EA027511B1 - Способ отделения популяции парвовирусных вирионов от популяции бакуловирусных вирионов - Google Patents

Способ отделения популяции парвовирусных вирионов от популяции бакуловирусных вирионов Download PDF

Info

Publication number
EA027511B1
EA027511B1 EA201490583A EA201490583A EA027511B1 EA 027511 B1 EA027511 B1 EA 027511B1 EA 201490583 A EA201490583 A EA 201490583A EA 201490583 A EA201490583 A EA 201490583A EA 027511 B1 EA027511 B1 EA 027511B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
filter
virions
sample
baculovirus
virus
Prior art date
Application number
EA201490583A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201490583A1 (ru
Inventor
Вильхельмус Теодорус Йоханнес Мария Кристиан Херменс
Джеймс Патрик Смит
Original Assignee
ЮНИКЬЮРЕ АйПи Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47832422&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA027511(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ЮНИКЬЮРЕ АйПи Б.В. filed Critical ЮНИКЬЮРЕ АйПи Б.В.
Publication of EA201490583A1 publication Critical patent/EA201490583A1/ru
Publication of EA027511B1 publication Critical patent/EA027511B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B01D61/145—Ultrafiltration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B01D61/16—Feed pretreatment
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
    • B01D71/08—Polysaccharides
    • B01D71/10—Cellulose; Modified cellulose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/04—Specific process operations in the feed stream; Feed pretreatment
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/26—Further operations combined with membrane separation processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/26—Further operations combined with membrane separation processes
    • B01D2311/2623—Ion-Exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/26—Further operations combined with membrane separation processes
    • B01D2311/2649—Filtration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14351—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу отделения популяции парвовирусных вирионов от популяции бакуловирусных вирионов, включающему стадию фильтрации образца, содержащего парвовирусные и бакуловирусные вирионы, через фильтр с размером пор 30-40 нм.

Description

Изобретение относится к областям вирусологии и генной терапии. В частности, изобретение относится к способу удаления примесных вирусов палочковидной формы, таких как, например, бакуловирус, из препаратов вируса практически шаровидной формы, таких как, например, аденоассоциированные вирусные векторы для генной терапии.
Уровень техники
В производстве вирусных векторов для применения в генной терапии в целях безопасности используют дефектные по репликации вирусы. Дефектные по репликации вирусы способны инфицировать человеческую клетку ίη νίνο и переносить трансген в клетку, но сами неспособны реплицироваться в клетке. Как правило, это достигается путем удаления вирусных генов, которые важны для репликации вируса, таких как, например, гены гер и сар. Это также позволяет вводить интересующий генный продукт(ы) вместо этих вирусных генов. Для образования вирусных частиц в клетке-хозяине вирусные гены, которые были удалены из дефектного по репликации вируса, должны быть предоставлены отдельно, например, за счет вирусов-помощников.
Аденоассоциированный вирус (ААВ) (ААУ) представляет собой неавтономно реплицирующийся вирус, принадлежащий к семейству Рагуоутбае и состоящий из одноцепочечной молекулы ДНК с внешней икосаэдрической оболочкой из структурного белка, имеющий диаметр примерно от 18 до 26 нм. Вирусы ААВ дикого типа способны либо интегрироваться в геном клетки-хозяина, либо реплицироваться в клетках-хозяевах в присутствии вируса-помощника. Аденовирусы были первыми вирусами, идентифицированными как возможные вирусы-помощники. Однако для этого подходят и другие имеющие практически шаровидную форму вирусы-помощники млекопитающих, такие как вирусы герпеса, являющиеся патогенными для людей и животных. В последние годы получение аденоассоциированного вирусного (ААВ) вектора с помощью экспрессионных систем на основе бакуловируса в клетках насекомых (ИгаЬе е1 а1. [2002] Нит Оепе Тйег. 13(16): 1935-43) становится все более популярным, так как эту систему можно легко масштабировать для промышленных применений генной терапии. В данной системе производства, как правило, используют три рекомбинантных бакуловируса, кодирующие гены гер ААВ, гены сар ААВ и интересующий генный продукт (трансгенная ДНК), фланкированный инвертированными концевыми повторами (ИКП) (ΙΤΚδ) ААВ.
Существенным недостатком, связанным с получением вирусных векторов при помощи вирусовпомощников или экспрессионных систем на основе вирусов, является образование смешанной популяции частиц вируса-продукта и вирусов-помощников, которую следует подвергать дальнейшей очистке. Примесные вирусы, такие как, например, аденовирус или бакуловирус, должны отсутствовать или присутствовать в минимальном количестве в случае использования вирусных векторов в генной терапии изза потенциальной патогенности и/или иммуногенности примесного вируса.
В настоящее время в данной области известно несколько способов удаления вирусов-помощников, однако все они имеют свои недостатки. Примерами таких способов являются центрифугирование в градиенте плотности или тепловая инактивация, либо их сочетание. Однако центрифугирование в градиенте плотности экономически оправдано только для относительно небольших объемов и, таким образом, данный способ неприменим в промышленных масштабах. Тепловая инактивация основана на различной термоустойчивости ААВ и вирусов-помощников. Например, нагревание смешанной популяции аденовируса и ААВ до 56-65°С приводит к более или менее избирательной тепловой инактивации вирусапомощника всего лишь с небольшой потерей активности ААВ. К сожалению, денатурированные белки вируса-помощника, все еще присутствующие в образце, в случае применения для генной терапии могут вызывать клеточный иммунный ответ у пациента (8тИй С.А. е1 а1. (1996) 1. νίτοί., 70, 6733-6740).
Кроме того, для очистки ААВ векторов были разработаны методы колоночной хроматографии, включая ионообменную (основанную на обмене анионов и/или катионов) и аффинную хроматографию. Такие методы позволяют получать высокообогащенные препараты ААВ вектора, однако они не могут быть валидированы сами по себе для подтверждения существенной очистки от вирусов-помощников, чтобы соответствовать нормативным требованиям, предъявляемым к выпускаемым на рынок фармацевтическим препаратам.
Наконец, в патенте США 6479273 раскрыто, что разделение рекомбинантного ААВ и аденовируса, т.е. двух практически шаровидных вирусов с существенно различающимися диаметрами, достигается путем подвергания раствора, содержащего оба вируса, одной или более стадиям фильтрации через фильтрующую мембрану с размером пор примерно 50 нм или фильтрующую мембрану с размером пор примерно 35 нм. Описано, что рААВ имеет диаметр примерно 25 нм, а аденовирус, как считают, имеет диаметр примерно 65-90 нм, хотя в литературе описаны случаи более крупного диаметра, например около 100 нм [Кеппебу и Рагкх (2009) Мо1еси1аг Тйегару 17(10): 1664-1666; Вегко\\й/ (2003) \УСВР 71й аппиа1 теебпд 1апиагу 7-10 2003, 8ап Ргапс18со, СА]. Однако примесные вирусы, появляющиеся в результате производства ААВ вектора с использованием экспрессионных систем на основе бакуловируса в клетках насекомых, происходят из семейства Васи1о\апбае и, таким образом, являются палочковидными вирусами с длиной примерно 260 нм и диаметром примерно 20 нм. Поскольку (рекомбинантный) ААВ является практически шаровидным и имеет диаметр примерно от 18 до 26 нм, бакуловирус частично имеет (в двух
- 1 027511 измерениях) размер, близкий к размеру целевого вируса.
Нормативные требования, например оценка вирусной безопасности биотехнологических продуктов, полученных из линии клеток человеческого или животного происхождения (1СН Ц5Л (К.1)), Европейского агентства по лекарственным средствам (ЕМА) подразумевают, что способ очистки биологического фармацевтического продукта позволяет удалять любой не относящийся к продукту вирус. Удаление вирусных примесей проводят на стадиях вирусной очистки или удаления вируса процесса и, как правило, осуществляют методом хроматографии и/или фильтрации вируса. Кроме того, используют стадии вирусной инактивации процесса для ослабления потенциальных патогенных эффектов, вызванных не относящимися к продукту вирусами. Это, как правило, происходит при экстремальных физических условиях (например, рН, температура) и/или химических условиях (например, детергенты, растворители). Фармацевтические продукты, как правило, представляют собой белки с размером менее чем примерно 200 кДа, и способы удаления вируса хорошо известны. Однако существует относительно новый тип продуктов, относящихся к продуктам для генной терапии, которые содержат вирусы размером нескольких тысяч кДа, для которых способы удаления вируса не подтверждены документальными доказательствами. В частности, способ удаления вируса, в котором фармацевтический продукт представляет собой шаровидный вирус, а примесный вирус представляет собой палочковидный вирус, еще не описан.
Таким образом, в данной области существует потребность в дополнительных способах разделения/очистки, которые с технической и экономической точек зрения целесообразно применять в промышленном масштабе и которые позволяют частично или полностью удалять не относящийся к продукту вирус в экспрессионной системе на основе вирусов, из образца, содержащего ААВ, предпочтительно образца с рекомбинантным ААВ, полученного из экспрессионной системы на основе бакуловируса. Тем самым снижается потенциальная патогенность и/или иммуногенность не относящегося к продукту вируса. В частности, в данной области существует потребность в дополнительных способах разделения/очистки в случаях, когда не относящийся к продукту вирус имеет палочковидную форму с длиной, в несколько раз превышающей диаметр ААВ, но с диаметром, аналогичным диаметру ААВ.
Описание изобретения Краткое описание изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу отделения популяции парвовирусных вирионов от популяции бакуловирусных вирионов, включающему стадию фильтрации образца, содержащего популяции парвовирусных и бакуловирусных вирионов, через фильтр, сквозь который могут проходить только парвовирусные вирионы. Предпочтительно, если фильтр имеет номинальный размер пор 30-40, более предпочтительно 32-38 нм и наиболее предпочтительно (примерно) 35 нм. В предпочтительном варианте осуществления парвовирус представляет собой аденоассоциированный вирус, более предпочтительно бакуловирус представляет собой мультикапсидный вирус ядерного полиэдроза ЛиЮдтарЬа саПГогшса (АспШРУ).
В предпочтительном варианте осуществления фильтр, используемый для фильтрования образца, представляет собой поверхностный и/или глубинный фильтр. Фильтр для применения в способе по изобретению предпочтительно содержит материал, выбранный из группы, состоящей из регенерированной из медноаммиачного раствора целлюлозы, поливинилиденфторида, полисульфона, такого как, например, полиэфирсульфон, например модифицированный или немодифицированный полиэфирсульфон, политетрафторэтилена, полипропилена, модифицированного или немодифицированного полиэфирсульфона, ацетата целлюлозы, нитрата целлюлозы, полиамида или регенерированной целлюлозы. В особенно предпочтительном варианте осуществления фильтр для применения в способе по изобретению содержит регенерированную из медноаммиачного раствора целлюлозу, предпочтительно половолоконную регенерированную из медноаммиачного раствора целлюлозу, более предпочтительно, если фильтр представляет собой мембрану Р1аиоуа™ 35 (АкаЫ КА8Е1; №№№.р1аиоуай11ет8.сот). В другом предпочтительном варианте осуществления фильтр для применения в способе по изобретению представляет собой фильтр для удаления вируса ИШрот™ ΥΡ Огабе Όν50 (Ра11 Согр.; №№№.ра11.сот).
В одном из вариантов осуществления способа по настоящему изобретению образец подвергают фильтрации с использованием двух или более фильтров.
В способе по изобретению образец до стадии фильтрации можно предварительно очищать при помощи метода, выбранного из группы, состоящей из центрифугирования в градиенте плотности, предварительной фильтрации, стадии хроматографии, предпочтительно аффинной хроматографии и/или ионообменной хроматографии, а также комбинации этих методов. Предварительную фильтрацию предпочтительно выполняют с использованием фильтра с размером пор 70-200 нм. Предпочтительно, рН образца, к которому применяют способ по изобретению, составляет от 6 до 10, предпочтительно от 7 до 9, более предпочтительно от 7,5 до 8,5, наиболее предпочтительно примерно 8. В одном из вариантов осуществления изобретения от 1 до 200 мл образца фильтруют на каждом 1 см2 поверхности вирусного фильтра, предпочтительно 80-120 мл на 1 см2.
Предпочтительно, способ по изобретению позволяет элюировать по меньшей мере 85% парвовируса и уменьшать количество бакуловируса на по меньшей мере 5 1о§5. т.е. 10-105.
- 2 027511
Определения
Используемый в настоящем описании термин вирус или вирусы охватывает не только природные вирусы или вирусы, которые были изменены путем генетической манипуляции, т.е. так называемые рекомбинантные вирусы, но также вирусные частицы, т.е. как инфекционные, так и неинфекционные вирусы, вирусоподобные частицы (ВПЧ) (УЬР), такие как папилломавирус-подобные частицы согласно \νϋ 96/11272, а также капсиды, которые содержат нуклеиновые кислоты, но могут быть и пустыми, и их части, в частности один или более, предпочтительно несколько субъединиц или капсомеров, особенно когда несколько капсомеров связаны или соединены таким образом, что они составляют по меньшей мере примерно 50%, предпочтительно по меньшей мере 80%, особенно предпочтительно примерно 90% капсида. Вирусы, которые удаляют из смеси, имеют, в частности, преимущественно не шаровидную палочковидную форму, тогда как вирусы, которые являются фармацевтическим продуктом, преимущественно имеют шаровидную, предпочтительно икосаэдрическую, форму. Кроме того, понятно, что термин вирус может относиться к популяции вирионов данного вируса, предпочтительно гомогенной популяции вируса. Таким образом, термин парвовирус может относиться к популяции парвовирусных вирионов, предпочтительно гомогенной популяции парвовирусных вирионов.
Вирусы семейства Ратуоушбае представляют собой небольшие ДНК-содержащие вирусы животных. Семейство Ратуоушбае можно разделить на два подсемейства: Ратуоутиае, которые инфицируют позвоночных, и Иеикоушиае, которые инфицируют насекомых. Члены подсемейства Ратуоушиае называются в настоящем описании парвовирусами и включают род Оерепбоззгик. Как можно заключить из названия, члены рода Оерепбоуиик уникальны тем, что, как правило, для их продуктивной инфекции в клеточной культуре необходима со-инфекция с вирусом-помощником, таким как аденовирус или вирус герпеса.
Род Оерепбоззгик включает аденоассоциированный вирус (ААВ), который обычно инфицирует людей (например, серотипы 1, 2, 3А, 3В, 4, 5 и 6) или приматов (например, серотипы 1 и 4), и родственные вирусы, которые инфицируют других теплокровных животных (например, аденоассоциированные вирусы крупного рогатого скота, собак, лошадей и овец). В настоящее время можно различать серологически отличающиеся типы, по меньшей мере, ААВ-1, ААВ-2, ААВ-3, ААВ-4, ААВ-5, ААВ-6, ААВ-7, ААВ-8 и ААВ-9. ААВ векторы представляют собой одноцепочечную молекулу ДНК с внешней икосаэдрической оболочкой из структурного белка, и имеют диаметр от 18 до 26 нм, как правило, примерно 25 нм. Дополнительная информация о парвовирусах и других членах семейства Ратуоушбае приведена в публикации Кенией! I. Вегпк, Ратуоушбае: ТЬе У1гикек аиб ТЬей Керйсайои, глава 69 в Ие1бк Уйо1оду (3е издание 1996). Для удобства, настоящее изобретение далее разъяснено на примерах и описано здесь применительно к ААВ. Однако понятно, что изобретение не ограничено ААВ, но в равной степени может быть применено и к другим парвовирусам. Также понятно, что изобретение распространяется и на химерные ААВ вирусы, содержащие химерные капсидные белки, и/или гибридные ААВ вирусы (или псевдотипированные вирусы), которые также имеют размер, похожий на тот, который наблюдается у парвовирусов дикого типа (диаметр 18-26 нм). Описание и некоторые примеры приведены в νθ 0028004. Примерами химерных и/или гибридных вирусов ААВ являются, например, ААВ2/1, ААВ2/3, ААВ2/4, ААВ2/5, ААВ2/5.2, ААВ2/6, ААВ2/7, ААВ2/8 и ААВ2/9.
Геном ААВ состоит из генов гер, кодирующих белки, необходимые для репликации вируса, и генов сар, кодирующих вирусные структурные белки. Один или более из генов гер, которые необходимы для репликации (например, гер 40, гер 52, гер 68 и/или гер 78) или генов сар, которые необходимы для структуры капсида (например, УР-1, УР-2 и/или УР-3), могут, например, быть заменены в вирусе на трансген при создании аденоассоциированных векторов. Области ИКП, которые все еще присутствуют на 5' и 3'концах, необходимы в качестве шк-активных элементов для упаковки трансгена в инфекционные рекомбинантные частицы ААВ и для репликации ДНК рекомбинантного генома ААВ (Койи К.М. (1994) Нит Оеие ТЬег. 5(7): 793-801). Используемый в настоящем описании термин рекомбинантный парвовирусный или ААВ вектор (или рААВ вектор) означает вектор, содержащий одну или более интересующих полинуклеотидных последовательностей, интересующие гены или трансгены, которые фланкированы последовательностями инвертированных концевых повторов (ИКП) парвовируса или ААВ. Такие рААВ векторы могут реплицироваться и упаковываться в инфекционные вирусные частицы, когда присутствуют в клетке-хозяине насекомого, экспрессирующей продукты генов гер и сар ААВ (т.е. белки Кер и Сар ААВ). Когда рААВ вектор встроен в более крупный конструкт нуклеиновой кислоты (например, в хромосому или в другой вектор, такой как плазмида или бакуловирус, используемый для клонирования или трансфекции), тогда рААВ вектор, как правило, называют про-вектор, который может быть освобожден путем репликации и инкапсидации при наличии упаковывающих функций ААВ и необходимых функций помощника.
Используемый в настоящем описании термин клетка насекомого означает клетку насекомого, которая допускает репликацию рекомбинантного парвовирусного (рААВ) вектора и которую можно поддерживать в культуре. Например, используемая линия клеток может быть линией клеток §робор!ета Ггидрегба, линиями клеток дрозофилы или линиями клеток комара, например линиями клеток, полученными из Аебек а1Ьор!с1ик. Предпочтительные клетки или линии клеток насекомых представляют собой
- 3 027511 клетки от видов насекомых, которые восприимчивы к бакуловирусной инфекции, включая, например, 8е301, 8еКП2109, 8еИСК1, 819, 81900+, 8121, ΒΤΙ-ΤΝ-5Β1-4, МО-1, Тп368, НгАш1, На2302, Ηζ2Ε5, I Ιϊμΐι Нус Дпукгодеи, СА, И8А) и ехргек8Р+® (И8 6103526; Рго1еш 8с1епсек Согр., СТ, И8А). Условия выращивания клеток насекомых в культуре и производство гетерологичных продуктов в культуре клеток насекомых хорошо известны в данной области и описаны, например, в следующих ссылках, относящихся к молекулярной инженерии клеток насекомых. Методология молекулярной инженерии и экспрессии полипептидов в клетках насекомых описана, например, в публикациях 8иттегк апб 8ткк. 1986. А Мапиа1 о1 Ме!кобк 1ог Васи1оу1ги8 Уес1огк апб 1пкес! СиКиге Ргосебигек, Техак АдгкиКига1 Ехрептеп1а1 81а1юп Ви11. Νο. 7555, Со11еде 81айоп, Тех.; Ьискоте, 1991. В Ргокор е! а1., С1отпд и Ехргеккюп о1 Не1его1одоик Оепек ш 1пкес! Се11к νίΐΗ Васи1оу1гик УесЮгк' КесотЫпап! ΩΝΛ Тескпо1оду апб Аррксакопк, 97-152; Кшд, Ь.А. апб КТО. Роккее, 1992, Тке Ьаси1оу1гик ехргеккюп кук!ет, Скартап апб На11, Ипкеб Кшдбот; О'КеШу, Ό.Κ., Ь.К. МШег, У.А. Ьискоте, 1992, Васи1оу1гик Ехргеккюп УесЮгк: А ЬаЬога1огу Мапиа1, №ν Уогк; \У.Н. Ргеетап апб Кюкагбкоп, СО., 1995, Васи1оу1гик Ехргеккюп Рго1осо1к, Мебюбк т Мо1еси1аг Вю1о§у, том 39; И8 4745051; И8 2003148506 и \\'О 03/074714.
Подробное описание изобретения
Рекомбинантный рААВ можно получать в клетках насекомых при помощи экспрессионной системы на основе бакуловируса, в которой клетка насекомого инфицируется тремя рекомбинантными бакуловирусами, заключающими в себе ААВ вектор и функции гер и сар. При культивировании инфицированных клеток насекомого гены неструктурных белков ААВ и гены структурных белков ААВ экспрессируются, трансгенная ДНК реплицируется и частицы рекомбинантного ААВ (частицы рААВ) упаковываются и собираются. Частицы рААВ содержат интересующий генный продукт(ы) (трансген(ы)), фланкированный^) на обоих концах областями ИКП, в форме одноцепочечной ДНК. В то же время рекомбинантный бакуловирус реплицируется в этих клетках, что, как правило, приводит к лизису и гибели инфицированных клеток через несколько дней. Полученные вирусы (бакуловирус и частицы рААВ) или частично высвобождаются в супернатант клеточной культуры, или продолжают оставаться в лизированных клетках. По этой причине клетки, как правило, разрушают с использованием методов разрушения клеток, известных специалистам в данной области, таких как поочередное замораживание и оттаивание, или при помощи ферментативного гидролиза, например трипсином, чтобы добиться практически полного высвобождения вирусов, или при помощи лизиса детергентом.
Существенным недостатком, связанным с получением вирусных векторов при помощи экспрессионных систем на основе вирусов, таких как экспрессионная система на основе бакуловируса, или при помощи системы с вирусом-помощником, является образование смешанной популяции частиц вирусапродукта и не относящихся к продукту вирусов, каковую популяцию следует подвергать дополнительной очистке. Для удобства слово вирус-помощник используют в настоящем описании для обозначения либо истинных вирусов-помощников, используемых в производстве ААВ, таких как, например, аденовирус или вирус герпеса, либо бакуловируса, хотя до сих пор не ясно, действительно ли бакуловирус обеспечивает функции помощника или просто доставляет гены ААВ в клетки насекомых. Примесей бакуловируса следует избегать, если использовать вирусные векторы в генной терапии, из-за потенциальной патогенности или иммуногенности бакуловируса.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу разделения/очистки, подходящему, например, для получения соответствующего нормативным требованиям парвовирусного продукта, который с технической и экономической точек зрения целесообразно применять в промышленном масштабе и который способен продемонстрировать уменьшение количества, предпочтительно элиминацию, палочковидного вируса в образце вируса, содержащем палочковидные вирусные частицы и практически шаровидные вирусные частицы, в частности, когда палочковидные вирусные частицы имеют диаметр, сходный с диаметром парвовирусных частиц (т.е. палочковидные вирусные частицы имеют сходство по двум измерениям, но не по третьему измерению, которое должно быть больше), так что снижается потенциальная патогенность и/или иммуногенность вируса-помощника. Специалисты в данной области понимают, что это является сложной задачей и не похоже, что смесь не относящегося к продукту вируса и вируса-продукта, оба из которых имеют сходный размер в двух измерениях, можно разделять методом фильтрации, предпочтительно на высоком уровне.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу разделения двух популяций вирионов в образце, предпочтительно, когда одна популяция вирионов содержит вирионы, которые имеют практически шаровидную форму, а другая популяция вирионов содержит вирионы, которые имеют палочковидную форму, включающему стадию фильтрации образца, содержащего обе популяции вирионов, через фильтр, сквозь который могут проходить только вирионы практически шаровидной формы. Предпочтительно, вирус палочковидной формы имеет аспектное отношение по меньшей мере 4:1. Также предпочтительно, если диаметр палочковидного вируса и диаметр практически шаровидного вируса не отличаются более чем на 12 нм. Предпочтительно, если практически шаровидный вирус представляет собой парвовирус и если вирус палочковидной формы представляет собой бакуловирус. В частности, изобретение относится к способу отделения популяции парвовирусных вирионов от популяции бакуловирусных вирионов, включающему стадию фильтрации образца, содержащего популя- 4 027511 ции парвовирусных и бакуловирусных вирионов, через фильтр, сквозь который могут проходить только парвовирусные вирионы.
Используемый в настоящем описании термин разделение не подразумевает, что оба вида частиц будут разделены и извлечены из образца. Используемый в настоящем описании термин разделение указывает на частичное или полное удаление палочковидных вирусных частиц из образца и, таким образом, уменьшение примеси палочковидного вируса в образце практически шаровидных вирусных частиц. Таким образом, разделение может означать очистку практически шаровидных вирусных частиц в образце. В случае бакуловируса и парвовируса можно сказать, что используемый в настоящем описании термин разделение указывает на частичное или полное удаление бакуловируса и, таким образом, уменьшение примеси бакуловируса в образце, содержащем парвовирус. В этом случае разделение означает очистку парвовируса в образце.
Фильтрация представляет собой физическую операцию, которую используют для отделения, например, твердых частиц от твердых частиц другого размера или от жидкостей, путем применения среды, сквозь которую могут проходить только твердые частицы, имеющие размер ниже заданного предела размера, или только жидкости. Твердые частицы большего размера из образца остаются в исходном материале. Жидкость, а также твердые частицы, которые прошли через фильтр, можно назвать фильтратом или пермеатом.
Способ удаления вируса, применяемый по настоящему изобретению, осуществляют путем фильтрации, также известной как вирусная фильтрация. Под вирусной фильтрацией понимают отделение фармацевтического продукта от вирусной примеси при помощи фильтра, такого как вирусный фильтр или ультрафильтр. Понятно, что сам фармацевтический продукт может тоже представлять собой вирус, такой как вирусный (генно-терапевтический) вектор.
Вирусная фильтрация представляет собой технологию фильтрации, в которой используют мембрану с номинальным размером пор в нанометровом диапазоне. Вирусные фильтры и ультрафильтры, как правило, включают мембраны с номинальным размером пор в диапазоне 30 нм-1 мкм или с порогом отсечения по молекулярной массе (М\УСО) в диапазоне 10000-750000 Да, предпочтительно в диапазоне 10000-500000 Да, более предпочтительно в диапазоне 10000-100000 Да. Классификация типа фильтра зависит от структуры мембраны, от материала и от поставщика. Классификация также может зависеть от характера использования. Можно использовать ультрафильтры в методе проточной фильтрации вдоль потока (ТРР) (также известной как фильтрация в тангенциальном потоке; во время рециркуляции исходная жидкость, содержащая образец, находится параллельно фильтру, и только часть исходной жидкости, содержащей образец, используется для производства пермеата, большая часть исходной жидкости покинет модуль, не проходя через фильтр) или использовать их в качестве тупикового фильтра (весь образец проходит через фильтр). Терминология очень хорошо понятна специалистам в данной области.
При вирусной фильтрации, как правило, используют перепад давления по обе стороны мембраны: трансмембранное давление (перепад давления между двумя сторонами мембраны) составляет от 0,02 до 0,8 МПа, предпочтительно от 0,02 до 0,1 МПа. На разницу в давлении может влиять заданная скорость потока образца (т.е. с помощью насоса). Когда фильтр применяют в методе ТРР, трансмембранное давление также можно модулировать, подвергая образец давлению до прохождения через мембрану путем сужения линии ретентанта или после прохождения через мембрану (т.е. в пермеате) при помощи насоса. Эти операции могут быть легко определены специалистом в данной области.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения популяция вирионов, которые имеют практически шаровидную форму, представляет собой вирионы, которые имеют икосаэдрическую симметрию и диаметр примерно 18-25 нм. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения популяция вирионов, которые имеют практически шаровидную форму, представляет собой популяцию парвовирусных вирионов, предпочтительно аденоассоциированного вируса.
Аспектное отношение какой-либо формы представляет собой отношение ее более длинного измерения к ее более короткому измерению. Таким образом, для симметричных объектов, которые описываются всего лишь 2 измерениями, ими являются длина и диаметр стержня. Альтернативно или в сочетании с любым из других вариантов осуществления настоящего изобретения в предпочтительном варианте осуществления изобретения аспектное отношение вируса палочковидной формы составляет по меньшей мере 4:1, предпочтительно по меньшей мере 5:1, более предпочтительно по меньшей мере 6:1, по меньшей мере 7:1, по меньшей мере 8:1, по меньшей мере 9:1, по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 11:1 по меньшей мере 12:1 или примерно 13:1. В популяции палочковидных вирионов, таких как бакуловирус, которые отделяют с использованием способа по изобретению, вирионы предпочтительно имеют диаметр 18-30 нм, более предпочтительно 20-27 нм, более предпочтительно 20-25 нм, более предпочтительно 20-23 и длину 70-300 нм, предпочтительно 80-280, 90-260, 100-260, 120-260, 140-260, 160-260, 180-260, 200-260, 220-260, 240-260 нм. Более предпочтительно, если вирионы имеют диаметр 20-23 и длину 180-280 нм, в частности диаметр примерно 20 и длину примерно 120-260 нм.
Популяция палочковидных вирионов по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой популяцию вирионов, которые принадлежат к семейству Васи1оутбае. Название Васи1оутбае было предложено из-за палочковидной формы их вирионов, оно происходит от латинского Ьаси1иш - палка,
- 5 027511 трость, посох. Наиболее изученным бакуловирусом является вирус ядерного полиэдроза Аи!о§гарйа сайГогшса (АстЫРУ), который имеет асимметричную форму с размерами примерно 20 - 120-260 нм (т.е. примерно 20 нм в двух измерениях и примерно 120-260 нм в третьем измерении, или в альтернативной и более предпочтительной формулировке: имеет диаметр примерно 20 нм и длину примерно 120-260 нм). Вирусами, которые по классификации относят к роду Васи1оу1пбае, являются А1рйаЬаси1оу1гизе8, Ве!аЬаси1оу1ги8е8, ПеЙаЬасШоуйизез и ОаттаЬасШоуйизез, и их соответствующими представителями являются ЫРУз чешуекрылых, ОУз бабочек, ЫРУз перепончатокрылых и ЫРУз двукрылых. Поскольку установлено, что некоторые бакуловирусы имеют разную длину генома, предполагается, что длина капсида может меняться в зависимости от длины генома, которая варьируется от 80 до 160 т.н. Примеры бакуловирусов, которые можно отделять от популяции парвовирусных вирионов, как определено в другой части данного документа, с использованием способа по настоящему изобретению, приведены в табл. 1 (на основании книги Васи1оу1ги8 Мо1еси1аг Вю1о§у автора Θ.Ρ. Койгтапп; второе издание; 26 января 2011 г.; глава 1: 1п!гобисйоп 1о !йе ЬасШоуйизез апб !йе1г !ахопоту).
Таблица 1. Размер генома и предсказанное содержание ОРС (ОКБ)* избранных бакуловирусов
Тип вируса Название вируса Ссылка Размер (т.н.) ОРС (>50 ак)
Группа I (12 членов)** ЕрроМИРУ Нуьпк 0. е£ <3_Ζ. / Ц беп νίτοί. 2002; 83(Рк 4) : 957-71 . [РиЬМеЦ] 119 136
АпреИРУ Гап 0. е£ а1. ; У1го1оду. 2007; Збб (2) : 304-15. [РиЬМеЦ] 126 145
АсМИРУ Аугез Μ.ϋ. е£ а1. ; Уьго1оду. 1994; 202: 586-605. [РиЬМеЦ] 134 -150
- 6 027511
Группа II (16 членов) ΑάΗοΝΡν Ыака1 М. еС а1. ; У1го1оду. 2003; 316(1) : 171-83. [РиЪМесЦ 113 125
ΞθΜΝΡν 1^ке1 И. Г. ОТ. ек а1.; δ. Сеп. νίτοί. 1999; 80: 3289-3304. [РиЪМесЦ 136 139
АдзеЫРУ ЭакиЬомзка А.К. ек а!.; Л Сеп νίτοί. 2006; 87 (РЕ 3) : 537-51. [РиЪМесЦ 148 153
ЬсМЯРУ Κτιζίο Л. е£ а1. ; У1го1оду. 1999; 253: 17-34 . [РиЪМесЦ 161 163
ЬезеЫРУ Х1ао Η. , Οί Υ. ; Шгиз бепез. 2007; 35(3) : 845- 56. [РиЬМеЦ] 168 169
- 7 027511
СУ (10 членов) АДогбУ Иогт1еа£оп 3., Κτιζίο Л., К1пз£ап1еу Ό. ; У1го1оду. 2003; 311 (2) : 350-65. [РиЬМеД] 100 119
Сг1ебУ Ъапде М., 1еЬ1е Л.А.; У1го1оду. 2003; 317(2): 220-36. [РиЬМеД] 111 124
СрбУ Ъидие Τ. е£ а!. ; Л беп νίτοί. 2001; 82(РЕ 10): 2531-47. [РиЬМеД] 124 143
ХеспбУ Науакама Т. е£ а1. ; У1го1оду. 1999; 262: 277-297. [РиЬМеД] 179 181
ΝΡν перепончатокрылых (3 члена) Ые1еЫРУ Ъаигоп Н.А. е£ а!. ; Л беп У1го1. 2005; 86: 945-61. [РиЬМеД] 82 89
ЫеаЬЫРУ Ъи££у З.Р. е£ а1. ; Л νίτοί. 2006; 80(14) : 6952-63. [РиЬМеД] 84 93
ЫезеЫРУ багета- 86 90
МагипЪак е£ а1. νίτοί. 78 (13) : 51. [РиЫ А. ; л 2004; 7036- ЧеД]
ΝΡν двукрылых (1 член) СиптЫРУ А£опзо С.Ъ. е£ а!.; Л νίτοί. 2001; 75: 11157-65. [РиЬМеД] 108 109
*Выбраны из более чем 40 геномных последовательностей (2008); * **Цифры в скобках указывают общее количество геномов в данной категории; группа 1: одна из двух основных линий ΝΡν§ чешуекрылых; она отличается от других бакуловирусов за счет использования другого слитого белка оболочки, др64. Несколько других генов также уникальны для этой линии; группа 2: одна из двух основных линий ΝΡν§ чешуекрылых; считается, что ее представители используют слитый белок (Р) для инициирования инфекции; Ον: вирусы гранулеза: линия бакуловирусов, патогенных для чешуекрылых, которые, как правило, имеют один вирион на яйцевидное тельце включения; ΝΡν: вирус ядерного полиэдроза: наибо- 8 027511 лее широко распространенный тип бакуловируса. ΝΡΥ5 реплицируются в ядре и обычно образуют тельца включения в форме полиэдра, содержащие более одного вириона.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения популяция бакуловирусных вирионов представляет собой популяцию мультикапсидного вируса ядерного полиэдроза Аи1одтарйа сайГотшса (Аст№У). В системах производства ААВ мультикапсидный вирус ядерного полиэдроза Аи1одтарйа сайГотшса (АстNΡV) является наиболее часто используемым типом бакуловируса. АстNΡV является наиболее изученным бакуловирусом. Вирус впервые был выделен из пяденицы калифорнийской люцерновой (чешуекрылое) и содержит геном из 134 т.п.н. с 154 открытыми рамками считывания. Основной капсидный белок УР39 вместе с некоторыми второстепенными белками образует палочковидный нуклеокапсид (21 х 260 нм), внутри которого находится ДНК с белком р6.9. В опосредованном бакуловирусом процессе производства ААВ, семь генов, в настоящее время проверенных на репликацию ААВ, похоже, связаны с репликацией бакуловируса (1еГ-1, 1еГ-2, 1еГ-11, йпа-ро1, 1еГ-3, 1еГ-7 и йЬр), и три гена описаны как кодирующие факторы транс-активации (р35, 1е-1, 1е-2).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения диаметр палочковидного вириона и диаметр практически шаровидного вириона различаются по размеру менее чем на 12 нм, предпочтительно менее чем на 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 нм, причем вирион шаровидной формы предпочтительно имеет больший диаметр из двух. Таким образом, например, в предпочтительном варианте осуществления изобретения, в котором популяцию парвовирусных вирионов, предпочтительно аденоассоциированного вируса, отделяют от популяции бакуловирусных вирионов, два типа вирионов имеют до некоторой степени аналогичный размер, поскольку диаметр парвовируса (например, ААВ) и бакуловируса (в двух измерениях) отличаются менее чем на 5 нм.
Фильтр для использования по настоящему изобретению представляет собой мембрану с номинальным размером пор предпочтительно в 1,2-3,3 раза больше диаметра вируса палочковидной формы (т.е. диаметра в более коротком измерении, а не длины палочковидного вируса). Термины размер пор, степень удаления, эффективный размер, номинальный размер пор или размер пор, который позволяет удалять частицы, имеющие определенный минимальный размер, используемые различными производителями фильтров, являются эквивалентными терминами для целей настоящего изобретения и могут быть использованы взаимозаменяемо в настоящем описании.
Предпочтительно, мембрана имеет размер пор, по меньшей мере в 1,3; 1,4; 1,5 раза превышающий диаметр вируса палочковидной формы, но менее чем в 3,2; 3,1; 3,0; 2,9; 2,7; 2,5; 2,3; 2,1; 1,9; 1,8 раз превышающий диаметр вируса палочковидной формы. Более предпочтительно, мембрана имеет размер пор, в 1,6-1,7 раза превышающий диаметр вируса палочковидной формы. В предпочтительном варианте осуществления фильтр для использования в способе по настоящему изобретению имеет размер пор 30-70 нм, более предпочтительно 30-60 нм, более предпочтительно 30-50 нм, более предпочтительно 30-40 нм, более предпочтительно 32-38 нм, более предпочтительно 34-36 нм, наиболее предпочтительно 35 нм. Примером вирусного фильтра, имеющего размер пор 35 нм, например, является мембрана А5аЙ1-Ка5а1 Р1аиоуа 35Ν (\у\у\у.р1апоуаПЙег5.сот). В другом предпочтительном варианте осуществления фильтр для использования в способе по настоящему изобретению представляет собой фильтр для удаления вирусов ИШротТМ УР Огайе ЭУ50 (Ра11 Согр.; \\уу\у.ра11.сот).
В предпочтительном варианте осуществления фильтр для использования по настоящему изобретению представляет собой вирусный фильтр или ультрафильтр. Вирусный фильтр, как правило, представляет собой фильтр, в котором поры имеют размер в нанометровом диапазоне. Предпочтительно, вирусный фильтр является фильтром, в котором поры имеют размер в нанометровом диапазоне и в котором волокна имеют асимметрические поры в них, захватывающие частицы определенных размеров и пропускающие частицы меньшего размера. Примером вирусных фильтров, которые можно использовать в настоящем изобретении, является мембрана 35Ν Р1апоуа. Примерами ультрафильтров являются РеШсоп 2 или РеШсоп 3 (Мййроте), БатЮсоп (§апотш5) и СеШгасеИе (Ра11).
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в фильтре, например фильтре 35Ν Р1апоуа, используется поверхностный или глубинный механизм, или сочетание обоих, для различения вирусов различной морфологии. Поверхностная фильтрация основана на размерах пор и заключается в том, что в процессе фильтрации частицы с большим диаметром, чем диаметр пор, будут оставаться на поверхности с приточной стороны фильтра, и образуется фильтрационный осадок. Напротив, при глубинной фильтрации частицы удерживаются внутри фильтровальной среды из-за состава отдельных слоев волокон: как правило, с приточной стороны слой состоит из грубых волокон, а со стороны оттока слой состоит из тонких волокон. Глубинные фильтры являются разновидностью фильтров, в которых используется пористая фильтрующая среда для удержания частиц во всем объеме среды, а не только на поверхности среды. Эти фильтры обычно используют, когда жидкость для фильтрации содержит большое количество частиц, поскольку по сравнению с другими типами фильтров они способны удерживать большую массу частиц до своего засорения.
Следует отметить, что фильтрующая мембрана означает фактический фильтрующий материал, который обеспечивает просеивание, во всех фильтрах. Используемые фильтрующие мембраны преимущественно состоят из, предпочтительно, регенерированной целлюлозы, например регенерированной из
- 9 027511 медноаммиачного раствора целлюлозы, такой как, предпочтительно, половолоконная регенерированная из медноаммиачного раствора целлюлоза, однако другими подходящими материалами также являются поливинилиденфторид, политетрафторэтилен, полипропилен, модифицированный или немодифицированный полиэфирсульфон, ацетат целлюлозы, нитрат целлюлозы или полиамид. Примерами таких мембран, имеющих размер пор, позволяющий удалять частицы с размером примерно 40-400 нм, являются мембраны ИШрог УР от компании Ра11 СтЬН, 63303 Иге1е1сЬ, которые имеют номинальные размеры пор примерно 50 или 20 нм, микропористые мембраны АкаШ СНетюаГк ВетЬегд от компании АкаШ СНет1са1 ШДийгу ЫД., Токио, Япония, которые имеют номинальные размеры пор примерно 15, 19, 3 5 или 72 нм, или соответствующие мембраны от других производителей, т.е. Байопик АС, 37075 СоШпдеп, или БсЫеюНег и БсНие11 СтЬН, 37582 Иаккек В предпочтительном варианте осуществления изобретения фильтр содержит регенерированную из медноаммиачного раствора целлюлозу, поливинилиденфторид, полисульфон, политетрафторэтилен, полипропилен, модифицированный или немодифицированный полиэфирсульфон, ацетат целлюлозы, нитрат целлюлозы, полиамид или регенерированную целлюлозу; предпочтительно, если фильтр содержит половолоконную регенерированную из медноаммиачного раствора целлюлозу или поливинилиденфторид.
Способ по изобретению, в частности, подходит для очистки популяции парвовирусных вирионов от популяции бакуловирусных вирионов. Действительно, вирусный фильтр с размером пор 35 нм, например мембрана АкаС-Какгн Р1апоуа 35Ν, является особенно предпочтительным в способе по изобретению для разделения частиц рААВ и бакуловируса. Эти фильтры, в частности, позволяют не только добиться практически количественного удаления инфекционных бакуловирусов по меньшей мере на 5 1од 10 из смешанной популяции, но также и достичь высокого выхода, примерно >90%, частиц рААВ.
Снижение титра палочковидного вируса, т.е. коэффициент снижения титра удаляемого вируса, предпочтительно составляет по меньшей мере 5 1одк, например, после того как смешанную популяцию вирионов рААВ и 10х105 бакуловирусных вирионов разделяли способом по изобретению, бакуловирусные вирионы в фильтрате не поддавались определению. Предпочтительно, снижение титра палочковидного вируса, которое достигается при помощи способа по изобретению, составляет по меньшей мере 5,5 1одк, по меньшей мере 6 1одк, по меньшей мере 6,5 1одк, по меньшей мере 7 1одк, по меньшей мере 8 1одк, по меньшей мере 9 1одк, наиболее предпочтительно по меньшей мере 10 1одк. Титр можно определять обычными методами, известными в данной области, такими как, например, анализ на определение 50% инфекционной дозы для тканевых культур (ТСГО50). Например, инфекционный титр для бакуловируса в образце бакуловирусных вирионов можно определять с использованием анализа ТСГО50. Данный метод основан на инфицировании монослоев клеток БГ9 насекомых инфекционным бакуловирусом в образце положительного контроля. Культуральную среду в серийных разведениях от образца положительного контроля используют для инфицирования клеток. Клетки инкубируют при 28°С в течение 7 дней. Затем супернатанты переносят в новые подготовленные планшеты с монослоями клеток БГ9 насекомых и инкубируют при 28°С в течение 7 дней. По мере прогрессирования инфекции инфицированные клетки теряют способность оставаться прикрепленными друг к другу и к поверхности планшета и становятся несвязанными клетками, т.е. проявляется цитопатогенный эффект (ЦПЭ) (СРЕ), который можно наблюдать под микроскопом. Титр в 1од10 ТСГО50/мл рассчитывают при помощи метода Бреагтап-КагЬег.
Предпочтительно, по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 99% популяции вирионов практически шаровидной формы извлекают при помощи способа по изобретению. Таким образом, предпочтительно по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 99% популяции вирионов практически шаровидной формы извлекают в элюате (или пермеате).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения образец фильтруют через два или более фильтров.
Образец, содержащий популяции вирионов, которые нужно разделять, как правило, представляет собой культуральный супернатант (например, культуральную среду) от экспрессионной системы на основе вирусов, например, от культуры клеток насекомых, продуцирующих вирионы ААВ, клетки насекомых из экспрессионной системы на основе вирусов для производства вирионов ААВ, или сочетание культурального супернатанта и клеток насекомых. Предпочтительно, образец подвергают циклам замораживания-оттаивания до того, как использовать в способе по настоящему изобретению. Более предпочтительно, образец подвергают предварительной очистке перед использованием в способе по настоящему изобретению. Это может увеличивать выход при фильтровании популяции вирионов практически шаровидный формы (например, вирионов парвовируса, предпочтительно ААВ) и, кроме того, это считается полезным для продления срока эксплуатации фильтра. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления образец не содержит клеточных примесей.
Итак, в предпочтительном варианте осуществления способ включает предварительную очистку образца, содержащего популяцию вирионов, например, при помощи центрифугирования с использованием одного или более градиентов плотности, предварительной фильтрации и/или хроматографии. Предпочтительно, образец предварительно очищают в случае, если образец представляет собой, например, супернатант культуры рААВ, например, с использованием предварительной фильтрации для удаления крупных частиц, и при этом бакуловирус и частицы рААВ остаются в фильтрате. Предпочтительно,
- 10 027511 предварительную фильтрацию, как описано более подробно ниже, проводят до фактического разделения популяций вирионов, как описано выше в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления образец предварительно очищают, используя метод, выбранный из группы, состоящей из центрифугирования в градиенте плотности, предварительной фильтрации, стадии хроматографии, предпочтительно аффинной хроматографии и/или ионообменной хроматографии, а также сочетания данных методов. Примеры таких методов очистки включают методы, описанные в статьях ВгитсШ с1. а1., 2002 Мо1еси1аг Тйетару, Ка1ибиу с1. а1., 2002 Нитап Оепе Тйетару, Ройет с1. а1., 2002 МеШобк ίη Εηζνιηοίοβν. и СессНип е1. а1., 2010 Нитап депе Легару. Предпочтительно, предварительная очистка включает центрифугирование в градиенте плотности и одну или более стадий предварительной фильтрации и/или центрифугирования. Предпочтительно, предварительная очистка включает одну или более стадий предварительной фильтрации в сочетании с одной или несколькими стадиями хроматографии.
Особое предпочтение отдается предварительной очистке образца с использованием одного или более мембранных фильтров, которые позволяют популяциям вирионов, которые предстоит разделять, проходить насквозь, но которые при этом задерживают крупные примеси. Как правило, предварительная очистка предотвращает или затрудняет засорение фильтра, который используют в способе по изобретению, обеспечивающем последующее разделение популяций палочковидных и практически шаровидных вирионов. Засорение фильтра в процессе разделения популяций вирионов может происходить за счет компонентов культуры вируса в образце, которые не были удалены, или не были должным образом удалены, до применения к образцу способа по изобретению. Центрифугирование на низкой скорости может быть недостаточным для надлежащего удаления этих компонентов, вследствие этого, предпочтительно проводить дополнительную предварительную очистку образца для минимизации засорения фильтра.
Предпочтительно, предварительно очистку проводят путем предварительной фильтрации. Мембранный фильтр для предварительной очистки образца, который содержит ААВ и бакуловирус и к которому предстоит применять способ по изобретению, предпочтительно, имеет размер пор 70-200 нм, более предпочтительно 80-180, 90-150, 100-130 нм. Например, мембранный фильтр с размером пор примерно 100 нм, такой как фильтр ИМрот N66 (Ра11 ОтЬН, 63303 Пте1еюй), особенно хорошо подходит для предварительной очистки смешанной популяции частиц рААВ и бакуловирусов. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления предварительную фильтрацию проводят с помощью фильтра, имеющего размер пор 70-200 нм.
Подходящие методы и средства для предварительной очистки зависят от фильтра, который будет использован в способе по изобретению для разделения популяций парвовирусных и бакуловирусных вирионов, как описано выше в настоящем описании, и могут быть протестированы специалистом. Условия после предварительной очистки должны быть такими, чтобы 1) фильтр оставался целым, 2) парвовирус был стабильным, 3) концентрации соли были близки к физиологическим и 4) перепад давления в фильтре не был настолько большим, чтобы вызвать лизис парвовируса (например, ААВ) и, следовательно, потерю его функциональности.
В другом предпочтительном варианте осуществления значение рН образца составляет от 6 до 10, предпочтительно от 7 до 9, более предпочтительно от 7,5 до 8,5, в частности примерно 8,0. При необходимости рН образца доводят соответствующими буферами, например трис/НС1 буфером (трис(гидроксиметил)аминометан), до величины рН, указанной выше. Значение рН образца предпочтительно составляет примерно 8,0, так как способствует хорошему выходу ААВ после фильтрации.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения образец имеет рН 6-8,5 (практически физиологический) для гарантии стабильности ААВ. Буфер с рН в данном диапазоне предпочтительно должен также иметь проводимость, которая подходит для конкретного парвовируса. Как правило, необходимая проводимость зависит от серотипа ААВ и от трансгена. Специалист способен определять подходящий буфер в каждом отдельном случае. Как правило, фоновая проводимость должна быть сопоставимой с физиологической проводимостью, т.е. 137 мМ №С1. Примерами подходящих буферных растворов являются ΜΕδ, Τπζπκτ бис-трис, НЕРЕ8, РВ§ и бис-трис пропан.
В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 0,5 мл образца фильтруют на каждом 1 см2 поверхности фильтра, предпочтительно от 1 до 100 мл на 1 см2. Однако это в значительной степени зависит от чистоты и концентрации вирусов в образце, которые предстоит разделять, и в большинстве случаев, поскольку фильтрацию применяют в конце последовательного процесса, более 1 л можно фильтровать на 1 см2. Альтернативно или в сочетании с любыми другими предпочтительными вариантами осуществления, в предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере 1-10 мл, предпочтительно 1-5 мл, в частности примерно 1,5 мл образца фильтруют на 1 см2 поверхности фильтра. Как правило, этим достигается, например, высокий выход частиц рААВ и в тоже время достигается удаление бакуловирусов.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу, обеспечивающему разделение/очистку популяции вирионов практически шаровидной формы и популяции вирионов палочковидной формы простым и недорогим образом, и при этом способ можно применять в промышленном масштабе. Способ по изобретению может применяться, в частности, в мягких условиях и обеспечивает высокий выход вирионов практически шаровидной формы, притом что вирионы палочковидной формы уменьшаются в
- 11 027511 количестве или даже элиминируются из фильтрата. Еще одно преимущество настоящего изобретения заключается в том, что вирионы, которые были очищены в соответствии с настоящим изобретением, можно, например, использовать непосредственно в качестве вирусных векторов для генной терапии, поскольку они в надлежащей степени свободны от других вирусов, например бакуловирусов. Хотя небольшие остаточные фракции бакуловирусной ДНК могут оставаться в фильтрате, эта ДНК, тем не менее, не связана со способными к репликации бакуловирусами, а скорее связана с со-упакованной ДНК в рААВ и, следовательно, не представляет инфекционный бакуловирус.
В предпочтительном варианте осуществления компоненты бакуловируса, такие как, например, свободные бакуловирусные белки и субвирусные частицы, уменьшаются в количестве при использовании способа по изобретению. Это, в частности, является преимуществом, поскольку эти компоненты способны индуцировать неспецифический иммунный ответ, если вирусные векторы используют в генной терапии пациента.
Альтернативно или в сочетании с вариантами осуществления, описанными выше, один из вариантов осуществления изобретения заключается в том, что способ по настоящему изобретению можно использовать для разделения более чем двух различных популяций вирионов, например, когда используют бакуловирусную экспрессионную систему, в которой задействовано более одного бакуловирусного вектора, и, таким образом, в результате образуются несколько типов бакуловирусных вирионов. Способ по настоящему изобретению, описанный выше, можно использовать для отделения бакуловирусных популяций от популяции парвовирусных вирионов. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу разделения по меньшей мере двух популяций вирионов в образце, предпочтительно, когда одна или более популяций вирионов содержат вирионы с практически шаровидной формой и одна или более других популяций вирионов содержат вирионы, имеющие палочковидную форму, включающему стадию фильтрации образца, содержащего популяции вирионов, через фильтр, сквозь который могут проходить только вирионы практически шаровидной формы.
В настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения глагол включать и его спряжения используют в его неограничивающем смысле для обозначения того, что следующие за этим словом пункты включены, однако пункты, которые специально не упомянуты, не исключены. Кроме того, использование единственного числа применительно к элементу не исключает возможности того, что присутствует более одного элемента, если из контекста ясно не следует, что присутствует один и только один из элементов. Таким образом, единственное число применительно к элементу, как правило, означает по меньшей мере один.
Полное содержание всех патентов и литературных источников, процитированных в настоящей спецификации, включено в данный документ посредством ссылок.
Следующие примеры предложены исключительно для иллюстративных целей и никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Описание фигур
Фиг. 1 - выход ГК и ОЧ при вирусной фильтрации. На фигуре представлен выход в виде % от внесенных геномных копий и общего количества частиц в фильтрате, включая внесенную коррекцию на объемы образца, промывание мембраны после использования и объединение вышеуказанных аликвот;
фиг. 2 - уменьшение содержания бакуловируса при вирусной фильтрации. На фиг. представлен титр бакуловируса, измеренный методом определения ТСГО50, в матричном материале бакуловируса, материале, нанесенном на вирусный фильтр (элюат с колонки ΑΙΕΧ с добавкой матричного материала), нанофильтрате в зависимости от фильтрационного объема (х мл) и в конечной объединенной фракции фильтрата, прошедшего через вирусный фильтр, и жидкости от промывания фильтра. Для фильтратов и конечных объединенных фракций представлены максимально возможные титры, поскольку результаты анализа не были вполне положительными на бакуловирус.
Примеры
Пример 1.
Аденоассоциированный вирусный вектор (ААВ) получали после инфицирования клеток насекомых тремя рекомбинантными бакуловирусами, как ранее описано в статье игаЬе с1 а1., 2002 (Нит. Оепе Тйег 13(16): 1935-1943).
Через три дня после инфицирования клеточную культуру лизировали детергентом и затем обрабатывали нуклеазой, добавляя 9 Ед/мл бензоназы (Мегск) и инкубируя в соответствии с рекомендациями производителя.
Затем сырую лизированную массу осветляли, последовательно фильтруя через фильтры Ра11 РгоЙ1е® §1аг и Ра11 8ирог® (Ра11 СогрогаДоп). Инкубацию для снижения вирусной нагрузки в присутствии детергента проводили при температуре по меньшей мере 28°С. Этот материал очищали методом аффинной хроматографии с использованием АУВ сефарозы НР, ОЕ Неаййсаге. Вкратце, отфильтрованный клеточный лизат наносили на колонку с диаметром 20 см (ВРО 200/500, ОЕ Неаййсаге) с примерно 6-см высотой слоя, при линейной скорости 150 см/ч. Колонку промывали фосфатно-солевым буфером до тех пор, пока кривая УФ-поглощения не возвращалась на базовую линию и стабилизировалась. Адсорбиро- 12 027511 ванные частицы рААВ элюировали в кислой среде (50 мМ цитрат натрия, доведенный НС1 до рН 3,0), и к элюату с колонки немедленно добавляли 1/10 объема 1М трис-НС1 (рН 8,0).
В этот нейтрализованный элюат вносили 10% по объему добавку бакуловируса, полученного как описано ранее в статье Игайе е! а1. (2002, выше), после осветления центрифугированием при 1900 § в течение 15 мин и фильтрования через 0,2-мкм фильтрующую насадку на колбу (Согшпд), для создания смешанной популяции бакуловируса и ААВ для нанесения на вирусный фильтр.
Перед использованием фильтр Р1апоуа 35Ν подготавливали в соответствии с рекомендациями производителя. Вкратце, раствор для хранения удаляли, и весь воздух вытесняли путем добавления 40 мл 60 мМ раствора трис/НС1, рН 8,0, и промывания в соответствии с рекомендациями производителя.
Скорость подачи материала на вирусный фильтр была установлена на 5 мл/мин в соответствии с рекомендациями производителя (см. табл. 2) при помощи перистальтического насоса. В процессе вирусной фильтрации контролировали давление подачи и поток пермеата (см. табл. 2).
Таблица 2. Рабочие характеристики процесса вирусной фильтрации
Время процесса (мин) Скорость насоса ( об/мин) Давление подачи (мБар) Обработанный объем (мл) Поток пермеата (мл/мин)
0 3 160 0 5
10 3 160 50 5
20 3 160 100 5
30 3 160 150 5
40 3 160 200 5
50 3 160 250 5
60 3 160 300 5
70 3 160 350 5
80 3 160 400 5
Образцы собирали после 50, 250 и 400 мл фильтрата для титрования бакуловируса в анализе ТСГО50 на содержание инфекционного бакуловируса с использованием линии клеток 819. Результаты приведены в ТСГО50: 50% инфекционной дозе для тканевых культур, которая определяет количество вируса, необходимое для оказания цитопатического эффекта в 50% инокулированной тканевой культуры клеток δ19.
Образцы, примерно 1 мл, отбирали из фильтрата; их анализировали на геномные копии (далее в настоящем описании обозначаемые ГК) интересующего гена в ААВ, и общее количество частиц (далее в настоящем описании обозначаемое 04) ААВ, для определения связанных с ними показателей выхода. Анализ ГК и 04 проводили, как описано ниже.
Для определения концентрации геномных копий в образцах готовили десятикратные серийные разведения тестируемых образцов и надлежащего рабочего стандарта, постороннюю ДНК удаляли расщеплением ДНКазой и инкапсидированную ДНК высвобождали путем расщепления протеазой К. Высвобожденную вирусную ДНК затем очищали с использованием МадпеЗй В1ие®. Затем ДНК амплифицировали количественной ПЦР (к-ПЦР) с использованием праймеров, специфичных для геномной последовательности вектора. Амплификацию ДНК контролировали в реальном времени за счет включения флуоресцентного связывающего ДНК красителя 8УВК зеленого. Количество ДНК, присутствующее в образце, можно рассчитать путем сравнения значений С1 для тестируемого образца со значениями для рабочего стандарта. Использовали дизайн анализа с параллельными группами для тестирования серийных разведений тестируемого образца против надлежащего рабочего стандарта, получая соответствующее отношение. Это отношение переводили в концентрацию геномных копий (гк/мл), используя содержание геномных копий в рабочем стандарте.
Общее количество частиц ААВ (как полных частиц, содержащих соответствующий геном (векторные частицы), так и пустых частиц) определяли с помощью гель-фильтрационной хроматографии. Гельфильтрационную ВЭЖХ проводили с использованием колонки ВюВаб1е 8ЕС-1000 (Тйегшо Е1ее1гоп Согрогайоп) при скорости потока 1 мл/мин с водной фазой И-РВ8 при 25°С. Элюцию контролировали по УФ-поглощению при 214 нм. Площади пиков тестируемых образцов рассчитывали с использованием калибровочной кривой надлежащего рабочего стандарта с известным количеством частиц ААВ в мл.
Фильтр Р1апоуа 35Ν промывали 10 мл 60 мМ раствора трис/НС1, рН 8,0, согласно инструкциям производителя. Смыв объединяли с фильтратом и отбирали образцы для определения инфекционного титра бакуловируса в анализе на ТСГО50. Из смыва отбирали образцы для последующего определения титров ГК и 04 до того, как объединяли с материалом фильтрата. Объединенную фракцию фильтрата и смыва смешивали вручную для обеспечения гомогенности и отбирали образцы для последующего определения титров ГК и 04. Из титров ГК и 04 рассчитывали выход, и полученные результаты приведены на фиг. 1.
- 13 027511
Инфекционный титр бакуловируса в образцах определяли с помощью анализа 50% инфекционной дозы для тканевых культур (ТСГО50). Данный метод основан на инфицировании монослоев клеток δί9 насекомых инфекционным бакуловирусом в тестируемом образце. 3-кратное серийное разведение в культуральной среде тестируемого образца использовали для инфицирования клеток в восьмикратном дублировании. Планшет инкубировали при 28°С в течение 7 дней. Затем супернатанты переносили в новые подготовленные планшеты и инкубировали при 28°С в течение 7 дней. По мере прогрессирования инфекции инфицированные клетки теряли способность оставаться прикрепленными друг к другу и к поверхности планшета и становились несвязанными клетками, т.е. проявлялся цитопатогенный эффект (ЦПЭ) (СРЕ), который можно наблюдать под микроскопом. Титр в 1од10 ТСГО50/мл рассчитывали при помощи метода Зреатшап-КатЬет.
Результаты.
Результаты титрования бакуловируса приведены на фиг. 2.
Матричный раствор бакуловируса имел инфекционный титр бакуловируса 8,1 1од10 ТСГО50/мл. Элюат с колонки ΑΙΕΧ с добавкой, при добавлении матричного раствора до 10%, имел титр 7,62 1од10 ТСГО50/мл. Значение ТСГО50 нанофильтрата было снижено на по меньшей мере 6 1од5, до величины ниже 1,511 1од10 ТСГО50/мл, уровня количественного определения этого конкретного анализа. Таким образом, нанофильтрация приводит к снижению содержания бакуловируса на по меньшей мере 6 1о§5. вследствие чего нанофильтрация является вполне оправданным типовым технологическим процессом для различения двух вирусов, имеющих сопоставимые размеры в двух измерениях.

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ отделения популяции парвовирусных вирионов от популяции бакуловирусных вирионов, включающий стадию фильтрации образца, содержащего популяции парвовирусных и бакуловирусных вирионов, через фильтр, отличающийся тем, что фильтр имеет номинальный размер пор 30-40 нм.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что парвовирусный вирион представляет собой аденоассоциированный вирус.
  3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что бакуловирусный вирион представляет собой мультикапсидный вирус ядерного полиэдроза АиЮдгарйа саПГогшса (АсшЫРУ).
  4. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что фильтр содержит материал, выбранный из регенерированной из медноаммиачного раствора целлюлозы, поливинилиденфторида, полисульфона, политетрафторэтилена, полипропилена, модифицированного или немодифицированного полиэфирсульфона, ацетата целлюлозы, нитрата целлюлозы, полиамида и регенерированной целлюлозы.
  5. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что фильтр имеет номинальный размер пор 3238 нм.
  6. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что фильтр имеет номинальный размер пор приблизительно 35 нм.
  7. 7. Способ по любому из пп.4-6, отличающийся тем, что фильтр содержит регенерированную из медноаммиачного раствора целлюлозу, предпочтительно половолоконную регенерированную из медноаммиачного раствора целлюлозу, более предпочтительно, если фильтр представляет собой мембрану Р1апоуа 35 или фильтр ИШрот Όν50.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что образец подвергают фильтрации с использованием двух или более фильтров.
  9. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что образец перед стадией фильтрации подвергают лизису, предпочтительно детергентному лизису.
  10. 10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что образец перед стадией фильтрации предварительно очищают с использованием метода, выбранного из центрифугирования в градиенте плотности, фильтрации через фильтр с размером пор от 70 до 200 нм, хроматографии, предпочтительно аффинной хроматографии и/или ионообменной хроматографии, а также комбинации этих методов.
  11. 11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что рН образца составляет от 6 до 10, предпочтительно от 7 до 9, более предпочтительно от 7,5 до 8,5, наиболее предпочтительно примерно 8.
  12. 12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что от 1 до 200 мл, предпочтительно от 80 до 120 мл образца пропускают через 1 см2 поверхности фильтра.
  13. 13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что в фильтре задерживается по меньшей мере 85% парвовирусных вирионов, и титр бакуловирусных вирионов в фильтрате снижается по меньшей мере на 5 1од5.
EA201490583A 2011-09-08 2012-09-07 Способ отделения популяции парвовирусных вирионов от популяции бакуловирусных вирионов EA027511B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161532176P 2011-09-08 2011-09-08
EP11180594 2011-09-08
PCT/NL2012/050619 WO2013036118A1 (en) 2011-09-08 2012-09-07 Removal of contaminating viruses from aav preparations

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201490583A1 EA201490583A1 (ru) 2014-07-30
EA027511B1 true EA027511B1 (ru) 2017-08-31

Family

ID=47832422

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201490583A EA027511B1 (ru) 2011-09-08 2012-09-07 Способ отделения популяции парвовирусных вирионов от популяции бакуловирусных вирионов

Country Status (20)

Country Link
US (3) US9840694B2 (ru)
EP (3) EP2990477B8 (ru)
JP (2) JP6198278B2 (ru)
KR (1) KR101961347B1 (ru)
CN (2) CN107502597A (ru)
AU (1) AU2012304993B2 (ru)
BR (1) BR112014005255A2 (ru)
CA (1) CA2847604A1 (ru)
DK (1) DK2744895T3 (ru)
EA (1) EA027511B1 (ru)
ES (1) ES2558168T3 (ru)
HK (1) HK1220229A1 (ru)
HU (1) HUE026579T2 (ru)
IL (1) IL231398A (ru)
MX (1) MX349601B (ru)
PL (1) PL2744895T3 (ru)
PT (1) PT2744895E (ru)
SI (1) SI2744895T1 (ru)
WO (1) WO2013036118A1 (ru)
ZA (1) ZA201401714B (ru)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2558168T3 (es) * 2011-09-08 2016-02-02 Uniqure Ip B.V. Eliminación de virus contaminantes en preparaciones AVV
WO2015060722A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Uniqure Ip B.V. Aav-5 pseudotyped vector for gene therapy for neurological diseases
US10577627B2 (en) 2014-06-09 2020-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
CA2966620A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Voyager Therapeutics, Inc. Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease
SG11201703419UA (en) 2014-11-14 2017-05-30 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
US10597660B2 (en) 2014-11-14 2020-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
US11697825B2 (en) 2014-12-12 2023-07-11 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scAAV
LT3237618T (lt) 2014-12-24 2019-07-10 Uniqure Ip B.V. Rnri sukeltas hantingtino geno slopinimas
EP3054007A1 (en) * 2015-02-09 2016-08-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Recombinant adeno-associated virus particle purification comprising an immuno-affinity purification step
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
SG11201809643UA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
KR102392236B1 (ko) 2016-05-18 2022-05-03 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
US11298041B2 (en) 2016-08-30 2022-04-12 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
CN110913866A (zh) 2017-05-05 2020-03-24 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
WO2018204803A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
WO2019018342A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. NETWORK EQUIPMENT TRACK GUIDE SYSTEM
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
JP7502991B2 (ja) 2017-10-16 2024-06-19 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
HUE062774T2 (hu) 2018-01-17 2023-12-28 Meiragtx Uk Ii Ltd Módosított rAAV kapszidfehérje génterápiához
EP3850098A1 (en) 2018-09-12 2021-07-21 uniQure IP B.V. Rnai induced c9orf72 suppression for the treatment of als/ftd
CA3120177A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Uniqure Ip B.V. Method and means to deliver mirna to target cells
WO2020104480A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Uniqure Biopharma B.V. Adeno-associated virus vectors for expressing fviii mimetics and uses thereof
AU2019385598A1 (en) 2018-11-19 2021-06-03 Uniqure Ip B.V. RNAi induced reduction of ataxin-3 for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 3
WO2020104435A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Uniqure Ip B.V. A companion diagnostic to monitor the effects of gene therapy
EP3924364A1 (en) 2019-02-15 2021-12-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions and methods for producing recombinant aav
WO2020219897A1 (en) * 2019-04-24 2020-10-29 Biogen Ma Inc. Methods for production of recombinant adeno-associated viruses
AU2020314883A1 (en) 2019-07-15 2022-03-03 Meiragtx Uk Ii Limited Modified AAV capsid proteins for treatment of arthritic disease
EP4031148A1 (en) 2019-09-16 2022-07-27 uniQure IP B.V. Targeting misspliced transcripts in genetic disorders
AU2020398178A1 (en) 2019-12-04 2022-06-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel compositions and methods for producing recombinant AAV
WO2021119404A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 Emd Millipore Corporation Intensified virus filtration using diafiltration buffer
CN115176037A (zh) * 2020-02-28 2022-10-11 旭化成医疗株式会社 病毒清除性能的评价方法
EP4133074A1 (en) 2020-04-07 2023-02-15 uniQure IP B.V. Gene constructs for silencing angiopoietin-like 3 (angptl3) and uses thereof
WO2022188797A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Huigene Therapeutics Co., Ltd. Engineered crispr/cas13 system and uses thereof
US20240157306A1 (en) * 2021-03-30 2024-05-16 3M Innovative Properties Company Hollow-fiber membrane and method making thereof
WO2022214635A1 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Stichting Vu Nucleic acid molecules for compensation of stxbp1 haploinsufficiency and their use in the treatment of stxbp1-related disorders
CA3219847A1 (en) 2021-06-02 2022-12-08 Sander Jan Hendrik Van Deventer Adeno-associated virus vectors modified to bind high-density lipoprotein
WO2022268835A1 (en) 2021-06-21 2022-12-29 Uniqure Biopharma B.V. Gene constructs for silencing alpha-synuclein and uses thereof
WO2022268811A1 (en) 2021-06-21 2022-12-29 Uniqure Biopharma B.V. Improved lysis procedures
WO2023283962A1 (en) 2021-07-16 2023-01-19 Huigene Therapeutics Co., Ltd. Modified aav capsid for gene therapy and methods thereof
WO2023198662A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Novel systems for nucleic acid regulation
WO2023198745A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Nucleic acid regulation of apoe
WO2023198702A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Nucleic acid regulation of c9orf72
WO2023198663A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Nucleic acid regulation of snca

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6479273B1 (en) * 1997-03-06 2002-11-12 Medigene Aktiengesellschaft Filtration method for separating viruses
WO2010148143A1 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 Genzyme Corporation Improved methods for purification of recombinant aav vectors

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US6066324A (en) 1994-10-07 2000-05-23 Loyola University Of Chicago Carboxyl terminal of papilloma virus L1 region is not required for formation of virus-like particles
US6103526A (en) 1998-10-08 2000-08-15 Protein Sciences Corporation Spodoptera frugiperda single cell suspension cell line in serum-free media, methods of producing and using
WO2000028004A1 (en) 1998-11-10 2000-05-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Virus vectors and methods of making and administering the same
US6593123B1 (en) * 2000-08-07 2003-07-15 Avigen, Inc. Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
WO2003074714A1 (en) 2002-03-05 2003-09-12 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Baculovirus expression system
US20050009168A1 (en) * 2003-05-12 2005-01-13 Robbins Joan Marie Methods and apparatus for Adeno associated virus purification
RU2457252C2 (ru) * 2006-06-21 2012-07-27 Амстердам Молекьюла Терапьютикс (Амт) Ип Б.В. AAV ВЕКТОРЫ С УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫМИ Rep-КОДИРУЮЩИМИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫМИ В СИСТЕМАХ ПРОДУКЦИИ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НАСЕКОМЫХ
US20080299545A1 (en) * 2007-03-06 2008-12-04 Shuyuan Zhang Chromatographic methods for assessing adenovirus purity
US20100323429A1 (en) * 2008-04-10 2010-12-23 Yu-Chen Hu Methods for purifying baculovirus
MX340102B (es) * 2010-01-28 2016-06-24 The Children's Hospital Of Philadelphia * Una plataforma de fabricacion ajustable en escala, para la purificacion de vector viral y vectores virales asi purificados para el uso en terapia de genes.
ES2558168T3 (es) * 2011-09-08 2016-02-02 Uniqure Ip B.V. Eliminación de virus contaminantes en preparaciones AVV

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6479273B1 (en) * 1997-03-06 2002-11-12 Medigene Aktiengesellschaft Filtration method for separating viruses
WO2010148143A1 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 Genzyme Corporation Improved methods for purification of recombinant aav vectors

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GERD KERN: "Virus removal by filtration", BIOPHARM INTERNATIONAL, vol. 19, no. 10, 1 January 2006 (2006-01-01), pages 32 - 41, XP055017438 *
J. BLüMEL ; A. STüHLER: "Wichtige Aspekte der Virussicherheit bei Neuartigen Therapien", BUNDESGESUNDHEITSBLATT - GESUNDHEITSFORSCHUNG - GESUNDHEITSSCHUTZ, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 53, no. 1, 26 November 2009 (2009-11-26), Berlin, DE, pages 38 - 44, XP019765204, ISSN: 1437-1588 *
JOHANNES BLÜMEL: "Virus Safety Aspects of advanced Therapies", 25 November 2008 (2008-11-25), pages 1 - 18, XP055016970, Retrieved from the Internet <URL:http://www.dgra.de/fortbildung/pdf/workshops/20081125_pei/4-5-bluemel.pdf> [retrieved on 20120119] *
RUEDA, P. ; FOMINAYA, J. ; LANGEVELD, J.P. ; BRUSCHKE, C. ; VELA, C. ; CASAL, J.: "Effect of different baculovirus inactivation procedures on the integrity and immunogenicity of porcine parvovirus-like particles", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 19, no. 7-8, 22 November 2000 (2000-11-22), AMSTERDAM, NL, pages 726 - 734, XP027322027, ISSN: 0264-410X *

Also Published As

Publication number Publication date
HUE026579T2 (en) 2016-06-28
JP2014526246A (ja) 2014-10-06
ES2558168T3 (es) 2016-02-02
DK2744895T3 (en) 2016-01-04
US10253301B2 (en) 2019-04-09
US20180100143A1 (en) 2018-04-12
EP2744895B1 (en) 2015-10-14
SI2744895T1 (sl) 2016-03-31
JP6624690B2 (ja) 2019-12-25
US20190218523A1 (en) 2019-07-18
IL231398A0 (en) 2014-04-30
CN103857790B (zh) 2017-09-08
AU2012304993B2 (en) 2017-09-14
CN103857790A (zh) 2014-06-11
BR112014005255A2 (pt) 2017-04-04
KR101961347B1 (ko) 2019-03-25
JP2018023365A (ja) 2018-02-15
CN107502597A (zh) 2017-12-22
IL231398A (en) 2017-06-29
EA201490583A1 (ru) 2014-07-30
EP2990477B1 (en) 2018-08-29
HK1220229A1 (zh) 2017-04-28
ZA201401714B (en) 2015-12-23
JP6198278B2 (ja) 2017-09-20
PL2744895T3 (pl) 2016-04-29
EP3425044A1 (en) 2019-01-09
EP2744895A1 (en) 2014-06-25
WO2013036118A1 (en) 2013-03-14
CA2847604A1 (en) 2013-03-14
EP2990477B8 (en) 2018-10-31
PT2744895E (pt) 2016-02-08
MX2014002733A (es) 2014-07-14
EP2990477A1 (en) 2016-03-02
AU2012304993A1 (en) 2014-03-20
KR20140074333A (ko) 2014-06-17
US9840694B2 (en) 2017-12-12
MX349601B (es) 2017-08-04
US20140342434A1 (en) 2014-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA027511B1 (ru) Способ отделения популяции парвовирусных вирионов от популяции бакуловирусных вирионов
Liu et al. Rift Valley fever virus structural proteins: expression, characterization and assembly of recombinant proteins
ES2472429T3 (es) Método para la purificación de partículas de adenovirus a partir de cultivos de alta densidad celular
AU2005297372A1 (en) Improved viral purification methods
US20240141377A1 (en) Controlled expression of viral proteins
US6479273B1 (en) Filtration method for separating viruses
Tijssen et al. Parvoviridae. Structure and reproduction of densonucleosis viruses
KR20230011935A (ko) 아데노 연관 바이러스 입자 또는 아데노바이러스를 정제하기 위한 방법 및 조성물
Kalbfuss-Zimmermann et al. Viral vaccines purification
Michalsky et al. Concentration of the baculovirus Autographa californica M nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) by ultrafiltration
CN117836010A (zh) 改进的裂解程序
CN109153978A (zh) 使用聚二烯丙基二烷基铵盐分离腺相关病毒的方法
Lee et al. Processing of Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) Polyprotein and Self‐Assembly of IBDV‐Like Particles in Hi‐5 Cells
Zhou et al. Characterization of two density populations of feline calicivirus particles
WO2024054983A1 (en) Controlled expression of viral proteins
Gurda et al. Production and purification of viruses for structural studies

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU