гладкий ЛПС, в то время как отсутствие или уменьшение цепей делает ЛПС шероховатой. Гладкие бактерии включают полные ядро и О-антиген. Шероховатые бактерии включают лишенный О-антигенный ЛПС, означающее отсутствие О-антигена или уменьшенную длину цепи О-антигена или уменьшенное количество гладких цепей ЛПС. Термин слегка-шероховатый относится к подгруппе необработанных бактерий, которые имеют уменьшенную длину цепи О-антигена или уменьшенное количество гладких цепей ЛПС. Глубоко шероховатые бактерии теряют части ядра ЛПС, следовательно, также отсутствие О-антигенов.

Термин лишенный О-антигенных ЛПС, используемый по отношению к шероховатой Shigella, в частности, относится к менее 50%, или менее 40%, или менее 30%, или менее 20%, или менее 10%, или, по существу, или полному отсутствию О-антигенного ЛПС, как определено в стандартном анализе.

Стандартный тест может быть использован для определения шероховатых характеристик штамма.

Например, фенотип мутантов ЛПС может, например, определяться SDS-PAGE разделением ЛПС и окрашиванием серебром или тестами агглютинации с использованием серотип-специфической иммунной сыворотки.

Шероховатая Shigella могут быть получена путем ослабления, например, мутацией, по меньшей мере, одного гена или значительной его части, например, путем делеции и/или инактивации гена, который участвует в синтезе, транспорте и/или экспрессии ЛПС, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из генов в кластере оперона rfb, или одного или более генов в кластере генов rfb/wbb, кодирующих синтез О-антигенов, waaL, кодирующего О-антиген лигазу, wzx, кодирующего О-антиген флиппазу, участвующую в транспорте О-антигена, wzy/rfc, участвующих в полимеризации О-антигенов, генов в кластере генов rfa/waa, кодирующих синтез ядер ЛПС, регуляторных генов, вызывающих экспрессию Оантигенов, таких как rfaH, или потерю функции(й), которая приводит по меньшей мере к 90% снижению экспрессии О-антигенов.

Специфические примеры генов, участвующих в синтезе ЛПС сахара, являются rfbA, В, D и С. Специфические примеры генов, участвующих в трансферазе ЛПС сахара, являются rfbF и G. Специфический пример гена, вовлеченного в полимеразу О-антигенного ЛПС, является rfc/wzy.

Кластер оперона rfb находится на хромосоме или на плазмиде инвазии (Shigella sonnei). Специфическими генами в этом кластере являются гены rfb F, D, С, Е, J и/или I.

Используемый термин рекомбинантный относится к молекуле или структуре, которая по природе не встречается в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот содержат два или более естественно встречающихся последовательности, которые связаны друг с другом таким образом, который не имеет место в природе. Рекомбинантный белок относится к белку, который является кодированным и/или экспрессированным рекомбинантной нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не находятся в одинаковом виде внутри родной (т.е. нерекомбинантной) формы клетки и/или экспресси

- 9 031812 руют собственные гены, которые в противном случае аномально сверхэкспрессируются, подэкспрессируются и/или не экспрессируются вообще из-за преднамеренного вмешательства человека. Рекомбинантные клетки содержат, по меньшей мере, один рекомбинантный полинуклеотид или полипептид. Рекомбинации, рекомбинировать и генерирование рекомбинации нуклеиновой кислоты, как правило, включают сборку по меньшей мере двух фрагментов нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантные белки и рекомбинантные нуклеиновые кислоты остаются функциональными (в нормальном режиме), т.е. сохраняют свою активность или проявляют повышенную активность в клетке-хозяине. В любом случае ослабленная бактерия, такая как ослабленная Shigella настоящего изобретения, считается рекомбинантной клеткой. Конструкция нуклеиновой кислоты, такой как плазмида или вектор, нуклеиновая кислота (например, полинуклеотид), полипептид, или клетка-хозяин называется «рекомбинантной», когда она является не встречающейся в природе, искусственной или инженерной. Рекомбинантная плазмида Shigella инвазии, в частности, разработана для включения конкретной делеции и/или инактивации одного, двух или более полинуклеотид(ов) или генов, например, по меньшей мере, одной делеции генов, кодирующих антигены плазмиды инвазии, и/или дополнительно содержит один или более гетерологичных генов, таких как гены, кодирующие защитные антигены.

Стабильной рекомбинантной плазмидой Shigella инвазии является плазмида Shigella, которая отображает по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или более 90% удерживания в культуре Shigella клеток в условиях, выбранных для поддержания плазмиды в культуре клеток. Конкретным примером стабильной рекомбинантной плазмиды Shigella инвазии является рекомбинантная клетка-хозяин Shigella, которая мутирована для делеции и/или инактивации незаменимого гена, расположенного на хромосомном локусе, и интегрированного в локусе плазмиды инвазии. В то время как Shigella без плазмиды инвазии не будет расти или не может быть воспроизведена, Shigella, несущая эндогенную плазмиду инвазии, сможет расти и размножаться in vivo.

Используемый термин «вектор» относится к транспортному средству, с помощью которого последовательность ДНК или РНК, например, чужой (гетерологичный) ген, могут быть введены в клеткухозяина таким образом, чтобы преобразовать хозяина и способствовать экспрессии (например, транскрипции и трансляции) введенной последовательности. Плазмиды являются предпочтительными векторами по данному изобретению, в частности, плазмида Shigella инвазии, в том числе, в частности, эндогенная плазмида инвазии.

Векторы обычно содержат ДНК передающегося агента, в который вставлена внешняя ДНК. Общий способ вставки одного сегмента ДНК в другой сегмент ДНК включает использование ферментов, называемых ферменты рестрикции, которые расщепляют ДНК в специфических сайтах (специфические группы нуклеотидов), называемых сайтами рестрикции. Кассета относится к ДНК, кодирующей последовательность или сегмент ДНК, которая кодирует продукт экспрессии, которые могут быть вставлены в вектор, в определенных сайтах рестрикции. Сайты рестрикции кассеты предназначаются для обеспечения вставки кассеты в правильную рамку считывания. Как правило, чужеродный ДНК вставляется в один или более сайтов рестрикции вектора ДНК, а затем переносится вектором в клетку-хозяина вместе с передающейся векторной ДНК. Сегмент или последовательность ДНК, имеющие вставленную или добавленную ДНК, такие как экспрессирующий вектор, можно также назвать конструкции ДНК. Общим типом вектора является плазмида, которая, как правило является автономной молекулой двухустойчивых ДНК, обычно бактериального происхождения; которая может легко принимать дополнительную (чужую) ДНК и которая может быть легко введена в подходящую клетку-хозяина.

Shigella по настоящему изобретению предпочтительно содержит рекомбинантный эндогенный плазмид инвазии, используемый в качестве вектора для экспрессии одного или более гетерологичных генов. Таким образом, в соответствии с предпочтительным вариантом Shigella является штаммом без искусственного вектора, это означает, что штамм не содержит искусственных плазмид, кроме того, любой (рекомбинантной) эндогенной плазмиды.

Плазмидный вектор часто содержит кодирующую ДНК и промотор ДНК и имеет один или более сайтов рестрикции, пригодных для вставки чужеродной ДНК. Кодирующая ДНК является последовательностью ДНК, которая кодирует определенную аминокислотную последовательность для конкретного белка или фермента. Промотер ДНК является последовательностью ДНК, которая инициирует, регулирует или иным образом опосредует или контролирует экспрессию кодирующей ДНК. Промотер ДНК и кодирующая ДНК могут быть из того же гена или из разных генов, и могут быть из тех же или разных организмов. Рекомбинантные векторы клонирования часто включают в себя одну или несколько систем репликации для клонирования или экспрессии, один или несколько маркеров для отбора в хозяине, например, устойчивость к антибиотикам, и одну или более кассеты экспрессии. Термин система экспрессии означает клетку-хозяина, и совместимый вектор при подходящих условиях, например, для экспрессии белка, кодируемого чужеродной ДНК, осуществляется с помощью вектора и вводится в клеткухозяина.

Таким образом, ослабленная Shigella в соответствии с изобретением специально используется в развитии живой вакцины.

- 10 031812

Ослабленную Shigella специально получают из вирулентного штамма любого из видов и серогрупп (серотипов) Shigella. Например, любой из следующих групп: серогруппа A. S. dysenteriae (12 серотипов) серогруппа В: S. flexneri (15 серотипов и субсеротипов) серогруппа С: С. boydii (18 серотипов) серогруппа D: S. sonnei (1 серотип).

Вирулентный штамм Shigella, как используется для целей ослабления, может быть клинически известным вирулентным штаммом или штаммом, который определен как содержащий факторы вирулентности. В частности, штамм выбирают из любого из S. S. flexneri, S. sonnei, S. dysenteriae and S. boydii, предпочтительно S. flexneri 2a, такие как S. flexneri 2a 2457T (ATCC 700930, ДНК = 700930D-5), или CIP 107659 (Институт Пастера, Франция).

Вирулентный штамм Shigella может быть изменен с помощью методов, известных в данной области, включая многократное последовательное прохождение, чувствительное к температуре затухания, мутации и т.п., так что полученный в результате штамм ослабляется, в частности авирулентен, не способен вызвать заболевание у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления модификации вирулентных штаммов приводят к делеции и/или инактивации гена, в том числе к снижению или подавлению экспрессии полинуклеотидов или генов, кодирующих факторы вирулентности или приводят к экспрессии нефункциональных факторов вирулентности.

Существуют несколько способов, хорошо известных в данной области техники, для получения ослабляющих мутаций, например, для уменьшения или отмены экспрессии полинуклеотид. Например, мутации могут быть введены в заданном месте, например, в область промотора или в кодирующую последовательность для получения нонсенс-мутации, с помощью ДНК-рекомбинантной технологии. ДНКрекомбинантные технологии включают клонирование интересующего гена, модификацию последовательности гена путем сайт-направленного мутагенеза, дигерирование фермента рестрикции с последующим повторным лигированием и последующей заменой гена дикого типа мутантным геном.

Подходящие стандартные ДНК-рекомбинантные методики хорошо известны в данной области и описаны, в частности, в Sambrook и др, «Molecular Cloning: A Laboratory Manual». (1989), 2-е издание (Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Ослабляющие мутации могут быть проведены с использованием методов, хорошо известных в данной области техники, в том числе клонирования ДНК-последовательности гена дикого типа в вектор, например плазмиду, произвольной вставки селектируемого маркера в последовательность клонированной ДНК или делеции части последовательности ДНК, что приводит к его инактивации. Делеция может быть введена, например, сокращением (отрезанием) последовательности ДНК с помощью ферментов рестрикции, которые разрезают в двух точках или в непосредственной близости от кодирующей последовательности и лигируют вместе два конца в оставшейся последовательности. Альтернативно, может быть построен мутантный аллель, в котором фланкирующие области гена-мишени амплифицируют раздельно и связывают непосредственно друг с другом в отдельной реакции ПЦР перекрытия, с пропуском промежуточной последовательности-мишени. Плазмида, несущая мутантную последовательность ДНК, может быть трансформирована в бактерию с помощью известных методов, таких как электропорация химической трансформации или конъюгации. В этом случае можно путем соответствующего выбора для идентификации мутантов, где последовательность инактивированной ДНК рекомбинирована в хромосому бактерии и ДНК-последовательность дикого типа, производится нефункционально путем гомологичной рекомбинации.

Кроме того, если используют ген устойчивости к антибиотику, как правило, его извлекают из бактерий, прежде чем они будут использованы в качестве вакцины. В соответствии с методом Datsenko и др. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 97, 6640-6645 (2000)) мутагенез основывается на системе бактериофага лямбда Red-рекомбиназы, которая позволяет специфическое нарушение обоих кодирующих плазмид и хромосомных генов. Стратегия заключается в замене таких генов, например, с возможностью выбора гена резистентности к антибиотику, который генерируется с помощью ПЦР с использованием праймеров, с 40-60 расширениями гомологии нуклеотидов к гену-мишени. Рекомбинация на Red-основе является посредником в этих гомологичных последовательностях. После отбора, ген устойчивости к антибиотику может также быть устранен с помощью вспомогательного вектора, который экспрессирует рекомбиназу FLP, которая использует прямые повторы FRT (мишени распознавания FLP), фланкирующие ген устойчивости к антибиотику.

В некоторых вариантах осуществления мутации могут быть введены в заданном месте в хромосомной или внехромосомной ДНК, например, плазмида, с помощью вставки, делеции или замены одного нуклеотида на другой, например, точечной мутации, что приводит к мутантному гену, который имеет пониженную или не имеет экспрессии. Мутация должна произвести штамм Shigella, который имеет пониженную способность вызывать дизентерию. Предпочтительно, мутация является мутацией делеции, где нарушение гена вызвано делецией нуклеиновых кислот. Такая мутация может, например, быть выполнена путем делеции непрерывного участка пар оснований. Даже очень небольшие делеции, такие как участки из 10 пар оснований, могут привести к гену, который не кодирует ни белок, ни неактивный белок. Даже делеции одной пары оснований может не привести ни к белку, ни нефункциональному белку,

- 11 031812 так как в результате такой мутации, другие пары оснований уже не находятся в правильной рамке считывания или транскрипция была ингибирована или уменьшена. Более предпочтительно, больше растяжения удаляют, например, 100 пар оснований или, по крайней мере, значительную часть гена, например по меньшей мере 50% от гена. Еще более предпочтительно удаляют весь ген.

Четкие и сознательно выполненные мутации, вызывающие делецию фрагментов или всего гена, или их комбинации, имеют преимущество, по сравнению с классическими индуцированными мутациями, так как они не будут возвращаться к дикому типу. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения вакцинный штамм содержит живой ослабленный штамм Shigella, в котором мутация в гене, кодирующем фактор вирулентности, содержит делецию или введение для нарушения полинуклеотидной последовательности, кодирующей фактор вирулентности, так что соответствующий белок не производится или белок не функционирует.

Примерами факторов вирулентности, выбранных для инженерно ослабленного штамма Shigella, являются rfb, ipaB, ipaC или aroC.

Ослабление может быть, например, быть достигнуто путем делеции и/или инактивации одного или более из следующих генов, или (значительной) его часть, или любого из модуляторов указанный гена, осуществляющего ослабление указанных генов: rfb, aroA, aroC, aroD, aroE, virG и ipaA-D. Предпочтительные ослабленные штаммы Shigella по изобретению представляют собой двойные мутанты или несколько мутантных штаммов по меньшей мере с тремя или более смягчающими мутациями. Предпочтительные комбинации генов-мишеней для ослабления мутации включают по меньшей мере один ген rfb (например, гены rfb F, D, С, Е, J, и/или I) и по меньшей мере один ген ipa (например ipaB, ipaC).

В качестве альтернативы к ослабленным мутациям, проводимой генной инженерией, также возможно идентифицировать имеющиеся в природе штаммы Shigella, которые являются авирулентными или содержат один или более ранее существовавших мутаций в полинуклеотиде или гене, кодирующем фактор вирулентности, которые могут быть использованы в качестве живых вакцинных штаммов, Эти природные штаммы Shigella, выделенные стандартными методами, могут быть подвергнуты дальнейшему мутагенезу или ДНК-рекомбинантным методикам для построения двойных или полимутантных штаммов.

Методы идентификации бактерий, которые имеют одну или несколько мутаций в генах, кодирующих факторы вирулентности, известны специалистам в данной области техники. Соответственно, обычные методы для обнаружения штаммов Shigella, которые были мутированы описанными выше способами, включают анализ северного и западного блоттинга, ПЦР, ИФА (ELISAs) и цитотоксичность, как описано в другом месте. Мутантные штаммы, без функциональных генов, кодирующих специфические факторы вирулентности, могут быть легко выбраны с использованием стандартных методик.

Гены, кодирующие факторы вирулентности, которые подвергаются ослаблению, могут быть переносящими плазмиды. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления модификация вирулентного штамма Shigella включает мутации одного или более эндогенных плазмид Shigella. Термин плазмида, в частности, относится к цитоплазматической ДНК, которая копирует независимо от бактериальной хромосомы. Мутация частей вирулентности Shigella или плазмиды инвазии или даже устранение плазмиды могут быть предусмотрены. Тем не менее, предпочтительно, что ослабленный Shigella еще содержит эндогенную плазмиду инвазии, более предпочтительно стабильную плазмиду инвазии. Это обеспечивает стабильность ослабленного штамма, в частности по отношению к потенциальной потере плазмиды инвазии ослабленной клеткой или потенциального поглощения (родной) плазмиды инвазии, полученной из Shigella дикого типа, которые могут возникнуть с нестабильным штаммом или нестабильной плазмидой инвазии.

Плазмиды Shigella инвазии являются эндогенными в большинстве штаммов Shigella. Хотя плазмида инвазии может быть потеряна при культивировании штамма Shigella, она может быть сконструирована для получения рекомбинантной, обладающей высоким уровнем стабильности, который делает ее привлекательной мишенью для развития в качестве полезного вектора, чтобы включить гетерологичные гены, кодирующие антигены, в частности, защитные антигены.

Рекомбинантная плазмида инвазии настоящего изобретения, полученная в описанных далее примерах, имеет свои признаки, как указано на фиг. 5 и 10А.

Плазмида настоящего изобретения включает ее производные, автономно реплицируемые в Shigella. Такое производное может быть одной, соответствующей плазмидой инвазии, часть которой, кроме области, ответственной за инвазию удаляется из нее, или одна соответствующая плазмида инвазии, часть которой вставляется в другую (гетерологичную) последовательность ДНК. Таким образом может быть получен пригодный челночный вектор, автономно репликацируемый в Shigella. Такой вектор может быть использован в любом живом вакцинной штамме ослабленных Shigella в соответствии с изобретением, или в любых других бактериях, способных включить плазмиду инвазии, в том числе энтероинвазивную Escherichia.

Эндогенная плазмида Shigella инвазии хорошо охарактеризована в данной области техники, и на этих знаниях делается выбор участков для рекомбинации в таких плазмидах, а также подходящих условий для размножения, например, в положении между ntds 103187-103328 между генами IS100 и ipaJ (эти

- 12 031812 позиции определяются для рСР301 плазмиды инвазии штамма Shigella flexneri 2a 301).

Плазмиду предпочтительно используют в качестве простой копии плазмиды.

Плазмида настоящего изобретения может быть предусмотрена в изолированном виде, например, путем приготовления фракции ДНК цитоплазмы из клеток Shigella по общему способу получения плазмидной ДНК из клеток. Кроме того, фракция ДНК может быть очищена в градиенте плотности методом центрифугирования, электрофореза в агарозном геле и тому подобное.

Для построения челночного вектора быть использована вся последовательность или ее часть. При использовании ее части такая часть, как правило, содержит область, ответственную за репликацию плазмиды, но область, не нужная для репликации, могут быть исключена. Например, область, необходимая для репликации, может быть определена путем лигирования части, полученной расщеплением плазмиды рестриктазой (ферментом рестрикции) в плазмиду, автономно репликацируемую в Shigella, преобразованием другой бактерии, такой как другой штамм Shigella или штамм Escherichia, с получением рекомбинантной плазмиды, и определением, если рекомбинантная плазмида питается от трансформанта.

Вакцина в соответствии с изобретением может быть приготовлена с использованием известных методик для выработки ослабленных бактериальных вакцин. Вакцина предпочтительно предназначается для перорального введения, например, в виде водного раствора или лиофилизированного (высушенного) порошка для разведения в подходящем буфере перед введением. Восстановление предпочтительно проводят в буфере при подходящей рН, чтобы обеспечить жизнеспособность бактерий. В целях защиты ослабленных бактерий и вакцины от желудочной кислотности, преимущественно вводят защитный агент, такой как бикарбонат натрия, с каждым введением вакцины. Альтернативно вакцина представлена в лиофилизированной инкапсулированной форме.

Вакцинные штаммы можно вводить в фармацевтически приемлемом носителе, например, в виде спрея или смешивать с пищей и/или водой, или поставлять в смеси с подходящим носителем, разбавителем, адъювантом или наполнителем, таким как стерильная вода, физиологический раствор, глюкоза и т.п. Штаммы вакцины могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН буферные агенты, адъюванты, желирующие или усиливающие вязкость добавки, консерванты, ароматизаторы, красители и т.п., в зависимости от способа введения и приготовления желаемого. Фармацевтические носители для приготовления фармацевтических композиций и лекарственных средств хорошо известны в данной области техники, как это изложено в учебниках, таких как Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18 издание (Mack Publishing Co.).

Штаммы вакцины по настоящему изобретению могут быть введены в дозах и с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области медицины или ветеринарии, с учетом таких факторов, как возраст, пол, вес, виды и состояния субъекта-реципиента, а также пути введения. Способ введения может быть чрескожным, мукозальным (например, оральный, назальный, анальный, вагинальный) или парентеральным (внутрикожный, внутримышечный, подкожный, внутривенный, или внутрибрюшинным). Вакцинные штаммы можно вводить отдельно, или они могут быть введены совместно или последовательно с другими способами лечения или терапии. Формы введения могут включать суспензии, сиропы или эликсиры и препараты для парентерального, подкожного, внутрикожного, внутримышечного или внутривенного введения (например, вводимые или впрыскиваемые инъекции), таких как стерильные суспензии или эмульсии.

Вакцина может быть использована в вакцинации субъекта, в частности человека, или же теплокровного млекопитающего, в частности, включая свиней.

После изготовления вакцинный штамм по настоящему изобретению может быть введен субъекту в ходе активной иммунотерапии, в частности, путем вакцинации, чтобы предотвратить энтеральное заболевание, в частности дизентерию, вызванную Shigella и произвольно гетерологичными энтеральными или диарейными патогенами. Это может быть достигнуто с помощью любой из вакцин согласно изобретению, которые являются перекрестно-защитными и/или поливалентными.

Перекрестно-защитные и/или поливалентные вакцины по изобретению, нацеленные на инфекции, вызванные Shigella и, возможно, другими микроорганизмами, такими как желудочно-кишечные микроорганизмы, могут, следовательно, предотвратить или лечить их введением эффективной дозы вакцины в соответствии с изобретением. Вводимая дозировка в конечном итоге может быть подобрана по усмотрению лечащего врача, но будет зависеть от различных факторов, включая размеры и вес субъекта, а также тип сформулированной вакцины. Тем не менее, дозировки, включающие пероральное введение от 10⁷ до 10¹¹, например от 10⁸ до 10¹⁰, бактерий на дозу, могут быть удобны для 70 кг взрослого человека-хозяина.

Инфекции, вызванные Shigella и, произвольно, другим микроорганизмом, особенно патогеном, могут, следовательно, быть предотвращены или излечены введением эффективной дозы вакцины в соответствии с изобретением. В конечном итоге используемая дозировка может быть выбрана по усмотрению лечащего врача, но будет зависеть от различных факторов, включая размеры и вес субъекта и тип сформулированной вакцины. Тем не менее, дозировки, включающие пероральное введение от 10⁷ до 10¹¹, например от 10⁸ до 10¹⁰, бактерий на дозу могут быть удобно для 70 кг взрослого человека-хозяина.

В соответствии с конкретными примерами, были созданы изогенные ослабленные мутанты прототипа штамма S. flexneri 2a. Мутанты были не в состоянии синтезировать О-антигены (ArfbF) или - пред

- 13 031812 ставляя подход хорошо зарекомендовавшей себя вакцины - были ауксотрофными (ДагоС). Вирулентность этих мутантов в модели легких мышей показывает сопоставимый уровень затухания. Впоследствии, были выделены производные обоих мутантов, в которых отсутствует плазмида инвазии, кодирующая Ipa-S (конго красный негативный/CRN/мутанты). Потеря инвазивного фенотипа в этих последних мутантах увеличивает затухание до дальнейшем неопределяемого уровня. Эта серия мутантов S. Jlexneri 2а, лишенных О-антигенов (ArfbF CRP) или белков ipa (AaroC CRN), или обоих (ArfbF CRN) или ни одного из этих антигенов (AaroC CRP) используется для иммунизации мышей сублетальными дозами интраназально. Впоследствии мышей заражают летальными дозами гетерологичных S. flexneri 6 (фиг. 1а) или S. sonnei (фиг. 1b) штаммов дикого типа. Ослабленный мутант, экспрессирующий ipa и О-антигены (AaroC CRP), не может обеспечить защиту на уровне, превышающем наблюдаемый у ложно вакцинированных мышей. В отличие от этого двойной мутант, лишенный основных иммуногенных групп антигенов, вызвающих высокую защиту от обоих гетерологичных штаммов заражения. Даже потеря только плазмидами вирулентности (AaroC CRN), оказалось, улучшает перекрестную защиту. Чтобы подтвердить эти результаты, группы мышей также иммунизируют на I фазе (Ipa и О-антигена положительного) и II фазе (Ipa и O-антигена отрицательной) вариантов изолята S. sonnei. Фазы II вакцинный штамм обеспечивает высокую защиту от действий S. flexneri 6, в то время как иммунизации полностью вирулентными штаммами I фазы, не представляет существенных отличий в выживании, по сравнению с предусмотренным солевым раствором (фиг. 1с).

Для поддержания концепции, что улучшенная перекрестная защита возникает от повышения иммуногенности малых антигенов при этом известном мутанте (т.е. при потере доминирующих антигенов см. фиг. 2), иммунологическая реактивность сыворотки и образцы бронхоальвеолярного лаважа (BAL), полученные от иммунизированных мышей по сравнению с ELISA на целых бактериальных клетках, которые экспрессируют оба или ни одной из основных антигенных групп (фиг. 3).

Образцы BAL, полученные от мышей, вакцинированных мутантом AaroC CRP (как ipa и О-антиген положительный) являются более реактогенными к инвазивной гладкой гомологичной мишени, проверяющей то, что эти антигены, по сути, доминируют иммунный ответ. Напротив, потеря иммунодоминантных антигенов на вакцинном штамме (ArfbF CRN) приводит к улучшению реактогенности к гомологичному целевому штамму, лишенному обоих О- и Ipa антигенов.

Кроме того, гетерологичный штамм S. sonnei легче распознается образцом BAL, полученным от мышей, вакцинированных двойным мутантом. Эти результаты подтверждают, что существует более высокий титр мукозальных антител против этих общих незначительных антигенов, которые являются доступными на этих целей. Интересно, что это явление не было очевидным в случае сыворотки IgG (данные не показаны), поддерживая ранние выводы, показывающие, что sIgA, а не сыворотка IgG опосредует защиту в этой модели.

Технологии настоящей вакцины (в целом, а также к Shigella, в частности) зависят от использования основных иммуногенных антигенов. Однако, для того, чтобы уклониться от иммунного ответа, эволюционное давление выбирается мульти иммунологично отличительным вариантам этих антигенов, которые формируют основу классификации патогенов в серотипах. Поэтому использование серотипопределяющих основных антигенов может давать только частичную защиту от патогена, если все серотипы не могут быть включены в вакцину (например, в случае вакцин полиовируса). Комбинация из наиболее распространенных серотипов может дать относительно широкую защиту, тем не менее, она может быть кратковременной вследствие замены серотипа (т.е. появляются менее распространенные серотипы, которые заполняют пробел, открытый исчезновением серотипов вакцины). Все это требует время от времени оптимизации вакцины, например, путем включения дополнительных серотипов в поливалентных вакцин. Тем не менее, из-за явлений, таких как антигенная конкуренция и помехи, а также финансовых соображений, максимальное количество вновь открываемых серотипов будет ограничено.

С другой стороны, различные серотипы данного бактериального патогена совместно используют и распределяют огромное количество консервативных антигенов на своей поверхности. Тот факт, что они, возможно, остались консервативными означает, что они или не доступны на поверхности (не защитные антигены) и/или их функции настолько незаменимы для патогенеза, что не допускает модификацию их антигенной структуры. Это подтверждается белками ipa Shigella, которые являются высоко консервативными (в связи с их сложной функцией в инвазии) и очень иммуногенными, до сих пор не может вызвать перекрестную защиту, вероятно, потому, что они экспрессируются только после контакта с клеткоймишенью, поэтому, вероятно, не доступны для опосредованного антителами защитного механизма.

Как показано на фиг. 2, иммунодоминантные антигены, такие как Iipa и О-антигенов вызывают такой иммунный ответ, который позволяет вызывать меньше антител в отношении незначительных антигенов. Учитывая, что Ipa-s не являются защитными и О-антигены являются высоко варьируемыми, Shigella может эффективно уклоняться от иммунного ответа. Несмотря на это, показывается, что делеции этих классов антигенов значительно улучшают перекрестно-защитный потенциал живых вакцинных штаммов.

В отношении мутации плазмиды инвазии, вместо выбора мутанта спонтанной делеции плазмиды

- 14 031812 инвазии на основе потери конго красной положительности, гены ipaB и ipaC могут быть удалены, в то время как остальная часть плазмиды не повреждается.

Кроме того, плазмиду можно стабилизировать путем имплантации незаменимого гена, такого как рра, из хромосомы в плазмиду инвазии.

Кроме того, является возможной экспрессия чужих (гетерологичных) антигенов, таких как токсины ETEC LTB и мутированных Sta (STm). STm предпочтительно содержит один или несколько точечных мутаций. В частности, предпочтительно STm являются

где

X в положении 12 является N, K или R, и/или

X в положении 13 является Р, G, L или F, при этом STm исключает последовательности дикого типа:

NSSNYCCELCCNPACTGCY (SEQ ID NO. 2).

Предпочтительными комбинациями точечных мутаций являются N12K или N12R в сочетании с P13F.

Кроме того, примеры показывают, что относительная иммуногенность совместно используемых консервативных антигенов увеличивается в отсутствие основных антигенов в вакцинном штамме. Поскольку эти делеции не только улучшают спектр защиты, но также представляют вакцинный штамм высоко авирулентным, двойной мутант считается очень безопасным, даже при очень высоких дозах. Кроме того, живые оральные вакцины являются относительно дешевыми в изготовлении и не требуют квалифицированного медицинского персонала для введения, что является важными факторами при рассмотрении целевой группы населения в эндемичных странах.

Предметы следующих ниже пунктов являются вариантами осуществления настоящего изобретения:

1) Вакцина из живых ослабленных Shigella, которая основывается на шероховатой колонии штамма Shigella, лишенного О-антигенных липополисахаридов (ЛПС), предпочтительно неинвазивного штамма.

2) Вакцина по п.1, которая ослаблена мутагенезом одного или нескольких генов, участвующих в синтезе, транспорте и экспрессии ЛПС, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из генов в кластере оперона rfb, или одного или более генов в кластере генов rfb/wbb, кодирующих синтез Оантигенов, waaL, кодирующего О-антиген лигазу, wzx, кодирующего О-антиген флиппазу, участвующую в транспорте О-антигена, wzy/rfc, участвующих в полимеризации О-антигенов, генов в кластере генов rfa/waa, кодирующих синтез ядер ЛПС, регуляторных генов, вызывающих экспрессию О-антигенов, таких как rfaH, или потерю функции(й), которая приводит по меньшей мере к 90% снижению экспрессии О-антигенов.

3) Вакцина по п. 1 или 2, в которой мутагенез осуществлен путем делеции одного или более генов из rfb F, D, С, Е, J и/или I, или делеции их части, или соответствующих генов в различных серотипах Shigella.

4) Вакцина по любому из пп.1 до 3, в которой штамм Shigella выбран из рода Shigella, например из любого серотипа или видов Shigella, в частности, S. flexneri, S. sonnei, С. dysentheriae и С. boydii.

5) Вакцина по любому из пп.1 до 4, в которой Shigella экспрессирована перекрестно-реактивными белками наружной мембраны.

6) Вакцина по любому из пп.1 до 5, которая предназначена для перекрестной защиты от различных серотипов и видов Shigella, в частности, в отношении любого из S. flexneri 2а, S. flexneri 6 и S. Sonnei, или энтероинвазивной Escherichia coli.

7) Вакцина по любому из пп.1 до 6, в которой указанная Shigella является неинвазивной путем дальнейшего мутагенеза плазмиды инвазии, в частности делеции генов ipaB и/или ipaC и/или других генов ipa.

8) Вакцина по любому из пп.1 до 7, в которой Shigella включает рекомбинантную эндогенную плазмиду инвазии, включающую по меньшей мере один ген, кодирующий гетерологичный антиген, для секреции или экспрессии указанного антигена на поверхности бактериальной клетки.

9) Вакцина по п.8, в которой указанный антиген выбран из группы, состоящей из бактериального антигена, предпочтительно токсина или фактора колонизации, вирусного антигена, предпочтительно из патогена, вызывающего энтеральные и мукозальные инфекции, грибкового антигена, предпочтительно из патогена, вызывающего энтеральные и мукозальные инфекции, и паразитарного антигена, предпочтительно из патогена, вызывающего энтеральные инфекции.

10. Вакцина по п.9, в которой бактериальный антиген происходит из энтеропатогенных бактерий, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из:

a) антигенов E.coli, в частности энтеротоксина, выбранного из группы, состоящей из LTB, мутантного LTA и ST штамма ЕТЕС, их субъединиц или слияний, антигенов из энтероагрегативной E.coli (EAEC), или Шига(shiga)-подобного токсина 1 или 2,

b) антигенов Campylobacter jejuni,

- 15 031812

c) антигенов Clostridium difficile, в частности токсины А и В,

d) антигенов Vibrio cholera, в частности антигена СТ-В, и

e) мутантов или гибридных белков а), b) с) или d).

11) Вакцина по пп.10, в которой указанный ЕТЕС представляет собой слитый энтеротоксин LTB и мутантный ST (STm), в частности слитый белок, содержащий STm с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 1.

12) Вакцина по п.10, в которой вирусный антиген происходит из желудочно-кишечных вирусов, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из ротавирусов и калицивирусов, таких как вирус Norwalk.

13) Вакцина по п.10, в которой антиген-паразит происходит из вызывающих диарею простейших, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из Giardia lamblia, видов Cryptosporidium и Entameba histolytica.

14) Вакцина по п.10, в которой грибковый антиген происходит от вызывающих диарею грибов, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из Blastomyces dermatiditis и Histoplasma spp.

15) Вакцина по любому из пп.1 до 14, в которой Shigella дополнительно содержит делеции незаменимого хромосомного гена и вставку указанного гена в плазмиду инвазии, в частности ген рра или любой из accD, acpS, dapE, era, frr, ftsI, ftsL, ftsN,ftsZ, infA, lgt, lpxC, msbA, murA, murI, nadE, parC, proS, pyrB, rpsB, trmA, rho и rhoL.

16) Вакцина по любому из пп.1 до 15 для применения в активной иммунотерапии субъекта для профилактики инфекционных заболеваний, в частности энтерального заболевания, такого как диарея или дизентерия.

17) Вакцина для применения по п.16, в которой энтеральное заболевание вызвано любым серотипом или видом Shigella.

18) Вакцина для применения по п.16 или 17, в которой иммунотерапия включает введение вакцины в мукозальный или пероральный препарат.

19) Вакцина для применения по любому из пп.16 до 18, в которой вакцину вводят перорально или интраназально.

20) Вакцина для применения по любому из пп.16 до 19, в которой поливалентная вакцина используется для экспрессии защитных антигенов Shigella и по меньшей мере одного патогена видов, отличающихся от Shigella, посредством включения защитного антигена указанного патогена в эндогенную плазмиду инвазии, и в которой указанное инфекционное заболевание вызвано любым серотипом или видами Shigella и/или указанного патогена.

21) Штамм Shigella, который является штаммом S. flexneri 2a с делецией генов rfbF, ipaB и/или ipaC, или делецией их незаменимых частей.

22) Штамм Shigella по п.21, который содержит рекомбинантную плазмиду инвазии, включающую по меньшей мере один ген, кодирующий гетерологичный антиген, для экспрессии и/или секреции указанного антигена.

23) Штамм Shigella по п.21 или 22, который дополнительно содержит делеции незаменимого хромосомного гена и вставку указанного гена в плазмиду инвазии.

24) Рекомбинантный плазмидный вектор на основе мутантной плазмиды Shigella инвазии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один гетерологичный антиген, отличающийся тем, что плазмида является мутированной, по меньшей мере в один из генов ipaB и/или ipaC.

25) Бактериальная клетка-хозяин, содержащая вектор по п.24, отличающаяся тем, что клетка-хозяин выбрана из родов Shigella, Escherichia, Salmonella, Campylobacter или Yersinia.

26) Клетка-хозяин по п.25, отличающаяся тем, что вектор является эндогенной плазмидой инвазии.

Приведенное выше описание будет более понятным при ознакомлении со ссылкой на следующие примеры. Приведенные примеры, однако, являются только характерными способами выполнения одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения и не должны быть рассматриваться, как ограничивающие объем изобретения.

Примеры

Пример 1. Получение ослабленных штаммов Shigella

Способы

Бактериальные штаммы и условия культивирования

Бактерии, как правило, выращивают в бульоне Луриа-Бертани (Luria Bertani, LB) или чашках с агаром. Для обнаружения интактной (неповрежденной) плазмиды инвазии, экспрессирующей белки ipa, используют чашки с триптическим соевым агаром (TSA) с добавлением 0,01% конго красного химического красителя (Congo Red dye, Sigma-Aldrich). Свежие культуры всегда происходят из конго краснойположительной (CRP) колонии, обеспечивающей перенос плазмиды. В случае необходимости в средуноситель добавляют антибиотики в следующих концентрациях: ампициллин 100 мкг/мл, канамицин 100 мкг/мл, хлорамфеникол 25 мкг/мл.

- 16 031812

Секвенированный прототип 2 штамма Shigella flexneri 2а (штамм 2457Т, АТСС 700930) используют в качестве родительского штамма для мутагенеза. Инактивацию генов aroC и rfbF проводят по ранее описанной методике Red-рекомбиназы (Levine, М.М., et al. Nat. Rev. Microbiol. 5, 540-553 (2007)). Делеция aroC приводит к ауксотрофному мутанту, не способному синтезировать ароматические соединения. RfbF участвует в синтезе субъединиц О-антигенов, потеря которых приводит к шероховатому фенотипу ЛПС. Олигонуклеотиды, используемые для генерации и подтверждения мутаций, представляются в виде дополнительной табл. 1 на фиг. 4 (SEQ ID NO. 3-10). Мутанты 2457ТΔaroC:: kan и 2457ТАг[ЬБ:: cat позже культивируют на чашках с агаром с добавлением конго красного (CR) для выбора CR-позитивных (CRP) и CR-негативных (CRN) колоний. Утрату вирулентных детерминант, кодированных на плазмиде инвазии, подтверждают с помощью ПЦР. Подобным образом, варианты I фазы и II фазы S. sonnei дифференцируют на чашках CR. I Фаза является традиционным указанием плазмиды инвазии, несущей дикого типа штаммы S. sonnei, в то время как II фаза относится к штаммам, потерявшим плазмиды. Так как синтез О-антигенов также кодируется на вирулентной плазмиде в этих видах, варианты II фазы являются неинвазивными и шероховатыми. Дикого типа штаммы Shigella flexneri 6 и S. Sonnei, используемые для изучения заражений, выделяют из клинических случаев бактериальной дизентерии. Их серотипы определяют слайд-агглютинацией с использованием коммерческих сывороток типирования (Mast AssureTM; Mast Group Ltd., Merseyside, UK).

Эксперименты на животных

Все in vivo исследования проводят на ранее описанной модели легких мышей (van de Verg et al., Infect Immun 63: 1947-1954, 1995). Самок мышей линии BALB/c возраста 6-8 недель анестезируют введением внутрибрюшинно смеси 5 мг/мл кетамина (Calipsol, Richter Gedeon, Hungary) и 0,3 мг/мл ксилазина (Primasine, Alfasan).

Инфицирование проводят интраназально 50 мкл инокулята (разведенного в физиологическом растворе), содержащего требуемое КОЕ (колониеобразующих единиц CFU) бактерий. Количество бактерий выравнивают высеванием на чашки серийных разведений из инокулята. 50 Процентные летальные дозы (значения LD50) рассчитывают по инфицированию 0,5 log-серийными разведениями (10⁵-10⁸ КОЕ) в соответствии с методом Рида-Менча (Reed и Muench) подсчета индекса нейтрализации вирусов (Oaks, EV, et al. Infect. Immun. 53: 57-63, 1986). Прививки выполняют сублетальными дозами бактерий (10 КОЕ мутантов CRP и 10 КОЕ мутантов CRN из штамма 2457Т; 10^5,5 КОЕ I фазы и 10^7,5 КОЕ II фазы S. sonnei) два раза с 2-недельными интервалами. Контрольная группа получает физиологический раствор. Экспериментальное исследование показывает, что все вакцинные штаммы очищаются в течение 3 дней p.i. Через две недели после иммунизации типа booster мышей заражают летальной дозой дикого типа штамма S. flexneri 6 или S. sonnei.

В дальнейшем, летальность наблюдают в течение 14 дней. С другой стороны, иммунизированных мышей умерщвляют через две недели после booster, и образцы жидкости и крови бронхоальвеолярного лаважа (BAL) собирают. Для сбора образцов BAL, трахеи умерщвленных мышей готовят для катетеризации закругленными иглами, вводят 200 мкл физиологического раствора и вытягивают образцы из бронхов каждой мыши.

ELISA

Бактерии, инокулированные из свежих чашек CR, выращивают в течение ночи в бульоне LB. 96Луночные планшеты (С.Е.В., France) покрывают в течение ночи 0,1 мл промытых бактериальных суспензий (5x10⁸ КОЕ/мл) в карбонатном буфере (рН 9,5) при 4°С. На следующий день планшеты промывают PBS, содержащим 0,05% Tween 20, а затем блокируют при помощи PBS, содержащего 2% BSA (SigmaAldrich) в течение 1 ч при комнатной температуре. Образцы BAL и сыворотки разводят в PBS, содержащем 0,5% BSA, и инкубируют с помощью чашек, покрытых антигеном, течение 1 ч при 37°С. Серийные разведения проводят вдоль чашек. После трех промывок чашки зондируют анти-мышиным IgG (для сыворотки IgG) или анти-мышиным IgA (для образцов BAL) иммуноглобулином, конъюгированным с HRPO (пероксидазой хрена, Dako A/S, Denmark). Субстрат ELISA представляет собой о-фенилендиамин (Sigma-Aldrich), растворенный в буфере лимонной кислоты, содержащей Н₂О₂. Оптическую плотность (OD) измеряют при 492 нм на обычном ELISA-ридере для чашек. Иммунореактивность экспрессируют по отношению к реакционной способности образца BAL Aaro CRP при том же разведении (1:10). Средние значения + SEM рассчитывают на основе 4 независимых анализов.

Статистический анализ

50%-ную летальную дозу рассчитывают статистическим методом Рида и Мюнх 6 (Reed and Muench

6). Статистический анализ кривых выживаемости выполняют с испытанием на LogRank (Mantel-Cox) с использованием версии 5.00 GraphPad Prism для Windows. Титры IgA образцов BAL сопоставляют с анализом непараметрических критериев Манна-Уитни (Mann-Whitney). Значение р рассматривается значительным, если оно ниже 0,05.

Результаты

На основании кривых выживаемости животных, иммунизированных ослабленными (серотип 2а) вакцинными штаммами Shigella flexneri 2457Т и зараженных дикого типа штаммами Shigella, синергиче

- 17 031812 ский защитный эффект наблюдается при объединении делеции гена rfbF с потерей плазмиды инвазии в установке гетерологичного заражения. Значительно лучшая защита достигается иммунизацией конго красным отрицательным (CNR, с делецией плазмиды инвазии) штаммом Shigella flexneri 245 7T (2a) ΔrfbF относительно конго красного положительного (CNP, интактные плазмиды инвазии) штамма Shigella flexneri 2a Δι&Ε, когда животных заражают гетерологичным штаммом Shigella flexneri 6 (фиг. 1b). В случае гомологичного заражения дикого типа штаммом (2а) Shigella flexneri 544, оба вакцинных штамма показывают одинаковое защитное действие, исходя из предположения, что для гомологичного заражения даже делеция гена rfbF является достаточной (фиг. 1а). Различия в эффективности вакцинации могут быть частично связаны с более высокой допустимой сублетальной дозой двойного мутанта ΔrfbF плазмиды инвазии, но он не в полной мере ответствен за это, так как (контроль) штамм CRN Δaro, используемый при сопоставимой с двойным мутантом дозе заражения, индуцирует частичную защиту экспериментах и с гомологичным и с гетерологичным заражениями (фиг. 1a, 1b).

Дальнейшие доказательства положительного эффекта инактивации мутаций гена rfbF и инвазионных плазмид, достигающих существенную защиту от гетерологичного заражения, обеспечивается использованием вакцинных штаммов Shigella sonnei. Иммунизация с помощью II фазы варианта Shigella sonnei (удалена плазмида инвазии, отвечающая за экспрессию как комплекса, так и гена rfbF инвазии) приводит к высокому уровню защиты от летального заражения дикого типа штаммом Shigella flexneri 542 (серотип 6), в то время как I фазы вариант дикого типа штамма S. sonnei (интактная плазмида инвазии, несущая комплекс и ген rfbF инвазии) показывает низкое (статистически не значимое) защитное действие (фиг. 1с).

Пример 2. Получение мутанта Shigella flexneri 2a 2457 с синтетической генной конструкцией на плазмиде инвазии

Исходным материалом для строительства мутанта является штамм Shigella flexneri 2a 2457T АТСС, как описывается выше. Делеции генов rfbF и ipaB и ipaC, a также гена рра осуществляются с использованием метода Red-рекомбиназы (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 97, 6640-6645 (2000)).

Этап 1: Ген rfbF удаляют из хромосомы. Отсутствие RfbF ассоциируется с фенотипическим изменением: штамм Shigella становится шероховатым, типичное морфологическое изменение, которое можно обнаружить невооруженным глазом на чашках с агаром. Это фенотипическое изменение можно наблюдать, несмотря на это, успешное удаление гена rfbF также подтверждается анализом ПЦР. Анализ основывается на разной длине продукта ПЦР, полученного геномной ДНК из дикого типа или мутантной Shigella (фиг. 8).

Этап 2: Гены ipaB и ipaC удаляют из плазмиды инвазии. Эти гены являются соседними и удаляются совместно посредством той же методики Red-рекомбиназы, примененной к делеции гена rfbF. Эта делеция гена также приводит к фенотипу: Shigella теряет способность поглощать конго красный химический краситель и, соответственно, образует белую колонию на конго красном, содержащемся в чашке с агаром, в отличие от Shigella, несущих дикого типа плазмиды, которые являются красными. Так как Shigella может потерять свои плазмиды самопроизвольно во время культивирования in vitro, делеции генов ipaB и ipaC подтверждаются с помощью ПЦР анализа мутантов, и подтверждение основывается на более коротких фрагментах ПЦР, полученных мутантами, по сравнению с диким типом плазмиды (фиг. 9).

Этап 3: Введение синтетического гена, который запускает экспрессию токсинов LT-B и ST штаммов ЕТЕС, а также трансплантирует незаменимый ген (рра) из хромосомы в плазмиду инвазии (см фиг. 10А). Успешное внедрение гибридного (слитого) гена LTB-mST доказывается ПЦР-амплификацией специфического участка гена области генетических манипуляций (фиг. 10В). Экспрессия слитого гена токсина из Shigella тестируется с помощью иммуноблоттинга (фиг. 10С). Удаление гена рра из хромосомы (необходимой для роста Shigella) доказывается с помощью ПЦР на основе более короткой длины ампликона в сравнении со штаммом конечной вакцины.

Все генетические манипуляции включают введение генов устойчивости к антибиотикам. После каждого этапа гены, ответственные за устойчивость к антибиотикам, удаляются с помощью плазмид хелперов, как описывается Datsenko и Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 97, 6640-6645 (2000)).

Пример 3. Исследования защиты животных для тестирования мутантного штамма, описанного в примере 2

Вирулентное ослабление изогенных мутантных штаммов по сравнению с их родительским штаммом дикого типа показывается на модели шигеллеза легких мышей. Группы мышей заражают интраназально 10-кратным серийным разведением (от 10⁶ до 10⁸ КОЕ) различных бактериальных штаммов, с тем чтобы определить минимальную летальную дозу для каждого штамма. В случае штамма дикого типа обнаружена 30, 50 и 100% летальность при дозах 10⁶, 10⁷ и 10⁸ КОЕ/мышь соответственно. В отличие от этого не одна из мышей не умерла от воздействия любых изогенных мутантов 2457TΔrfb, 2457TΔipaBC или двойного мутанта 2457TΔrfbΔipaBC при любых из испытанных доз. Эти результаты показывают ослабление высокой вирулентности во всех мутантах при удалении соответствующих генов.

Затем группы мышей иммунизируют в той же модели сублетальными дозами штамма 2457Т (5 х

- 18 031812

10⁵ КОЕ/мышь) дикого типа или его изогенных делеционных мутантов 2457TArfb, 2457TAipaBC, 2457TArfbAipaBC (все при 10⁸ КОЕ/мышь), или ложно иммунизированных только PBS. Три одинаковые прививки производят с 2-недельными интервалами. Через неделю после последнего booster мышей заражают (предварительно оптимизируют) летальной дозой (2 х 10 КОЕ/мышь) штамма S. sonnei. Как показано на фиг. 11, иммунизация штаммом дикого типа не может обеспечить защиту, в то время как каждый из мутантов с одним локусом (или 2457TAifb или 2457TAipaBC) вызывает лишь частичную защиту. В отличие от этого, двойной мутант (2457TArfbAipaBC) может обеспечить полную защиту от заражения гетерологичными видами Shigella.

Перечень последовательностей <110> EveliQure Biotechnologies GmbH <120> Новая вакцина из живых ослабленных Shigella <130> EQ001P <160> 29 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> искусственный <220>

<223> бактериальный антиген <220>

<221> ПЕПТИД <222> (12)..(12) <223> X может быть N, К или R, где последовательность NSSNYCCELCCNPACTGCY исключена <220>

<221> ПЕПТИД <222> (13)..(13) <223> X может быть Р, G, L или F, где последовательность

NSSNYCCELCCNPACTGCY исключена <400> 1

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Xaa Xaa Ala Cys Thr

10 15

Gly Cys Tyr <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Escherichia Sp.

<400> 2

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr

10 15

- 19 031812

Gly Cys Туг <210> 3 <211> 63 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 3 cgcacgggct ggcgctcggc tgctgcatcg tcgatggtgt tccgtgtagg ctggagctgc 60 ttc 63 <210> 4 <211> 70 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 4 tatcagtctt cacatcggca ttttgcgccc gctgccgtaa catatgaata tcctccttag 60 ttcctattaa 70 <210> 5 <211> 61 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 5 gaatagtaat atttacgctg tcattgtgac atataatccc ggtgtaggct ggagctgctt 60 c 61 <210> 6 <211> 68 <212> ДНК <213> искусственный <220>

- 20 031812 <223> Олигонуклеотид <400> 6 gcattataac gaccgccccc agtaattcct cttattccca tatgaatatc ctccttagtt 60 cctaatcc 68 <210> 7 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 7 gagccgtgat ggctggaaac ac 22 <210> 8 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 8 agcgcaatcg cggttttgtt ca 22 <210> 9 <211> 24 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Олигонуклеотид <400> 9 gggttactgg gtgccgcaat atcc 24 <210> 10 <211> 27 <212> ДНК <213> искусственный <220>

- 21 031812 <223> Олигонуклеотид <400> 10 cctcaatcca gcattcgcca ttatacg 27 <210> 11 <211> 796 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Конструкция <400> 11 gctgccgtgg ttcaagtcgc gactaataaa aataatcagg ttgccatgat tcaatgtaca 60 cctttctcac attcgtctcc ggcatgaaaa cgatgcactc tttctttatc gctttcacta 120 cacattttat cctcgcatgg atgttttata aaaaacatga ttgacatcat gttgcatata 180 ggttaaacaa aacaagtggc gttatctttt tccggattgt cttcttgtat gatatataag 240 ttttcctcga tgaataaagt aaaatgttat gttttattta cggcgttact atcctctcta 300 tgtgcatacg gagctcccca gtctattaca gaactatgtt cggaatatcg caacacacaa 360 atatatacga taaatgacaa gatactatca tatacggaat cgatggcagg caaaagagaa 420 atggttatca ttacatttaa gagcggcgca acatttcagg tcgaagtccc gggcagtcaa 480 catatagact cccaaaaaaa agccattgaa aggatgaagg acacattaag aatcacatat 540 ctgaccgaga ccaaaattga taaattatgt gtatggaata ataaaacccc caattcaatt 600 gcggcaatca gtatggaaaa cgggccgggg cccaattctt ctaactactg ctgtgaactt 660 tgttgtaatt ttgcctgtac aggatgttac tagtttgctt taaaagcatg tctaatgcta 720 ggaacctata taacaactac tgtacttata ctaatgagcc ttatgctgca tttgaaaagg 780 cggtagagga tgcaat 796 <210> 12 <211> 147 <212> PRT <213> искусственный <220>

<223> Конструкция <400> 12

Met Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser

10 15

- 22 031812

Leu Cys Ala Tyr Gly Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu

2530

Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr

4045

Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys

5560

Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp

70 7580

Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr

9095

Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys

100 105110

Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn Gly Pro Gly Pro

115 120125

Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Phe Ala Cys Thr

130 135140

Gly Cys Tyr

145 <210> 13 <211> 799 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Конструкция <400> 13 gctgccgtgg ttcaagtcgc gactaataaa aataatcagg ttgccatgat tcaatgtaca 60 cctttctcac attcgtctcc ggcatgaaaa cgatgcactc tttctttatc gctttcacta 120 cacattttat cctcgcatgg atgttttata aaaaacatga ttgacatcat gttgcatata 180 ggttaaacaa aacaagtggc gttatctttt tccggattgt cttcttgtat gatatataag 240 ttttcctcga tgaataaagt aaaatgttat gttttattta cggcgttact atcctctcta 300 tgtgcatacg gagctcccca gtctattaca gaactatgtt cggaatatcg caacacacaa 360 atatatacga taaatgacaa gatactatca tatacggaat cgatggcagg caaaagagaa 420 atggttatca ttacatttaa gagcggcgca acatttcagg tcgaagtccc gggcagtcaa 480 catatagact cccaaaaaaa agccattgaa aggatgaagg acacattaag aatcacatat 540

- 23 031812 ctgaccgaga ccaaaattga taaattatgt gtatggaata ataaaacccc caattcaatt 600 gcggcaatca gtatggaaaa cggcggaggt ggctccaatt cttctaacta ctgctgtgaa 660 ctttgttgta atggcgcctg tacaggatgt tactagtttg ctttaaaagc atgtctaatg 720 ctaggaacct atataacaac tactgtactt atactaatga gccttatgct gcatttgaaa 780 aggcggtaga ggatgcaat 799 <210> 14 <211> 148 <212> PRT <213> искусственный <220>

<223> Конструкция <400> 14

Met Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser

1015

Leu Cys Ala Tyr Gly Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu

2530

Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr

4045

Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys

5560

Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp

70 7580

Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr

9095

Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys

100 105110

Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn Gly Gly Gly Gly

115 120125

Ser Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Gly Ala Cys

130 135140

Thr Gly Cys Tyr

145 <210> 15 <211> 799

- 24 031812 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Конструкция <400> 15 gctgccgtgg ttcaagtcgc gactaataaa aataatcagg ttgccatgat tcaatgtaca 60 cctttctcac attcgtctcc ggcatgaaaa cgatgcactc tttctttatc gctttcacta 120 cacattttat cctcgcatgg atgttttata aaaaacatga ttgacatcat gttgcatata 180 ggttaaacaa aacaagtggc gttatctttt tccggattgt cttcttgtat gatatataag 240 ttttcctcga tgaataaagt aaaatgttat gttttattta cggcgttact atcctctcta 300 tgtgcatacg gagctcccca gtctattaca gaactatgtt cggaatatcg caacacacaa 360 atatatacga taaatgacaa gatactatca tatacggaat cgatggcagg caaaagagaa 420 atggttatca ttacatttaa gagcggcgca acatttcagg tcgaagtccc gggcagtcaa 480 catatagact cccaaaaaaa agccattgaa aggatgaagg acacattaag aatcacatat 540 ctgaccgaga ccaaaattga taaattatgt gtatggaata ataaaacccc caattcaatt 600 gcggcaatca gtatggaaaa cggcggaggt ggctccaatt cttctaacta ctgctgtgaa 660 ctttgttgtc gccctgcctg tacaggatgt tactagtttg ctttaaaagc atgtctaatg 720 ctaggaacct atataacaac tactgtactt atactaatga gccttatgct gcatttgaaa 780 aggcggtaga ggatgcaat 799 <210> 16 <211> 148 <212> PRT <213> искусственный <220>

<223> Конструкция <400> 16

Met Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser

1015

Leu Cys Ala Tyr Gly Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu

2530

Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr

4045

Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys

5560

- 25 031812

Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp

70 7580

Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr

9095

Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys

100 105110

Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn Gly Gly Gly Gly

115 120125

Ser Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Arg Pro Ala Cys

130 135140

Thr Gly Cys Tyr

145 <210> 17 <211> 799 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Конструкция <400> 17 gctgccgtgg ttcaagtcgc gactaataaa aataatcagg ttgccatgat tcaatgtaca 60 cctttctcac attcgtctcc ggcatgaaaa cgatgcactc tttctttatc gctttcacta 120 cacattttat cctcgcatgg atgttttata aaaaacatga ttgacatcat gttgcatata 180 ggttaaacaa aacaagtggc gttatctttt tccggattgt cttcttgtat gatatataag 240 ttttcctcga tgaataaagt aaaatgttat gttttattta cggcgttact atcctctcta 300 tgtgcatacg gagctcccca gtctattaca gaactatgtt cggaatatcg caacacacaa 360 atatatacga taaatgacaa gatactatca tatacggaat cgatggcagg caaaagagaa 420 atggttatca ttacatttaa gagcggcgca acatttcagg tcgaagtccc gggcagtcaa 480 catatagact cccaaaaaaa agccattgaa aggatgaagg acacattaag aatcacatat 540 ctgaccgaga ccaaaattga taaattatgt gtatggaata ataaaacccc caattcaatt 600 gcggcaatca gtatggaaaa cggcggaggt ggctccaatt cttctaacta ctgctgtgaa 660 ctttgttgta aacctgcctg tacaggatgt tactagtttg ctttaaaagc atgtctaatg 720 ctaggaacct atataacaac tactgtactt atactaatga gccttatgct gcatttgaaa 780 aggcggtaga ggatgcaat 799 <210> 18

- 26 031812 <211> 148 <212> PRT <213> искусственный <220>

<223> Конструкция <400> 18

Met Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser

1015

Leu Cys Ala Tyr Gly Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu

2530

Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr

4045

Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys

5560

Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp

70 7580

Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr

9095

Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys

100 105110

Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn Gly Gly Gly Gly

115 120125

Ser Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Lys Pro Ala Cys

130 135140

Thr Gly Cys Tyr

145 <210> 19 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Праймер <400> 19 gtaagcacca caaccactgg 20

- 27 031812 <210> 20 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Праймер <400> 20 ccagcaatct gactggctgt eg 22 <210> 21 <211> 77 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Конструкция <400> 21 gccaaaatat tggcttccac tgagcttgga gacaatacta tccaagccat atgaatatcc 60 teettagtte ctaatcc 77 <210> 22 <211> 65 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Конструкция <400> 22 gtattaattg atttgtcgct tgggatgctt ctttagatac ttggggtgta ggctggagct 60 gette 65 <210> 23 <211> 2854 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Ген <400> 23 atgeataatg taagcaccac aaccactggt tttcctcttg ccaaaatatt ggcttccact 60

- 28 031812 gagcttggag acaatactat ccaagctgca aatgatgcag ctaacaaatt attttctctt 120 acaattgctg atcttactgc taaccaaaat attaatacaa ctaatgcaca ctcaacttca 180 aatatattaa tccctgaact taaagcacca aagtcattaa atgcaagttc ccaactaacg 240 cttttaattg gaaaccttat tcaaatactc ggtgaaaaat ctttaactgc attaacaaat 300 aaaattactg cttggaagtc ccagcaacag gcaagacagc aaaaaaacct agaattctcc 360 gataaaatta acactcttct atctgaaact gaaggactaa ccagagacta tgaaaaacaa 420 attaataaac taaaaaacgc agattctaaa ataaaagacc tagaaaataa aattaaccaa 480 attcaaacaa gattatccga actcgaccca gagtcaccag aaaagaaaaa attaagccgg 540 gaagaaatac aactcactat caaaaaagac gcagcagtta aagacaggac attgattgag 600 cagaaaaccc tgtcaattca tagcaaactt acagataaat caatgcaact cgaaaaagaa 660 atagactctt tttctgcatt ttcaaacaca gcatctgctg aacagctatc aacccagcag 720 aaatcattaa ccggacttgc cagtgttact caattgatgg caacctttat tcaactagtt 780 ggaaaaaata algaagaatc tttaaaaaat gatctggctc tattccagtc tctccaagaa 840 tcaagaaaaa ctgaaatgga gagaaaatct gatgagtatg ctgctgaagt acgtaaagca 900 gaagaactca acagagtaat gggttgtgtt gggaaaatac ttggggcact tttaactatc 960 gttagtgttg ttgcagcagc tttttctgga ggagcctctc tagcactggc agctgttggt 1020 ttagctctta tggttacgga tgctatagta caagcagcga ccggcaattc cttcatggaa 1080 caagccctga atccgatcat gaaagcagtc attgaaccct taatcaaact cctttcagat 1140 gcatttacaa aaatgctcga aggcttgggc gtcgactcga aaaaagccaa aatgattggc 1200 tctattctgg gggcaatcgc aggcgctctt gtcctagttg cagcagtcgt tctcgtagcc 1260 actgttggta aacaggcagc agcaaaactt gcagaaaata ttggcaaaat aataggtaaa 1320 accctcacag accttatacc aaagtttctc aagaattttt cttctcaact ggacgattta 1380 atcactaatg ctgttgccag attaaataaa tttcttggtg cagcgggtga tgaagtaata 1440 tccaaacaaa ttatttccac ccatttaaac caagcagttt tattaggaga aagtgttaac 1500 tctgccacac aagcgggagg aagtgtcgct tctgctgttt tccagaacag cgcgtcgaca 1560 aatctagcag acctgacatt atcgaaatat caagttgaac aactgtcaaa atatatcagt 1620 gaagcaatag aaaaattcgg ccaattgcag gaagtaattg cagatctatt agcctcaatg 1680 tccaactctc aggctaatag aactgatgtt gcaaaagcaa ttttgcaaca aactactgct 1740 tgatacaaat aaggagaatg ttatggaaat tcaaaacaca aaaccaaccc agattttata 1800 tacagatata tccacaaaac aaactcaaag ttcttccgaa acacaaaaat cacaaaatta 1860 tcagcagatt gcagcgcata ttccacttaa tgtcggtaaa aatcccgtat taacaaccac 1920 attaaatgat gatcaacttt taaagttatc agagcaggtt cagcatgatt cagaaatcat 1980 tgctcgcctt actgacaaaa agatgaaaga tcgttcagag atgagtcaca cccttactcc 2040 agagaacact ctggatattt ccagtctttc ttctaatgct gtttctttaa ttattagtgt 2100

- 29 031812 agccgttcta ctttctgctc tccgcactgc agaaactaaa ttgggctctc aattgtcatt 2160 gattgcgttc gatgctacaa aatcagctgc agagaacatt gttcggcaag gcctggcagc 2220 cctatcatca agcattactg gagcagtcac acaagtaggt ataacgggta tcggtgccaa 2280 aaaaacgcat tcagggatta gcgaccaaaa aggagcctta agaaagaacc ttgccactgc 2340 tcaatctctt gaaaaagagc ttgcaggttc taaattaggg ttaaataaac aaatagatac 2400 aaatatcacc tcaccacaaa ctaactctag cacaaaattt ttaggtaaaa ataaactggc 2460 gccagataat atatccctgt caactgaaca taaaacttct cttagttctc ccgatatttc 2520 tttgcaggat aaaattgaca cccagagaag aacttacgag ctcaataccc tttctgcgca 2580 gcaaaaacaa aacattggcc gtgcaacaat ggaaacatca gccgttgctg gtaatatatc 2640 cacatcagga gggcgttatg catctgctct tgaagaagaa gaacaactaa tcagtcaggc 2700 cagcagtaaa caagcagagg aagcatccca agtatctaaa gaagcatccc aagcgacaaa 2760 tcaattaata caaaaattat tgaatataat tgacagcatc aaccaatcaa agaattcgac 2820 agccagtcag attgctggta acattcgagc ttaa 2854 <210> 24 <211> 938 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Ген <400> 24 aagtaaataa aacgttaatc acaagtttgt aatcgctttc atctcactat gaaaaatgcg 60 gctacggtta tggattttcc tgctctgtat accgtcttaa aactggcgaa aaaggaaaat 120 gaagacgaaa acaagcaaag acattcggcg cgagttggct ataatacttg gcacttgttt 180 gccacatatt tttaaaggaa acagacatga gcttactcaa cgtccctgcg ggtaaagatc 240 tgccggaaga catctacgtt gttattgaga tcccggctaa cgcagatccg atcaaatacg 300 aaatcgacaa agagagcggc gcactgttcg ttgaccgctt catgtccacc gcgatgttct 360 atccgtgcaa ctacggttac atcaaccaca ccctgtctct ggacggtgac ccggttgacg 420 tactggtccc gactccgtac ccgctgcagc ctggttctgt gatccgttgc cgtccggttg 480 ccgttctgaa aatgaccgac gaagccggtg aagatgcaaa actggttgcg gttccgcaca 540 gcaagctgag caaagaatac gatcacatta aagacgtaaa cgatctgcct gaactgctga 600 aagcgcaaat cgctcacttc ttcgagcact acaaagacct cgaaaaaggc aagtgggtga 660 aagttgaagg ttgggaaaac gcagaagccg ctaaagctga aatcgttgct tccttcgagc 720 gcgcaaagaa taaataagtt cttctagcgc aataaccctg aacgccgggc ttcggttagt 780 aagggttttt ttatgcccgc gataaataaa ctctctattc caccatcatt attctcagcg 840

- 30 031812 gttgcaaggc ttgaacggta agaacaagca aacccgacca ccattttgct gttcatagcc 900 acttgctgga agttagccga cctcactcat actcaccg 938 <210> 25 <211> 90 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Праймер <400> 25 ttattattgg tgaaaagatg ttcgcgaaaa aactatagac aattcgttat gtaacggatt 60 gcgttacatc gtgtaggctg gagctgcttc 90 <210> 26 <211> 100 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Праймер <400> 26 tccatatctg caatcgcata aaaaactctg ctggcgttca caaatgtgca ggggtaaaac 60 gggggcacgc catatgaata tcctccttag ttcctaatcc 100 <210> 27 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Праймер <400> 27 catagggttg tcctcgtcgg gg 22 <210> 28 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Праймер <400> 28 gttttatgcg atgtatctcg eg 22 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> искусственный <220>

<223> Лнкер <400> 29

Gly Gly Gly Gly Ser

5

Claims (14)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Вакцина из живых ослабленных бактерий Shigella, предназначенная для перекрестной защиты от различных серотипов и видов бактерий Shigella, включающая штамм Shigella, который является шероховатым и неинвазивным посредством делеции гена rfbF и делеции генов ipaB и ipaC на плазмиде инвазии.
2. 2. Вакцина по п.1, в которой штамм Shigella выбран из S. flexneri, S. sonnei, S. dysenteriae и S. boydii.
3. 3. Вакцина по п.2, в которой штамм Shigella представляет собой S. flexneri 2a 2457Т (АТСС 700930).
4. 4. Вакцина по любому из пп.1-3, предназначенная для перекрестной защиты от любого из штаммов

   S. flexneri 2a, S. flexneri 6 и S. sonnei.
5. 5. Вакцина по любому из пп.1-4, в которой плазмида инвазии представляет собой рекомбинантную эндогенную плазмиду инвазии, включающую по меньшей мере один ген, кодирующий гетерологичный антиген, для секреции и/или экспрессии указанного антигена, при этом гетерологичный антиген выбран из группы, состоящей из бактериального антигена, вирусного антигена, грибкового антигена и паразитарного антигена.

   - 31 031812
6. 6. Вакцина по п.5, в которой бактериальный антиген является энтеротоксином энтеротоксигенной Escherichia coli (ETEC), содержащим В-субъединицу (LTB) термолабильного токсина (LT), термостойкого токсина (ST) или их слитые формы, предпочтительно форму LTB/STm, содержащую STm с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO. 1.
7. 7. Применение вакцины по любому из пп.1-6 для профилактики предупреждения заболеваний, вызванных различными серотипами и видами бактерий Shigella.
8. 8. Применение по п.7, в котором вакцина предназначена для профилактики предупреждения энтеральных заболеваний.
9. 9. Применение по п.7 или 8, в котором вакцина предназначена для перорального или интраназального введения.
10. 10. Применение по п.8 или 9, в котором вакцина является поливалентной и используется для экспрессии защитных антигенов Shigella и по меньшей мере одного вида патогенов, отличающихся от Shigella, посредством включения защитного антигена указанного патогена в эндогенную плазмиду инвазии, указанное инфекционное заболевание вызвано любым серотипом или видами Shigella и/или указанного патогена.
11. 11. Штамм Shigella для применения в вакцине по п.1, который является штаммом S. flexneri 2a, содержащим делецию гена rfbF и делеции генов ipaB и ipaC.
12. 12. Штамм Shigella по п.11, который представляет собой штамм S. flexneri 2a 2457Т (АТСС 700930), содержащий делецию гена rfbF и генов ipaB и ipaC.
13. 13. Штамм Shigella по п.11 или 12, который содержит рекомбинантную плазмиду инвазии, включающую по меньшей мере один ген, кодирующий гетерологичный антиген, для экспрессии и/или секреции указанного антигена, при этом указанный антиген выбран из группы, состоящей из бактериального антигена, вирусного антигена, грибкового антигена и паразитарного антигена.
14. 14. Штамм Shigella по п.13, в котором гетерологичный антиген представляет собой бактериальный энтеротоксин (ЕТЕС), содержащий В-субъединицу (LTB) термолабильного токсина (LT), термостойкого токсина (ST) или их субъединицы или слитые формы, предпочтительно форму LTB/STm, содержащую STm с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO. 1.