EA025527B1

EA025527B1 - Способы лечения и предупреждения нейродегенеративных заболеваний и нарушений

Info

Publication number: EA025527B1
Application number: EA201400009A
Authority: EA
Inventors: И Ши; Роберт Нейджел
Original assignee: Томас Джефферсон Юниверсити; Роуэн Юниверсити
Priority date: 2007-05-11
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2017-01-30
Also published as: EA201400009A1

Abstract

Изобретение обеспечивает композиции и способы, применимые для лечения и предупреждения нейродегенеративного заболевания и неврологически родственных нарушений путем ингибирования Lp-PLA. Композиции и способы применимы для лечения и предупреждения заболеваний и нарушений, связанных с нарушенным функционированием гематоэнцефалического барьера (ВВВ), например нейродегенеративных заболеваний с проницаемым ВВВ, таких как, но без ограничения, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона и сосудистая деменция.

Description

Настоящее изобретение относится в основном к способам лечения и/или предупреждения нейродегенеративных заболеваний и нарушений, а конкретнее, к лечению и/или предупреждению нейродегенеративного заболевания, связанного с аномальной проницаемостью гематоэнцефалического барьера, с использованием агентов, ингибирующих экспрессию и/или активность белка Ьр-РЬЛ₂.

Предпосылки создания изобретения

Липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А₂ (Ьр-РЬА₂), также ранее известная в данной области техники как ацетилгидролаза тромбоцит-активирующего фактора (ацетилгидролаза РАР), является членом надсемейства ферментов фосфолипаз А2, которые вовлечены в гидролиз липидов или фосфолипидов липопротеинов. Она секретируется несколькими клетками, которые играют основную роль в системной воспалительной реакции на повреждение, включающими лимфоциты, моноциты, макрофаги, Тлимфоциты и тучные клетки.

Во время превращения ЬПЬ (липопротеина низкой плотности) в его окисленную форму Ьр-РЬА₂является ответственной за гидролиз образованного по механизму сложного 8Ν-2 эфира окислительномодифицированного фосфатидилхолина с предоставлением лизофосфатидилхолина и окислительномодифицированной жирной кислоты. Ьр-РЬА₂ осуществляет гидролиз 8п2-положения усеченного фосфолипида, ассоциированного с окисленным ЬПЬ. В результате происходит образование двух участвующих в клеточном хоминге медиаторов воспаления (неэстерифицированных жирных кислот (ΝΕΡΑ) и ЬУ8О РС). Как ΝΕΡΑ, так и ЬУ§0 РС являются хемоаттрактантами для циркулирующих в периферической крови моноцитов, играют роль в активации макрофагов и увеличивают окислительный стресс, а также оказывают влияние на функциональные реакции гиперчувствительности немедленного типа Тлимфоцитов. У людей и свиней Ьр-РЬА₂ связана с молекулой ЬПЬ через липопротеин В, и при нахождении в стенке артерии окисленный ЬПЬ чувствителен к гидролизу Ьр-РЬА₂.

Оба этих продукта действия Ьр-РЬА₂ являются сильными хемоаттрактантами для циркулирующих моноцитов. Полагают, что как таковой этот фермент ответствен за аккумуляцию клеток, нагруженных холестериновым сложным эфиром, в артериях, являясь причиной характерной жировой прожилки, ассоциированной с ранними стадиями атеросклероза, и ингибирование фермента Ьр-РЬА₂ может быть полезно для предотвращения формирования этой жировой прожилки (путем ингибирования формирования лизофосфатидилхолина) и применимо для лечения атеросклероза.

Кроме того, было сделано предположение, что Ьр-РЬА₂ играет непосредственную роль в окислении ЬПЬ. Это обусловлено тем, что происходящие из полиненасыщенных жирных кислот продукты действия Ьр-РЬА₂ в виде пероксидов липидов вносят вклад и увеличивают общий окислительный процесс. В соответствии с этой идеей ингибиторы Ьр-РЬА₂ ингибируют окисление ЬПЬ. Поэтому ингибиторы Ьр-РЬА₂могут иметь унифицированное применение при любом заболевании, в которое вовлечено пероксидное окисление липидов в сочетании с активностью фермента, например, помимо таких заболеваний, как атеросклероз и диабет, при таких заболеваниях, как ревматоидный артрит, инфаркт миокарда и реперфузионное повреждение.

Прогрессирующий характер дегенеративных, травматических или деструктивных неврологических заболеваний и ограниченная эффективность и серьезные побочные эффекты имеющихся фармакологических агентов делали тщетным клиническое лечение многочисленных неврологических нарушений. Такие заболевания, как болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, тяжелые эпилепсии (например, эпилепсия и семейная дисавтономия) ускользали от самых принятых попыток облегчить или вылечить заболевания с использованием фармакологических агентов.

Деменция, прогрессирующая дисфункция головного мозга, приводит к постепенно увеличивающемуся ограничению повседневной деятельности. Самым широко известным типом деменции является болезнь Альцгеймера. Она поражает приблизительно 10% популяции возрастом свыше 65 лет и приблизительно 40% популяции возрастом свыше 80 лет. Приблизительно 4,5 млн людей в Соединенных Штатах в настоящее время поражено этим нарушением, и ожидают, что это число резко увеличится в грядущие годы, поскольку эта демографическая популяция является сегментом самого быстрого роста в нашем обществе. К 2050, если не станут доступными профилактические лечения, ожидают, что число американцев с болезнью Альцгеймера утроится (с 4,6 до 14 млн), и затраты на уход за людьми с этой болезнью в США превысят 100 миллиардов долларов ежегодно. Эта эпидемия имеет значительные последствия для общества, относительно как страдания людей, так и денежных затрат.

Сосудистую деменцию определяют как утрату когнитивной функции вследствие ишемического, ишемически гипоксического или геморрагического поражений головного мозга в результате сердечнососудистых заболеваний и патологических изменений в сердечно-сосудистой системе. См., например, С.С. Котап, Меб. С1ш. ΝογΟι. Ат., 86, рр. 477-499 (2002). Сосудистая деменция является хроническим и прогрессирующим заболеванием. Симптомы сосудистой деменции включают утрату когнитивной функции, головные боли, инсомнию и потерю памяти. Сосудистая деменция может быть вызвана множественными лакунами и вызывающими недостаточную перфузию повреждениями, такими как инфаркты в краевой зоне и ишемическая перивентрикулярная лейкодистрофия (болезнь Бинсвангера). См. С.С. Котап, выше. В азиатских странах, таких как Китай, Япония и Корея, сосудистая деменция наблюдается у

- 1 025527 свыше 60% пациентов с деменцией.

Лечение сосудистой деменции обычно включает контроль факторов риска (т.е. гипертензии, диабета, пищи с высоким содержанием жира, курения, гиперфибриногенемии, гипергомоцистинемии, ортостатической гипотензии, аритмий сердца). См., С.С. Котаи, выше. Ученые также исследовали, может ли гормонозаместительная терапия и заместительная терапия эстрогенами отсрочить начало деменции у женщин. См. Е. Нодегуогк! с1 а1., СоеЬгаие Оа1аЬаке Зук1. Кеу., 3, СО 003799 (2002). Однако такая гормонозаместительная терапия имеет отрицательные побочные эффекты.

Кроме того, хотя аспирин часто предписывается для сосудистой деменции, существует очень ограниченное доказательство того, что аспирин действительно эффективен при лечении пациентов с сосудистой деменцией. См. Р.З. ХУПЬатк е1 а1., СоеЬгаие Оа1аЬаке Зук1. Кеу., 2, СО 001296 (2000). Нимодипин подразумевался в качестве лекарственного средства, демонстрирующего кратковременную пользу у пациентов с сосудистой деменцией, но был подтвержден в качестве лекарственного средства длительного действия против деменции. См. 1.М. Ьоре/-Агпе1а аиб 1. Впкк, СоеЬгаие Оа1аЬаке Зук1. Кеу., 3, СО 000147 (2002). Кроме того, клинические данные, касающиеся эффективности пирацетама, не поддерживают использование этого лекарственного средства для лечения деменции и ухудшения когнитивной функции (Ь. РЬекег апб О. 1пт1еу Еуапк, СоеЬгаие Оа1аЬаке Зук1. Кеу., 2, СО 001011 (2001)).

В настоящее время никакое лечение не может предотвратить сосудистую деменцию или остановить болезнь Альцгеймера. У людей на ранней и средней стадиях заболевания существующие в настоящее время лекарственные средства (Когнекс, Арицепт, Экселон, Разадин, Наменда) могут ослабить некоторые симптомы на ограниченное время. Поскольку воспаление головного мозга может вносить вклад в болезнь Альцгеймера, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (Ν3ΑΙΟ, Виокс, Алеве, Целебрекс) были проверены в клинических испытаниях и не продемонстрировали пользы.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лечения и/или предупреждения нейродегенеративного заболевания и нарушений путем ингибирования Ьр-РЬА₂, например ингибирования экспрессии и/или активности белка Ьр-РЬА₂. В конкретных вариантах осуществления нейродегенеративные заболевания, поддающиеся лечению и/или предупреждению с помощью способов настоящего изобретения, связаны с нарушенным функционированием гематоэнцефалического барьера (ВВВ), например нейродегенеративное заболевание с проницаемым ВВВ, и включают, например, но без ограничения, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, сосудистую деменцию и т.п.

В одном варианте осуществления раскрытые здесь способы включают введение нуждающемуся в лечении и/или предупреждении нейродегенеративного заболевания субъекту фармацевтической композиции, содержащей агент, который ингибирует Ьр-РЬА₂, например, агент, который ингибирует экспрессию Ьр-РЬА₂ и/или активность белка Ьр-РЬА₂. Не предусматривается, что настоящее изобретение ограничивается какой-либо конкретной стадией заболевания (например, ранней или запущенной).

В некоторых вариантах осуществления предусматриваются раскрытые здесь способы предотвращения просачивания через ВВВ путем ингибирования Ьр-РЬА₂, например ингибирования экспрессии ЬрРЬА₂ и/или ингибирования активности белка Ьр-РЬА₂. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления предусматриваются способы ингибирования Ьр-РЬА₂ путем блокирования ферментативной активности, а в некоторых вариантах осуществления предусматриваются способы ингибирования Ьр-РЬА₂путем уменьшения экспрессии РНК для Ьр-РЬА₂. В некоторых вариантах осуществления предотвращение и/или уменьшение просачивания через ВВВ или проницаемости ВВВ приводит к предотвращению и/или ослаблению симптомов, сопровождающих нейродегенеративные заболевания или нарушения.

В одном аспекте раскрытые здесь способы предусматривают способы лечения и/или предупреждения нейродегенеративного нарушения или заболевания у субъекта, включающие введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтической композиции, содержащей агент, который ингибирует активность и/или экспрессию белка Ьр-РЬА₂. В таком варианте осуществления такое нейродегенеративное заболевание или нарушение может быть нейродегенеративным заболеванием или нарушением и может быть, например, но без ограничения, болезнью Альцгеймера, сосудистой деменцией, болезнью Паркинсона и болезнью Хантингтона. В альтернативных вариантах осуществления нейродегенеративное заболевание или нарушение связано с нарушением гематоэнцефалического барьера. В дальнейшем варианте осуществления субъектом, которому вводят агент, который ингибирует активность или экспрессию белка ЬрРЬА₂, является человек.

В другом варианте осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы лечения и/или предупреждения сосудистой деменции у субъекта или риска развития такой деменции у субъекта, включающие введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей агент, который ингибирует активность и/или экспрессию белка Ьр-РЬА₂, причем ингибирование белка Ьр-РЬА₂ ослабляет или прекращает симптом сосудистой деменции. В некоторых вариантах осуществления сосудистая деменция сопровождается болезнью Альцгеймера.

В другом варианте осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы лечения и/или предупреждения заболевания или нарушения, связанного с нарушением гематоэнцефалического барьера, у нуждающегося в этом субъекта, включающие введение субъекту фармацевтической компози- 2 025527 ции, содержащей агент, который ингибирует экспрессию и/или активность белка Ьр-РЬЛг. В некоторых вариантах осуществления нарушенным ВВВ является проницаемый гематоэнцефалический барьер, и в дальнейших вариантах осуществления заболеванием или нарушением является нейродегенеративное заболевание или нарушение. Такими нейродегенеративными заболеваниями или нарушениями являются, например, но без ограничения, сосудистая деменция, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и т.п.

В другом варианте осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы уменьшения отложения бета-амилоида, упоминаемого как Αβ, в головном мозге субъекта, включающие введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей агент, который ингибирует экспрессию и/или активность белка Ьр-РЬАг, причем ингибирование белка Тр-РЬА₂ ослабляет или прекращает симптом отложения бета-амилоида в головном мозге. В некоторых вариантах осуществления бета-амилоидом является Абета-42.

В некоторых вариантах осуществления агент, который ингибирует Тр-РЬА₂, может ингибировать экспрессию Ьр-РЬА₂, например ингибировать трансляцию РНК для Тр-РЬА₂ с получением белка ЬрРЬА₂. В альтернативных вариантах осуществления агент, который ингибирует Тр-РЬА₂, может ингибировать активность белка Ьр-РЬА₂. Для применения в раскрытых здесь способах включается любой агент. В некоторых вариантах осуществления агентом может быть малая молекула, нуклеиновая кислота, аналог нуклеиновой кислоты, белок, антитело, пептид, аптамер или их варианты или варианты. В некоторых вариантах осуществления агентом является агент в виде нуклеиновой кислоты, например, но без ограничения, агент для РНК-интерференции, например, но без ограничения, малая интерферирующая РНК, малая шпилечная РНК, микро-РНК, двухцепочечная РНК или рибозим или их варианты.

В некоторых вариантах осуществления агентом, который ингибирует активность белка Ьр-РЬА₂, является малая молекула, например, но без ограничения, обратимый или необратимый ингибитор белка Тр-РЬА₂ в виде малой молекулы. В некоторых вариантах осуществления такой малой молекулой является молекуле соединения, в основе которого лежит пиримидион. В некоторых вариантах осуществления ингибитором Тр-РЬА₂ в виде малой молекулы является, например, но без ограничения, 1-(Ν-(2диэтиламино)этил)-Х-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6триметиленпиримидин-4-он (который также известен как 8В480848) или его соль. В некоторых вариантах осуществления ингибитором Тр-РЬА₂ в виде малой молекулы является, например, но без ограничения, ^(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил]^-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид или его соль. В некоторых вариантах осуществления ингибитором Тр-РЬА₂ в виде малой молекулы является, например, но без ограничения, №(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-^(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид или его соль. В некоторых вариантах осуществления ингибитором Тр-РЬА₂ в виде малой молекулы является, например, но без ограничения, метил-2-[4-({[2-[2-(2,3дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-4]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат или его соль.

В некоторых вариантах осуществления, когда следствием нейродегенеративного заболевания является снижение когнитивной функции, например, когда нейродегенеративным заболеванием является, например, болезнь Альцгеймера и/или сосудистая деменция, способ лечения и/или предупреждения заболевания, используя раскрытые здесь способы, может, кроме того, включать оценку когнитивной функции субъекта после введения фармацевтической композиции, содержащей агент, который ингибирует экспрессию и/или активность Тр-РЬА₂.

В дальнейших вариантах осуществления раскрытые здесь способы лечения и/или предупреждения нейродегенеративных заболеваний и/или лечения и/или предупреждения нарушенного функционирования ВВВ у субъекта могут, кроме того, включать мониторинг лечения путем оценки мозгового кровотока или функционирования гематоэнцефалического барьера. Такие способы могут быть осуществлены специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники, например, но без ограничения, оценивая присутствие тау и Αβ-42 в С8Р (цереброспинальной жидкости).

В некоторых вариантах осуществления, когда субъекту вводится фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор Ьр-РЬА₂, способы могут, кроме того, включать введение субъекту дополнительных терапевтических средств, например, но без ограничения, терапевтических средств, используемых для лечения нейродегенеративных нарушений. Например, когда нейродегенеративным нарушением является, например, болезнь Альцгеймера, субъекту можно, кроме того, вводить терапевтические средства для лечения болезни Альцгеймера, например, но без ограничения Арицепт или донепезил, Когнекс или такрин, Экселон или ривастигмин, Реминил или галантамин, противоамилоидную вакцину, понижающие Абета терапии, умственное упражнение или стимуляцию.

В некоторых вариантах осуществления раскрытые здесь способы лечения и/или предупреждении нейродегенеративных заболеваний применимы к субъектам, например, являющимся млекопитающими субъектами. В некоторых вариантах осуществления субъектом является человек.

Краткое описание чертежей

- 3 025527

На фиг. 1 демонстрируется доказательство ΌΜ/НС-индуцированного кровоизлияния и просачивания через ВВВ. На панели А демонстрируется отсутствие кровоизлияния в контрольном головном мозге по сравнению с головным мозгом животного с ΌΜ/НС на панели В, при этом черные стрелки указывают на клетки воспаления вне кровеносного сосуда, а белые стрелки показывают увеличение адгезии клеток воспаления к поверхности эндотелиальных клеток. На панели С демонстрируются отсутствие сосудистой проницаемости и ненарушенный ВВВ у контрольного животного по сравнению с просачиванием через ВВВ в головном мозге животного с ΌΜ/НС, как показано на панели Ό, при этом стрелки на панели С и Ό показывают границу иммуноглобулин(1д)-положительное затемнение-утечка, окружающую небольшие кровеносные сосуды.

На фиг. 2 демонстрируется, что просочившиеся 1д в головном мозге животных с ΌΜ/НС связываются с нейронами и вызывают разрушение дендритов. На левой и правой панелях демонстрируются 1дположительные нейроны с характерным нарушением дендритов, обнаруживаемым по спиралеобразной морфологии дендритных отростков, отходящих от тела нервной клетки.

На фиг. 3 демонстрируется доказательство ΌΜ/НС-индуцированной активации астроцитов и демонстрируется иммуноокрашивание СРАР в качестве маркера активированных астроцитов вблизи больных нейронов в головном мозге подвергнутых лечению животных с ΌΜ/НС.

На фиг. 4 демонстрируется доказательство ΌΜ/НС-индуцированной аккумуляции Абета-42 внутри нейронов и в локальной микрососудистой сети головного мозга. На панели А демонстрируются нейроны, которые являются Абета-42-иммуноположительными в значительной степени, и артериолы, демонстрирующие отложение Абета-42 в сосудистом слое гладкомышечных клеток (цереброваскулярный амилоидоз), а на панели В демонстрируется, что Абета-42-иммуноположительные нейроны имеют спиралеобразные дендриты, являющиеся признаком ретракции дендритов.

На фиг. 5 демонстрируется, что ингибитор Ьр-РЬА₂ предотвращает просачивание через ВВВ и связывание 1д с нейронами. Панели А-Р представляют собой репрезентативные изображения нарушения (проницаемости) ВВВ головного мозга животных с ΌΜ/НС без лечения (п=6), а панели С-Ь представляют собой репрезентативные изображения ненарушенного ВВВ в сравнимых областях головного мозга от животных с ΌΜ/НС, подвергшихся лечению ингибитором Рр-РЬА₂, (п=6). На панелях А-Р демонстрируется обильная утечка 1д из локальной микрососудистой сети головного мозга в ткань головного мозга и связывание 1д с нейронами по сравнению с панелями С-Ь.

На фиг. 6 демонстрируется, что ингибитор Рр-РЬА₂ сохраняет здоровье нейронов у животных с ΌΜ/НС путем блокирования утечки компонентов плазмы (в том числе 1д) из кровеносных сосудов. В результате 1д ограничен просветом кровеносных сосудов у животных с ΌΜ/НС, подвергшихся лечению ингибитором Ьр-РЬА^ что делает и стенки артериол, и нейроны отрицательными при иммуноокрашивании на 1д.

На фиг. 7 демонстрируется, что ингибитор Рр-РЬА₂ предотвращает аккумуляцию Абета-42 в нейронах. Панели А-Р представляют собой репрезентативные изображения иммуноокрашивания на Абета-42 головного мозга животных с ΌΜ/НС без лечения (п=6), а панели С-Ь представляют собой репрезентативные изображения иммуноокрашивания на Абета-42 в сравнимых областях головного мозга от животных с ΌΜ/НС, подвергшихся лечению ингибитором Ьр-РЬА^ (п=6). Увеличенная иммунореактивность Абета-42, продемонстрированная на панелях А-Р, показывает, что Абета-42 связывается с нейронами и аккумулируется в ним, по сравнению с Абета-42-иммуноотрицательными нейронами на панелях С-Ь.

На фиг. 8 демонстрируется, что ингибитор Рр-РЬА₂ уменьшал цереброваскулярный амилоидоз. На панели А демонстрируется иммуноокрашивание на Абета-42 в слое гладкомышечных клеток артериол (т.е. цереброваскулярный амилоидоз) в головном мозге животных с ΌΜ/НС без лечения, по сравнению с панелью В, на которой демонстрируется незначительное иммуноокрашивание на Абета-42 в артериолах или его отсутствие в сравнимых областях головного мозга от животных с ΌΜ/НС, подвергшихся лечению ингибитором Ьр-РЬА^

На фиг. 9 демонстрируется репрезентативное изображение головного мозга свиньи, демонстрирующее полностью интактный головной мозг на панели А и полусекционированное после срединной линии на панели В, при этом стрелки указывают на локализацию ствола головного мозга и гиппокапма, а также грид для областей головного мозга, использованных для иммуногистохимического анализа.

Подробное описание изобретения

Как здесь сообщается, авторы настоящего изобретения обнаружили, что животные, подверженные патологическим признакам сосудистой деменции, включающим просачивание и проницаемость ВВВ и кровоизлияние, после лечения ингибитором Ьр-РЬА^ как установлено, демонстрируют ослабление признаков и симптомов проницаемости ВВВ и редуцирование нарушенного функционирования ВВВ. Например, животные, подвергнутые лечению ингибитором Ьр-РЬА^ демонстрируют уменьшение проницаемости ВВВ, меньшую активацию глиальных клеток и меньшее повреждение нервных клеток. В частности, животные, подвергнутые лечению ингибитором Ьр-РЬА^ также имеют меньшее отложение амилоида, например, отложение бета-амилоида (или Абета-42) в головном мозге или сосудистой сети головного мозга. Следовательно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что ингибиторы Рр-РЬА₂ могут использоваться для лечения и/или предупреждения нейродегенеративных заболеваний и нарушений, в

- 4 025527 частности нейродегенеративных заболеваний и нарушений, связанных с нарушенным функционированием гематоэнцефалического барьера, например, нейродегенеративных заболеваний с проницаемостью ВВВ или увеличенной проницаемостью ВВВ. Такие заболевания включают, например, но без ограничения, сосудистую деменцию, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона и т.п.

Определения

Для удобства здесь собраны некоторые термины, используемые по всех заявке (в том числе описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения). Кроме случаев, специально оговоренных, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют такое же значение, как и значение, в котором они обычно понимаются специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники, частью которой является это изобретение.

Используемый здесь термин нейродегенеративное заболевание относится к разнообразному выбору нарушений центральной нервной системы, характеризующихся постепенной и прогрессирующей утратой нервной ткани и/или функции нервной ткани. Нейродегенеративное заболевание представляет собой класс неврологического нарушения или заболевания, которое характеризуется постепенной и прогрессирующей утратой нервной ткани и/или изменением функции нервной системы, обычно снижением функции нервной системы в результате постепенной и прогрессирующей утраты нервной ткани. Нейродегенеративные заболевания, поддающиеся предупреждению и/или лечению с помощью описанных здесь способов, являются нейродегенеративными заболеваниями, при которых существует нарушенный гематоэнцефалический барьер, например проницаемый гематоэнцефалический барьер. Примеры нейродегенеративных заболеваний, при которых существует нарушенный гематоэнцефалический барьер, включают, например, но без ограничения, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, сосудистую деменцию и т.п.

Термин сосудистая деменция, также упоминаемая в данной области техники как мультиинфарктная деменция, относится к группе синдромов, вызванных различными механизмами, все из которых приводят к повреждению сосудов головного мозга. Основными подтипами сосудистой деменции являются, например, небольшое ослабление когнитивной функции сосудистой этиологии, мультиинфарктная деменция, сосудистая деменция вследствие одного ключевого инфаркта (поражающего таламус, переднюю мозговую артерию, теменные доли головного мозга или поясную извилину головного мозга), сосудистая деменция вследствие геморрагических повреждений, заболевание небольших сосудов (в том числе, например, сосудистая деменция вследствие лакунарных повреждений или болезнь Бинсвангера) и болезнь Альцгеймера в сочетании с сосудистой деменцией.

Термин заболевание или нарушение используется здесь взаимозаменяемо и относится к любому изменению состояния организма или некоторых органов, препятствующему или нарушающему выполнение функций и/или вызывающему такие симптомы, как дискомфорт, дисфункция, дистресс или даже смерть пораженного человека или людей, контактирующих с пораженным человеком. Заболевание или нарушение также относится к душевному расстройству, нахождению в болезненном состоянии, недомоганию, болезни, нарушению, заболеванию, расстройству, жалобе, легкому заболеванию или аффектации.

Термины гематоэнцефалический барьер или ВВВ используются здесь взаимозаменяемо и используются для ссылки на барьер для проницаемости, который существует в кровеносных сосудах, поскольку они проходят через ткань головного мозга, который строго ограничивает и тесно регулирует то, что обменивается между кровью и тканью головного мозга. Компоненты гематоэнцефалического барьера включают эндотелиальные клетки, которые образуют выстилку в крайнем положении в направлении внутрь всех кровеносных сосудов, плотные соединения между соседними эндотелиальными клетками, которые являются структурным аналогом ВВВ, базальную мембрану эндотелиальных клеток и удлиненные отростки-ножки расположенных поблизости астроцитов, которые покрывают почти всю незащищенную внешнюю поверхность кровеносного сосуда. ВВВ препятствует проникновению большинства веществ крови в ткань головного мозга, в том числе большинства больших молекул, таких как 1д, антитела, комплемент, альбумин и лекарственные средства, и малых молекул.

Термин нарушенный ВВВ используется для ссылки на дисфункциональный ВВВ, например, когда ВВВ не позволяет проходить молекулам, которые обычно проходят через функциональный ВВВ, например, питательным веществам и сахарам, таким как глюкоза. Нарушенный ВВВ может также упоминаться, когда ВВВ является проницаемым для молекул, проникновение которых нормально функционирующий ВВВ обычно бы не допустил, на что здесь обычно приводится ссылка проницаемость ВВВ.

Термины проницаемость ВВВ или проницаемый ВВВ обычно упоминаются специалистами в данной области техники как просачивание через ВВВ. Термины используются здесь взаимозаменяемо для ссылки на нарушенную целостность ВВВ и увеличенную сосудистую проницаемость. Например, проницаемый ВВВ позволяет проходить молекулам через ВВВ, которые ненарушенный ВВВ обычно бы не допустил в ткань головного мозга, например, молекулам 1д, белкам комплемента, сывороточному альбумину и многочисленным другим белкам. Анализом для определения присутствия проницаемого ВВВ может быть, например, оценка наличия внесосудистого 1д в ткани головного мозга, который обычно ограничен просветом кровеносных сосудов, когда ВВВ функционирует нормально (т.е. когда ВВВ не является проницаемым).

- 5 025527

Термин агент относится к любой молекуле, которая обычно не присутствует или не присутствует на вводимых уровнях в клетке. Агент может выбираться из группы, включающей химические продукты, малые молекулы, последовательности нуклеиновых кислот, аналоги нуклеиновых кислот, белки, пептиды, аптамеры, антитела или их фрагменты. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть РНК или ДНК и может быть одноцепочечной или двухцепочечной, и может выбираться из группы, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес белок, олигонуклеотиды, аналоги нуклеиновых кислот, например, пептидо-нуклеиновую кислоту (ПНК), псевдокомплементарную ПНК (рс-ΡΝΑ), закрытую нуклеиновую кислоту (ΕΝΑ) и т.п. Такие последовательности нуклеиновых кислот включают, например, но без ограничения, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белки, например, которые действуют в качестве репрессоров транскрипции, антисмысловые молекулы, рибозимы, небольшие ингибиторные последовательности нуклеиновых кислот, например, но без ограничения, молекулу для РНК-интерференции, малую шпилечную РНК, малую интерферирующую РНК, микро-РНК, антисмысловые олигонуклеотиды и т.п. Белок и/или пептид или его фрагмент может быть любым представляющим интерес белком, например, но без ограничения, мутированными белками, терапевтическими белками и усеченными белками, причем белок обычно отсутствует или экспрессируется на низких уровнях в клетке. Белки могут также выбираться из группы, включающей мутированные белки, созданные методами генетической инженерии белки, пептиды, синтетические пептиды, рекомбинантные белки, химерные белки, антитела, мидитела, минитела, триатела, гуманизированные белки, гуманизированные антитела, химерные антитела, модифицированные белки и их фрагменты. Альтернативно, агент может быть внутриклеточным в результате введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетки и ее транскрипции, приводящей к продукции нуклеиновой кислоты и/или белка - ингибитора Ер-РБА₂ в клетке. В некоторых вариантах осуществления агентом являются какой-либо химический продукт, молекула или составляющая, включающий, без ограничения, синтетические и встречающиеся в природе небелковоподобные молекулы. В некоторых вариантах осуществления агентом является малая молекула, имеющая химическую составляющую. Например, химические составляющие включают незамещенные или замещенные алкильные, ароматические или гетероциклические составляющие, в том числе макролиды, лептомицины и родственные природные продукты или их аналоги. Известно, что агенты могут обладать желаемой активностью и/или свойством или могут быть выбраны из библиотеки разнообразных соединений.

Используемый здесь термин ингибирование означает, что экспрессия или активность белка ЬрРЬА₂ или его вариантов или гомологов снижается до некоторой степени и/или на период времени, достаточный для вызова желаемого эффекта. Снижение активности может быть обусловлено воздействием на одно или несколько свойств Ер-РЬА₂, в том числе уменьшением ее каталитической активности или ингибированием кофактора Ер-РЬА₂, или связыванием Ер-РЬА₂ с такой степенью авидности, что результатом является лечение или предупреждение нейродегенеративного нарушения или нарушенного ВВВ, такого как проницаемый ВВВ. В частности, ингибирование Ер-РЬА₂ можно определить, используя анализ ингибирования Ер-РЬА₂, например, но без ограничения, используя описываемый здесь биоанализ белка Ер-РЬА₂.

Используемый здесь термин Ер-РЬА₂ относится к белку-мишени, который ингибируют с помощью раскрытых здесь способов. Ер-РЬА₂ используется взаимозаменяемо с Ер-РЬА₂ и липопротеинассоциированной фосфолипазой А₂, также ранее известной в данной области техники как ацетилгидролаза тромбоцит-активирующего фактора (ацетилгидролаза РАР). Ер-РЬА₂ человека кодируется нуклеиновой кислотой, соответствующей № доступа И20157 (8ЕС ГО N0: 1) или идентификатору эталонной последовательности ΝΜ_005084 (8ЕС ΙΌ N0: 2), или Ер-РЬА₂ человека соответствует белковой последовательности, соответствующей № доступа №_005075 (8ЕС ГО N0: 3), которая описывается в патенте США № 5981252, который полностью включен сюда посредством ссылки.

Как здесь используются, выключение гена или выключенный ген относительно активности пРНК-интерферирующей молекулы, например малой интерферирующей РНК или микро-РНК, относится к снижению в клетке уровня мРНК для гена-мишени на по меньшей мере приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 99%, приблизительно 100% от уровня мРНК, обнаруживаемого в клетке в отсутствие малой интерферирующей РНК или молекулы для РНК-интерференции. В одном предпочтительном варианте осуществления уровни мРНК снижаются на по меньшей мере приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 99%, приблизительно 100%.

Используемый здесь термин молекула для РНК-интерференции относится к любому типу интерферирующей РНК, в том числе, но без ограничения, малой интерферирующей РНК, малой шпилечной РНК, эндогенной микро-РНК и искусственной микро-РНК. Например, он включает последовательности, ранее идентифицированные как малая интерферирующая РНК, независимо от механизма последующего процессинга РНК (т.е. хотя полагают, что малая интерферирующая РНК имеет специфический порядок ίη νίνο процессинга, приводящего к расщеплению мРНК, такие последовательности можно встроить в векторы в соединении с фланкирующими последовательностями, описанными здесь).

- 6 025527

Как здесь используется, малая интерферирующая РНК относится к нуклеиновой кислоте, которая образует двухцепочечную РНК, которая обладает способностью уменьшать или ингибировать экспрессию гена или гена-мишени, когда малая интерферирующая РНК присутствует или экспрессируется в той же клетке, что и ген-мишень, например, Ьр-РЬЛ₂. Малая интерферирующая РНК в виде двухцепочечной РНК может быть образована комплементарными цепями. В одном варианте осуществления малая интерферирующая РНК относится к нуклеиновой кислоте, которая может образовать двухцепочечную малую интерферирующую РНК. Последовательность малой интерферирующей РНК может соответствовать полноразмерному гену-мишени или его подпоследовательности. Как правило, длина малой интерферирующей РНК составляет по меньшей мере приблизительно 15-50 нуклеотидов (например, длина каждой комплементарной последовательности двухцепочечной малой интерферирующей РНК составляет приблизительно 15-50 нуклеотидов, а длина двухцепочечной малой интерферирующей РНК составляет приблизительно 15-50 пар оснований, предпочтительно приблизительно 19-30 пар оснований, предпочтительно 20-25 нуклеотидов, например, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов).

Как здесь используется, малая шпилечная РНК (также называемая петлей с ножкой) является типом малой интерферирующей РНК. В одном варианте осуществления эти малые шпилечные РНК состоят из короткой, например, длиной от приблизительно 19 до приблизительно 25 нуклеотидов, антисмысловой цепи, за которой следует нуклеотидная петля длиной от приблизительно 5 до приблизительно 9 нуклеотидов и аналогичная смысловая цепь. Альтернативно, смысловая цепь может быть перед нуклеотидной структурой петли, а затем может следовать антисмысловая цепь.

Термин микро-РНК означает эндогенные РНК, некоторые из которых, как известно, регулируют экспрессию кодирующих белки генов на посттранскрипционном уровне. Эндогенные микро-РНК представляют собой малые РНК, природно присутствующие в геноме, которые способны модулировать продуктивное использование мРНК. Термин искусственная микро-РНК включает любой тип последовательности РНК, отличный от эндогенной микро-РНК, который способен модулировать продуктивное использование мРНК. Последовательности микро-РНК были представлены в таких публикациях, как Вт е! а1., Сепек & Эеуе1ортеп!, 17, р. 991-1008 (2003), Вт е! а1., 8шепсе 299, 1540 (2003), Ьее апй АтЪгок, 8с1епсе, 294, 862 (2001), Ьаи е! а1., 8шепсе 294, 858-861 (2001), Ьадок-Ршйапа е! а1., Сиггеп! Вю1оду, 12, 735-739 (2002), Ьадок ОшШапа е! а1., 8аепсе 294, 853-857 (2001) и Ьадок-Ршйапа е! а1., ΚΝΑ, 9, 175-179 (2003), которые включены посредством ссылки. Множество микро-РНК можно также встроить в молекулу-предшественник. Кроме того, подобные микро-РНК петли с ножками можно экспрессировать в клетке в качестве носителя для доставки искусственной микро-РНК и малых интерферирующих РНК с целью модулирования экспрессии эндогенных генов через пути с участием микро-РНК или молекул для РНКинтерференции.

Как здесь используются, двухцепочечная РНК или дцРНК относятся к молекулам РНК, которые состоят из двух цепей. Двухцепочечные молекулы включают молекулы, состоящие из одной молекулы РНК, которая спаривается с самой собой с образованием двухцепочечной структуры. Например, структура петли и ножки молекул-предшественников, из которой происходит одноцепочечная микро-РНК, называемая пре-микроРНК (Ваг!е1 е! а1. 2004, Се11 116: 281-297), включает молекулу дцРНК.

Термины пациент, субъект и индивидуум используются здесь взаимозаменяемо и относятся к животному, в частности человеку, которому предоставляется лечение, в том числе профилактическое лечение. Используемый здесь термин субъект относится к человеку и не являющимся людьми животным. Термины не являющиеся людьми животные и не являющимся людьми млекопитающие используются здесь взаимозаменяемо и включают всех позвоночных, например, млекопитающих, таких как не являющиеся людьми приматы (в частности, высшие приматы), овца, собака, грызун (например, мышь или крыса), морская свинка, коза, свинья, кошка, кролики, коровы, и не являющихся млекопитающими животных, таких как куры, земноводные, рептилии и т.п. В одном варианте осуществления субъектом является человек. В другом варианте осуществления субъектом является экспериментальное животное или животное-заместитель в качестве модели заболевания.

Используемый здесь термин ген может быть геномным геном, включающим регулирующие транскрипцию, и/или трансляцию последовательности, и/или кодирующую область, и/или нетранслируемые последовательности (например, интроны, 5' - и 3'-нетранслируемые последовательности и регуляторные последовательности). Кодирующая область гена может быть нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность или функциональную РНК, такую как тРНК, рРНК, каталитическую РНК, малую интерферирующую РНК, микро-РНК и антисмысловую РНК. Ген может быть также мРНК или кДНК, соответствующей кодирующим областям (например, экзонам или микро-РНК), необязательно включающей связанные с кодирующими областями 5'- или 3'-нетранслируемые последовательности. Ген может также быть амплифицированной молекулой нуклеиновой кислоты, продуцированной ш уПго. включающей целиком или часть кодирующей области и/или связанные с ней 5' - или 3'нетранслируемые последовательности.

Используемый здесь термин нуклеиновая кислота или олигонуклеотид, или полинуклеотид может означать по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанных вместе. Как это будет понятно специалистам в данной области техники, изображение одной цепи также определяет последовательность

- 7 025527 комплементарной цепи. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает комплементарную цепь изображенной одной цепи. Также специалистам в данной области техники будет понятно, что множество вариантов нуклеиновой кислоты может использоваться с одной и той же целью в качестве заданной нуклеиновой кислоты. Следовательно, нуклеиновая кислота также включает, по существу, идентичные нуклеиновые кислоты и их комплементы. Как это будет понятно специалистам в данной области техники, одиночная цепь предусматривает зонд, который может гибридизоваться с последовательностьюмишенью в жестких условиях гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает зонд, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации.

Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными или могут содержать части и двухцепочечной, и одноцепочечной последовательности. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, как геномной, так и кДНК, РНК или гибридом, причем нуклеиновая кислота может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов и комбинации оснований, включающих урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин и изогуанин. Нуклеиновые кислоты можно получить с помощью способов химического синтеза или рекомбинантных способов.

Нуклеиновая кислота будет, как правило, содержать фосфодиэфирные связи, хотя могут быть включены аналоги нуклеиновых кислот, которые могут иметь по меньшей мере одну отличную связь, например, фосфорамидатную, фосфоротиоатную, фосфородитиоатную или О-метилфосфорамидатную связи и пептидонуклеиновые основы и связи. Другие нуклеиновые кислоты-аналоги включают нуклеиновые кислоты с положительно заряженными остовами, неионными остовами и не содержащими рибозу остовами, в том числе те, которые описываются в патентах США № 5235033 и 5034506, которые включены посредством ссылки. Нуклеиновые кислоты, содержащие один или несколько не встречающихся в природе или модифицированных нуклеотидов, также включены в определение нуклеиновых кислот. Модифицированный нуклеотидный аналог может располагаться, например, на 5'-конце и/или 3'-конце молекулы нуклеиновой кислоты. Репрезентативные примеры нуклеотидных аналогов можно выбрать из рибонуклеотидов с модифицированным сахаром или образующим остов элементом. Однако следует отметить, что также подходят рибонуклеотиды с модифицированным нуклеиновым основанием, т.е. рибонуклеотиды, содержащие вместо встречающегося в природе нуклеинового основания не встречающееся в природе нуклеиновое основание, такое как модифицированные по 5-положению уридины или цитидины, например, 5-(2-амино)пропилуридин, 5-бромуридин, модифицированные по 8-положению аденозины и гуанозины, например, 8-бромгуанозин, деазануклеотиды, например, 7-деазааденозин, О- и Ν-алкилированные нуклеотиды, например, №-метиладенозин. 2'ОН-группу можно заменить группой, выбираемой из Н, ОК, К, галогена, §Н, §К, ΝΗ₂, ΝΗΚ, ΝΚ₂ или С^ где К представляет собой С-С6 алкил, алкенил или алкинил, а галоген представляет собой Р, С1, Вг или I. Модификации рибозофосфатного остова можно проводить по множеству причин, например, для увеличения стабильности и полупериода существования таких молекул в физиологических окружающих условиях или в качестве зондов на биочипах. Могут быть приготовлены смеси встречающихся в природе нуклеиновых кислот и аналогов, альтернативно, могут быть приготовлены смеси различных аналогов нуклеиновых кислот и смеси встречающихся в природе нуклеиновых кислот и аналогов.

Используемый здесь термин вектор относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей начало репликации. Вектор может быть плазмидой, бактериофагом, бактериальной искусственной хромосомой или дрожжевой искусственной хромосомой. Вектор может быть вектором в виде ДНК или РНК. Вектор может быть или самореплицирующимся экстрахромосомным вектором, или вектором, который интегрируется в геном хозяина.

Используемый здесь термин лечение включает уменьшение или ослабление по меньшей мере одного отрицательного действия или симптома состояния, заболевания или нарушения, связанного с проницаемым ВВВ, и/или сосудистой деменции, и/или болезни Альцгеймера. Как здесь используется, термин лечение используется для ссылки на ослабление (уменьшение) симптома и/или биохимического маркера болезни Альцгеймера по меньшей мере на 10%. Например, но без ограничения, уменьшение биохимического маркера болезни Альцгеймера, например, уменьшение отложения амилоидных бляшек, на 10% или уменьшение активации глиальных клеток, например, уменьшение клеток, зкспрессирующих СРАР, на 10% могло бы считаться эффективным лечением с помощью раскрытых здесь способов. В качестве альтернативных примеров, ослабление симптома, например, замедление скорости потери памяти, на 10% или остановка ухудшения памяти, или уменьшение утраты памяти на 10%, или улучшение памяти на 10% могло бы также считаться эффективным лечением с помощью раскрытых здесь способов.

Используемый здесь термин эффективное количество относится к количеству терапевтического агента фармацевтической композиции, которое ослабляет или прекращает по меньшей мере один симптом заболевания или нарушения, например, симптом или нарушение нарушенного ВВВ или сосудистой деменции. Например, эффективным количеством при использовании раскрытых здесь способов могло бы считаться количество, достаточное для ослабления симптома заболевания или нарушения, например, сосудистой деменции или проницаемости ВВВ, на по меньшей мере 10%. Как здесь используется, эффективное количество могло бы включать также количество, достаточное для предупреждения или отсрочки развития симптома заболевания, изменения течения симптома заболевания (например, но без ог- 8 025527 раничения, замедления прогрессирования симптома заболевания) или реверсирования симптома заболевания.

Используемые здесь термины назначение и введение используются взаимозаменяемо и имеют отношение к размещению раскрытых здесь агентов, которые ингибируют Ьр-РЬА₂, в организме субъекта с помощью способа или пути, результатом которого является по меньшей мере частичная локализация агентов в желаемом месте. Соединения настоящего изобретения можно вводить с помощью любого подходящего пути, который приводит к эффективному лечению субъекта.

Термин векторы используется взаимозаменяемо с плазмидой для ссылки на молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Векторы, способные управлять экспрессией генов и/или последовательности нуклеиновой кислоты, с которой они функционально связаны, упоминаются здесь как экспрессионные векторы. Как правило, экспрессионные векторы, применяемые в методах рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид, которые относятся к кольцевым двухцепочечным петлевым ДНК-фрагментам, которые в своей векторной форме не связаны с хромосомой. В отличных вариантах осуществления настоящего изобретения могут использоваться другие экспрессионные векторы, например, но без ограничения, плазмиды, эписомы, бактериофаги или вирусные векторы, и такие векторы могут интегрироваться в геном хозяина или автономно реплицироваться в конкретной клетке. Можно также использовать другие формы экспрессионных векторов, известных квалифицированным в данной области техники специалистам, которые выполняют эквивалентные функции. Экспрессионные векторы включают экспрессионные векторы для постоянной или временной экспрессии кодирующей ДНК.

Артикли а и ап используются здесь при упоминании одного или более чем одного (т.е. по меньшей мере одного) грамматического элемента артикля. В виде примера, ап е1етеп1 означает один элемент или более чем один элемент.

Ьр-РЬА₂: Общая информация

Ьр-РЬА₂, также упоминаемая в данной области техники под альтернативными названиями Ьр-РЬА₂, ТОТ-РЬА₂, липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А₂ РЬА2О7, фосфолипаза А2 (группы VII) или ацетилгидролаза тромбоцит-активирующего фактора (ацетилгидролаза РАТ или РАТАН). Ьр-РЬА₂ человека кодируется нуклеиновой кислотой, соответствующей № доступа в ОепВапк: И20157 (ЗЕЦ ГО N0: 1) или идентификатору эталонной последовательности ΝΜ_005084 (ЗЕЦ ГО N0: 2), и Тр-РЬЛ₂ человека соответствует белковой последовательности, соответствующей № доступа в ОепВапк: №_005075 (ЗЕЦ ГО N0: 3), которая описывается в патенте США № 5981252, который полностью включен сюда посредством ссылки.

Липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А₂ (Ур-РкАз), ее последовательность, выделение и очистка, выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие фермент, и рекомбинантные клетки-хозяева, трансформированные ДНК, кодирующей фермент, описываются в заявке У0 95/00649 (ЗтДЬК1ше ВеесЬат РЬС), которая полностью включена сюда посредством ссылки. Этот фермент далее описывается в последующей публикации той же группы (Тете Ό. е1 а1., Айегюкскг ТЬготЬ. Vа5. Вю1. 1996: 16, 591-599), в которой он упоминается как кЭк-РкАз, и в более поздней заявке на патент (\У0 95/09921, 1сок СогрогаЧоп) и родственной публикации в №йиге (Т)ое1кег е1 а1., уо1. 374, 6 Арп1 1995, 549) описывается фермент РАТ-АН, который имеет по существу такую же последовательность, что и кр-РкА₂.

Установлено, что кр-РкА₂ ответственна за превращение фосфатидилхолина в лизофосфатидилхолин, во время превращения липопротеина низкой плотности (Юк) в его окисленную форму. Известно, что этот фермент гидролизует образованный по механизму кп-2 сложный эфир окисленного фосфатидилхолина с предоставлением лизофосфатидилхолина и окислительно-модифицированной жирной кислоты. Оба продукта действия кр-РкА₂ являются биологически активными, при этом лизофосфатидилхолин, в частности, обладает несколькими проатерогенными активностями, приписываемыми ему, включающими хемотаксис моноцитов и индукцию эндотелиальной дисфункции, обе из которых способствуют аккумуляции происходящих из моноцитов макрофагов в стенке артерии.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что животные, подверженные нарушениям, характеризующимся просачиванием через ВВВ, как установлено, демонстрируют ненарушенный ВВВ и уменьшение признаков проницаемости ВВВ после лечения ингибитором кр-РкА₂. Такие животные, подвергнутые лечению ингибитором кр-РкА₂, также демонстрировали уменьшение признаков сосудистой деменции и уменьшение отложения бета-амилоида в ткани головного мозга и в кровеносных сосудах, проходящих через головной мозг, по сравнению с животными, не подвергнутыми лечению этим ингибитором. Следовательно, ингибиторы кр-РкА₂ могут использоваться для лечения и/или предотвращения заболеваний и нарушений, характеризующихся проницаемостью ВВВ, например, но без ограничения, нейродегенеративных заболеваний. Примеры нейродегенеративных заболеваний, поддающихся лечению и/или предотвращению, используя раскрытые здесь способы, включают, но без ограничения, сосудистую деменцию, болезнь Алыдгеймера и другие нейродегенеративные заболевания, например, болезнь Хантингтона и болезнь Паркинсона.

- 9 025527

Агенты, которые ингибируют Ьр-РЬА₂

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к ингибированию ЬрРЬА₂. В некоторых вариантах осуществления ингибированием является ингибирование транскриптов нуклеиновых кислот, кодирующих Ьр-РЬА₂, например ингибирование информационной РНК (мРНК). В альтернативных вариантах осуществления ингибированием Ьр-РЬА₂ является ингибирование экспрессии и/или ингибирование активности продукта гена Ьр-РЬА₂, например полипептида или белка Ьр-РЬА₂ или его изоформ. Используемый здесь термин продукт гена относится к РНК, транскрибированной с гена, или полипептиду, кодированному геном или транслированному с РНК.

В некоторых вариантах осуществления ингибирование Ьр-РЬА₂ осуществляется с помощью агента. Можно использовать любой агент, например, но без ограничения, нуклеиновые кислоты, аналоги нуклеиновых кислот, пептиды, фаг, фагемиды, полипептиды, пептидомиметики, рибозимы, аптамеры, антитела, малые или большие органические или неорганические молекулы или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления агенты, применимые в способах настоящего изобретения, включают агенты, которые функционируют в качестве ингибиторов экспрессии Ьр-РЬА₂, например ингибиторов мРНК, кодирующей Ьр-РЬА₂.

Агенты, применимые в раскрытых здесь способах, могут также ингибировать экспрессию гена (т.е. подавлять экспрессию гена).

Такие агенты упоминаются в данной области техники как выключатели гена и широко известны специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники. Примеры включают, но без ограничения, последовательность нуклеиновой кислоты, например, РНК, ДНК или аналог нуклеиновой кислоты, которая может быть одноцепочечной или двухцепочечной и может выбираться из группы, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес белок, олигонуклеотиды, нуклеиновые кислоты, аналоги нуклеиновых кислот, например, но без ограничения, пептидонуклеиновую кислоту (ПНК), псевдокомплементарную ПНК, закрытую нуклеиновую кислоту и их производные и т.п. Агенты в виде нуклеиновых кислот также включают, например, но без ограничения, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки, которые действуют в качестве репрессоров транскрипции, антисмысловые молекулы, рибозимы, небольшие ингибиторные последовательности нуклеиновых кислот, например, но без ограничения, молекулу для РНК-интерференции, малую шпилечную РНК, малую интерферирующую РНК, микро-РНК, антисмысловые олигонуклеотиды и т.п.

Как здесь используется, агентами, применимыми в способе настоящего изобретения в качестве ингибиторов экспрессии Тр-РЬА₂ и/или ингибиторов функции белка Ьр-РЬА₂, могут быть молекулы любого типа, например, но без ограничения, химические продукты, последовательности нуклеиновых кислот, аналоги нуклеиновых кислот, белки, пептиды или их фрагменты. В некоторых вариантах осуществления агентом является какой-либо химический продукт, молекула или составляющая, включающий, без ограничения, синтетические и встречающиеся в природе небелковоподобные молекулы. В некоторых вариантах осуществления агентом является малая молекула, имеющая химическую составляющую. Например, в некоторых вариантах осуществления химической составляющей является раскрытое здесь соединение, в основе которого лежит пиримидион.

В альтернативных вариантах осуществления агентами, применимыми в раскрытых здесь способах, являются белки и/или пептиды или их фрагменты, которые ингибируют экспрессию гена Тр-РЬА₂ или функцию белка Ьр-РЬА₂. Такие агенты включают, например, но без ограничения, варианты белка, мутированные белки, терапевтические белки, усеченные белки и фрагменты белков. Белковые агенты могут также выбираться из группы, включающей мутированные белки, созданные методами генетической инженерии белки, пептиды, синтетические пептиды, рекомбинантные белки, химерные белки, антитела, мидитела, минитела, триатела, гуманизированные белки, гуманизированные антитела, химерные антитела, модифицированные белки и их фрагменты.

Альтернативно, агентами, применимыми в раскрытых здесь способах в качестве ингибиторов ЬрРЬА₂, могут быть химические продукты, малая молекула, большая молекула, или целиком, или ее составляющая, в том числе, без ограничения, синтетические и встречающиеся в природе небелковоподобные молекулы. В некоторых вариантах осуществления агентом является раскрытая здесь малая молекула, имеющая химические составляющие.

Малые молекулы

В некоторых вариантах осуществления агентами, которые ингибируют Тр-РЬА₂, являются малые молекулы. В способах настоящего изобретения могут использоваться необратимые или обратимые ингибиторы Ьр-РЬА₂.

Необратимые ингибиторы Тр-РЬА₂ описываются в заявках на патенты АО 96/13484, АО 96/19451, АО 97/02242, АО 97/217675, АО 97/217676, АО 97/41098 и АО 97/41099 (8тйЬК1ше ВеесЬат РЬС), которые полностью включены сюда посредством ссылки, и в которых описываются, в числе прочего, различные экспериментальные серии соединений 4-тионил/сульфинил/сульфонилазетидинона, которые являются ингибиторами фермента Ьр-РЬА₂. Они являются необратимыми, ацилирующими ингибиторами (Тете е! а1., ВюсНепиЦгу. 37, 10087, 1998).

Ингибиторы Тр-РЬА₂, эффективные для людей, широко известны специалистам со средним уров- 10 025527 нем компетентности и включают ингибиторы, подвергающиеся оценке, например, подвергающиеся преклинической и клинической оценке, в том числе клиническим испытаниям фазы II. Ряд заявок был подан и опубликован ЗтИЬКПие ВеесЬат и его правопреемником О1ахо8тИЬК1ше.

Списком релевантных опубликованных заявок, переуступленных ему, является АО 01/60805, АО 02/30904, АО 03/016287, АО 00/66567, АО 03/042218, АО 03/042206, АО 03/042179, АО 03/041712, АО 03/086400, АО 03/087088, АО 02/30911, АО 99/24420, АО 00/66566, АО 00/68208, АО 00/10980 и АО 2005/021002, которые полностью включены сюда посредством ссылки. Кроме того, приводится ссылка на предварительные заявки на патенты США 60/829328 и 60/829327, обе из которых были поданы 13 октября 2006, которые полностью включены сюда посредством ссылки.

Другие ингибиторы Ьр-РЬЛ₂, применимые в раскрытых здесь способах, описываются в опубликованных заявках на патенты, например, АО 2006063791-А1, АО 2006063811-А1, АО 2006063812-А1, АО 2006063813-А1, все на имя Вауег НеаИЬсате, и И82006106017-А1, переуступленной Когеа Ке8. Ιηδΐ. Вю8С1еисе & Вю1есЬио1оду, которые полностью включены сюда посредством ссылки. Ингибиторы Ьр-РЬА₂также включают известные агенты, например, но без ограничения, включают применение статинов с ниацином (см. тетете.депепдпете8.сот/иете8/Ьт1ет.а8рх?иате=6724568) и фенофибратом (см. \у\у\у.8еиеидие\У5.со1п/ие\У5/Ьш1ет.а5рх?иа1пе=14817756&1ах10=19).

Все заявки, представленные выше, включены сюда посредством ссылки. Полагают, что любое и все соединения, описанные в этих документах, пригодны для профилактики или лечения нейродегенеративных заболеваний и нарушений, в том числе, например, но без ограничения, сосудистой деменции и болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний, описанных в этом документе, при которых встречается нарушенный ВВВ. Описанная здесь модель проницаемости ВВВ и нейродегенеративного заболевания на свинье, приведенная в качестве примера в Примерах, может использоваться специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники для определения того, какое из описанных соединений или других ингибиторов Ьр-РЬА₂, например, антител, или молекул для РНКинтерференции, является эффективным для лечения или предупреждения нейродегенеративных заболеваний или нарушений, как здесь заявлено. В некоторых вариантах осуществления агенты, ингибирующие Ьр-РЬА₂, можно оценить в моделях на животных для определения эффекта на облегченную проницаемость ВВВ. Например, можно использовать описанную здесь в примерах модель гипергликемии и гиперхолестеринемии на свинье, в которой проницаемость ВВВ является аномальной, например, ВВВ является проницаемым, используя которую проницаемость ВВВ можно оценить в присутствии и в отсутствие ингибиторов Ьр-РЬА₂ с помощью способов, широко известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления можно использовать индикаторы функционирования ВВВ, например, как описывается в патенте США № 6884591, который полностью включен посредством ссылки.

В конкретном варианте осуществления ингибиторы Ьр-РЬА₂, описанные в патентах США № 6649619 и 7153861, которые полностью включены сюда посредством ссылки (и международная заявка АО 01/60805), и в патенте США № 7169924, который полностью включен сюда посредством ссылки (и международная заявка на патент АО 02/30911), применимы в раскрытых здесь способах для профилактики или для лечения сосудистой деменции, например болезни Альцгеймера и/или нарушений проницаемости ВВВ. В некоторых вариантах осуществления ингибиторы Ьр-РЬА₂, описанные в публикации заявки на патент США № 20005/0033052А1, которая полностью включена сюда посредством ссылки, и в международных заявках на патенты АО 02/30904, АО 03/042218, АО 03/042206, АО 03/042179, АО 03/041712, АО 03/086400 и АО 03/87088, являются обратимыми ингибиторами Ьр-РЬА₂.

Формула (I):

Можно использовать группу обратимых ингибиторов Ьр-РЬА₂, которые описываются в международной заявке АО 01/60805, из которой произошли патенты США № 6649619 и 7153861, которые полностью включены сюда посредством ссылки, полное раскрытие которых включено сюда, как если бы оно было представлено в этом документе. Более узкой группой представляющих интерес соединений являются соединения формулы (I), описанные в АО 01/60805 и заявленные в патентах США № 6649619 и 7153861, а именно

где

К^а и К^Ь вместе с атомами углерода пиримидинового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное 5-членное карбоциклическое кольцо;

- 11 025527

К² представляет собой фенил, замещенный одним-тремя атомами фтора;

К³ представляет собой метил или С(_1-3)алкил, замещенный МК⁸К⁹; или

К³ представляет собой Не1-С(_0-2)алкил, в котором Не( представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, имеющее Ν, и в котором N не замещен или замещен С(1_-6)алкилом;

К⁴ и К⁵ вместе образуют составляющую 4-(4-трифторметилфенил)фенил;

К⁸ и К⁹, которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают из группы, состоящей из водорода и С(_1-6)алкила;

X представляет собой 8, или их фармацевтически приемлемая соль.

Еще больший интерес представляют следующие соединения, все из которых подпадают под формулу (I) и описываются в заявке и патентах, отмеченных выше:

1-(Ν-(2-диэтиламино)этил)-Ν-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он, использованный в описанном здесь исследовании на свинье;

1-(Ν-(2-диэтиламино)этил)-Ν-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонияметил)-2-(2,3дифторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;

1-(И-(2-диэтиламино)этил)-Ν-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонияметил)-2-(3,4дифторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;

1- (Ν-(2-диэтиламино)этил)-Ν-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(2,3,4трифторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он;

1-(Ν-(2-диэтиламино)этил)-Ν-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(2фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;

1-(Ν-метил-Ы-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;

1-(Ν-(2-(1-пиперидино)этил)-Ν-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;

1-(И-(1-этилпиперидин-4-ил)-Ν-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;

1-(Ν-(2-этиламино-2-метилпропил)-Ν-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он, (Ы-(2-трет-бутиламиноэтил)-Ν-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он;

1-(Ν-(1-метилпиперидин-4-ил)-Ν-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он;

1-(Ν-(1-изопролИлпиперидин-4-ил)-Ν-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;

1-(Ν-(1-(2-метоксиэтил)пипериДин-4-ил)-Ν-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;

1-(Ν-(2-(этиламино)этил)-И-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;

- 12 025527 или фармацевтически приемлемая соль этих соединений.

Способы приготовления этих соединений описываются в отмеченных документах.

Второй способ получения 1-(Ы-(2-(диэтиламино)этил)-М-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-она можно найти в заявке \УО 03/016287 (публикации заявки на патент США № 20050014793А1), которая полностью включена сюда посредством ссылки.

Формула (II):

Дальнейшая группа соединений, которые можно использовать при осуществлении на практике способов настоящего изобретения, описывается в \УО 02/30911, патент США № 7169924 соответствует этой международной заявке. И заявка, и патент включены сюда полностью. В этом случае общей формулой, представленной здесь как формула (II), является следующая формула:

где

К¹ представляет собой арильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из С(1_-6)алкила, С(1-₆)алкокси, С(1_-6)алкилтио, гидрокси, галогена, ί',’Ν и от монофтор-С(1_-4)алкила до перфтор-С(1_-4)алкила;

К² представляет собой галоген, С(_1-3)алкил, С(1_-3)алкокси, гидроксиС^алкил, С(1_-3)алкилтио, С(_1-3)алкилсульфинил, аминоС(1_-3)алкил, моно- или ди-С(_1-3)алкиламиноС(_1-3)алкил, С(_1-3)алкилкарбониламиноС(_1-3)алкил, С(1_-3)алкоксиС(1_-3)алкилкарбониламиноС(1_-3)алкил, С(_1-3)алкилсульфониламиноС(_1-3)алкил, С(_1-3)алкилкарбокси, С(₁₃)алкилкарбоксиС(_1-3)алкил, и

К³ представляет собой водород, галоген, С(_1-3)алкил или гидроксиС(_1-3)алкил; или

К² и К³ вместе с атомами углерода пиримидинового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденированное 5- или 6-членное карбоциклическое кольцо; или

К² и К³ вместе с атомами углерода пиримидинового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденированное бензо- или гетероарильное кольцо, необязательно замещенное 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из галогена, С(_1-4)алкила, циано, С(_1-6)алкокси, С(_1-6)алкилтио или от монофтор-С(_1-3)алкила до перфтор-С(_1-4)алкила;

К⁴ представляет собой водород, С(1-6)алкил, который может быть не замещен или замещен 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из гидрокси, галогена, ОК⁷, СОК⁷, карбокси, СООК⁷, ΦΌΝΕ⁹^⁰, ΝΕΕ¹⁰, ΝΕ^ΟΗ.⁸, моно- или ди-(гидроксиС(1-6)алкил)амино и ^гидроксиС(_1-3)алкил-^С(_1-6)алкиламино; или

К⁴ представляет собой Не1-С(0-4)алкил, в котором Не! представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, включающее N и необязательно О или 8, и в котором N может быть замещен СОК⁷, СООК⁷, 03^¾¹⁰ или С(1 -6)алкилом, необязательно замещенным 1, 2 или 3 заместителями, и выбраны из гидрокси, галогена, ОК⁷, СОК⁷, карбокси, СООК⁷, ί'ΌΝΕΕ¹⁰ или NΕ⁹К¹⁰, например, пиперидин-4-илом, пирролидин-3 -илом;

К⁵ представляет собой арильное или гетероарильное кольцо, необязательно замещенное 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из С(_1-6)алкила, С(₁₆)алкокси, С(_1-6)алкилтио, арилС(_1-6)алкокси, гидрокси, галогена, ΟΝ, СОК⁷, карбокси, СООК⁷, МК⁷СОК⁸

СОНКЕ¹⁰, 8Ο₂NΕ⁹Ε¹⁰

ЯКЕ¹⁰, от монофтор-С(1-4)алкила до перфтор-С(1-4)алкила и от монофтор-С(1-4)алкокси до перфтор-С(1-4)алкокси;

К⁶ представляет собой арильное или гетероарильное кольцо, которое дополнительно необязательно замещено 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, выбираемыми из С(1-18)алкила, С(1-18)алкокси, С(1-6)алкилтио, С(1-6)алкилсульфонила, арилС(1-6)алкокси, гидрокси, галогена, ΌΝ, СОК⁷, карбокси, СООК⁷, СΟNΕ⁹Ε¹⁰, NΕ⁷СΟК⁸, 8ОЛКЕ , ИКЕОЕ⁸, \'Ю' , от монофтор-С₍₁₄)алкила до перфтор-С(_1-4)алкила и от монофтор-С(_1-4)алкокси до перфтор-С(_1-4)алкокси, или С(_5-10)алкил;

К⁷ представляет собой водород или С(_1-12)алкил, например, С(_1-4)алкил (например, метил или этил);

К⁸ представляет собой водород, ОС(_1-6)алкил или С(_1-12)алкил, например, С(_1-4)алкил (например, метил или этил);

К⁹ и К¹⁰, которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают, каждый, из водорода или С(112)алкила, или К⁹ и К¹⁰ вместе с азотом, с которому они присоединены, образуют 5-7-членное кольцо, необязательно содержащее один или несколько дополнительных гетероатомов, выбранных из кислорода, азота и серы, и необязательно замещенное одним или двумя заместителями, выбранными из гидрокси, оксо, С(1-4)алкила, С(_1-4)алкилкарбокси, арила, например фенила, или аралкила, например бензила, например морфолина или пиперазина; и

- 13 025527

X представляет собой С(_2-4)алкилен, необязательно замещенный 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из метила и этила, или СН=СН.

В способе лечения настоящего изобретения можно также использовать все соли соединений формулы (II).

Особый интерес представляют соединения формулы (II) здесь, в которых, как отмечено в \УО 02/30911 для формулы (I) там, К¹ может быть фенильной группой, необязательно замещенной 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, выбранными из галогена, С(1_-6)алкила, трифторметила или С(1_-6)алкокси. Конкретнее, фенил является незамещенным или замещенным 1, 2, 3 или 4 заместителями-галогенами, в частности 1-3 группами фтора, а конкретнее, К¹ является 2,3дифторфенилом, 2,4-дифторфенилом или 4-фторфенилом.

Дальнейшим вариантом формулы (II) здесь является вариант, в котором X представляет собой -СН2СН2-.

Кроме того, интерес представляют соединения формулы (II), в которых К² представляет собой водород, по умолчанию, или галоген, С(1-6)алкил, от монофтор-С(1-4)алкила до перфтор-С(1-4)алкила, от монофтор-С(1-4)алкокси до перфтор-С(1-4)алкокси или С,-1-6,алкокси, особенно от монофтор-С(1-4)алкила до перфтор-С(1-4)алкила, от монофтор-С1-4,алкокси до перфтор-С,-1-.1,алкокси или С(1-6,алкокси. Особый интерес представляют соединения формулы (II), в которых К² отличен от водорода, п в (К²)п равно 1, 2 или 3, и характером замены является мета и/или пара, особенно пара, т.е. заместитель в 4-положении. См. также те соединения, в которых К² является 4-трифторметилом или 4-трифторметокси.

К³ и К⁴ могут быть одинаковыми или разными и представляют собой метил, этил, н-пропил или нбутил. Особый интерес представляют соединения формулы (II) здесь, в которых К³ и К⁴ являются одинаковыми и представляют собой метил или этил, метил представляет особый интерес.

К⁵ может быть водородом, С(1_-6)алкилом, который является неразветвленным или разветвленным. Особый интерес представляет метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил, т-бутил, нпентил или н-гексил.

Будет понятно, что в пределах соединений формулы (II) существует дополнительная подгруппа соединений, в которых

К¹ представляет собой 2,3-дифторфенил;

К² и К³ вместе с атомами углерода пиримидинового кольца, к которым они присоединены, образуют слитое 5-членное циклопентенильное кольцо;

К⁴ представляет собой 2-(диэтиламино)этил;

К⁵ представляет собой фенил;

К⁶ представляет собой фенил, замещенный трифторметилом в 4-положении, или тиен-2-ил, замещенный трифторметилом в 5-положении; и

X представляет собой (СН₂)₂.

Конкретными соединениями формулы (II), представляющими здесь интерес, являются Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;

Н-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-{2-(2,3-дифторфенил)этил)-4оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2 -этиламино-2-метилпропил)-2-(2-{2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин1-ил)-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида Ситартрат;

Ν-(2 -трет-бутиламиноэтил)-2-(2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)- 14 025527

4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-(2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(4-фтор-2(трифторметил)фенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-Ν-(4'-трифторметилбифенил4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν- (2-диэтиламинозтил)-2-(2-(2-(4-фтор-З(трифторметил)фенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-Ν-(4'-трифторметилбифенил4-илметил)ацетамида битартрат;

Ы- (2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(З-хлор-4-фторфенил)этил)-4 оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-Ν-{4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

(+/-)-Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-фенилпропил)-4-оксо4.5.6.7- тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(2,4-дифторфенил)этил)-4оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-И-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(2,5-дифторфенил)этил)-4оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(3,4-дифторфенил)этил)-4оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-К-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(2-фторфенил)этил)-4-оксо4.5.6.7- тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-Ν-{4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;

Ν-(2-дизтиламиноэтил)-2-(2-(2-(3-фторфенил)этил)-4-оксо4.5.6.7- тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(3-хлорфенил)этил)-4-оксо4.5.6.7- тетрадидроциклопентапиримидин-1-ил)-Ν-{4'- 15 025527 трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(4-хлорфенил)этил)-4-оксо4.5.6.7- тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-И-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;

Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(4-метилфенил)этил)-4-оксо4.5.6.7- тетрагидроциклолентапиримидин-1-ил)-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;

Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(4(трифторметил)фенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-И-(4'-трифторметилбифенил4-илметил)ацетамид;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(4-метоксифенил)этил)-4оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-Ν-(4’трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(4(трифторметокси)фенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-Ν-(4'-трифторметилбифенил4-илметил)ацетамида битартрат;

или свободное основание любой из солей битартратов, или другая фармацевтически приемлемая соль.

Кроме того, представляют интерес соединения формулы (III), описанные в \νϋ 02/30904:

где

К¹ представляет собой арильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из С(₁_б)алкила, С(_1-6)алкокси, С(₁_б)алкилтио, гидрокси, галогена, ΟΝ, от монофтор-С(_1-4)алкила до перфтор-С(_1-4)алкила, от монофтор-С(_1-4)алкоксиарила до перфтор-С(_1-4)алкоксиарила и арилС(_1-4)алкила;

К² представляет собой галоген, С(_1-3)алкил, С(_1-3)алкокси, гидроксиС(_1-3)алкил, С(_1-3)алкилтио, С(_1-3)алкилсульфинил, аминоС(_1-3)алкил, моно- или ди-С(_1-3)алкиламиноС(_1-3)алкил, С(_1-3)алкилкарбониламиноС(_1-3)алкил, С(_1-3)алкоксиС(_1-3)алкилкарбониламиноС(_1-3)алкил, С(_1-3)алкилсульфониламиноС(_1-3)алкил, С(_1-3)алкилкарбокси, С(_1-3)алкилкарбоксиС(_1-3)алкил, и

К² и К³ вместе с атомами углерода пиридонового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное 5- или 6-членное карбоциклическое кольцо; или

К² и К³ вместе с атомами углерода пиридонового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное бензо- или гетероарильное кольцо, необязательно замещенное 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из галогена, С(_1-4)алкила, циано, С(_1-3)алкоксиС(_1-3)алкила, С(_1-4)алкокси или С(_1-4)алкилтио, или от монофтор-С(_1-4)алкила до перфтор-С(_1-4)алкила;

К⁴ представляет собой водород, С(1-6)алкил, который может быть не замещен или замещен 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из гидрокси, галогена, ОК⁷, СОК⁷, карбокси, СООК⁷, ^ΝΕ,Ή¹⁰, ΝΕ⁹Ε¹⁰, Ν^ΉΟΕ⁸, моно- или ди- (гидроксиС(1-6)алкил)амино и ^гидроксиС(_1-6)алкил^-С(_1-6)алкиламино; или

К⁴ представляет собой Не1-С(_0-4)алкил, в котором Не! представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, включающее N и необязательно О или 8, и в котором N может быть замещен СОК⁷, _(1-6)алкилом, необязательно замещенным 1, 2 или 3 заместителями, выбранными

СООК⁷, ί.ΌΝΕ⁹Ε¹⁰ или С₍

СОК⁷, карбокси, СООК⁷,

ί.ΌΝΕ⁹Ε¹⁰ или νεΉ¹⁰, например, пиперидин-4из гидрокси, галогена, ОК⁷илом, пирролидин-3-илом;

К⁵ представляет собой арильное или гетероарильное кольцо, необязательно замещенное 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из С(1-6)алкила, С(1-6)алкокси, С(_1-6)алкилтио, арилС(_1-6)алкокси, гидрокси, галогена, ΟΝ, СОК⁷, карбокси, СООК⁷, ΝΕ⁷ί.ΌΕ^χ ί-ΌΝΕ^Ε¹⁰, 8О^Е⁹К¹⁰

ΝΚ 8О_;К\ ΝΕ⁹Ε¹⁰, от монофтор-С(_1-4)алкила до перфтор-С(_1-4)алкила и от моно- 16 025527 фтор-С(1_-4)алкокси до перфтор-С(1_-4)алкокси;

К⁶ представляет собой арильное или гетероарильное кольцо, которое дополнительно необязательно замещено 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из С(1-е4алкила, С,4-6,алкокси. С^^алкилтио, С(1-6)алкилсульфонила, арилС,4-6,алкокси. гидрокси, галогена, ΟΝ, С0К⁷, карбокси, С00К⁷, ^ΝΚκ¹⁰, ΝΚά'ΌΚ⁸, §Ο2ΝΚ⁹Κ¹⁰, ΝΚ⁷δ02Κ⁸, ΝΚ'Κ¹⁰, от монофтор-С малкила до перфторС(1-4)алкила и от монофтор-С _малкокси до перфтор-С(_1-4)алкокси, или С _5-1₀,алкила;

К⁷ и К⁸ независимо представляют собой водород или С(_1-12)алкил, например, С_|4-.₄,алкил (например, метил или этил);

К⁹ и К¹⁰, которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают, каждый, из водорода или Сц^у алкила, или К⁹ и К¹⁰ вместе с азотом, с которому они присоединены, образуют 5-7-членное кольцо, необязательно содержащее один или несколько дополнительных гетероатомов, выбираемых из кислорода, азота и серы, и необязательно замещенное одним или двумя заместителями, выбираемыми из гидрокси, оксо, С(1_-4)алкила, С(1_-4)алкилкарбокси, арила, например фенила, или аралкила, например бензила, например морфолина или пиперазина; и

X представляет собой С(_2-4)алкиленовую группу (необязательно замещенную 1, 2 или 3 заместителями, выбираемыми из метила и этила), СН=СН, (СН₂)_п§ или (СН₂)_п0, где η равно 1, 2 или 3;

или их фармацевтически приемлемая соль.

Особый интерес представляют соединения формулы (III), в которых К² и К³ вместе с атомами углерода пиридонового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное бензо- или гетероарильное кольцо, необязательно замещенное 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, выбираемыми из галогена, С(1-4)алкила, циано, С(1-4)алкокси или С(1-4)алкилтио, или от монофтор-С(1-4)алкила до перфтор-С(1-4)алкила. Предпочтительно К¹ представляет собой фенил, необязательно замещенный галогеном, С(1-6)алкилом, трифторметилом, С(_1-6)алкокси, предпочтительно 1-3 фторами, более предпочтительно К¹ является 2,3-дифторфенилом.

Репрезентативные примеры К⁴ включают пиперидин-4-ил, замещенный в 1-положении метилом, изопропилом, 1-(2-метоксиэтилом), 1-(2-гидроксиэтилом), трет-бутоксикарбонилом или этоксикарбонилметилом; этил, замещенный во 2-положении аминоэтилом; 1-этилпиперидинилметил; пиперидин-4ил; 3-диэтиламинопропил; 4-пирролидин-1-илбутил и 1-этилпирролидин-3-ил. Предпочтительно К⁴представляет собой 1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил, 1-метилпиперидин-4-ил или 1-этилпирролидин-3ил. Репрезентативные примеры К⁵ включают фенил и пиридил. Предпочтительно К⁵ представляет собой фенил. Репрезентативные примеры К⁶ включают фенил, необязательно замещенный галогеном или трифторметилом, предпочтительно в 4-положении, и гексил. Предпочтительно К⁶ представляет собой фенил, замещенный трифторметилом в 4-положении. Дополнительные репрезентативные примеры К⁶включают фенил, замещенный 1 или несколькими С(1-3)алкилами. Предпочтительно К⁶ представляет собой фенил, замещенный этилом в 4-положении. Предпочтительно К⁵ и К⁶ вместе образуют заместитель 4-(фенил)фенил или 2-(фенил)пиридинил, в котором отдаленное фенильное кольцо может быть необязательно замещено галогеном или трифторметилом, предпочтительно в 4-положении. Предпочтительно X представляет собой С(2-4)алкилен, более предпочтительно С(2-3)алкилен, наиболее предпочтительно (СН2)2 или СН2§.

Будет понятно, что в пределах группы соединений формулы (III) существует подгруппа соединений, в которых

К¹ представляет собой 2,3-дифторфенил;

К² и К³ вместе с атомами углерода пиридонового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденситованное бензо- или пиридокольцо;

К⁴ представляет собой 1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил;

К⁵ и К⁶ вместе образуют заместитель 4-(фенил)фенил, в котором отдаленное фенильное кольцо замещено трифторметилом, предпочтительно в 4-положении; и

X представляет собой СН₂§ или (СН₂)₂.

Представляют интерес следующие соединения формулы (III):

- 17 025527

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторбензилтио)-4оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида Ситартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамид;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо5,6-триметиленпиридин-1-ил]-Н-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;

Ы-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)4 - оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;

Ν- (1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-И-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-этилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[5-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2метил-7-оксо-7Н-тиазоло[4,5-Ь]пиридин-4-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

(±) И-(1-этилпирролидин-З-ил)-2-[2-(2-(2,3 дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ы-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

- 18 025527 (±) Ν-(1-этилпирролидин-3-ил)-2-[2 -(2,3-дифторбензилтио)

4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν- (1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2 - [2-(2,3дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида дигидрохлорид ,Ν- (1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2- [2-(2,3дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида моно пара толуол сул ьфонат ,Ν- (1- (2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2 - [2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4' трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2- [2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида моногидрохлорид;

Ν-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2- [2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида дигидрохлорид;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(4-фторбензилтио)-4-оксо-4Нхинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат ,Ν- (2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(4-фторбензилтио)-4-оксо-5,6триметиленпиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо5, б-триметиленпиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(4-фторфенил)этил)-4-оксо-4Нхинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(3,4-дифторфенил)этил)-4оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4- 19 025527 илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2-фторфенил)этил)-4-оксо4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(3-хлорфенил)этил)-4-оксо4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

К-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 ОКСО-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 ОКСО-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамид;

Ν-(1-этилпиперидин-4-ил)-2 - [2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 оксо-4Н-хинолин-1-ил]-К-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(2-пирролидин-1-илэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-И-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-изопропилпиперидин-4-ил)-2 - [2 - (2 - (2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ы-(4 ' трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-пиперидин-1-илэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-7-фтор-4 оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-5-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2метил-7-оксо-7Н-тиено[3,2 -Ь]пиридин-4-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-5,6диметил-4-оксо-4Н-пиридин-1-ил]-И-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида Оитартрат;

Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-5этил-4-оксо-4Н-пиридин-1-ил]-Ы-(4'-трифторметилбифенил-4- 20 025527 илметил) ацетамида битартрат;

Ы- (1 -(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2- [2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-И-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

И-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4оксо-4Н-тиено[3,4-Ъ]пиридин-1-ил]-Ы-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2 -(2,3-дифторбензилтио)-4 оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-пирролидин-1-илэтил)-2-[2 -(2,3-дифторбензилтио)-4оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-этилпипериДин-4-ил)-2-(6-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2 метил-4-оксо-4Н-пиразоло[3,4-Ъ]пиридин-7-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-иэопропилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)4-ОКСО-4Н-ХИНОЛИН-1-ИЛ]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-этилпиперидин-4-илметил)-2-[2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(3-диэтиламинопропил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо 4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(4-пирролидин-1-илбутил)-2- [2-(2-(2,3-дифторфенил)этил) 4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(3-диэтиламинопропил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4оксо-4Н-хинолин-1-ил]-И-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(4-пирролидин-1-илбутил)-2- [2 -(2,3-дифторбензилтио)-4оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4- 21 025527 илметил)ацетамида битартрат,·

Ν-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[5-(2,3-дифторбензилтио)-7оксо-7Н-тиено[3,2-Ь]пиридин-4-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4 илметил)ацетамида битартрат;

К-(2-диэтиламиноэтил)-2-[5-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2метил-7-оксо-7Н-тиазоло[4,5-Ь]пиридин-4-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-этилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-этилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-изопропилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат ,Ν- (2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-изопропилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат,·

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо4Н-[1, 8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2 -(2,3-дифторбензилтио)-4оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4ОКСО-4Н-ХИНОЛИН-1-ил]-Ν-(4'-метилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-метилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат ,Ν- (1-этоксикарбонилметилпилеридин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-изопропилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'- 22 025527 трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо4Н-хинолин-1-ил]-Ν-{3',4'-диметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-(трет-бутоксикарбонил)пиперидин-4-ил)-2- [2-(2-(2,3дифторфенил) этил)-4-ОКСО-4Н-Е1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν- (2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(3',4'-дифторбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[6-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо4Н-тиено[2,3-Ь]пиридин-7-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4ОКСО-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторыетилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-этилпиперидин-4-ил)-2 - [2-(2 - (2,3,4трифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(2-диэтиламинозтил)-2-[6-(2,3-дифторбензилтио)-2-метил4-оксо-2,4-дигидропиразоло[3,4-Ь]пиридин-7-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Н-(1-этиллиперидин-4-ил)-2-[б-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2 этил-4-оксо-2,4-дигидропиразоло[3,4-Ь]пиридин-7-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[б-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2 изопропил-4-оксо-2,4-дигидропиразоло[3,4-Ь]пиридин-7-ил]-Ν-(4' трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-зтилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-{2,3-дифторфенил)этил)-4 оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-зтилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-изопропилпиперидин-4-ил)-2 - [5-(2-(2,3дифторфенил) этил)-2-метил-7 -оксо-7Н-тиазоло[4,5-Ь]пиридин-4ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2- [5-(2-(2,3дифторфенил) этил)-2-метил-7-оксо-7Н-тиазоло[4,5-Ь]пиридин-4- 23 025527 ил]-Ы-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-12-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-(2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)4-оксо-5,б-триметиленпиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4 илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил]-Ν-{4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-изопропилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил]-Н-(4' трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-(Б-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2 метил-7-оксо-2,7-дигидропиразоло[4,3-Ь]пиридин-4-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат,·

И-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[5-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-1 метил-7-оксо-1,7-дигидропиразоло[4,3-Ь]пиридин-4-ил]-Ы-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 оксо-5,б-триметиленпиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-7 метил-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-7метил-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)7-метил-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ы-(1-изопропилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-7-метил-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν<4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3дифторфенил)этил)- 7-метил-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ν- 24 025527 (4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-метилпиперидин-4-ил)-2- [2-(2,3-дифторбензилтио)-4сксо-5,б-триметиленпиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2 -{2,3-дифторбензилтио)-4оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил]-Ν-{4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-изопропилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)4-оксо-5,б-триметиленпиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4 илметил)ацетамида битартрат;

Ν- (1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3дифторбензилтио)-4-оксо-5,б-триметиленпиридин-1-ил]-Ы-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4оксо-5,б-тетраметиленпиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4 илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-метилпиперидин-4-ил)-2 -[2 -(2,3-дифторбензилтио)-4 оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-хлорбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат ,Ν- (1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4’-хлорбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат ,Ν- (1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-хлорбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2 - [2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-хлорбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-изопропилперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-хлорбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[6-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2метил-4-оксо-4Н-пиразоло[3,4-Ь]пиридин-7-ил]-Ν-(4’трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(1-(трет-бутоксикарбонил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-[1,3]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'- 25 025527 трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;

Ν-(1-этиллиперидин-4-ил)-2- [6-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2 (2-метоксиэтил)-4-оксо-4Н-пиразоло[3,4-Ъ]пиридин-7-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат?

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2- [4-оксо-2-(2-(2,3,4трифторфенил)этил)- 4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,4-дифторфенил)этил)-4оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат?

Ν-(2-диэтиламиноэтил)-2- [2-(2-(3-фторфенил)этил)-4-оксо4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(пиперидин-4-ил}-2-(2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксс-4Нхинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(пиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(пиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо5,б-триметиленпиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(пиперидин-4-ил)-2- [2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо4Н-[1,3]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида битартрат;

Ν-(пиперидин-4-ил)-2- [2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н[1,3]нафтиридин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4илметил)ацетамида трифторацетат;

Ν-(2-этиламинозтил)-2- [2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Нхинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;

Ν-(2-этиламиноэтил)-2- [2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо 4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;

Ν-(1-(2-гидроксиэтил}пиперидин-4-ил)-2-(2-(2-(2,3дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ν-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;

или их свободное основание или другая фармацевтически приемлемая соль. Формула (IV):

Также представляют интерес соединения формулы (IV)

где

К¹ представляет собой арильную группу, незамещенную или замещенную 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из группы, состоящей из С(1_₆)алкила, С(1_₆)алкокси, С(1_₆)алкилтио, арил-С(1_₆)алкокси, гидрокси, галогена, СИ, СОК⁶, СООК⁶, ИК⁶СОК⁷, СОИК⁸К⁹, 8О2ИК⁸К⁹, ИК⁶8О2К⁷, ИК⁸К⁹, галоген-С(1_4)алкила и галоген-С^алкокси;

№ представляет собой СН, а X представляет собой Ν, или № представляет собой Ν, а X представляет собой СН, и №, и X представляют собой СН, или и №, и X представляют собой Ν;

Υ представляет собой С^алкил,

К² представляет собой водород, С^.^алкил, С(1_₆)алкокси, С(1_₆)алкилтио, арил-С(1_₆)алкокси, гидро- 26 025527 кси, галоген, СН СОК⁶, карбокси, СООК⁶, МК'СОН , СО1МК⁸К⁹, 8Ο2ΝΚ⁸Κ⁹, ΝΚ⁶8Ο2Κ⁷, ΝΚ⁸Κ⁹, от монофтор-С(1_-6)алкила до перфтор-С(1_-6)алкила или от монофтор-С(1_-6)алкокси до перфтор-С(1_-6)алкокси;

п равно 0-5;

К³ представляет собой С(_!-4)алкил;

К представляет собой С _1-4,алкил;

К представляет собой водород, С(_1-10)алкил, С(_2-40)алкенил, С(_2-ю)алкинил, галоген-С(1_-4)алкил, С(_3-8)циклоалкил, С(_3-8)циклоалкил, С(_3-8)циклоалкил-С(1_-4)алкил, С(_5-8)циклоалкенил, С(_5-8)циклоалкенил-С(1_-4)алкил, 3-8-членный гетероциклоалкил, 3-8-членный гетероциклоалкил-С(1_-4)алкил, С,-_6-1.₁,арил, С_(6-1.₁,арилС(1_ю)алкил, гетероарил или гетероарил-С _1-10,алкил; причем каждая группа необязательно замещена один или несколько раз одной и той же и/или отличной группой, которая является С(1_-6)алкокси, С(1_-6)алкилтио, арил-С(1_-6)алкокси, гидрокси, галогеном, СН ΝΕΉ⁹ или галоген-С(1_-4)алкокси;

К⁶ и К⁷ независимо представляют собой водород или С(1_ю)алкил;

К⁸ и К⁹ являются одинаковыми или разными и представляют собой водород или С^ц^алкил, или К⁹и К¹⁰ вместе с азотом, к которому они присоединены, образуют 5-7-членное кольцо, необязательно содержащее один или несколько дополнительных гетероатомов, выбираемых из кислорода, азота и серы, и необязательно замещенное одним или двумя заместителями, выбираемыми из группы, состоящей из гидрокси, оксо, С(1_-4)алкила, С _1-4ллкилкарбокси, арила и арил-С _1-4,алкила;

или их фармацевтически приемлемая соль.

Без намерения исключить какие-либо заданные заместители и/или перечисленные радикалы из объема формулы (IV), следующие группы К и ассоциированные радикалы представляют особый интерес.

Что касается К¹, он может представлять собой фенильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из галогена, С(1-6)алкила, трифторметила или С(1-6)алкокси. Конкретнее, фенил не замещен или замещен 1, 2, 3 или 4 заместителями - галогенами, в частности 1-3 группами фтора, а конкретнее К¹ представляет собой 2,3-дифтор-, 2,4-дифтор- или 4-фторфенил.

Дальнейшим вариантом соединений формулы (I) здесь является вариант, в котором Υ представляет собой -СН2СН2-.

Настоящим изобретением также обеспечивается соединение формулы (I), в котором К² представляет собой водород, по умолчанию, или галоген, С^алкил, от монофтор-С|4-4алкила до перфтор-С(1-4)алкила, от монофтор-С(1-4)алкокси до перфтор-С1-.1,алкокси или С1-6алкокси, особенно от монофтор-С(1-4)алкила до перфтор-С(1-4)алкила, от монофтор-С(1-4)алкокси до перфтор-С(1-4)алкокси или С(1-6)алкокси. Особый интерес представляют соединения, в которых К² отличен от водорода, п в (К²)п равно 1, 2 или 3, и характером замены является мета и/или пара, особенно пара, т.е. заместитель в 4-положении. Приводимые в качестве примеров соединения включают соединения, в которых К² является 4-трифторметилом или 4трифторметокси.

К³ и К⁴ могут быть одинаковыми или разными и представляют собой метил, этил, н-пропил или нбутил. Особый интерес представляют соединения формулы (I), в которых К³ и К⁴ являются одинаковыми и представляют собой метил или этил, метил представляет особый интерес.

К⁵ может быть водородом, С(1_-6)алкилом, который является неразветвленным или разветвленным. Особый интерес представляет метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил, третбутил, н-пентил или н-гексил.

Любое из описанных здесь выше соединений можно приготовить в кристаллической или некристаллической форме, и, если оно в некристаллической форме, может быть сольватировано, например, в виде гидрата. В объем этого изобретения включены стехиометрические сольваты (например, гидраты).

Некоторые из описанных здесь соединений могут содержать один или несколько хиральных атомов или, иначе, способны существовать в виде двух энантиомеров. Соединения, применимые в описанных здесь способах, включают смеси энантиомеров, а также чистые энантиомеры или энантиомерно обогащенные смеси. В объем настоящего изобретения также включены индивидуальные изомеры соединений, представленных формулами (Γ)-(Γν), а также полностью или частично уравновешенные их смеси. Настоящим изобретением также охватываются индивидуальные изомеры заявленных соединений в виде смесей с их изомерами, в которых один или несколько хиральных центров инвертированы. Понятно, что в объем соединений формул (Γ)-(Γν) также включены любые таутомеры и смеси таутомеров. Различные изомерные формы можно разделить друг от друга с помощью общепринятых способов, или любой данный изомер можно получить с помощью общепринятых способов синтеза или с помощью стереоспецифических или асимметрических синтезов.

Синтезы соединений формул (I), (II), (III) и (IV)

Способы приготовления соединений формул (I), (II), (III) и (IV) опубликованы в патентной литературе. Например, способы получения соединений формулы (I) можно найти в \УО 01/60805 и \УО 03/016287. Способы получения соединений формулы (II) были представлены в \УО 02/30911. А способы получения соединений формулы (III) можно найти в \УО 02/30904. В этом документе предоставляются способы получения соединений формулы (IV), которые перенесены сюда из предварительных заявок на

- 27 025527 патенты США 60/829328 и 60/829327, которые включены сюда посредством ссылки.

Ниже представлены некоторые примеры синтезов. Для проведения различий между несколькими общими группами соединений в примерах здесь, материалы, относящиеся к формуле (I), будут отмечены как Пример метода синтеза ОД-Е и следующие, для формулы (II) - Пример метода синтеза (П)-1 и следующие, для формулы (III) - Пример метода синтеза (ΙΙΙ)-Ι и следующие, и для формулы (IV) - Пример метода синтеза (Γν)-1 и следующие.

Синтез соединений формулы (I).

Соединения формулы (I) можно приготовить по схеме I процессов, как раскрыто в νθ 01/60805.

где

Ь³ представляет собой С(_1-6)алкильную группу, например метил;

К¹⁵ представляет собой С(_1-6)алкильную группу, например этил или трет-бутил; и Ь¹, Ь², К^а, К^ь, К^с, К², К³, К⁴, К⁵, η, X, Υ и Ζ такие, как определено в νθ 01/60805.

Приводимой в качестве примера реакцией для получения представляющего интерес соединения формулы (I) является следующая реакция.

Пример метода синтеза (1)-1(а). 1-(Х-(2-Диэтиламино)этил)-Х-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он

Промежуточный продукт В69 в νθ 01/60805 (87,1 г, 9,26 моль) суспендировали в дихлорметане (2,9 л). Добавляли 1-гидроксибензотриазола гидрат (35,2 г, 0,26 моль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3этилкарбодиимида гидрохлорид (99,7 г, 0,52 моль) и суспензию перемешивали в течение составляющего 45 мин периода времени, по истечении которого получали полное растворение. Добавляли промежуточный продукт А30 в νθ 01/60805 (91,2 г, 0,26 моль) в виде раствора в дихлорметане (100 мл) в течение 5 мин и раствор перемешивали в течение 4 ч. Добавляли смесь насыщенный раствор аммония хлорида:вода (1:1, 1 л) и раствор перемешивали в течение 10 мин. Органическую фазу отделяли и экстрагировали смесью насыщенный раствор аммония хлорида:вода (1:1, 1 л), экстракты имели рН 6. Органическую фазу отделяли и экстрагировали водой (1 л), содержащей уксусную кислоту (10 мл), экстракт имел рН 5. Дихлорметановый слой отделяли и экстрагировали смесью насыщенный раствор натрия карбоната:вода:насыщенный соляной раствор (1:3:0,2, 1 л), рН 10,5, а затем смесью насыщенный соляной раствор:вода (1:1, 1 л). Коричневый раствор сушили над безводным натрия сульфатом в присутствии обесцвечивающего угля (35 г), фильтровали и растворитель удаляли в вакууме с получением темнокоричневого вспененного материала. Вспененный материал растворяли в изопропилацетате (100 мл) и растворитель удаляли в вакууме. Темно-коричневый вязкий остаток растворяли в кипящем изопропил- 28 025527 ацетате (500 мл), охлаждали до комнатной температуры, затравляли и перемешивали в течение ночи. Полученное светло-кремовое твердое вещество отфильтровывали и промывали изопропилацетатом (100 мл). Твердое вещество было осушено с использованием всасывания в агломерат в течение 1 ч, затем рекристаллизовано из изопропилацетата (400 мл). После перемешивания в течение ночи образованное твердое вещество отфильтровывали, промывали изопропилацетатом (80 мл) и сушили в вакууме с получением приведенного в заголовке соединения, 110 г, выход: 63,5%.

¹Н ЯМР (СОС1₃, смесь ротамеров приблизительно 1,9:1) δ 0,99 (6Н, т), 2,10 (2Н, м), 2,50 (4Н, кв.), 2,58/2,62 (2Н, 2х т), 2,70/2,82 (2Н, 2х т), 2,86 (2Н, т), 3,28/3,58 (2Н, 2х т), 4,45/4,52 (2Н, 2х с), 4,68/4,70 (2Н, 2х с), 4,93 (2Н, с), 6,95 (2Н, м), 7,31 (2Н, д), 7,31/7,37 (2Н, 2х м), 7,48/7,52 (2Н, д), 7,65 (2Н, м), 7,72 (2Н, м); МС (АРС1) (М+Н)' 667; тр 125°С (согласно ДСК - ассиметричным эндотермам).

Пример метода синтеза (1)-1(Ь). 1-^-(2-Диэтиламино)этил)-^(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-она битартрат

Приготовлен из промежуточных продуктов А30 и В69 в АО 01/60805 с помощью способа примера 1 в АО 01/60805.

¹Н ЯМР (Д5-ДМСО, смесь ротамеров приблизительно 1:1) δ 0,92/0,99 (6Н, 2х т), 1,99 (2Н, м), 2,54 (6Н, м), 2,68/2,74 (4Н, м), 3,36 (2Н, м), 4,21 (2Н, с), 4,37/4,44 (2Н, 2х с), 4,63/4,74 (2Н, 2х с), 4,89/5,13 (2Н, 2х с), 7,08/7,14 (2Н, 2х м), 7,36-7,50 (4Н, м), 7,64/7,70 (2Н, 2х д), 7,83 (4Н, м); М8 (АРС1 + ) обнаружила (М+1)=667; С₃₆Н₃₈Р₄^О₂§ подразумевает 666.

Пример метода синтеза (1)-1(с). 1-^-(2-Диэтиламино)этил)^-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-она гидрохлорид

Свободное основание из примера (1)-1(а) (3,00 г, 0,0045 моль) суспендировали при перемешивании в изопропаноле (30 мл) и нагревали до 45°С с получением прозрачного раствора. Раствор затем охлаждали до температуры окружающей среды и добавляли концентрированную соляную кислоту (0,40 мл, 0,045 моль). Результирующую взвесь затем перемешивали при температуре окружающей среды в течение 35 минут, перед охлаждением до 0°С в течение 35 мин. Взвесь затем фильтровали и промывали изопропанолом (10 мл), а затем гептаном (30 мл), перед высушиванием под вакуумом с получением приведенного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (3,00 г, 95%).

¹Н ЯМР (ΟϋΟ1₃) δ 1,38 (6Н, т), 2,08 (2Н, м), 2,82 (2Н, т), 2,99 (2Н, т), 3,19 (4Н, м), 3,35 (2Н, м), 3,97 (2Н, с), 4,42 (2Н, с), 4,81 (2Н, с), 4,99 (2Н, с), 6,87 (2Н, т), 7,26 (2Н, т), 7,33 (2Н, д), 7,41 (2Н, д), 7,53 (2Н, д), 7,71 (2Н, д), 11,91 (1Н, с).

Синтез соединений формулы (II).

Описание того, как получить соединения формулы (II) и примеры промежуточных и конечных продуктов для названных выше соединений, можно найти в опубликованной международной заявке АО 02/30911, которая включена сюда посредством ссылки. Способом последней стадии для получения соединения, применимого в этом изобретении, является пример (П)-1.

Пример метода синтеза (П)-1. ^(2-Диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил]-^(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат

Раствор ^^диэтил-№-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)этан-1,2-диамина (промежуточного продукта Ό4 в АО 02/30911) (0,50 г, 1,44 ммоль), 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (0,56 г, 1,45 ммоль), 1-гидроксибензотриазола гидрата (0,12 г) и 2-(2-[2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С1 в АО 02/30911) (0,48 г, 1,44 ммоль) в дихлорметане (10 мл) перемешивали при температуре окружающей среды в течение ночи, затем разбавляли дихлорметаном (30 мл), промывали водным раствором натрия бикарбоната и подвергали выпариванию. Остаток очищали с помощью хроматографии (картриджа с 10 г диоксида кремния, с использованием этилацетата-ацетона) с получением приведенного в заголовке соединения в виде желтого вспененного материала (свободного основания) (0,50 г, 52%).

Ή ЯМР (ДМСО, смесь ротамеров) δ 0,83-0,89 (6Н, м), 1,98 (2Н, м), 2,40 (4Н, м), 2,45-2,82 (10Н, м), 3,02 (2Н, м), 4,64/4,75 (2Н, 2хс), 4,96/5,19 (2Н, 2хс), 7,11-7,40 (5Н, м), 7,65 (2Н, м), 7,84 (4Н, м); М8 (АРСН) обнаружила (М+1)=667; С₃₇Н₃₉Р₅^О₂ подразумевает 666.

ά-Винную кислоту (0,09 г, 0,60 ммоль) добавляли к раствору свободного основания (0,40 г, 0,60 ммоль) в метаноле (10 мл) при перемешивании. Результирующий раствор подвергали выпариванию для получения соли (0,49 г). Ή ЯМР (ДМСО, смесь ротамеров) δ 0,85-0,97 (6Н, м), 1,91-2,00 (2Н, м), 2,402,49 (4Н, м), 2,54-2,82 (10Н, м), 3,02-3,46 (2Н, м), 4,20 (2Н, с), 4,64/4,75 (2Н, 2хс), 4,97/5,18 (2Н, 2хс), 7,11-7,40 (5Н, м), 7,65 (2Н, м), 7,84 (4Н, м); М8 (АРСН) обнаружила (М+1)=667; С₃₇Н₃₉Р₅^О₂ подразумевает 666.

- 29 025527

Следуя этому методу, или альтернативно другим методам, описанным в νθ 02/30911, можно приготовить другие названные выше соединения, которые имеют структуру формулы (II).

Синтез соединений формулы (III)

Общий синтез соединений формулы (III) иллюстрируется на следующей схеме III, как представлено в νθ 02/30904:

Обращаясь к этой схеме, сложный эфир (IV) обычно готовят с помощью ΝΙ-алкилирования (V), используя (VI), в котором К¹¹ определен здесь выше, например, (VI) представляет собой третбутилбромацетат или этилбромацетат, в присутствии основания, например, ВиЫ в ΤΝΕ или натрия гидрида в Ν-метилпирролидиноне (NΜΡ)(стадия с).

Когда X представляет собой СН₂§, ключевой промежуточный продукт (IV) можно синтезировать путем осуществления реакции (XX) с диметилоксосульфония метилидом, созданным посредством обработки триметилсульфоксония йодида натрия гидридом при низкой температуре, для получения илида серы (XXII) (стадия μ). Последующая обработка (XXII) сероуглеродом в присутствии диизопропиламина, а затем К?СН₂-Ь⁴, где Ь⁴ является уходящей группой, дает промежуточный продукт (IV) (стадия г).

Альтернативно, когда X представляет собой СН₂§, заместитель КА можно ввести путем замены уходящей группы Ь² (например, С1) (стадия е) или на пиридине (VIII), или на пиридине Ν-оксиде (XIV) для предоставления 2-замещенных пиридинов (VII) и (XV). Преобразование (VII) или (XV) в 4-пиридон (V) осуществляют снятием защитной группы с 4-кислорода (например, используя (РЬ₃Р)₃КЪС1, когда в водном растворе этанола, когда К¹²=аллил) (стадия б), а затем для (XVI), удалением замещающей Νоксидной группы, используя водород в присутствии Рб/С в уксусной кислоте (стадия к). Пиридин (VIII) или пиридина Ν-оксид (XIV) можно приготовить с помощью стадий (ί), (П), (д), (ί) и (]), на которых:

(ί) осуществляют обработку (VIII) м-хлорпербензойной кислотой в дихлорметане;

(ί) осуществляют обработку (IX) К¹²ОН (X), в котором К¹² представляет собой аллил, и натрия гидридом в ΌΜΡ;

(д) осуществляют обработку (XI) хлорангидридом фосфорной кислоты;

(П) осуществляют обработку (XII) водным раствором НС1 при нагревании;

(ί) осуществляют обработку (XIII) (в котором К¹³ представляет собой С(1_-6)алкил, обычно К¹³=Е1) ди(низший алкил)малонатом и алкоголятом натрия в спирте; и

К¹-СН2§Н (XIX) обычно готовят из тиоацетата, который образуют из соответствующего алкилбромида К¹-СН2Вг.

- 30 025527

Альтернативно, когда X представляет собой СН₂8, а К² и К³ вместе с атомами углерода пиридонового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное бензокольцо, промежуточный продукт (IV) можно синтезировать из известных исходных материалов с помощью стадий (в), (с) и (ν), в которых (в) осуществляют обработку кислоты Мелдрума (XXIII) натрия гидридом при низкой температуре с последующей реакцией с фенилизотиоцианатом и последующую обработку с использованием К¹ СН₂-Ь⁴;

(с) как обсуждалось выше;

(ν) осуществляют обработку (XXV) трифторуксусной кислотой.

Когда X является алкиленом, предпочтительно использовать стадии (т) и (И) (промежуточные продукты (XVII), (XVIII)) или стадии (п) и (р) (промежуточные продукты (XIX), (XX), (XXI)), в которых (И) осуществляют преобразование 4-замещенного пиридина в 4-пиридон, например, путем обработки (XVII) К¹⁴=С1 водным раствором НС1 и диоксаном, или снятием защитной группы с К¹⁴=ОК¹², например, используя условия стадии (ά);

(т) осуществляют удлинение цепи 2-алкилпиридина, например, где X=ΥСН₂СН₂, обработкой 2метилпиридина (XVIII) К¹-У-СН₂-Ь⁴ (XVI), где Ь⁴ является уходящей группой, и сильным основанием, таким как ВиЫ, в ТНР.

В альтернативном пути 3-эфирную группу удаляют из промежуточного продукта (XIX), где К¹⁵=С(_4-6)алкил, путем нагревания в дифенильном эфире, где К¹⁵=1Ви (стадия п); промежуточный продукт (XIX) образуют из 2,6-диоксо-1,3-оксазина (XX) и сложного эфира (XXI) путем обработки основанием, таким как КаН, в ΌΜΡ или 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-еном в дихлорметане.

Синтез (XX) из известных исходных материалов можно успешно выполнить через стадии (те) и (с) или стадии (у) и (с), в которых (те) осуществляют обработку (XXVII) азидотриметилсиланом в ТНР;

(у) осуществляют обработку (XXVI) фосгеном;

(с) как описывается выше.

См. заявку АО 02/30904, которая включена сюда посредством ссылки, в отношении дополнительных подробностей и объяснения, как получить соединения формулы (III).

Пример метода синтеза (Ш)-1. Х-(1-(2-Метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ы-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид

Свободное основание готовили из промежуточного продукта Е1 и промежуточного продукта А42 с помощью способа примера 1 в АО 02/30904, за исключением использования ΌΜΡ в качестве растворителя вместо дихлорметана. 1,97 г этого материала подвергали кристаллизации из н-бутилацетата (10 мл) для получения приведенного в заголовке соединения (1,35 г).

Ή ЯМР (СО₃ОЭ) δ 1,7-2,05 (4Н, м), 2,05-2,3 (2Н, 2хт), 2,5-2,65 (2Н, м), 2,95-3,1 (2Н, м), 3,3 (3Н, с), 3,45-3,55 (2Н, м), 3,9-4,05+4,4-4,5 (1Н, 2хм), 4,37+4,48 (2Н, 2хс), 4,71+4,87 (2Н, 2хушир.с), 5,31+5,68 (2Н, 2хс), 6,44+6,52 (1Н, 2хс), 6,95-7,3 (3Н, м), 7,35-7,85 (11Н, м), 8,2-8,35 (1Н, м); Μ8 (АРСН) обнаружила (Μ+1)=736; С₄оН₃₈Р₅М₃О₃8 подразумевает 735.

Синтез соединений формулы (IV)

Следующая схема последовательности операций иллюстрирует метод получения соединений этого изобретения.

- 31 025527

Кроме того, читателя отсылают к опубликованной РСТ-заявке УО 03/016297 для химических технологий и продуктов, которые могут быть пригодны для приготовления некоторых промежуточных продуктов, представленных в этой схеме последовательности операций. Эти химические технологии и продукты, в той мере, в которой они применимы в этом случае, включены сюда посредством ссылки, как если бы они были полностью представлены здесь. Кроме того, приводится ссылка на синтезы, представленные в опубликованных РСТ-заявках УО 01/60805, УО 02/30911, УО 02/30904, УО 03/042218, УО 03/042206, УО 03/041712, УО 03/086400 и УО 03/87088 и находящихся одновременно на рассмотрении предварительных заявках на патенты США 60/829328 и 60/829327, обе из которых поданы 13 октября 2006, отмеченных выше. Если читатель желает приготовить соединения формулы (IV), используя промежуточные продукты, реагенты, растворители, периоды времени, температуры и т.п., отличные от тех, которые используются в пути на предшествующей странице, эти опубликованные РСТ-заявки и находящиеся одновременно на рассмотрении заявки на патенты США могут обеспечить полезное руководство. В тех случаях, когда химические технологии и продукты в этих заявках применимы для приготовления соединений настоящего изобретения, эти материалы включаются сюда посредством ссылки.

Промежуточный продукт (ΐν)-Α1.

{[4'-(Т рифторметил) -4 -бифенилил] метил }амин

Приготовление этого соединения описано в УО 02/30911 в виде промежуточного продукта Ό7. Промежуточный продукт (ΐν)-Α2.

({4'-[(Трифторметил)окси] -4-бифенилил}метил)амина гидрохлорид

Раствор 4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилкарбонитрила (приготовленного из {4-[(трифторметил)окси]фенил}бороновой кислоты с помощью способа, аналогичного способу, описанному для 4'трифторметильного аналога, промежуточного продукта Ό6 в УО 02/30911) (66,6 г) в этаноле (2000 мл) и концентрированной соляной кислоте (100 мл) гидрировали над катализатором Перлмана (10 г) при давлении 25 фунт/дюйм до полного восстановления. Катализатор удаляли фильтрацией через целит, затем растворитель удаляли в вакууме для получения желаемого продукта.

ЬСМ8 (жидкостная масс-спектрометрия) Κΐ=2,212 минутам; т/ζ [М+Н]+=251,0.

Промежуточные продукты для получения соединений формулы (IV)

Промежуточный продукт (ΐν)-Α3.

Метил-2-метил-2-(4-оксо-1-пиперидинил)пропаноат

Смесь метил-2-бром-2-метилпропаноата (80,87 мл, 5 эквивалентов), 4-пиперидона гидрохлорида моногидрата (19,6 г, 1 эквивалент), ацетонитрила (200 мл) и калия карбоната (69,1 г, 4 эквивалента) нагревали в колбе с обратным холодильником в азотной среде при механическом перемешивании в течение 17,5 ч, затем охлаждали в ледяной бане перед добавлением диэтилового эфира (100 мл). Фильтрация через целит с последующей флэш-хроматографией (диоксид кремния, 10-50% этилацетат в гексане) и вы- 32 025527 паривание фракций с продуктом дали желаемый продукт в виде желтого масла (14,28 г). Υ ЯМР (СЭС1₃) δ 1,41 (6Н, с), 2,47 (4Н, м), 2,88 (4Н, м), 3,73 (3Н, с). Промежуточный продукт (1У)-А4

Этил-2 -метил-2 -(4-оксо-1 -пиперидинил) пропаноат

Смесь этил-2-бром-2-метилпропаноата (48,3 мл, 5 экв.), 4-пиперидона гидрохлорида моногидрата (100 г, 1 экв.), ацетонитрила (1216 мл) и калия карбоната (353 г, 4 экв.) нагревали в колбе с обратным холодильником в азотной среде при механическом перемешивании в течение 20 ч, затем охлаждали в ледяной бане перед добавлением диэтилового эфира (приблизительно 1400 мл). Смесь фильтровали через целит, подвергали выпариванию в вакууме, затем избыточный бромэфир отгоняли (постоянный уровень температуры 50°С/10 торр). Флэш-хроматография (диоксид кремния, 10-50% этилацетат в гексане) и выпаривание фракций с продуктом дали неочищенный продукт в виде желтого масла. Для удаления некоторых остающихся примесей -сложного бромэфира осуществляли разделением между этилацетатом и 2М водным раствором соляной кислоты. Органический слой отбрасывали, а водный слой превращали в основание с помощью натрия карбоната, насыщали натрия хлоридом и экстрагировали этилацетатом. Сушка и выпаривание органических экстрактов давали желаемый продукт в виде желтого масла (54,7 г).

Υ ЯМР (СЭС1₃) δ 1,27 (3Н, т), 1,40 (6Н, с), 2,47 (4Н, м), 2,90 (4Н, м), 4,20 (2Н, кв.).

Промежуточный продукт (1У)-А5.

1,1 -Диметилэтил-2-метил-2-(4-оксо-1 -пиперидинил)пропаноат

Смесь 1,1-диметилэтил-2-бром-2-метилпропаноата (8,0 г, 1,1 экв.), 4-пиперидона гидрохлорида (5 г, 1 эквивалент), ацетона (50 мл) и калия карбоната (13,0 г, 3 экв.) нагревали в колбе с обратным холодильником при перемешивании в течение 24 ч, затем фильтровали и фильтрат подвергали выпариванию. Неочищенный остаток использовали в следующей стадии без очистки.

Εδ+Μδ т/ζ [М+Н-1Би]+=186,1.

Промежуточный продукт (1У)-В1.

Метил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноат

Смесь метил-2-метил-2-(4-оксо-1-пиперидинил)пропаноата (промежуточного продукта А3) (14,28 г, 1 экв.), {[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амина (промежуточного продукта А1) (19,6 г, 0,85 экв.), ЭСЕ (300 мл), уксусной кислоты (3,8 мл, 0,90 экв.) и натрия триацетоксиборгидрида (20,7 г, 1,25 экв.) перемешивали при комнатной температуре в азотной среде в течение 17,5 ч. Водный раствор натрия карбоната (2М раствор, в избытке) добавляли и перемешивали в течение 4 ч, затем смесь экстрагировали смесью диэтилового эфира и ТНР. Органические экстракты подвергали реэкстракции водой и соляным раствором, сушили над натрия сульфатом и фильтровали через слой силикагеля, который промывали 2,5% метанолом в ЭСМ. После выпаривания в вакууме неочищенный продукт подвергали кристаллизации из эфира/гексана, в конечном счете, при температуре ледяной бани, которая после сушки дала белое твердое вещество (20,9 г).

Ι,ΟΙδ К1=2,070 мин; т/ζ [М+Н] +=435,2.

Υ ЯМР (б₆-ДМСО) δ 1,15-1,32 (8Н, м), 1,75-1,87 (2Н, м), 1,97-2,12 (2Н, м), 2,27-2,40 (1Н, м), 2,772,90 (2Н, м), 3,60 (3Н, с), 3,76 (2Н, с), 7,46 (2Н, д, 1=8,03 Гц), 7,67 (2Н, д, 1=8,28 Гц), 7,80 (2Н, д, 1=8,53 Гц), 7,88 (2Н, д, 1=8,03 Гц).

Промежуточный продукт (1У)-В2.

Этил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноат

Смесь этил-2-метил-2-(4-оксо-1-пиперидинил)пропаноата (промежуточного продукта А4) (25,6 г,

1,2 экв.), {[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амина (промежуточного продукта А1) (31,1 г, 1 экв.), ЭСЕ (400 мл) и уксусной кислоты (6,3 мл, 1,1 эквэ) перемешивали при комнатной температуре в азотной среде. Добавляли натрия триацетоксиборгидрид (33,5 г, 1,5 экв.) и перемешивание продолжали в течение 19 ч. Водный раствор натрия карбоната (2М раствор, в избытке) добавляли и перемешивали в течение 1,5 ч, затем смесь экстрагировали смесью диэтилового эфира и ТНР.

Органические экстракты подвергали реэкстракции водой и соляным раствором, фильтровали через слой силикагеля, сушили над натрия сульфатом и подвергали выпариванию в вакууме. Желаемый про- 33 025527 дукт получали в виде белого твердого вещества (44,2 г), которое использовали без дальнейшей очистки.

ЬСМЗ К1=2,194 мин; т/ζ [М+Н]+=449,3.

Ή ЯМР (б₆-ДМСО) δ 1,06-1,32 (11Н, м), 1,74-1,89 (2Н, м), 1,99-2,14 (2Н, м), 2,25-2,39 (1Н, м), 2,692,89 (2Н, м), 3,75 (2Н, с), 4,01-4,12 (2Н, м), 7,45 (2Н, д, 1=7,55 Гц), 7,67 (2Н, д, 1=7,81 Гц), 7,79 (2Н, д, 1=8,06 Гц), 7,88 (2Н, д, 1=8,06 Гц).

Промежуточный продукт (ГУ)-В3.

Этил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}пропаноат

Смесь этил-2-метил-2-(4-оксо-1-пиперидинил)пропаноата (промежуточного продукта А4) (1,09 г,

1,2 экв.), ({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амина гидрохлорида (промежуточного продукта А2) (1,28 г, 1 экв.), ОСЕ (21 мл) и уксусной кислоты (0,27 мл, 1,1 экв.) перемешивали при комнатной температуре в азотной среде. Добавляли натрия триацетоксиборгидрид (1,42 г, 1,5 экв.) и перемешивание продолжали в течение 3 ч. Водный раствор натрия карбоната (2М раствор, в избытке) добавляли и перемешивали в течение 45 мин, затем смесь разделяли с использованием смеси диэтилового эфира/ТНТ и воды. Органические экстракты подвергали реэкстракции водой и соляным раствором, сушили над натрия сульфатом и подвергали выпариванию в вакууме. Желаемый продукт получали в виде светло-желтого твердого вещества (2,14 г), которое использовали без дальнейшей очистки.

ЬСМЗ К1=2,244 мин; т/ζ [М+Н]+=465,3.

Промежуточный продукт (ГУ)-В4.

1,1-Диметилэтил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноат

Смесь 1,1-диметилэтил-2-метил-2-(4-оксо-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта А6) (370 мг, 1,2 экв.), {[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амина (промежуточного продукта А1) (397 мг, 1 экв.), натрия триацетоксиборгидрида (400 мг, 1,5 экв.), ОСМ (10 мл) и уксусной кислоты (0,076 мл, 1 экв.) получали и перемешивали при комнатной температуре до момента подтверждения с помощью ЬСМЗ исчезновения исходного материала в виде амина (приблизительно 18 ч). Добавляли водный раствор натрия карбоната и затем осуществляли экстракцию с использованием ОСМ. Органические экстракты сушили над натрия сульфатом и концентрировали для получения твердого вещества (420 мг), которое использовали без дальнейшей очистки.

ЬСМЗ К1=2,24 минутам; т/ζ [М+Н]+=477,3.

Промежуточный продукт (ГУ)-С1.

[2-[2-(2,3-Дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусная кислота

Приготовление этого соединения описано в \У0 02/30911 в виде промежуточного продукта С43. Промежуточный продукт (ГУ)-С2.

[2-[2-(2,3-Дифторфенил)этил]-4-оксо-1,8-нафтиридин-1(4Н)-ил]уксусная кислота

Приготовление этого соединения описано в \У0 02/30904 в виде промежуточного продукта Е21. Промежуточный продукт (ГУ)-С3.

[2-[2-(2,4-Дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусная кислота

Приготовление этого соединения описано в \У0 02/30911 в виде промежуточного продукта С45.

- 34 025527

Промежуточный продукт (1У)-С4.

Этил-[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетат

Смесь этил-(2,4-диоксо-3,4-дигидропиридо[2,3-й]пиримидин-1(2Н)-ил]ацетата (\УО 02/30911, промежуточного продукта В52) (40,8 г, 1,2 экв.) и 3-(2,4-дифторфенил)пропанимидамида (полученного с помощью способов, аналогичных способам, описанным для 2,3-дифторизомера, промежуточных продуктов А1-А3 в \УО 02/30911) (30,0 г, 1 экв.) подвергали реакции конденсирования в масляной бане при 150°С в течение 25 мин, затем быстро охлаждали до комнатной температуры в водяной бане. Хроматография (диоксид кремния, неочищенный продукт загружали в ЭСМ и элюировали, используя 50-100% этилацетат в гексане) давала желаемый продукт (43,56 г).

ЬСМ8 К4=2,521 мин; т/ζ [М+Н]+=374,1.

Ή ЯМР (СОС1₃) δ 1,31 (3Н, т), 3,13 (2Н, м), 3,26 (2Н, м), 4,28 (2Н, кв.), 5,27 (2Н, с), 6,82 (2Н, м), 7,34 (1Н, м), 7,50 (1Н, м), 8,65 (1Н, м), 8,74 (1Н, м).

Промежуточный продукт (1У)-С5.

[2-[2-(2,3-Дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]уксусная кислота

Приготовление этого соединения описано в \УО 02/30911 в виде промежуточного продукта С35. Промежуточный продукт (1У)-С5.

[2-[2-(2,4-Дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]уксусная кислота

Этил-[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетат (промежуточный продукт С1), (32,76 г, 1 экв.) растворяли в этаноле (350 мл) и воде (70 мл), охлаждали на льду, затем добавляли водный раствор лития гидроксида (2М раствор, 43,42 мл, 0,99 экв.). Перемешивание продолжали в течение 2 ч при комнатной температуре. Раствор концентрировали в вакууме и остаток повторно растворяли в воде (700 мл) и насыщенным водном растворе натрия бикарбоната (50 мл), затем промывали этилацетатом (200 мл). Водный слой подкисляли до рН 2 2М соляной кислотой и преципитат отфильтровывали, промывали ледяной водой (50 мл) и сушили в вакууме (50°С, 16 ч) для получения желаемого продукта (23,2 г).

Ή ЯМР (й₆-ДМСО) δ 2,4-2,6 (4Н, м), 5,24 (2Н, с), 7,04 (1Н, м), 7,22 (1Н, м), 7,48 (1Н, м), 7,60 (1Н, м), 8,47 (1Н, м), 8,84 (1Н, м).

Пример (1У)-1.

Метил-2[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С1) (100 мг, 1 экв.), метил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В1) (130 мг, 1,03 экв.), ΌΣΡΕΑ (0,1 мл, 3,6 экв.), ацетонитрила (2 мл) и НАТИ (130 мг, 1,4 экв.) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем подвергали выпариванию и вновь растворяли в ацетонитриле. НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод А) дала метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат (128 мг).

ЬСМ8 К4=2,686 мин; т/ζ [М+Н]+=761, 3.

- 35 025527 'ίί ЯМР (СБС1₃) δ 1,33 (3Н, с), 1,36 (3Н, с), 1,83-2,02 (4Н, м), 2,36-2,48 (2Н, м), 2,87-2,91 (1Н, м), 3,06-3,09 (2Н, м), 3,16-3,20 (2Н, м), 3,26-3,29 (1Н, м), 3,71-3,73 (3Н, м), 4,02/4,51 (1Н, 2х ушир.м), 4,74 (1Н, с), 4,92 (1Н, с), 5,12 (1Н, с), 5,56 (1Н, с), 7,00-7,19 (3Н, м), 7,32-7,37 (1Н, м), 7,48-7,62 (5Н, м), 7,727,81 (5Н, м), 8,22-8,28 (1Н, м).

Свободное основание превращали в битартратную соль добавление Ь-винной кислоты (1,675 г, 1,0 эквивалента) в одной порции и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Раствор концентрировали в вакууме до грязно-белого порошка, который сушили в вакуумной печи при комнатной температуре.

Пример метода синтеза 0;ν)-2.

Метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1,8-нафтиридин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1,8-нафтиридин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С2) (100 мг, 1 экв.), карбонилдиимидазола (50 мг, 1,05 экв.) и диметилацетамида (4 мл) перемешивали при 60°С в течение 30 мин, затем добавляли метил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноат (промежуточный продукт В1) (132 мг, 1,05 экв.) и температуру повышали до 80°С на 2 ч. Добавляли дополнительную порцию карбонилдиимидазола (0,5 эквивалента) и перемешивание продолжали при 80°С в течение 15 ч. После охлаждения неочищенную смесь использовали для НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод А) для получения метил-2-[4({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-1,8-нафтиридин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата (99 мг).

ЬСМ8 К1=2,845 мин; т/ζ [М+Н]+=761,3.

ΊI ЯМР (СПС1₃) δ 1,28 (3Н, с), 1,31 (3Н, с), 1,73-2,05 (4Н, м), 2,25 (1Н, т), 2,39-2,46 (1Н, м), 2,96-2,99 (1Н, м), 3,00-3,12 (4Н, м), 3,19 (1Н, с), 3,68-3,73 (3Н, м), 4,11/4,41 (1Н, 2х ушир.м), 4,73 (1Н, с), 4,97 (1Н, с), 5,51 (1Н, с), 6,29-6,34 (1Н, м), 7,06-7,20 (2Н, м), 7,35-7,41 (1Н, м), 7,48-7,58 (2Н, м), 7,68-7,84 (6Н, м), 8,60-8,68 (1Н, м), 8,87-8,91 (1Н, м).

Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (I).

Пример метода синтеза (Ίν)-3.

Этил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С1) (115 мг, 1 экв.), этил-2-метил-2-[4-({[4'(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В2) (150 мг, 1 экв.), НАТИ (151 мг, 1,2 экв.), ΌΜΡ (2,7 мл) и ОГРЕА (0,17 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре в течение 5 ч. Реакционную смесь разделяли между этилацетатом/метанолом и водным раствором натрия бикарбоната, затем органический слой промывали соляным раствором и сушили. Флэш-хроматография (диоксид кремния, 3-4% метанол в ЭСМ) дала этил-2[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат в виде белого твердого вещества (190 мг).

ЬСМ8 К1=2,55 мин; т/ζ [М+Н]+=775,3.

ΊI ЯМР (СБС1з) δ 1,18-1,40 (9Н, м), 1,61-2,09 (4Н, м), 2,22-2,45 (2Н, м), 2,75-2,85 (1Н, м), 2,90-3,34 (5Н, м), 3,71/4,66 (1Н, 2х м), 4,12-4,26 (2Н, м), 4,70-4,85 (3Н, м), 5,08 (1Н, с), 6,80-6,88 (1Н, м), 6,95-7,13 (3Н, м), 7,27-7,33 (1Н, м), 7,34-7,52 (3Н, м), 7,56-7,62 (1Н, м), 7,63-7,77 (4Н, м), 8,29-8,44 (2Н, м).

- 36 025527

Пример метода синтеза 0^)-4.

Этил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси] -4-бифенилил}метил)амино] -1 -пиперидинил}-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С1) (124 мг, 1,2 экв.), этил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}пропаноата (промежуточного продукта В3) (139 мг, 1 экв.), ΌΜΡ (1,2 мл) и ЭГРЕЛ (0,16 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем добавляли НАТИ (176 мг, 1,5 экв.) и встряхивание продолжали в течение 4 ч. НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод В) дала этил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}({4'[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноат в виде белого твердого вещества (174 мг).

ЬСМ8 Ηι 2.77 минутам; т/ζ [М+Н]+=791,3.

¹Н ЯМР (СЭС1₃) Характеристические пики: δ 1,21-1,42 (9Н, м), 1,58-2,08 (4Н, м), 2,20-2,48 (2Н, м), 2,71-5,1 (13Н, ушир.м), 6,79-6,87 (1Н, д), 6,92-7,11 (3Н, м), 7,30-7,46 (5Н, м), 7,48-7,63 (5Н, м), 8,26-8,40 (1Н, м).

Пример метода синтеза (Ίν)-5.

Метил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)4-бифенилил]метил}амино] -1 -пиперидинил] -2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь [2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С3) (100 мг, 1 экв.), метил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В1) (130 мг, 1,03 экв.), ΌΣΡΕΑ (0,1 мл, 2 экв.), ацетонитрила (2 мл) и НАТИ (130 мг, 1,4 экв.) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем подвергали выпариванию и вновь растворяли в ацетонитриле. Очистка с помощью НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод В) дала метил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)хиназолинил]ацетил}{ [4'-(трифторметил)-4-бифенилил] метил}амино] -1 -пиперидинил] -2-метилпропаноат (126 мг).

ЬСМ8 Н1 2.698 мин; т/ζ [М+Н]+=761, 3.

¹Н ЯМР (СЭС1₃) δ 1,30 (3Н, с), 1,34 (3Н, с), 1,81-2,03 (4Н, м), 2,29-2,35 (1Н, м), 2,39-2,45 (1Н, м), 2,82-2,87 (1Н, м), 3,00-3,14 (4Н, м), 3,19-3,24 (1Н, м), 3,70-3,73 (3Н, м), 4,00/4,51 (1Н, 2х ушир.м), 4,74 (1Н, с), 4,91 (1Н, с), 5,10 (1Н, с), 5,54 (1Н, с), 6,77-6,84 (1Н, м), 6,87-6,98 (1Н, м), 7,28-7,43 (2Н, м), 7,487,61 (5Н, м), 7,73-7,81 (5Н, м), 8,23-8,29 (1Н, м).

Пример метода синтеза 0^)-6.

Этил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь [2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусной кислоты (промежуточного

- 37 025527 продукта С3) (120 мг, 1 экв.), этил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В2) (204 мг, 1,3 экв.), ΌΜΡ (1,4 мл) и ОРЕЛ (0,183 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре, затем добавляли НАТИ (206 мг, 1,5 экв.) при энергичном перемешивании и встряхивание продолжали в течение 1,5 ч. Добавляли дополнительную порцию промежуточного продукта Ό5 (12 мг, 0,1 экв.), затем встряхивание продолжали в течение 2 дней. НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод В) дала этил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат в виде белого твердого вещества (173 мг).

ЬСМ8 К1=2,751 мин; т/ζ [М+Н]+=775,3.

^!Н ЯМР (СЭСЕ) δ (смесь ротамеров)

Характеристические пики: 1,22-1,47 (9Н, м), 1,63-2,10 (4Н, м), 2,16-5,11 (15Н, ушир.м), 6,75-6,88 (2Н, м), 7,14-7,80 (12Н, м), 8,26-8,40 (1Н, м).

Пример метода синтеза (ТУ)-7.

Этил-2-{4-[{[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси] -4-бифенилил}метил)амино] -1 -пиперидинил}-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь [2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С3) (114 мг, 1,1 экв.), этил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}пропаноата (промежуточного продукта В3) (139 мг, 1 экв.), ΌΜΡ (1,2 мл) и ОГРЕА (0,16 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре, затем добавляли НАТИ (176 мг, 1,5 экв.) при энергичном перемешивании и встряхивание продолжали в течение 30 мин. Добавляли дополнительную порцию промежуточного продукта Ό5 (21 мг, 0,2 экв.), а затем спустя 1 ч дополнительно НАТИ (23 мг, 0,2 экв.), затем встряхивание продолжали в течение 18 ч. НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод В) дала этил-2-{4-[{[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)хиназолинил]ацетил} ({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2метилпропаноат в виде белого твердого вещества (149 мг).

ЬСМ8 К1=2,793 мин; т/ζ [М+Н]+=791, 3.

Ή ЯМР (СПС1₃) δ Характеристические пики: δ 1,20-1,45 (9Н, м), 1,58-2,12 (4Н, м), 2,14-2,48 (2Н, м), 2,620-5,11 (11Н, м), 6,59-6,72 (1Н, м), 6,73-6,90 (2Н, м), 7,16-7,64 (11Н, м), 8,25-8,40 (1Н, м).

Пример метода синтеза 0^)-8.

2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1,8-нафтиридин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропановой кислоты трифторацетат

Смесь 1,1-диметилэтил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В4) (1 экв.), [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1,8нафтиридин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С2) (1,2 экв.), ОРЕЛ (3 эквивалента) и ΌΜΡ (1,0 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавляют в одной порции НАТИ (1,5 экв.) и перемешивают дополнительно 5 мин. Неочищенную реакционную смесь концентрируют, фильтруют через слой диоксида кремния, элюируют ацетоном и подвергают выпариванию для получения неочищенного 1,1-диметилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1,8-нафтиридин1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата.

Пропаноат, без выделения в чистом виде, растворяют в смеси (1:1) ТРА и ЭСМ и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Выпаривание и препаративная НРЬС (способ А) дают приведенное в заголовке соединение.

- 38 025527

С помощью обычных способов можно приготовить другие соли. С помощью обычных способов также можно приготовить свободное основание.

Пример метода синтеза (ГУ)-9.

2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропановой кислоты трифторацетат

Смесь 1,1-диметилэтил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В4) (1 экв.), [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)хиназолинил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С1) (1,2 экв.), ЭРЕА (3 экв.) и ΌΜΡ (1,0 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавляют в одной порции НАТи (1,5 экв.) и перемешивают дополнительно 5 мин. Неочищенную реакционную смесь концентрируют, фильтруют через слой диоксида кремния, элюируют ацетоном и подвергают выпариванию для получения неочищенного 1,1-диметилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата.

Пример метода синтеза 0^)-10.

Метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]-ацетил}{[4'(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат

Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,3-й]пиримидин-1 (4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта Ό1) (20,7 г, 1,3 экв.), метил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В1) (20,0 г, 1,3 экв.), ЭРЕА (24,0 мл, 3 экв.) и ΌΜΕ (184 мл) механически перемешивали, затем добавляли в одной порции НАТИ (27,1 г, 1,5 экв.) и перемешивание продолжали в течение 2 ч. Реакционную смесь разделяли между диэтиловым эфиром/ТНР (1:1) и натрия карбонатом (1М, в избытке). Органический слой промывали водой и соляным раствором, сушили и подвергали выпариванию. Хроматографию проводили последовательно на трех колонках с диоксидом кремния (с использованием, во-первых, смеси 3: 1 ЕЮАс/гексаны; во-вторых, 2% МеОН в ЭСМ; в-третьих, смеси 1:1 ЕЮАс/гексаны до 100% ЕЮАс). Фракции с продуктом подвергали выпариванию для получения желаемого продукта в виде некристаллического розового твердого вещества (27,5 г).

ЬСМ8 К!=2,702 мин; т/ζ [М+Н]+=762,3.

Кристаллизация:

Смесь метил-2-[4-({ [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,3-й]пиримидин-1 (4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата (8,0 г) и этанола (200 мл) нагревали до полного растворения. Раствор перемешивали с использованием магнитного устройства в течение 24 ч при комнатной температуре, затем фильтровали и собирали 7,5 г твердого вещества. Эти сольватированные кристаллы помещали в вакуумную печь на 60°С со стравливанием азота для удержания вакуума на уровне приблизительно 630 торр в течение 24 ч для предоставления несольватированного, кристаллического соединения, приведенного в заголовке (7,15 г), точка плавления 150°С.

Ίΐ ЯМР (СЭ₃0Э) δ 1,25 (3Н, с), 1,30 (3Н, с), 1,63-1,99 (4Н, м), 2,16-2,28 (1Н, м), 2,3-2,43 (1Н, м), 2,89-2,98 (1Н, м), 2,98-3,08 (2Н, м), 3,16-3,30 (3Н, м), 3,66-3,69 (3Н, м), 4,02/4,38 (1Н, 2х ушир.м), 4,69 (1Н, с), 4,87 (1Н, с), 5,4/5,73 (2Н, 2х с), 6,99-7,19 (3Н, м), 7,29-7,35 (1Н, м), 7,50-7,61 (3Н, м), 7,64-7,82 (5Н, м), 8,48-8,57 (1Н, м), 8,80-8,89 (1Н, м). См. фиг. 1 ниже.

Пример метода синтеза (Ίν)-11.

Метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

- 39 025527

Метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат (8,5 г, 1 экв.) суспендировали в метаноле (100 мл) и нагревали до 50°С до растворения твердого вещества. В одной порции добавляли Ь-винную кислоту (1,675 г, 1,0 экв.) и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Раствор концентрировали в вакууме до получения грязно-белого порошка, который сушили в вакуумной печи при комнатной температуре.

ЬСМ8 К1=2,697 мин; т/ζ [М+Н]+=762,3.

Ή ЯМР (й₆-ДМСО) δ 1,17 (3Н, с), 1,23 (3Н, с), 1,47-1,91 (4Н, м), 1,98-2,41 (1Н, м), 2,16-2,33 (1Н, м), 2,80-3,26 (6Н, м), 3,50-3,67 (3Н, м), 3,95/4,17 (1Н, 2х ушир.м), 4,61 (1Н, с), 4,85 (1Н, с), 5,39/5,69 (2Н, 2х с), 7,08-7,39 (4Н, м), 7,53-7,70 (3Н, м), 7,72-7,97 (5Н, м), 8,42-8,54 (1Н, м), 8,85-8,95 (1Н, м).

Пример метода синтеза (ΐν)-12.

Этил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,3-й]пиримидин-1 (4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта Ό1) (116 мг, 1 экв.), этил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В2) (150 мг, 1 экв.), НАТИ (151 мг, 1,2 экв.), ΌΜΡ (2,72 мл) и ΌΙΡΕΑ (0,17 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре в течение 3,25 ч. Реакционную смесь разделяли между этилацетатом/метанолом и водным раствором натрия бикарбоната, органический слой промывали соляным раствором, сушили и обрабатывали активированным углем (250 мг). Флэш-хроматография (диоксид кремния, 3-4% метанол в ЭСМ) давала этил-2[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат в виде белого твердого вещества (178 мг).

ЬСМ8 К1=2,58 минутам; т/ζ [М+Н]+=776,3.

Ή ЯМР (СПС1₃) δ 1,20-1,40 (9Н, м), 1,56-2,02 (4Н, м), 2,19-2,44 (2Н, м), 2,88-3,20, (4Н, м), 3,22-3,40 (2Н, м), 3,81/4,58 (1Н, 2х м), 4,11-4,27 (2Н, м), 4,69/4,84 (2Н, 2х с), 5,17/5,49 (2Н, 2х с), 6,95-7,14 (3Н, м), 7,25-7,31 (1Н, м), 7,38-7,54 (3Н, м), 7,54, 7,61 (1Н, м), 7,62-7,79 (4Н, м), 8,57-8,75 (2Н, м).

Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (ΐΐ).

Пример метода синтеза (ΐν)-13.

Этил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}([4'[(трифторметил)окси] -4-бифенилил}метил)амино] -1 -пиперидинил}-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,3-й]пиримидин-1 (4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта Ό1) (114 мг, 1,1 экв.), этил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}пропаноата (промежуточного продукта В4) (139 мг, 1 экв.), ОМЕ (1,2 мл) и ΌΙΡΕΑ (0,16 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем добавляли НАТИ (176 мг, 1,5 экв.) и встряхивание продолжали в течение 3 ч. НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод В) дала этил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)хиназолинил]ацетил}([4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпро- 40 025527 паноат в виде белого твердого вещества (166 мг). Εί',’Μδ К!=2,87 минутам; т/ζ [Μ+^+=792,3.

Ή ЯМР (СПС1₃) δ 1,18-1,42 (9Н, м), 1,54-2,04 (4Н, м), 2,12-2,46 (2Н, м), 2,86-3,21 (4Н, м), 3,21-3,41 (2Н, м), 3,79/4,57 (1Н, 2х м), 4,10-4,27 (2Н, м), 4,68 (1Н, с), 4,82 (1Н, с), 5,17 (1Н, с), 5,47 (1Н, с), 6,94-7,16 (3Н, м), 7,20-7,36 (3Н, м), 7,37-7,48 (3Н, м), 7,48-7,61 (3Н, м), 8,56-8,76 (2Н, м).

Его превращали в бйтартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (II).

Пример метода синтеза 0^)-14.

1-Метилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил} {[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1 -пиперидинил] -2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь 1-метилэтил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В3) (420 мг, 1 эквивалент), [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта Ό1) (300 мг, 1 экв.), НАТИ (396 мг, 1,2 экв.), ОРЕЛ (0,22 мл, 1,5 экв.) и ΌΜΡ (3,0 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Неочищенную реакционную смесь использовали непосредственно для НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод А) для получения 1-метилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,3дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата (171 мг).

Εί,’Μδ К!=2,837 минутам; т/ζ ^+^+=790,3.

Ή ЯМР (С1+О1+ δ 1,16-1,37 (12Н, м), 1,62-2,01 (4Н, м), 2,27-2,55 (2Н, м), 2,95-3,12 (3Н, м), 3,123,29 (3Н, м), 4,06/4,40 (1Н, 2х ушир.м), 4,71 (1Н, с), 4,89 (1Н, с), 4,92-5,07 (1Н, м), 5,43/5,76 (2Н, 2х с), 7,00-7,21 (3Н, м), 7,29-7,38 (1Н, м), 7,49-7,65 (3Н, м), 7,65-7,87 (5Н, м), 8,48-8,58 (1Н, м), 8,81-8,90 (1Н, м).

Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (II).

Пример метода синтеза 0^)-15.

1-Метилэтил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)ил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь 1-метилэтил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}пропаноата (промежуточного продукта В5) (80 мг, 1 экв.), [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта Ό1) (67 мг, 1 экв.), НАТИ (400 мг, 5 экв.), ЭРЕА (0,22 мл, 1,5 экв.) и ΌΜΡ (2,0 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Неочищенную реакционную смесь использовали непосредственно для НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод А) для получения 1-метилэтил-2-{4-[{[2-[2-(2,3дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата (25 мг).

ΕϋΜδ К!=2,952 минутам; т/ζ [М+Н]+=806,4.

Ή ЯМР (ДМСО-Й6) δ 1,09-1,25 (12Н, м), 1,47-1,91 (4Н, м), 2,05-2,20 (1Н, м), 2,21-2,38 (1Н, м), 2,873,07 (3Н, м), 3,08-3,22 (3Н, м), 3,95/4,17 (1Н, 2х ушир.м), 4,59 (1Н, с), 4,75-4,97 (2Н, м), 5,38/5,68 (2Н, 2х с), 7,90-7,21 (1Н, м), 7,21-7,36 (3Н, м), 7,42-7,55 (3Н, м), 7,55-7-64 (2Н, м), 7,66-7,77 (2Н, м), 7,77-7,85 (1Н, м), 8,43-8,52 (1Н, м), 8,86-8,95 (1Н, м).

Пример метода синтеза 0^)-16.

Метил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

- 41 025527

Смесь [2-[2-(2,4-дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,4-б]пиримидин-1 (4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта Ό2) (100 мг, 1 экв.), метил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В1) (130 мг, 1,03 экв.), 01РЕА (0,16 мл, 3 экв.), ацетонитрила (2 мл) и НАТИ (130 мг, 1,2 экв.) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем подвергали выпариванию и вновь растворяли в ацетонитриле. Очистка с помощью НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод В) дала метил-2-[4-({[2-[2-(2,4дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-б]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат (145 мг).

ЬСМЗ К1=2,716 мин; т/ζ [М+Н]+=762,3.

Ή ЯМР (СОС1₃) δ 1,27 (3Н, с), 1,33 (3Н, с), 1,69-1,98 (4Н, м), 2,22-2,29 (1Н, м), 2,36-2,43 (1Н, м), 2,96-3,08 (3Н, м), 3,13-3,24 (3Н, м), 3,69-3,72 (3Н, м), 4,04/4,41 (1Н, 2х ушир.м), 4,72 (1Н, с), 4,91 (1Н, с), 5,41/5,73 (2Н, 2х с), 6,84-6,97 (2Н, м), 7,34-7,44 (2Н, м), 7,54-7,63 (3Н, м), 7,69-7,83 (5Н, м), 8,55-8,60 (1Н, м), 8,86-8,91 (1Н, м).

Пример метода синтеза (Γν)-17.

Этил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-б]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь [2-[2-(2,4-дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,4-б]пиримидин-1 (4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта Ό2) (120 мг, 1 экв.), этил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В2) (198 мг, 1,3 экв.), ОМЕ (1,4 мл) и ЭРЕА (0,178 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч, затем добавляли НАТИ (200 мг, 1,5 эквивалента) при энергичном перемешивании и встряхивание продолжали в течение 1,5 ч. Добавляли добавочную порцию промежуточного продукта Ό2 (12 мг, 0,1 экв.), а затем встряхивание продолжали в течение 2 дней. НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод В) дала этил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-б]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат в виде белого твердого вещества (170 мг).

ЬСМЗ К1=2,827 минутам; т/ζ [М+Н]+=776,3.

Ή ЯМР (СОС1₃) Характеристические пики: δ 1,14-1,43 (9Н, м), 1,57-2,05 (4Н, м), 2,10-2,46 (2Н, м), 2,84-3,11 (3Н, м), 3,12-3,34 (3Н, м), 3,65/3,85 (1Н, м), 4,06-4,27 (2Н, м), 4,65/4,85 (2Н, с), 5,15/5,45 (2Н, с), 6,62-6,89 (2Н, м), 7,18-7,34 (1Н, м), 7,37-7,82 (9Н, м), 8,59-8,77 (2Н, м).

Пример метода синтеза 0ν)-18.

Этил-2-{4-[{[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-б]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'[(трифторметил)окси] -4-бифенилил}метил)амино] -1 -пиперидинил}-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь [2-[2-(2,4-дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,4-б]пиримидин-1 (4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта Ό2) (114 мг, 1,1 экв.), этил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}пропаноата (промежуточного продукта В4) (139 мг, 1 экв.л),

- 42 025527

ΌΜΡ (1,2 мл) и ΌΓΓΕΑ (0,16 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре, затем добавляли НАТи (176 мг, 1,5 экв.) при энергичном перемешивании и встряхивание продолжали в течение 2 ч. НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод В) дала этил-2-{4-[{[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1пиперидинил}-2-метилпропаноат в виде белого твердого вещества (149 мг).

РСМ8 К!=2,801 минутам; т/ζ [Μ+4]⁺=792,3.

¹Н ЯМР (СОС1₃) δ 1,18-1,40 (9Н, м), 1,61-2,02 (4Н, м), 2,20-2,44 (2Н, м), 2,83-3,35 (6Н, ушир.м), 3,79/4,57 (1Н, 2х ушир.м), 4,07-4,27 (2Н, м), 4,68/4,81 (2Н, 2х с), 5,14/5,46 (2Н, 2х ушир.м), 6,62-6,90 (2Н, 2х м), 7,18-7,63 (10Н, м), 8,59-8,75 (2Н, м).

Пример метода синтеза (Γν)-19.

1-Метилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-

Смесь 1-метилэтил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В3) (70 мг, 1 экв.), [2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4оксопиридо[2,4-й]пиримидин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта Ό2) (52,2 мг, 1 экв.), НАТИ (69 мг, 1,2 экв.), ΌΨΕΑ (0,04 мл, 1,5 экв.) и ΌΜΡ (1,0 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Неочищенную реакционную смесь использовали непосредственно для НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод А) для получения 1-метилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,4дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата (20 мг).

1.СХ18 К!=2,910 мин; т/ζ [М+Н]+=790,4.

¹Н ЯМР (й₆-ДМСО) δ 1,08-1,27 (12Н, м), 1,40-1,90 (4Н, м), 2,03-2,35 (2Н, м), 2,85-3,24 (6Н, м), 3,95/4,17 (1Н, 2х ушир.м), 4,61 (1Н, с), 4,80-4,97 (2Н, м), 5,36/5,67 (2Н, 2х с), 6,96-7,10 (1Н, м), 7,13-7,28 (1Н, м), 7,28-7,38 (1Н, м), 7,39-7,54 (1Н, м), 7,54-7,68 (3Н, м), 7,72-7,98 (5Н, м), 8,43-8,52 (1Н, м), 8,86-8, 95 (1Н, м).

Пример метода синтеза 0;ν)-20.

1-Метилэтил-2-{4-[{[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата 2,3дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь 1-метилэтил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1пиперидинил}пропаноата (промежуточного продукта В5) (80 мг, 1 экв.), [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4оксопиридо[2,4-й]пиримидин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта Ό2) (57 мг, 1 экв.), НАТИ (76 мг, 1,2 экв.), ΌΡΕΛ (0,04 мл, 1,5 экв.) и ΌΜΡ (1,0 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Неочищенную реакционную смесь использовали непосредственно для НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод А) для получения 1-метилэтил-2-{4-[{[2-[2-(2,4дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-й]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата (47 мг).

1.СХ18 К!=2,909 мин; га/ζ [Μ+4]+=806,4.

’Н ЯМР (а₆-ДМСО) δ 1,09-1,27 (12Н, м), 1,50-1,90 (4Н, м), 2,03-2,17 (1Н, м), 2,20-2,37 (1Н, м), 2,883,18 (6Н, м), 3,94/4,17 (1Н, 2х м), 4,60 (1Н, с), 4,74-4,96 (2Н, м), 5,36/5,66 (2Н, 2х ушир.с), 6,96-7,09 (1Н, м), 7,14-7,32 (2Н, м), 7,39-7,55 (4Н, м), 7,55-7,66 (2Н, м), 7,66-7,87 (3Н, м), 8,43-8,54 (1Н, м), 8,85-8,96 (1Н, м).

- 43 025527

Пример метода синтеза (1У)-21.

Метил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-']пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата дигидроксибутандиоат (соль)

Смесь метил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}пропаноата (промежуточного продукта В6) (145 мг, 1 экв.), [2-[2-(2,3-дифторфенил) этил]-4оксопиридо [2,3-ά] пиримидин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта Ό1) (122 мг, 1 экв.), ΌΙΡΕΆ (0,084 мл, 1,5 экв.) и ΌΜΡ (2,0 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин. В одной порции добавляли НАТИ (160 мг, 1,3 эквивалента) и перемешивали в течение дополнительного 1 ч в азотной среде. Неочищенную реакционную смесь использовали непосредственно для НРЬС с обращенной фазой (препаративный метод А) для получения метил-2-{4-[{[2-[2-(2,3дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-Д]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата (116 мг).

ЬСМ8 Р1=2.721 мин; т/ζ [М+Н]+=778,3.

¹Н ЯМР (СЭС1₃) Характеристические пики: δ 1,53-1,62 (6Н, м), 3,46-5,99 (22Н, м), 7,01-7,21 (3Н, м), 7,30-7,43 (3Н, м), 7,50-7,78 (6Н, м), 8,54-8,60 (1Н, м), 8,86-8,94 (1Н, м).

Пример метода синтеза 0^)-22.

2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-']пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропановой кислоты трифторацетат

Смесь 1,1-диметилэтил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В7) (150 мг, 1 экв.), [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4оксопиридо[2,3-']пиримидин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта Ό1) (130 мг, 1,2 экв.), ΌΓΡΕΑ (0,164 мл, 3 экв.) и ΌΜΡ (1,0 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавляли в одной порции НАТИ (180 мг, 1,5 экв.) и перемешивали дополнительно 5 мин. Неочищенную реакционную смесь концентрировали, фильтровали через слой диоксида кремния, элюировали ацетоном и подвергали выпариванию для получения неочищенного 1,1-диметилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,3дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-']пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата.

ЬСМ8 К4=2,823 мин; т/ζ [М+Н]+=804,4.

Этот промежуточный продукт, без выделения в чистом виде, растворяли в смеси (1:1) ТРА и ЭСМ и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Выпаривание и препаративная НРЬС (способ А) давали желаемый 2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-']пиримидин-1(4Н)ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропановой кислоты трифторацетат (70 мг).

ЬСМ8 К4=2,554 мин; т/ζ [М+Н]+=748,2.

Ή ЯМР (Д₆-ДМСО) δ 1,44 (3Н, с), 1,51 (3Н, с), 1,70-2,30 (4Н, м), 2,41-2,56 (2Н, м), 2,94-3,54 (6Н, м), 4,44-4,95 (3Н, м), 5,42/5,76 (2Н, 2х ушир.с), 7,07-7,38 (4Н, м), 7,54-7,75 (3Н, м), 7,76-7,99 (5Н, м), 8,428,54 (1Н, м), 8,85-8,98 (1Н, м).

В некоторых вариантах осуществления соединениями, пригодными в качестве ингибиторов ЬрРЬА₂ в раскрытых здесь способах, являются 1-(Х-(2-диэтиламино)этил)-Х-(4-(4трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он, также упоминаемый как 8В480848 или под названием и8АЫ дарапладиб, который представляет со- 44 025527 бой соединение, в основе которого лежит пиримидинон, и является обратимым ингибитором Ьр-РЬА₂, и используется в приведенных здесь примерах;

М-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил]-Ы-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;

М-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-М-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид и метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-б]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат.

Фармацевтически приемлемые соли 1-(К-(2-диэтиламино)этил)-Н-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-она, АКА 8В480848, используемые в приведенных здесь примерах;

М-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1 -ил] -Ν-(4 '-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида;

М-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-М-(4'трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида и метил-2-[4-({ [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4оксопиридо[2,3-б]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1пиперидинил]-2-метилпропаноата также применимы в качестве ингибиторов Ьр-РЬА₂ для применения в раскрытых здесь способах. Ингибиторы Ьр-РЬА₂ в виде нуклеиновых кислот В некоторых вариантах осуществления агенты, которые ингибируют Ьр-РЬА₂, являются нуклеиновыми кислотами.

Ингибиторами Ьр-РЬА₂ в виде нуклеиновых кислот являются, например, но без ограничения, индуцирующие РНК-интерференцию молекулы, например, но без ограничения, малая интерферирующая РНК, дцРНК, малая временная РНК, малая шпилечная РНК и их модифицированные варианты, причем молекула для РНК-интерференции выключает экспрессию гена Ьр-РЬА₂. В некоторых вариантах осуществления ингибитором Ьр-РЬА₂ в виде нуклеиновой кислоты является антисмысловой олигонуклеотид или аналог нуклеиновой кислоты, например, без ограничения, ДНК, РНК, пептидонуклеиновая кислота (ПНК), псевдокомплементарная ПНК или закрытая нуклеиновая кислота и т.п. В альтернативных вариантах осуществления нуклеиновой кислотой является ДНК или РНК и аналоги нуклеиновых кислот, например, ПНК, псевдокомплементарная ПНК и закрытая нуклеиновая кислота. Нуклеиновая кислота может быть одно- или двухцепочечной и может быть выбрана из группы, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес белок, олигонуклеотиды, ПНК и т.п. Такие последовательности нуклеиновых кислот включают, например, но без ограничения, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белки, которые действуют в качестве репрессоров транскрипции, антисмысловые молекулы, рибозимы, небольшие ингибиторные последовательности нуклеиновых кислот, например, но без ограничения, молекулу для РНК-интерференции, малую шпилечную РНК, малую интерферирующую РНК, микро-РНК, антисмысловые олигонуклеотиды и т.п.

В некоторых вариантах осуществления для образования молекулы для РНК-интерференции может использоваться одноцепочечная РНК (оцРНК), форма РНК, эндогенно обнаруживаемая в эукариотических клетках. Клеточные молекулы оцРНК включают информационные РНК (и предшественник премРНК), малые ядерные РНК, малые ядрышковые РНК, транспортные РНК и рибосомальные РНК. Двухцепочечные РНК (дцРНК) индуцируют зависимый от их размера иммунный ответ, так что превышающая 30 п.о. дцРНК активирует ответ с продукцией интерферонов, в то время как более короткие дцРНК вводятся в эндогенный аппарат РНК-интерференции клетки, находящийся в прямом направлении от дайсер фермента.

Тр-РЬА₂ можно уменьшить ингибированием экспрессии полипептида Тр-РЬА₂ или с помощью способов выключения гена, широко известных специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники.

РНК-интерференция обеспечивает мощный способ ингибирования экспрессии выбранных полипептидов-мишеней. Для РНК-интерференции используются дуплексы малых интерферирующих РНК, которые делают информационную РНК, кодирующую полипептид-мишень, мишенью избирательной деградации. Зависимое от малых интерферирующих РНК посттранскрипционное выключение экспрессии гена включает разрезание молекулы мРНК-мишени в месте, в которое нацелена малая интерферирующая РНК.

РНК-интерференция является эволюционно консервативным процессом, посредством которого экспрессия или введение РНК с последовательностью, которая идентична гену-мишени или в высокой степени схожа с таким геном, приводит к последовательность-специфической деградации информационной РНК (мРНК), транскрибируемой с этого сделавшегося мишенью гена, или последовательностьспецифическому посттранскрипционному выключению гена (РТО8) (см. СоЬиги, О. апб Си11еп, В. (2002) 1. о£ Уио1оду 76(18): 9225), что приводит, тем самым, к ингибированию экспрессии гена. В одном варианте осуществления РНК является двухцепочечной РНК (дцРНК). Этот процесс был охарактеризован у растений, беспозвоночных и в клетках млекопитающих. В природе РНК-интерференция инициируется дцРНК-специфической эндонуклеазой дайсер, которая активирует процессивное расщепление длинной дцРНК на двухцепочечные фрагменты, называемые малыми интерферирующими РНК. Малые интерфе- 45 025527 рирующие РНК включаются в белковый комплекс (называемый комплекс для РНК-индуцированного выключения или Ы8С), который распознает и расщепляет мРНК-мишени. РНК-интерференцию можно также инициировать введением молекул нуклеиновых кислот, например, синтетических малых интерферирующих РНК или РНК-интерферирующих агентов, для ингибирования или выключения экспрессии генов-мишеней. Как здесь используется, ингибирование экспрессии гена-мишени включает любое уменьшение экспрессии или активности белка или уровня гена-мишени или белка, кодируемого геноммишенью, по сравнению с ситуацией, при которой РНК-интерференция не была индуцирована. Уменьшение может составлять по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 99% или более по сравнению с экспрессией гена-мишени или активности или уровня белка, кодируемого геном-мишенью, который не сделался мишенью РНК-интерферирующего агента.

Короткую интерферирующую РНК, также упоминаемую здесь как малая интерферирующая РНК, определяют как агент, который функционирует для ингибирования экспрессии гена-мишени, например, путем РНК-интерференции. Малую интерферирующую РНК можно химически синтезировать, можно продуцировать с помощью ίη νί/го транскрипции, или можно продуцировать внутри клеткихозяина . В одном варианте осуществления малая интерферирующая РНК является молекулой двухцепочечной РНК (дцРНК) длиной от приблизительно 15 до приблизительно 40 нуклеотидов, предпочтительно от приблизительно 15 до приблизительно 28 нуклеотидов, более предпочтительно от приблизительно 19 до приблизительно 25 нуклеотидов и более предпочтительно приблизительно 19, 20, 21, 22 или 23 нуклеотида и может содержать 3'- и/или 5'-концевую избыточность на каждой цепи, имеющую длину, составляющую 0, 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов. Длина концевой избыточности является автономной между двумя цепями, т.е. длина концевой избыточности на одной цепи не зависит от длины концевой избыточности на второй цепи. Предпочтительно малая интерферирующая РНК способна активировать РНКинтерференцию через деградацию мишени-информационной РНК (мРНК) или специфическое посттранскрипционное выключение гена (РТС8).

Малая интерферирующая РНК также включает малую шпилечную РНК (также называемую петлей с ножкой). В одном варианте осуществления эти малые шпилечные РНК состоят из короткой (например, от приблизительно 19 до приблизительно 25 нуклеотидов) антисмысловой цепи, за которой следует нуклеотидная петля длиной от приблизительно 5 до приблизительно 9 нуклеотидов и аналогичная смысловая цепь. Альтернативно, смысловая цепь может быть перед нуклеотидной структурой петли, а затем может следовать антисмысловая цепь. Эти малые шпилечные РНК могут содержаться в плазмидах, ретровирусах и лентивирусах и экспрессироваться, например, с промотора ро1 III И6 или другого промотора (см., например, 8/е\уаг1 е/ а1. (2003) ΚNА Арг. 9(4): 493-501, документ, который полностью включен сюда посредством ссылки).

Г ен-мишень или последовательность РНК-интерферирующего агента может быть клеточным геном или геномной последовательностью, например, последовательностью Ьр-РЬА₂. Малая интерферирующая РНК может быть по существу гомологична гену-мишени или геномной последовательности-мишени, или их фрагменту. Используемый в этом контексте термин гомологичная определяют как являющаяся по существу идентичной, достаточно комплементарной или схожей с мРНК-мишенью, или ее фрагментом, для осуществления РНК-интерференции в отношении мишени. Кроме того, встречающиеся в природе молекулы РНК, РНК, подходящие для ингибирования экспрессии последовательности-мишени или внесение в нее помех, включают производные и аналоги РНК. Предпочтительно малая интерферирующая РНК идентична своей мишени.

Предпочтительно малая интерферирующая РНК нацелена только на одну последовательность. Каждый из РНК-интерферирующих агентов, таких как малые интерферирующие РНК, можно подвергнуть скринингу на возможные эффекты вне цели, например, с помощью анализа профиля экспрессии. Такие способы известны квалифицированному в данной области техники специалисту и описываются, например, 1аск8ои и др. в №/1иге Вю1есЬио1оду 6: 635-637, 2003. Помимо анализа профиля экспрессии потенциальные последовательности-мишени можно также подвергнуть скринингу на схожие последовательности в базе данных последовательностей для идентификации потенциальных последовательностей, которые могут иметь эффекты вне цели. Например, в соответствии с к/скюп и др. (там же) 15 или, возможно, минимально 11 непрерывных нуклеотидов идентичности последовательностей достаточно для прямого выключения транскриптов, не являющихся мишенью. Следовательно, можно сначала подвергнуть скринингу предполагаемые малые интерферирующие РНК для исключения возможного выключения не мишеней, используя анализ идентичности последовательностей с помощью любых известных способов сравнения последовательностей, таких как ВЬАЗТ.

Молекулы малых интерферирующих РНК не должны ограничиваться теми молекулами, которые содержат только РНК, но, например, также включают химически модифицированные нуклеотиды и ненуклеотиды, а также включают молекулы, в которых молекула сахара рибозы заменена на другую молекулу сахара или молекулу, которая выполняет схожую функцию. Кроме того, можно использовать неприродную связь между остатками нуклеотидов, такую как фосфоротиоатная связь. Например, в качестве РНК-интерферирующих молекул в соответствии с настоящим изобретением может использоваться малая интерферирующая РНК, содержащая Ό-арабинофуранозильные структуры вместо встречающихся

- 46 025527 в природе Ό-рибонуклеозидов, обнаруживаемых в РНК (патент США № 5177196). Другие примеры включают молекулы РНК, содержащие О-связь между сахаром и гетероциклическим основанием нуклеозида, которая придает устойчивость к нуклеазам и обеспечивает прочное связывание комплементарных цепей с молекулами олигонуклеотидов, схожих с олигонуклеотидами, содержащими 2'-Ометилрибозу, арабинозу и, особенно, -Э-арабинозу (патент США № 5177196).

Из цепи РНК можно получить производные, используя реакционноспособную функциональную группу репортерной группы, такой как флуорофор. Особенно полезные производные модифицированы на конце или концах цепи РНК, обычно на 3'-конце смысловой цепи. Например, можно легко и избирательно модифицировать 2'-гидроксил на 3'-конце рядом групп.

Другие полезные производные РНК включают нуклеотиды, имеющие модифицированные углеводные составляющие, такие как 2'-О-алкилированные остатки или содержащие 2'-О-метилрибозил производные и содержащие 2'-О-фторрибозил производные. Основания РНК могут также быть модифицированы. Можно использовать любое модифицированное основание, пригодное для ингибирования экспрессии последовательности-мишени или внесения в нее помех. Например, можно включить галогенизированные основания, такие как 5-бромурацил и 5-йодурацил. Основания могут быть также алкилированы, например, 7-метилгуанозин можно включить вместо остатка гуанозина. Можно также включить неприродные основания, которые дают успешное ингибирование.

Наиболее предпочтительные модификации малых интерферирующих РНК включают 2'-дезокси-2'фторуридин или нуклеотиды закрытых нуклеиновых кислот и дуплексы РНК, содержащие или сложный фосфодиэфир, или варьирующие числа фосфоротиоатных связей. Такие модификации известны квалифицированному в данной области техники специалисту и описываются, например, ВгааксН и др. в ΒίοсНетМгу, 42: 7987-7975, 2003. Наиболее полезные модификации в молекулах малых интерферирующих РНК можно ввести, используя химические продукты и технологии, широко известные для технологии антисмысловых олигонуклеотидов. Предпочтительно модификации включают минимальную 2'-Ометильную модификацию, предпочтительно они исключают такую модификацию. Модификации также предпочтительно исключают модификации свободных 5-гидроксильных групп малой интерферирующей РНК.

Молекулы малых интерферирующих РНК и микроРНК, имеющие различные хвосты, ковалентно присоединенные или к их 3'-концам, или к их 5'-концам, или к обоим концам, также известны в данной области техники и могут использоваться для стабилизации молекул малых интерферирующих РНК и микроРНК, доставляемых с использованием способов настоящего изобретения. Вообще говоря, интеркалирующие группы, различные виды репортерных групп и липофильные группы, присоединенные к 3'или 5'-концам молекул РНК, хорошо известны квалифицированному в данной области техники специалисту и применимы в соответствии со способами настоящего изобретения. Описания синтезов 3'холестерин- или 3'-акридин-модифицированных олигонуклеотидов, применимых для приготовления модифицированных молекул РНК, применимых в соответствии с настоящим изобретением, можно найти, например, в статьях: Оатрег Н.В., Кеей М.А., Сох Т., У1гоксо 18., Айатк А.И., Оа11 А., 8сНо11ег ТК. аий Меуег, К.В. (1993) Расйе Ргерагайоп апй Ехопис1еаке 8!аЬййу о£ 3'-МойШей Ойдойеохупис1еоййек. ШсШс Ас1Й8 Кек. 21 145-150; Кеей М.А., Айатк А.И., №1коп 18., апй Меуег К.В., 1г. (1991) Аспйте апй СНо1ек1его1-Эег1уа11/ей 8оПй 8ирройк £ог Ппргомей 8уп1Иек1к о£ 3'-МойШей Ойдопис1еоййек. ВюсопщдаЮ СНет. 2: 217-225 (1993).

Другие малые интерферирующие РНК, применимые для нацеливания на экспрессию Ьр-РЬА^ можно легко сконструировать и проверить. Соответственно, малые интерферирующие РНК, применимые для описанных здесь способов, включают молекулы малых интерферирующих РНК длиной от приблизительно 15 до приблизительно 40 или от приблизительно 15 до приблизительно 28 нуклеотидов, которые гомологичны гену Ьр-РЬА^ Предпочтительно, направленные на Рр-РЬА₂ молекулы малых интерферирующих РНК имеют длину, составляющую от приблизительно 19 до приблизительно 25 нуклеотидов. Более предпочтительно, направленные на Рр-РЬА₂ молекулы малых интерферирующих РНК имеют длину, составляющую 19, 20, 21 или 22 нуклеотида. Молекулы малых интерферирующих РНК, направленные на Ьр-РЬА^ могут также включать 3'-гидроксильную группу. Молекулы малых интерферирующих РНК, направленные на Ьр-РЬА^ могут быть одноцепочечными или двухцепочечными; такие молекулы могут быть с тупыми концами или включать липкие концы (например, 5', 3'). В конкретных вариантах осуществления молекула РНК является двухцепочечной и либо с тупыми концами, либо с липкими концами. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна цепь направленной на Рр-РЬА₂ молекулы РНК имеет 3'-концевую избыточность длиной от приблизительно 0 до приблизительно 6 нуклеотидов (например, содержащих пиримидиновые основания нуклеотидов, содержащих пуриновые основания нуклеотидов). В других вариантах осуществления длина 3'-концевой избыточности составляет от приблизительно 1 до приблизительно 5 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 3 нуклеотидов и от приблизительно 2 до приблизительно 4 нуклеотидов. В одном варианте осуществления направленная на Рр-РЬА₂ молекула РНК является двухцепочечной, при этом одна цепь имеет 3'-концевую избыточность, а другая цепь может быть цепью с тупым концом или иметь концевую избыточность. В варианте осуществления, в котором направленная на Рр-РЬА₂ молекула РНК является двухцепочечной, и обе

- 47 025527 цепи содержат концевые избыточности, длины концевых избыточностей могут быть одинаковыми или различными для каждой цепи. В конкретном варианте осуществления РНК настоящего изобретения включает приблизительно 19, 20, 21 или 22 нуклеотида, которые спариваются и которые имеют концевые избыточности длиной от приблизительно 1 до приблизительно 3, в частности, приблизительно 2, нуклеотидов на обоих 3'-концах РНК. В одном варианте осуществления 3'-концевую избыточность можно сделать устойчивой к деградации. В предпочтительном варианте осуществления РНК делают устойчивой включением содержащих пуриновые основания нуклеотидов, таких как содержащих аденозин или гуанозин нуклеотидов. Альтернативно, замена пиримидиновых нуклеотидов модифицированными аналогами, например, 3'-концевого нуклеотида 2-уридин, имеющего липкие концы, 2'-дезокситимидином, является допустимой и не оказывает влияния на эффективность малых интерферирующих РНК. Отсутствие 2'-гидроксила значительно усиливает устойчивость к нуклеазам концевой избыточности в среде для культивирования тканей.

мРНК для Ьр-РЬА₂ была успешно превращена в мишень, используя малые интерферирующие РНК, и такие малые интерферирующие РНК или векторы для их приготовления имеются в продаже, например, от 1пуПгодсп. В некоторых вариантах осуществления оценку экспрессии и/или уничтожения белка ЬрРЬА₂, используя такие направленные на Ьр-РЬА₂ малые интерферирующие РНК, можно осуществить, используя имеющиеся в продаже наборы, например, но без ограничения, анализ РЬАС от йаОехик. Другие средства могут быть без труда приготовлены квалифицированными в данной области техники специалистами на основе известной последовательности мРНК-мишени. Во избежание сомнений, предоставляется последовательность кДНК Ьр-РЬА₂ человека, например, № доступа в СепВапк: И20157 (8ЕЦ ГО N0: 1) или ΝΜ_005084 (8ЕЦ ΙΌ N0: 2). Последовательность с № доступа И20157 является следующей последовательностью (8ЕЦ ГО N0: 1):

дсХддХсдда ддсхсдсадх дсХдХсддсд адаадсадхс дддХХХддад сдсХХдддХс дсдххддсдс дсддХддаас дсдоссаддд ассссадххс ссдедадсад сХссдсдссд

121 сдссХдадад асХаадсХда ааоХдсХдсх садоХсссаа даХддХдсеа оссаааХХдо

131 аХдХдсХХХХ сХдссХсХдс ддсХдссХдд сХдХддХХХа ХссХХХХдас хддсааХаса

241 ХаааХссХдХ ХдсссаЁаХд аааХсаХсад саХдддХсаа сааааХасаа дХасХдаХдд

301 сХдсХдсаад сХХХддссаа асХааааХсс сссддддааа ХдддссХХаХ ХссдХХддХХ

361 дХасздзсХХ ааХдХХХдаХ сасасХааХэ адддсассХХ сХХдсдХСХа СаЬхахссаХ

421 сссаадаХаа ХдаХсдссХХ дасасссххь ддаХсссааа хааадааХаХ ххххддддхс

481 ХХадсаааХХ ХсХХддааса сасХддсХХа ХдддсаасаХ ХХХдаддХХа сХсХХХддХХ

541 сааХдасаас ХссХдсааас ХддааХХссс сХсХдаддсс ХддХдааааа ХаХссасХХд

601 ХХдХХХХХХс ХсаХддХсХХ ддддсаХХса ддасасХХХа ХХсХдсХаХХ ддсаХХдасс

661 ХддсаХсХса ХдддХХХаХа дХХдсХдсХд Хадаасасад адаХадаХсХ дсаХсХдсаа

721 сХХасХаХХХ сааддассаа ХсХдсХдсад аааХадддда саадХсХХдд сХсХассХХа

701 даасссхдаа асаададдад дадасасаХа ХасдаааХда доаддХасдд сааададсаа

841 аадаахдххс ссаадсхсхс адХсХдаХХс ххдасаххда хсаХддааад ссадХдаада

901 аХ'дсаЬХада ХХЬааадХЬХ даХаХддаас аасХдаадда сХсХаХХдаХ адддаааааа

961 ХадсадХааХ ЬддасаХХсХ СХХддХддад саасддХХаЬ ХсадзсХсХХ адЬдаадаХс

1021 ададаХХсад аХдХддХаХХ дсссХддаХд еаХддаХдХХ ЬссасХдддХ даЬдаадХах

1081 аххссадаах ХссХсадссс сХсХХХХХХа ХсаасХсХда аХаХХХссаа ХаХссХдсХа

1141 ахахсахааа аахдаааааа ХдсхасХсас сХдаХааада аадааадаХд аХХасааХса

1201 ддддххсадх ссассадаах хххдсхдасх ХсаоХХХХдс аасХддсааа аХааХХддас

1261 асаХдсХсаа аХХаааддда дасаХадаХХ саааХдХадс ХаХХдаХсХХ адсаасааад

1321 сХХсаХХадс аХХсХХасаа аадсаХХХад дасХХсаХаа адаХХХХдаХ садХдддасЬ

13В1 дсХХдаХхда аддадаХдаХ дадааХсХХа ХХссадддас саасаХХаас асаассааХс

1441 аасасаХсаХ дХХасадаас ХсХЬсаддаа Хададзааха сааххаддах ХааааХаддХ

1501 ХХХХХ

Последовательности малых интерферирующих РНК выбирают так, чтобы максимизировать внедрение антисмысловой (направляющей) цепи малой интерферирующей РНК в К18С и, тем самым, максимизировать способность К18С делать мРНК Ьр-РЬА₂ человека мишенью деградации. Это можно успешно выполнить путем отбора последовательностей, которые имеют наименьшую свободную энергию связывания на 5'-конце антисмысловой цепи. Низкая свободная энергия приводит к усилению раскручивания 5'-конца антисмысловой цепи дуплекса малой интерферирующей РНК, тем самым, обеспечивая внедрение антисмысловой цепи в К18С и непосредственное последовательностьспецифическое расщепление мРНК Ьр-РЬА₂ человека.

В предпочтительном варианте осуществления малая интерферирующая РНК или модифицированная малая интерферирующая РНК доставляется в фармацевтически приемлемом носителе. В фармацевтически приемлемый носитель могут быть добавлены дополнительные агенты-носители, такие как липосомы.

В другом варианте осуществления малая интерферирующая РНК доставляется путем доставки вектора, кодирующего малую шпилечную РНК, в фармацевтически приемлемом носители в клетки органа индивидуума. Малые шпилечные РНК превращаются клетками после транскрипции в малую интерферирующую РНК, способную к нацеливанию, например, на Ьр-РЬА₂. В одном варианте осуществления вектор может быть регулируемым вектором, таким как тетрациклин-индуцибельный вектор.

В одном варианте осуществления РНК-интерферирующие агенты, используемые в описанных здесь способах, активно поглощаются клетками ίη νίνο после внутривенной инъекции, например, гидродинамической инъекции, без применения вектора, что иллюстрирует эффективную ίη νίνο доставку РНКинтерферирующих агентов, например, малых интерферирующих РНК, используемых в способах на- 48 025527 стоящего изобретения.

Могут также использоваться другие стратегии для доставки РНК-интерферирующих агентов, например, малых интерферирующих РНК или малых шпилечных РНК, используемых в способах настоящего изобретения, такие как, например, доставка с помощью вектора, например, плазмидного или вирусного вектора, например, лентивирусного вектора. Такие векторы можно использовать, как описано, например, Х1ао-Реп§ Οίπ и др. в Ргос. Ναΐΐ. Асай. δοΐ. и.8.А., 100: 183-188. Другие способы доставки включают доставку РНК-интерферирующих агентов, например, малых интерферирующих РНК или малых шпилечных РНК настоящего изобретения, используя основный пептид, путем конъюгации или смешивания РНК-интерферирующего агента с основным пептидом, например, фрагментом пептида ТАТ, смешивания с катионными липидами или формулирования в частицы.

Как отмечено, дцРНК, такие как малая интерферирующая РНК или малая шпилечная РНК, могут быть доставлены, используя индуцибельный вектор, такой как тетрациклин-индуцибельный вектор. Можно использовать способы, описанные, например, Лапд и др. в Ргос. ΝαΙΙ. Асай. 8а. 100: 5103-5106, используя векторы рТе1-0п (ВИ Вюкаепсек С1оп1еск. Ра1о АЙо, СА). В некоторых вариантах осуществления вектор может быть плазмидным вектором, вирусным вектором или любым другим подходящим носителем, приспособленным к встраиванию чужеродной последовательности и к введению в эукариотические клетки. Вектор может быть экспрессионным вектором, способным управлять транскрипцией ДНК-последовательности молекулы нуклеиновой кислоты-агониста или антагониста в РНК. Вирусные экспрессионные векторы можно выбрать из группы, включающей, например, ретровирусы, лентивирусы, вирус Эпштейна-Барра, вирус папилломы крупного рогатого скота, векторы на основе аденовируса и аденоассоциированного вируса и гибридный вирус любых из вышеперечисленных. В одном варианте осуществления вектор является эписомным. Использование подходящего эписомного вектора обеспечивает способ сохранения молекулы нуклеиновой кислоты-антагониста у субъекта в большом числе копий вне хромосомной ДНК, исключая, тем самым, возможные эффекты интеграции в хромосому.

Молекулы для РНК-интерференции и ингибиторы в виде нуклеиновых кислот, применимые в раскрытых здесь способах, можно получить, используя любые известные методы, такие как прямой химический синтез, через процессирование более длинных двухцепочечных РНК путем подвергания воздействию рекомбинантного дайсер белка или лизатов зародышей дрозофилы, благодаря ίη уйго системе, полученной из клеток 82, используя РНК-полимеразу фага, РНК-зависимую РНК-полимеразу, и основанные на ДНК векторы. Использование клеточных лизатов или ίη уйго процессирование может, кроме того, включать последующее выделение коротких, например, длиной приблизительно 21-23 нуклеотидов, малых интерферирующих РНК из лизата и т.п. К химическому синтезу обычно приступают с получения двух одноцепочечных РНК-олигомеров, за которым следует отжиг двух одноцепочечных олигомеров в двухцепочечную РНК. Другие примеры включают способы, раскрытые в ЛО 99/32619 и ЛО 01/68836, в которых приводятся наставления в отношении химического и ферментативного синтеза малой интерферирующей РНК. Кроме того, для конструирования и производства специфических малых интерферирующих РНК имеются многочисленные коммерческие системы обеспечения (см., например, ΟΙΑΟΕΝ 1пс., Уа1епаа, СА и ΑΜΒΙ0Ν 1пс., Аикйп, ТХ).

В некоторых вариантах осуществления агентом является белок или полипептид или агент для РНКинтерференции, который ингибирует экспрессию Ьр-РЬА₂ и/или активность белка Ьр-РЬА₂. В таких вариантах осуществления клетки можно модифицировать (например, с помощью гомологичной рекомбинации) для обеспечения увеличенной экспрессии такого агента, например, путем замены, полной или частичной, встречающегося в природе промотора полным гетерологичным промотором или его частью из условия, чтобы клетки экспрессировали природный агент-ингибитор Ьр-РЬА₂, например, ингибитор Ьр-РЬА₂ в виде белка или микроРНК, на высоких уровнях. Гетерологичный промотор встраивают так, чтобы он был функционально связан с желаемой нуклеиновой кислотой, кодирующей агент. См., например, публикацию международной РСТ-заявки ЛО 94/12650 (Ттапккатуойс Тйегар1е5, 1пс.); публикацию международной РСТ-заявки ЛО 92/20808 (Се11 Сепезуз, 1пс.) и публикацию международной РСТ-заявки ЛО 91/09955 (АррБей Кекеатсй 8у51ет5). Можно также разработать клетки, экспрессируюшие эндогенный ген, включающий агент, под контролем индуцибельных регуляторных элементов, в случае которых регуляторные последовательности эндогенного гена можно заменить с помощью гомологичной рекомбинации. Методы активации генов описываются в патенте США № 5272071, выданном Скарре1; в патенте США № 5578461, выданном 8йегош и др.; в заявке РСТ/и892/09627 (ЛО 93/09222) 8е1йеп и др., и в заявке РСТ/и890/06436 (ЛО 91/06667) и др. Агент можно приготовить культивированием трансформированных клеток-хозяев в условиях культивирования, подходящих для экспрессии микроРНК.

Результирующий экспрессированный агент можно затем очистить из такой культуры (т.е. среды для культивирования клеток или клеточных экстрактов), используя известные способы очистки, такие как гель-фильтрация и ионообменная хроматография. Очистка ингибитора Ьр-РЬА^агента в виде пептида или нуклеиновой кислоты может также включать аффинную колонку, содержащую агенты, которые будут связывать белок; одну или несколько стадий колоночной хроматографии на таких смолах для связывания по сродству, как конканавалин А-агароза, керапп-ЮуореагЕ™ или сефароза СлЫасгот Ыие 3ОА; одну или несколько стадий, включающих хроматографию на основе гидрофобных взаимодействий, ис- 49 025527 пользуя такие смолы, как фениловый эфир, бутиловый эфир или пропиловый эфир; иммуноаффинную хроматографию или аффинную хроматографию с использованием комплементарной кДНК.

В одном варианте осуществления ингибиторы Ьр-РЬА₂ в виде нуклеиновых кислот можно получить синтетически, например, путем химического синтеза нуклеиновой кислоты любым способом синтеза, известным квалифицированному специалисту. Являющиеся ингибиторами Ьр-РЬА₂, синтезированные нуклеиновые кислоты затем можно очистить с помощью любого способа, известного в данной области техники. Способы химического синтеза нуклеиновых кислот включают, но без ограничения, ίη νίίΓΟ химический синтез, используя фосфотриэфирную, фосфатную или фосфорамидитную технологию и твердофазные методы, или через промежуточные продукты дезоксинуклеозид-Н-фосфонаты (см. патент США № 5705629, выданный В1опд1е).

В некоторых случаях, например, когда желательна увеличенная устойчивость к нуклеазам, предпочтительными могут быть нуклеиновые кислоты, включающие аналоги нуклеиновых кислот и/или имеющие модифицированные межнуклеозидные связи. Нуклеиновые кислоты, содержащие модифицированные межнуклеозидные связи, можно также синтезировать, используя реагенты и способы, которые широко известны в данной области техники. Например, в данной области техники широко известны способы синтеза нуклеиновых кислот, содержащих фосфонатные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, фосфорамидатные, метоксиэтилфосфорамидатные, формацетальные, тиоформацетальные, диизопропилсилильные, ацетамидатные, карбаматные, диметиленсульфидные (-СН₂-З-СН₂), диметиленсульфоксидные (-СН₂-ЗО-СН₂), диметиленсульфонные (-СН₂-ЗО₂-СН₂), 2'-О-алкильные и 2'-дезокси-2'-фторфосфоротиоатные межнуклеозидные связи (см. иЬ1тапп еί а1., 1990, СЬет. Ке\\ 90: 543-584; ЗсЬпеИег еί а1., 1990, ТейаЬейгоп Ьей. 31: 335 и приведенные там ссылки). В патентах США № 5614617 и 5223618, выданных Соок и др., № 5714606, выданном Αсеνеάо и др., № 5378825, выданном Соок и др., № 5672697 и 5466786, выданных ВиЬг и др., № 5777092, выданном Соок и др., № 5602240, выданном Эе Мезтаскег и др., № 5610289, выданном Соок и др., и № 5858988, выданном Vаηд. также описываются аналоги нуклеиновых кислот для усиления устойчивости к нуклеазам и поглощения клетками.

Синтетические молекулы малых интерферирующих РНК, включающие молекулы малых шпилечных РНК, можно получить, используя ряд методов, известных квалифицированным в данной области техники специалистам. Например, молекулы малых интерферирующих РНК можно химически синтезировать или рекомбинантно продуцировать, используя известные в данной области техники способы, такие как использование соответствующим образом защищенных рибонуклеозид-фосфорамидитов и обычного ДНК/РНК синтезатора (см., например, Е1Ьа8Й1г З.М. еί а1. (2001) №1иге 411: 494-498; Е1Ьа8Й1г З.М., V. Ьепйеске1 апй Т. Ти8сЬ1 (2001) Сепе8 & ^еνе1ортеηί 15: 188-200; НагЬойЬ, ί. еί а1. (2001) ί. Се11 8с1епсе 114: 4557-4565; Ма81ег8, ЙК. еί а1. (2001) Ргос. №Й. Асай 8ск ИЗА 98: 8012-8017; Ти8сЬ1, Т. еί а1. (1999) Сепе8 & ^еνе1ортеηί 13: 3191-3197). Альтернативно, имеется несколько коммерческих поставщиков услуг, связанных с синтезом РНК, включающих, но без ограничения, Ргойдо (НатЬигд, Германия), ЭЬагтасоп Ке8еагсЬ (ЬаГауейе, СО, США), Р1егсе СЬетюа1 (часть РегЬю Заепсе, КоскГогй, Ш. США), С1еп Ке8еагсЬ ^егйпд, VΑ, США), СЬетСепе8 (А8Й1апй, МА, США) и СгиасЬет (С1а8доте, Соединенное Королевство). Как таковые, молекулы малых интерферирующих РНК не слишком трудно синтезировать и легко обеспечить с качеством, подходящим для РНК-интерференции. Кроме того, дцРНК можно экспрессировать в виде структур петель с ножками, кодируемых плазмидными векторами, ретровирусами и лентивирусами (РайЙ18оп, Р.й еί а1. (2002) Сепе8 Эе\'. 16: 948-958; МсМапи8 М.Т. еί а1. (2002) КЫА 8: 842850; Раи1, С.Р. еί а1. (2002) №·ιΙ. ВюйсЬпо1. 20: 505-508; М1уад18Ы М. еί а1. (2002) №·ιΙ. ВюйсЬпо1. 20: 497500; Зш С. еί а1. (2002) Ргос. Асай За ИЗА 99: 5515-5520; Вгитте1катр Т. еί а1. (2002) Сапсег Се11

2: 243; Ьее Ν.3., е1 а1. (2002) №ί. ВюйсЬпо1. 20: 500-505; Υυ ΙΥ. е1 а1. (2002) Ргос. №Й. Асай. Зс1. ИЗА 99: 6047-6052; Ζ^Ίΐμ Υ. е1 а1. (2002) Мо1. Се11 9: 1327-1333; КиЫтоп Э.А., е1 а1. (2003) №ί. Сепек 33: 401-406; З1е\уаг1 З.А., еί а1. (2003) КNΑ 9: 493-501). Эти векторы обычно имеют промотор ро1Ш в области ир81геат дцРНК, и могут экспрессировать смысловую и антисмысловную РНК-цепи отдельно и/или в виде шпилечных структур. Внутри клеток дайсер процессирует малую шпилечную РНК в эффективную малую интерферирующую РНК.

Наведенную на цель область молекулы малой интерферирующей РНК настоящего изобретения можно выбрать из установленной последовательности гена-мишени, например, кодирующей Ьр-РЬА₂последовательности, начиная с приблизительно 25 по 50 нуклеотид, с приблизительно 50 по 75 нуклеотид или с приблизительно 75 по 100 нуклеотид в области йо\уп81геат инициирующего кодона. Нуклеотидные последовательности могут содержать 5' или 3' ИТК и области, расположенные поблизости от инициирующего кодона. Один способ конструирования молекулы малой интерферирующей РНК настоящего изобретения включает идентификацию состоящего из 23 нуклеотидов элемента последовательности АА(Ш9)ТТ (где N может быть любым нуклеотидом) и отбор вариантов с содержанием С/С, составляющим по меньшей мере 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 или 75%. Часть последовательности ТТ является необязательной. Альтернативно, если такая последовательность не выявляется, поиск можно продолжить, используя элемент NΑ(N21), где N может быть любым нуклеотидом. В этом случае 3'-конец смысловой малой интерферирующей РНК можно превратить в ТТ для того, чтобы сделать возможным образование симметричного дуплекса относительно состава последовательностей смысловой и

- 50 025527 антисмысловой 3'-концевых избыточностей. Антисмысловую молекулу малой интерферирующей РНК можно затем синтезировать в виде комплемента нуклеотидов в положениях с 1 по 21 состоящего из 23 нуклеотидов элемента последовательности. Использование симметричных 3'-концевых избыточностей ТТ может быть полезным для обеспечения того, чтобы малые интерферирующие рибонуклеопротеиновые частицы образовывались в приблизительно равных соотношениях этих частиц, расщепляющих смысловую и антисмысловую РНК-мишени (Е1ЪакЫг е! а1. (2001), выше, и Е1ЪакЫг е! а1. (2001), выше). Анализ баз данных последовательностей, включающих, но без ограничения, NСВI, ВЬА8Т, Оег\уеп1 и Сеп8ес|, а также имеющееся в продаже программное обеспечение для олигосинтеза, такое как ОНдоепдше®, могут также использоваться для отбора последовательностей малых интерферирующих РНК из библиотек Е8Т для гарантии того, что только один ген станет мишенью.

Доставка РНК-интерферирующих агентов

Способы доставки РНК-интерферирующих агентов, например, малой интерферирующей РНК, или векторов, содержащих РНК-интерферирующий агент, в клетки-мишени (например, клетки головного мозга или другие желаемые клетки-мишени, например клетки центральной и периферической нервной системы) могут включать, например, (ί) инъекцию композиции, содержащей РНК-интерферирующий агент, например, малую интерферирующую РНК; или (ΐΐ) приведение клетки, например, клетки головного мозга, в непосредственный контакт с композицией, содержащей РНК-интерферирующий агент, например, малую интерферирующую РНК. В другом варианте осуществления РНК-интерферирующие агенты, например малую интерферирующую РНК, можно вводить непосредственно в какой-либо кровеносный сосуд, такой как вена, артерия, венула или артериола, посредством, например, гидродинамической инъекции или катетеризации. В некоторых вариантах осуществления направленные на Ьр-РЬА₂агенты, такие как направленная на Ьр-РЬА₂ малая интерферирующая РНК, могут доставляться в конкретные органы, например, печень, костный мозг, или системно.

Введение может быть однократной инъекцией или с использованием двух или более инъекций. РНК-интерферирующий агент доставляется в фармацевтически приемлемом носителе. Один или несколько РНК-интерферирующих агентов могут использоваться одновременно. РНК-интерферирующие агенты, например малые интерферирующие РНК, направленные на мРНК Ьр-РЬА^ могут доставляться отдельно или в комбинации с другими РНК-интерферирующими агентами, например, малыми интерферирующими РНК, такими как, например, малые интерферирующие РНК, направленные на другие клеточные гены. Направленные на Ьр-РЬА₂ малые интерферирующие РНК могут также вводиться вместе с другими фармацевтическими агентами, которые используются для лечения или профилактики нейродегенеративных заболеваний или нарушений.

В одном варианте осуществления мишенями РНК-интерференции являются специфические клетки, ограничивающие возможные побочные эффекты РНК-интерференции, вызванные неспецифическим наведением на цель РНК-интерференции. В способе может использоваться, например, комплекс или слитая молекула, включающие направленную на клетку составляющую и связывающую молекулу для РНКинтерференции составляющую, которые используются для эффективной доставки молекул для РНКинтерференции в клетки. Например, слитый белок антитело-протамин после смешивания с малой интерферирующей РНК связывается с малой интерферирующей РНК и избирательно доставляет малую интерферирующую РНК в клетки, экспрессирующие распознаваемый антителом антиген, что приводит к выключению экспрессии гена только в тех клетках, которые экспрессируют антиген. Составляющая, связывающая малую интерферирующую РНК или индуцирующую РНК-интерференцию молекулу, является белком или связывающим нуклеиновую кислоту доменом или фрагментом белка, и связывающая составляющая сконденсирована с частью направляющей составляющей. Местонахождение направляющей составляющей может быть или на карбоксильном конце, или на аминоконце конструкции или в середине слитого белка.

Для доставки малых интерферирующих РНК в клетки ш уйго и ш νί\Ό может использоваться механизм опосредованной вирусами доставки, описанный Х1а, Н. и др. (2002) в №ц. Вю!есЬпо1. 20(10): 1006. Для доставки малых шпилечных РНК в клетки ш У1!го и ш У1уо могут также использоваться механизмы опосредованных плазмидами или вирусами доставок малых шпилечных РНК, описанные КиЪшкоп, Э.А. и др. (2003) в N81. Сепе!. 33: 401-406 и 8!е^аг1, 8.А. и др. (2003) в ^А 9: 493-501.

РНК-интерферирующие агенты, например, малую интерферирующую РНК, можно также вводить в клетки через сосудистую и внесосудистую циркуляцию, кровеносную или лимфатическую систему и спинномозговую жидкость.

Доза конкретного РНК-интерферирующего агента будет составлять количество, необходимое для осуществления РНК-интерференции, например, посттрансляционного выключения гена (РТС8) конкретного гена-мишени, что, тем самым, приводит к ингибированию экспрессии гена-мишени или ингибированию активности или уровня белка, кодируемого геном-мишенью.

Также известно, что молекулы для РНК-интерференции не должны полностью соответствовать их последовательности-мишени. Предпочтительно, однако, когда 5' и срединная часть антисмысловой (направляющей) цепи малой интерферирующей РНК полностью комплементарна мишенипоследовательности нуклеиновой кислоты.

- 51 025527

Соответственно, молекулами для РНК-интерференции, функционирующими в качестве ингибиторов Ьр-РЬА₂ в виде нуклеиновых кислот в настоящем изобретении, являются, например, но без ограничения, немодифицированные или модифицированные двухцепочечные РНК-молекулы, включающие малую временную РНК, малую интерферирующую РНК, малую шпилечную РНК, микроРНК, двухцепочечную РНК (дцРНК) (см., например, Ваи1сотЬе, 8с1епсе 297: 2002-2003, 2002). Молекулы дцРНК, например, малая интерферирующая РНК, также может содержать 3'-концевые избыточности, предпочтительно 3'-концевые избыточности ИИ или ТТ. В одном варианте осуществления молекулы малых интерферирующих РНК настоящего изобретения не включают молекулы РНК, которые включают оцРНК, превышающую приблизительно 30-40 оснований, приблизительно 40-50 оснований, приблизительно 50 оснований или больше. В одном варианте осуществления молекулы малых интерферирующих РНК настоящего изобретения являются двухцепочечными на протяжении более чем приблизительно 25%, более чем приблизительно 50%, более чем приблизительно 60%, более чем приблизительно 70%, более чем приблизительно 80%, более чем приблизительно 90% их длины. В некоторых вариантах осуществления ингибитором Ьр-РЬА₂ в виде нуклеиновой кислоты является любой агент, который связывается с мРНК для Ьр-РЬА₂ и ингибирует ее экспрессию, причем ингибированию подвергается экспрессия мРНК для Ьр-РЬА₂ или продукта транскрипции нуклеиновой кислоты, кодируемой 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1 или 2.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибирующими Ьр-РЬА₂ агентами являются конструкции каталитических нуклеиновых кислот, такие как, например, рибозимы, которые способны к расщеплению РНК-транскриптов и, тем самым, предотвращению продукции белка дикого типа. Рибозимы направлены на конкретную последовательность и подвергаются с ней отжигу благодаря двум районам последовательности, комплементарным мишени, фланкирующим каталитический сайт рибозима. После связывания рибозим расщепляет мишень сайт-специфическим образом. Конструирование и проверку рибозимов, которые специфически распознают и расщепляют описанные здесь последовательности продуктов гена, например, Ьр-РЬА₂, или их гомологи или варианты, можно успешно выполнить с помощью методов, хорошо известных квалифицированным в данной области техники специалистам (например, Ь1еЬег апб 81гаи88 (1995) Μο1. Се11. Βίο1. 15: 540-551, раскрытие этого документа включено сюда посредством ссылки).

Ингибиторы Ьр-РЬА₂ в виде белков и пептидов

В некоторых вариантах осуществления агентами, которые ингибируют Ьр-РЬА₂, являются ингибиторы в виде белков и/или пептидов или фрагменты ингибиторов Ьр-РЬА₂, например, но без ограничения, мутированные белки, терапевтические белки и рекомбинантные белки. Ингибиторы в виде белков и пептидов могут также включать, например, мутированные белки, генетически модифицированные белки, пептиды, синтетические пептиды, рекомбинантные белки, химерные белки, антитела, гуманизированные белки, гуманизированные антитела, химерные антитела, модифицированные белки и их фрагменты.

В некоторых вариантах осуществления агентами, которые ингибируют Ьр-РЬА₂, являются доминантно-отрицательные варианты Ьр-РЬА₂, например нефункционирующий вариант Ьр-РЬА₂.

Антитела

В некоторых вариантах осуществления применимые в способах настоящего изобретения ингибиторы генов и/или продуктов генов включают, например, антитела, в том числе моноклональные, химерные, гуманизированные и рекомбинантные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления в качестве ингибиторов фермента Ьр-РЬА₂ можно использовать нейтрализующие антитела. Антитела легко индуцировать у животных, таких как кролики или мыши, иммунизацией антигеном. Иммунизированные мыши особенно полезны для обеспечения источников В-клеток для производства гибридом, которые в свою очередь культивируют для получения больших количеств моноклональных антител.

В одном варианте осуществления этого изобретения ингибитором определенных здесь продуктов генов может быть молекула антитела или эпитопсвязывающая составляющая молекулы антитела и т.п. Антитела предусматривают высокую авидность связывания и уникальную специфичность в отношении широкого ряда мишеней - антигенов и гаптенов. Моноклональные антитела, пригодные для осуществления на практике настоящего изобретения, включают целое антитело или его фрагменты, и их создают согласно общепринятым методам, таким как синтез гибридом, методы рекомбинантных ДНК и синтез белков.

Применимые моноклональные антитела и фрагменты могут происходить из любого вида (в том числе людей) или могут быть созданы в виде химерных белков, в которых используются последовательности из более чем одного вида. В соответствии с настоящим изобретением также используются моноклональные антитела человека или гуманизированные мышиные антитела. Например, мышиное моноклональное антитело может быть подвергнуто гуманизации путем генетического рекомбинирования нуклеотидной последовательности, кодирующей Ρν-область мыши (т.е. содержащую антигенсвязывающие сайты) или ее определяющие комплементарность участки, с нуклеотидной последовательностью, кодирующей область константных доменов человека и Рс-область. Признается, что гуманизированные направляющие составляющие уменьшают иммунореактивность антитела или полипептида в реципиентехозяине, делая возможными увеличение полупериода существования и уменьшение возможности небла- 52 025527 гоприятных иммунных реакций образом, схожим с тем, который описан в заявке на европейский патент № 0411893 А2. Антигенсвязывающую активность определяют по последовательностям и конформации аминокислот шести определяющих комплементарность участков (СОК), которые находятся в легкой и тяжелой цепях (по три СЭК в каждой из этих цепей) вариабельной части (Ρν) антитела. Молекула одноцепочечного Ρν (5сΡν) с М.м. 25 кДа, состоящая из вариабельной области (УЪ) легкой цепи и вариабельной области (νΉ) тяжелой цепи, соединенных через последовательность короткого пептидного спейсера, является наименьшим фрагментом антитела, разработанным на данное число. Были разработаны методы для дисплея молекул 5сΡν на поверхности нитчатых фагов, которые содержат ген для 8сΡν. Молекулы 5сΡν с широким выбором антигенных специфичностей могут присутствовать в одном большом пуле библиотеки 8сΡν-фагов. Некоторые примеры моноклональных антител и их химерных производных с высокими аффинностями, применимых в способах настоящего изобретения, описываются в заявке на европейский патент ЕР 186833; РСТ-заявке на патент ¥0 92/16553 и в патенте США № 6090923.

Химерные антитела представляют собой молекулы иммуноглобулинов, характеризующиеся двумя или более сегментами или частями, происходящими из различных видов животных. Как правило, вариабельная область химерного антитела происходит из антитела не являющегося человеком млекопитающего, такого как мышиное моноклональное антитело, а константная область иммуноглобулина происходит из молекулы иммуноглобулина человека. Предпочтительно, обе области и их комбинация имеют низкую иммуногенность, определяемую в заведенном порядке.

Одним из ограничений молекул 8сΡν является их одновалентное взаимодействие с антигеноммишенью. Одним из самых легких способов улучшения связывания 8сΡν с его мишенью-антигеном является увеличение его функциональной аффинности через создание мультимера. Объединение идентичных молекул 5сΡν с образованием диател, триател и тетрател может включать ряд идентичных модулей Ρν. Эти реагенты, поэтому, являются поливалентными, но моноспецифическими. Объединение двух различных модулей 5сΡν, при этом каждый модуль включает УН- и УЪ-домены, происходящие из различных исходных будет приводить к образованию полностью функционального биспецифического диатела. Уникальным применением биспецифических 8сΡν является связывание двух сайтов одновременно на одной и той же молекуле-мишени благодаря двум (соседним) поверхностным эпитопам. Эти реагенты обеспечили значительное преимущество в авидности относительно одноцепочечных 8сΡν или РаЬфрагментов. Был разработан ряд поливалентных структур, основанных на 8сΡν, включающих, например, миниантитела, димерные миниантитела, минитела, (5сРу)₂, диатела и триатела. Эти молекулы охватывают ряд валентностей (от двух до четырех сайтов связывания), размеров (от 50 до 120 кДа), гибкости и легкости продукции. В большинстве случаев одноцепочечные Ρν-фрагменты антител (5сРу) являются предоминантными мономерными, когда УН- и УЪ-домены соединены с помощью полипептидных линкеров из по меньшей мере 12 остатков. Во всех условиях термодинамически стабильным является мономерный 5сΡν с линкерами длиной 12 и 25 аминокислот. Молекулы нековалентных диател и триател легко сконструировать, и их получают путем укорочения пептидного линкера, который соединяет вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи молекулы одноцепочечного 5сΡν. Димеры 5сΡν соединены с помощью амфипатических спиралей, которые придают высокую степень гибкости, и структуру миниантитела можно модифицировать с созданием димерного биспецифического (ΌίΒί) миниантитела, которое содержит два миниантитела (четыре молекулы 5сΡν), соединенных через двойную спираль. Сконденсированные на уровне гена или связанные через дисульфидную связь димеры 5сΡν предусматривают промежуточную степень гибкости и создаются методами непосредственного клонирования с добавлением С-концевой последовательности С1у4Су5. Минитела 5сΡν-СН3 состоят из двух молекул 5сΡν, соединенных с СН3-доменом или напрямую (ЬО-минитело), или через очень гибкую шарнирную область (Р1ех-минитело). Эти двухвалентные конструкции с молекулярной массой, составляющей приблизительно 80 кДа, способны к значительному связыванию с антигенами. Р1ех-минитело проявляет впечатляющую локализацию в опухолях мышей. Би- и триспецифические мультимеры могут быть образованы путем объединения различных молекул 5сΡν. Увеличения функциональной аффинности можно достичь, когда РаЬ- или одноцепоченые Ρν (5сΡν)-фрагменты антител подвергают комплексному соединению в димеры, тримеры или большие агрегаты. Самым важным преимуществом поливалентных 5сΡν над одновалентными 5сΡν- и ΡаЬ-фрагментами является увеличение функциональной аффинности связывания (авидности) с антигенами-мишенями. Для высокой авидности требуется, чтобы мультимеры 5сΡν были способны к связыванию одновременно с различными антигенами-мишенями. Увеличение функциональной аффинности у диател из 5сΡν по сравнению с мономерами 5сΡν является значительным и главным образом проявляется в уменьшенных скоростях диссоциации, что является следствием множественного связывания с двумя или более антигенами-мишенями и приводит к повторному связыванию, когда один Ρν подвергается диссоциации. Когда такие молекулы 5сΡν объединяются в мультимеры, можно осуществить конструирование их или с высокой авидностью в отношении одного антигенамишени, или со множеством специфичностей в отношении различных антигенов-мишеней. Множественное связывание с антигенами зависит от надлежащего расположения и ориентации Ρν-модулей. Для полной авидности в целевом поливалентном 5сΡν антигенсвязывающие сайты должны быть ориентированы в одном и том же направлении. Если множественное связывание стерически невозможно, тогда

- 53 025527 видимые увеличения функциональной аффинности, вероятно, обусловлены эффектом увеличения повторного связывания, которое зависит от скоростей диффузии и концентрации антигена. Для настоящего изобретения также предусматриваются антитела, конъюгированные с составляющими, которые улучшают их свойства. Например, для настоящего изобретения можно использовать конъюгаты антитела с РЕО, который увеличивает их полупериод существования ш У1уо. Иммунные библиотеки готовят подверганием амплификации с помощью ПЦР генов, кодирующих вариабельные фрагменты антител, из Влимфоцитов неиммунизированных или иммунизированных животных или пациентов. Используют комбинации олигонуклеотидов, которые являются специфичными для генов иммуноглобулинов или семейств генов иммуноглобулинов. Гены иммуноглобулинов зародышевой линии можно использовать для приготовления наборов полусинтетических антител, при этом определяющий комплементарность участок вариабельных фрагментов амплифицируют с помощью ПЦР, используя вырожденные праймеры. Преимуществом таких библиотек одной совокупности является то, что фрагменты антител против большого числа антигенов можно выделить из одной единственной библиотеки. Для увеличения аффинности фрагментов антител можно использовать метод фагового дисплея, при этом новые библиотеки готовят из уже существующих фрагментов антител с помощью случайного мутагенеза, мутагенеза со смещением кодонов или сайт-направленного мутагенеза, путем перетасовки цепей отдельных доменов с цепями фрагментов из первичных наборов или путем использования бактериальных штаммов-мутаторов.

Альтернативно, для продуцирования антител или их фрагментов можно использовать мышь ЗСГОЬи, например, модель, разработанную ОепрЬагт. В одном варианте осуществления предусматривается новый тип связывающейся с высокой авидностью молекулы, названной пептатело, созданной путем использования в максимальной мере эффекта множественного взаимодействия. Короткий пептидный лиганд конденсируют через полужесткую шарнирную область с доменом с биспиральной сборкой олигомерного матриксного белка хряща, что дает в результате пентамерную молекулу с поливалентным связыванием. В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения лиганды и/или химерные ингибиторы могут быть нацелены на ткане- или опухолевоспецифические мишени путем использования биспецифических антител, например, полученных с помощью химического соединения антитела (Ат, АЬ) против лиганда и Ат, направленного против специфической мишени. Во избежание ограничений химических конъюгатов молекулярные конъюгаты антител можно использовать для продукции рекомбинантных биспецифических одноцепочечных Ат, направляющих лиганды и/или химерные ингибиторы к молекулам клеточной поверхности. Альтернативно, можно вводить два или более активных агентов и/или ингибиторов, присоединенных к направляющим составляющим, причем каждый конъюгат включает направляющую составляющую, например, другое антитело. Каждое антитело является реакционноспособным в отношении другого эпитопа-сайта мишени (ассоциированного с одним и тем же или другим антигеном-мишенью). Различные антитела с присоединенными агентами аккумулируются аддитивно в желаемом сайте-мишени. Для доставки лиганда или ингибитора в сайт-мишень можно использовать направляющие составляющие на основе антител или не на их основе. Предпочтительно для этой цели используют природный агент, связывающий нерегулируемый или специфичный для болезни антиген.

Биоанализ для идентификации ингибиторов Ьр-РЬА₂Скринирование на ингибирование белка Ер-РЕА_з

В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения имеют отношение к применению ингибиторов Ер-РЬ-Аз для лечения сосудистой деменции, например, болезни Альцгеймера и/или лечения нарушений, связанных с проницаемостью ВВВ. Если необходимо, проводят оценку агентов, которые ингибируют белок Гр-РГАз, используя биоанализ, описанный в патенте США № 5981252, который полностью включен сюда посредством ссылки. Одним таким анализом является проверка действия агента на рекомбинантный белок Ер-РЕА^ В одном анализе, например, рекомбинантный Ер-РЕА_зочищают до гомогенности из инфицированных бакуловирусом клеток ЗГ9, используя колонку, заполненную цинк-хелатной смолой, аффинную хроматографию на голубой сефорозе и колонку для анионообменной хроматографии. После очистки и ультрафильтрации фермент хранят при 6 мг/мл при 4°С. Буфер для анализа включает Тпк-НС1 (50 мМ), ΝηΟ (150 мМ) и 1 мМ СНАРЗ, рН 7,4 при комнатной температуре. Активность определяют по увеличению эмиссии при 535 нм при гидролизе Ν-((6-(2,4динитрофенил)амино)гексаноил)-2-(4,4-дифтор-5,7-диметил-4-бора-3а,4а-диаза-к-индацен-3-пентаноил)1-гексадеканоил-5и-глицеро-3-фосфоэтаноламина, триэтиламмонийной соли (РЕЭ6, индекс в каталоге Мо1еси1аг РгоЬек - Ό-23739), в качестве субстрата, используя флуорометрическое считывающее устройство для планшетов. Реакцию инициируют добавлением фермента (приблизительно 400 пМ в итоге по весу) и субстрата (5 мкМ в итоге) к ингибитору в общем объеме, составляющем 10 мкл.

- 54 025527

Раскрытые здесь соединения, например, соединения, раскрытые в разделах, озаглавленных Примеры синтеза, были проверены, и, как обнаружено, имеют значения 1С₅₀ в диапазоне от 0,1 до 10 нМ.

Применение агентов, которые ингибируют Ьр-РЬА₂, для лечения нейродегенеративных заболеваний или нарушений Нарушения, связанные с проницаемостью ВВВ

Не желая ограничиваться какой-либо теорией, ВВВ, функциональный, а также анатомический барьер, имеет большое значение для сохранения постоянной среды для оптимального функционирования центральной нервной системы. Большинство метаболических субстратов (т.е. сахара и аминокислоты) являются гидрофильными и проходят через ВВВ только с помощью специфических, опосредованных носителями транспортных систем, которые экспрессируются как на люминальной, так и аблюминальной сторонах эндотелиальных клеток ВВВ. Отмечены апикальные/базальные различия в распределении носителей и ферментов, которое позволяет проводить различие между специализированным эндотелием ВВВ и периферическим эндотелием. Был сделан значительный прогресс в понимании патофизиологии и механизмов, вовлеченных в облегчение проницаемости ВВВ. Клиническое последствие больного ВВВ встречается при многих заболеваниях, которые поражают головной мозг, при этом ВВВ становится нарушенным или измененным таким образом, что существует драматическое увеличение сосудистой проницаемости. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, существует несколько способов, с помощью которых различные молекулы могут проходить через эндотелий. Они включают межклеточные пути, везикулярный перенос или прямое чресклеточное проникновение через поврежденный эндотелий.

Нарушенный ВВВ или дисфункция ВВВ может быть причиной или следствием конкретного патологического процесса, например, нейродегенеративных заболеваний и нарушений. Заболевания, при которых подтверждена увеличенная проницаемость ВВВ, включают неоплазию, ишемию, гипертензию, деменцию, эпилепсию, инфекцию, рассеянный склероз и травму. Эффект заболевания на функционирование ВВВ будет вторично влиять на кровоток в головном мозге и тонус сосудов головного мозга, что будет оказывать дальнейшее влияние на перенос через ВВВ.

Как здесь раскрыто, ингибирование Ьр-РЬА₂ с использованием раскрытых здесь агентов применимо для лечения нарушений или заболеваний, при которых возникает проницаемость ВВВ и/или происходит нарушение ВВВ. Ингибирование Ьр-РЬА₂ с использованием агентов, например раскрытых здесь агентов, применимо для лечения или предупреждения нарушений или заболеваний, при которых желательно сохранение ненарушенного ВВВ.

В некоторых вариантах осуществления раскрытые здесь агенты, ингибирующие Ьр-РЬА₂, применимы для предупреждения и лечения нейродегенеративных заболеваний и нарушений. Примеры неврологических заболеваний и нейродегенеративных заболеваний и нарушений включают, но без ограничения, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, сосудистую деменцию, старение и легкую степень ухудшения когнитивной функции.

В других вариантах осуществления раскрытые здесь агенты, ингибирующие Ьр-РЬА₂, применимы для предупреждения и лечения заболеваний, при которых, как установлено или может быть установлено, играет роль проницаемость ВВВ, таких как, но без ограничения, осмотическая гипертония, кислотный рН, ожоговая энцефалопатия, свинцовая энцефалопатия, аутоиммунный энцефалит, рассеянный склероз, постишемическая реперфузия, острая гипертензия, СВЧ-облучение, печеночная энцефалопатия, пароксизмы, опухоли, рост, гиперволемия, гипотермия, состояние после облучения, гипербарические состояния, менингит, лимфостатическая энцефалопатия, диабет, синдром Вернике-Корсакова, семейная олигофрения и боковой амиотрофический склероз.

Субъекты, поддающиеся лечению раскрытыми здесь агентами, ингибирующими Ьр-РЬА₂, включают субъектов, подверженных риску развития заболевания, но не демонстрирующих симптомы (например, бессимптомных субъектов), а также субъектов, демонстрирующих в данный момент симптомы. В случае болезни Альцгеймера практически любой подвержен риску страдания болезнью Альцгеймера, если он или она живут достаточно долго. Следовательно, способы настоящего изобретения могут назначаться профилактически всей популяции без какой-либо оценки риска у пациента-субъекта. Раскрытые здесь способы особенно полезны для индивидуумов, которые подвержены известному наследственному риску развития болезни Альцгеймера. Такие индивидуумы включают индивидуумов, имеющих родственников, которые были подвержены этому заболеванию, или индивидуумов, риск развития этого заболевания у которых определен с помощью анализа генетических или биохимических маркеров, как здесь описано.

Заболевания в виде сосудистой деменции

Сосудистая деменция состоит из ряда гетерогенных патологических состояний, которые являются следствием ишемических или геморрагических повреждений головного мозга, а также повреждений, которые развиваются во время продолжительной гипоперфузии.

Субкортикальная ишемическая форма сосудистой деменции является часто встречающимся типом ухудшения когнитивной функции сосудистой этиологии и сосудистой деменции и одной из основных причин снижения когнитивной функции у пожилых людей. Субкортикальная ишемическая сосудистая деменция является, главным образом, следствием заболевания небольших сосудов, которое является

- 55 025527 причиной лакун и обширных повреждений белого вещества, и может быть сопоставима с крупнососудистой деменцией или кортикальной сосудистой деменцией (Котап СС, №иго1оду, 1993, 43: 250-260; Котап СС Ьапсе! Иеиго1. 2002, 1: 426-436). Ишемические повреждения при субкортикальной ишемической сосудистой деменции особенно затрагивают фронтальные-субкортикальные участки, наблюдение, которое объясняет основные когнитивные и клинические неврологические последствия сосудистой деменции (Йш Ν., №иго1оду 986, 36: 340-345; Ситтйдк ТЬ, Агсй. №иго1. 1993, 50: 873-880). Причиной субкортикальной ишемической сосудистой деменции также является устойчивая гипертензия (бе Ьееиет РЕ, Вгаш, 2002, 125: 765-772) и гипоперфузия вследствие застойной сердечной недостаточности (Котап СС, №иго1. Кек. 2004, 26: 454-458), фибрилляции предсердий (бе Ьееите РЕ, №иго1оду 2000, 54: 1795-1801) и синдрома обструктивного апноэ во сне (КатЬа М., 1. Иеигокигд. РкусЫайу. 2001, 71: 334-339).

Ишемические повреждения белого вещества, часто встречающееся повреждение у пожилых людей, являются характерными патологическими изменениями при субкортикальной ишемической сосудистой деменции и ухудшении когнитивной функции, и когнитивные дисфункции связаны с тяжестью поражения (НасЫпкЫ νθ, Агсй. №иго1. 1987; 4: 21-23; Райот Ь., Аййешег Όίδ. Аккос. О1когб. 1999, 13 (кирр1 3): §49-854; бе Сгоо! 1С, №иго1оду 2001; 56: 1539-1545). Повреждения белого вещества головного мозга цереброваскулярной этиологии составляют основную патологию в нескольких типах сосудистой деменции, таких как болезнь Бинсвангера, церебральная амилоидная ангиопатия и наследуемая по аутосомально-доминантному типу церебральная артериопатия с субкортикальными инфарктами и лейкодистрофией (САОАЗГЬ). Причиной этих повреждений белого вещества головного мозга цереброваскулярной этиологии является хроническая церебральная гипоперфузия, которая является следствием сильного стеноза нескольких артерий или артериол, главным образом, в глубоко расположенном белом веществе (Райот Ь., §!гоке 1997, 28: 652-659; бе Сгоо! 1С, №иго1оду 2001, 56: 1539-1545, Котап СС, №иго1. Кек. 2004, 26: 454-458; Сира/зпо АА, Ат. 1. ИеигогабюР 2000, 21: 621-630).

Болезнь Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера (АО) является прогрессирующим заболеванием, приводящим к сенильной деменции. См. в основном §е1кое, ΤΓΝδ 16, 403-409 (1993); Нагбу е! а1., №О 92/13069; §е1кое, 1. Иеигора1йо1. Ехр. Иеиго1. 53, 438-447 (1994); ОиТГ е! а1., Иа!иге 373, 476-477 (1995); Сатек е! а1., Иа!иге 373, 523 (1995). Вообще говоря, заболевание делится на два класса: заболевание с поздним началом, которое возникает в престарелом возрасте (свыше 65 лет), и заболевание с ранним началом, которое развивается задолго до старческого периода, т.е. между 35 и 60 годами. При обоих типах заболевания патология является одной и той же, но β-патологии имеют тенденцию быть более тяжелыми и распространенными в случаях начала в более раннем возрасте. На макроскопическим уровне заболевание характеризуется значительным сморщиванием головного мозга вдали от свода черепа, наблюдаемым при магнитнорезонансной томографии, являющимся прямым результатом утраты нейронов, и двумя типами макроскопических повреждений головного мозга, сенильными бляшками и нейрофибриллярными клубками. Сенильные бляшки представляют собой зоны, включающие дезорганизованные нейрональные отростки вплоть до 150 мкм в поперечном направлении и внеклеточные амилоидные отложения, которые обычно сконцентрированы в центре и видны при микроскопическом анализе срезов ткани головного мозга. Нейрофибриллярные клубки являются внутриклеточными отложениями белка тау, состоящими из двух филаментов, закрученных вокруг друг друга попарно.

Основной составной частью бляшек является пептид, называемый Ав или β-амилоидным пептидом. Пептид Ав является внутренним фрагментом из 39-43 аминокислот белка-предшественника, называемого белком-предшественником амилоида (АРР). С наличием болезни Альцгеймера было увязано несколько мутаций в белке АРР. См., например, Соа!е е! а1., Иа!иге 349, 704 (1991) (замена валина⁷¹⁷ изолейцином); Сйагйег Наг1ап е! а1., Иа!иге 353, 844 (1991)) (замена валина⁷¹⁷ глицином); Мигге11 е! а1., 8с1епсе 254, 97 (1991) (замена валина⁷¹⁷ фенилаланином); Ми11ап е! а1. Иа!иге Сепе!. 1, 345 (1992) (двойная мутация с заменой лизина⁵⁹⁵-метионина⁵⁹⁶аспарагином⁵⁹⁵ лейцином⁵⁹⁶). Полагают, что такие мутации вызывают болезнь Альцгеймера путем увеличения или изменения процессирования АРР в Ар, в частности, процессирования АРР в увеличенные количества удлиненных форм Ав (т.е. Ав 1-42 и Ав 1-43). Полагают, что мутации в других генах, таких как гены пресенилинов, Р§1 и Р§2, косвенно влияют на процессирование АРР с созданием увеличенных количеств удлиненных форм Ав (см. Нагбу, ΤΓΝδ 20, 154 (1997)).

Эти наблюдения указывают на то, что Ав, и особенно его удлиненная форма, является причинным элементом при болезни Альцгеймера.

Ав, также известный как в-амилоидный пептид, или А4-пептид (см. патент США № 4666829; С1еппег & №опд, Вюсйет. Вюрйук. Кек. Соттип. 120. 1131 (1994)) представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, является основным компонентом характерных для болезни Альцгеймера бляшек. Ав образуется при процессировании большого белка АРР двумя ферментами, называемыми в- и γ-секретазами (см. Нагбу, ΤΓΝδ 20, 154 (1997)). Известные мутации в АРР, ассоциированные с болезнью Альцгеймера, встречаются очень близко к сайту расщепления в- или γ-секретазами или в пределах Ав. Например, положение 717 является очень близким к сайту расщепления γ-секретазой АРР при его процессировании в Ав, а положения 670/671 являются очень близкими к сайту расщепления в-секретазой. Полагают, что

- 56 025527 мутации вызывают болезнь Альцгеймера путем такого влияния на реакции расщепления, с помощью которых образуется Ав, при котором увеличивается количество образуемой формы из 42/43 аминокислот Ав.

Ав обладает необычной способностью к установлению и активированию как классического, так и альтернативного пути активации комплемента. В частности, он связывается с ί','ίς и, в конечном счете, с С3Ы. Это связывание способствует связыванию с макрофагами, что приводит к активации В-клеток. Кроме того, С3Ы распадается далее и затем связывается с СК2 на В-клетках зависимым от Т-клеток образом, что приводит к 10000-увеличению активации этих клеток. Этот механизм является причиной того, что Ав вызывает иммунный ответ, превышающий иммунный ответ на другие антигены.

Большинство стратегий лечения болезни Альцгеймера направлено на уменьшение или устранение отложения Ав42 в головном мозге, как правило, через уменьшение образования Ав42 из АРР и/или некоторые способы снижения существующих уровней Ав42 в источниках, которые вносят непосредственный вклад в отложение этого пептида в головном мозге (Эе Рейсе апй Реггеиа, 2002). Неполный список ассоциированных со старением причинных факторов в развитии спорадической болезни Альцгеймера включает смещение баланса между продукцией пептида Ав и его выведением из нейронов, что способствует внутриклеточной аккумуляции, увеличенную секрецию пептидов Ав нейронами в окружающее экстраклеточное пространство, увеличенные уровни окислительного повреждения этих клеток и общую гипоперфузию головного мозга и связанные компенсаторные метаболические сдвиги в поврежденных нейронах (СоИеп е! а1., 1988; Шддшв е! а1., 1990; Ка1апа, 2000; Nа1^νаеνаа е! а1., 2004; Те11ег е! а1., 1996; Аеп е! а1., 2004).

Ав42, который откладывается внутри нейронов и бляшек, мог бы также возникнуть вне нейронов (экзогенный Ав42) при патогенезе болезни Альцгеймера. Известно, что уровни растворимых пептидов Ав в крови намного выше, чем в интерстициальной ткани и С8Р мозга здоровых индивидуумов (§еиЬег! е! а1., 1992), при этом кровь является источником экзогенных пептидов Ав, которые, в конечном счете, откладываются в головном мозге при болезни Альцгеймера (Ζ1ο1<ονχ е! а1., 1993). Однако за исключением ничтожных количеств Ав, которые активно переносятся через эндотелиальные клетки, хорошо известно, что доступ переносимых кровью пептидов Ав к ткани головного мозга у нормальных здоровых индивидуумов эффективно заблокирован при целостности гематоэнцефалического барьера (ВВВ) (КапЙ1та11а е! а1., 2005; Ройив1о е! а1., 1999). ВВВ является сложной структурой, состоящей из церебральных эндотелиальных клеток, опирающихся на базальную мембрану, которая дополнительно поддерживается отростками-ножками локальных астроцитов (С1оог е! а1., 2001; Шваи е! а1., 1998). Он тесно регулирует проход компонентов крови в ткань головного мозга и является в высокой степени непроницаемым для почти всех белков и других макромолекул, хотя, в то же самое время, он делает возможным избирательное вхождение существенных молекул ^ауНаи, 2001). Множество данных выявило, что старение связано с дегенеративными изменениями в кровеносных сосудах, которые могут поставить под угрозу целостность ВВВ. Например, ряд относительно часто встречающихся нейродегенеративных заболеваний у пожилых людей, включающих сосудистую деменцию и болезнь Альцгеймера, возникают, по меньшей мере, отчасти в результате цереброваскулярных патологий, которые развиваются в микроциркуляторном русле головного мозга (Вге!е1ег, 2000; Виее е! а1., 1997; йе 1а Тогге, 1997; Евгп е! а1., 1999; Ка1апа е! а1., 1996). Хорошо известным фактом является связь между нервно-сосудистой сетью и нейродегенеративным заболеванием, заключающаяся в том, что патология болезни Альцгеймера, в том числе амилоидные бляшки и нейрофибриллярные клубки, развивается впоследствии поблизости от повреждений при ударе (1еШпдег, 2002; Ка1апа, 1996; Ка1апа, 2002; Ыа!!е е! а1., 1998).

Генетические маркеры риска развития болезни Альцгеймера включают мутации в гене АРР, в частности мутации в положении 717 и положениях 670 и 671, упоминаемые как мутация Нагйу и шведские мутации, соответственно (см., Нагйу, ΉΝδ, выше). Другими факторами риска являются мутации в генах пресенилинов, Р§1 и Р§2, и АроЕ4, семейный анамнез болезни Альцгеймера, гиперхолестеринемия или атеросклероз. Субъектов, страдающих в настоящее время болезнью Альцгеймера, можно распознать по характерной деменции, а также наличию описанных выше факторов риска. Кроме того, для идентификации субъектов, имеющих болезнь Альцгеймера, имеется ряд диагностических анализов. Они включают измерение уровней тау и Ав42 в С8Р. Увеличенные уровни тау и Ав42 являются признаком наличия болезни Альцгеймера. Болезнь Альцгеймера у индивидуумов можно также диагностировать по критериям ΜΜδΕ или АПКОА. Образцом ткани для анализа обычно является кровь, плазма, сыворотка, слизь или спинномозговая жидкость пациента. Образец анализируют по шкале иммунного ответа на любые формы пептида Ав, обычно Ав42. Иммунный ответ можно определить по наличию, например, антител или Тклеток, которые специфически связываются с пептидом Ав. Способы ЕЫ8А выявления антител, специфичных для Ав, описываются в разделе Примеры.

Лечение пациентов, у которых не обнаруживаются симптомы заболевания, можно начинать в любом возрасте (например, 10, 20, 30). Однако обычно нет необходимости начинать лечение до достижения пациентом возраста 40, 50, 60 или 70 лет. Лечение, как правило, включает в себя множество доз в тече- 57 025527 ние периода времени. Лечение можно контролировать с помощью исследования присутствия пептида Ав в С8Р или проницаемости ВВВ с течением времени. Если пептид Ав все еще присутствует в С8Р или ВВВ остается проницаемым или нарушенным, рекомендуется дополнительное лечение раскрытыми здесь агентами, ингибирующими Ьр-РЬА₂, и/или лечение дополнительными терапиями для болезни Алыдгеймера. В случае пациентов с возможным синдромом Дауна лечение можно начинать внутриутробно путем введения терапевтического агента матери или вскоре после рождения.

В некоторых вариантах осуществления раскрытые здесь агенты, ингибирующие Ьр-РЬА₂, также применимы для лечения других нейродегенеративных нарушений и нарушений когнитивных функций в общем, например, деменции, депрессии, спутанности сознания, болезни Крейтцфельда-Якоба или коровьего бешенства, болезни Хантингтона, утраты моторной координации, рассеянного склероза, болезни Паркинсона, болезни Пика и других болезней накопления в головном мозге (например, амилоидоза, ганглиозидоза, болезней липидного накопления, мукополисахаридоза), обморока и сосудистой деменции. Таким образом, лечение может быть направлено на субъекта, пораженного без проявления симптомов нейродегенеративным заболеванием, оно может улучшить когнитивную функцию. Эффективность лечения можно определить с помощью контролирования мозгового кровотока (СВР) и/или функционирования гематоэнцефалического барьера (ВВВ), например, определения наличия тау или Ав в С8Р. В некоторых вариантах осуществления можно использовать индикаторы функционирования ВВВ, например, описанные в патенте США № 6884591, который полностью включен посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления функционирование ВВВ можно контролировать, используя методы формирования изображения, известные специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники, например, используя магнитно-резонансный томограф (ΜΕΣ) с высокой контрастностью. В таких вариантах осуществления выполняют сосудистое введение специфических контрастирующих агентов для МР-томографии непосредственно перед МР-томографией, причем контрастирующий агент остается внутри кровеносных сосудов у субъектов с нормальным ВВВ, в то время как у индивидуумов с проницаемым ВВВ контрастирующий агент проникает в ткань головного мозга и обнаруживается в виде затемнения при магнитно-резонансной томографии. Используя этот способ, можно провести количественные измерения локализации и степени нарушения ВВВ, используя программное обеспечение для МРтомографии. Соответственно, эффективность лечения ингибитором Ьр-РЬА₂ можно определить по выявлению измеряемого уменьшения затемнения и/или уменьшения степени нарушения ВВВ после введения ингибиторов Ьр-РЬА₂ по сравнению с нарушением до введения, как здесь описано.

Некоторые способы включают в себя определение значения исходного уровня, например, уровня бета-амилоида в С8Р субъекта до введения дозы агента, и сравнение его со значением бета-амилоида в С8Р после лечения. Снижение, например, снижение на 10%, уровня бета-амилоида в С8Р служит признаком положительного результата лечения (т.е. введением агента добились уменьшения бета-амилоида в С8Р, или усилили такое уменьшение). Если значение уровня бета-амилоида в С8Р значительно не изменяется или увеличивается, это служит признаком отрицательного результата лечения. Как правило, предполагается, что субъекты, подвергаемые первоначальному курсу лечения агентом, будут демонстрировать снижение уровня бета-амилоида в С8Р при использовании последовательных доз агента, как здесь описано.

В других способах определения эффективности лечения определяют контрольное значение (т.е. среднее и среднеквадратическое отклонение) бета-амилоида для контрольной популяции. Как правило, индивидуумы в контрольной популяции не получали предварительное лечение и не страдают болезнью Альцгеймера. Определенные значения бета-амилоида в С8Р у субъекта после введения агентаингибитора Ьр-РЬА₂, раскрытого здесь, затем сравнивают с контрольным значением. Снижение бетаамилоида в С8Р субъекта по сравнению с контрольным значением (т.е. снижение по меньшей мере на 10% бета-амилоида у субъекта) является сигналом положительного результата лечения. Отсутствие значительного снижения является сигналом отрицательного результата лечения.

В других способах определяют контрольное значение, например, бета-амилоида в С8Р для контрольной популяции субъектов, которые были подвергнуты лечению терапевтическим агентом, который является эффективным в снижении бета-амилоида в С8Р. Определенные значения бета-амилоида в С8Р субъекта сравнивают с контрольным значением.

В других способах у субъекта, который в настоящее время не получает лечения раскрытыми здесь агентами, которые ингибируют Ьр-РЬА₂, но был подвергнут предшествующему курсу лечения, контролируют бета-амилоид в С8Р для определения того, требуется ли возобновление лечения. Определенное у испытуемого субъекта значение бета-амилоида в С8Р можно сравнить с уровнем бета-амилоида в С8Р, ранее достигнутым у субъекта после предшествующего курса лечения. Значительное снижение бетаамилоида в С8Р касательно предшествующего измерения (т.е. снижение на по меньшей мере 10%) является признаком того, что лечение можно возобновить. Альтернативно, уровень бета-амилоида в С8Р субъекта можно сравнить с контрольным уровнем бета-амилоида в С8Р, определенным в популяции субъектов после подвергания курсу лечения. Альтернативно, уровень бета-амилоида в С8Р субъекта можно сравнить с контрольным значением в популяциях подвергнутых профилактическому лечению

- 58 025527 субъектов, которые остаются без симптомов заболевания, в частности, без симптомов проницаемости ВВВ, или популяциях подвергнутых терапевтическому лечению субъектов, которые демонстрируют ослабление интенсивности симптомов заболевания.

Способы идентификации субъектов, подверженных риску развития болезни Альцгеймера или имеющих это заболевание

В состав субъектов, поддающихся лечению с использованием раскрытых здесь способов, входят субъекты, подверженные риску развития нейродегенеративного заболевания, например болезни Альцгеймера, но не демонстрирующие симптомы, а также субъекты, демонстрирующие симптомы нейродегенеративного заболевания, например, субъекты с симптомами болезни Альцгеймера.

Можно провести скрининг субъектов на вероятность наличия или развития у них болезни Альцгеймера, основываясь на ряде биохимических и генетических маркеров.

У субъекта можно также диагностировать повышенный риск развития болезни Альцгеймера, используя генетические маркеры болезни Альцгеймера. У небольшого числа семей прослеживалось генетическое отклонение от нормы на хромосоме 21 (δΐ. Сеогде-Ну§1ор е! а1., 8с1еисе 235: 885-890, 1987). Одним из генетических маркеров являются, например, мутации в гене АРР, в частности, мутации в положении 717 и положениях 670 и 671, упоминаемые как мутация Нагйу и шведские мутации, соответственно (см., Нагйу, ΊΝΈΝδ, выше). Другими факторами риска являются мутации в генах пресенилинов, Р81 и Р82, и АроЕ4, семейный анамнез болезни Альцгеймера, гиперхолестеринемия или атеросклероз. В высокой степени вероятно, что у субъектов с мутациями в АРР, Р81 или Р82 будет развиваться болезнь Альцгеймера. АроЕ4 является геном подверженности заболеванию, и субъекты с е4-изоформой АроЕ (изоформой АроЕ4) подвержены увеличенному риску развития болезни Альцгеймера. Проверка субъектов с изоформой АроЕ4 описывается в патенте США № 6027896, который полностью включен сюда посредством ссылки. Другие генетические связи были увязаны с повышенным риском развития болезни Альцгеймера, например, вариации в нейронном сортилин-подобном рецепторе ЗОКС1 могут увеличить вероятность развития болезни Альцгеймера с поздним началом (Родае\'а е1 а1., №к Сенек 2007 РеЬ; 39(2): 168-177). Другие потенциальные гены подверженности болезни Альцгеймера включают, например, АСЕ, СНКНВ2, С8Т3, Е8К.1, СЛРПН8, ГОЕ, МТНРР, ΝΟδΊΝ, РКЫР, Р8ЕШ, ТР, ТРАМ и 1ΝΡ и используются для идентификации субъектов с повышенным риском развития болезни Альцгеймера (ВеПгат е1 а1., №к Сеиек 2007 1ан; 39(1): 17-23), а также вариации в гене альфа-Т-катенина (УК.22) (ВеПгат е1 а1., I. Мей. Сеиек 2 0 07 1ан; 44(1); 363) и в инсулин-деградирующем ферменте (ГОЕ) (К1т е1 а1., I. Вю1. СЬет. 2007; 282: 7825-7832).

У субъекта можно также диагностировать повышенный риск развития болезни Альцгеймера на основе простой проверки глаз, причем по наличию катаракты и/или Абета в хрусталике выявляют повышенный риск развития болезни Альцгеймера у субъекта. Способы выявления болезни Альцгеймера включают использование устройства для квазиупругого рассеивания света (СоИЧет е1 а1., Ьаисе!. 2003; 12, 361: 1258-1265) от №игорк1х, использование квазиупругого рассеивания света (ЦЬ8) и сканирования с использованием флуоресцентных лигандов (РЬ8) и устройства для сканирования №игорЬх™ ЦЕЬ, для того чтобы сделать возможными неинвазивные количественные определения амилоидных агрегатов в глазу, исследовать и определить отложения в специфических областях хрусталика в качестве ранней диагностики болезни Альцгеймера. Способ диагностирования у субъекта риска развития болезни Альцгеймера с использованием такого способа неинвазивной проверки глаз описывается в патенте США № 7107092, который полностью включен сюда посредством ссылки.

Индивидуумов, страдающих в настоящее время болезнью Альцгеймера, можно распознать по характерной деменции, а также наличию описанных выше факторов риска. Кроме того, для идентификации индивидуумов, имеющих болезнь Альцгеймера, имеется ряд диагностических анализов. Они включают измерение уровней тау и А.\3(/242 в С8Р. Повышенные уровни тау и пониженные уровни Ах3в242 являются признаком наличия болезни Альцгеймера.

Существуют два альтернативных критерия, которые используются для клинического диагностирования болезни Альцгеймера: критерий П8М-ШК и критерий NINС^8-Л^Κ^Л (акроним №-11юна1 ПъПППе ок №иго1одюа1 аий СотншшсаПте ЭЬогйег аий 8!гоке (Ν!ΝΕΌ8) и АкЬешег'к ЭЬеахе аий Ке1а1ей ЭЬогйег8 АккошаЬои (АЭРОА), см. МсКЬаии е! а1., №иго1оду 34: 939-944, 1984). Вкратце, критерии диагностирования болезни Альцгеймера согласно П8М-ШР включают: (1) деменцию, (2) протекающее без явных симптомов начало с обычно прогрессирующим течением с ухудшением и (3) исключение всех других специфических причин деменции с помощью анамнеза физического обследования и лабораторных тестов. В контексте критерия ОЗМ-ШР подразумевается, что деменция включает многогранную утрату интеллектуальных способностей, таких как память, суждение, абстрактное мышление и другие высшие кортикальные функции, и изменения личности и поведения (П8М-ПР, 1987).

В противоположность, критерий NINС^δ-Л^Р^А определяет три класса болезни Альцгеймера, включающие вероятную, возможную и установленную болезнь Альцгеймера. Клиническое диагностирование возможной болезни Альцгеймера можно провести на основе синдрома деменции, в отсутствие других неврологических, психиатрических или системных нарушений, достаточных для вызова

- 59 025527 деменции. Критерии клинического диагностирования вероятной болезни Альцгеймера включают: (а) деменцию, установленную с помощью клинического исследования и подтвержденную доказательствами с использованием такого теста, как минипсихиатрический тест (РоМкЯеЯп с1 а1., Я. Ркусй. Кек. 12: 189-198, 1975); (Ь) недостаток в двух или более областях познания; (с) прогрессирующее ухудшение памяти и других когнитивных функций; (ά) отсутствие нарушения сознания; (е) начало в возрасте от 40 до 90 лет, наиболее часто в возрасте после 65 лет; и (ί) отсутствие системных нарушений или других заболеваний головного мозга, которые могли бы явиться причиной деменции. Критерии диагностирования установленной болезни Альцгеймера включают гистопатологические данные, полученные биопсическим методом, или после аутопсии. Поскольку для подтверждения установленной болезни Альцгеймера требуется гистологическое исследование взятого биопсическим методом образца головного мозга (который трудно получить), его редко используют для ранней диагностики болезни Альцгеймера.

Можно также использовать невропатологическое диагностирование болезни Альцгеймера, при котором анализируют ряд бляшек и клубков в коре головного мозга (лобных, височных и теменных долях), гиппокампе и миндалевидном теле (КйасйаЯшгап, Агсй. №иго1. 42: 1097-1105; ЕкЯгЯ. АпаЯотЯса1 Сгйепа Гог Яйе ВЯорку ФадпокЯк οί АкйеЯтег'к ОЯкеаке, АкйеЯтег'к ОЯкеаке, СиггепЯ Кекеагсй ίη Еаг1у ОЯадпокЯк, Вескег апй ОЯасоЬЯпЯ (ейк.), рр. 239-252, 1990).

Можно также использовать количественный электроэнцефалографический анализ (ЕЕО) для диагностирования болезни Альцгеймера. В этом способе используется анализ Фурье бета, альфа, зета и дельта полос (ЫеккЯпеп еЯ а1., ЕЕО ίη Яйе ОЯадпокЯк оГ Еаг1у АкйеЯтег'к ОЯкеаке, АкйеЯтег'к ОЯкеаке, СиггепЯ Кекеагсй Яп Еаг1у ОЯадпокЯк, Вескег апй ОЯасоЬЯпЯ (ейк.), рр. 159-167, 1990) для диагностирования болезни Альцгеймера.

Можно также диагностировать болезнь Альцгеймера с помощью количественного определения степени амиотрофии, поскольку такая атрофия обычно признается следствием болезни Альцгеймера. Примеры этих способов включают компьютерное томографическое сканирование (СТ) и магнитнорезонансную томографию (МЫ) (Ьеейот апй МЯ11ег, СТ, МЫ, апй ЫМК ЗресЯгоксору Яп АкйеЯтег'к Όίκеаке, АкйеЯтег'к ОЯкеаке, СиггепЯ Кекеагсй Яп Еаг1у ОЯадпокЯк, Вескег апй ОЯасоЬЯпЯ (ейк.), рр. 297-313, 1990).

Можно также диагностировать болезнь Альцгеймера с помощью оценки уменьшенного мозгового кровотока или метаболизма в коре задней височно-теменной области головного мозга путем определения уменьшенного кровотока или метаболизма с помощью позитрон-эмиссионной томографии (РЕТ) (Рагкк апй Вескег, РокЯЯгоп ЕтЯккЯоп Тотодгарйу апй №игоркусйо1одЯса1 ЗЯиФек Яп ОетепЯЯа, АкйеЯтег'к ЭСеаке, СиггепЯ Кекеагсй Яп Еаг1у ОЯадпокЯк, Вескег апй ОЯасоЬЯпЯ (ейк.), рр. 315-327, 1990), однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ЗРЕСТ) (Мепа еЯ а1., 8РЕСТ ЗЯиФек Яп АкйеЯтег'к Туре ЭетепЯЯа РаЯЯепЯк, АкйеЯтег'к ОЯкеаке, СиггепЯ Кекеагсй Яп Еаг1у ОЯадпокЯк, Вескег апй ОЯасоЬЯпЯ (ейк.), рр. 315-327, 1990) и способов ингаляции ксенона (ЯадикЯ еЯ а1., №иго1оду 38: 909-912; РгойоупЯк еЯ а1., №иго1оду 38: 931-937; УаИетап еЯ а1., ЗепЯ1е ОетепЯтак: II IηЯе^ηаЯ^οηа1 ЗутрокЯит, рр. 399-407, 1988).

Болезнь Альцгеймера можно также диагностировать иммунологически (^УоЯохлп, НптипосНеписа! Арргоасйек Яо Яйе ОЯадпокЯк оГ АкйеЯтег'к ОЯкеаке, АкйеЯтег'к ОЯкеаке, СиггепЯ Кекеагсй Яп Еаг1у ОЯадпокЯк, Вескег апй ОЯасоЬЯпЯ (ейк.), рр. 217-235, 1990). ХУо^т и сотрудники (УоЯохлп еЯ а1., ЗсЯепсе 232: 648650, 1986) продуцировали моноклональное антитело 'Ά1ζ50, которое взаимодействует с белком с М.м. 68 кДа А68, который экспрессируется в бляшках и нейронных клубках пациентов с болезнью Альцгеймера. При использовании антитела Ак50 и анализа Вестерн-блоттингом А68 был обнаружен в спинномозговой жидкости (СЗР) некоторых пациентов с болезнью Альцгеймера, но не в СЗР нормальных пожилых пациентов (ХУо^т апй ОауЯек, Апп. №иго1. 22: 521-526, 1987).

Болезнь Альцгеймера можно также диагностировать, используя нейрохимические маркеры для болезни Альцгеймера.

Нейрохимические маркеры, которые были ассоциированы с болезнью Альцгеймера, включают пониженные уровни ацетилхолинэстеразы (ОЯасоЬЯпЯ апй Зидауа, Магкегк оГ СйойпегдЯс ОукГипсЯЯоп Яп АКйеЯтег'к ОЯкеаке, АкйеЯтег'к ОЯкеаке, СиггепЯ Кекеагсй Яп Еаг1у ОЯадпокЯк, Вескег апй ОЯасоЬЯпЯ (ейк.), рр. 137-156, 1990), пониженный уровень соматостатина (ТаттЯпда еЯ а1., №иго1оду 37: 161-165, 1987), обратная зависимость серотонина от 5-гидроксииндолуксусной кислоты (Уойсег еЯ а1., Агсй. №иго1. 42: 127-129, 1985), большее повышение гомованилиновой кислоты, индуцированное пробенецидом (ОЯЬкоп еЯ а1., Агсй. №иго1. 42: 489-4 92, 1985), и пониженный уровень нейронноспецифической энолазы (СиЯ1ег еЯ а1., Агсй. Ыеиго1. 43: 153-154, 1986).

Способы идентификации субъектов, подверженных риску развития деменции или имеющих ее, и/или способы оценки памяти

Для диагностирования различных типов деменции и после диагностирования, контроля прогрессирования заболевания в течение продолжительного периода времени можно использовать стандартную врачебную практику, используемую в настоящее время. Один такой способ включает по меньшей мере следующее: (Я) оценку памяти, (ЯЯ) экстенсивное нейропсихологическое исследование, (ίίί) осмотр неврологом-гериатром и (ίν) магнитно-резонансную томографию головного мозга.

Прогрессирование заболевания подтверждается по изменениям этих параметров с течением време- 60 025527 ни. В некоторых вариантах осуществления изменения параметров по меньшей мере одной из этих оценок можно использовать для оценки эффективности ингибитора Ьр-РЬА₂ у субъекта в течение периода времени.

Можно использовать оценку памяти, например, программу ИМОМ №ν кгкеу ПъШШе £ог Зиссекк£и1 Адшд. Взрослые пациенты с жалобой на короткую память и/или снижение когнитивной функции находятся в программе оценки памяти, включающей оценку гериатрическими неврологическими, нейропсихологическими и социальными службами. Пациенты могут или сами обращаться, или направляться местными клиницистами или врачами при подозрении на возможное или вероятное нарушение памяти или деменцию. При такой оценке памяти во время первоначальной оценки все оценки, такие как: (ί) оценка памяти, (ίί) экстенсивное нейропсихологическое исследование, (ίίί) осмотр неврологом-гериатром и (ίν) магнитно-резонансная томография головного мозга проводят в один и тот же день. Нейропсихологическая оценка охватывает широкий список когнитивных функций, который помогает определить ряд и тяжесть нарушений. Она включает оценки суждения, адекватной самооценки, поведения, ориентации, контроля исполнения, общей умственной деятельности, зрительно-пространственной функции, памяти и способности к обучению. Определяют депрессию, если имеется. Неврологическая оценка охватывает анамнез изменения когнитивной функции, а также общий анамнез, и обычно проводят полный неврологический осмотр. Неврологическая оценка также может включать лабораторные исследования для исключения обратимых причин деменции, включающие витамин В12, фолат, основной метаболический профиль, СВС, ТЗН, АЬТ, АЗТ, С-реактивный белок, сывороточный гомоцистеин и КРК Изображения головного мозга предусматривают изображения структуры головного мозга, такие как магнитнорезонансная томография головного мозга, хотя могут использоваться другие способы получения изображения головного мозга, известные специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники. Для вынесения диагноза используют таблицу данных, касающихся анамнеза, нейропсихологических тестов, неврологического исследования, лабораторных исследований и изображения головного мозга.

Диагностирование деменции может основываться на руководствах в отношении практического параметра Атепсап Асабету о£ №иго1оду, опубликованных в 2001 г. Диагностирование болезни Алыдгеймера может основываться на критерии ΝΙΝΌδ-АОРОА. Диагностирование сосудистой деменции может основываться на критериях диагностических и лечебных центров штата Калифорния, АО. При последующей встрече можно сообщить заключительный диагноз пациенту и семье. Если в заключительном диагнозе указывается на то, что пациент или субъект имеет или, вероятно, имеет деменцию и/или потерю памяти, клиницист может уведомить о назначении лечения с использованием эффективного количества агента-ингибитора Ер-РЬА₂, раскрытого здесь. Часто присутствие социального работника при последующей встрече может также оказать пациенту и его семье помощь в текущих и будущих потребностях и ориентировать их в таких потребностях.

Другие способы диагностирования пациента, подверженного риску развития нейродегенеративного заболевания или нарушения, такого как сосудистая деменция или болезнь Альцгеймера, или имеющего такое заболевание, включают определение активности и/или экспрессии Ьр-РЬА₂, используя раскрытые здесь способы, например, используя анализ РЬАС, коммерчески доступный от б1аОехик.

Способы идентификации субъектов, подверженных риску нарушения ВВВ или проницаемости ВВВ или имеющих такое нарушение и такую проницаемость

Прямое выявление нарушения ВВВ можно осуществить, используя магнитно-резонансную томографию и иъецирование контрастирующего агента. Для выявления проницаемости ВВВ можно использовать улучшения в разрешении МР-томографии и использовании специальных контрастирующих агентов. При одном способе субъектам вводят контрастирующий агент непосредственно перед получением изображения головного мозга, такого как изображение, полученное с помощью МР-томографии. В случае ненарушенного ВВВ контрастирующие агенты ограничиваются кровеносными сосудами головного мозга, в то время как у субъектов с нарушенным ВВВ контрастирующий агент распыляется в ткани головного мозга, что можно визуализировать. Таким образом, локализации в головном мозге, размер нарушения ВВВ и степень угрозы нарушения ВВВ, например степень просачивания сосудов, у субъектов можно непосредственно и количественно оценить согласно поддающимся измерению параметрам проницаемости ВВВ. Кроме того, такие способы можно использовать для оценки любых улучшений этих параметров, являющихся следствием лечения субъекта агентом, который ингибирует Ьр-РЬА₂. Прямая визуализация нарушения ВВВ и связанного с ним просачивания сосудов в головном мозге применима в раскрытых здесь способах для контроля благоприятных эффектов лечения субъекта с проницаемостью ВВВ ингибиторами ВВВ. Улучшение по меньшей мере одного поддающегося измерению параметра проницаемости ВВВ, такого как локализация, размер нарушения ВВВ и степень просачивания сосудов, у субъектов, которым назначали ингибитор Ьр-РЬА₂, служит признаком положительного результата назначения ингибитора Ьр-РЬА₂. Параметры проницаемости ВВВ можно контролировать путем прямой визуализации и определять количественно с помощью анализа изображения, получаемого при МРтомографии, и они применимы в раскрытых здесь способах.

- 61 025527

Оценка ингибиторов Ьр-РЬА₂ в моделях сосудистой деменции и болезни Альцгеймера

В некоторых вариантах осуществления ингибирующие Ьр-РЬА₂ агенты можно подвергнуть в моделях на животных оценке их эффекта на облегченную проницаемость ВВВ. Например, можно использовать модель гипергликемии и гиперхолестеринемии (НО/НС) на свинье, описанную здесь, в которой проницаемость ВВВ является нарушенной, например ВВВ является проницаемым, используя которую проницаемость ВВВ можно оценить в присутствии и в отсутствие ингибиторов Ьр-РЬА₂ с помощью способов, широко известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления можно использовать маркеры функционирования ВВВ, описанные, например, в патенте США № 6884591, который полностью включен сюда посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления ингибирующие Ьр-РЬА₂ агенты можно подвергнуть оценке в моделях на животных сосудистой деменции, позволяющих проанализировать эффекты ингибирующих Ьр-РЬА₂ агентов на развитие и лечение сосудистой деменции, а также оценить дозы лекарственного средства, оказывающие эффект на развитие, прогноз сосудистой деменции и излечение от нее.

Модели сосудистой деменции на животных включают, например, окклюзию сонных артерий у крыс. См., например, 8агй е! а1., Регк1к1еп1 ппрайтеШ оГ дай регГогтапсек апй теогкшд тетогу айег Ьйа!ега1 соттоп сагойй айегу осс1икюп ш !Не айий А1к1аг га!, ВЕНАУЮКАЬ ВКАШ ЕЕ8ЕАЕСН 136: 13-20 (2002). Таким образом, повреждения белого вещества головного мозга цереброваскулярной этиологии можно экспериментально индуцировать в головном мозге крысы вследствие хронической гипоперфузии мозга. Эту модель создают с помощью долговременной окклюзии обеих общих сонных артерий у крыс. Например, крыс Ай1аг можно подвергнуть анестезии, билатеральные общие сонные артерии обнажают благодаря срединному разрезу в области шеи и дважды перевязывают, используя шелковые нитки, билатерально. Затем после перевязывания мозговой кровоток (СВР) сначала уменьшается на приблизительно 30-50% от контроля. Позже, от приблизительно 1 недели до приблизительно 1 месяца, значения СВР находятся в диапазоне от 40 до 80% от контроля. Также наблюдались нарушения гематоэнцефалического барьера, а также увеличенная активность матриксных металлопротеиназ в повреждениях белого вещества. Эти изменения имеют очень схожий вид с изменениями в повреждениях белого вещества головного мозга цереброваскулярной этиологии у людей. Кроме того, эти результаты говорят о том, что в патогенезе изменений белого вещества играют роль воспалительные и иммунологические реакции.

Такие физиологические изменения коррелируют с проблемами обучения и памяти в модели окклюдированных сонных артерий на крысе. Поэтому динамика ходьбы крыс с окклюдированными сонными артериями снижается с течением времени по сравнению с исходной динамикой, например, на 90 день, у крыс с окклюзией билатеральных общих сонных артерий снижались функции распознавания объекта и выполнение теста на спонтанное изменение горизонтального перемещения по лабиринту по сравнению с крысами с симуляцией операции. Таким образом, эта модель на крысе экспериментальной хронической церебральной гипоперфузии в результате долговременной окклюзии билатеральных общих сонных артерий пригодна в качестве модели значительного ухудшения обучения вместе с разрежением белого вещества. Эта модель является полезным инструментом для оценки действенности агентов, ингибирующих Рр-РЬА₂, на патофизиологию хронической церебральной гипоперфузии и для предоставления данных для определения оптимальных доз и схем введения доз для предупреждения ухудшения когнитивных функций и повреждений белого вещества у пациентов с цереброваскулярным заболеванием.

Эффективность агентов, которые ингибируют Рр-РЬА₂, для лечения или предупреждения сосудистой деменции можно, следовательно, определить с помощью наблюдения за динамикой ходьбы, памятью, способностями к обучению и частотой и тяжестью повреждений белого вещества у крыс с окклюзией сонных артерий. Схожим образом, дозу и схему назначения ингибиторов Рр-РЬА₂ можно устанавливать согласно памяти и способностям к обучению пациентов-людей, подвергаемых лечению в связи с сосудистой деменцией.

В некоторых вариантах осуществления оптимальной дозой агентов, которые ингибируют Рр-РЬА₂, является доза, которая приводит к уменьшению активности и/или экспрессии Рр-РЬА₂, например, уменьшенной экспрессии нуклеиновой кислоты, например, мРНК, кодируемой геном Рр-РЬА₂, или уменьшенной экспрессии или активности белка Ьр-РЬА^ В других вариантах осуществления оптимальной дозой агентов, которые ингибируют Рр-РЬА₂, является доза, которая создает максимальный защитный эффект для профилактики нейродегенеративного заболевания или нарушения или ослабляет симптом нейродегенеративного заболевания или нарушения.

В других вариантах осуществления оптимальной дозой агентов, которые ингибируют Рр-РЬА₂, является доза, которая создает максимальный благоприятный эффект на ткань с повреждением, вызванным окклюзией артерий. Эффективная доза вызывает, по меньшей мере, статистически или клинически значительное ослабление по меньшей мере одного маркера, симптома или характеристики в виде гистологических данных сосудистой деменции. Маркеры, симптомы и характеристика в виде гистологических данных сосудистой деменции включают потерю памяти, спутанность сознания, нарушения в аксональном транспорте, демиелинизацию, индукцию металлопротеиназ (ММР), активацию глиальных клеток, инфильтрацию лимфоцитов, отек и иммунологические реакции, которые приводят к повреждению ткани и дальнейшему повреждению сосудов. Стабилизация симптомов или уменьшение повреждения ткани в

- 62 025527 условиях, в которых у контрольных пациентов или животных наблюдается ухудшение симптомов или повреждение ткани, является одним из индикаторов эффективности супрессивной терапии.

Другие нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся проницаемостью ВВВ

В некоторых вариантах осуществления агенты, ингибирующие Ьр-РЬА₂ при использовании раскрытых здесь способов, применимы для предупреждения и лечения нейродегенеративных заболеваний и нарушений. Дополнительные примеры неврологических заболеваний и нейродегенеративных нарушений включают, например, опосредованные повтором в виде полиглутамина заболевания, такие как болезнь Хантингтона, спинально-церебеллярные атаксии (например, типа 1, 2, 3, 6, 7 и 17), болезнь МакадоДжозефа, спинальная и бульбарная мышечная атрофия (8ВМА или синдром Кеннеди), Дентато-рубропаллидо-льюисова атрофия (ОКРЬА) и другие неврологические заболевания, являющиеся результатом удлинения полиглутамина, или заболевания, являющиеся результатом удлинения повторов некодирующих ДНК, такие как Х-синдром ретардации психического развития, определяемая ломкостью Ххромосомы (ХЕ) ретардация психического развития, наследственная атаксия Фридрейха, миотоническая дистрофия, спинально-церебеллярные атаксии (типов 8, 10 и 12), или другие нейродегенеративные заболевания, такие как спинальная мышечная атрофия (болезнь Верднига-Хоффмана, болезнь КугельбергаВеландера), болезнь Пика и губкообразная энцефалопатия.

Дополнительные нейродегенеративные заболевания, для которых применимы раскрытые здесь агенты, ингибирующие Ьр-РЬА^ включают, например, возрастное ухудшение памяти, деменцию с агирофильными частицами, Гуамский комплекс паркинсонизм-деменция, аутоиммунные заболевания (например, синдром Гийома-Барре, обыкновенную волчанку), болезнь Бисвангера, опухоли головного и спинного мозга (в том числе неврофиброматоз), церебральные амилоидные ангиопатии Цоигпа1 о£ А1/Ьешет'к Огкеаке уо1. 3. 65-73 (2001)), центральный паралич, синдром хронической усталости, кортикобазальную дегенерацию, заболевания вследствие связанной с развитием дисфункции паренхимы ЦНС, заболевания вследствие связанной с развитием дисфункции сосудистой сети головного мозга, мультиинфарктную деменцию, субкортикальную деменцию, деменцию с тельцами Леви, деменцию, индуцированную вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), деменцию без четкой гистологии, боксерскую деменцию, плотные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, заболевания глаза, уха и вестибулярной системы, в которые вовлечена нейродегенерация (в том числе дегенерация желтого пятна и глаукома), синдром Дауна, дискинезии (пароксизмальные), дистонии, эссенциальное дрожание, синдром Фара, лобно-височную деменцию и паркинсонизм, связанный с хромосомой 17 (РТПР-17), дегенерацию лобновисочных долей, деменцию лобного типа, печеночную энцефалопатию, наследственную параплегию, гидроцефалию, ложную опухоль головного мозга и другие состояния, в которые вовлечены дисфункция С8Р, болезнь Гоше, болезнь Халлервордена-Шпатца, синдром Корсакова, небольшое ослабление когнитивной функции, одночленную амиотрофию, боковой амиотрофический склероз, множественную системную атрофию, рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания (например, лейкодистрофии), миалгический энцефаломиелит, миоклонус, нейродегенерацию, индуцированную химическими веществами, лекарственными средствами и токсинами, неврологические проявления СПИД, в том числе деменцию при СПИД, неврологические/когнитивные проявления и последствия бактериальных и/или вирусных инфекций, в том числе, но без ограничения, энтеровирусов, болезнь Ниманна-Пика, негуамский боковой амиотрофический склероз с нейрофибриллярными клубками, некетотическую гиперглицимию, оливомостомозжечковую атрофию, окулофарингеальную мышечную дистрофию, неврологические проявления полиомиелита, в том числе непаралитического полиомиелита и постполиомиелитный синдром, первичный боковой склероз, прионовые болезни, в том числе болезнь Крейтцфельда-Якоба (в том числе вариантную форму), куру, спорадическую фатальную инсомнию, болезнь ГерстманнаШтреусслера-Шейнкера и другие трансмиссивные губкообразные энцефалопатии, церебральную амилоидную ангиопатию прионовой этиологии, постэнцефалитный паркинсонизм, прогрессирующую мышечную атрофию, прогрессирующий бульбарный синдром, прогрессирующий субкортикальный глиоз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, синдром усталых ног, синдром Ретта, болезнь Сандгоффа, мышечную спастичность, спорадические лобно-височные деменции, стриатонигральную дегенерацию, подострый склерозирующий панэнцефалит, недостаток сульфитоксидазы, хорею Сиденгама, деменцию только с клубками, болезнь Тея-Сакса, синдром Туретта, сосудистую деменцию и болезнь Вильсона.

Дополнительные нейродегенеративные заболевания, для которых применимы раскрытые здесь агенты, ингибирующие Ер-РЕА₂, включают другие деменции, не перечисленные выше, такие как, но без ограничения, другую смешанную деменцию, лобно-височную деменцию, болезнь Пика, прогрессирующий супрануклеарный паралич (Р8Р), болезнь Паркинсона, сопровождаемую деменцией, кортикобазальную дегенерацию, множественную системную атрофию, ВИЧ-индуцированную деменцию, деменции, сопровождаемые повреждением белого вещества, небольшое ослабление когнитивной функции (МСЦ

В некоторых вариантах осуществления агенты, ингибирующие Ер-РЕА₂, при использовании раскрытых здесь агентов, применимы для предупреждения и лечения проницаемости ВВВ у субъекта. Дополнительные примеры заболеваний и нарушений, при которых встречается проницаемость ВВВ, включают, например, рассеянный склероз (АЬ8), церебральную амилоидную ангиопатию, диабетическую ретинопатию, прионовые болезни, боковой амиотрофический склероз, синдром скованного человека, спи- 63 025527 нально-церебеллярную атаксию, наследственную атаксию Фридрейха, атаксию-телеангиэктазию, бульбоспинальную атрофию (синдром Кеннеди), спинальную мышечную атрофию, болезни накопления в нейронах (липофусцинозы), митохондриальную энцефаломиопатию, лейкодистрофии, неврологические остаточные явления после спинального шока/тупой травмы, цереброваскулярную гипертоническую болезнь, такую как лакунарные инфаркты, кровоизлияния с порезами, гипертоническая энцефалопатия. Проницаемость ВВВ также встречается при опухолях головного мозга, таких как опухоли с синусоидальным (иначе называемым высокопитательным) кровоснабжением.

Проницаемость ВВВ также встречается при неврологических остаточных явлениях, связанных со стрептококковыми инфекциями, аутоиммунных психоневрологических нарушениях, связанных со стрептококковыми инфекциями, у детей (РАЫОА8), синдроме Туретта, обсессивно-компульсивном расстройстве (ОСИ).

Проницаемость ВВВ также встречается при следующих заболеваниях и нарушениях: посленаркозной нейропсихологической дисфункции и психоневрологических нарушениях, связанных с васкулопатией (например, обыкновенной волчанкой, гипертензией и т.п.). Проницаемость ВВВ может также встречаться у субъектов с заболеваниями, вызванными инфекционными агентами (или проникающими в центральную нервную систему, размножающимися в пределах ЦНС, или покидающими ЦНС при укоренении инфекции), например, ВИЧ, третичным сифилисом, нейроборрелиозом (болезнью Лима), вирусом простого герпеса типа 1 (Н8У-1)/вирусом простого герпеса типа 2 (Н8У-2), вирусом ветряной оспы (опоясывающим герпесом), цитомегаловирусом, полиомиелитом, бешенством, прогрессирующей множественной лейкодистрофией, подострым склерозирующим панэнцефалитом (после кори), болезнью, передаваемой простейшими микроорганизмами (токсоплазмозом, амебиазом и трипаносомозом), риккетсиозными инфекциями (эпидемическим сыпным тифом и пятнистой лихорадкой Скалистых гор), болезнями, передаваемыми многоклеточными организмами, малярией и энцефалитом/менингитом. В некоторых вариантах осуществления энцефалит/менингит является следствием сепсиса.

В некоторых вариантах осуществления агенты, ингибирующие Ьр-РЬА₂ при использовании раскрытых здесь способов, применимы для предупреждения и/или лечения проницаемости ВВВ, встречающейся у субъектов с аутизмов или субъектов, подверженных риску развития аутизма. Аутизм является, в основном, наследственным заболеванием, отличительными признаками которого являются недостаточное социальное взаимодействие и общение, речевые отклонения и ограниченное, повторяющееся поведение (Атепсап РкусЫайгс Аккотайоп, 1994). Представленные данные невропатологических исследований и исследований изображений головного мозга говорят об увеличенном размере и весе головного мозга (ВаЛеу е! а1., 1998, Кетрег апб Ваитап, 1998, 8рагк§ е! а1., 2002; НегЬег! е! а1., 2003; Ра1теп е! а1., 2004). Представленные данные многих исследований головного мозга больных аутизмом говорят об общем уменьшении размера клетки или увеличенной плотности клеточной упаковки, особенно в гиппокампе, основании и миндалевидном теле (Кетрег апб Ваитап, 1993), что указывает на то, что нейронырезиденты имеют небольшие дендритные деревья и характеризуются возможным неполным созреванием или приостановленным развитием.

В патогенез аутизма может вносить вклад аутоиммунность, причем связывание аутоантител с нейронами приводит к нарушению нормального характера развития мозга на критических стадиях. Были сообщения о специфичных для головного мозга аутоантителах у детей, страдающих аутизмом (8шдй е! а1., 1988), и нескольких аутоиммунных факторах, включающих специфичные для головного мозга аутоантитела (Оир!а е! а1., 1996; 8шдй апб РУа5. 2004), аномальное функционирование лимфоцитов (^аггеп е! а1., 1996), аномальную регуляцию цитокинов и связи с вирусами (8шдЬ, 2001). 8шдЬ и РУа5 (2004) продемонстрировали, что в сыворотке страдающих аутизмом детей скапливаются специфичные для головного мозга аутоантитела, и у 68 страдающих аутизмом детей возрастом от 4 до 12 лет антитела против хвостатого ядра, коры головного мозга и мозжечка были выявлены у 49, 18 и 9%, соответственно, страдающих аутизмом детей, но не у нормальных детей.

В другом исследовании было показано, что дети с синдромом Туретта имеют антитела против полосатого тела, и экспериментальная инфузия этих антител в полосатое тело крысы вызывала нейрональную дисфункцию, схожую с синдромом Туретта, у крыс (На11е! е! а1., 2000). Устойчивая связь между наличием аутоантител против нейронов и неврологическим заболеванием была продемонстрирована наиболее ясно у людей в случаях, следующих за стрептокковыми инфекциями, таких как обсессивнокомпульсивное расстройство (ОСИ), хорея Сиденгама, синдром Туретта, аутоиммунные психоневрологические нарушения, связанные со стрептококковыми инфекциями, у детей (РΛN^А8), паранеоплазия, и у пожилых пациентов с системной красной волчанкой, у которых демонстрируется как утрата когнитивной функции, так и потеря памяти (8\\ебо е! а1., 1989; Ка1игае е! а1., 2004, Тапака е! а1., 2004).

Доступ аутоантител против нейронов в головной мозг мог бы естественным образом быть ограничен целостностью гематоэнцефалического барьера (ВВВ), по меньшей мере, у нормальных здоровых индивидуумов. Для получения доступа антител к нейронам головного мозга гематоэнцефалический барьер может быть или нарушенным, или иметь замедленное развитие. Сцепление образования ВВВ в возрасте шесть месяцев или близко к этому возрасту, развития нормального иммунного спектра у новорожденного с нарушениями в развитии мозга может, в конечном счете, привести к аутизму. Во время позд- 64 025527 него эмбрионального периода и нескольких первых месяцев жизни создаются и уточняются критические нейронные пути, контролирующие рецепцию сигналов окружающей среды, и индивидуальные и соответствующие пути ответа на эти сигналы. Отсрочка развития или дефект в формировании ВВВ в это время может сделать возможным подвергание нейронов воздействию переносимых кровью аутоантител против нейронов, которые могли бы нарушить нормальный характер межсоединения нейронов, приводя к аутизму.

Оценка ингибиторов Ьр-РЬА₂ на моделях нейродегенеративных заболеваний и/или проницаемости ВВВ

Пригодность ингибитора Ьр-РЬА₂ для лечения нейродегенеративного заболевания можно оценить в любой из ряда моделей нейродегенеративного заболевания на животных. Например, известны мыши, трансгенные по гену мутантного белка атаксина-1 с удлиненным повтором в виде полиглутамина, у которых развивается атаксия, типичная для спинально-церебеллярной атаксии типа 1 (8СА-1) (ВигпдШ е! а1., 1995, Се11 82: 937-948; когеп/еШ е! а1., 2000, Нит. Мо1. Оепе!. 9: 779-787; Ла!аке, 2002, №итоп 34: 905-919), и их можно использовать для определения эффективности агента-ингибитора Ьр-РЬА₂ для лечения или предупреждения нейродегенеративного заболевания.

Дополнительные модели на животных, например, болезни Хантингтона (см., например, Мапщагип е! а1., 1996, Се11 87: 493-506, Ып е! а1., 2001, Нит. Мо1. Оепе!. 10: 137-144), болезни Альцгеймера Нк1ао, 1998, Ехр. Оегоп!о1. 33: 883-889; Нк1ао е! а1., 1996, 8с1епсе 274: 99-102), болезни Паркинсона (Ктт е! а1., 2002, №Циге 418: 50-56), амиотрофического бокового склероза (Ζ1η.ι е! а1., 2002, №!ите 417: 74-78), болезни Пика (Ьее & Тго]апо\уккк 2 001, №иго1о§у 5 6 (8ирр1. 4): 826-830) и губкообразной энцефалопатии (Не е! а1., 2003, 8аепсе 299; 710-712) можно использовать для оценки эффективности раскрытых здесь агентов, которые ингибируют Ьр-РЬА₂, аналогичным образом.

Модели на животных не ограничиваются моделями на млекопитающих. Например, род ИтокорЫНа обеспечивает приемлемые модели для ряда нейродегенеративных нарушений (представленные в обзорах Ройте & 1Вотт, 2000, Тгепйк Оепе!. 16: 161-167; ΖоβкЫ^ & Во!ак, 2002, Тгепйк Оепе!. 18: 463-471). Эти модели включают не только мушек, несущих мутированные гены мушки, но также мушек, несущих трансгены человека, необязательно с намеченными мутациями. Среди моделей на дрозофилах имеются, например, модели спинально-церебеллярной атаксии (например, 8СА-1 (см., например, ЛО 02/058626), 8СА-3 (Латск е! а1., 1998, Се11 93: 939-949)), болезни Хантингтона (1<а/еткЕкГаг|аш & Веп/ег, 2000, 8с1епсе 287: 1837-1840)), болезни Паркинсона (Реапу е! а1., 2000, №Циге 404: 394-398; Аи1иск е! а1., 2002, 8с1епсек 295: 809-810), возрастной нейродегенерации (Оепейск, 2002, 161: 4208), болезни Альцгеймера (8е1кое е! а1., 1998, Тгепйк Се11 Вю1. 8: 447-453; Уе е! а1., 1999, ΐ. Се11 Вю1. 146: 1351-1364), амиотрофического бокового склероза (Рагкек е! а1., 1998, №!ите Оепе!. 19: 171-174) и адренолейкодистрофии.

Доказано, что использование дрозофилы в качестве модельного организма является важным инструментальным средством для оценки нейродегенеративных путей у человека, поскольку геном дрозофилы содержит много релевантных человеческих ортологов, функция которых очень хорошо сохранена (КиЫш О.М., е! а1., 8аепсе 287: 2204-2215 (2000). Например, ИтокорЫ1а те1аподак!ег несет ген, который гомологичен АРР человека, который вовлечен в функционирование нервной системы. Ген, подобный АРР (АРРЬ), идентичен на приблизительно 40% АРР695, нейронной изоформе (Кокеп е! а1., Ргос. №!1. Асай. 8с1. и.8.А. 86: 2478-2489)), и, подобно АРР695 человека, экспрессируется исключительно в нервной системе. Мушки с нехваткой гена АРРЬ демонстрируют нарушения поведения, которое можно восстановить с помощью гена АРР человека, что говорит о том, что два гена имеют схожие функции в двух организмах (Ьио е! а1., №итоп 9: 595-605 (1992)). Модели болезни Альцгеймера на дрозофиле описываются в заявках на патенты США 2004/0244064, 2005/0132425, 2005/0132424, 2005/0132423, 2005/0132422, 2005/0132421, 2005/0108779, 2004/0255342, 2004/0255341, 2004/0250302, которые полностью включены сюда посредством ссылки.

Кроме того, были созданы модели на дрозофилах опосредованных повтором в виде полиглутамина заболеваний (.Тасккоп О.К., е! а1., №итоп 21: 633-642 (1998); Ка/епи-ЕкГагаш Р. апй Веп/ег 8., 8аепсе 287: 1837-1840 (2000); Регпапйег-Рипе/ е! а1., №!ите 408: 101-106 (2000)), болезни Паркинсона (Реапу М.В. апй Вепйег Л.Л., №Циге 404; 394-3981 (2000)) и других заболеваний, которые близко воспроизводят состояние заболевания у людей на клеточном и физиологическом уровнях, и эти модели были успешно использованы для идентификации других генов, которые причастны к этим заболеваниям. Трансгенные мушки демонстрируют прогрессирующую нейродегенерацию, которая может приводить ко множеству измененных фенотипов, включающих опорно-двигательные фенотипы, поведенческие фенотипы (например, аппетит, поведение при спаривании и/или время жизни) и морфологические фенотипы (например, форму, размер или расположение клетки, органа или придатка, или размер, форму или скорость роста мушки).

Оценку симптомов животных, которым вводили соединения, проводят относительно симптомов животных, которым не вводили соединения. Измеряемое изменение тяжести симптома (т.е. ослабление по меньшей мере одного симптома, т.е. ослабление на 10% или больше) или отсрочка в возникновении симптома у животных, повергнутых лечению ингибитором Ьр-РЬА^ в сравнении с животными, не подвергнутыми лечению, служит признаком эффективности терапии.

Можно оценить память или обучение животных, например, выполняя поведенческий тест. Можно

- 65 025527 использовать любой поведенческий тест на память и обучение, широко известный специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники, например, но без ограничения, тест в водном лабиринте Морриса для моделей на являющихся грызунами животных. Измеряемое увеличение способности выполнять тест в водном лабиринте Морриса у животных, которым вводили ингибитор Ер-РЬ-А^ в сравнении с животными, не подвергнутыми лечению, служит признаком эффективности терапии.

Пригодность ингибитора Ер-РЕА_з для лечения заболевания или нарушения ВВВ можно оценить в любой из ряда моделей на животных, в которых имеет место нарушение ВВВ и/или проницаемость ВВВ. Одним из способов, который можно использовать, является оценка способности переносимых кровью компонентов, таких как Ц или пептиды амилоиды-бета (Ав), к пересечению ВВВ и взаимодействию с нейронами головного мозга. В одном из способов, применимом в раскрытых здесь способах, для оценки способности переносимых кровью компонентов, таких как Ц или пептиды амилоиды-бета (Ав), к пересечению ВВВ используется флуоресцентно меченный Абета42, и этот способ описывается СПГГогб и др., 2007, в Вгаш КекеагсЬ 1142: 223-236, документе, который полностью включен сюда посредством ссылки. В этом способе способность переносимых кровью пептидов Ав пересекать нарушенный ВВВ оценивали, используя меченные флуоресцеин-изотиоцианатом (ИТС) Ав42 и Ав40, вводимые посредством инъекции в хвостовую вену мышей с ВВВ, ставшим проницаемым с помощью обработки коклюшным токсином. Установлено, что как Ав40, так и Ав42 пересекают ВВВ с аномальной проницаемостью и связываются избирательно с некоторыми подтипами нейронов, но не с глиальными клетками, при этом через 48 ч после инъекции в головном мозге Ав42-положительные нейроны широко распространены. В качестве контроля, животные с ненарушенным ВВВ (контроли с введением солевого раствора) блокировали проникновение переносимых кровью пептидов Ав в головной мозг. Такую модель на животном можно использовать для оценки способности ингибитора Ер-РЕА_з предупреждать или лечить нарушение ВВВ или проницаемость ВВВ с помощью определения Ав42-положительных нейронов в головном мозге через 48 ч после инъекции коклюшного токсина и ИТС-меченного Ав42 в присутствии или в отсутствие ингибитора Ер-РЕА^ Уменьшение Ав42-положительных нейронов в головном мозге животных, которым вводили ингибитор Ер-РЕА^ по сравнению с животными, которым не вводили ингибитор Ер-РЕА^ указывает на то, что ингибитор Ер-РЕА_з является эффективным в лечении и/или предупреждении проницаемости ВВВ.

Можно также использовать другие микромолекулы в моделях на животных проницаемости ВВВ. В ткани головного мозга можно выявить меченые, переносимые кровью компоненты, например, флуорес35 125 35 центно меченные или З-меченные пептиды Абета, I- или З-меченный иммуноглобулин Од), пероксидазу хрена (НКР), Эванс голубой, флуоресцентные или магнитные микрошарики (Мо1еси1аг РгоЬек) и декстраны различной молекулярной массы.

Известно, что коклюшный токсин, происходящий из Вогбе1е11а рег1и5515, эффективно увеличивает проницаемость ВВВ у мышей уже через 24 ч после инъекции и в течение периода, составляющего вплоть до нескольких недель (АпиеЕ 1976; Вгискепег е1 аЕ, 2003), и, вероятно, вовлечен в проявление связанных с коклюшем, неврологических последствий, которые связаны с нарушением целостности ВВВ в эпителии хориоидного сплетения и/или эндотелии капилляров головного мозга. Коклюшный токсин также использовали для усиления развития экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ), широко используемой модели на мыши рассеянного склероза (Веп-Шп е1 аЕ, 1997; НпПисит е1 аЕ, 1982; Уопд е! аЕ, 1993).

Составы композиций

Соединения, например раскрытые здесь агенты, ингибирующие Ер-РЕА^ могут использоваться в качестве лекарственного средства или использоваться для приготовления фармацевтических композиций с использованием одного или нескольких раскрытых здесь средств обеспечения. Их можно вводить ш νίίΐΌ в клетки культуры, ш угуо в клетки организма или ех угуо в клетки вне индивидуума, которые позже возвращают в организм того же самого индивидуума или другого индивидуума. Такие клетки могут быть дезагрегированы или предоставлены в виде солидной ткани.

Соединения, например, раскрытые здесь агенты, ингибирующие Ер-РЕА^ могут использоваться для приготовления лекарственного средства или других фармацевтических композиций. Применение ингибирующих Ер-РЕА_з агентов, дополнительно включающих фармацевтически приемлемый носитель, и композиций, дополнительно содержащих компоненты, пригодные для доставки композиции индивидууму, известно в данной области техники. Добавление таких носителей и других компонентов к раскрытым здесь агентам не выходит за пределы уровня знаний в этой области техники.

Фармацевтические композиции можно вводить в виде композиции, адаптированной к прохождению через гематоэнцефалический барьер или прямому контакту с эндотелием. В некоторых вариантах осуществления композиции можно вводить в виде композиции, адаптированной для системного введения. В некоторых вариантах осуществления композиции можно вводить в виде композиции, адаптированной для доставки в конкретные органы, например, но без ограничения, печень, костный мозг, или для системной доставки.

Альтернативно, фармацевтические композиции можно добавлять в среду для культивирования кле- 66 025527 ток ех νίνο. Помимо активного соединения такие композиции могут содержать фармацевтически приемлемые носители и другие ингредиенты, о которых известно, что они облегчают введение и/или усиливают поглощение, (например, солевой раствор, диметилсульфоксид, липид, полимер, системы направленной доставки к специфическим клеткам, основанной на сродстве). Композиция может быть включена в гель, тампон или другую проницаемую матрицу (например, сформированную в виде шариков или диска) и размещена поблизости от эндотелия для непрерывного, местного высвобождения. Композиция может назначаться в однократной дозе или в многократных дозах, которые вводят в различные периоды времени.

Фармацевтические композиции могут вводиться с использованием любого известного пути. В качестве примера композицию можно вводить через слизистую оболочку, с использованием легочного, местного или другого пути введения в строго определенное место или системного пути (например, энтерального или парентерального). Используемые здесь выражения парентеральное введение и вводимый парентерально означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно с помощью инъекции, и включают, но без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, подоболочечную, внутрижелудочковую, внутрикапсульную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, интрацереброспинальную и надчревную инъекцию, инфузию и другие методы инъекции или инфузии, без ограничения. Используемые здесь выражения системное введение, вводимый системно, периферическое введение и вводимый периферически означают введение раскрытых здесь агентов так, что они поступают в систему животного и, следовательно, подвергаются метаболизму и другим подобным процессам, например, подкожное введение.

Выражение фармацевтически приемлемый используется здесь для ссылки на такие соединения, материалы, композиции и/или лекарственные формы, которые, в рамках обоснованной оценки лечения, являются подходящими для применения для приведения в контакт с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, соответствующими допустимому отношению польза/риск.

Используемое здесь выражение фармацевтически приемлемый носитель означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, такие как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, инертный наполнитель, растворитель или инкапсулирующий материал, вовлеченные в перенос или транспортировку рассматриваемых агентов от одного органа, или части тела, в другой орган, или часть тела. Каждый носитель должен быть приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции, например, носитель не должен уменьшать эффект агента на лечение. Другими словами, носитель является фармацевтически инертным.

Соответствующие выборы количеств и назначений по времени доз, композиции и путей введения можно осуществить с целями достижения благоприятного эффекта у субъекта с сосудистой деменцией, например, субъекта с болезнью Альцгеймера или субъекта, подверженному риску развития такого заболевания (т.е. эффективности), и избегания чрезмерной токсичности или другого вреда субъекту (т.е. безопасности). Следовательно, эффективные относятся к таким выборам, которые включают обычное манипулирование условиями для достижения желаемого эффекта.

Общепринятой схемой введения доз является болюсное введение композиции индивидууму в течение короткого периода времени один раз в день. Альтернативно, эффективную суточную дозу можно разделить на множество доз для введения, например от двух до двенадцати доз в день. Уровни доз активных ингредиентов в фармацевтической композиции можно также изменять для достижения неустойчивой или устойчивой концентрации соединения или его производного у индивидуума, особенно в эндотелии сосудов головного мозга или вокруг него, и вызова желаемого терапевтического ответа или защиты. Но начало с доз на уровнях, которые ниже уровней, требуемых для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенное увеличение дозы до достижения желаемого эффекта также находится в пределах знаний в данной области техники.

Вводимое количество ингибирующих Ьр-РЬА₂ агентов зависит от факторов, известных квалифицированному в данной области техники специалисту, таких как биоактивность и биодоступность соединения (например, полупериод существования в организме, стабильность и метаболизм), химические свойства соединения (например, молекулярная масса, гидрофобность и растворимость), путь и схема введения и т.п. Будет также понятно, что конкретный уровень дозы, который должен быть достигнут для какого-либо конкретного индивидуума, может зависеть от множества факторов, включающих возраст, пол, состояние здоровья, анамнеза, вес, сочетание с одним или несколькими другими лекарственными средствами и тяжесть заболевания.

Термин лечение, относительно лечения сосудистой деменции, или болезни Альцгеймера, или заболевания, связанного с нарушенным ВВВ, относится, среди прочего, к предупреждению развития заболевания или изменению течения заболевания (например, но без ограничения, замедлению прогрессирования заболевания), или реверсированию симптома заболевания или ослаблению одного или нескольких симптомов и/или одного или нескольких биохимических маркеров у субъекта, предотвращению ухудше- 67 025527 ния или прогрессирования одного или нескольких симптомов, инициированию возврата в прежнее состояние или улучшению прогноза, и/или предупреждению заболевания у субъекта, не имеющего его, а также замедлению или уменьшению прогрессирования существующего заболевания. Для данного субъекта ослабление симптома, его ухудшение, регрессию или прогрессирование можно определить по объективному или субъективному критерию. Например, можно определить изменение одного или нескольких биохимических маркеров, например, проницаемости, наличия 1д вне сосудов в головном мозге или бета-амилоида в С8Е.

В некоторых вариантах осуществления можно определить эффективность лечения как уменьшение заболеваемости или смертности (т.е. удлинение кривой выживаемости для выбранной популяции). Профилактические способы (например, предотвращение или уменьшение частоты рецидива) также считаются лечением.

В некоторых вариантах осуществления лечение может также включать комбинацию с другими существующими способами лечения, например, существующими агентами для лечения болезни Альцгеймера, например, но без ограничения, Арисептом или донепезилом, Когнексом или такрином, Экселоном или ривастигмином, Реминилом или галантамином, противоамилоидной вакциной, понижающими Абета терапиями, умственным упражнением или стимуляцией; см. обзор ΖΙοΚονίο. Λύν. Эгид Όβΐίν. Ксу. 54: 1533-1660, 2002.

В некоторых вариантах осуществления раскрытые здесь агенты, которые ингибируют Ьр-РЬА₂, можно комбинировать с другими агентами, например терапевтическим агентом для предупреждения и/или лечения нейродегенеративных заболеваний. Такими агентами могут быть любые агенты, используемые в настоящее время или разрабатываемые для лечения и/или предупреждения нейродегенеративного заболевания или нарушения, причем агент может оказывать профилактический и/или лечебный эффект и/или ослаблять симптом нейродегенеративного нарушения или заболевания.

В тех вариантах осуществления, в которых раскрытые здесь агенты-ингибиторы Ьр-РЬА₂ используются для предупреждения и/или лечения болезни Альцгеймера и/или сосудистой деменции, раскрытые здесь агенты-ингибиторы Ьр-РЬА₂ можно использовать в комбинации с лекарственными средствами, широко известными специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники, которые, как заявлено, являются полезными для симптоматических лечений деменции. Примеры таких лекарственных средств включают, но без ограничения, агенты, которые, как известно, модифицируют холинергическую передачу, такие как агонисты или аллостерические модуляторы мускариновых рецепторов М1, антагонисты мускариновых рецепторов М2, ингибиторы ацетилхолинэстеразы (такие как тетрагидроаминоакридин, донепезил, галантамин и ривастигмин), агонисты или аллостерические модуляторы никотиновых рецепторов (такие как агонисты или аллостерические модуляторы α7 или агонисты или аллостерические модуляторы α4β2), агонисты активируемых пролифератом пероксисом рецепторов (РРАК) (такие как агонисты РРАКу), частичные агонисты рецептора 5-НТ4, антагонисты и обратные агонисты гистамина Н3, антагонисты рецептора 5-НТ6 или антагонисты рецептора 5НТ1А, позитивные модуляторы АМРА (альфа-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионат, подтип глутаматных рецепторов) и антагонисты или модуляторы рецептора Ν-метил-Э-аспарагиновой кислоты (такие как мемантин).

В тех вариантах осуществления, в которых раскрытые здесь агенты-ингибиторы Ьр-РЬА₂ используются для лечения болезни Альцгеймера, раскрытые здесь агенты-ингибиторы Ьр-РЬА₂ можно использовать в комбинации с вышеупомянутыми лекарственными средствами, которые, как заявлено, являются полезными для симптоматических лечений деменции и/или в качестве модифицирующих заболевание агентов. Модифицирующие заболевание агенты включают, но без ограничения, ингибиторы и модуляторы гамма-секретазы и ингибиторы бета-секретазы человека (ВАСЕ). Модифицирующими заболевание агентами также являются, например, но без ограничения, ингибиторы и модуляторы гамма-секретазы, ингибиторы бета-секретазы (ВАСЕ) и любые другие антиамилоидные подходы, включающие активную и пассивную иммунизацию, например агенты, идентифицированные с использованием способов, раскрытых в заявке на патент США 2005/0170359, а также агенты, раскрытые в международных заявках на патенты УО 05/07277, УО 03/104466 и УО 07/028133 и в патентах США № 6866849 и 6913745, которые полностью включены сюда посредством ссылки.

Таким образом, на практике может осуществляться лечение комбинацией одного или нескольких агентов, которые ингибируют Ьр-РЬА₂, с одной или несколькими другими лечебными процедурами.

Кроме того, лечение может также включать множество агентов для ингибирования экспрессии или активности Ьр-РЬА₂. Например, другие агенты включают применение статинов с ниацином (см. Ьйр://№№№.депепдпе№8.сот/пе№8/Ьпйет.а8рх?иате=6724568) и фенофибратом (см.

Ьйр://№№№.депепдпе№8.сот/пе№8/Ьпйет.а8рх?иате=14817756&1ах1Й= 19).

Аналогично, диагностирование в соответствии с настоящим изобретением можно осуществлять на практике с использованием других диагностических способов. Например, изменение профилей экспрессии генов в эндотелии сосудистой системы, головном или спинном мозге (например, кровеносных или лептоменингеальных сосудах) можно проанализировать, используя специфичные для заболевания набо- 68 025527 ры для молекулярной диагностики (например, выполненные по заказу ранжированные ряды, мультиплексную количественную ПЦР, ранжированные ряды для мультиплексного протеомного анализа). Кроме того, для увеличения точности и/или чувствительности диагностики в комбинации можно использовать неинвазивный способ диагностирования (например, САТ, ΜΜ, 8РЕСТ или РЕТ). Ранняя и надежная диагностика особенно полезна для лечений, которые эффективны только для болезни Альцгеймера от легкой до средней степени тяжести или только для отсрочки ее прогрессирования.

Вводимым субъекту количеством предпочтительно является количество, которое не вызывает токсические эффекты, которые перевешивают пользу, которую приносит их введение. Дальнейшими целями являются уменьшение числа симптомов заболевания у индивидуума, уменьшение их тяжести и/или иное уменьшение страдания от них по сравнению с признанными стандартами лечения.

Получение соединений в соответствии с существующими в настоящее время правилами надлежащей лабораторной практики (СЬР) и надлежащей производственной практики (ΌΜΓ) будет контролироваться государственными органами (например, Администрацией по контролю за продуктами питания и лекарствами). Для этого необходимо точное и полное ведение записей, а также контролирование обеспечения/контроля качества. Также предусматривается контроль подписанных пациентами протоколов органами и основными группами лиц для гарантии того, что информированное согласие получено, безопасность, биоактивность, соответствующая доза и эффективность продуктов исследуются пофазно; результаты являются статистически значимыми; и придерживаются этических правил. Необходим аналогичный контроль протоколов, в которых используются модели на животных, а также применения токсических химических веществ и соблюдения правил.

Дозы, составы, объем доз, схемы введения доз и способы анализа результатов, направленных на ингибирование экспрессии и/или активности Ьр-РЬА₂, могут варьировать. Таким образом, минимальная и максимальная эффективные дозы варьируют в зависимости от способа введения. Блокирование клинических и гистологических изменений, сопровождающих сосудистую деменцию, может происходить в конкретном диапазоне доз, который, однако, варьирует в зависимости от организма, в который вводится доза, пути введения, того, вводятся ли агенты, которые ингибируют Ьр-РЬА₂, в соединении с другими костимулирующими молекулами, и конкретной схемы введения ингибитора Ьр-РЬА₂. Например, обычно при назальном введении требуются меньшие дозы, чем при пероральном, энтеральном, ректальном или вагинальном введении.

Для оральных или энтеральных композиций для применения в настоящем изобретении могут быть изготовлены таблетки в соответствии с общепринятыми способами, в которых используются твердые носители, широко известные в данной области техники. Капсулы, используемые для оральных композиций, используемых в способах настоящего изобретения, могут быть изготовлены из любого фармацевтически приемлемого материала, такого как желатин или производные целлюлозы. Также предусматриваются системы для пероральной доставки с непрерывным высвобождением и/или энтеросолюбильные покрытия для вводимых перорально лекарственных форм, такие как те, которые описаны в патенте США № 4704295 Еп1епс Рйт-Соайпд СотроШют, выданном 3 ноября 1987, в патенте США № 4556552 Еп1епс Рйт-Соайпд СотрокШопк, выданном 3 декабря 1985, в патенте США № 4309404 8и81ашей Ке1еазе РЬагтасеийса1 СотрозШопз, выданном 5 января 1982, и в патенте США № 4309406 8и51ашей Ке1еазе РЬагтасеийса1 СотрозШопз, выданном 5 января 1982.

Примеры твердых носителей включают крахмал, сахар, бентонит, диоксид кремния и другие широко используемые носители. Дальнейшие неограничивающие примеры носителей и разбавителей, которые можно использовать в композициях настоящего изобретения, включают физиологический раствор, сироп, декстрозу и воду.

Композиция с энтеросолюбильным покрытием

Что касается композиций для введения малых химических молекул-ингибиторов Ьр-РЬА₂ типа, подобного формулам (Ί)-(Ίν), раскрытых здесь, одним особенно полезным вариантом осуществления является композиция в форме таблетки, содержащая ингибитор Ьр-РЬА, с энтеросолюбильной полимерной оболочкой. Пример такого препарата можно найти в \УО 2005/021002. Активный материал в сердцевине может присутствовать в. микронизированной или солюбилизированной форме. Помимо активных материалов сердцевина может содержать добавки, принятые в области спрессованных таблеток. Соответствующие добавки в такой таблетке могут включать разбавляющие вещества, такие как безводная лактоза, лактозы моногидрат, кальция карбонат, магния карбонат, дикальция фосфат или их смеси; связующие вещества, такие как микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, поливинилпирролидон, прежелатинизированный крахмал или аравийская камедь или их смеси, дезинтегрирующие агенты, такие как сшитый с микрокристаллической целлюлозой (выполняющей как функцию связующего вещества, так и функцию дезинтегратора) поливинилпирролидон, натрийкрахмалгликолят, натрия кроскармеллоза или их смеси; смазывающие вещества, такие как магния стеарат или стеариновая кислота, вещества, способствующие скольжению, или средства для текучести, такие как коллоидный раствор диоксида кремния, тальк или крахмал, и стабилизаторы, такие как обезвоживающий аморфный диоксид кремния, красящие вещества, корригенты и т.п. Предпочтительно таблетка содержит лактозу в качестве разбавляющего вещества. Когда связующее вещество присутствует, им

- 69 025527 предпочтительно является гидроксипропилметилцеллюлоза. Предпочтительно таблетка содержит магния стеарат в качестве смазывающего вещества. Предпочтительно таблетка содержит натрия кроскармеллозу в качестве дезинтегрирующего агента. Предпочтительно таблетка содержит микрокристаллическую целлюлозу.

Разбавляющее вещество может присутствовать в диапазоне 10-80 вес.% сердцевины. Смазывающее вещество может присутствовать в диапазоне 0,25-2 вес.% сердцевины. Дезинтегрирующий агент может присутствовать в диапазоне 1-10 вес.% сердцевины. Микрокристаллическая целлюлоза, если присутствует, может находиться в диапазоне 10-80 вес.% сердцевины.

Предпочтительно вес активного ингредиента (рассчитанный как эквивалент свободного основания) составляет от 10 до 50 вес.% сердцевины, более предпочтительно от 15 до 35 вес.% сердцевины (рассчитанный как эквивалент свободного основания). Сердцевина может содержать любой терапевтически подходящий уровень дозы активного ингредиента, но предпочтительно содержит вплоть до 150 мг активного ингредиента в виде свободного основания. Особенно предпочтительно, когда сердцевина содержит 20, 30, 40, 50, 60, 80 или 100 мг активного ингредиента в виде свободного основания. Активный ингредиент может присутствовать в виде свободного основания или любой фармацевтически приемлемой соли. Если активный ингредиент присутствует в виде соли, вес регулируют, с тем чтобы таблетка содержала желаемое количество активного ингредиента, рассчитанное как свободное основание соли. Предпочтительно активный ингредиент присутствует в виде соли гидрохлорида.

Сердцевина может быть изготовлена из спрессованной смеси ее компонентов. Компоненты можно подвергнуть непосредственному прессования или можно подвергнуть гранулированию перед прессованием. Такие гранулы можно создать с помощью общепринятого способа гранулирования, известного в данной области техники. В альтернативном варианте осуществления гранулы можно индивидуально покрыть энтеросолюбильной оболочкой, а затем заключить в стандартную капсульную оболочку.

Сердцевину окружают оболочкой, которая включает энтеросолюбильный полимер. Примерами энтеросолюбильных полимеров являются целлюлозы ацетат фталат, целлюлозы ацетат сукцинат, метилцеллюлозы фталат, этилгидроксицеллюлозы фталат, поливинилацетат фталат, поливинилбутират ацетат, сополимер винилацетата с малеиновым ангидридом, сополимер стирола с моноэфиром малеиновой кислоты, сополимер метилакрилата с метакриловой кислотой или сополимер метакрилат-метакриловая кислота-октилакрил. Их можно использовать или по отдельности, или в комбинации, или вместе с полимерами, отличными от вышеупомянутых полимеров. Оболочка может также включать нерастворимые вещества, которые не разлагаются, не растворяются в живом организме, такие как производные алкилцеллюлозы, такие как этилцеллюлоза, сшитые полимеры, такие как сополимер стирола с дивинилбензолом, полисахариды, имеющие гидроксильные группы, такие как декстран, производные целлюлозы, которые обрабатывают бифункциональными сшивающими агентами, такими как эпихлоргидрин, дихлоргидрин или 1,2-,3,4-диэпоксибутан. Оболочка может также включать крахмал и/или декстрин.

Предпочтительными энтеросолюбильными покровными материалами являются имеющиеся в продаже, энтеросолюбильные полимеры Еийгадй®, такие как Еийгадй® Ь, ЕийгадИ® 8 и Еийгадй® ΝΕ, используемые отдельно или с пластификатором. Такие покрытия обычно наносят, используя жидкую среду, и природа пластификатора зависит от того, является ли среда водной или неводной. Пластификаторы для использования с водной средой включают пропиленгликоль, триэтилцитрат, ацетилтриэтилцитрат или С'ПгоЛех® или С'ПгоЛех® А2. Неводные пластификаторы включают эти пластификаторы, а также диэтил- и дибутилфталат и дибутилсебакат. Предпочтительным пластификатором является триэтилцитрат. Включаемое количество пластификатора будет выявлено квалифицированными в данной области специалистами.

Оболочка может также включать препятствующее прилипанию вещество, такое как тальк, диоксид кремния или глицерилмоностеарат. Предпочтительно препятствующим прилипанию веществом является глицерилмоностеарат. Как правило, оболочка может включать приблизительно 5-25 вес.% пластификатора и вплоть до приблизительно 50 вес.% препятствующего прилипанию вещества, предпочтительно 110 вес.%. препятствующего прилипанию вещества.

Если желательно, можно включить поверхностно-активное вещество для содействия в формировании суспензии полимера в воде. Квалифицированному в данной области техники специалисту известно множество примеров возможных поверхностно-активных веществ. Предпочтительными примерами поверхностно-активных веществ являются полисорбат 80, полисорбат 20 или натрия лаурилсульфат. Если присутствует, поверхностно-активное вещество может составлять 0,1-10% оболочки, предпочтительно 0,2-5% и особенно предпочтительно 0,5-2%.

В одном варианте осуществления между сердцевиной и энтеросолюбильным покрытием включен защитный слой. Защитный слой представляет собой покровный материал, который может использоваться для защиты энтеросолюбильной оболочки от возможного химического разъедания какими-либо щелочными ингредиентами в сердцевине. Защитный слой может также обеспечить более сглаженную поверхность, тем самым делая возможным более легкое присоединение энтеросолюбильной оболочки. Квалифицированный в данной области техники специалист знает о подходящих покрытиях. Предпочти- 70 025527 тельно защитный слой изготовлен их покровного материала Опадри (Орайгу) и особенно предпочтительно, когда он представляет собой Опадри белый ОУ-8-28876.

В одном варианте осуществления фармацевтически активным ингредиентом является 1-(Ν-(2диэтиламино)этил)^-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6триметиленпиримидин-4-он или его соль.

Один пример такой композиции с энтеросолюбильным покрытием, описанный в АО 2005/021002, включает варьирующие количества 1-^-(2-диэтиламино)этил)-^(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-она (называемого активным в этом примере) в виде соли гидрохлорида.

В этом примере лактозы моногидрат, микрокристаллическую целлюлозу, активный ингредиент, гидроксипропилметилцеллюлозу и половину кроскармеллозы натрия помещали в смеситель на 10 л с большим усилием сдвига Р1е1йег (мог быть использован любой смеситель с большим усилием сдвига) и смешивали в течение 5 мин при 300 об./мин с выключенным прерывателем. Смесь затем гранулировали при добавлении приблизительно 750 мл воды при продолжении смешивания. Гранулы сушили в сушилке с псевдоожиженным слоем О1а!! 3/5, помещали с использованием СотП в бункерный смеситель на 5 л РЬагта!ес и затем смешивали с любой заданной формулой безводной лактозой плюс остальная часть кроскармеллозы натрия в течение 5 мин при 20 об./мин. Магния стеарат помещали в смеситель и процесс смешивания продолжали в течение дополнительной 1 мин при 10 об./мин. Смесь с добавленным смазочным веществом подвергали прессованию, используя роторный таблеточный пресс Куа Р1ссо11а, оснащенный 9,5 мм круглыми нормально выпуклыми пробивными штампами (можно было использовать любой подходящий таблеточный пресс). Защитный слой и впоследствии энтеросолюбильное покрытие наносят напылением водной суспензии ингредиентов покровных слоев в установке для нанесения покрытия Μаиеβίу 10, используя параметры процесса покрытия, рекомендуемые производителями покровных полимеров (снова любая подходящая установка для нанесения покрытия могла бы использоваться).

Используя эти материалы или их эквиваленты, квалифицированный в данной области техники специалист может приготовить другие препараты с энтеросолюбильным покрытием этого сорта.

Примеры

Представленные здесь примеры относятся к способам и композициям для предупреждения и/или лечения нейродегенеративных нарушений, например, но без ограничения, сосудистой деменции и нарушений гематоэнцефалического барьера, например болезни Альцгеймера, болезни Хантингтона, болезни Паркинсона, путем ингибирования Ьр-РЬА₂. По всей этой заявке приводятся ссылки на различные публикации. Полное раскрытие всех публикаций и приведенных в них ссылок, тем самым, включено посредством ссылки в эту заявку для того, чтобы более полно описать уровень области техники, к которой относится это изобретение. Не подразумевается, что следующие примеры ограничивают объем формулы настоящего изобретения, а скорее подразумевается, что они приведены в качестве примеров некоторых вариантов осуществления. Подразумевается, что любые варианты приведенных в качестве примеров способов, осуществленные квалифицированным специалистом, находятся в объеме настоящего изобретения.

Способы

Модель на животном:

Была разработана модель диабета/диабетической гиперхолестеринемии (ΌΜ/НС) на свинье, которая воспроизводит атеросклероз типа, подобного человеческому. Диабет у сельскохозяйственных свиней весом 25-30 кг и возрастом ~4 месяца вызывали с помощью одной внутривенной инъекции 125 мг/кг стрептозотоцина (8юог РИагтасеи!1са1в, ГСше, СА). После стабилизации в течение 1-2 недель животные с повышенными уровнями глюкозы в плазме (>150 мг/дл) находились на атерогенной (с высоким содержанием жира) диете, как показано в табл. 1 (Ашта1 8рес1а111ев, ОиакеПотеп, РА) для достижения уровня холестерина, составляющего приблизительно 250-800 мг/дл.

Сохранение уровня холестерина определяли по схеме, представленной в табл. 2.

Таблица 1. Компоненты диеты с содержанием холестерина, составляющим 2,0%, являются

Компонент	В весовом отношении
Фермерский корм для свиней Ригхпа*	47,5%
Лярд	25,0%
Казеин	11,1%
Сухое цельное молоко	7,9%
Арахисовое масло	2,37%
Холестерин	2,0%
Солевая смесь Вессона	2,37%
Витаминная смесь Ригхпа*	1,58%
Натрия холат	1,58%
Кальция карбонат	0,4%
Холина хлорид	0,2%

- 71 025527

Корма Риппи*, ЬЬС, СкескегЬоагб Зциаге, δΐ. Ьошк, М155ошт, 63164, США. Эти корма были приготовлены производителем Специальный ассортимент и оборудование для животных, ЬЬС, Оиакег1о\уп, РА иЗА.

Для диеты с содержанием холестерина, составляющим 0,5%, компоненты были схожими за исключением 0,5% холестерина и 20% лярда. Животными были белые свиньи йоркширской породы, которые были кастрированными самцами возрастом 3-5 месяцев и были получены из Агскег Рагтк, ОагПпЦоп, МО. Эти корма были приготовлены производителем Специальный ассортимент и оборудование для животных, ЬЬС, Оиакег1о\уп, РА ИЗА.

В дни 1-2 животных кормили нормальной пищей, а затем в дни 3-14 животные находились на диете с содержанием холестерина 0,5% и содержанием лярда 2%, и на 14 день определяли уровни холестерина, и диету изменяли соответствующим образом с увеличением содержание холестерина и лярда до 2 и 10%, соответственно, если уровень холестерина составлял <300 мг/дл.

После индукции ЭМ/НС холестерин измеряли до стабилизации холестерина на уровнях между 300 и 800 мг/дл, а после стабилизации уровней холестерина холестерин измеряли ежемесячно. Если уровни холестерина не были стабильными после стадии первоначальной стабилизации, контроль диеты животного снова проводили по первоначальной схеме измерения каждые две недели. Ежемесячно определяли уровни холестерина, в том числе уровни общего холестерина, ЬПЬ, НОЬ, УЬПЬ и триглицеридов. Установку диеты животного на обеспечение стабильного уровня холестерина определяли по схемам, представленным в табл. 2.

Таблица 2. Изменение холестерина и диеты

Уровень холесте- рина	Изменение диеты	Следующее измерение	Уровень холесте- рина	Изменение диеты	Следующее измерение холесте- рина
<250 ьлг/дл	Переход на диету с содержанием лярда 25%	через 2 недели	<300 мг/дл	Продолжение диеты о содержанием лярда 25%	через 2 недели
			300-300 мг/дл	Переход на 75% лярда {25% лярда): 25% нормальной пищи	через 2 недели
			>800 мг/дл	Переход на 100% диету с содержанием лярда 10%	через 2 недели
			>1000 мг/дл	Переход на смесь (50:50) с диетой с содержанием лярда 10%	через 2 недели
			>1500 мг/дл	Переход на нормальную пишу	через 2 недели*

зоо-аоо мг/дл	Без изменения. Диета с содержанием лярда 10%	через 2 недели	<300 мг/дл	Продолжение диеты с содержанием лярда 25%	через 2 недели

- 72 025527

			300-800 мг/дл	Без изменения	Обычный график
			>800 мг/дл	Переход на смесь (50:50) диета с содержанием лярда 10%	через 2 недели
			>1000 мг/дл	Смесь (25:75) диета с содержанием лярда 10%	через 2 недели
			>1500 мг/дл	Нормальный корм	через 2 недели

800-1000 мг/дл	Переход на смесь (50:50) диета с содержанием лярда 10%: и нормальный корм	через 2 недели	<300 мг/дл	Переход на смесь (50:50) диета С содержанием лярда 10%:нормальный корм	через 2 недели
			300-300 мг/дл	Без изменения в диете. Смесь (50:50) с диетой с содержанием лярда 10%	через 2 недели
			>900 мг/дл	Переход на смесь 25:75 (10% лярда)	через 2 недели
			>1000 мг/дл	Переход на смесь 25:75 (10% лярда)	через 2 недели
			>1500 мг/дл	Нормальный корм	через 2 недели*

- 73 025527

>1000 мг/дл	Смесь (25:75) диета с содержанием лярда 10%:нормальный корм	через 2 недели	<300 мг/дл	Переход на смесь (50:50) диета с содержанием лярда 10%:нормальный корм	через 2 недели
			300-800 мг/дл	Без изменения в диете. Смесь (25:75) диета с содержанием лярда 10%:нормальный корм.	через 2 недели
			>800 мг/дл	Без изменения в диете	через 2 недели
			>1000 мг/дл	Нормальный корм	через 2 недели*
			>1500 мг/дл	Нормальный корм	через 2 недели*

>1500 мг/дл	Нормальный диетический корм	через 2 недели	<300 мг/дл	Переход на 100% диету с содержанием лярда 10%	через 2 недели
			300-300 мг/дл	Переход на смесь (50:50) диета с содержанием лярда 10%:нормальный корм	через 2 недели
			>800 мг/дл	Нормальный корм	через 2 недели*
			>1000 мг/дл	Нормальный корм	через 2 недели*
			>1500 мг/дл	Нормальный корм	через 2 недели*

Через месяц после стабилизации холестерина на уровне 250-800 мг/дл животных рандомизировали в две экспериментальные группы, группу ΌΜ/НС (гипергликемии и гиперхолестеринемии), не подвергаемую лечению, и группу ΌΜ/НС, подвергаемую лечению (10 мг/кг/день 8Β-480848, также упоминаемого как 1-^-(2-диэтиламино)этил)^-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он. Животных умерщвляли на 6 месяц после рандомизации. Протокол опыта на животных был утвержден комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию ишуегеПу οί Репп5уката.

Оценивали две группы с диабетом/гиперхолестеринемией:

1) группу ΌΜ/НС и 2) животных с ΌΜ/НС, получающих ингибиторы Ьр-РЬА₂. В эксперименты были включены контрольная группа (группа ΌΜ/НС - 17 свиней) и экспериментальная группа (животные ΌΜ/НС, получающие ингибиторы Ьр-РЬА₂ - 20 свиней). Кроме того, уровни холестерина в крови поддерживали на уровне от 300 до 800 мг/дл у экспериментальных животных, при этом этот диапазон, как было определено, обеспечивает лучшую модель для испытания. Уровни холестерина в крови контролировали у всех животных по схеме два раза в месяц, как представлено в табл. 4, и вносили соответствующие изменения в содержание жира в корме, как представлено в табл. 2. Процент холестерина и лярда находился в диапазоне 0,5-2% и 10-25%, соответственно, и все животные получали корм, в котором концентрация холестерина и лярда находился в этом диапазоне. Образцы крови получали в исходном состоянии через 1, 3 и 6 месяцев. Каждый раз получали менее 1 мл/кг крови. При проводимых два раза в месяц исследованиях уровней холестерина в крови исследовали уровни общего холестерина, ЬОЬ, НОЬ, УЬОЬ и триглицеридов, глюкозы в крови и стволовых клеток костного мозга (РВМС) (см. табл. 4).

Количествами животных, выбранными для подтверждения соответствия минимальному условию

- 74 025527 для статистической достоверности, были следующие две группы животных в каждом эксперименте: 1) контрольная группа (п=17); животные с диабетом и гиперлипидемией; 2) экспериментальная группа (п=20), животные с диабетом и гиперлипидемией, получающие 10 мг/кг ингибитора Ьр-РЬА₂, как представлено в табл. 3.

Домашних свиней для сельского хозяйства, боровов йоркширской породы, весом в диапазоне 25-35 кг покупали в местной ферме и помещали внутрь помещения под наблюдение ветеринара. Их кастрировали за 3-5 дней до даты начала исследования. Диабет у испытуемых свиней вызывали с помощью инфузии одной дозы стрептозоцина (125 мг/кг) внутривенно за период, составляющий 30 мин. Если у животных диабет не развивался, вводили вторую дозу (50 мг/кг). Во избежание возможного возникновения первоначальной гипогликемии, в корм добавляли 20 г порошкообразной глюкозы в течение первых 2 дней. Уровень глюкозы в крови определяли, используя глюкометр, каждый день перед кормлением в течение первых 14 дней и затем один раз в неделю.

Испытуемых животных содержали отдельно от контрольных животных во избежание переноса лекарственного средства между животными вследствие копрофагии. Все животные находились на атерогенной диете, предоставляемой дважды в день, с неограниченным доступом к воде. Изготовленная по заказу диета, компоненты которой представлены в табл. 1, содержала 0,5 и 2% холестерина и 10 и 25% лярда.

Таблица 3. План для животных и процедур (разделенных на 2 группы)

	Число животных	Временная шкала
Группа 1: ПМ/НС	N=20	7 месяцев
Группа 2: животные с ПМ/НС, получающие ингибиторы Ьр-РЬА;	N=17	7 месяцев
Всего	N=3 7	7 месяцев

Таблица 4. Краткое изложение процедур

	Начало	28 день	57 день	85 день	113 день	141 день	168 день	196 день
Глюкоза, ΙΜ,	НйЬ,	X	X	X	X	X	X	X	X
триглицериды	в
сыворотке

Ьр-РЛАг (замороженная сыворотка-ЕОТА)	X	X	X	X	X	X	X	X
ЕВМС	X		X		X			X
Получение тканей								X

Введение суточной дозы начинали в день 29, когда каждое испытуемое животное получало суточную дозу 10 мг/кг 8В-480848 (вводимую как болюсный эквивалент в пище для собак). Перед этим животные ничего не получали через рот ночью с полуночи. Животных подвергали эвтаназии в день 196 и немедленно получали ткани.

Приготовление ткани головного мозга

В пределах одного часа после эвтаназии животных извлекали целый головной мозг. Правое полушарие фиксировали в 10% формалине в течение по меньшей мере одной недели. Затем делали срезы тканей головного мозга и заливали их в парафин. От каждого животного было создано всего ~11 групп тканей (см. иллюстрацию) для иммуногистохимии (ГНС). Из левого полушария были сохранены кора головного мозга (из множества мест), гиппокамп и ствол головного мозга для анализа РНК и белкового анализа.

Полученная после смерти ткань головного мозга человека, использованная для сравнения с тканью головного мозга свиньи. Гиппокамп и энториальную область коры головного мозга от пациентов с клинически диагностированной, спорадической АО (болезнь Альцгеймера) (п=21, возрастной диапазон - 7284) и контрольные ткани от нормальных, подобранных по возрасту, неврологически нормальных индивидуумов (п=13, возрастной диапазон = 69-81) получали из Натуатй Вгат Т1ккие Кекоигсе Сеп!ег (Ве1топ!, СА) и СоорегаИге Нитап ТЬкие №1\\όγ1< (РЫ1айе1рЫа, РА). Интервалы между получениями после смерти этих головных мозгов составляли <24 ч, и патологическое подтверждение АО для каждого образца головного мозга проводили в соответствии с критериями, определенными №Юопа1 !пк111и1е оп Адшд и группой, работающей над диагностическими критериями для неврологической оценки болезни Альцгеймера, Кеадап !пк111и1е (1997). Используя те же критерии, отбирали образцы головного мозга по- 75 025527 добранных по возрасту контролен. Ткани характеризовали иммуногистохимически на присутствие старческих (амилоидных) бляшек и нейрофибриллярных клубков, описанных ранее (Э'Апйгеа е! а1., 2001; №-1§е1е е! а1., 2002). В контрольных тканях не выявлялась тяжелая патология или выявлялась минимальная, локализованная, микроскопическая, напоминающая ΛΌ невропатология. Ткани обрабатывали с использованием обычной заливки в парафин и получения срезов в соответствии с широко известными протоколами. Последовательно делали срезы толщиной пять микрометров, размещали на предметных стеклах 8ирегРгок! Р1ик+ (Р1кЬег 8с1епййс, РШкЬигдН, РА) и сушили в течение ночи.

Гистология и иммуногистохимия (1НС) ткани головного мозга человека и свиньи

Иммуногистохимию проводили на залитый в парафин тканях, как ранее описано (ПАп^еа е! а1., 2001; №де1е е! а1., 2002). Вкратце, после удаления парафина с помощью ксилола и восстановления влагосодержания благодаря ступенчато изменяющемуся ряду увеличивающихся концентраций этанола антигенность белков усиливали с помощью помещения срезов в целевом буфере (Эако, Сагреп!ипа, СА) в микроволновую печь на 2 мин. Альтернативно, замороженные срезы обрабатывали в течение 2 мин ацетоном и снова сушили на воздухе. После инкубации в течение 30 мин в 0,3 Н₂О₂ срезы обрабатывали в течение 30 мин нормальной сывороткой для блокирования и затем инкубировали с первыми антителами в соответствующих разведениях в течение 1 ч при комнатной температуре. После тщательной промывки в РВ8 использовали второе, меченное биотином антитело в течение 30 мин. Иммунологические реакции обрабатывали комплексом авидин-меченный пероксидазой биотин (АВС, Уес!ог ЬаЬк, Рок!ег Сйу, СА) и визуализировали с помощью обработки срезов 3-3-диаминобензидина тетрагидрохлоридом (ПАВ)/Н₂О₂(Вютейа, Рок!ег Ору, СА). Срезы подвергали легкому контрастирующему окрашиванию гематоксилином, восстановлению влагосодержания благодаря ступенчато изменяющемуся ряду увеличивающихся концентраций этанола, очищали в ксилоле и заключали в пермаунт. Контроли состояли из срезов головного мозга, обработанных или неиммунной сывороткой, подвергнутым предварительной абсорбции антителом, или в отсутствие первого антитела. Образцы исследовали и фотографировали с использованием микроскопа №коп РХА, и цифровые изображения записывали, используя цифровую камеру №коп ЭХМ1200Р, и обрабатывали, используя программное обеспечение для изображений Iтаде Рго Р1ик (РНаке 3 Ттадтд, О1еп МШк, РА).

Последовательные гистологические срезы из лобной области коры головного мозга окрашивали следующим образом: гематоксилин и эозин (Н&Е) для выявления сосудистой системы и кровоизлияния; ИС для выявления просачивания через ВВВ (иммуноглобулина свиньи в качестве индикатора просачивания сосудов и проницаемости ВВВ), активации астроцитов (глиального фибриллярного кислого белка) и морфологического вида и структурной целостности нейронов (ассоциированного с микротрубочками белка-2), амилоидной бляшки (Абета-42).

Пример 1.

Ингибирование активности Ьр-РЬА₂ предотвращает сосудистую деменцию и болезнь Альцгеймера. Индуцированное ϋΜ/НС кровоизлияние в головной мозг и нарушение гематоэнцефалического барьера (ВВВ)

Основной функцией ВВВ является поддержание в силе точного контроля над веществами, которые проникают в головной мозг или покидают его, для того чтобы окружающая среда, в которой функционируют нейроны, оставалась гомеостатической. При нарушении ВВВ компоненты крови, проникновение которых обычно запрещено, могли бы проникать в ткань головного мозга, создавать помехи в функционировании нейронов, инициировать иммунный ответ и вызывать воспаление мозга, все из которых вносят вклад в сосудистую деменцию и развитие болезни Альцгеймера. Как продемонстрировано на фиг. 1, в противоположность контрольному сосуду (слева) в головном мозге свиньи с ЭМ/НС отмечались кровоизлияние (верхняя панель справа, Н&Е 200х) и просачивание через ВВВ (нижняя панель справа, ИС для иммуноглобулина свиньи 100х). Черные стрелки указывают на клетки воспаления вне кровеносного сосуда (сверху) и вокругсосудистые затемнения-утечки (нижняя панель справа, ВУ: кровеносный сосуд). Кроме того, наблюдается увеличение адгезии клеток воспаления к поверхности эндотелиальных клеток (белая стрелка, верхняя панель справа). ИС использовали для (ί) выявления просачиваний сосудов, являющихся следствием нарушенного ВВВ, и (ίί) прослеживания судьбы просочившегося материала в ткани головного мозга. Подобно тому, что наблюдается в головном мозге человека с болезнью Альцгеймера (АО), просочившиеся иммуноглобулины (¾) связываются с нейронами и вызывают разрушение дендритного дерева, что демонстрируется отходом назад и скручиванием основных дендритных отростков (т.е. спиралеобразным дендритным видом (фиг. 2).

В течение периода исследования наблюдали, что животные, которым вводили ингибитор Ьр-РЬА₂, больше реагировали на внешние стимулы, демонстрировали увеличенную активность в клетке и имели тенденцию к более активной реакции на кормление и манипулирование по сравнению с контрольными животными, не подвергшимися лечению. Также, несмотря на схожие уровни глюкозы и холестерина в сыворотке, животные, подвергшиеся лечению ингибитором Ьр-РЬА₂, демонстрировали увеличение веса по сравнению с контрольными животными (62,5 кг в сравнении с 50,9 кг для контрольных животных) с веса в исходном состоянии, составляющего 26,9 кг и 30,3 кг соответственно. Вес животных, которым вводили ингибитор Ьр-РЬА₂, является прямым отражением их общего благополучия, поскольку более

- 76 025527 больные животные (т.е. контрольные, не подвергшиеся лечению животные) не едят. Наблюдали, что ингибирование воспаления ингибитором Ьр-РЬА₂ приводит к большему благополучию и здоровью при установлении системного воспаления.

Пример 2.

Животные с ОМ/НС демонстрировали патологию болезни Альцгеймера на ранней стадии.

Было установлено, что активация астроцитов и внутриклеточная аккумуляция Ав42 внутри нейронов являются ранними и ключевыми явлениями в патогенезе болезни Альцгеймера (АО), и они были полностью подтверждены доказательствами в головном мозге пациентов с АО. Как продемонстрировано на фиг. 3, уже через 7 месяцев после воздействия сосудистых факторов риска ОМ/НС индуцировали активацию астроцитов, на что указывает увеличенная экспрессия глиального фибриллярного кислого белка (СРАР). Астроциты, демонстрирующие сильное иммуноокрашивание на СРАР, наблюдались в непосредственной близости от нейронов, демонстрирующих аномальную морфологию. Кроме того, нейроны и гладкомышечные клетки (§МС) сосудов демонстрировали увеличенную иммунореактивность с антителами против Ав42 (фиг. 4). Стоит отметить, что астроциты демонстрировали отрицательную иммунореактивность с антителами против Ав42, показывая, что аккумуляция Ав42 происходит относительно избирательно в нейронах и §МС сосудов. Эти данные демонстрируют, что нейроны и §МС сосудов являются клетками, которые в наибольшей степени подвержены аккумуляции Ав42, что сопоставимо с тем, что наблюдается в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера на ранней стадии. Важно отметить, что Ав42-положительные нейроны также проявляют свойства больных нейронов, при этом некоторые из них демонстрируют спиралеобразные дендритные отростки, индикатор того, что дендритное дерево нейронов находится в процессе разрушения (фиг. 5). В противоположность Ав42(+)-нейронам, Ав42-отрицательные нейроны выглядели здоровыми.

Пример 3.

Ингибирование активности Ьр-РЬА₂ уменьшало ОМ/НС-индуцированное просачивание через ВВВ

Как продемонстрировано на фиг. 5, ОМ/НС индуцировали обширное просачивание через ВВВ у всех 6 животных, в то время как животные, подвергшиеся лечению ингибитором Ьр-РЬА₂, продемонстрировали незначительное просачивание через ВВВ. Коричневое окрашивание указывает на то, что компоненты крови (в этом случае !д) просочились из мелких артерий в окружающую ткань головного мозга, и на экстенсивное связывание Ц с нейронами. В противоположность, у подвергшихся лечению животных нет просачивания Ц из кровеносных сосудов, нет связывания Ц с нейронами и нет разрушения дендритов (фиг. 5 и фиг. 6).

Пример 4.

Ингибирование активности Ьр-РЬА₂ предотвращало ОМ/НС-индуцированную аккумуляцию Абета42 в нейронах и минимизировало цереброваскулярный амилоидоз.

Животные с ОМ/НС продемонстрировали непостоянную степень аккумуляции Абета в нейронах, а также повреждение нейронов (фиг. 7, левая панель), в то время как животные, подвергшиеся лечению ингибитором Ьр-РЬА₂ (фиг. 7, правая панель), не продемонстрировали иммунореактивность с антителами против Абета-42 в нейронах. Кроме того, больные нейроны редко наблюдались у подвергшихся лечению животных по сравнению с животными, не подвергшимися лечению. Равно, ингибитор Ьр-РЬА₂ также предотвращал аккумуляцию Абета42 в §МС сосудов и, тем самым, минимизировал цереброваскулярный амилоидоз (фиг. 8).

В заключение, ингибирование Ьр-РЬА₂ предотвращает индуцированное метаболическими факторами риска нарушение ВВВ, связывание Ц с нейронами и аккумуляцию Абета42 в нейронах. Ингибирование Ьр-РЬА₂ также уменьшало активацию глиальных клеток (например, активацию астроцитов) и минимизировало отложение Абета42 в кровеносных сосудах головного мозга (т.е. цереброваскулярный амилоидоз).

Ссылки

Ссылки, приведенные здесь и во всех разделах данной заявки, включены сюда посредством ссылки.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения и/или предупреждения нейродегенеративного нарушения или заболевания у субъекта, включающий идентификацию субъекта, страдающего или подверженного риску развития нейродегенеративного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из сосудистой деменции, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона, и введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль

- 77 025527 где

К^а и К^Ь вместе с атомами углерода пиримидинового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное 5-членное карбоциклическое кольцо;

К² представляет собой фенил, замещенный одним-тремя атомами фтора;

К³ представляет собой метил или С(1_₃)алкил, замещенный Ν^^; или

К³ представляет собой Не!-С(₀.₂)алкил, в котором Не! представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, имеющее Ν, и в котором Ν не замещен или замещен С(1_₆)алкилом;

К⁴ и К⁵ вместе образуют составляющую 4-(4-трифторметилфенил)фенил;

К⁸ и К⁹, которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают из группы, состоящей из водорода и С(1_₆)алкила;

X представляет собой 8.
2. Способ по п.1, в котором субъектом является млекопитающее.
3. Способ по п.1, в котором соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой

1-(М-(2-диэтиламино)этил)-М-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он (8В480848) или его соль.
4. Способ по п.1, дополнительно включающий оценку когнитивной функции указанного субъекта после введения фармацевтической композиции, содержащей агенты, ингибирующие Ьр-РЬА₂.
5. Способ по п.1, дополнительно включающий мониторинг лечения путем оценки мозгового кровотока или функционирования гематоэнцефалического барьера.
6. Способ по п.1, дополнительно включающий введение субъекту дополнительных терапевтических средств.
7. Способ по п.6, в котором дополнительными терапевтическими средствами являются донепезил, такрин, ривастигмин, галантамин, противоамилоидная вакцина, понижающие Абета терапии, умственное упражнение или стимуляция.
8. Способ по п.1 или 2, в котором субъектом является человек.
9. Способ по п.1, в котором нейродегенеративное заболевание или нарушение представляет собой сосудистую деменцию.
10. Способ по п.1, в котором нейродегенеративное заболевание или нарушение представляет собой болезнь Паркинсона.
11. Способ по п.1, в котором нейродегенеративное заболевание или нарушение представляет собой болезнь Хантингтона.
12. Применение фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) по п.1 или его фармацевтически приемлемую соль, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения нейродегенеративного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из сосудистой деменции, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона.