EA024137B1

EA024137B1 - Способ стимуляции регенерации резецированной печени рекомбинантным эритропоэтином

Info

Publication number: EA024137B1
Application number: EA201400037A
Authority: EA
Inventors: Инга Михайловна Колесник; Михаил Владимирович Покровский; Виктор Анатольевич Лазаренко; Александр Анатольевич Должиков
Priority date: 2013-12-04
Filing date: 2013-12-04
Publication date: 2016-08-31
Also published as: EA201400037A1

Abstract

Изобретение относится к экспериментальной фармакологии и хирургии и может быть использовано для стимуляции регенерации резецированной печени. Для этого лабораторному животному на вторые сутки эксперимента осуществляют резекцию печени в объеме 70%, рекомбинантный эритропоэтин вводят внутрибрюшинно, в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента. Способ обеспечивает эффективную стимуляцию регенерации резецированной печени, подтверждаемую снижением летальности, улучшением микроциркуляции, уменьшением выраженности цитолиза, улучшением синтетической функции печени в сравнении с контрольной группой, а также результатами морфологического исследования.

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и экспериментальной хирургии, и может быть использовано для стимуляции регенерации резецированной печени.

Наиболее близким к заявленному решению является Способ пострезекционной регенерации печени в эксперименте авт. С.П. Чикотеева и др. КИ 2232550. В данном решении проводят предварительную ксенотрансплан-тацию криоконсервированными изолированными гепатоцитами свиньи подкожно в переднюю брюшную стенку. Процедуру осуществляют за 48 ч до операции. Затем интраоперационно непосредственно после резекции 90% печени выполняют трансплантацию таких же клеток под капсулу селезенки.

Недостатками данного метода являются сложность технического выполнения и высокая вероятность развития осложнений при ксенотрансплантации. Кроме того 100% летальность крыс контрольной группы затрудняет проведение эксперимента из-за невозможности сравнения показателей в опытной и контрольной группах животных. По данным большинства исследователей наиболее оптимальной для изучения регенерации печени у крыс является резекция 70% органа.

В каждом живом организме заложены сложные механизмы самосохранения и восстановления. Задача современной медицины изучить и найти способы их активации. В этой связи феномен ишемического прекондиционирования заслуживает самого детального изучения. Эффекты прекондициониро-вания цитопротекция и неоангиогенез, лежащий в основе восстановительных процессов важны в хирургии. Внедрение в практику фармакологических средств, способствующих активации и продлению этого естественного защитного механизма позволит значительно улучшить результаты лечения. Наиболее перспективным для изучения, с нашей точки зрения, является эритропоэтин. Это гликопротеиновый гормон, синтез которого стимулирует гипоксия (Захаров Ю.М., 2007; Райасш Μ., ΒίαηοίαΓάί Р., Саге!й А., 2006).

Период полувыведения эритропоэтина значительно выше, чем у других гуморальных агентов прекондиционирования (аденозин, брадикинин, опиоиды), следовательно, временной интервал периода толерантности к ишемии, инициируемый им, должен быть существенно шире. Кроме того, открытие рецепторов эритропоэтина на мезангиальных клетках и в миокарде, фибробластах мышечной и нервной ткани позволило изучать неэритропоэтические функции гормона (Бакшеев В.И., Коломоец Н.М., 2007; МеШ С., 1аск С, ЬатЪгшок С.Ь. е! а1., 2006; Таоийк Е., Рей Е., Ийоих И. е! а1., 2008). Некоторыми авторами доказано, что применение эритропоэтина в малых дозах не оказывает влияния на показатели периферической крови, в то время как неэритропоэтические функции его сохраняются (Реггагю М. е! а1., 2007).

Доказанная способность стимулировать неоангиогенез (Колесник И.М. 2010), лежащий в основе регенераторных процессов, позволяет предположить эффективность применения рекомбинантного эритропоэтина для стимуляции процесса регенерации резецированной печени.

Основным преимуществом предлагаемого способа является простота исполнения, а также применение препарата в минимальной дозе, не вызывающей побочных эффектов.

Техническим результатом изобретения является разработка способа стимуляции регенерации резецированной печени с помощью рекомбинантного эритропоэтина.

Технический результат достигается тем, что при резекции 70% печени на вторые сутки эксперимента лабораторному животному вводят внутрибрюшинно рекомбинантный эритропоэтин в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.

Способ осуществляется следующим образом.

Опыты проводят на белых крысах линии ХУМаг массой 210-220 г.

Резекция печени производится на вторые сутки в объеме 70%.

Состояние печени оценивается по показателю летальности животных, уровню микроциркуляции, выраженности цитолиза, показателям синтетической функции печени и результатам морфологического исследования в группах интактных животных, ложнооперированных, с резекцией печени и в группе животных с резекцией печени, которым вводился эритропоэтин.

Показатель летальности оценивается в экспериментальных группах животных в первые 10 суток после операции.

Уровень микроциркуляции в печени определяется при помощи оборудования производства компании Вюрас 5У51еш5: полиграфа МР100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии ЕИР100С и поверхностного датчика ТЗИ 140. Регистрация и обработка результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производится с помощью программы Асс|Кпо\у1е<1де версии 4.2., значения микроциркуляции выражают в перфузионных единицах (ПЕ). Запись уровня микроциркуляции осуществляют последовательно по поверхности печени, затем рассчитывают среднее значение. Регистрацию уровня микроциркуляции проводят на 2, 7, 14, 21 и 28 сутки после операции.

Выраженность цитолиза оценивают по уровню показателей АлАТ, АсАТ и ЛДГ в крови экспериментальных животных на 2, 7, 14, 21 и 28 сутки после операции. Показатели определяют УФ-кинетическим методом на автоматизированной системе АИ5800 (Весктап Сои1!ег, США).

Синтетичесую функцию печени оценивают по показателям коагулограммы (АЧТВ, МНО, фибриноген) на 7, 14, 21 и 28 сутки после операции на анализаторе СЗ-20001 (Зуктех, Япония).

Морфологическое исследование выполняется на материале стандартных участков печени, взятых после

- 1 024137 выведения животных из эксперимента. Обработка материала производится по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняются с применением системы для сканирования и архивирования изображений МпахЭекк.

Рекомбнантный эритропоэтин (Эпокрин эпоэтин альфа; ФГУП Государственный научноисследовательский институт особо чистых препаратов Федерального медикобиологического агентства г. Санкт-Петербург, Россия) вводят внутрибрюшинно в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.

При статистической обработке данных рассчитывают среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считают достоверными при р<0,05.

Пример конкретного выполнения

Экспериментальные животные были разделены на следующие группы:

1) интактные животные (п=20)

2) ложнооперированные животные (п=20);

3) резекция печени (п=50);

4) резекция печени + рекомбинантный эритропоэтин (п=50).

Резекцию печени производили лабораторным животным на вторые сутки эксперимента в объёме 70%. Крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением комбинации хлоралгидрата и золетила. После наркотизации крысу фиксировали в положении на спине. Шерсть на брюшке тщательно выстригали, кожу обрабатывали 70% раствором этилового спирта. Срединную лапаротомию выполняли от мечевидного отростка длиной 4 см. Печень мобилизовывали посредством пересечения связок. Удаляли левую и медиальную доли после предварительного лигирования сосудов. Лапаротомное отверстие ушивали после санации брюшной полости и контроля гемостаза послойно узловым швом.

Стимуляцию регенерации печени проводили у животных 4-й группы внутрибрюшинным введением рекомбинантного эритропоэтина в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.

Показатель летальности оценивали в экспериментальных группах животных в первые 10 суток после операции. В группе животных с резекцией печени он составил 40%, в группе животных с резекцией печени и введением рекомбинантного эритропоэтина летальных исходов не было.

Уровень микроциркуляции в печени определяли при помощи оборудования производства компании Βίорас 8у81еш8: полиграфа МР100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии ЬПР100С и поверхностного датчика ΤδΌ 140 на 2, 7, 14, 21 и 28 сутки после операции. Регистрацию и обработку результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производили с помощью программы АсдКпоМебде версии 4.2., значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ). Запись кривой уровня микроциркуляции осуществляли по всей поверхности печени в течение 30 с в каждой точке. Из полученных значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в печени у данного животного. Из полученных значений рассчитывали среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в данной группе животных на данном сроке исследования.

В группе интактных животных уровень микроциркуляции в печени составил 877±17 ПЕ. Результаты оценки уровня микроциркуляции у животных опытных групп представлены в табл. 1.

Среднее значение уровеня микроциркуляции в печени ложнооперированных животных на всех сроках не имеет достоверных отличий от такового у интактных крыс.

После резекции печени показатель снижается на 50% и остается на прежнем уровне первые 14 суток. К 21 суткам показатель начинает расти, однако на 28-е сутки среднее значение уровня микроциркуляции в резецированной печени крыс достоверно ниже такового у интактных животных.

Введение рекомбинантного эритропоэтина способствовало сохранению кровотока в резецированной печени на довольно высоком уровне (показатель снижается на 15%) и восстановлению его на сроке до 21-х суток после резекции.

Таблица 1. Результаты оценки уровня микроциркуляции в печени животных опытных групп (М±т) в перфузионных единицах на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28 сутки после операции (соответственно 3, 8, 15, 22 и 29 сутки эксперимента)

Группа	Уровень микроциркуляции в печени в перфузионных единицах
2-е сутки	7-е сутки	14-е сутки	21-е сутки	28-е сутки
Ложнооперированные	881±14	860±19	872±21	875±9	880±12
Резекция печени	421±14*	429±9*	501±11*	591±17*	637±19*
Резекция печени + ЕРО	740±19**	738±18**	783±14**	933±21**	1110±31**

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; ** - р<0,05 в сравнении с группой животных с резекцией печени на соответствующем сроке; ложная операция - лапаротомия с последующим ушиванием передней брюшной стенки на вторые сутки эксперимента; резекция печени осуществля- 2 024137 лась в объеме 70% на вторые сутки эксперимента; ЕРО - рекомбинантный эритропоэтин внутрибрюшинно в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.

Выраженность цитолиза оценивали по уровню показателей АлАТ, АсАТ и ЛДГ в крови экспериментальных животных на 2, 7, 14 21, 28 сутки после операции. Показатели определяли УФ-кинетическим методом на автоматизированной системе АИ5800 (Весктап СоиИет, США).

АлАТ в контрольной группе на 2 сутки 108±4 МЕ/л снижается до нормальных показателей к 21 суткам - 38±2 МЕ/л, в группе с эритропоэтином на 2 сутки - 60±2 МЕ/л нормализуется на 7 сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.

АсАТ в контрольной группе на 2 сутки 184±7 МЕ/л снижается до нормальных показателей к 21 суткам, в группе с эритропоэтином на 2 сутки - 82±3 МЕ/л нормализуется на 14 сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.

ЛДГ в контрольной группе на 2 сутки 564±3 МЕ/л снижается до нормальных показателей к 28 суткам - 250±6 ЕД/л, в группе с эритропоэтином на 2 сутки - 300±8 МЕ/л нормализуется на 7 сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.

Синтетическую функцию печени оценивали по показателям коагулограммы (АЧТВ, МНО, фибриноген) на 7, 14, 21 и 28 сутки после операции на анализаторе С8-20001 (8уктех, Япония).

На 7 сутки после резекции печени отмечено снижение синтетической функции, проявляющееся удлинением АЧТВ до 60±1 с, увеличением МНО до 4±0,2, снижением уровня фибриногена до 1,7 ± 0,002 г/л; наибольшие изменения показателей выявлены на 21 сутки (АЧТВ - 75±1 с, МНО -6±0,1, фибриноген 0,9±0,003 г/л). На 28 сутки отмечается их некоторое восстановление (АЧТВ - 55±1 с, МНО - 4±0,1, фибриноген 1,2±0,002 г/л). Коррекция рекомбинантным эритропоэтином способствовала менее выраженному снижению синтетической функции печени после ее резекции. Наиболее выраженные изменения показателей были зарегистрированы на 7 сутки (АЧТВ - 39±1 с, МНО - 2,5±0,02, фибриноген 1,9±0,01 г/л). К 14 суткам показатели восстановились и сохранялись в пределах нормы на всех остальных сроках эксперимента.

Морфологическое исследование выполняли на материале стандартных участков печени, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработку материала производили по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняли с применением системы для сканирования и архивирования изображений МиахЭекк.

Масса печени у интактных животных составила 9,2±0,002 г. В группе ложнооперированных животных показатель не имеет достоверных отличий от такового у интактных животных. Масса печени непосредственно после резекции 2,8±0,003 г. Средняя масса печени животных опытных групп на различных сроках эксперимента представлена в табл. 2.

В группе животных с резекцией печени масса печени на 2 сутки увеличивается в сравнении с массой непосредственно после резекции почти в 2 раза, к 7-м суткам несколько уменьшается, затем начинает увеличиваться, однако на 28 сутки после резекции достоверно меньше массы печени у ин-тактных крыс. В группе животных с резекцией печени и введением рекомби-нантного эритропоэтина масса печени на 2 сутки увеличивается ровно в 2 раза, продолжая расти и достигая массы у интактных животных к 21 суткам.

Таблица 2. Средняя масса печени животных опытных групп (М±т) в граммах на 2, 7, 14, 21 и 28 сутки после операции (соответственно 3, 8, 15, 22 и 29 сутки эксперимента)

Группа	Средняя масса печени граммах
2-е сутки	7-е сутки	14-е сутки	21-е сутки	28-е сутки
Резекция печени	5,1 ±0,01*	4,2±0,01*	5±0,01*	5,9±0,01*	6,3±0,02*
Резекция печени + ЕРО	5,4±0,01**	7,3±0,01**	8,3±0,01**	9,3±0,021**	10,2±0,02**

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; ** - р<0,05 в сравнении с группой животных с резекцией печени на соответствующем сроке; ложная операция - лапаротомия с последующим ушиванием передней брюшной стенки на вторые сутки эксперимента; резекция печени осуществлялась в объеме 70% на вторые сутки эксперимента; ЕРО - рекомбинантный эритропоэтин внутрибрюшинно в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.

При микроскопии - на отдаленных сроках в контрольной группе сохранялось неравномерное кровенаполнение сосудов всех типов, наблюдались очаги зернистой дистрофии гепатоцитов, очаги склерозирования и воспалительной инфильтрации портальных трактов. Восстановление печеночной ткани происходило за счет гипертрофии одноядерных гепатоцитов, полиплоидии и амитотического деления двуядерных гепатоцитов. В группе с введением эритропоэтина на отдаленных сроках нарушений микроцир- 3 024137 куляции и признаков повреждения гепатоцитов не выявлено, определяется равномерно выраженная гипертрофия цитоплазмы и ядер гепатоцитов. Восстановление печеночной ткани происходило за счет полиплоидии, амитотического деления двуядерных гепатоцитов и митотического деления одноядерных гепатоцитов, то есть были задействованы все виды регенерации печени. Основная нагрузка приходилась на одноядерные гепатоциты с размером ядра 9 мкм на 2 и 7 сутки, что свидетельствовало о стимуляции генетического аппарата клетки.

Полученные результаты позволяют констатировать возможность стимуляции регенерации резецированной печени у крыс рекомбинантным эритропоэтином.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ стимуляции регенерации резецированной печени, отличающийся тем, что резекцию печени осуществляют лабораторному животному на вторые сутки эксперимента в объеме 70%, рекомбинантный эритропоэтин вводят внутрибрюшинно, в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.