EA031758B1 - Niacinamide for inducing generation of antimicrobial peptides - Google Patents
Niacinamide for inducing generation of antimicrobial peptides Download PDFInfo
- Publication number
- EA031758B1 EA031758B1 EA201692284A EA201692284A EA031758B1 EA 031758 B1 EA031758 B1 EA 031758B1 EA 201692284 A EA201692284 A EA 201692284A EA 201692284 A EA201692284 A EA 201692284A EA 031758 B1 EA031758 B1 EA 031758B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- niacinamide
- skin
- antimicrobial peptides
- coli
- psoriasin
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
- A61K31/455—Nicotinic acids, e.g. niacin; Derivatives thereof, e.g. esters, amides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/67—Vitamins
- A61K8/673—Vitamin B group
- A61K8/675—Vitamin B3 or vitamin B3 active, e.g. nicotinamide, nicotinic acid, nicotinyl aldehyde
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
- A61Q17/005—Antimicrobial preparations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q5/00—Preparations for care of the hair
Abstract
Description
Изобретение относится к новому применению ниацинамида для стимуляции продуцирования АМР (антимикробных пептидов) в коже. Изобретение может применяться для улучшения иммунитета кожи, волосистой части кожи головы и полости рта в отношении микроорганизмов.
031758 Bl
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к новому применению ниацинамида для стимуляции продуцирования AMP (антимикробных пептидов) в коже. Изобретение может быть применено для улучшения иммунитета кожи, волосистой части головы и полости рта в отношении микроорганизмов.
Предпосылки создания изобретения
Кожа является основной линией защиты, которая ограждает организм человека от вторжения патогенов, таких как вирусы и бактерии. Как основной орган обороны ткань кожи всегда остается в постоянном контакте с окружающей средой, и поэтому ей приходится сталкиваться и преодолевать угрозы и вызовы от вторгающихся патогенных микроорганизмов. Открытая поверхность кожи не только подвергается воздействию патогенными чужеродными бактериями, но также остается в контакте и взаимодействует с резидентными комменсальными (условно-патогенными) бактериями. Несмотря на все эти вызовы со стороны инородных и комменсальных микробов, здоровая кожа не поражается инфекциями, а количество резидентной микрофлоры остается постоянным. Это равновесие во взаимодействии ткани кожи и микробов сохраняется, поскольку кожа имеет сложную стратегию защиты, и антимикробные пептиды (AMP) являются важной ее частью.
AMP представляют собой неотъемлемую часть собственной системы защиты кожи. AMP были первоначально обнаружены у насекомых и животных, и со времени первоначального открытия AMP рассматриваются как перспективные антимикробные средства. AMP повсеместно распространены в природе, и они, как правило, обладают широким спектром активности против вторгающихся бактерий, грибов, оболочечных вирусов и паразитов (Braff and Gallo, 2006). AMP, как правило, представляют собой короткие пептиды, и сообщалось, что в организме человека присутствует около 90 различных AMP. AMP в целом имеют две основные физические особенности: они a) имеют катионный заряд и b) имеют значительную часть гидрофобных остатков. Катионный заряд AMP способствует селективности в отношении отрицательно заряженных микробных цитоплазматических мембран, тогда как гидрофобность облегчает взаимодействие с клеточной мембраной микробных видов.
Авторы настоящего изобретения работали над получением гигиенических преимуществ для потребителей путем повышения уровней AMP в коже. Авторы хотели добиться поставленного эффекта за счет применения природных молекул, которые воспринимаются потребителями как более благоприятные для кожи и, тем самым, менее жесткие. Для достижения этой цели были испытаны различные активные вещества и после обширных исследований было обнаружено, что применение ниацинамида или витамина B3 повышает уровень AMP в коже.
Ниацинамид или витамин B3 является хорошо известным активным агентом для осветления кожи, который используется в нескольких продуктах для ухода за кожей. Также сообщается, что ниацинамид имеет различные другие свойства, такие как предотвращение целлюлита, лечение раздражения кожи и улучшение поглощения воды кожей (об этом сообщается, в частности, в патентных публикациях EP 1063963, EP 1063994, EP 1063965). Ниацинамид также используется при лечении многих воспалительных кожных заболеваний, таких как обыкновенные угри, псориаз и атопический дерматит (Niren N.M. (2006) Pharmacologic doses of nicotinamide in the treatment of inflammatory skin conditions: a review. Cutis 77: 11-16.).
WO 11133692 (Cedars-Sinai Medical Centre) раскрывает важную роль С/ЕВРе во естественном иммунном ответе против патогенов. В частности, было показано, что при отсутствии функционального С/ЕВРе мыши резко ограничены в своей способности освобождаться от инфекции S.aureus. Особенно оказываются затронуты нейтрофилы, и восприимчивость к S.aureus может быть исправлена путем обработки гамма-интерфероном (IFN-γ). Важно отметить, что повышение активности С/ЕВРе, либо в результате стимуляции избыточной экспрессии С/ЕВРЕ, либо в результате применения ниациномида или его аналога, производного или соли, резко усиливает опосредованное иммунитетом уничтожение S.aureus и приводит к уменьшению интенсивности инфекции.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что при нанесении ниацинамида на кожу (которая может быть кожей как таковой или волосистой частью головы или полостью рта), активный агент индуцирует образование AMP, которые, как известно, являются важным шагом в улучшении иммунитета кожи в отношении атак микроорганизмов. Таким образом, выгода, получаемая потребителем, заключается в том, что путем применения композиции, содержащей ниацинамид, можно защитить кожу от микробов, которые могут атаковать в будущем.
Сущность изобретения
Изобретение относится к применению ниацинамида для стимуляции секреции антимикробных пептидов (AMP) при его нанесении на внешнюю поверхность человеческого тела.
Соответственно, в изобретении также описывается ниацинамид, предназначенный для профилактической стимуляции секреции антимикробных пептидов (AMP) путем его нанесения на внешнюю поверхность человеческого тела.
Кроме того, изобретение относится к способу обеспечения защиты волосистой части кожи головы путем стимуляции секреции антимикробных пептидов (AMP), включающему стадию нанесения ниацинамида на волосы/волосистую часть кожи головы человека.
- 1 031758
Подробное описание изобретения
Эти и другие аспекты, признаки и преимущества будут понятны специалистам в данной области техники после ознакомления со следующим далее подробным описанием и прилагаемой формулой изобретения. Во избежание каких бы то ни было сомнений любой признак одного из аспектов настоящего изобретения может быть использован и в любом другом аспекте настоящего изобретения. Слово содержащий означает включающий, но не обязательно означает состоящий из, или составленный из. Иными словами, перечисленные стадии или варианты не обязательно являются исчерпывающими. Следует отметить, что примеры, приведенные в описании ниже, предназначены для пояснения изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения одними лишь этими примерами. Все проценты являются процентами масса/масса, если не указано иное. За исключением рабочих и сравнительных примеров, или случаев, когда в явном виде указано иное, все числа в данном описании, указывающие количества материала или условия реакции, физические свойства материалов и/или их применение, следует понимать как предваряемые словом около. Численные диапазоны, выраженные в формате от x до y, понимаются как включающие x и y. Когда для какого-то конкретного признака приведены несколько предпочтительных диапазонов в формате от x до y, следует понимать, что авторами также были предусмотрены и все диапазоны, комбинирующие различные конечные точки.
Термин кожа при использовании в данном документе включает внешнюю поверхность млекопитающих, особенно людей, и включает кожу, волосистую часть кожи головы, волосы и полость рта. Применение по изобретению может быть осуществлено путем включения ниацинамида в смываемый или несмываемый продукт, и включает любой продукт, наносимый на человеческий организм, главным образом для осветления кожи, но может также включать улучшение внешнего вида, очищение, контроль запаха или общую эстетику. Применение по изобретению предпочтительно осуществляется путем включения в несмываемую композицию. Композиция может быть в виде жидкости, лосьона, крема, пены, скраба, геля, мыла или тонера, или может наноситься с использованием или с помощью лицевой маски, тампона или пластыря.
Неограничивающие примеры таких композиций включают несмываемые лосьоны и кремы для кожи, шампуни, кондиционеры, гели для душа, туалетное мыло, антиперспиранты, дезодоранты, средства для удаления волос, губные помады, тушь для ресниц, крем-основы, средства для искусственного загара и солнцезащитные лосьоны. Ниацинамид имеет структуру, указанную ниже
Ниацинамид, используемый в настоящем изобретении, предпочтительно стимулирует секрецию AMP кератиноцитами. AMP, секретируемые таким образом, предусматривают повышение иммунитета внешней поверхности организма. Внешняя поверхность включает кожу, волосистую часть кожи головы или полость рта.
С помощью настоящего изобретения было установлено, что ниацинамид активирует кератиноциты, которые являются основными клетками эпидермиса кожи, тем самым обеспечивая преимущества по настоящему изобретению, а именно стимуляцию секреции антимикробных пептидов (AMP). Таким образом, ниацинамид стимулирует образование щита против микробов. Поэтому ниацинамид обеспечивает защиту организма от инфекций, повышая собственную защиту организма. Иными словами, активный агент подготавливает поверхность организма к защите от микробов. Преимуществом этого является то, что агент обеспечивает длительную защиту, например защиту от микробов вплоть до 24 ч.
Состав, в котором ниацинамид используется в соответствии с настоящим изобретением, может иметь следующие предпочтительные свойства. Ниацинамид предпочтительно присутствует в количестве от 0,1 до 5%, более предпочтительно от 0,5 до 5%, еще более предпочтительно от 0,5 до 3%, а оптимально от 1,0 до 3,0% от массы композиции. Композиция предпочтительно содержит косметически приемлемую основу. Косметически приемлемая основа предпочтительно представляет собой крем, лосьон, гель или эмульсию.
Композиции для личной гигиены могут быть получены с использованием различных косметически приемлемых эмульгирующих или неэмульгирующих систем и носителей. Предпочтительные косметически приемлемые основы включают от 1 до 25% жирной кислоты. Еще один предпочтительный аспект предусматривает включение от 0,1 до 10% мыла. Весьма подходящую основу представляет собой крем. Особенно предпочтительными являются быстро впитывающиеся кремы. Основы быстро впитывающегося крема обычно содержат от 5 до 25% мас./мас. жирной кислоты и от 0,1 до 10% мас./мас. мыла. Основа быстро впитывающегося крема дает высоко ценимое ощущение матовости кожи. Cj2-C20 жирные кислоты особенно предпочтительны в основах быстро впитывающегося крема, еще более предпочтительными являются C14-C18 жирные кислоты. Наиболее предпочтительной жирной кислотой является стеариновая кислота. Жирная кислота может также представлять собой смесь пальмитиновой и стеариновой кислот. Жирная кислота в композиции более предпочтительно присутствует в количестве в диапазоне от 5 до 20% мас./мас. композиции. Мыло в основе быстро впитывающегося крема включает соли щелочных металлов жирных кислот, например натриевые или калиевые соли, наиболее предпочтительным является
- 2 031758 стеарат калия. Мыло в основе быстро впитывающегося крема, как правило, присутствует в количестве в диапазоне от 0,1 до 10%, более предпочтительно от 0,1 до 3% мас./мас. композиции. Композиция для личной гигиены, при ее получении в виде быстро впитывающегося крема, предпочтительно включает от 60 до 85%, более предпочтительно от 65 до 80% мас./мас. воды. Вода, как правило, присутствует во многих композициях, полученных в соответствии с изобретением и, как правило, составляет 40-85% от массы композиции.
Композиция по настоящему изобретению может содержать другие необязательные ингредиенты, такие как агенты для осветления кожи, и один или несколько УФ солнцезащитных фильтров. Композиция по настоящему изобретению может также содержать другие разбавители. Разбавители действуют в качестве диспергатора или носителя для других материалов, присутствующих в композиции, с тем, чтобы облегчить их распределение при нанесении композиции на кожу. Отличные от воды разбавители могут включать жидкие или твердые смягчающие вещества, растворители, влагоудерживающие агенты, загустители и порошки.
Композиция необязательно может быть выпущена в виде дезодоранта. Под дезодорантом понимается дезодорант-стик, шариковый дезодорант или аэрозольный дезодорант, который используется для личного дезодорирования, например в области под рукой, который может содержать или не содержать антиперспирантные активные вещества.
Дезодорирующие композиции обычно могут быть в виде твердых веществ, мягких твердых веществ, гелей, кремов и жидкостей и дозироваться с помощью аппликаторов, соответствующих физическим характеристикам композиции.
Композиции могут содержать широкий спектр других дополнительных компонентов. Руководство CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition, 1992, которое включено в данный документ во всей полноте посредством ссылки, описывает широкий круг неограничивающих косметических и фармацевтических ингредиентов, обычно используемых в индустрии ухода за кожей, которые подходят для применения в композициях по настоящему изобретению. Примеры включают: антиоксиданты, связующие вещества, биологические добавки, буферные агенты, красители, загустители, полимеры, вяжущие вещества, ароматизаторы, увлажнители, контрастные вещества, кондиционеры, отшелушивающие агенты, регуляторы pH, консерванты, натуральные экстракты, эфирные масла, агенты усиливающие чувствительность кожи, успокаивающие кожу средства, и кожа лечебных агентов.
Композиция может быть составлена в любом известном формате, таком как шампунь, не требующие смывания кремы, лосьоны, тоники или сыворотки, причем более предпочтительными форматами являются шампуни, кремы или лосьоны.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу обеспечения защиты головы путем стимуляции секреции антимикробных пептидов (AMP), включающему стадию нанесения ниацинамида на волосы/волосистую часть кожи головы человека. Ниацинамид предпочтительно наносят в терапевтическом количестве для стимуляции секреции антимикробных пептидов.
Защита волосистой части кожи головы за счет секреции AMP предпочтительно приводит к расширенной защите или более длительной защите волосистой части кожи головы от проблем, связанных с волосистой частью кожи головы, таких как перхоть. В альтернативном варианте применение ниацинамида обеспечивает превосходный контроль перхоти из-за повышенной секреции AMP. Кроме того, с помощью этого механизма волосистой часть кожи головы придается превосходный контроль над перхотью и, в некоторых случаях, устойчивость против рецидивирующей перхоти.
Таким образом, усиленная секреция AMP за счет применения ниацинамида обеспечивает повышенную защиту/оборону, устойчивость к перхоти и к образованию перхоти и усиленное благоприятное воздействие. Преимущества данного изобретения могут быть понятны людям, страдающим от перхоти или от сухой и зудящей волосистой части кожи головы.
В соответствии с предпочтительным аспектом осуществления применение ниацинамида по настоящему изобретению предпочтительно является нетерапевтическим.
Далее изобретение будет дополнительно описано с помощью следующих неограничивающих примеров.
Примеры
Примеры 1-6. Примеры, доказывающие то, что ниацинамид стимулирует экспрессию гена LL-37, но не влияет на экспрессию псориазина.
Приведенные ниже образцы, представленные в табл. 1, были приготовлены для измерения их влияния на экспрессию псориазина и экспрессированных AMP (LL-37) псориазина.
- 3 031758
Таблица 1
Используемые материалы и процедура измерения экспрессии соответствующего гена приведены ниже.
Материалы.
Нормальные неонатальные эпидермальные первичные кератиноциты человека (NHEK), питательная среда для кератиноцитов (KGM) и ростовые добавки, антибиотики (пенициллин и стрептомицин), штамм E.coli (ATCC штамм 10536), липополисахарид (LPS) из Escherichia coli, штамм 055: В5, 1X фосфатный буферный солевой раствор, 10 мМ натрий-фосфатный буфер, ниацинамид, стерильные чашки (оба конца открыты, площадь открытого конца составляет 2,27 см2 и стержни с округлыми концами, изготовленные из твердого тефлона (приложение-1), ингредиенты Вазелина (приложение-2), псориазин (S100A7) (CircuLex) и набор LL-37 ELISA (Hycult), среда МакКонки с агаром, среда TSA (исследовательский отчет компании Unilever No: BL 110086).
Стимуляция первичных кератиноцитов кожи человека.
Человеческие первичные кератиноциты, приготовленные из неонатальной крайней плоти, получали из (Lonza Индия) и культивировали в среде без сыворотки роста кератиноцитов с определенными ростовыми добавками (Invitrogen). Кератиноциты культивировали в 12 и 24-луночных планшетах для тканевых культур (BD Falcon) и обрабатывали клетки при конфлуэнтности 60-70%. Стимуляцию кератиноцитов проводили в KGM с ростовой добавкой и все эксперименты проводили между пассажами 3-5.
Выделение РНК и количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени.
NHEK культивировали в 12-луночных планшетах (BD, Falcon) в количестве 6*104 клеток на лунку. После 24 ч инкубации 50% среды заменяли свежей средой. На 3-й день клетки обрабатывали различными концентрациями ниацинамида со свежей средой в течение 16-18 ч. Клетки собирали в буфере RLT (Qiagen) и образцы хранили при -70°C до использования при выделении РНК.
Общую РНК выделяли с использованием набора RNeasy Mini Kit от Qiagen в соответствии с инструкциями производителя. Чистоту и концентрацию РНК проверяли с использованием устройства NanoDrop (Thermo scientific). Образцы РНК загружали в 1% агарозный гель и качество экстракции наблюдали с использованием УФ-трансиллюминатора (Bangalore Genie, Индия). Образцы РНК разделяли на аликвоты и хранили при -70°C. Аликвоту общей РНК (от 250 до 500 нг) использовали для получения к ДНК с использованием набора Script cDNA synthesis kit (Bio-Rad, США). Программу синтеза кДНК проводили при 65°C в течение 5 мин с последующими 25°C в течение 5 мин. Синтез кДНК проводили при 42°C в течение 30 мин, конечный продукт денатурировали при 85°C в течение 5 мин с последующими 4°C до удаления.
ПЦР в реальном времени проводили с использованием метода SYBR green в соответствии с инструкциями производителя (Bio-Rad, США) с использованием устройства теплового контроля Chromo4 (Bio-Rad, США). 5 мкл 1:10 разбавленной пробы к ДНК и 1,5 пмоль специфических праймеров использовали в каждой реакции с использованием стандартной программы ПЦР (т.е. 94°С в течение 5 мин, а затем 50 циклов 94°C в течение 15 с, 60°C в течение 30 с, 72°C в течение 30 с) и результаты анализировали п-ДДСТ с использованием метода 2 .
Псориазин и LL-37 ELISA.
Первичные кератиноциты высевали в 12-луночные планшеты (BD Falcon). При конфлуентности от 60 до 70% клетки обрабатывали различными концентрациями ниацинамида в течение 72 ч. После 72 ч инкубации надосадочную жидкость клеточной культуры хранили при -70°C до применения в ELISA. Все реагенты и образцы ELISA доводили до комнатной температуры перед анализом. Образцы надосадочной жидкости клеточных культур центрифугировали при 5000 оборотах в минуту в течение 10 мин перед использованием. 100 мкл неразбавленного образца надосадочной жидкости культуры клеток использовали для проверки уровня псориазина с помощью набора ELISA от CircuLex. Клинические образцы разводили 1:25 в буфере для разведения и использовали 100 мкл разведенных образцов для проверки уровня псориазина методом ELISA. В случае LL-37 100 мкл неразбавленных образцов из in vitro, а также клинических образцов использовали для проверки уровня LL-37 с помощью ELISA (Hycult Biotech).
Экспрессия гена псориазина и LL-37 AMP в кератиноцитах, обработанных ниацинамидом в течение 18 ч. LPS (20 мкг/мл) использовали в качестве положительного контроля, чтобы вызвать экспрессию гена псориазина и LL-37 AMP в первичных кератиноцитах, которую исследовали после 18 часов с помощью с
- 4 031758 процедуры, представленной выше. Результаты кратного изменения приводятся в табл. 2 ниже. Таблица 2
Данные, приведенные в табл. 2 выше, указывают на то, что ниацинамид не смог стимулировать экспрессию гена псориазина даже при очень высокой концентрации (1,22 мг/мл), но, что удивительно, ниацинамид был способен вызвать секрецию AMP псориазина, который был обнаружен с помощью методики ELISA.
Примеры 7-12. In vivo эксперименты с лосьонами для кожи, содержащими ниацинамид для того, чтобы доказать индуцированную секрецию псориазина и LL-37 в коже.
Чтобы подтвердить результаты, полученные при опытах in vitro, эффект ниацинамида на здоровых добровольцах испытывали in vivo. Добровольцев просили наносить лосьон с ниацинамидом (3%) и без него на свое предплечье два раза в день. Через 7 дней после нанесения пятна экстрагировали в PBS и проводили эксперимент ELISA для обнаружения псориазина и LL-37 AMP.
Процедура исследования in vivo.
Получение культуры E.coli.
Глицериновый сток E.coli (10536) высевали в 30 мл среды TSB и культуры инкубировали в течение ночи при 37°C в инкубаторе-шейкере. Ночную культуру субкультивировали на скошенном агаре TSA и инкубировали в течение ночи при 37°C, затем скошенный агар хранили при 4°C (один раз в 15 дней готовили свежий скошенный агар).
Культуру E.coli из скошенного агара субкультивировали на планшете TSA и инкубировали в течение ночи при 37°C. Выращенную на планшетах ночную культуру E.coli суспендировали в 6-7 мл натрийфосфатного буфера (10 мМ). Плотность культуры доводили до 1 OD620 с помощью спектрофотометра и использовали для клинических исследований.
Способ экстракции Cup Scrub.
Этот способ включен в способ ASTM, E2752 - 10 (Стандартное руководство по оценке остаточной эффективности антибактериальных препаратов). Чашка и стержень были изготовлены из тефлона, при этом площадь чашки составляла 2,84 см2. Чашку использовали для сохранения буфера на коже, а стержень использовали для отшелушивания, для лучшего извлечения AMP кожи и/или остаточных бактерий с кожи. Продолжительность отшелушивания составляла 1 мин. Извлеченный образец собирали в 1,5 мл пробирку Eppendorf для анализа (приложение-1).
Оценка псориазина и LL-37 AMP и подсчет остаточных E.coli с человеческой кожи способом cup scrub.
мкл 1 OD620 культуры E.coli наносили на 2,27 см2 площади на отмеченной области предплечья (без крема, основной крем и крем с ниацинамидом наносили на пятно). Культуру равномерно распределяли на каждом участке. После 15-минутного контакта образцы извлекали способом cup scrub в 1 мл PBS. Образцы собирали в стерильную микроцентрифужную пробирку.
В экстрагированном образце 800 мкл использовали для подсчета остаточных E.coli стандартным микробиологическим методом (рассевали 100 мкл неразведенного, -1 и -2 разведенного образцов на чашке с агаром МакКонки поверхностным методом). Оставшиеся 200 мкл образца использовали для анализа уровней псориазина и LL-37 с помощью ELISA с использованием стандартных наборов. Чистый образец использовали для проверки уровня LL-37 в образцах. В случае псориазина образцы разводили 1:25 в буфере для разведения (который предоставляется вместе с набором) и использовали для анализа 100 мкл разбавленных образцов.
Дизайн исследования in vivo.
1. Добровольцев просили зайти к исследователям после мытья каждый день утром.
2. Площадь 6,25 см2 (2,5χ2,5 см) размечали на внутреннем предплечье с помощью маркера и линейки. Три области размечали на предплечье, за исключением запястья (5 см от основания ладони). (Один маркер был дан каждому добровольцу для того, чтобы отметить область, если она становится тусклой или стирается).
3. Аликвоты 62,5 мг составов взвешивали в стерильных контейнерах (35-мм пластиковые круглые чашки) и передавали добровольцам.
4. Добровольцев просили нанести лекарственные формы (62,5 мг/6,25 см2 площади) в разграничен
- 5 031758 ные пятна на предплечье. (Порядок нанесения был следующим: основной состав с последующими составами, содержащими активные вещества). Препараты распределяли по площади в течение ~30 с каждый.
5. После нанесения каждого препарата палец вытирали стерильной санитарно-гигиенической бумагой.
6. Аналогичные аликвоты 62,5 мг состава взвешивали в стерильных 35 мм пластиковых чашках Петри, герметизировали парафином и давали каждому добровольцу для нанесения на ночь (перед сном).
7. Стадии с 3 по 6 повторяли в течение 7 дней в течение 7-дневного исследования. В случае однодневного исследования оценку давали на второй день.
8. На 8-й день добровольцев просили зайти к исследователям утром, без мытья предплечий.
9. Предплечья добровольцев промывали (исследователи) с помощью неантибактериального мыла (мыло Lux).
10. Избыток воды удаляли похлопыванием сухой стерильной санитарно-гигиенической бумагой.
11. Добровольцев просили подождать в течение 6 ч, не прикасаясь к предплечью.
12. Круглый участок 2,27 см2 отмечали на каждом месте нанесения крема с помощью шаблона и 10 мкл культуры E.coli 10536, соответствующей от 1*108 до 1*109 клеток/мл, добавляли в каждую зону окружности и равномерно распределяли.
13. После 15-минутного контакта E.coli выделяли способом cup-scrub с использованием 1 мл 1X PBS. Продолжительность экстракции составляла 1 мин.
14. Образцы анализировали на количество бактерий поверхностным методом посева на агаре МакКонки.
Остаточный логарифм E.coli в области предплечий в различных экспериментах представлен в табл. 3 и в табл. 4 ниже.
Таблица 3
Остаточный логарифм E.coli, измеренный после одного дня применения композиции (n=28)
Таблица 4
Остаточный логарифм E.coli измеряли через 7 дней применения композиции (n=34)
Данные в табл. 3 выше демонстрируют, что композиция, содержащая ниацинамид, способна уменьшать количество бактерий даже после одного дня применения, в то время как табл. 4 указывает на то, что этот эффект сохраняется в течение длительного периода времени (семидневное нанесение).
Пример 13. Эксперимент для определения типов и количеств антимикробных пептидов (AMP), секретируемых, благодаря стимуляции ниацинамидом.
Следующая процедура была использована для определения AMP, индуцированных в результате воздействия ниацинамида на клетки-кератиноциты.
1. Первичные кератиноциты высевали в 12-луночные планшеты с 1 мл полной среды KGM (рассевали 60000 клеток/лунку в Пассаже-4).
2. Планшеты инкубировали в CO2 инкубаторе в течение 48 ч.
3. После 48 ч инкубации клетки обрабатывали 1 мг/мл ниацинамида и не обрабатывали в дублированных лунках (для обработки использовали свежую среду).
4. После 72 ч инкубации надосадочную жидкость культуральной среды переносили в 1,5 мл пробирки соответственно.
5. Образцы затем пропускали через фильтр с порогом 20 кДа для удаления высокомолекулярных белков.
6. Элюированные образцы, содержащие белки <20 кДа, переносили в 15 мл стерильные центрифужные пробирки.
7. Затем к элюированным образцам добавляли охлажденный ацетон (категории ВЭЖХ) (1 мл образца: 4 мл ацетона).
8. Пробирки переносили на -20°C для осаждения белков в течение 24 ч.
- 6 031758
9. Через 24 ч пробирки центрифугировали при 14000 g в течение 40 мин при температуре 4°C.
10. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок белка анализировали с помощью массспектрометрии белков.
Данные о повышенных уровнях секреции различных AMP сведены в табл. 5. Повышенный уровень секреции AMP измеряли по значению PSM (балльная функция совпадения пептидного спектра), которое является относительной мерой избытка пептида в секретоме.
Таблица 5
Данные в табл. 5 указывают на то, что вследствие применения ниацинамида имеется значимо высокий уровень секреции различных AMP.
Примеры 14-17. Исследование на людях-добровольцах способности кожи защищать себя от инфекций.
Был проведен эксперимент с использованием следующего протокола.
1. Добровольцы получали мыло Lux™ для применения, и их просили не использовать любое другое мыло или увлажнители на их предплечье в течение 7 дней до начала исследования.
2. Добровольцам было предложено применять полезный белый крем-основу Vaseline™ и полезный белый крем-основу Vaseline™ с включенным в него ниацинамидом (1, 2 и 3%) в различных местах на предплечье.
3. Добровольцев просили повторять стадию 1 по два раза в день в течение 1 дня, утром после мытья и вечером сразу перед сном. Добровольцев просили не мыть предплечья после применения составов вечером.
4. На 2-й день предплечья промывалось исследователем с помощью небактериального мыла, и добровольцев просили ждать в течение 6 ч в контролируемых условиях (24±2°C и 45±5% относительной влажности).
5. Через 6 ч ожидания ~106 E.coli наносили на предплечье к каждой точке по отдельности. Время контакта B.coli на коже составляло 15 мин.
6. Через 15 мин образец извлекали с предплечья с использованием способа cup-rod.
7. E.coli подсчитывали с использованием стандартного микробиологического способа.
Данные о E.coli, рассчитанные для различных обработок, представлены в табл. 6.
Таблица 6
Данные, приведенные в табл. 6 указывают на то, что использование ниацинамида повышает врожденный иммунитет кожи против вторгшихся бактерий.
Таким образом, изобретение раскрывает новое применение ниацинамида, не известное до настоящего времени, которое должно стимулировать секрецию антимикробных пептидов (AMP) при нанесении на внешнюю поверхность человеческого тела.
The invention relates to the use of niacinamide to stimulate the production of AMP (antimicrobial peptides) in the skin. The invention can be used to improve the immunity of the skin, scalp and mouth against microorganisms.
031758 Bl
The technical field to which the invention relates.
The invention relates to the use of niacinamide to stimulate the production of AMP (antimicrobial peptides) in the skin. The invention can be applied to improve the immunity of the skin, scalp and mouth against microorganisms.
Background of the invention
The skin is the main line of defense that protects the human body from invading pathogens, such as viruses and bacteria. As the main defense organ, the skin tissue always remains in constant contact with the environment, and therefore it has to face and overcome threats and challenges from invading pathogenic microorganisms. The exposed surface of the skin is not only exposed to pathogenic alien bacteria, but also remains in contact and interacts with resident commensal (conditionally pathogenic) bacteria. Despite all these challenges from foreign and commensal microbes, healthy skin is not affected by infections, and the number of resident microflora remains constant. This balance in the interaction of skin tissue and germs is maintained, since the skin has a complex protection strategy, and antimicrobial peptides (AMP) are an important part of it.
AMPs are an integral part of their own skin protection system. AMPs were originally found in insects and animals, and since the initial discovery, AMPs have been considered promising antimicrobial agents. AMPs are ubiquitous in nature, and they tend to have a broad spectrum of activity against invading bacteria, fungi, enveloped viruses, and parasites (Braff and Gallo, 2006). AMPs are typically short peptides, and it has been reported that about 90 different AMPs are present in the human body. AMPs generally have two main physical features: they a) have a cationic charge and b) have a significant portion of hydrophobic residues. The cationic charge of AMP promotes selectivity for negatively charged microbial cytoplasmic membranes, while hydrophobicity facilitates interaction with the cell membrane of microbial species.
The authors of the present invention have worked to obtain hygienic benefits for consumers by increasing AMP levels in the skin. The authors wanted to achieve the desired effect through the use of natural molecules, which are perceived by consumers as more favorable for the skin and, thus, less rigid. To achieve this goal, various active substances were tested and, after extensive research, it was found that the use of niacinamide or vitamin B3 increases the level of AMP in the skin.
Niacinamide or Vitamin B3 is a well-known active agent for skin lightening, which is used in several skin care products. It is also reported that niacinamide has various other properties, such as preventing cellulite, treating skin irritation and improving water absorption of the skin (this is reported, in particular, in patent publications EP 1063963, EP 1063994, EP 1063965). Niacinamide is also used in the treatment of many inflammatory skin diseases, such as common acne, psoriasis, and atopic dermatitis (Niren NM (2006).:. Cutis 77: 11-16.).
WO 11133692 (Cedars-Sinai Medical Center) discloses the important role of C / EBRE in the natural immune response against pathogens. In particular, it was shown that in the absence of functional C / EBRE, mice are sharply limited in their ability to free themselves from S.aureus infection. Neutrophils are particularly affected, and susceptibility to S.aureus can be corrected by treatment with gamma-interferon (IFN-γ). It is important to note that an increase in C / EBRE activity, either as a result of stimulation of over-expression of C / EBRE, or as a result of the use of niacinomide or its analog, derivative or salt, sharply enhances the immune-mediated destruction of S.aureus and leads to a decrease in the intensity of infection.
The authors of the present invention have found that when niacinamide is applied to the skin (which may be the skin itself or the scalp or the oral cavity), the active agent induces the formation of AMP, which is known to be an important step in improving skin immunity against microorganism attacks. Thus, the benefit to the consumer is that by applying a composition containing niacinamide, you can protect the skin from germs that may attack in the future.
Summary of Invention
The invention relates to the use of niacinamide to stimulate the secretion of antimicrobial peptides (AMP) when applied to the external surface of the human body.
Accordingly, the invention also describes niacinamide, designed to prophylactically stimulate the secretion of antimicrobial peptides (AMP) by applying it to the external surface of the human body.
In addition, the invention relates to a method for ensuring the protection of the scalp by stimulating the secretion of antimicrobial peptides (AMP), comprising the step of applying niacinamide to the hair / scalp of the human scalp.
- 1,031,758
Detailed Description of the Invention
These and other aspects, features and advantages will be apparent to those skilled in the art after reviewing the following detailed description and appended claims. In order to avoid any doubt, any feature of one of the aspects of the present invention can be used in any other aspect of the present invention. The word containing means including, but not necessarily means consisting of, or composed of. In other words, the listed stages or variants are not necessarily exhaustive. It should be noted that the examples provided in the description below are intended to illustrate the invention and are not intended to limit the scope of the present invention by these examples alone. All percentages are weight / mass percent unless otherwise indicated. Except for working and comparative examples, or when explicitly stated otherwise, all numbers in this description, indicating quantities of the material or reaction conditions, physical properties of the materials and / or their use, should be understood as being preceded by the word about. Numerical ranges, expressed in the format from x to y, are understood to include x and y. When for a particular attribute, several preferred ranges are given in the format from x to y, it should be understood that the authors also provided for all ranges combining different endpoints.
The term skin, as used herein, includes the outer surface of a mammal, especially humans, and includes the skin, hairy scalp, hair, and oral cavity. The use according to the invention can be carried out by incorporating niacinamide into a washable or indelible product, and includes any product applied to the human body, mainly for lightening the skin, but may also include improving appearance, cleansing, controlling odor or general aesthetics. The use according to the invention is preferably carried out by incorporation into an indelible composition. The composition can be in the form of a liquid, lotion, cream, foam, scrub, gel, soap or toner, or it can be applied using or with a face mask, tampon or patch.
Non-limiting examples of such compositions include indelible lotions and creams for the skin, shampoos, conditioners, shower gels, toilet soap, antiperspirants, deodorants, hair removers, lipsticks, mascara, cream foundation, artificial tanners and sunscreen lotions . Niacinamide has the structure shown below.
The niacinamide used in the present invention preferably stimulates the secretion of AMP by keratinocytes. AMPs secreted in this way provide for an increase in the immunity of the external surface of the body. The outer surface includes the skin, the hairy part of the scalp, or the oral cavity.
Using the present invention, it was found that niacinamide activates keratinocytes, which are the main cells of the skin epidermis, thereby providing the advantages of the present invention, namely stimulating the secretion of antimicrobial peptides (AMP). Thus, niacinamide stimulates the formation of a shield against microbes. Therefore, niacinamide protects the body against infections, enhancing the body's own defense. In other words, the active agent prepares the surface of the body to protect against germs. The advantage of this is that the agent provides long-term protection, for example, protection against microbes up to 24 hours.
The composition in which niacinamide is used in accordance with the present invention may have the following preferred properties. Niacinamide is preferably present in an amount of from 0.1 to 5%, more preferably from 0.5 to 5%, even more preferably from 0.5 to 3%, and optimally from 1.0 to 3.0% by weight of the composition. The composition preferably contains a cosmetically acceptable base. The cosmetically acceptable base is preferably a cream, lotion, gel or emulsion.
Personal care compositions can be made using various cosmetically acceptable emulsifying or non-emulsifying systems and carriers. Preferred cosmetically acceptable bases include from 1 to 25% fatty acid. Another preferred aspect involves the inclusion of from 0.1 to 10% soap. A very suitable foundation is a cream. Especially preferred are rapidly absorbed creams. The basics of a fast-absorbing cream usually contain from 5 to 25% w / w. fatty acid and from 0.1 to 10% wt./wt. soap. The basis of the quickly absorbed cream gives a highly valued sensation of matte skin. Cj 2 -C 20 fatty acids are particularly preferred in the basics of a fast-absorbing cream, C is even more preferred. 14 -C 18 fatty acid. The most preferred fatty acid is stearic acid. Fatty acid may also be a mixture of palmitic and stearic acids. The fatty acid in the composition is more preferably present in an amount in the range of from 5 to 20% w / w. compositions. The soap in the base of the fast-absorbing cream includes alkali metal salts of fatty acids, for example sodium or potassium salts, most preferred
- 2 031758 potassium stearate. The soap in the base of the fast-absorbing cream is usually present in an amount in the range from 0.1 to 10%, more preferably from 0.1 to 3% w / w. compositions. The personal care composition, when prepared as a fast-absorbing cream, preferably comprises from 60 to 85%, more preferably from 65 to 80% w / w. water. Water is usually present in many of the compositions obtained in accordance with the invention and, as a rule, is 40-85% by weight of the composition.
The composition of the present invention may contain other optional ingredients, such as skin lightening agents, and one or more UV sunscreens. The composition of the present invention may also contain other diluents. Diluents act as a dispersant or carrier for other materials present in the composition in order to facilitate their distribution when the composition is applied to the skin. Non-water diluents may include liquid or solid emollients, solvents, humectants, thickeners and powders.
The composition may not necessarily be released in the form of a deodorant. A deodorant is a deodorant stick, a ball deodorant or an aerosol deodorant that is used for personal deodorization, for example in the area at hand, which may or may not contain antiperspirant actives.
Deodorizing compositions can usually be in the form of solids, soft solids, gels, creams, and liquids and be dosed using applicators that match the physical characteristics of the composition.
Compositions may contain a wide range of other optional components. The CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition, 1992, which is incorporated herein in its entirety by reference, describes a wide range of non-limiting cosmetic and pharmaceutical ingredients commonly used in the skin care industry that are suitable for use in the compositions of the present invention. Examples include: antioxidants, binders, biological additives, buffering agents, colorants, thickeners, polymers, binders, fragrances, moisturizers, contrast agents, conditioners, exfoliating agents, pH regulators, preservatives, natural extracts, essential oils, skin-enhancing agents skin soothing agents and skin therapeutic agents.
The composition may be formulated in any known format, such as shampoo, creams, lotions, tonics or serums that do not require rinsing, with shampoos, creams or lotions being more preferred.
Another aspect of the present invention relates to a method of providing head protection by stimulating the secretion of antimicrobial peptides (AMP), comprising the step of applying niacinamide to the hair / scalp of the scalp. Niacinamide is preferably applied in a therapeutic amount to stimulate the secretion of antimicrobial peptides.
Protecting the scalp through AMP secretion preferably results in enhanced protection or longer protection of the scalp from problems associated with the scalp, such as dandruff. Alternatively, the use of niacinamide provides excellent control of dandruff due to increased secretion of AMP. In addition, with this mechanism, the scalp part of the scalp is given excellent dandruff control and, in some cases, resistance to recurrent dandruff.
Thus, enhanced secretion of AMP through the use of niacinamide provides enhanced protection / defense, resistance to dandruff and dandruff and enhanced beneficial effects. The advantages of this invention can be understood by people suffering from dandruff or from a dry and itchy scalp.
In accordance with a preferred aspect of the implementation, the use of the niacinamide of the present invention is preferably non-therapeutic.
Hereinafter the invention will be further described using the following non-limiting examples.
Examples
Examples 1-6. Examples that prove that niacinamide stimulates the expression of the gene LL-37, but does not affect the expression of psoriasin.
The following samples are presented in table. 1 were prepared to measure their effect on the expression of psoriasin and the AMP (LL-37) expressed psoriasin.
- 3 031758
Table 1
The materials used and the procedure for measuring the expression of the corresponding gene are given below.
Materials
Normal human neonatal epidermal primary keratinocytes (NHEK), nutrient medium for keratinocytes (KGM) and growth supplements, antibiotics (penicillin and streptomycin), E. coli strain (ATCC strain 10536), lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli strain, strain 10536), lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli strain, strain 50036 strain, E. coli strain (ATCC strain 10536), lipopolysaccharide (LPS), Escherichia coli strain strain 10036; , 1X phosphate buffered saline, 10 mM sodium phosphate buffer, niacinamide, sterile cups (both ends open, the open end area is 2.27 cm 2 and rods with round ends, made of solid Teflon (Appendix-1), ingredients of Vaseline (Appendix-2), Psoriasin (S100A7) (CircuLex) and LL-37 ELISA Kit (Hycult), MacConkey Medium with Agar, medium TSA (research Unilever Report No: BL 110086).
Stimulation of primary keratinocytes of human skin.
Human primary keratinocytes prepared from neonatal foreskin were obtained from (Lonza India) and cultured in a serum-free medium keratinocyte growth with certain growth supplements (Invitrogen). Keratinocytes were cultured in 12 and 24 well tissue culture plates (BD Falcon) and cells were treated with confluence of 60-70%. Stimulation of keratinocytes was performed in KGM with a growth supplement, and all experiments were performed between passages 3-5.
RNA isolation and quantitative polymerase chain reaction (PCR) in real time.
NHEK was cultivated in 12-well plates (BD, Falcon) in the amount of 6 * 10 four cells per well. After 24 hours of incubation, 50% of the medium was replaced with fresh medium. On day 3, cells were treated with various concentrations of niacinamide with fresh medium for 16-18 hours. Cells were collected in RLT buffer (Qiagen) and samples were stored at -70 ° C until used for RNA isolation.
Total RNA was isolated using the RNeasy Mini Kit from Qiagen according to the manufacturer's instructions. The purity and concentration of RNA was tested using a NanoDrop device (Thermo scientific). RNA samples were loaded on a 1% agarose gel and the quality of extraction was observed using a UV transilluminator (Bangalore Genie, India). RNA samples were aliquoted and stored at -70 ° C. An aliquot of total RNA (250 to 500 ng) was used to prepare for DNA using the Script cDNA synthesis kit (Bio-Rad, USA). The cDNA synthesis program was carried out at 65 ° C for 5 min, followed by 25 ° C for 5 min. The synthesis of cDNA was carried out at 42 ° C for 30 min, the final product was denatured at 85 ° C for 5 min, followed by 4 ° C before removal.
Real-time PCR was performed using the SYBR green method in accordance with the manufacturer's instructions (Bio-Rad, USA) using a Chromo4 thermal control device (Bio-Rad, USA). 5 μl of a 1:10 diluted sample for DNA and 1.5 pmol of specific primers were used in each reaction using the standard PCR program (ie, 94 ° C for 5 min, and then 50 cycles of 94 ° C for 15 s, 60 ° C for 30 s, 72 ° C for 30 s) and the results were analyzed by p-DDST using method 2.
Psoriasin and LL-37 ELISA.
Primary keratinocytes were seeded in 12-well plates (BD Falcon). With confluence of from 60 to 70%, cells were treated with various concentrations of niacinamide for 72 hours. After 72 hours of incubation, the cell culture supernatant was stored at -70 ° C until used in ELISA. All reagents and ELISA samples were brought to room temperature before analysis. Cell culture supernatant samples were centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes before use. 100 μl of the undiluted sample of the cell culture supernatant was used to check the level of psoriasin using the CircuLex ELISA kit. Clinical samples were diluted 1:25 in dilution buffer and 100 μl of diluted samples were used to check the level of psoriasin by ELISA. In the case of LL-37, 100 μl of undiluted samples from in vitro, as well as clinical samples were used to check the level of LL-37 using ELISA (Hycult Biotech).
Expression of psoriasin gene and LL-37 AMP in keratinocytes treated with niacinamide for 18 hours. LPS (20 μg / ml) was used as a positive control to induce expression of the gene of psoriasin and LL-37 AMP in primary keratinocytes, which was examined after 18 hours using with
- 4,031,758 procedures presented above. The results of a multiple change are given in table. 2 below. table 2
The data given in table. 2 above indicate that niacinamide could not stimulate psoriasin gene expression even at very high concentrations (1.22 mg / ml), but surprisingly, niacinamide was able to cause AMP secretion of psoriasin, which was detected by ELISA.
Examples 7-12. In vivo experiments with skin lotions containing niacinamide to prove the induced secretion of psoriasin and LL-37 in the skin.
To confirm the results obtained in vitro experiments, the effect of niacinamide on healthy volunteers was tested in vivo. Volunteers were asked to apply lotion with niacinamide (3%) and without it on their forearm twice a day. 7 days after application, the spots were extracted in PBS and an ELISA experiment was conducted to detect psoriasin and LL-37 AMP.
In vivo study procedure.
Obtaining a culture of E. coli.
Glycerol stock of E.coli (10536) was sown in 30 ml of TSB medium and cultures were incubated overnight at 37 ° C in a shaker incubator. The overnight culture was subcultured on oblique TSA agar and incubated overnight at 37 ° C, then the oblique agar was stored at 4 ° C (fresh oblique agar was prepared once every 15 days).
E. coli culture from oblique agar was subcultured on a TSA plate and incubated overnight at 37 ° C. The E. coli overnight culture grown on the plates was suspended in 6-7 ml of sodium phosphate buffer (10 mM). The culture density was adjusted to 1 OD 620 using a spectrophotometer and used for clinical studies.
Cup Scrub extraction method.
This method is included in the ASTM method, E2752-10 (Standard Guide for Evaluating Residual Efficacy of Antibacterial Drugs). The cup and the core were made of Teflon, while the area of the cup was 2.84 cm 2 . The cup was used to preserve the buffer on the skin, and the core was used to exfoliate, for better AMP of the skin and / or residual bacteria from the skin. The peeling duration was 1 min. The extracted sample was collected in a 1.5 ml Eppendorf tube for analysis (Appendix-1).
Evaluate psoriasin and LL-37 AMP and calculate residual E. coli from human skin using cup scrub.
µl 1 OD 620 E. coli cultures were applied to 2.27 cm 2 the area on the marked area of the forearm (without cream, the main cream and cream with niacinamide were applied to the stain). The culture was evenly distributed at each site. After a 15-minute contact, the samples were removed by cup scrub method in 1 ml of PBS. Samples were collected in a sterile microcentrifuge tube.
In the extracted sample, 800 μl was used to calculate the residual E. coli by the standard microbiological method (100 μl of undiluted, -1 and -2 diluted samples were used on a plate with MacConkey's agar by the surface method). The remaining 200 μl of the sample was used to analyze the levels of psoriasin and LL-37 using ELISA using standard kits. A clean sample was used to check the level of LL-37 in the samples. In the case of psoriasin, the samples were diluted 1:25 in the dilution buffer (which is provided with the kit) and 100 μl of the diluted samples were used for analysis.
In vivo study design.
1. Volunteers were asked to go to the researchers after washing every day in the morning.
2. Area 6.25 cm 2 (2.5 χ 2.5 cm) marked on the inner forearm with a marker and a ruler. Three areas were marked on the forearm, with the exception of the wrist (5 cm from the base of the palm). (One marker was given to each volunteer in order to mark the area if it becomes dim or erased).
3. Aliquots of 62.5 mg of the compositions were weighed in sterile containers (35 mm plastic round cups) and transferred to volunteers.
4. Volunteers were asked to apply the dosage form (62.5 mg / 6.25 cm 2 area) in delimited
- 5,031,758 spots on the forearm. (The order of application was as follows: the main composition with subsequent compositions containing the active substances). The preparations were distributed by area for ~ 30 s each.
5. After applying each preparation, wipe the finger with sterile sanitary paper.
6. Similar aliquots of 62.5 mg of the composition were weighed into sterile 35 mm plastic Petri dishes, sealed with paraffin, and given to each volunteer for application overnight (before bedtime).
7. Stages 3 through 6 were repeated for 7 days during the 7-day study. In the case of a one-day study, an assessment was given on the second day.
8. On the 8th day, volunteers were asked to visit the researchers in the morning, without washing their forearms.
9. The volunteers' forearms were washed (by the researchers) with non-antibacterial soap (Lux soap).
10. Excess water was removed by patting with dry sterile sanitary-hygienic paper.
11. Volunteers were asked to wait for 6 hours without touching their forearm.
12. Round section 2.27 cm 2 noted at each site of application of the cream using a template and 10 μl of E.coli 10536 culture, corresponding to 1 * 10 eight up to 1 * 10 9 cells / ml, added to each zone of the circle and evenly distributed.
13. After a 15-minute contact, E. coli was isolated by the cup-scrub method using 1 ml of 1X PBS. The duration of extraction was 1 min.
14. Samples were analyzed for the number of bacteria by surface sowing on MacConkey agar.
The residual logarithm of E. coli in the forearm area in various experiments is presented in Table. 3 and in table. 4 below.
Table 3
Residual log E. coli, measured after one day of use of the composition (n = 28)
Table 4
The residual logarithm of E. coli was measured after 7 days of use of the composition (n = 34)
The data in the table. 3 above demonstrate that a composition containing niacinamide is able to reduce the number of bacteria even after one day of use, while tab. 4 indicates that this effect persists for a long period of time (seven-day application).
Example 13. An experiment to determine the types and amounts of antimicrobial peptides (AMP) secreted by stimulation with niacinamide.
The following procedure was used to determine the AMP induced as a result of exposure of niacinamide to keratinocyte cells.
1. Primary keratinocytes were seeded into 12-well plates with 1 ml of complete KGM medium (60,000 cells / well were seeded in Passage-4).
2. Plates were incubated in CO 2 incubator for 48 hours
3. After 48 hours of incubation, the cells were treated with 1 mg / ml of niacinamide and not treated in duplicate wells (fresh medium was used for processing).
4. After 72 hours of incubation, the supernatant of the culture medium was transferred to 1.5 ml tubes, respectively.
5. Samples were then passed through a filter with a 20 kDa threshold to remove high molecular weight proteins.
6. Eluted samples containing proteins. <20 kDa, transferred to 15 ml sterile centrifuge tubes.
7. Then cooled acetone (HPLC category) was added to the eluted samples (1 ml of sample: 4 ml of acetone).
8. Vials were transferred at -20 ° C to precipitate proteins for 24 hours.
- 6 031758
9. After 24 hours, the tubes were centrifuged at 14,000 g for 40 minutes at 4 ° C.
10. The supernatant was discarded, and the protein pellet was analyzed using protein mass spectrometry.
Data on elevated levels of secretion of various AMP are summarized in Table. 5. The elevated level of AMP secretion was measured by the PSM value (score function of the peptide spectrum), which is a relative measure of the excess peptide in the secretion.
Table 5
The data in the table. 5 indicate that, due to the use of niacinamide, there is a significantly high level of secretion of various AMPs.
Examples 14-17. A study on human volunteers of the ability of the skin to protect itself from infections.
An experiment was conducted using the following protocol.
1. Volunteers received Lux ™ soap for use, and were asked not to use any other soap or moisturizers on their forearm for 7 days before the start of the study.
2. Volunteers were encouraged to apply Vaseline ™ wholesome white cream and Vaseline ™ wholesome white cream with niacinamide (1, 2 and 3%) included in different places on the forearm.
3. Volunteers were asked to repeat stage 1 twice a day for 1 day, in the morning after washing and in the evening right before bedtime. Volunteers were asked not to wash their forearms after applying the compositions in the evening.
4. On the 2nd day, the forearm was washed by the researcher with non-bacterial soap, and volunteers were asked to wait for 6 hours under controlled conditions (24 ± 2 ° C and 45 ± 5% relative humidity).
5. After 6 hours of waiting ~ 10 6 E. coli was applied on the forearm to each point separately. The contact time of B. coli on the skin was 15 minutes.
6. After 15 min, the sample was removed from the forearm using the cup-rod method.
7. E. coli was calculated using standard microbiological method.
Data on E. coli, calculated for various treatments, are presented in Table. 6
Table 6
The data given in table. 6 indicate that using niacinamide enhances the innate immunity of the skin against invading bacteria.
Thus, the invention discloses a new use of niacinamide, not known to date, which should stimulate the secretion of antimicrobial peptides (AMP) when applied to the external surface of the human body.
Claims (8)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/EP2014/059590 WO2015172801A1 (en) | 2014-05-12 | 2014-05-12 | Niacinamide for inducing generation of antimicrobial peptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201692284A1 EA201692284A1 (en) | 2017-03-31 |
| EA031758B1 true EA031758B1 (en) | 2019-02-28 |
Family
ID=50771476
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201692284A EA031758B1 (en) | 2014-05-12 | 2014-05-12 | Niacinamide for inducing generation of antimicrobial peptides |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6446065B2 (en) |
| CN (2) | CN113908074A (en) |
| BR (1) | BR112016024400A2 (en) |
| EA (1) | EA031758B1 (en) |
| MX (1) | MX2016014760A (en) |
| PH (1) | PH12016502047A1 (en) |
| WO (1) | WO2015172801A1 (en) |
| ZA (1) | ZA201607105B (en) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017027603A1 (en) | 2015-08-10 | 2017-02-16 | Mary Kay Inc. | Topical compositions |
| EA035440B1 (en) | 2015-10-05 | 2020-06-15 | Юнилевер Н.В. | Skin lightening composition |
| EA036976B1 (en) * | 2016-05-10 | 2021-01-21 | Юнилевер Н.В. | Topical composition |
| JP6859367B2 (en) | 2016-05-26 | 2021-04-14 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | Antibacterial composition for topical use |
| WO2018218012A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Follea International | Synephrine compositions |
| EP3703690A1 (en) * | 2017-10-30 | 2020-09-09 | Unilever N.V. | Use of niacinamide for microbiome balancing |
| US20200316050A1 (en) | 2017-12-18 | 2020-10-08 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | A topical composition based on niacinamide derivative |
| WO2019121529A1 (en) | 2017-12-18 | 2019-06-27 | Unilever N.V. | A topical composition |
| US20200404915A1 (en) | 2018-03-13 | 2020-12-31 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | A sanitizer composition |
| WO2024042554A1 (en) * | 2022-08-25 | 2024-02-29 | Istituto Fondazione Di Oncologia Molecolare Ets | A pharmaceutical composition for treatment of viral infections |
| WO2024041910A1 (en) * | 2022-08-25 | 2024-02-29 | Unilever Ip Holdings B.V. | Inactivation or kill of virus and compositions thereof |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7026308B1 (en) * | 1999-06-25 | 2006-04-11 | The Procter & Gamble Company | Topical anti-microbial compositions |
| WO2006040048A1 (en) * | 2004-10-15 | 2006-04-20 | Bayer Consumer Care Ag | Acidic and buffered skin-care compositions comprising nicotinamid and an absorbing agent |
| WO2011133692A1 (en) * | 2010-04-20 | 2011-10-27 | Cedars-Sinai Medical Center | Boosting immune defense by upregulating ccaat/enhancer binding protein epsilon |
| WO2012049677A2 (en) * | 2010-10-10 | 2012-04-19 | Dermipsor Ltd. | Compositions for treating psoriasis of the scalp |
| WO2012137169A1 (en) * | 2011-04-05 | 2012-10-11 | L'oreal | Bacterial lysate for preventing or treating scalp dandruff |
| DE102012002592A1 (en) * | 2012-02-13 | 2013-08-14 | Dr. Kurt Wolff Gmbh & Co. Kg | Use of an agent for stimulating the gene expression of antimicrobial peptides (AMP) |
| EP2742942A1 (en) * | 2012-12-14 | 2014-06-18 | Unilever N.V. | Niacinamide for inducing generation of antimicrobial peptides |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPN892496A0 (en) * | 1996-03-25 | 1996-04-18 | Technical Consultancy Services Pty Limited | Acne treatment |
| CN101019865A (en) * | 2007-01-23 | 2007-08-22 | 中国医学科学院皮肤病医院 | Compound nicotinamide medicine for antiphlogosis, wet storage and eliminating spot |
| US8293790B2 (en) * | 2011-10-19 | 2012-10-23 | Dignity Sciences Limited | Pharmaceutical compositions comprising DGLA and benzoyl peroxide and methods of use thereof |
| EP3831379A1 (en) * | 2012-06-15 | 2021-06-09 | CONARIS research institute AG | A composition containing nicotinic acid and/or nicotinamide and/or tryptophan for positively influencing the intestinal microbiota |
-
2014
- 2014-05-12 JP JP2016567081A patent/JP6446065B2/en active Active
- 2014-05-12 WO PCT/EP2014/059590 patent/WO2015172801A1/en active Application Filing
- 2014-05-12 EA EA201692284A patent/EA031758B1/en not_active IP Right Cessation
- 2014-05-12 CN CN202111170332.0A patent/CN113908074A/en active Pending
- 2014-05-12 CN CN201480078798.XA patent/CN106413680A/en active Pending
- 2014-05-12 BR BR112016024400A patent/BR112016024400A2/en not_active Application Discontinuation
- 2014-05-12 MX MX2016014760A patent/MX2016014760A/en active IP Right Grant
-
2016
- 2016-10-14 PH PH12016502047A patent/PH12016502047A1/en unknown
- 2016-10-14 ZA ZA2016/07105A patent/ZA201607105B/en unknown
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7026308B1 (en) * | 1999-06-25 | 2006-04-11 | The Procter & Gamble Company | Topical anti-microbial compositions |
| WO2006040048A1 (en) * | 2004-10-15 | 2006-04-20 | Bayer Consumer Care Ag | Acidic and buffered skin-care compositions comprising nicotinamid and an absorbing agent |
| WO2011133692A1 (en) * | 2010-04-20 | 2011-10-27 | Cedars-Sinai Medical Center | Boosting immune defense by upregulating ccaat/enhancer binding protein epsilon |
| WO2012049677A2 (en) * | 2010-10-10 | 2012-04-19 | Dermipsor Ltd. | Compositions for treating psoriasis of the scalp |
| WO2012137169A1 (en) * | 2011-04-05 | 2012-10-11 | L'oreal | Bacterial lysate for preventing or treating scalp dandruff |
| DE102012002592A1 (en) * | 2012-02-13 | 2013-08-14 | Dr. Kurt Wolff Gmbh & Co. Kg | Use of an agent for stimulating the gene expression of antimicrobial peptides (AMP) |
| EP2742942A1 (en) * | 2012-12-14 | 2014-06-18 | Unilever N.V. | Niacinamide for inducing generation of antimicrobial peptides |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PIERRE KYME, NILS H. THOENNISSEN, CHING WEN TSENG, GABRIELA B. THOENNISSEN, ANDREA J. WOLF, KENICHI SHIMADA, UTZ O. KRUG, KUNIK LE: "C/EBPε mediates nicotinamide-enhanced clearance of Staphylococcus aureus in mice", JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, vol. 122, no. 9, 4 September 2012 (2012-09-04), pages 3316 - 3329, XP055128464, ISSN: 00219738, DOI: 10.1172/JCI62070 * |
| TATSUO HASHIMOTO, THOMAS PERLOT, ATEEQUR REHMAN, JEAN TRICHEREAU, HIROAKI ISHIGURO, MAGDALENA PAOLINO, VERENA SIGL, TOSHIKATSU HAN: "ACE2 links amino acid malnutrition to microbial ecology and intestinal inflammation", NATURE, �MACMILLAN JOURNALS LTD., ETC.|, vol. 487, no. 7408, 1 January 2012 (2012-01-01), pages 477 - 481, XP055059617, ISSN: 00280836, DOI: 10.1038/nature11228 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA201607105B (en) | 2018-05-30 |
| CN113908074A (en) | 2022-01-11 |
| MX2016014760A (en) | 2017-03-06 |
| PH12016502047A1 (en) | 2017-01-09 |
| EA201692284A1 (en) | 2017-03-31 |
| CN106413680A (en) | 2017-02-15 |
| JP6446065B2 (en) | 2018-12-26 |
| WO2015172801A1 (en) | 2015-11-19 |
| BR112016024400A2 (en) | 2017-08-15 |
| JP2017515829A (en) | 2017-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA031758B1 (en) | Niacinamide for inducing generation of antimicrobial peptides | |
| EP2742942B1 (en) | Niacinamide for inducing generation of antimicrobial peptides | |
| KR20110137236A (en) | Antibacterial or anti-inflammatory peptides and pharmaceutical composition containing thereof | |
| KR101669359B1 (en) | composition for promoting melanin synthesis | |
| JP6023756B2 (en) | Composition for skin care, fungus body, dried fungus body and collection tool | |
| KR102173646B1 (en) | Streptococcus salivarius sbk4 strain isolated from skin and functional cosmetic composition comprising Streptococcus salivarius sbk4 strain | |
| WO2019086327A1 (en) | Use of niacinamide for microbiome balancing | |
| EP3362038A1 (en) | Cosmetic composition having probiotic bacteria | |
| KR101634668B1 (en) | Cosmetic composition comprising fermented extract of mistletoe for anti-oxidation or whitening | |
| KR101842700B1 (en) | A cosmetic composition comprising leontopodium alpinum cell culture extract and natural complex extract | |
| BR112018010456B1 (en) | Antimicrobial composition, method for cleaning or disinfecting a surface, and uses of a composition | |
| KR101433823B1 (en) | External Composition for Skin Using an Extract or a Fraction of Padina arborescens | |
| JPWO2020090321A1 (en) | Methods for producing heat shock protein gene expression regulators, pharmaceuticals, cosmetics, and heat shock protein gene expression regulators | |
| KR20210029359A (en) | Cosmetic composition for improving acne | |
| KR20190111840A (en) | Skin derived novel lactic acid bacteria and cosmetic composition comprising thereof | |
| KR102200874B1 (en) | Composition for improving skin condition comprising chitosan as a effective ingredient and method for preparing the same | |
| KR102139000B1 (en) | Antioxidant, anti-wrinkle, whitening and antibiotic cosmetic composition comprising fermented Methyl Sulfonyl methane extract and the preparation method of the same | |
| KR20220153866A (en) | External Composition Comprising Plant Extracellular vesicle of Rose for Improving Skin | |
| RU2729821C1 (en) | Antimicrobial mixture containing 4-(3-ethoxy-4-hydroxyphenyl)butan-2-one and chlorphenezin, and a cosmetic composition containing it | |
| CN105310917A (en) | Sunscreen anti-allergic aqueous agent | |
| AU2021105081A4 (en) | Design and analysis of various formulations of selected herbo cosmeceuticals | |
| KR102337935B1 (en) | Cosmetic composition for improving of skin barrier and moisturizing comprising lacritin | |
| KR20230087208A (en) | Korean medicinal green tea callus ferment filtrate for improving atopic dermatitis and cosmetic composition containing the same | |
| JP2021525253A (en) | Compounds for preventing and treating morbidity of skin or mucous membranes with inflammatory components | |
| KR20130102215A (en) | Composition containing tranexamic acid for treating atopic dermatitis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |
|
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment |