EA024137B1 - Способ стимуляции регенерации резецированной печени рекомбинантным эритропоэтином - Google Patents
Способ стимуляции регенерации резецированной печени рекомбинантным эритропоэтином Download PDFInfo
- Publication number
- EA024137B1 EA024137B1 EA201400037A EA201400037A EA024137B1 EA 024137 B1 EA024137 B1 EA 024137B1 EA 201400037 A EA201400037 A EA 201400037A EA 201400037 A EA201400037 A EA 201400037A EA 024137 B1 EA024137 B1 EA 024137B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- liver
- day
- experiment
- animals
- resection
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к экспериментальной фармакологии и хирургии и может быть использовано для стимуляции регенерации резецированной печени. Для этого лабораторному животному на вторые сутки эксперимента осуществляют резекцию печени в объеме 70%, рекомбинантный эритропоэтин вводят внутрибрюшинно, в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента. Способ обеспечивает эффективную стимуляцию регенерации резецированной печени, подтверждаемую снижением летальности, улучшением микроциркуляции, уменьшением выраженности цитолиза, улучшением синтетической функции печени в сравнении с контрольной группой, а также результатами морфологического исследования.
Description
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и экспериментальной хирургии, и может быть использовано для стимуляции регенерации резецированной печени.
Наиболее близким к заявленному решению является Способ пострезекционной регенерации печени в эксперименте авт. С.П. Чикотеева и др. КИ 2232550. В данном решении проводят предварительную ксенотрансплан-тацию криоконсервированными изолированными гепатоцитами свиньи подкожно в переднюю брюшную стенку. Процедуру осуществляют за 48 ч до операции. Затем интраоперационно непосредственно после резекции 90% печени выполняют трансплантацию таких же клеток под капсулу селезенки.
Недостатками данного метода являются сложность технического выполнения и высокая вероятность развития осложнений при ксенотрансплантации. Кроме того 100% летальность крыс контрольной группы затрудняет проведение эксперимента из-за невозможности сравнения показателей в опытной и контрольной группах животных. По данным большинства исследователей наиболее оптимальной для изучения регенерации печени у крыс является резекция 70% органа.
В каждом живом организме заложены сложные механизмы самосохранения и восстановления. Задача современной медицины изучить и найти способы их активации. В этой связи феномен ишемического прекондиционирования заслуживает самого детального изучения. Эффекты прекондициониро-вания цитопротекция и неоангиогенез, лежащий в основе восстановительных процессов важны в хирургии. Внедрение в практику фармакологических средств, способствующих активации и продлению этого естественного защитного механизма позволит значительно улучшить результаты лечения. Наиболее перспективным для изучения, с нашей точки зрения, является эритропоэтин. Это гликопротеиновый гормон, синтез которого стимулирует гипоксия (Захаров Ю.М., 2007; Райасш Μ., ΒίαηοίαΓάί Р., Саге!й А., 2006).
Период полувыведения эритропоэтина значительно выше, чем у других гуморальных агентов прекондиционирования (аденозин, брадикинин, опиоиды), следовательно, временной интервал периода толерантности к ишемии, инициируемый им, должен быть существенно шире. Кроме того, открытие рецепторов эритропоэтина на мезангиальных клетках и в миокарде, фибробластах мышечной и нервной ткани позволило изучать неэритропоэтические функции гормона (Бакшеев В.И., Коломоец Н.М., 2007; МеШ С., 1аск С, ЬатЪгшок С.Ь. е! а1., 2006; Таоийк Е., Рей Е., Ийоих И. е! а1., 2008). Некоторыми авторами доказано, что применение эритропоэтина в малых дозах не оказывает влияния на показатели периферической крови, в то время как неэритропоэтические функции его сохраняются (Реггагю М. е! а1., 2007).
Доказанная способность стимулировать неоангиогенез (Колесник И.М. 2010), лежащий в основе регенераторных процессов, позволяет предположить эффективность применения рекомбинантного эритропоэтина для стимуляции процесса регенерации резецированной печени.
Основным преимуществом предлагаемого способа является простота исполнения, а также применение препарата в минимальной дозе, не вызывающей побочных эффектов.
Техническим результатом изобретения является разработка способа стимуляции регенерации резецированной печени с помощью рекомбинантного эритропоэтина.
Технический результат достигается тем, что при резекции 70% печени на вторые сутки эксперимента лабораторному животному вводят внутрибрюшинно рекомбинантный эритропоэтин в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.
Способ осуществляется следующим образом.
Опыты проводят на белых крысах линии ХУМаг массой 210-220 г.
Резекция печени производится на вторые сутки в объеме 70%.
Состояние печени оценивается по показателю летальности животных, уровню микроциркуляции, выраженности цитолиза, показателям синтетической функции печени и результатам морфологического исследования в группах интактных животных, ложнооперированных, с резекцией печени и в группе животных с резекцией печени, которым вводился эритропоэтин.
Показатель летальности оценивается в экспериментальных группах животных в первые 10 суток после операции.
Уровень микроциркуляции в печени определяется при помощи оборудования производства компании Вюрас 5У51еш5: полиграфа МР100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии ЕИР100С и поверхностного датчика ТЗИ 140. Регистрация и обработка результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производится с помощью программы Асс|Кпо\у1е<1де версии 4.2., значения микроциркуляции выражают в перфузионных единицах (ПЕ). Запись уровня микроциркуляции осуществляют последовательно по поверхности печени, затем рассчитывают среднее значение. Регистрацию уровня микроциркуляции проводят на 2, 7, 14, 21 и 28 сутки после операции.
Выраженность цитолиза оценивают по уровню показателей АлАТ, АсАТ и ЛДГ в крови экспериментальных животных на 2, 7, 14, 21 и 28 сутки после операции. Показатели определяют УФ-кинетическим методом на автоматизированной системе АИ5800 (Весктап Сои1!ег, США).
Синтетичесую функцию печени оценивают по показателям коагулограммы (АЧТВ, МНО, фибриноген) на 7, 14, 21 и 28 сутки после операции на анализаторе СЗ-20001 (Зуктех, Япония).
Морфологическое исследование выполняется на материале стандартных участков печени, взятых после
- 1 024137 выведения животных из эксперимента. Обработка материала производится по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняются с применением системы для сканирования и архивирования изображений МпахЭекк.
Рекомбнантный эритропоэтин (Эпокрин эпоэтин альфа; ФГУП Государственный научноисследовательский институт особо чистых препаратов Федерального медикобиологического агентства г. Санкт-Петербург, Россия) вводят внутрибрюшинно в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.
При статистической обработке данных рассчитывают среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считают достоверными при р<0,05.
Пример конкретного выполнения
Экспериментальные животные были разделены на следующие группы:
1) интактные животные (п=20)
2) ложнооперированные животные (п=20);
3) резекция печени (п=50);
4) резекция печени + рекомбинантный эритропоэтин (п=50).
Резекцию печени производили лабораторным животным на вторые сутки эксперимента в объёме 70%. Крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением комбинации хлоралгидрата и золетила. После наркотизации крысу фиксировали в положении на спине. Шерсть на брюшке тщательно выстригали, кожу обрабатывали 70% раствором этилового спирта. Срединную лапаротомию выполняли от мечевидного отростка длиной 4 см. Печень мобилизовывали посредством пересечения связок. Удаляли левую и медиальную доли после предварительного лигирования сосудов. Лапаротомное отверстие ушивали после санации брюшной полости и контроля гемостаза послойно узловым швом.
Стимуляцию регенерации печени проводили у животных 4-й группы внутрибрюшинным введением рекомбинантного эритропоэтина в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.
Показатель летальности оценивали в экспериментальных группах животных в первые 10 суток после операции. В группе животных с резекцией печени он составил 40%, в группе животных с резекцией печени и введением рекомбинантного эритропоэтина летальных исходов не было.
Уровень микроциркуляции в печени определяли при помощи оборудования производства компании Βίорас 8у81еш8: полиграфа МР100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии ЬПР100С и поверхностного датчика ΤδΌ 140 на 2, 7, 14, 21 и 28 сутки после операции. Регистрацию и обработку результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производили с помощью программы АсдКпоМебде версии 4.2., значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ). Запись кривой уровня микроциркуляции осуществляли по всей поверхности печени в течение 30 с в каждой точке. Из полученных значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в печени у данного животного. Из полученных значений рассчитывали среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в данной группе животных на данном сроке исследования.
В группе интактных животных уровень микроциркуляции в печени составил 877±17 ПЕ. Результаты оценки уровня микроциркуляции у животных опытных групп представлены в табл. 1.
Среднее значение уровеня микроциркуляции в печени ложнооперированных животных на всех сроках не имеет достоверных отличий от такового у интактных крыс.
После резекции печени показатель снижается на 50% и остается на прежнем уровне первые 14 суток. К 21 суткам показатель начинает расти, однако на 28-е сутки среднее значение уровня микроциркуляции в резецированной печени крыс достоверно ниже такового у интактных животных.
Введение рекомбинантного эритропоэтина способствовало сохранению кровотока в резецированной печени на довольно высоком уровне (показатель снижается на 15%) и восстановлению его на сроке до 21-х суток после резекции.
Таблица 1. Результаты оценки уровня микроциркуляции в печени животных опытных групп (М±т) в перфузионных единицах на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28 сутки после операции (соответственно 3, 8, 15, 22 и 29 сутки эксперимента)
Группа | Уровень микроциркуляции в печени в перфузионных единицах | ||||
2-е сутки | 7-е сутки | 14-е сутки | 21-е сутки | 28-е сутки | |
Ложнооперированные | 881±14 | 860±19 | 872±21 | 875±9 | 880±12 |
Резекция печени | 421±14* | 429±9* | 501±11* | 591±17* | 637±19* |
Резекция печени + ЕРО | 740±19** | 738±18** | 783±14** | 933±21** | 1110±31** |
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; ** - р<0,05 в сравнении с группой животных с резекцией печени на соответствующем сроке; ложная операция - лапаротомия с последующим ушиванием передней брюшной стенки на вторые сутки эксперимента; резекция печени осуществля- 2 024137 лась в объеме 70% на вторые сутки эксперимента; ЕРО - рекомбинантный эритропоэтин внутрибрюшинно в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.
Выраженность цитолиза оценивали по уровню показателей АлАТ, АсАТ и ЛДГ в крови экспериментальных животных на 2, 7, 14 21, 28 сутки после операции. Показатели определяли УФ-кинетическим методом на автоматизированной системе АИ5800 (Весктап СоиИет, США).
АлАТ в контрольной группе на 2 сутки 108±4 МЕ/л снижается до нормальных показателей к 21 суткам - 38±2 МЕ/л, в группе с эритропоэтином на 2 сутки - 60±2 МЕ/л нормализуется на 7 сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.
АсАТ в контрольной группе на 2 сутки 184±7 МЕ/л снижается до нормальных показателей к 21 суткам, в группе с эритропоэтином на 2 сутки - 82±3 МЕ/л нормализуется на 14 сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.
ЛДГ в контрольной группе на 2 сутки 564±3 МЕ/л снижается до нормальных показателей к 28 суткам - 250±6 ЕД/л, в группе с эритропоэтином на 2 сутки - 300±8 МЕ/л нормализуется на 7 сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.
Синтетическую функцию печени оценивали по показателям коагулограммы (АЧТВ, МНО, фибриноген) на 7, 14, 21 и 28 сутки после операции на анализаторе С8-20001 (8уктех, Япония).
На 7 сутки после резекции печени отмечено снижение синтетической функции, проявляющееся удлинением АЧТВ до 60±1 с, увеличением МНО до 4±0,2, снижением уровня фибриногена до 1,7 ± 0,002 г/л; наибольшие изменения показателей выявлены на 21 сутки (АЧТВ - 75±1 с, МНО -6±0,1, фибриноген 0,9±0,003 г/л). На 28 сутки отмечается их некоторое восстановление (АЧТВ - 55±1 с, МНО - 4±0,1, фибриноген 1,2±0,002 г/л). Коррекция рекомбинантным эритропоэтином способствовала менее выраженному снижению синтетической функции печени после ее резекции. Наиболее выраженные изменения показателей были зарегистрированы на 7 сутки (АЧТВ - 39±1 с, МНО - 2,5±0,02, фибриноген 1,9±0,01 г/л). К 14 суткам показатели восстановились и сохранялись в пределах нормы на всех остальных сроках эксперимента.
Морфологическое исследование выполняли на материале стандартных участков печени, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработку материала производили по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняли с применением системы для сканирования и архивирования изображений МиахЭекк.
Масса печени у интактных животных составила 9,2±0,002 г. В группе ложнооперированных животных показатель не имеет достоверных отличий от такового у интактных животных. Масса печени непосредственно после резекции 2,8±0,003 г. Средняя масса печени животных опытных групп на различных сроках эксперимента представлена в табл. 2.
В группе животных с резекцией печени масса печени на 2 сутки увеличивается в сравнении с массой непосредственно после резекции почти в 2 раза, к 7-м суткам несколько уменьшается, затем начинает увеличиваться, однако на 28 сутки после резекции достоверно меньше массы печени у ин-тактных крыс. В группе животных с резекцией печени и введением рекомби-нантного эритропоэтина масса печени на 2 сутки увеличивается ровно в 2 раза, продолжая расти и достигая массы у интактных животных к 21 суткам.
Таблица 2. Средняя масса печени животных опытных групп (М±т) в граммах на 2, 7, 14, 21 и 28 сутки после операции (соответственно 3, 8, 15, 22 и 29 сутки эксперимента)
Группа | Средняя масса печени граммах | ||||
2-е сутки | 7-е сутки | 14-е сутки | 21-е сутки | 28-е сутки | |
Резекция печени | 5,1 ±0,01* | 4,2±0,01* | 5±0,01* | 5,9±0,01* | 6,3±0,02* |
Резекция печени + ЕРО | 5,4±0,01** | 7,3±0,01** | 8,3±0,01** | 9,3±0,021** | 10,2±0,02** |
Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; ** - р<0,05 в сравнении с группой животных с резекцией печени на соответствующем сроке; ложная операция - лапаротомия с последующим ушиванием передней брюшной стенки на вторые сутки эксперимента; резекция печени осуществлялась в объеме 70% на вторые сутки эксперимента; ЕРО - рекомбинантный эритропоэтин внутрибрюшинно в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.
При микроскопии - на отдаленных сроках в контрольной группе сохранялось неравномерное кровенаполнение сосудов всех типов, наблюдались очаги зернистой дистрофии гепатоцитов, очаги склерозирования и воспалительной инфильтрации портальных трактов. Восстановление печеночной ткани происходило за счет гипертрофии одноядерных гепатоцитов, полиплоидии и амитотического деления двуядерных гепатоцитов. В группе с введением эритропоэтина на отдаленных сроках нарушений микроцир- 3 024137 куляции и признаков повреждения гепатоцитов не выявлено, определяется равномерно выраженная гипертрофия цитоплазмы и ядер гепатоцитов. Восстановление печеночной ткани происходило за счет полиплоидии, амитотического деления двуядерных гепатоцитов и митотического деления одноядерных гепатоцитов, то есть были задействованы все виды регенерации печени. Основная нагрузка приходилась на одноядерные гепатоциты с размером ядра 9 мкм на 2 и 7 сутки, что свидетельствовало о стимуляции генетического аппарата клетки.
Полученные результаты позволяют констатировать возможность стимуляции регенерации резецированной печени у крыс рекомбинантным эритропоэтином.
Claims (1)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯСпособ стимуляции регенерации резецированной печени, отличающийся тем, что резекцию печени осуществляют лабораторному животному на вторые сутки эксперимента в объеме 70%, рекомбинантный эритропоэтин вводят внутрибрюшинно, в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EA201400037A EA024137B1 (ru) | 2013-12-04 | 2013-12-04 | Способ стимуляции регенерации резецированной печени рекомбинантным эритропоэтином |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EA201400037A EA024137B1 (ru) | 2013-12-04 | 2013-12-04 | Способ стимуляции регенерации резецированной печени рекомбинантным эритропоэтином |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201400037A1 EA201400037A1 (ru) | 2015-06-30 |
EA024137B1 true EA024137B1 (ru) | 2016-08-31 |
Family
ID=53488015
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201400037A EA024137B1 (ru) | 2013-12-04 | 2013-12-04 | Способ стимуляции регенерации резецированной печени рекомбинантным эритропоэтином |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
EA (1) | EA024137B1 (ru) |
-
2013
- 2013-12-04 EA EA201400037A patent/EA024137B1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
FRANKLIN Greif et al. Dual Effect of Erythropoietin on Liver Protection and Regeneration after Subtotal Hepatectomy in Rats. Liver Transplantation, 2010, 16, p. 631-638 * |
SCHÖN Michael R. et al. Erythropoietin stimulates hepatocyte regeneration after liver resection. EXCLI Journal, 2008, 7, p. 79-92 * |
VASSILIOU Ioannis et al. The combined effect of erythropoietin and granulocyte macrophage colony stimulating factor on liver regeneration after major hepatectomy in rats. World journal of Surgical Oncology, 2010, 8:57, p. 1-6 * |
КОЛЕСНИК И.М. и др. Фармакологическое прекондиционирование эритропоэтином при ишемии конечности. Биомедицина, 2011, No. 4, с. 90-92 * |
ЭПОКРИН. Инструкция по медицинскому применению препарата, [онлайн][найдено 16.04.2014]. Найдено в Интернете: * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EA201400037A1 (ru) | 2015-06-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Chang et al. | Development of zebrafish epidermis | |
JP2012533545A (ja) | 肝臓の増殖を増大させる方法 | |
Nguyen et al. | A protocol for macrophage depletion and reconstitution in a mouse model of sepsis | |
EP2441462B1 (en) | Method for treating type I diabetes | |
Żarski et al. | Effect of different commercial spawning agents and thermal regime on the effectiveness of pikeperch, Sander lucioperca (L.), reproduction under controlled conditions | |
Svet-Moldavsky | Development of multiple cysts and of haemorrhagic affections of internal organs in albino rats treated during the embryonic or new-born period with Rous sarcoma virus | |
Heggestad et al. | Experiments on the contribution of somatotrophin to prenatal growth in the rat | |
Kleinman | Preparation of basement membrane components from EHS tumors | |
Li et al. | Intranasal oxytocin restores maternal behavior and oxytocin neuronal activity in the supraoptic nucleus in rat dams with cesarean delivery | |
von Schönfeldt et al. | Advanced follicle development in xenografted prepubertal ovarian tissue: the common marmoset as a nonhuman primate model for ovarian tissue transplantation | |
US20210069177A1 (en) | Method for destroying cellular mechanical homeostasis and promoting regeneration and repair of tissues and organs, and use thereof | |
CN107441100A (zh) | 治疗缺血再灌注损伤的化合物 | |
Cheng et al. | Acid-sensing ion channel 3, but not capsaicin receptor TRPV1, plays a protective role in isoproterenol-induced myocardial ischemia in mice | |
Lotz et al. | Does stimulation with human gonadotropins and gonadotropin-releasing hormone agonist enhance and accelerate the developmental capacity of oocytes in human ovarian tissue xenografted into severe combined immunodeficient mice? | |
EA024137B1 (ru) | Способ стимуляции регенерации резецированной печени рекомбинантным эритропоэтином | |
Lücke et al. | Protocol for generating lung and liver metastasis in mice using models that bypass intravasation | |
RU2556609C1 (ru) | Способ стимуляции регенерации резецированной печени l-норвалином | |
McLaughlin | Opioid antagonist modulation of rat heart development | |
EA024104B1 (ru) | Способ стимуляции регенерации резецированной печени дистантным ишемическим прекондиционированием | |
Shaya | The Effects of Dexamethasone on the Histology and Histochemistry of Thyroid Gland in Female Rabbits. | |
Zhang et al. | Mouse double minute 2 actively suppresses p53 activity in oocytes during mouse folliculogenesis | |
CN107625781B (zh) | miRNA抑制子在制备防治心肌梗死药物中的应用 | |
RU2559586C1 (ru) | Способ стимуляции регенерации резецированной печени дигидрокверцетином | |
Yin et al. | Developmental switch from morphological replication to compensatory growth for salamander lung regeneration | |
CN112245582A (zh) | Rab22a基因作为靶标在制备心肌梗死治疗产品中的用途及相关产品 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU |