EA025690B1

EA025690B1 - Ранозаживляющее средство, обладающее иммуностимулирующим и антиоксидантным эффектами

Info

Publication number: EA025690B1
Application number: EA201400777A
Authority: EA
Inventors: Вадим Теймуразович Корошвили; Михаил Юрьевич Смахтин; Игорь Иванович Бобынцев; Зоя Александровна Ардемасова; Виктор Николаевич Калихевич; Екатерина Сергеевна Литвинова
Priority date: 2014-07-15
Filing date: 2014-07-15
Publication date: 2017-01-30
Also published as: EA201400777A1

Abstract

Изобретение относится к медицине (травматологии, хирургии) и ветеринарии и может быть использовано для стимуляции заживления кожных ран. Изобретение заключается в применении пептида, имеющего формулу HN-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH, отличающегося от тимогена HN-L-Glu-L-Trp-COOH наличием дополнительной аминокислоты (D-аланина) возле N-конца пептида. Пептид вводили один раз в сутки парентерально (внутрибрюшинно или внутрикожно) в эквимолярной с тимогеном разовой дозе (HN-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH - 1,2 мкг/кг, тимоген - 1 мкг/кг массы). При парентеральном введении пептида в течение 10 дней с момента возникновения кожной раны у экспериментальных животных (крысы Вистар) наблюдалась стимуляция репаративной регенерации кожи (повышалось число фибробластов) и активировалась функция нейтрофилов крови. Также в этих условиях пептид HN-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH обладал антиоксидантным действием, о чем свидетельствовало повышение активности супероксиддисмутазы при внутрибрюшинном и внутрикожном введениях, а также снижался уровень малонового диальдегида при внутрикожном введении этого пептида. Таким образом, синтетический пептид общей формулы HN-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH может быть использован в качестве средства, стимулирующего заживление кожных ран, иммунную и антиоксидантную защиту организма.

Description

Изобретение относится к медицине (фармакологии, травматологии, хирургии), ветеринарии и может быть использовано в качестве средства, стимулирующего заживление кожных ран и иммунную функцию организма.

Известны репаранты, стимулирующие заживление кожных ран: метилурацил, пентоксил, бетамецил, декспантенол и другие. Однако при травмах многие из них влияют только на отдельные звенья патогенеза (Регистр лекарственных средств России (РЛС) Энциклопедия лекарств, 2004, 11 выпуск, с. 1155-1156). В связи с этим, часто приходится использовать комплексную терапию. Однако такой подход к лечению ран и травм может иметь непредсказуемые последствия взаимодействия препаратов при полипрагмазии. Одновременно с этим многие препараты данной группы имеют побочные эффекты, которые ограничивают их применение (Белоусов Ю.Б., Моисеев В.С., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. М.: Универсум паблишинт, 1997, 532 с.).

Известны также регуляторные пептиды, обладающие репаративным и ранозаживляющим действием (Рюкай, Ь. ТЬе Ьитаи йт-рерЬбе СНК аиб Иккие тетобеЬпд//1. Вюта1ет δει. Ро1ут. Еб. 2008. Уо1. 19, № 8. Р. 969-988). Преимуществом пептидных средств является тот факт, что они инактивируются путем протеолиза и распадаются до обычных аминокислот, которые не являются чужеродными (ксенобиотиками) для организма и, следовательно, не обладают побочными эффектами (Белоусов Ю.Б., Кукес В.Г., Лепахин В.К., Петров В.И. Клиническая фармакология. Национальное руководство. М. Гэотар-Медиа, 2009, 965 с.).

Известный пептидный препарат - тимоген (дипептид Н₂Н-Е-С1ц-Е-Тгр-СООН) является иммуномодулятором, но при этом часто используется как репарант для стимуляции заживления ран, а также для лечения травм различной этиологии (Регистр лекарственных средств России (РЛС). Энциклопедия лекарств, 2004, 11 выпуск, с. 849-850). В качестве аналога того же назначения может быть приведен пример использования тимогена для стимуляции заживления кожных ран и активации функции нейтрофилов крови (Синергичное иммунотропное и репаративное действие тимогена, даларгина и регуляторного пептида ^Υ-ΗΙδ-6Υδ при экспериментальной травме кожи/В.Ю. Чердаков, М.Ю. Смахтин, Г.М. Дубровин, И.И. Бобынцев//Курский научно-практический вестник Человек и его здоровье. 2013. № 1. С. 38-42). Но к недостаткам этого препарата можно отнести быструю инактивацию под действием протеолитических ферментов (протеаз), уровень которых особенно высок в зоне воспаления (РоЬкоп, М.С. \Уоипб ίηГесОоп: а Габиге о! теоипб ЬеаЬпд саикеб Ьу ап 1тЬа1апсе о! Ьас1епа / М.С. РоЬкоп//8итд. СЬп. ЫойЬ. Ат. 1997. Уо1. 77. Р. 637-650). Протеазам достаточно разрушить только одну пептидную связь между двумя аминокислотами, что объясняет малое время полужизни этого пептида (ТА. Вегдеоп, Υ.Ν. СЬап, В.С. СЬаг1ек, I. То1Ь Ога1 аЬкотрбоп епЬапсетеп! оГ б1рерббе Ь-СЬ-Ь-Ттр-ОН Ьу Ьр1б апб д1усоку1 софидабоп// Вюро1утетк. 2008. Т. 90, № 5. Р. 633-643). Поэтому этот препарат может иметь недостаточную эффективность, особенно при местном применении (8а1бакЬтебоуа, Ζ.Έ 1ттипотоби1абпд асбубу оГ 1Ьутодеп ш аси!е рапсгеаббк/Ζ.Έ 8а1бакЬтебоуа//Уорт. РЬап. 2000. Т. 69, № 6. Р. 35-36).

Все вышеперечисленное обуславливает необходимость поиска новых пептидных репаративных средств, обладающих более высокой биологической активностью.

Технический результат изобретения заключается в создании нового синтетического ранозаживляющего средства с более высокой биологической активностью.

Технический результат изобретения достигается тем, что в качестве ранозаживляющего средства применяют пептид общей формулы Н₂ЮН-А1а-Е-С1и-Е-Ттр-СООН.

Благодаря введению в молекулу пептида с Ν-конца аминокислоты Э-А1а (Ό-аланина) усиливается ранозаживляющая активность, вероятно за счет того, что введение Ό-аминокислот повышает их устойчивость к действию протеаз (Стеуеп Н.М., Эе \У1еб Ό. 1пйиепсе оГ рерббек к1гис1ига11у те1а!еб 1о АСТН апб М8Н оп асбуе ауо1бапсе ш та1к//Ртопбегк оГ Ногтопе гекеагсЬ. 1977, ν. 4, р. 140-152).

Предлагаемый в качестве ранозаживляющего средства пептид получают путем химического синтеза из отдельных аминокислот. Пептид может быть синтезирован в любой лаборатории синтеза пептидов. Нами был использован препарат, синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета. В качестве препарата сравнения был использован тимоген, имеющий формулу Н₂Ю Е-С1и-Ь-Тгр-СООН, который является общедоступным фармацевтическим средством и производится фирмой МБНПК ЦИТОМЕД ЗАО (Россия).

Выявление эффектов препарата проводили на крысах Вистар массой 180-220 г. Раневой процесс моделировали под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно). При этом полнослойные раны стандартного размера (1 см²) наносили на холке животных (Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хотинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. М., 1981. 157 с.).

Пептиды вводили один раз в сутки парентерально (внутрибрюшинно или внутрикожно): тимоген в рекомендованной терапевтической дозе 1 мкг на 1 кг массы тела (Регистр лекарственных средств России (РЛС). Энциклопедия лекарств, 2004, 11 выпуск, с. 849-850), а аналог тимогена (пептид с общей формулой Н^-О-АН-Е-СШ-Е-Ттр-СООН) вводили в эквимолярной разовой дозе - 1,2 мкг/кг. Соответствующую навеску пептида растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в обьеме 0,1 мл десятикратно (один раз в сутки) с интервалом в 24 ч между инъекциями. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 ч до вывода животных из эксперимента. Крысам контрольной

- 1 025690 группы вводили изотоничный раствор хлорида натрия в эквивалентном объеме в течение того же периода времени.

Для оценки активности заживления кожных ран проводили их гистологическое исследование. Материал, взятый для исследования, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. После обезвоживания и заливки в парафин изготавливали срезы толщиной 7-10 мкм, которые затем окрашивали гематоксилин-эозином. При морфометрии на световом микроскопе Ье1са СМЕ определяли процентное соотношение фибробластов, как известно, непосредственно участвующих в процессе ранозаживления, в сосочковом слое кожи на 100 клеток (Савостьянов Г.А. Основы структурной гистологии. Пространственная организация эпителиев. СПб.: Наука, 2005. 375 с.).

Важную роль в ранозаживлении также играет иммунная функция и особенно активность нейтрофилов. Как известно, они первыми из фагоцитов приходят в очаг воспаления и от их активности существенно зависит вероятность нагноения раны, а следовательно, длительность раневого процесса (Фрейдлин И.С, Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. СПб. Наука, 2001. 390 с.). Фагоцитарную активность нейтрофилов крови исследовали после их инкубации с латексом (Медведев, А.Н. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза//Лаб. дело. 1991. № 2. С. 19-20), определяя фагоцитарное число (ФЧ) (среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит) в мазках, окрашенных по Романовскому. В каждом мазке просчитывали 100 нейтрофилов. (Фримель Г. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. 472 с.). Кислородзависимую активность нейтрофилов определяли по реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) с использованием МиШзсап МС 400 (ЕаЬ8у81ет8, Финляндия) (Зинкин В.Ю., Годков М.А. Способ количественной оценки кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов человека//Клин. лаб. диагност. 2004. № 8. С. 26-29).

Повреждение тканей и органов вызывает развитие окислительного стресса с повышенным образованием активных форм кислорода (В.К. Казимирко, В.И. Мальцев, В.Ю. Бутылин, Н.И. Горобец. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная терапия. Морион, 2004. 160 с.). Поэтому при травмах также важным является выявление эффектов новых лекарственных субстанций в отношении активности свободнорадикальных реакций и антиоксидантной системы организма.

Для выявления антиоксидантных эффектов определяли активность супероксиддиссмутазы (СОД) (Костюк В.А., Потапов А.Н., Ковалева Ж.В. (1990). Вопр.мед. химии № 2) и уровень малонового диальдегида (МДА) в крови (МФата, М. ТЫоЬагЬИштс асЛ уа1ие оп ГисН Ьотодепа1е оГ та! аз раташе1ет оГ Ιίρίά ретох16а1юп ίη адщд, СС1₄ ш1охюа1юп апб уйатш Е бейтепез/М. МФата, М. исЫата//Вюсйет. Меб. 1980. Уо1. 23, № 3. Р. 302-311) с использованием спектрофотометра Аре1 330 ΡΌ (Япония).

Пример конкретного выполнения.

Пример 1. Эффекты пептида Н₂Х-О-А1а-Б-С1и-Б-Тцэ-СООН при внутрибрюшинном введении.

Крысам Вистар (10 животных) под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно) на холке моделировали полнослойные раны стандартного размера (1 см²) (Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хотинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. М., 1981. 157 с.). Пептид с общей формулой Н₂Х-О-А1а-Б-С1и-Б-Тгр-СООН растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в обьеме 0,1 мл внутрибрюшинно в разовой дозе 1,2 мкг/кг массы десятикратно (один раз в сутки) с интервалом в 24 ч между инъекциями. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 ч до вывода животных из эксперимента. На следующий день после последнего введения крыс забивали обескровливанием под хлоралгидратным наркозом. Объектами исследования служили кровь и ткани кожи.

Выявленные эффекты представлены в табл. 1 и 2.

Таблица 1

Влияние пептида Н₂Х-Э-А1а-Б-С1и-Б-Тг^э-СООН на количество фибробластов (М±т, п=10) в сосочковом слое кожи при внутрибрюшинном введении в условиях кожных ран

№ п/п	Условия опыта	Фибробласты, %
1.	Контроль (№С1)	29,3±1,2
2.	Тимоген	29,6±1,7
3.	Н₂П-О-А1а-Е-О1и-Ь-Тгр-СООН	34,5±2,4*¹·²

Примечание: * показывает достоверные отличия, р<0,05, а рядом стоящая цифра номера групп сравнения; п - количество животных в группе.

В условиях кожных ран при внутрибрюшинном введении пептид Н₂Х-Э-А1а-Б-С1и-Б-Тг^э-СООН повышает число фибробластов в коже, что свидетельствует о его ранозаживляющей активности (табл. 1).

- 2 025690

Таблица 2

Иммунотропные и антиоксидантные эффекты (М±т, п=10) пептида Н₂Х-О-А1а-Т-О1и-Ь-Тгр-СООН в условиях кожных ран при внутрибрюшинном введении

№	Условия опыта	Иммунная функция	Антиоксидантная функция
ФЧ, абс.	НСТ, оп	Супероксид-	МДА
п/ п				дисмутаза, усл. ед.	мкмоль/л
1.	Контроль (ЫаС1)	4,53±0,43	0,22±0,015	2,32±0,12	2,26±0,21
2.	Тимоген	6,54±0,89*'	0,242±0,023	2,71±0,11*‘	2,04±0,11
3.	Η₂Ν-ϋ-Αΐ3- Ь-С1и-Ь-Тгр- СООН	5,7±0,44*'	0,314±0,009*‘’²	3,21±0,16*^1,2	1,94±0,15

В условиях кожных ран при внутрибрюшинном введении пептид Н₂Л-О-Л1а-Т-О1и-Т-Тгр-СООН стимулирует функцию нейтрофилов (ФЧ, НСТ) крови и повышает активность СОД, что свидетельствует о его иммуностимулирующей и антиоксидантной активности. При этом он обладает более выраженными эффектами по сравнению с тимогеном (табл. 2).

Пример 2. Эффекты пептида Н₂Х-О-А1а-Т-О1и-Ь-Тгр-СООН при внутрикожном (местном) введении.

Крысам Вистар (10 животных) под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно) на холке моделировали полнослойные раны стандартного размера (1 см²) (Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хотинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. М., 1981. 157 с.). Пептид с общей формулой Н₂Х-О-А1а-Т-О1и-Ь-Тгр-СООН растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в объеме 0,1 мл внутрикожно в разовой дозе 1,2 мкг/кг массы десятикратно (один раз в сутки) с интервалом в 24 ч между инъекциями. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 ч до вывода животных из эксперимента. На следующий день после последнего введения крыс забивали обескровливанием под хлоралгидратным наркозом. Объектами исследования служили кровь и ткани кожи.

Выявленные эффекты представлены в табл. 3 и 4.

Таблица 3

Влияние пептида Н₂Х-П-А1а-Т-О1и-Т-Тгр-СООН на количество фибробластов (М±т, п=10) в сосочковом слое кожи при внутрикожном введении в условиях кожных ран

№ п/п	Условия опыта	Фибробласты, %
1.	Контроль (ПаС1)	36,5±4,4
2.	Тимоген	45,9±1,9*'
3.	Н₂Ч-О-А1а-Ь-С1и-Ь-Тгр-СООН	52,3±1,6*'·²

В условиях кожных ран при внутрикожном введении пептид Н₂Х-О-А1а-Т-О1и-Ь-Тгр-СООН повышает число фибробластов в коже, что свидетельствует о его ранозаживляющей активности. При этом он обладает более выраженным действием по сравнению с тимогеном (табл. 3).

- 3 025690

Таблица 4

Иммунотропные и антиоксидантные эффекты (М±т, п=10) пептида Н₂Ы-О-А1а-Е-О1ц-Е-Тгр-СООН в условиях кожных ран при внутрикожном введении

№ п/ п	Условия опыта	Иммунная функция	Антиоксидантная функция
ФЧ, абс.	НСТ, оп	Супероксид- дисмутаза, усл. ед.	МДА мкмоль/л
I.	Контроль (ЧаС1)	4,53±0,43	0,22±0,015	2,32±0,12	2,26±0,21
2.	Тимоген	6,89±0,87*'	0,393±0,017*'	3,0±0,20*'	1,68±0,17*‘
3.	Н₂Ы-О-А1а- Ь-С1и-1.-Тгр- СООН	6,27±0,84*'	0,347±0,012*¹	3,12±0,16*‘	1,0±0,15*'·²

При внутрикожном введении пептид Н₂Ы-О-А1а-Е-О1и-Е-Тгр-СООН стимулирует функцию нейтрофилов (ФЧ, НСТ) крови, повышает активность СОД и снижает уровень МДА, что свидетельствует о его иммуностимулирующей и антиоксидантной активности. При этом в отношении уровня МДА он обладает более выраженным действием по сравнению с тимогеном (табл. 4).

Таким образом, пептид, имеющий формулу Н₂Ы-О-А1а-Е-О1и-Е-Тгр-СООН, стимулирует процессы заживления ран, и при этом он обладает иммуностимулирующим и антиоксидантным эффектами как при внутрибрюшинном, так и при внутрикожном (местном) введениях.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Применение синтетического пептида общей формулы Н₂М-О-А1а-Е-О1ц-Е-Тгр-СООН в качестве ранозаживляющего средства, обладающего иммуностимулирующим и антиоксидантным эффектами.