EA025113B1 - Ингибирование стрелкования и цветения растений сахарной свеклы - Google Patents
Ингибирование стрелкования и цветения растений сахарной свеклы Download PDFInfo
- Publication number
- EA025113B1 EA025113B1 EA201200468A EA201200468A EA025113B1 EA 025113 B1 EA025113 B1 EA 025113B1 EA 201200468 A EA201200468 A EA 201200468A EA 201200468 A EA201200468 A EA 201200468A EA 025113 B1 EA025113 B1 EA 025113B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- sequence
- nucleic acid
- sugar beet
- flowering
- zeg
- Prior art date
Links
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 title claims abstract description 71
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 title claims abstract description 48
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 60
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 claims abstract description 46
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 37
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 14
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 13
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 11
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 11
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 6
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 235000021537 Beetroot Nutrition 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 3
- -1 such as PT Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- JKVBWACRUUUEAR-UHFFFAOYSA-N (4-chlorophenyl)sulfanyl-(2,4,5-trichlorophenyl)diazene Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1SN=NC1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl JKVBWACRUUUEAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MXQGCMQXTPTJJT-UHFFFAOYSA-N 1-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-3-ylmethyl)-3-hydroxythieno[3,2-d]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1OC2=CC=CC=C2OC1CN1C(=O)N(O)C(=O)C2=C1C=CS2 MXQGCMQXTPTJJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100055072 Agrocybe aegerita Agr1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000013479 Amaranthus retroflexus Nutrition 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000233287 Beta vulgaris ssp maritima Species 0.000 description 1
- 101100476202 Caenorhabditis elegans mog-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021538 Chard Nutrition 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005980 Gibberellic acid Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241001553014 Myrsine salicina Species 0.000 description 1
- 101150035047 NKP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241001415849 Strigiformes Species 0.000 description 1
- 101150104157 YES1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000003967 crop rotation Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 101150044395 dda1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 101150035458 lnt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 101150108007 prs gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 101150018813 ssa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 244000045561 useful plants Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
- C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
Abstract
Данное изобретение раскрывает средство ингибирования стрелкования и цветения растения сахарной свеклы, к примеру, изолированную нуклеиновую кислоту с последовательностью или фрагментом последовательности SEQ ID NO: 1-3, которую можно применить для производства сахарной свеклы, в которой ингибировано стрелкование и цветение после яровизации.
Description
Данное изобретение раскрывает изолированную нуклеиновую кислоту для ингибирования стрелкования и цветения растения сахарной свеклы, а также ее применение, белок, способ получения трансгенного растения сахарной свеклы, в котором ингибируют стрелкование и цветение после яровизации, векторы или мобильные генетические элементы, а также трансгенную сахарную свеклу, в которой ингибируют стрелкование и цветение после яровизации, и семена, и части растения.
Посредством молекулярно-биологических методов возможно генетическое изменение полезных растений для того, чтобы изменить и улучшить их свойства. Важное свойство для выращивания и использования двухлетних растений, таких как сахарная свекла (Ве1а пОдачк), состоит в том, что их стрелкование и последующее цветение требует индукции в течение более длительного времени холодов, которое регулярно встречается зимой в зонах умеренного климата. Этот переход вегетативной фазы в генеративную, вызванный низкими температурами в течение продолжительного периода, называется яровизацией.
Существуют разные метаболические пути, которыми регулируют цветение. К ним относятся, кроме всего прочего, метаболический путь светового периода суток, автономный, обусловленный гиббереллиновой кислотой и яровизацией метаболический путь. В последние годы было идентифицировано большое количество генов, которые участвуют в регулировании цветения. Особенно подробно был изучен контроль времени цветения на примере модельного организма арабидопсис (Вокк, Р.К., Вак!оте, К.М., Му1пе, 18., ииб Оеаи, С. (2004), Ми1бр1е раШтаук ίη 1Пе бесйюи ίο Ло\\ег: ЕиаЫшд, рготоОид, апб геке1Ппд, Р1ап1 Се11 16 8ирр1: 18-31; Не, Υ. ииб Атакшо, КМ. (2005), Ко1е о! сОготаОи тоббгсаОои ίη Ло\\егшд-Оте соШгок Тгепбк Р1ап1 8е1 10, 30-35; Ваиг1е, I. ииб Эеап, С. (2006), Т0е Липид о! беуе1ортеп1а1 ОаиыОопк 1и р1айк, Се11 125(4): 655-664). Прежде всего, посредством исследования мутантных форм арабидопсиса были идентифицированы многочисленные гены раннего цветения (ЕаЛуЛо\уеппд) или гены позднего перехода к цветению ('Ъа1е-Ло\уеппд) (Са//аш 8., Оеибай, А.К, Ь1к!ег, С., ииб Эеап, С. (2003), Аиа1у818 о! 1Пе то1еси1аг Ьак1к о! Ло\уеппд Оте УапаОои ш АгаЫборОк ассеккюик, Р1ап1 РЬукюЕ 132: 1107-1114; Оега1бо, Ν., Ваиг1е, I., К1бои, 8., Ни, X., ииб Эеаи, С. (2009), РК.ЮГОА Эе1аук Р1о\уеппд ш АгаЫбор818 У1а а СоОаиксОрОоиа1 МесОаткт 1иуо1ушд ЭОес1 1п1егасРоп \\Ο1ι Ше Шс1еаг Сар-Втбшд Сотр1ех, Р1ап1 РОукю1оду, ШИ 1, 2009; 150(3): 1611-1618; МюОаек, 8.Ό., Атакшо, КМ. (2001), Ьокк о! ΡΈΟ^ΕΚΙΝΟ ЬОСИ8 С асОуНу еПиипаЮк Ше 1а1е-Ло\уеппд рНепоЕре о! ЕКЮГОА аиб аШопотоик раШ\уау тШаОопк Ьи1 ио! гекроикКеиекк Ю уешаИ/аЛот Р1ап1 Се11 13: 935-942).
В сахарной свекле был подробно охарактеризован до сих пор только ген ВуЕЬС. При этом было выявлено, что этот ген не является ключевым контролирующим геном для цветения, соответственно яровизации сахарной свеклы (Кееуек, Р.А., Не, Υ., 8с0т07, КЕ, Атакшо, К.М., Раие11а, Ь.^., РгсОагбк, С.М. (2007), Еуо1и0оиагу сопкегуаОоп о! Юе ЕЬО^ЕКШО ЬОСи8 С-теб1а1еб уегпаП/аРоп гекроике: еу1беисе !гот Юе кидаг Ьее1 (Ве1а уи1даОк), ОеиеОск 176(1): 295-307; СЫа, Т. Υ. Р., Ми11ег, А., Лтд, С, ииб МЫака-ОбЛдеик, Е.8. (2008), 8идаг Ьее1 сопРипк а 1агде СОЖТАЖ-ЫКЕ деие !атбу тс1ибтд а СО 0ото1одие ΟιηΙ 18 шбереибей о! Ше еаг1уЬо10ид (В) деие 1осик, ί. Ехр. Во!. 59(10): 2735-2748).
Стрелкование и цветение растений сахарной свеклы нежелательны, так как пригодными для использования являются не семена, соответственно плоды, а подземные части растений, корнеплоды, запасные вещества которых израсходуются во время прорастания в семена и цветения растения. Кроме того, у отдельных растений, которые называют цветушная свекла или цветуха, встречается нежелательное стрелкование или цветуха уже в первый год посева, что очень невыгодно для урожая и переработки.
Поэтому задачей данного изобретения является создание средств, которые позволяют ингибировать стрелкование и/или цветение сахарной свеклы и даже полностью препятствовать этому.
Согласно изобретению поставленная задача решается посредством изолированной нуклеиновой кислоты, причем нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, которая:
a) имеет последовательность или фрагмент последовательность 8ЕО ГО NΟ: 1-3, или
b) является дополнительной к последовательности или фрагменту последовательности 8ЕО ГО NΟ: 1-3, или
c) имеет последовательность или фрагмент последовательность 8ЕО ГО NΟ: 1-3 или дополнительную к этому последовательность в антисмысловом направлении, или
б) является гомологичной последовательности или фрагменту последовательности 8ЕО ГО NΟ: 1-3, или
ί) идентична последовательности или фрагменту последовательности 8ЕО ГО NΟ: 1-3 на по меньшей мере 80%, или
!) кодирует белок или часть белка с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО NΟ: 4, или д) кодирует белок с аминокислотной последовательностью из Ве1а уи1даОк, которая гомологична последовательности 8ЕО ГО NΟ: 4 или фрагменту последовательности 8ЕО ГО NΟ: 4, или
0) гибридизирует с последовательностью или фрагментом последовательностью в соответствии с 8ЕО ГО NΟ: 1-3 или дополнительной к этому нуклеотидной последовательностью или ориентированной для этого в антисмысловом направлении нуклеотидной последовательностью при строгих условиях.
Заявленная нуклеиновая кислота может применяться для того, чтобы, к примеру, посредством вве- 1 025113 дения РНК-интерференции (ΡΝΑί) или мРНК (Иге, А., Хи, 8., Мойдотегу, М., Ко81а8, 8., ΩγΕόγ. 8., Ме11о, С. (1998). Ро1еп1 аиб зресШс деиебс иНегГегепсе Ьу боиЫе-81гаибеб ΡΝΑ ίη СаепогЬаЬбЙ8 е1едаи8, Ыа1иге 391 (6669): 806-811) тормозить стрелкование и цветение сахарной свеклы, прежде всего, по возможности, препятствовать полностью стрелкованию и цветению, к примеру, ингибировать гены, которые кодируют индукторы цветения, как РТ, РНЬ, Со или νΐΝ3.
Заявленная нуклеиновая кислота отличается тем, что, используя ее, можно получить трансгенные растения, в частности сахарную свеклу, с особыми свойствами: предпочтительно, к примеру, ее применение для следующих целей, соответственно со следующими преимуществами:
производства нестрелкующейся, нецветущей сахарной свеклы:
производства сахарной свеклы как зимней свеклы, производства сахарной свеклы как весенней свеклы, повышения биомассы сахарной свеклы:
повышения выхода сахара;
предотвращения образования стрелок в сахарной свекле: продления сезона выращивания сахарной свеклы: предотвращения потерь запасных веществ в сахарной свекле: использования повышенной влажности осенью, покрытия земли и использования хранившегося азота: защиты полезных насекомых на поле.
Сахарная свекла является двухлетним растением. После зимовки и проведенной при этом яровизации сахарная свекла обычно зацветает на второй год. Посредством заявленной нуклеиновой кислоты, к примеру, применяемой в введении РНК-интерференции (ΡΝΑί) или мРНК последовательности по 8ЕО ГО N0: 5-7 или другой заявленной последовательности, или фрагмента, могут быть ингибированы гены и соответственно полностью предотвращено действие яровизации. Механизмы и методы ингибирования, соответственно выключения генов известны специалисту, к примеру, как сайленсинг генов, и могут включать уже упомянутые и известные специалисту ΡΝΑί или микро(м)РНК-методы, но этим не ограничены. В ΡΝΑί-вставке могут быть внесены последовательности 8Е0 ГО N0: 5-7 посредством известных специалисту молекулярно-биологических техник в антисмысловом направлении под контролем подходящего промотора в клетку сахарной свеклы и там экспрессированы.
Использование данного изобретения позволяет полностью препятствовать стрелкованию свеклы и ее цветению. Семенной материал свеклы вследствие этого можно высеять раньше, что в конечном итоге приводит к удлинению вегетационного периода и вместе с этим к повышению биомассы, соответственно к повышенному выходу сахара. В комбинации с устойчивостью к холоду свеклу можно, к примеру, выращивать также так озимую свеклу. При посеве сахарной свеклы в августе можно убирать урожай свеклы последующей весной уже как весенней свеклы. Это предоставляет возможность сельскому хозяйству дополнительного севооборота. В результате применения заявленной нуклеиновой кислоты длительные наступления холодов после посева на поле не приводят больше к усиленному образованию стрелок. Также наблюдаемое без длительных наступлений холодов при прежней сахарной свекле образование стрелок может быть предотвращено или, по меньшей мере, значительно сокращено. С помощью данного изобретения можно не только способствовать ингибированию, соответственно предотвращению стрелкования и цветения сахарной свеклы после первой яровизации, т.е. на втором году, но и можно подвергать сахарную свеклу также последующим холодным периодам без наблюдения действия яровизации.
Выращивание сахарной свеклы происходит обычно с апреля по октябрь/ноябрь. Так как не вся убранная сахарная свекла может быть переработана к одному и тому же времени, то ее необходимо временно хранить. Во время хранения, к примеру, в буртах возникают большие потери накопленных веществ (потери сахарозы) в результате расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу. В результате применения нуклеиновой кислоты, в частности при ее применении в ΡΝΑί-вставке, можно изменить сроки посева и сбора урожая таким образом, что можно продлить время уборки урожая без потерь урожая. Тем самым можно переработать больше сахарной свеклы во время более длительного периода времени без или с незначительной потерей запасных веществ.
Под термином сахарная свекла или растение сахарной свеклы понимают растение вида Вей νιι^ιπ8. к примеру Ве1а уи1даг18 88р. уи1даг18 уаг аШ88ипа (сахарная свекла в узком смысле), Ве1а уи1даг18 88р. МагШта (свёкла приморская или дикая), Ве1а уиг1даг18 88р. уи1даг18 уаг уи1даг18 (кормовая свекла мангольд), Ве1а уи1даг18 88р. уи1даг18 уаг сопбШуа (красная (столовая) свекла/свекла), Ве1а уи1даг18 88р. сга88а уи1даг18 уаг/а1Ьа (кормовая свекла).
Под изолированной нуклеиновой кислотой понимают выделенную из естественной, соответственно первоначальной среды нуклеиновую кислоту. Термин включает также синтетически полученную нуклеиновую кислоту.
Под ингибированием стрелкования и цветения растения сахарной свеклы понимают уменьшение количества стрелкующихся и соответственно цветущих растений сахарной свеклы по сравнению с неизмененными согласно изобретению растениями сахарной свеклы в сравниваемой фазе развития, в частности на втором году после завершения холодного периода, т.е. после яровизации. В частности, термин уменьшение количества сахарозы включает уменьшение на не более чем 80%, предпочтительно не более
- 2 025113 как 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10%, особенно предпочтительно не более как 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 или 0.1% количества стрелок неизмененных, согласно изобретению, контрольных растений. Контрольными растениями являются предпочтительно растения такого сорта, которые, однако, не изменены согласно данному изобретению, и имеют, к примеру, количество стрелок от максимум 0,01%. Под термином предотвращение или полностью предотвратить стрелкование и цветение понимают ингибирование по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 99,5%, особенно предпочтительно по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9%, это означает уменьшение количества стрелок на не более как 1%, не более как 0,5%, не более как 0,2% или не более как 0,1%, в частности на втором году после яровизации, по сравнению с неизмененным согласно изобретению растением сахарной свеклы, которое имеет, к примеру, количество стрелок от максимум 0,01%. Термин ингибирование, соответственно предотвращение стрелкования и цветения включает, прежде всего, ингибирование/предотвращение стрелкования, независимо от того, приводит ли это к цветению растения, или нет.
Термин трансгенный означает здесь генетически модифицированный. Применяемый термин включает также случай, когда видеоспецифичная нуклеиновая кислота в форме, расположении или количестве введена в клетки, в которых нуклеиновая кислота не встречается естественно в клетке.
Термин гомология относится к соответствию или сходству (подобию) в нуклеотидной последовательности двух молекул нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности двух белков, соответственно пептидов. Может быть установлено наличие гомологии между нуклеиновыми кислотами, соответственно белками, в то время как соответственно сравнивают и устанавливают положение в последовательности с соответствующим положением в другой последовательности, имеется ли здесь идентичные или сходные остатки. Две сравниваемые друг с другом последовательности гомологичны, когда представлено определенное минимальное количество идентичных или подобных нуклеотидов. Идентичный означает, что при сравнении двух последовательностей в эквивалентных участках имеются соответственно тот же нуклеотид, соответственно та же аминокислота. При этом необходимо при случае учесть разрывы последовательности, чтобы установить по возможности хорошее выравнивание сравниваемых последовательностей. Аналогичные нуклеотиды/аминокислоты не являются при этом идентичными нуклеотидами/аминокислотами с подобными или эквивалентными физико-химическими свойствами. При обмене одного нуклеотида (одной аминокислоты) на другой нуклеотид (другую аминокислоту) с подобными или эквивалентными физико-химическими свойствами речь идет о консервативном обмене. Примерами физико-химических свойств аминокислоты являются, к примеру, гидрофобность или заряд. В связи с нуклеиновыми кислотами речь идет о подобном нуклеотиде, соответственно консервативном обмене, когда в кодирующей последовательности заменяют один нуклеотид в кодоне другим, причем на основании дегенерации генетического кода та же аминокислота или подобная аминокислота как в сравниваемой последовательности кодируется кодоном относительно обмена. Специалисту известно, какой нуклеотидный, соответственно аминокислотный обмен, является консервативным обменом. Для определения степени подобия, соответственно идентичности между двумя нуклеиновыми кислотами исходят при этом предпочтительно из минимальной длины в 60 нуклеотидов, соответственно базовых пар, предпочтительно минимальной длины в 70, 80, 90, 100, 110, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350 или 400 нуклеотидов, соответственно базовых пар, особенно предпочтительно всей длины сравниваемой нуклеиновой кислоты, что касается белков/пептидов, исходят из минимальной длины в 50 аминокислот, предпочтительно минимальной длины в 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот, и особенно предпочтительно всей длины сравниваемой аминокислотной последовательности. Степень сходства (ροδίΐίνβδ) или идентичность двух последовательностей можно, к примеру, установить с помощью компьютерной программы ВЬА8Т (8.Р. А118сйи1 с1 а1. (1990), Ва8Ю Ьоса1 ЛПдптсШ 8еатсй 1оо1. ТМо1. Вю1. 215: 403-410; 8.Ζ.Β. 1Шр://\у\у\у.псЬгп1т.1п1тдо\'/ВРА8Т/). применяя стандартные параметры. Определение гомологии зависит от длины сравниваемых последовательностей. Для целей данного изобретения исходят из гомологии между двумя последовательностями нуклеиновой кислоты, самая короткая из которых включает по меньшей мере 100 нуклеотидов, когда по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% нуклеотидов идентичны и/или подобны (ШепЛЛе8 или ро8ЙАе8 по ВЬА8Т), предпочтительно подобны. При длине последовательности в 50-99 нуклеотидов исходят, что касается идентичности или, по меньшей мере, сходства из по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85, 86, 87, 88 или 89%, при длине последовательности в 15-49 нуклеотидов при идентичности или сходству из по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% гомологии между последовательностями. Что касается белков, исходя из гомологии, когда, применяя компьютерную программу ВЬА8Т, используя стандартные параметры и ВЬО8иМ62-подстановочную матрицу (НешкоГР 8., ипЛ НешкоГГ, 1., Атто асШ 8иЬ8Й1иЛоп тайтсе8 Ггот рго!еш Ыоск8. Ргос. ЫаИ. АсаЛ. 8ек II- 8А. 89: 10915-10919, 1992), получают идентичность ( 1ЛепШ1е8) и/или сходство (ро8ЙКе8), предпочтительно идентичность в по меньшей мере 25%, по меньшей мере 26%, по меньшей мере 27%, по меньшей мере 28%, по меньшей мере 29%, по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по
- 3 025113 меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, причем учитывают предпочтительно всю длину белка/пептида, который сравнивают с другим белком, к примеру, длину 653 аминокислот в случае 8ЕЦ ГО N0: 4. Специалисту очевидно без затруднений на основании специальных знаний, какая из доступных ВЬА8Т-программ (к примеру, ВЬА8Тп, ВЬА8Тр, ВЬА8Тх, 1ВЬА8Тп или 1ВЬА8Тх) рассматривается для определения гомологии. Кроме того, существуют другие программы, которые знает специалист, и которые он может в случае необходимости использовать для анализа гомологии двух или нескольких сравниваемых последовательностей или фрагментов последовательности. Такие программы доступны, к примеру, на интернет-страницах Европейского института биоинформации (ЕМВЬ) (см., к примеру, Ьйр://№№№.еЫ.ас.ик/Тоо15/51т11агИу.Ыт1).
Под гибридизировать или гибридизация понимают процесс, при котором присоединяют молекулу однонитчатой нуклеиновой кислоты к комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, т.е. этому соответствует спаривание оснований. Стандартные способы гибридизации описаны, к примеру, в 8атЬгоок е1 а1. (Мо1еси1аг С1ошпд. А 1аЬота1оту тапиа1, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота1огу Рте§5, 3. Аий. 2001). Предпочтительно под этим понимают, что по меньшей мере 50%, далее предпочтительно по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80 или 85%, особенно предпочтительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% оснований цепи нуклеиновой кислоты соответствуют спариванию оснований с комплементарной цепью нуклеиновой кислоты. Возможность такого присоединения зависит от строгости выполнения условий гибридизации. Термин строгость относится к условиям гибридизации. Высокая строгость указывается тогда, когда спаривание оснований затруднено, а низкая строгость, когда спаривание оснований облегчено. Строгость условий гибридизации зависит, к примеру, от концентрации соли, соответственно ионной силы и температуры. В основном строгость может быть повышена повышением и/или понижением содержания соли. Под строгими условиями гибридизации понимают такие условия, при которых происходит гибридизация преимущественно только между гомологичными молекулами нуклеиновой кислоты. Термин условия гибридизации относится при этом не только к преобладающим при настоящем присоединении нуклеиновых кислот условиям, но и к преобладающим при последующих этапах промывания условиям. Строгими условиями гибридизации являются, к примеру, условия, при которых гибридизируют преимущественно только такие молекулы нуклеиновой кислоты, которые имеют по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичности последовательности. Менее строгими условиями гибридизации являются, к примеру гибридизация в 4/88С при 37°С и последующее многократное промывание в 1 /88С при комнатной температуре. Строгими условиями гибридизации являются, к примеру: гибридизация в 4/88С при 65°С и последующее многократное промывание в 0,1/88С при 65°С в течение приблизительно 1 ч.
Термин комплементарный относится к способности пурин- и пиримидиннуклеотидов создавать через образования водородных мостиков базовые пары друг с другом. Комплементрарными базовыми парами являются, к примеру, гуанин и цитозин, аденин и тимин, а также аденин и урацил. Комплементарной нитью нуклеиновой кислоты является в соответствие с этим нить нуклеиновой кислоты, которая может образовывать в результате спаривания с комплементарными основаниями другой нити нуклеиновой кислоты двойную нить.
Под фрагментом или частичной последовательностью нуклеиновой кислоты понимают здесь связанный соседний фрагмент нуклеиновой кислоты, т.е. фрагмент последовательности из следующих друг за другом нуклеотидов нуклеиновой кислоты. Фрагменты могут предпочтительно применяться, к примеру, в КПАС или мРНК-вставке, причем последовательность может применяться при этом, к примеру, в антисмысловом (апйкепке) направлении. Антисмысловое направление, соответственно антисмысловая ориентация нуклеиновой кислоты, например, ДНК-последовательности, означает здесь, на пример, что транскрипция ДНК-последовательности приводит к мРНК, нуклеотидная последовательность которой является комплементарной к естественной (эндогенной) мРНК, таким образом их трансляция замедляется или предотвращается в результате присоединения комплементарной РНК. Под антисмысловой РНК, соответственно апйкепке РНК понимают РНК, комплементарную специфической мРНК или другой специфической РНК. Антисмысловое направление или антисмысловая ориентация мРНК-последовательности означает поэтому, что мРНК имеет последовательность, которая является комплементарной мРНК-последовательности, трансляции которой можно таким образом препятствовать или предотвратить в результате присоединения. Частичными последовательностями, которые могут применяться предпочтительно в рамках данного изобретения, к примеру, в антисмысловой ориентации, являются, к примеру, нуклеиновые кислоты с последовательностью согласно 8ЕЦ ГО N0: 5, 6 или 7. Что касается этих частичных последовательностей, имеются в виду фрагменты заявленной нуклеиновой кислоты согласно 8ЕЦ ГО N0: 3. Но можно также применять любые другие нуклеиновые кислоты с последовательностями или фрагментами последовательностями 8ЕЦ ГО N0: 1-3, например, в антисмысловом направлении.
Предпочтительно фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере
- 4 025113
15, предпочтительно по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или по меньшей мере 100 следующих один за другим нуклеотидов, далее предпочтительно по меньшей мере 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 следующих один за другим нуклеотидов. Часть белка (см., к примеру, буква 1) верху) включает предпочтительно по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 40 или 50, особенно предпочтительно по меньшей мере 60, 70, 80, 90 или по меньшей мере 100 следующих одна за другой аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 4. Фрагмент последовательности 8ЕЦ ГО N0: 4 (см., к примеру, букву д) вверху) включает предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80 или 90, далее предпочтительно по меньшей мере 100, 120, 150, 200 или 250 следующих один за другим аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 4. Требуемую длину частичной последовательности нуклеиновой кислоты или белка или фрагмента последовательности специалист смог бы установить при помощи общего профессионального мастерства и соответственно при проведении рутинных опытов посредством выбранной вставки и задуманного эффекта, не прикладывая к тому же изобретательской деятельности.
Заявленная нуклеиновая кислота идентична последовательности или частичной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1-3 предпочтительно на по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 или 99.9%.
В другом аспекте изобретения раскрыто применение одной или нескольких из заявленных нуклеиновых кислот для ингибирования стрелкования и цветения растения сахарной свеклы. Как уже выше указано, заявленная нуклеиновая кислота может быть введена, к примеру, в антисмысловой ориентации в растение сахарной свеклы, чтобы способствовать вследствие этого ингибированию ответственных за индукцию стрелкования и цветения генов. Способы, предназначенные для введения заявленной нуклеиновой кислоты в клетку сахарной свеклы, в общем, известны специалисту, и включают, к примеру, передающую агробактерии трансформацию. Введение нуклеиновой кислоты в антисмысловой ориентации в растение представляет собой, однако, только один из известных специалисту способов для торможения или угнетения генной активности. Заявленные нуклеиновые кислоты предпочтительно применяют также в рамках других способов или механизмов, которые могут способствовать торможению, соответственно угнетению стрелкования/цветения.
Кроме того, возможно применение заявленных нуклеиновых кислот также как зондов для определения других факторов, генов, соответственно генных продуктов, с помощью которых возможно торможение и/или подавление цветения и стрелкования растений сахарной свеклы.
В другом аспекте данного изобретения раскрыт белок с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 4 или белок с аминокислотной последовательностью, которая включает фрагмент последовательности 8ЕЦ ГО N0: 4, предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80 или 90, предпочтительно по меньшей мере 100, 120, 150, 200 или по меньшей мере 250 следующих друг за другом аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 4, или гомологичный белку с аминокислотной последовательностью или фрагментом последовательности 8ЕЦ ГО N0: 4 белок из Вс1а уи1дат18. Возможно применение белка или его любой части и соответствующих аминокислотных последовательностей в качестве зондов в аминокислотной последовательности для определения других факторов, генов, соответственно генных продуктов, с помощью которых возможно торможение и/или подавление цветения и стрелкования растений сахарной свеклы.
В еще другом аспекте данного изобретения раскрыт также способ производства трансгенного растения сахарной свеклы, включающий этапы (а) трансформации клетки сахарной свеклы одной или несколькими заявленными нуклеиновыми кислотами и (Ь) выращивания растения сахарной свеклы из трансформированной клетки сахарной свеклы. Трансформация клетки сахарной свеклы может быть осуществлена, к примеру, с помощью известных векторов, к примеру, Τί-плазмиды, и, как правило, известно специалисту. Заявленные нуклеиновые кислоты можно контролировать в таком векторе предпочтительно подходящим промотором.
Изобретение раскрывает также вектор или мобильный генетический элемент, который включает одну или несколько заявленных нуклеиновых кислот. Векторы и мобильные генетические элементы известны специалисту и включают, к примеру, такие плазмиды, как Τί-плазмиду. Вектор, соответственно мобильный генетический элемент, может содержать предпочтительно контролирующие элементы, к примеру, промотор.
Кроме того, изобретение раскрывает растение сахарной свеклы, которое включает одну или несколько заявленных нуклеиновых кислот, предпочтительно под контролем подходящего промотора, и в котором ингибировано стрелкование и цветение, а также семена и/или части заявленного растения сахарной свеклы, которые трансформированы одной или несколькими заявленными нуклеиновыми кислотами.
Изобретение разъясняется в дальнейшем при помощи примеров выполнения и приведенных чертежей с целью иллюстрации.
- 5 025113
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 изображено схематическое сравнение (ΒΕΑδΤ) соответствующего положения ΡΗΌ, ΡΝΙΙΙ и νΙΌ доменов в ВуУ1Ь, Л1У1Ь1 и ΑΐνΐΝ3. Также указан процент идентичных, соответственно сходных нуклеотидов (ίΗοηΙίΙίθ8/ρο8ίΙίνθ8„ в %). νΐΝ3_Α(1ι = ΑΐνΐΝ3. νΐΕ·1_Αΐ1ι = ΑΐνΐΕ-1. νΐΤ_Βν = ΒννίΤ.
На фиг. 2 изображена резистентная к прорастанию в семена и цветению сахарная свекла. Слева: резистентные к прорастанию в семена ΒννΐΕ-трансформанты АВ4-7(Ьа картинке слева) в сравнении с контрольным прорастанием в семена (на картинке справа); справа: ΒννΐΤ-трансформанты ΑΒ4-7, возрастнесколько месяцев.
Фиг. 3 - схематическое изображение структуры применяемых ΡΝΑί-кассет.
Фиг. 4-6 - схематическое изображение применяемых для создания ρΡΝΑί-вектора фрагментов 8а1δΜΑ-775> 1077 (фиг. 4), 8а1-8МА-779> 1197 (фиг. 5) и 8а1-8МА-971> 1466 (фиг. 6).
Фиг. 7-9 - схематическое изображение применяемых для создания ΡΝΑί-конструктов векторов ρΚΝΑί ϋννί1-775-> 10778а8 (фиг. 7), ρΚΝΑί ϋννί1-779-> 11978а8 (фиг. 8) и ρΡΝΑί ϋννί1-971-> 14668а8 (фиг. 9).
Фиг. 10-12 - схематическое изображение применяемых для передающей агробактерии трансформации бинарных Τί-плазмид ρΤΗΚΝΑί ϋννί1-775-1077838 (фиг. 10), ρΕΗΡ.ΝΑί-ϋννί1-779-11978;·ΐ8 (фиг. 11) аий ρ^ΗΚNΑ^-Ьνν^1_971-14468а8 (фиг. 12).
Фиг. 13 - схематическое изображение интрон-экзон-структуры геномной ДНК ΒννΐΤ, с указанием сайтов рестрикции.
Фиг. 14 структура ΒννΐΤ-сДНК-последовательности.
Примеры выполнения
Идентификация/изоляция полной комплементарной ДНК (сДНК) сахарной свеклы для предотвращения стрелкования и цветения.
В результате анализа специально созданной специальной ΕδΤ-базы данных сахарной свеклы идентифицировали 1499ϋρ длинную, неполную сДНК (δΕΟ ГО ΝΟ: 3). Исходя из этого неполного банка клонов ДНК, эта последовательность была дополнена. Полученная последовательность сДНК (δΕΟ ГО ΝΟ: 2) включает 1962ϋρ (2285ϋρ включая 3'ИТК). Полученный в результате белок включает 653 аминокислоты (δΕΟ ΐΌ ΝΟ: 4). Соответствующая геномная ДНК-последовательность (δΕΟ ГО ΝΟ: 1) включает 2366ϋρ.
Выравнивание геномной ДНК с сДНК показывает структуру всей ДНК, которая состоит из 4 экзонов и 3 интронов (фиг. 13). Схематическое изображение сДНК на фиг. 14.
Характеристика/аннотация последовательности.
Сравнение (ΒΕΑδΤ) полученных клонов полной длины, соответственно транслированная последовательность белка показывает только незначительное сходство с арабидопсис генами цветения (к примеру, ΑΐΆΚ- и ΑΐΥίΝ-семейство). Сюда относятся гены νΐΝ3 (ΥΚΝ7), νΐί1 (ΥΚΝ5), νΐΕ2 (АЕЬ1), νΐΕ3 (νΕΕ2) и νΐΕ4 (νΕΕ3). Наибольшее сходство по всей длине последовательности составляет к ΑΐνΚ·1 в 57.2% (см. табл. 1).
Таблица 1
Сравнение последовательности Βν-ΑΊΕ с кандидатами Απώίύορδίδ ШаЬаиа (Αΐ)-νΐΕ на плоскости ДНК. Сравнение осуществляется с Αΐ-νΐΝ3 по длине 2343 ϋρ, с Αΐ-νΐΕ1 по длине 2163 ϋρ, с Αΐ-νΐΕ2 по длине 2555, с Αΐ-ΥΐΕ3 по длине 1700 ϋρ и с Αΐ-ΥΐΕ4 по длине 251 ϋρ с помощью программы Α1ί§ηΧ (С1и81а1А)
| ΑΐνΐΝ3 | АМЫ | Α1ΥΊΙ_2 | А1У1ЬЗ | Αΐνΐί4 | |
| ВуУЕЬ | 40.0% | 57.2% | 51.5% | 49.8% | 45.9% |
Также сравнение последовательностей на плоскости белка с ΑΐΥΐΕ- и -νΐΝ-генным семейством сфокусировано как по всей последовательности, так и на разных доменах (для УТО- и νΐΝ-генного семейства характерны ΡΗΌ-, ΕΝΊΠ- и νΐΌ-домены), а области между доменами показывает также незначительная гомология (см. табл. 2).
- 6 025113
Таблица 2
Сравнение ВуУ1Ь-последовательности на плоскости белка с У1Ь-генами из ЛтаЫбор818 (сравнение со всеми последовательностями и отдельными генами). Άΐ = ЛгаЫбор818 ШаПапа. Βν = Вс1а уц1дат18, Апт= примечание, А8 = аминокислоты, 1беп1 = идентичный (Шепййек), рот = сходство (ροδίίίνθδ), Коп8.-Ь.
А8 = А8 консенсусная длина, дар8 = разрыв
| всего | Сравнение доменов | |||||||||||||||
| Рге-РНО | рни- Оопинпя | 1п1ег-РНО- ΡΝ3 | ΓΝ3 | 1п»сг-ГМЗУГО | УГО | |||||||||||
| нкп1. % | РОЗ» % | Сопя.- Ь.ЛЛ | ЛепЦ % | роз» % | |Лев(. ·/. | роз» % | Юео(. % | роз» % | Леп*. % | роз» % | 1ЛевЦ % | роз. % | Сов) | 1Леп(. % | роз. % | |
| А(У1И | 46.1 | 57.3 | 641 | 28.8 | 48.5 | 66.7 | 78.8 | 58.9 | 67.9 | 44.7 | 62.4 | 34.9 | 41.3 | 49.6 | 61.7 | |
| А1УЩ2 | 30.9 | 42.8 | 688 | 34.7 | 43.2 | 50.8 | 62.3 | 39.4 | 53.8 | 24.7 | 43.5 | 13 | 21.9 | 41.6 | 58.4 | |
| Αίνιυ | 23.4 | 33.6 | 692 | 16.4 | 25.9 | 55.2 | 65,7 | 36.3 | 46 | 20.7 | 42.5 | 3.6 | 8.3 | еарз | 44 | 55 |
| ΑΙΥ1Ν3 | 28.6 | 39.2 | 696 | 27.6 | 30.1 | 50 | 62.1 | 46.4 | 67.9 | 21.2 | 40 | 11.9 | 18 | 8ар5 | 40.2 | 54.9 |
Сравнение (ВЬА8Т) отдельных доменов показывает, что новая последовательность является У1Ьподобной последовательностью (фиг. 1). Последовательность (8ЕЦ ГО N0: 1) обозначена здесь поэтому, как ВуУТО (Ве1а уц1дат18 яровизация уш3-подобная).
Сравнение последовательности ВуУТО с А1У1Ь-кандидатами на всей плоскости ДНК показывает, однако, только максимальную гомологию в 57.2% с А1УТО1. Другими А1-генами УТО-семейства показано все еще незначительное сходство последовательности.
Анализ нетрансгенной сахарной свеклы на транскрипции ВуУТО показал до, во время и после яровизации, что ген не только после яровизации транскрибируется, но уже до, во время и после яровизации существенно активен. В противоположность этому, к примеру, УШ3 активируется в течение продолжительной яровизации.
Создание РХА|-констркуктов.
Для создания КПАБконстркуктов применяют три области в пределах 8ЕЦ ГО N0: 3: нуклеотиды 775-1077 (8ЕЦ ГО N0: 5); нуклеотиды 779-1197 (8ЕЦ ГО N0: 6); нуклеотиды 971-1446 (8ЕЦ ГО N0: 7).
Последовательность согласно 8ЕЦ ГО N0: 5 амплифицировали посредством ПЦР при помощи праймерных пар Р_РЬТ3 ~ 1:775И27, СТдддАТАСТТдддТдТТддАААААдС (81 ТО) ГО N0: 8) и РРЬТЗ ~ 1:1050Ь28, ТАдАААСАТТддСдАдССАТТСАТТАдС (81 ТО) ГО N0: 9).
Последовательность согласно 8ЕЦ ГО N0: 6 амплифицировали посредством ПЦР при помощи праймерных пар Р_РЬТ3 ~ 1:779И24, дАТАСТТдддТдТТддАААААдСА (81 ТО) ГО N0: 10) и Р_РЬТ3 ~ 1:1175Ь23, ААТСАдТСАТТддТдТддддАТА (81 ТО) ГО N0: 11).
Последовательность согласно 8ЕЦ ГО N0: 7 амплифицировали посредством ПЦР при помощи праймерных пар Р_РЬТ3 ~ 1:971 И21, СААдАТддССАдАддТАТТдТ (81 ТО) ГО N0: 12) и Р_РЬТ3 ~ 1:1426 Ь21, СТТССТТТТТАСАдСССАСТд (81 ТО) ГО N0: 13).
ПЦР провели, применяя 10 пд геномной ДНК сахарной свеклы, концентрацию праймера в 0,2 мкМ при температуре ренатурации ДНК в 55°С в мультициклере РТС-200 (М.1. КетеагсЬ, \Уа1ег1о\уц И8А). ПЦР-продукты были соответственно интегрированы в вектор рРТРХА| (Шгиет А., ЬабМд Р., 81гаи8ку Н., 0кито1о 8., КешаТО М., Нагт8 А., Рготтег ^.В., Коей (2006), АтаЫбор818 ЬНТ1 18 а Шдй-АГГшйу Ттаи8рог1ег Гог Се11и1аг Атшо Ашб Ир1аке ίη Во1й Роо! ЕрШетш апб ЬеаГ Ме8орйу11, Р1ап1 Се11. 18 (8): 1931-46) в структуре инвертированного повтора. Вектор базируется на плазмиде рКТ100 и конструирован для создания интрон-сплайсированной шпилечной структуры. Вектор содержит 358-промотор для конститутивной экспрессии (0бе11, ТТ., №ду, Р., апб Сйиа, ТО-Н. (1985), 1бепййсайоп оГ ЭХА 8едиепсе8 гееццгеб Гог асбуЦу оГ 1йе саибПогеег то8аю уни8 358 ртото1ет, №Циге 313, 810-812), АТААР6-интрон из арабидопсиса и ро1уА-терминатор. АТААР6-интрон фланкирован сайтами Хйо1/Ес1 136ΙΙ в 5'-конце, соответственно сайтами рестрикции 8та1/8а11 в 3'-конце. Это способствует интеграции идентичных фрагментов 8еп8е и апб8еп8е, когда эти фрагменты обладают совместимыми сайтами рестрикции Хйо1 или 8а11, соответственно на другом конце обрублены (тупой конец). Здесь первичные ПЦР-продукты переамплифицированы новыми удлиненными ПЦР-праймерами: 8а1-8МА-775>1077 дададдасд1сдасс1ддда1асйддд1д (8ЕЦ ГО N0: 14) и ссссссдддТадааасайддсдадс (8ЕЦ ГО N0: 15), 8АЬ-8МА-779> 1197 дададдасдГсдасдаПсйдддГдйдд (8ЕЦ ГО N0: 16) и ссссссдддаа!сад!сайдд1д1дддда!а (8ЕЦ ГО N0: 17), ХН0-8МА-971> 1446 дададдасс!сдадсаада!ддссададд! (8ЕЦ ГО N0: 18) и дГсдасссссссдддсйссййГ (8ЕЦ ГО N0: 19).
Для второго применения ПЦР-фрагменты клонированы в ТА-клонирующий вектор рСК2.1 (ТОРО ТА С1отпд Кй Цпуйтодеп СаткЪаб, И8А)) и трансформированы в Е. сой. Бело-голубая селекция способствовала идентификации рекомбинатных плазмид (8атЪгоок, 1., РгЙ8сй, Е.Р., апб МатаЙ8, Т, 1989, т Мо- 7 025113
1еси1аг С1отпд, А ЬаЬога1гогу Мапиа1, Со1б Зрйпд НагЪог ЬаЪога1огу Ргекк, №\у Уогк). В белых колониях подавляют вставкой экспрессию сс-галактозидаз, что приводит к белым колониям, так как добавляемый средству ферментный субстрат больше не разрывается. Последующее секвенирование М13-Губ/теупраймерами проведено Еитойик М\УС Орегоп (ЕЪегкЪегд, ОеШксЫапб). Анализ и сравнение данных последовательности выполняется программой Уес!ог ΝΤΙ (1пуйтодеи, Саг1кЪаб, И8А).
Фрагменты 8а1-8МА-775>1077, 8АЬ-8МА-779>1197 и ХНО-8МА-971>1446 (фиг. 4-6) вырезаны соответственно посредством 8а11/8ша1 или ХЪо1/8ша1 из ТОПО-вектора и затем лигированы прежде всего в разрезанный посредством 8а11/8ша1 или ХЪо1 /Ес1 13 6ΙΙ ρΡΤΡΝΛί-вектор ш кепке. Затем те же фрагменты лигированы во второй раз в апйкепке в совместимые ХЪо1/Ес1 136ΙΙ или 8а11/8ша1. Клонирования происходили в векторах рКNΛ^-Ъνν^1-775-1077как, рКNА^-Ъνν^1-779-1197как и рΡNΛ^- Ъууй_971 1446как (фиг. 3, 7-9).
Получение трансформирующих конструктов.
Для получения трансформирующих конструктов применяют бинарные трансформирующие векторы рЬН9000 (Наиктапп, Ь. апб ТоерГег, К. (1999), Еп1\\зск1ипд уоп Р1акниб-Уек1огеп. Уойтаде /иг РЙап/еп/ЪсШинд: Вюепдшеейпд Гиг Карккойеп пасЪ Мав 45: 155-172) ^СВЕАссекк питЪег: АЕ458478). Кассеты экспрессии изолируют после рестрикции рКNА^-плазмид посредством НшбШ, клонируют в бинарный вектор рЬН9000, и полученные в результате плазмиды обозначают как р^НКNА^-Ъνν^1-775-1077как, р^НКNΛ^-Ъνν^1-779-1197как и р^НКNΛ^-Ъνν^1-971-1446как.
Трансформация сахарной свеклы и проверка трансгенности.
Для трансформации растений применили бинарные векторы р^НКNА^-Ъν^1-775-1077как, р^НКNА^Ъууй-779-1197как и р^НКNА^-Ъνν^1-971-1446как. Бинарные векторы трансформировали в штамм С58С1 АдгоЪас1ейит ШтеГааенк с резидентной плазмидой рСУ3101 посредством способа трансформации ДНК (Ап, С. (1987), Вшату Τι уес!отк Гог р1ап! йапкГоттайоп апб ртото!ет апа1ук1к, МеБюбк Еп/утоЕ 153, 292305). Осуществили селекцию рекомбинантных клонов А. ШтеГашепк, применив антибиотик стрептомицин (50 мг/л). Трансформацию сахарной свеклы осуществили по Ьшбкеу е! а1. (1991), применив антибиотик канамицин (Ьшбкеу, К., Са11о1к, Р., Еабу, С. (1991), Кедепетайоп апб йапкГоттайоп оГ кидаг Ъее! Ъу АдтоЪас1ейит ШтеГааепк. Р1ап! ТЕкие СиНиге Мапиа1 В7: 1-13, К1и\уег Асабетю РиЪйкЪегк). Трансгенность растений проверили методом ПЦР. Применение праймеров СТССАСАСССТАТТСССТА (8ЕО ГО N0: 20) и ССАССАТСАТАТТССССААС (8Е0 ГО ΝΟ: 21) привело к амплификации ДНК-фрагмента размером 553 Ър из прШ-гена. ПЦР провели, применив 10 пд геномной ДНК, концентрацию праймера в 0.2 мкМ при температуре ренатурации ДНК в 55°С в мультициклере РТС-200 (М.1. КекеатсЪ, \Уа1ег1о\уц И8А).
Проверка процесса цветения и стрелкования трансформантов.
Около 40 независимых трансформантов вместе с нетрансгенными изогенными контрольными растениями размножили ш νίΙΐΌ и поместили в теплицу. После фазы адаптации трансформанты подвергались в течение 3 месяцев яровизации при 8°С в холодной камере (симуляция зимы). Затем трансформанты поместили вместе с идентично обработанными нетрансгенными контрольными растениями назад в теплицу (25°С). Вскоре после помещения, уже через 10 дней, контрольные растения начали стрелкование. Через около 4 недели контрольные растения начали цвести. В противоположность этому 10 из 40 трансформантов (25%) неожиданно не показали никакой реакции на предпринятую индукцию стрелкования и цветения после яровизации.
Из трансформантов всех трех применимых конструктов были получены стрелкующиеся/нецветущие растения. Положение применимой последовательности на гене не было решающим для функции. Полученные трансформанты проявили себя так же, как не подвергнутая яровизации сахарная свекла. Они не начали ни стрелковаться, ни цвести. Для каждого независимого трансформанта были протестированы 30 растений. Все растения без исключения были резистентны к стрелкованию и цветению. Ни одно из растений не проявило отклонений от нормального фенотипа. Растения были дальше культивированы, они развивались дальше в нормальные корнеплоды с нормальным телом свекловичного корня. Резистентность к стрелкованию и цветению сохранилась в течение всего периода проверки более чем 4 месяцев (см. фиг. 2).
Часть растений подвергли снова яровизации во второй раз в течение 3 месяцев.
Также вторая яровизация и помещение растений в теплицу при 25°С не привело к стрелкованию и цветению.
Неожиданно, таким образом было установлено, что можно посредством заявленных трансгенных методик полностью блокировать в сахарной свекле яровизацию, соответственно ее действие, а именно стрелкование и цветение, соответственно отменить.
Подтверждение повторного праймирования ВуУТО в сахарной свекле посредством КNΛ^-вставки с помощью экспрессионного анализа растений во время и после яровизации.
Из семинедельных тепличных растений линий сахарной свеклы 3ПС4156-уЪ5-1, 3ПС4156-уЪ4-1, 3ПС4156-уЪ4-14, 3ПС4156-уЪ4-5, 3ПС4156-уЪ5-18, 3ПС4156-уЪ4-9, 3ПС4156-уЪ4-7, 3ПС4156-уЪ3-4, 3ПС4156-уЪ3-4, 3ПС4156-уЪ7-1, 3ЭС4156-уЫ8-1 нетрансгенной 3ОС4156, которые последние три не- 8 025113 дели находились в яровизации, была изолирована РНК с ΤΚΙ-реагентом (81дта, 81. Ьошк, И8Л) по протоколу производителя.
Применяемую для сДНК-синтеза РНК проверили методом ПЦР на наличие примесей с геномной ДНК, одновременно исследовали параллельно результат сДНК-синтеза. При этом применили ΡΙΡΕΡοΙДНК-полимеразу (8ο1ίδ Вюбупе, Таг1и, Ейоша) по данным производителя. В качестве контрольных использовали всю ДНК. ПЦР-программу рассчитали для фрагмента размером в 369 Ьр. Праймеры синтезированы по Еитойпк МУС Орегоп (ЕЬеткЬетд, Сегтаиу) и приведены в табл. 3.
Таблица 3
Праймер для анализа РНК/с ДНК νίη31\νύ1994 Цасстааа^ацШсасдсс (8Еф ГО N0: 22) \3п3ге\;2317 1сааа8Касс§1с1а^а§аасс (8Еф ГО N0: 23)
Вся ДНК изолирована из четырехнедельных тепличных растений линии сахарной свеклы 3ЭС4156 набором для выделения П№а8у-Р1ап1-М1ш-Кт1 (ф1адеп, Нйбеп, Сегтаиу) по протоколу производителя. Набор реактивов РесеПАИ йг81-81гапб-сПНА-8уп1йе8-к11 от Реттеи1а8 (УПтик, ЫЙшаша) использовали для синтеза сДНК, причем данные производителя были соблюдены.
Применили сДНК как 1:10 разбавление для ς-ПЦР-исследований при помощи АВ1-81ерОпеР1и8- Реа1-йте-ПЦР-устройства, была проведена ς-ПЦР, основанная на 8ΥΒΡ дтееп. Был применен РОУЕР8УВР-§тееп-ПЦР-микс от ΑΒΙ (Ро§1ет Сйу, И8А) в качестве реакционного буфера. При составлении реакционных условий были соблюдены данные производителя, были проведены соответственно три повторения. Были синтезированы праймеры для ς-ПЦР от Еитойпк МУС Орегоп (ЕЬеткЬетд, Сегтапу) и приведены в табл. 4. При этом для нормализации были применена пара праймеров ЫоыеаШ и п1о5геаЙ2.
Таблица 4
Праймер для срПЦР-анализа п1о5геа1Н ОАСОААСТАОАСАТООООАТАСАТ (8Е0 ΤΟΝΟ: 24) п!о5геа1(2 ССОАТАСАААСТАСАСАТТАСААСТС (8Еф ГО ΝΟ: 25) уЁпЗгеаШ ТАООААССАААОСАООААОООА (8Е0 ГО N0: 26) утЗгеа112 ССТССОАСАОААСОСАТСАТСТ (ЗЕф ГО N0: 27) ς-ПЦР была проведена, как показано в табл. 5.
Таблица 5
| д-ПЦР/программа | |
| 95 ° С | 10 мин |
| 95° С | 15с |
| 58 0 С | 30 с |
| 72° С | 30 с |
| 95 0 С | 15с |
| 60° С | 1 мин |
| +0.5 0 С I с до 95 | ° С определение температуры плавления |
Этапы 2-4 повторили 40 раз, измерения проводили после этапа 4 и каждого этапа определения температуры плавления.
Из с|-ПЦР-анализа были определены уровни относительной экспрессии для ВуУ1Ь. Уровень экспрессии не/трансгенных контрольных обозначен при этом как 1. Результаты показаны в табл. 6 для растений из яровизации.
- 9 025113
Таблица 6
Относительная экспрессия ВуУТЬ в яровизованных ^Ь-линиях
| Линия | уровни относительной яровизации |
| \\'Ь к 5121 | 0.154 |
| \уЬк411 | 0.191 |
| к 4141 | 0.21 |
| ν,Τ к 451 | 0.238 |
| \уЬ к 5181 | 0.269 |
| \уЬ к 491 | 0.289 |
| к 472 | 0.384 |
| и/Ь к 341 | 0.423 |
| \уЬк716 | 0.529 |
| и/Ь к 1811 | 0.673 |
| зос \νι | 1 |
РНК была изолирована также из растений, которые были помещены в теплицу на несколько месяцев, линии сахарной свеклы 3ОС4156-\\Ь5-1. 3ОС4156-\\Ь4-1. 3ОС4156-\\Ь4-14. 3ОС4156-\\Ь4-5. 3ПС4156-мТ>5-18, 3ПС4156-мМ-9, 3ПС4156-мМ- 7, 3ПС4156-мТ>3-4, 3ПС4156-мТ>3-4, 3ϋΟ4156-^Β7-1, которые после нескольких яровизации оставались нестрелкующимися и нецветущими, и нетрансгенного 3ЭС4156. которое выращивали в теплице в течение 4 недель, посредством ΤΚΙ-реагента (81дта, δΐ. Ьошк, υδΑ) по протоколу производителя. При сДНК-синтезе происходит так, как уже указано выше для яровизированных растений.
Для уже несколько раз яровизированных, нестрелкующихся и нецветущих растений из теплицы с|ПЦР-анализ был проведен по такому же образцу. Из этого ц-ПЦР-анализа были определены соответственно уровни относительной экспрессии для ВуУШ Уровни экспрессии нетрансгенных контрольных обозначены как 1. Результаты показаны в табл. 7.
Таблица 7
Относительная экспрессия ВуУТЬ в нецветущих и нестрелкующихся \\Ь-линий
| Линия | Уровень относительной экспрессии |
| \\'Ъ к 5122 | 0.11 |
| \уЬк4142 | 0.15 |
| ν/Ь к 5183 | 0.17 |
| \νΒ к 496 | 0.21 |
| \уЪ к 412 | 0.24 |
| \уЬк451 | 0.24 |
| \уЬк711 | 0.35 |
| \иЬк471 | 0.36 |
| \\Ъ к 342 | 0.44 |
| ЗОС\УТ | 1 |
В обоих экспериментах выраженная редукция ВуУ1Ь-транскрипта коррелирует со склонностью к стрелкованию и цветению, а именно таким образом, что редукция ВуУ1Ь-транскрипта на менее 60%, повидимому, является достаточной для полного подавления стрелкования и цветения.
Обзор приведенных в заявке последовательностей приведен в следующей табл. 8.
- 10 025113
Таблица 8
Обзор последовательностей 8 ЕС) ГО N0: примечание
ΒνΥΙΓ., геномная ДНК, 2366 п(
ВуУГО, сДНК, включая З’-ЕНР, 2285 (З'-иТР = ηί 1963-2285)
ВуУГО, неполная сДНК, 1499 Ш
ΒνΥΙΕ, последовательность белка, 653 АА
Ш 775-1077 последовательности 8 ЕС) ГО ΝΟ: 3, 303 п!
ηΐ 779-1197 последовательности 8 ЕС) ГО N0: 3,419 п( п1971-1446 последовательности 8 ЕС) ГО N0: 3, 476 Ш 8-27 праймер
Протокол последовательности - свободный текст.
Праймер.
Выражение агййс1а1 5сс|испсс в протоколе последовательности означает искусственная последовательность.
- 11 025113
Протокол последовательностей <110> КИЗ ЗААТ АС
<170> Рабепб1п νβτβίοη 3.5 <210> 1 <211> 2366 <212> ϋΝΑ <213> Веба уи1даг!з <400> 1
| абдабадаас | сдсадсбдаа | адсабдсаас | ааааабдбда | адаабссдда | дадсаддаад | 60 | |
| асбдсббсса | сббсдбасаа | ббсбдсббсб | аддаадсааа | дсаддааддд | адаааабссб | 120 | |
| аббсдбдбба | сбссдббадд | ададсаабсб | бсбдаббббд | дабдббсбад | басббддаба | 130 | |
| 25 | бдбааааабб | сбдсабдбад | адсбдббсбд | бсбабадабд | абдсдббсбд | бсддаддбдб | 240 |
| бсабдсбдса | бсбдбсабса | абббдабдаб | аабааадасс | сбадбсбббд | дббддбббдб | 300 | |
| даабссдадб | сбдддсаддд | бдаббсббдб | ддаббабсаб | дссабаббда | дбдбдсаббб | 360 | |
| саасаадааа | адсбдддадб | бдбдаассбб | дддсаабаса | бдсабббдда | бдддадббас | 420 | |
| бдббдббсбб | сббдсддсаа | адбсбсбддд | абасббдддб | садбасббсб | дббббабдба | 480 | |
| 30 | дбдадабабб | дассбдаадб | сабдсббдбб | ббдабддаад | абааабаабб | бааааааааб | 540 |
| дббасабдсс | саасбаббас | ааддссадба | даааасбабд | адабабабба | аббббдабаб | 600 | |
| басбдбддад | дсбсадббда | абббабабдс | ббдадбббба | сбсасбаабд | дсаддбдббд | 660 | |
| дааааадсаа | ббддсбабад | сбааддабдс | бсдасдбдбс | дабдбдсббб | дсбабадааб | 720 | |
| абббббдадб | басадасбсс | бсдадддсас | адсбаадббб | ааддассбсс | асдадаббдб | 730 | |
| 35 | бдсадаадсб | аааасааадс | бддаддсада | ддбдддбссб | абдаасддад | асбсбдбсаа | 840 |
| дабддссада | ддбаббдбба | дсаддсббдс | баббдсбдса | дабдбдсааа | адсбсбдббс | 900 | |
| дсасдсдабб | дабааадсба | абдаабддсб | сдссаабдбб | бсбадсабба | дббсаааббд | 960 | |
| саааддббад | аабасабаса | дссбббаббд | ббсбссаббб | асббддбдад | баббсбабба | 1020 | |
| баабааабба | ббаабббсбб | ббддсабааб | ддбддсадбд | дабдсасббс | сбдсбдсабд | 1080 |
- 12 025113
| саддЪйЪсЪа | ГГГдаадаад | ГГасГГсГГд | ГГсасГГдсГ | аЬадГГГГда | ГадаГаГссс | 1140 |
| сасассаа^д | асСдаГГссд | ГсаааддсГа | саадсбаГдд | ГасГдсаааа | дГадасаГда | 1200 |
| дас££££дса | адддадссГа | саЬссдГсгГ | Гссаадддад | аааадааааа | ГаСеГдГааа | 1260 |
| дааЪс^саад | ссГГдсассд | адГасасаГГ | садааГадГГ | ГссГасасад | аадГГддГда | 1320 |
| Ъ^Ъаддссас | ГсГдаддсГа | адЬдГСГсас | саададГГГд | дадаГсаГГа | дГаадаааГс | 1380 |
| сассасад^д | ддсГдГаада | аддаадаГсс | ГГдГдГГдад | аддадсГссГ | сдааГдсааа | 1440 |
| ддаасаасаЪ | ааГГсаааГГ | ГддсЬдсааГ | аГсГГсГдда | ГГсааддГдс | дддассГГдд | 1500 |
| дааааЪсЪЪд | сассЬадсаГ | дддсссаада | асадддГГдс | еГГдааддГГ | ГеГдеадГде | 1560 |
| ИдаЪдЪадаа | сааГдсГдГд | дадЬаасГаа | аГдГдааГсГ | ссаааадаГс | ассадГсасс | 1620 |
| ЪссассСдЪЪ | ГсГсдГдадс | ГГдассГааа | ГдГадГГГса | дГГссГдаГГ | ГаааГдаада | 1680 |
| сс1:£ассссЪ | сссГГададГ | сГГеааддда | Гдаадасаас | ддаГдсасдс | ГададедГде | 1740 |
| ЪасЪдддссЪ | даГдаГдаГд | сГдсГГссса | ГддГдГГдад | аадааГдддс | СГдддсГадс | 1800 |
| садд^саааТ | ддГадГдддс | саадГдаГда | дГсГсаадсГ | ГдддсГсГса | ГссдаааГдд | 1860 |
| адаъдъдсеъ | дсГдГГдаГГ | ссГГддсада | дасссдГсдд | аададдГеГГ | саадГдсдаа | 1920 |
| Ьдаадаааса | саГдасГдГд | асадсасГсГ | даГаааГдда | ГсдссаЬГГс | ддаГГГсадд | 1980 |
| сдддсс^дд^. | ГсГсГадасд | дГаасГГГда | дЬаГЬдЬдГд | ааддГсаГсс | ддСддГГдда | 2040 |
| д£д£дадддс | ГаГсЬаааас | аддааГГГад | аГГдаааГГа | ГГдаеГГддГ | ГГадеГГаад | 2100 |
| а£с£ас!даа | саададсдГс | дддГадГсад | сасГГГсаГГ | сааасГсГда | ГддаЬдаГсс | 2160 |
| ааададсМза | деаддасадс | ГадГГдаСГс | сГГСддадаГ | сГсаЬаГсса | дсаададдсс | 2220 |
| саддасТад!: | ГГсасГадГа | адГГГаГдГс | ГаЬадГГдГГ | еГГГдаГГда | даааГГГГаЬ | 2280 |
| ааасаГСГсГ | аГГасГсГГс | ГГаГГеГдаа | дГГГГддасЬ | ааГГГГдГса | 2340 | |
| ЪдсЪааЪЪас | аддсаГГссГ | ГссГаа | 2366 |
<210>
<211>
<212>
2285
ΟΝΑ <213> ВеГа '/и1даг1з <220>
<221>
<222>
3’ϋΤΚ (1963)..(2285) <400> 2 аГдаГадаас сдсадсГдаа адсаГдсаас аааааГдбда адаабссдда дадсаддаад 60 асГдсГГсса еГГсдЬаеаа ГГсГдсГГсГ аддаадсааа дсаддааддд адааааГссГ 120 аГГсдГдГГа сГссдГГадд ададсааГсГ ГсГдаГГГГд даГдГГсГад ГасГГддаГа 180 ГдГаааааГГ сГдсаГдГад адсГдГГсСд ГсГаГадаГд аГдсдГГсГд ГсддаддГдГ 240
- 13 025113
| £са£дс):дса £с£д£са£са а'ЫзЬдаЪда'Ь ааГааадасс с£ад£с£££д д££дд£££д£ даа£ссдад£ сСдддсаддд £да£Ъсб£д£ дда££а£са£ дсса£а££да д£д£дса£££ саасаадааа адс£дддад£ £д£даасс££ дддсаа£аса £дса£££дда £дддад££ас | 300 360 420 480 | ||||||
| £д££д££с££ | сССдсддсаа | ад£с£сбддд | а£ас££ддд£ | д££ддааааа | дсааЬЬддсЬ | ||
| 5 | а£адс£аадд | а£дс£сдасд | £д£сда£д1:д | сЪ^'Ьдс'Ьа'Ьа | даа£аС£С(;£ | дад££асада | 540 |
| с£сс£сдадд | дсасадеЬаа | д£££ааддас | с£ссасдада | ££д££дсада | адсСааааса | 600 | |
| аадсЪддадд | сададд£ддд | ЬссШаЪдаас | ддадасЬсЬд | £саада£ддс | сададдЪаЪ! | 660 | |
| д££адсаддс | С£дсба££дс | £дсадабд£д | саааадс£с£ | дХЪсдсасдс | да£6да£ааа | 720 | |
| дс£аа£даа£ | ддс£сдссаа | кдСЬЁсЪадс | а^ЪадЁЪсаа | а££дсааад£ | дда£дсас££ | 780 | |
| 10 | ссбдсбдсаб | дсадд£££с£ | абббдаадаа | дб£ас££с££ | д££сас£6дс | £а£ад£££6д | 840 |
| а£ада£а£сс | ссасассаа! | дас£даЪ£сс | д£саааддс£ | асаадс^аЬд | д£ас£дсааа | 900 | |
| ад£адаса£д | адас££££дс | аадддадссЪ | асаГссд^сС | ££ссааддда | даааадаааа | 960 | |
| а£а£с£д£аа | адаа£с£саа | дсс££дсасс | дадЪасасаС | £садаа£ад£ | ££сс£асаса | 1020 | |
| даад£Сдд£д | а£С£аддсса | сЪсХдаддсШ | аад£д£££са | ссаадад£££ | ддадаъсаьъ | 1080 | |
| 15 | ад£аадааа£ | ссассасадЪ | дддс£д£аад | ааддаадаЪс | с£6д£д£6да | даддадсСсс | 1140 |
| £сдаа£дсаа | аддаасааса | ЬааЬЬсаааЬ | ЬЬддсЬдсаа | ЬаЬсЬЪсЬдд | а££саадд£д | 1200 | |
| сдддасс££д | ддаааа£с££ | дсассЬадса | £дддсссаад | аасаддд££д | сс£6даадд£ | 1260 | |
| ££с£дсад£д | с£да£д1:ада | асаа£дс£д£ | ддад£аас£а | аа£д£даа1:с | £ссаааада£ | 1320 | |
| сассад£сас | с£ссасс£д1: | ££с£сд£дад | сЫздассЬаа | аЬдТадТШс | ад££сс£да£ | 1380 | |
| 20 | ££ааа£даад | асс££асссс | ЪсссЪ-Ьадад | £с££сааддд | аъдаадасаа | сддаЬдсасд | 1440 |
| с£ададсд£д | с£ас£дддсс | £да£да£да£ | дс£дс££ссс | аЪдд^дЪЬда | даадааЪддд | 1500 | |
| с££дддс£ад | ссаддСсааа | £ддСад£ддд | ссаад£да£д | адСсСсаадс | ££дддс£с£с | 1560 | |
| а£ссдааа£д | дада£д£дсс | £дс£д££да£ | £сс££ддсад | адасссд£сд | даададд£с£ | 1620 | |
| £саад£дсда | аГдаадааас | аса£дас£д£ | дасадсасъс | 6да£ааа£дд | а£сдсса£££ | 1680 | |
| 25 | сддаС£Ссад | дсдддсс£дд | ЬЬсСсЬадас | дд£аас£'Ы:д | ад£а££д£д£ | дааддбсабс | 1740 |
| сдд£дд££дд | ад£д£даддд | с£а£с£аааа | саддаа£££а | да-ГСдаааСС | а££дас£Сдд | 1800 | |
| МЪадсЪЬаа | да£с£ас£да | асаададсд·: | сддд£ад£са | дсас£1:£са·: | £сааас£с£д | 1860 | |
| а£дда£да1:с | сааададс££ | адсаддасад | с£ад££да££ | ссЪЬЪддада | £с£са£а£сс | 1920 | |
| адсаададдс | ссаддас£ад | £££сас£адс | а££сс££сс£ | ааа£ааа£с£ | £аас£аадда | 1980 | |
| 30 | сддсасаса£ | а£с££дда1:а | саа££сада£ | д££Саддаса | саа££1:1:£ад | даддсадСас | 2040 |
| с£да££££сс | £сдадааадд | да££сса1:са | д£дд££аас£ | дсаса££££а | даадд£а£(:1: | 2100 | |
| д££адад£££ | сс££дассас | аЬЪЬдЬадаа | ада^ТсасаГ | £дадасаа£с | а££д££дсс·: | 2160 | |
| £с£сдса££д | ааддаадда·: | а£а£дс1:1:са | а£даа£а£££ | ааа££с1:ад£ | £саа£££ас£ | 2220 | |
| 35 | аа££аа££ад £ддсс | £££д1:<:£1:с·: | сааааааааа | аааааааааа | ааааадЪас·: | адСсдасдсд | 2280 2285 |
<210> 3 <211> 1499
- 14 025113 <212> ОНА <213> Вера тги1даг1з <400> 3
| 5 | ададдаддаа аааддаддаа РдасРаРада адааРаРсРа адсдаРдсаР РдРРадаРдд | 60 120 180 240 300 | |||||
| аРддаРаРсР дррддадррд аааасРддсР ссРасааРад дРаРРсаааа аРсРРРаРРа | дрррададса рдадрррдда адаРсаааРс дрдрдоааас рдсаааддас сдсддадааа | ||||||
| ааРддаааРс рдррссааас | ссадРРаРас Рссааадада | РРРдадаРдд дсдаРсаада | РРадаасРРР сРРРРРРРРР | РсРддадааР РРРРРРРРда | РссРдаааРс сааадааааР | ||
| 10 | аааааРРада | аРссРсРсРд | РааддсадРа | РдаРадаасс | дсадсРдааа | дсаРдсааса | 360 |
| ааааРдРдаа | дааРссддад | адсаддаада | сРдсРРссас | РРсдРаоааР | РсРдсРРсРа | 420 | |
| ддаадсааад | саддааддда | дааааРссра | РРсдРдРРас | РссдРРадда | дадсааРсРР | 480 | |
| срдаррррдд | аСдРРсРадР | асРРддаРаР | дРааааарРс | РдсаРдРада | дсРдРРсРдР | 540 | |
| сРаРадаРда | РдсдРРсРдР | сддаддРдРР | саРдсРдсаР | сРдРсаРсаа | РРРдаРдаРа | 600 | |
| 15 | арааадассс | РадРсРРРдд | ррддрррдрд | ааРссдадРс | рдддсадддР | даРРсРРдРд | 660 |
| даРРаРсаРд | ссаРаРРдад | РдРдсаРРРс | аасаадаааа | дсРдддадРР | дРдаассРРд | 720 | |
| ддсааРасаР | дсаРРРддаР | дддадРРасР | дРРдРРсРРс | РРдсддсааа | дРсРсРддда | 780 | |
| РасРРдддРд | РРддааааад | сааррддсра | РадсРаадда | РдсРсдасдР | дРсдаРдРдс | 840 | |
| РРРдсРаРад | ааРаРРРРРд | адРРасадас | РссРсдаддд | сасадсРаад | РРРааддасс | 900 | |
| 20 | Рссасдадар | РдРРдсадаа | дсРазаасаа | адсРддаддс | ададдрдддр | ссрардаасд | 960 |
| дадасРсРдР | оаадарддсс | ададдРаРРд | ррадсаддср | РдсРаРРдсР | дсадардрдс | 1020 | |
| аааадсРсРд | РРсдсасдсд | аРСдаРааад | сРааРдааРд | дсРсдссааР | дРРРсРадса | 1080 | |
| РРадРРсааа | РРдсааадРд | даРдсасРРс | сРдсРдсаРд | саддРРРсРа | РРРдаадаад | 1140 | |
| РРасРРсРРд | РРсасрРдсР | арадррррда | РадаРаРссс | сасассаард | асРдаРРссд | 1200 | |
| 25 | РсаааддсРа | саадсРаРдд | РасРдсаааа | дРадасаРда | дасРРРРдса | адддадссРа | 1260 |
| саРссдРсРР | Рссаадддад | аааадааааа | РаРсРдРааа | дааРсРсаад | ссРРдсассд | 1320 | |
| адРасасаРР | садаарадрр | РссРасасад | аадррддрда | РРРаддссас | РсРдаддсРа | 1380 | |
| адРдРРРсас | саададРРРд | дадаРсаРРа | дРаадаааРс | сассасадрд | ддсрдраааа | 1440 | |
| аддаадаРсс | ррдрдррдад | аддадсРссР | сдааРдсаад | адаасасаРа | аРРсаааРР | 1499 |
| <210> | 4 | |
| <211> | 653 | |
| <212> | РКТ | |
| 35 | <213> | Вера νιιΙςβΓίΒ |
<400> 4
Мер Не С1и Рго С1п Ьеи Ьуз А1а Суз Азп Ьуз Азп Уа! Ьуз Азп Рго
- 15 025113
10 15
С1и Зег Агд Ьуз ТНг А1а Зег ТНг Зег Туг Азп Зег А1а Зег Агд Ьуз 20 25 30
С1п Зег Агд Ьуз С1у С1и Азп Рго Не Агд Уа1 ТНг Рго Ьеи С1у С1и 35 40 45
С1п Зег Зег Азр РНе С1у Суз Зег Зег ТНг Тгр Не Суз Ьуз Азп Зег
50 55 60
А1а Суз Агд А1а Уа1 Ьеи Зег Не Азр Азр А1а РНе Суз Агд Агд Суз
70 75 80
Зег Суз Суз Не Суз Н1з С1п РНе Азр Азр Азп Ьуз Азр Рго Зег Ьеи 85 90 95
Тгр Ьеи Уа1 Суз С1и Зег С1и Зег С1у С1п С1у Азр Зег Суз С1у Ьеи 100 105 110
Зег Суз К1з Не С1и Суз А1а РНе С1п С1п С1и Ьуз Ьеи С1у Уа1 Уэ! 115 120 125
Азп Ьеи С1у С1п Туг МеН Шз Ьеи Азр С1у Зег Туг Суз Суз Зег Зег
130 135 140
Суз С1у Ьуз Уа1 Зег С1у Не Ьеи С1у Суз Тгр Ьуз Ьуз С1п Ьеи А1а
145 150 155 160
Не А1а Ьуз Азр А1а Агд Агд Уа1 Азр 7а1 Ьеи Суз Туг Агд Не РНе 165 170 175
Ьеи Зег Туг Агд Ьеи Ьеи 61и С1у ТНг А1а Ьуз РНе Ьуз Азр Ьеи Шз 180 185 190
С1и Не Уа1 А1а С1и А1а Ьуз ТНг Ьуз Ьеи С1и А1а С1и Уа1 С1у Рго 195 200 205
МеН Азп С1у Азр Зег Уа1 Ьуз МеН А1а Агд Е1у Не Уа1 Зег Агд Ьеи
210 215
А1а Не А1а А1а Азр Уа1 С1п Ьуз 225 230
А1а Азп С1и Тгр Ьеи А1а Азп Уа1 245
Уа1 Азр А1а Ьеи Рго А1а А1а Су5 10 260
Зег Суз Зег Ьеи А1а Не Уа1 Ьеи 275 280
Азр Зег Уа1 Ьуз 61у Туг Ьуз Ьеи 290 295
ТЬг РЬе А1а Агд С1и Рго ТЬг Зег 305 310
11е Зег Уа1 Ьуз Азп Ьеи Ьуз Рго 325
7з1 Зег Туг ТЬг С1и Уа1 С1у Азр 25 340
РЬе ТЬг Ьуз Зег Ьеи С1и 11е Не 355 360
Суз Ьуз Ьуз 61и Азр Рго Суз Уа1 370 375
С1и С1п Нхз Азп Зег Азп Ьеи А1а 385 390
Агд Азр Ьеи С1у Ьуз Не Ьеи Н1з 405
Суз Ьеи С1и С1у РЬе Суз Зег А1а
220
Ьеи Суз Зег Ηίβ А1а Не Азр Ьуз 235 240
Зег Зег Не Зег Зег Азп Суз Ьуз 250 255
Агд РЬе Ьеи РЬе 61и СЬи Уа1 ТЬг 265 270
Не Азр 11е Рго ТЬг Рго МеЬ ТЬг 285
Тгр Туг Суз Ьуз Зег Агд Шз С1и 300
Уа1 РЬе Рго Агд С1и Ьуз Агд Ьуз 315 320
Суз ТЬг 61и Туг ТЬг РЬе Агд 11е 330 335
Ьеи С1у Н1з Зег С1и А1а Ьуз Суз 345 350
Зег Ьуз Ьуз Зег ТЬг ТЬг Уа1 С1у 365
С1и Агд Зег Зег Зег Азп А1а Ьуз 380
А1а 11е Зег Зег 61у РЬе Ьуз Уа1 395 400
Ьеи А1а Тгр А1а 61п СЬи С1п С1у 410 415
Азр Уа1 С1и С1п Суз Суз С1у Уа1
420
ТЬг Ьуз Суз С1и Зег Рго Ьуз 435
Агд 61и Ьеи Азр Ьеи Азп Уа1 450 455
Ьеи ТЬг Рго Рго Ьеи С1и Зег 10 465 470
Ьеи 61и Агд А1а ТЬг С1у Рго 485
С1и Ьуз Азп С1у Ьеи Е1у Ьеи 500
Азр Е1и Зег Е1п А1а Тгр А1а 515
Уа1 Азр Зег Ьеи А1а Е1и ТЬг 530 535
Е1и 61и ТЬг НЬз Азр Суз Азр 25 545 550
Агд Не Зег Е1у Е1у Рго Е1у 565
Уа1 Ьуз Уа1 11е Агд Тгр Ьеи 580
РЬе Агд Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи ТЬг 595
Е1и Агд Агд Уа1 Уа1 Зег ТЬг 610 615
Ьуз Зег Ьеи А1а С1у Е1п Ьеи
425 430
Азр Нгз Е1п Зег Рго Рго Рго Уа1 Зег 440 445
Уа1 Зег 7а1 Рго Азр Ьеи Азп Е1и Азр 4 60
Зег Агд Азр Е1и Азр Азп С1у Суз ТЬг 475 480
Азр Азр Азр А1а А1а Зег Нгз 61у Уа1 490 495
А1а Агд Зег Азп С1у Зег Е1у Рго Зег 505 510
Ьеи 11е Агд Азп Е1у Азр Уа1 Рго А1а 520 525
Агд Агд Ьуз Агд Зег Зег Зег А1а Азп 540
Зег ТЬг Ьеи Не Азп С1у Зег Рго РЬе 555 560
Зег Ьеи Азр Е1у Азп РЬе Е1и Туг Суз 570 575
Е1и Суз Е1и С1у Туг Ьеи Ьуз Е1п Е1и 585 590
Тгр РЬе Зег Ьеи Агд Зег ТЬг Е1и С1п 600 605
РЬе 11е Е1п ТЬг Ьеи МеЬ Азр Азр Рго 620
7а1 Азр Зег РЬе О1у Азр Ьеи Не Зег
625
630
635
Зег Ьуз Агд Рго Агд ТЬг Зег РЬе ТЬг Зег Не Рго Зег 645 650 <210>
<211>
<212>
303
ΡΝΑ <213> Веба 1ги1даг1з
640 <400> 5
| сбдддабасб | бдддбдббдд | ааааадсааб | бддсбабадс | ЪааддаЪдсЪ | сдасдбдбсд | 60 |
| абдбдсбббд | сбабадааба | бббббдадбб | асадасбссб | сдадддсаса | дсбаадббба | 120 |
| 15 аддассбсса | сдадаббдбб | дсадаадсба | ааасааадсб | ддаддсадад | дбдддбссба | 180 |
| бдаасддада | сбсбдбсаад | абддссадад | дбаббдббад | саддсЪСдсС | аббдсбдсад | 240 |
| абдбдсаааа | дсбсбдббсд | сасдсдаббд | абааадсбаа | £даа1:ддсЪс | дссаабдббб | 300 |
| сба | 303 |
<210>
<211>
<212>
<213>
419
ОНА
Веба уи1даг15 <400> 6 дабасббддд бдббддаааа адсааббддс бабадсбаад дабдсбсдас дбдбсдабдб 60 дсбббдсбаб адаабабббб бдадббасад асбссбсдад ддсасадсба адбббаадда 120 ссбссасдад аббдббдсад аадсбаааас ааадсбддад дсададдбдд дбссбабдаа 180 сддадасбсб дбсаадабдд ссададдбаб бдббадсадд сббдсбаббд сбдсадабдб 240 дсаааадсбс бдббсдсасд сдаббдабаз адсбаабдаа бддсбсдсса абдбббсбад 300 саббадббса ааббдсааад бддабдсасб бссбдсбдса бдсаддбббс бабббдаада 360 адббасббсб бдббсасббд сбабадбббб дабадабабс сссасассаа бдасбдабб 419
| <210> | 7 |
| <211> | 476 |
| <212> | ϋΝΑ |
| <213> | Ве£а ννύ^βΓΐδ |
- 19 025113 <400> 7
| саадабддсс | ададд'Ьаб'Сд | Ъбадсаддс!; | ЪдсЪаЪбдс!; | дсада-ЬдЪдс | аааадсЖсЬд | 60 | |
| Ьбсдсасдсд | аСбда'Ьааад | сСаа1;даа<:д | дсСсдссааЖ | дЬЫсЬадса | СЪадСбсааа | 120 | |
| 5 | ЬЪдсааадЬд | даЬдсасЪ'Ьс | с£дсЬдса!:д | саддЪЬСсЬа | ЪЪЪдаадаад | ЖЪасЬЬсСЬд | 180 |
| 5ЬсасЫ;дсЬ | аЪад£'Ь£5да | ЬадаЬаСссс | сасассааЬд | асЬда'Ыссд | Ьсаааддсба | 240 | |
| саадсЬаЪдд | ЖасЬдсаааа | д^адасаЪда | дасЪЪбСдса | адддадссЬа | са£ссд£с££ | 300 | |
| Ъссаадддад | аааадааааа | 1абсЬд£ааа | дааЬсСсаад | ссЬСдсассд | адЬасасаС1 | 360 | |
| садааЬадЬЬ | 1сс±асасад | аад£5дд£да | ЪЬСаддссас | 1с1даддс5а | ад£д!55сас | 420 | |
| 10 | саададЪСЪд | дадафсаЪЪа | дЦаадаааТс | сассасадбд | ддсЬдЪаааа | аддаад | 476 |
<210> 8 <211> 27 <212> ОНА <213> Αι+ίίίοίδΐ Зечиепсе <220>
<223> Ргжшег <400> 8 сЬддда£ас£ £ддд£д££дд ааааадс
| 25 | <210> <211> <212> <213> | 9 28 ϋΝΑ АгМ£жс1а1 Зедиепсе |
| 30 | <220> | |
| <223> | Рг1тег |
<400> Э ^адааасаСС ддсдадсса!: ЬсаССадс
| <210> | 10 |
| <211> | 24 |
| <212> | ОНА |
- 20 025113
| <213> | АгЫ£з.с1а1 5едиепсе | ||
| <220> | |||
| <223> | Рг1иег | ||
| 5 | <4 00> | 10 | |
| да£ас££ддд ЬдЪЕддаааа адса | 24 | ||
| 10 | <210> | 11 | |
| <211> | 23 | ||
| <212> | ΟΝΑ | ||
| <213> | АгЫ£1с1а1 Зедиепсе | ||
| 15 | <220> | ||
| <223> | Ргхтег | ||
| <400> | 11 | ||
| 20 | ааЕсадЕса!; £дд£д£дддд а£а | 23 | |
| <210> | 12 | ||
| <211> | 21 | ||
| <212> | 0ΝΑ | ||
| 25 | <213> | АгЫ£1с1а1 Зедиепсе | |
| <220> | |||
| <223> | Ргхтег | ||
| 30 | <400> | 12 | |
| саадабддсс ададд£а££д ί | 21 |
| <210> | 13 | |
| 35 | <211> | 21 |
| <212> | ОНА | |
| <213> | АгсХПсга! Зедиепсе | |
| <220> |
- 21 025113 <223> Рг1шег <400> 13 сННссННННН асадсссаен д
| <210> | 14 | |
| <211> | 30 | |
| <212> | ϋΝΑ | |
| 10 | <213> | АгМ£1с1а1 Зедиепсе |
| <220> | ||
| <223> | Ргхшег | |
| 15 | <400> | 14 |
дададдасдН сдассНддда НасНдддНд
| <210> | 15 | |
| 20 | <211> | 26 |
| <212> | ΌΝΑ | |
| <213> | АгМ£1с1а1 Зедиепсе | |
| <220> | ||
| 25 | <223> | Ргхтег |
| <400> | 15 |
ссссссдддН адааасаННд дсдадс
| <210> | 16 |
| <211> | 30 |
| <212> | ϋΝΑ |
| <213> | АгН1£1с1а1 Зедиепсе |
| <220> | |
| <223> | Рггтег |
| <400> | 16 |
- 22 025113 дададдасд! сдасдаРасР ЬдддСдррдд
| <210> | 17 | |
| 5 | <211> | 32 |
| <212> | ϋΝΑ | |
| <213> | АгЪ1£1с1а1 Зедиепсе | |
| <220> | ||
| 10 | <223> | Ргхтег |
| <400> | 17 |
ссссссддда аЬсадЬсаЫ ддрдрдддда 1а
| <210> | 18 |
| <211> | 30 |
| <212> | ϋΝΑ |
| <213> | ΑΓίίίίοίθΙ Зедиепсе |
| <220> | |
| <223> | РгЗтег |
| <400> | 18 |
дэдаддасс! сдадсаада! ддссададд!
| <210> | 19 |
| <211> | 25 |
| <212> | ϋΝΑ |
| <213> | АхЪ1£1с±а1 Зедиепсе |
| <220> | |
| <223> | Ргхтег |
| <400> | 19 |
дЪсдассссс ссдддсИсс 11111
- 23 025113
| <210> | 20 |
| <211> | 19 |
| <212> | РИА |
| <213> | АгР1Р1с1а1 Зедиепсе |
| <220> | |
| <223> | ргхтег |
<400> 20 дрддададдс РаРРсддРа
| <210> | 21 |
| <211> | 20 |
| <212> | ΟΝΑ |
| <213> | Агр1£1с1а1 Зедиепсе |
| <220> | |
| <223> | Рг1тег |
| <400> | 21 |
ссассаРдаР аРРсддсаад
| 25 | <210> | 22 |
| <211> | 24 | |
| <212> | ΏΝΑ | |
| <213> | ΑΓΡΐίίοΐθΙ Зедиепсе | |
| 30 | <220> | |
| <223> | Ргхшег | |
| <400> | 22 |
РдассРаааР дРадРРРсад РРсс
| <210> | 23 |
| <211> | 23 |
| <212> | ИНА |
- 24 025113 <213> АгМ£1с1а1 Зечиепсе <220>
<223> Рг1шег <400> 23
ЬсааадНас сдЬсСадада асе <210> 24 <211> 24 <212> ОМА <213> ΑιΉίίοίβΙ Зедиепсе <220>
<223> Ргатег <400> 24 даддаасЪад асаЬддддаб аса!
<210> 25 <211> 26 <212> СНА <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Рг+тег <400> 25 дсдаЁасааа дСадасаЫза дааесс
| <210> | 26 |
| <211> | 22 |
| <212> | СНА |
| <213> | Аг-Ы£1с1а1 Зедиепсе |
| <220> |
- 25 025113 <223> Рптег <400> 26 баддаадсаа адсаддаадд да <210> 27 <211> 22 <212> ΟΝΑ <213> АгЫНсга! Зедиепсе <220>
<223> Рггтег <400> 27 ссГссдасад аасдсаГсаГ ст
Claims (9)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Изолированная нуклеиновая кислота для ингибирования стрелкования и цветения растения сахарной свеклы, отличающаяся тем, что включает нуклеотидную последовательность, которая:а) имеет последовательность 8ЕО ГО N0: 1-3 или фрагмент последовательности, содержащий по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов 8Е0 ГО N0: 1-3, илиб) является комплементарной к последовательности 8Е0 ГО N0: 1-3 или фрагменту последовательности, содержащему по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов 8Е0 ГО N0: 1-3, илив) является антисмысловой по отношению к последовательности 8Е0 ГО N0: 1-3 или фрагменту последовательности, содержащему по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов 8Е0 ГО N0: 1-3, или комплементарной им последовательности, илиг) является по меньшей мере на 70% идентичной последовательности 8Е0 ГО N0: 1-3 или по меньшей мере на 80% идентичной фрагменту последовательности 8К0 ГО N0: 1-3, содержащей по меньшей мере 100 смежных нуклеотидов или по меньшей мере на 95% идентичной фрагменту последовательности 8Е0 ГО N0: 1-3, содержащей по меньшей мере 50-99 смежных нуклеотидов, илид) кодирует белок с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 4 из Ве1а уи1даг18, илие) кодирует белок с аминокислотной последовательностью из Ве1а уи1даг18, которая является по меньшей мере на 50% идентичной последовательности 8Е0 ГО N0: 4 или по меньшей мере на 80% идентичной фрагменту последовательности, содержащей по меньшей мере 50 смежных аминокислот последовательности 8Е0 ГО N0: 4, илиж) гибридизируется с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1-3 или комплементарной ей нуклеотидной последовательностью или с антисмысловой по отношению к последовательности 8Е0 ГО N0: 1-3 последовательностью при строгих условиях.
- 2. Нуклеиновая кислота по п.1, отличающаяся тем, что фрагмент последовательности в соответствии с подпунктами а), б) и в) п.1 включает по меньшей мере 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 смежных нуклеотидов последовательности 8Е0 ГО N0: 1-3 или кодирует фрагмент последовательности в соответствии с подпунктом с) п.1, содержащий по меньшей мере 60, 70, 30, 90, 100, 120, 150, 200 или 250 смежных аминокислот последовательности 8Е0 ГО N0: 4.
- 3. Нуклеиновая кислота по одному из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что идентична последовательности или фрагменту последовательности 8Е0 ГО N0: 1-3, по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 или 99.9%.
- 4. Нуклеиновая кислота по одному из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что включает одну из последовательностей 8Е0 ГО N0: 5, 6 или 7, которые представляют собой фрагменты последовательностей 8Е0 ГО N0: 1-3, или одну из последовательностей 8Е0 ГО N0: 5, 6 или 7 в антисмысловой ориентации.
- 5. Применение нуклеиновой кислоты по одному из предшествующих пп.1-4 для ингибирования стрелкования и цветения растения сахарной свеклы.
- 6. Способ получения трансгенного растения сахарной свеклы, у которого ингибируют стрелкование или цветение после яровизации, включающий этапы (а) трансформации клетки сахарной свеклы нуклеиновой кислотой по одному из пп.1-4 и (б) выращивания растения сахарной свеклы из трансформированной клетки сахарной свеклы.
- 7. Вектор для ингибирования стрелкования и цветения растения сахарной свеклы, включающий нуклеиновую кислоту по одному из пп.1-4.- 26 025113
- 8. Трансгенное растение сахарной свеклы, у которого ингибировано стрелкование и цветение, включающее нуклеиновую кислоту по одному из пп.1-4 в качестве трансгена.
- 9. Семена или части трансгенного растения сахарной свеклы по п.8, которые трансформированы нуклеиновой кислотой по одному из пп.1-4 и включают указанную нуклеиновую кислоту в качестве трансгена.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102009041333 | 2009-09-15 | ||
| PCT/DE2010/001081 WO2011032537A1 (de) | 2009-09-15 | 2010-09-15 | Inhibierung des schossens und blühens einer zuckerrübenpflanze |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201200468A1 EA201200468A1 (ru) | 2012-08-30 |
| EA025113B1 true EA025113B1 (ru) | 2016-11-30 |
Family
ID=43413609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201200468A EA025113B1 (ru) | 2009-09-15 | 2010-09-15 | Ингибирование стрелкования и цветения растений сахарной свеклы |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9222102B2 (ru) |
| EP (1) | EP2478007B1 (ru) |
| CA (1) | CA2773488A1 (ru) |
| CL (1) | CL2012000649A1 (ru) |
| DE (1) | DE112010003653A5 (ru) |
| EA (1) | EA025113B1 (ru) |
| MA (1) | MA33657B1 (ru) |
| RS (1) | RS20120151A1 (ru) |
| UA (1) | UA110019C2 (ru) |
| WO (1) | WO2011032537A1 (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2647646B1 (en) | 2012-04-04 | 2019-07-31 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Nucleic acid sequences and peptides/proteins of the FT family providing flower-repressing properties in tobacco and transgenic plants transformed therewith |
| EP3162897A1 (en) | 2015-10-30 | 2017-05-03 | Kws Saat Se | Inhibition of bolting and flowering of a beta vulgaris plant |
| DK3282016T3 (da) | 2016-08-10 | 2025-11-03 | Kws Saat Se & Co Kgaa | Resistengener over for rizomania |
| EP3798301A1 (en) | 2019-09-25 | 2021-03-31 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Promoter repression |
| EP3835309A1 (en) * | 2019-12-13 | 2021-06-16 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Method for increasing cold or frost tolerance in a plant |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007122086A1 (en) * | 2006-04-21 | 2007-11-01 | Syngenta Participations Ag | Transgenic plants and methods for controlling bolting in sugar beet |
| WO2009141446A1 (en) * | 2008-05-23 | 2009-11-26 | Syngenta Participations Ag | Transgenic sugar beet plants |
| WO2010025888A2 (en) * | 2008-09-02 | 2010-03-11 | Syngenta Participations Ag | Engineering of bolting resistance in sugar beet by means of the transgenic expression of the beet homologue of flowering time control gene ft |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040031072A1 (en) * | 1999-05-06 | 2004-02-12 | La Rosa Thomas J. | Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement |
| CA2432380A1 (en) * | 2000-12-22 | 2002-07-04 | Cropdesign N.V. | Sugar beet genes involved in stress tolerance |
| JP2005185101A (ja) * | 2002-05-30 | 2005-07-14 | National Institute Of Agrobiological Sciences | 植物の全長ｃＤＮＡおよびその利用 |
| US8293977B2 (en) * | 2006-04-21 | 2012-10-23 | Syngenta Participations Ag | Transgenic plants and methods for controlling bolting in sugar beet |
-
2010
- 2010-09-15 DE DE112010003653T patent/DE112010003653A5/de not_active Withdrawn
- 2010-09-15 UA UAA201204227A patent/UA110019C2/uk unknown
- 2010-09-15 WO PCT/DE2010/001081 patent/WO2011032537A1/de not_active Ceased
- 2010-09-15 RS RS20120151A patent/RS20120151A1/sr unknown
- 2010-09-15 EA EA201200468A patent/EA025113B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-09-15 CA CA2773488A patent/CA2773488A1/en not_active Abandoned
- 2010-09-15 US US13/391,865 patent/US9222102B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-09-15 EP EP10776278.3A patent/EP2478007B1/de not_active Not-in-force
-
2012
- 2012-03-14 CL CL2012000649A patent/CL2012000649A1/es unknown
- 2012-04-04 MA MA34752A patent/MA33657B1/fr unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007122086A1 (en) * | 2006-04-21 | 2007-11-01 | Syngenta Participations Ag | Transgenic plants and methods for controlling bolting in sugar beet |
| WO2009141446A1 (en) * | 2008-05-23 | 2009-11-26 | Syngenta Participations Ag | Transgenic sugar beet plants |
| WO2010025888A2 (en) * | 2008-09-02 | 2010-03-11 | Syngenta Participations Ag | Engineering of bolting resistance in sugar beet by means of the transgenic expression of the beet homologue of flowering time control gene ft |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| DATABASE EMBL 1 January 2008 (2008-01-01), SHI Y H, ET AL: "UFL_192_45 Cotton fiber 0-10 day post anthesis Gossypium hirsutum cDNA, mRNA sequence.", XP002616055 * |
| DATABASE Geneseq 12 February 2004 (2004-02-12), LA ROSA T J, ET AL: "Glycine max cDNA SEQ ID NO:128994.", XP002616056 * |
| DATABASE UniProt 1 October 2008 (2008-10-01), CHAN A, ET AL: "SubName: Full=Putative uncharacterized protein;", XP002616057 * |
| JUNG, C. ; MULLER, A.E.: "Flowering time control and applications in plant breeding", TRENDS IN PLANT SCIENCE, ELSEVIER SCIENCE, OXFORD, GB, vol. 14, no. 10, 1 October 2009 (2009-10-01), GB, pages 563 - 573, XP026668259, ISSN: 1360-1385, DOI: 10.1016/j.tplants.2009.07.005 * |
| SUNG SIBUM, SCHMITZ R J, AMASINO R M: "A PHD finger protein involved in both the vernalization and photoperiod pathways in Arabidopsis", GENES AND DEVELOPMENT., COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, PLAINVIEW, NY., US, vol. 20, no. 23, 1 December 2006 (2006-12-01), US, pages 3244 - 3248, XP002616054, ISSN: 0890-9369, DOI: 10.1101/GAD.1493306 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MA33657B1 (fr) | 2012-10-01 |
| CA2773488A1 (en) | 2011-03-24 |
| WO2011032537A1 (de) | 2011-03-24 |
| UA110019C2 (uk) | 2015-11-10 |
| EP2478007A1 (de) | 2012-07-25 |
| DE112010003653A5 (de) | 2012-12-20 |
| EP2478007B1 (de) | 2017-11-15 |
| US20120167247A1 (en) | 2012-06-28 |
| RS20120151A1 (sr) | 2012-10-31 |
| CL2012000649A1 (es) | 2012-10-19 |
| EA201200468A1 (ru) | 2012-08-30 |
| US9222102B2 (en) | 2015-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Komatsu et al. | LAX and SPA: major regulators of shoot branching in rice | |
| EA024958B1 (ru) | Конструирование устойчивости к выходу в стрелку у сахарной свеклы с помощью трансгенной экспрессии гомолога гена ft свеклы, контролирующего время цветения | |
| Périlleux et al. | A root chicory MADS box sequence and the A rabidopsis flowering repressor FLC share common features that suggest conserved function in vernalization and de‐vernalization responses | |
| CN116622762B (zh) | 水稻OsRS29基因在调控水稻粒形、垩白形成及高温耐性中的应用 | |
| EA025113B1 (ru) | Ингибирование стрелкования и цветения растений сахарной свеклы | |
| US7217855B2 (en) | Gene controlling flowering time and method for controlling flowering time in plants using the gene | |
| CN116676317A (zh) | 一种水稻OsEns150基因及其在改良水稻株型、品质和增强穗发芽抗性中的应用 | |
| CN117587030B (zh) | 花生荚果大小相关基因AhPSW1及其应用 | |
| US20210269817A1 (en) | Inhibition of bolting and flowering of a beta vulgaris plant | |
| CN107868773B (zh) | 与水稻抗性淀粉相关的蛋白SSIIIa及其编码基因与应用 | |
| CN105087508B (zh) | 茄子黄烷酮3-羟化酶SmF3H及其基因和应用 | |
| CN102719451A (zh) | 枳转录因子PtrbHLH及在提高植物抗寒中的应用 | |
| CN120192976A (zh) | Lrk20基因在调控水稻抗病性中的应用、相关生物材料及培育方法 | |
| CN120099028A (zh) | 一种调控水稻纹枯病抗性基因lrk21及其编码蛋白和应用 | |
| CN104017781A (zh) | 百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针 | |
| CN115948434B (zh) | OsPHOT1基因在提高水稻抗高温和/或黑暗性能中的应用 | |
| JP2024139770A (ja) | 遺伝子改変イネ植物、イネ植物の作出方法、判定方法、成長促進剤、遺伝子及びタンパク質 | |
| CN114410603B (zh) | 水稻高环境温度适应性响应控制基因togr3及其应用 | |
| CN104725493A (zh) | 胚乳淀粉合成相关的转录因子及其应用 | |
| CN119913176B (zh) | OsLRK19基因及其在增强水稻抗纹枯病应用 | |
| Ohba et al. | Alteration of fruit characteristics in transgenic tomatoes with modified expression of a xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase gene | |
| CN117625641B (zh) | 一种抑制水稻穗发芽的核苷酸序列及其应用 | |
| EP4209502A1 (en) | Fructose sensing and signaling in plants | |
| CN116536349B (zh) | 一种大豆GmMLP34基因在调控植物耐高温性上的应用 | |
| CN119307546B (zh) | Hag18蛋白及其编码基因在提高玉米耐冷性中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |