EA024104B1

EA024104B1 - Способ стимуляции регенерации резецированной печени дистантным ишемическим прекондиционированием

Info

Publication number: EA024104B1
Application number: EA201400036A
Authority: EA
Inventors: Инга Михайловна Колесник; Михаил Владимирович Покровский; Виктор Анатольевич Лазаренко; Александр Анатольевич Должиков
Priority date: 2013-12-04
Filing date: 2013-12-04
Publication date: 2016-08-31
Also published as: EA201400036A1

Abstract

Изобретение относится к экспериментальной хирургии и может быть использовано для стимуляции регенерации резецированной печени. Для этого лабораторному животному на вторые сутки эксперимента осуществляют резекцию печени в объеме 70%, дистантное ишемическое прекондиционирование проводят 10-минутным пережатием бедренной артерии, посредством наложения жгута на верхнюю треть левого бедра на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента. Способ обеспечивает эффективную стимуляцию регенерации резецированной печени, подтверждаемую снижением летальности, улучшением микроциркуляции, уменьшением выраженности цитолиза, улучшением синтетической функции печени в сравнении с контрольной группой, а также результатами морфологического исследования.

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для стимуляции регенерации резецированной печени.

Наиболее близким к заявленному решению является Способ пострезекционной регенерации печени в эксперименте авт. С.П. Чикотеева и др. (КИ 2232550). В данном решении проводят предварительную ксенотрансплантацию криоконсервированными изолированными гепатоцитами свиньи подкожно в переднюю брюшную стенку. Процедуру осуществляют за 48 ч до операции. Затем интраоперационно непосредственно после резекции 90% печени выполняют трансплантацию таких же клеток под капсулу селезенки.

Недостатками данного метода являются сложность технического выполнения и высокая вероятность развития осложнений при ксенотрансплантации. Кроме того, 100% летальность крыс контрольной группы затрудняет проведение эксперимента из-за невозможности сравнения показателей в опытной и контрольной группах животных. По данным большинства исследователей наиболее оптимальной для изучения регенерации печени у крыс является резекция 70% органа.

Во всех живых организмах заложены сложные механизмы самосохранения и восстановления. Задача современной медицины изучить и найти способы их активации. Вот почему феномен ишемического прекондиционирования заслуживает самого детального изучения. Эффекты прекондиционирования цитопротекция и неоангиогенез, лежащий в основе восстановительных процессов, важны в хирургии. Доказанная способность стимулировать неоангиогенез (Колесник И.М., 2010), позволяет предположить эффективность применения дистантного ишемического прекондиционирования для стимуляции процесса регенерации органов и тканей, в том числе резецированной печени.

Основным преимуществом предлагаемого способа является простота исполнения, а также отсутствие необходимости применения фармакологических препаратов.

Техническим результатом изобретения является разработка способа стимуляции регенерации резецированной печени с помощью дистантного ишемического прекондиционирования.

Технический результат достигается тем, что при резекции 70% печени на вторые сутки эксперимента, лабораторному животному проводят дистантное ишемическое прекондиционирование 10-минутным пережатием бедренной артерии, посредством наложения жгута на верхнюю треть левого бедра, на первые четвертые и седьмые сутки эксперимента.

Способ осуществляется следующим образом.

Опыты проводят на белых крысах линии \УШ1аг массой 210-220 г.

Резекция печени производится на вторые сутки в объеме 70%.

Состояние печени оценивается по показателю летальности животных, уровню микроциркуляции, выраженности цитолиза, состоянию синтетической функции печени и результатам морфологического исследования в группах интактных животных, ложнооперированных, с резекцией печени и в группе животных с резекцией печени, которым проводилось дистантное ишемическое прекондиционирование.

Показатель летальности оценивается в экспериментальных группах животных в первые 10 суток после операции.

Уровень микроциркуляции в резецированной печени определяется при помощи оборудования производства компании Вюрас куЧепъ: полиграфа МР100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии ЬЭР100С и поверхностного датчика ΤδΌ 140. Регистрация и обработка результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производится с помощью программы АсцКпоШебде версии 4.2., значения микроциркуляции выражают в перфузионных единицах (ПЕ). Запись уровня микроциркуляции осуществляют последовательно по поверхности печени, затем рассчитывают среднее значение. Регистрацию уровня микроциркуляции проводят на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки после операции.

Выраженность цитолиза оценивают по уровню показателей АлАТ, АсАТ и ЛДГ в крови экспериментальных животных на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки после операции. Показатели определяют УФ кинетическим методом на автоматизированной системе АИ5800 (Весктап СоиНег, США).

Синтетическую функцию печени оценивают по показателям коагулограммы (АЧТВ, МНО, фибриноген) на 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки после операции на анализаторе С8-20001 (§уктех, Япония).

Морфологическое исследование выполняется на материале стандартных участков печени, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработка материала производится по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняются с применением системы для сканирования и архивирования изображений МшахЭекк.

Дистантное ишемическое прекондиционирование (ДИП) проводят 10-минутным пережатием бедренной артерии, посредством наложения жгута на верхнюю треть левого бедра, на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.

При статистической обработке данных рассчитывают среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считают достоверными при р<0,05.

Пример конкретного выполнения.

Экспериментальные животные были разделены на следующие группы:

1) интактные животные (п=20);

- 1 024104

2) ложнооперированные животные (п=20);

3) резекция печени (п=50);

4) резекция печени + ДИП (п=50).

Резекцию печени производили лабораторным животным на вторые сутки эксперимента в объёме 70%. Крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением комбинации хлоралгидрата и золетила. После наркотизации крысу фиксировали в положении на спине. Шерсть на брюшке тщательно выстригали, кожу обрабатывали 70% раствором этилового спирта. Срединную лапаротомию выполняли от мечевидного отростка длиной 4 см. Печень мобилизовывали посредством пересечения связок. Удаляли левую и медиальную доли после предварительного лигирования сосудов. Лапаротомное отверстие ушивали после санации брюшной полости и контроля гемостаза послойно, узловым швом.

Стимуляцию регенерации печени проводили у животных 4-й группы 10-минутным пережатием бедренной артерии, посредством наложения жгута на верхнюю треть левого бедра на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.

Показатель летальности оценивали в экспериментальных группах животных в первые 10 суток после операции. В группе животных с резекцией печени он составил 40%, в группе животных с резекцией печени и проведением дистантного ишемического прекондиционирования - 15%.

Уровень микроциркуляции в печени определяли при помощи оборудования производства компании Вюрас 8у81етз: полиграфа МР100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии Ь0Р100С и поверхностного датчика ΤδΌ 140 на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки после операции. Регистрацию и обработку результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производили с помощью программы АсдКпоШебде версии 4.2., значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ). Запись кривой уровня микроциркуляции осуществляли по всей поверхности печени в течение 30 с в каждой точке. Из полученных значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в печени у данного животного. Из полученных значений рассчитывали среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в данной группе животных на данном сроке исследования.

В группе интактных животных уровень микроциркуляции в печени составил 877±17 ПЕ. Результаты оценки уровня микроциркуляции у животных опытных групп представлены в табл. 1.

Таблица 1

Результаты оценки уровня микроциркуляции в печени животных опытных групп (М±т) в перфузионных единицах на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки после операции (соответственно 3-и, 8-е, 15-е, 22-е и 29-е сутки эксперимента)

Группа	Уровень микроциркуляции в печени в перфузионных единицах
2-е сутки	7-е сутки	14-е сутки	21-е сутки	28-е сутки
Ложнооперированные	881+14	860+19	872+21	875+9	880+12
Резекция печени	421+14*	429+9*	501±И*	591+17*	637+19*
Резекция печени + ДИП	738+17**	730+15**	764+19**	9П±20**	1000+25**

Примечание:

* - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных;

** - р<0,05 в сравнении с группой животных с резекцией печени на соответствующем сроке;

ложная операция - лапаротомия с последующим ушиванием передней брюшной стенки на вторые сутки эксперимента;

резекция печени осуществлялась в объеме 70% на вторые сутки эксперимента;

ДИП - дистантное ишемическое прекондиционирование - 10-минутное пережатие бедренной артерии, посредством наложения жгута на верхнюю треть левого бедра, на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.

Среднее значение уровня микроциркуляции в печени ложнооперированных животных на всех сроках не имеет достоверных отличий от такового у интактных крыс.

После резекции печени показатель снижается на 50% и остается на прежнем уровне первые 14 суток. К 21 суткам показатель начинает расти, однако на 28-е сутки среднее значение уровня микроциркуляции в резецированной печени крыс достоверно ниже такового у интактных животных.

Проведение дистантного ишемического прекондиционирования способствовало сохранению кровотока в резецированной печени на довольно высоком уровне (показатель снижается на 16%) и восстановлению его на сроке до 21-х суток после резекции.

Выраженность цитолиза оценивали по уровню показателей АлАТ, АсАТ и ЛДГ в крови экспериментальных животных на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е, 28-е сутки после операции. Показатели определяли УФ кинетическим методом на автоматизированной системе АИ5800 (Весктап СоиИег, США).

АлАТ в контрольной группе на 2-е сутки 108±4 МЕ/л - снижается до нормальных показателей к 21

- 2 024104 суткам - 38±2 МЕ/л, в группе с проведением дистантного ишемического прекондиционирования на 2-е сутки - 62±1 МЕ/л - нормализуется на 7-е сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.

АсАТ в контрольной группе на 2-е сутки 184±7 МЕ/л - снижается до нормальных показателей к 21 суткам, в группе с проведением дистантного ишемического прекондиционирования на 2-е сутки - 84±3 МЕ/л - нормализуется на 14-е сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.

ЛДГ в контрольной группе на 2-е сутки 564±9 МЕ/л - снижается до нормальных показателей к 28 суткам - 250±6 ЕД/л, в группе с проведением дистантного ишемического прекондиционирования на 2-е сутки - 300±8 МЕ/л - нормализуется на 7-е сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.

Синтетическую функцию печени оценивали по показателям коагулограммы (АЧТВ, МНО, фибриноген) на 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки после операции на анализаторе С8-20001 (8узтех, Япония).

На 7-е сутки после резекции печени отмечается снижение синтетической функции, проявляющееся удлинением АЧТВ до 60±1 с, увеличение МНО до 4±0,2, снижением уровня фибриногена до 1,7±0,002 г/л. Наиболее выраженные изменения показателей выявлены на 21-е сутки (АЧТВ - 75±1 с, МНО - 6±0,1, фибриноген 0,9±0,003 г/л). На 28 сутки отмечается их некоторое восстановление (АЧТВ - 55±1 с, МНО 4±0,1, фибриноген 1,2±0,002 г/л). Коррекция дистантным ишемическим прекондиционированием способствовала менее выраженному снижению синтетической функции печени после ее резекции. Наиболее выраженные изменения показателей были зарегистрированы на 7-е сутки (АЧТВ - 40±1 с, МНО 2,7±0,02, фибриноген 1,8±0,01 г/л). К 14-м суткам показатели восстановились и сохранялись в пределах нормы на всех остальных сроках эксперимента.

Морфологическое исследование выполняли на материале стандартных участков печени, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработку материала производили по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняли с применением системы для сканирования и архивирования изображений МиахЭезк.

Масса печени у интактных животных составила 9,2±0,002 г. В группе ложнооперированных животных показатель не имеет достоверных отличий от такового у интактных животных. Масса печени непосредственно после резекции 2,8±0,003 г. Средняя масса печени животных опытных групп на различных сроках эксперимента представлена в табл. 2.

В группе животных с резекцией печени масса печени на 2-е сутки увеличивается в сравнении с массой непосредственно после резекции почти в 2 раза, к 7-м суткам несколько уменьшается, затем начинает увеличиваться, однако на 28-е сутки после резекции достоверно меньше массы печени у интактных крыс. В группе животных с резекцией печени и проведением дистантного ишемического прекондиционирования масса печени на 2-е сутки увеличивается ровно в 2 раза, продолжая расти и достигая массы у интактных животных к 28 суткам.

Таблица 2

Средняя масса печени животных опытных групп (М±т) в граммах на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки после операции (соответственно 3-и, 8-е, 15-е, 22-е и 29-е сутки эксперимента)

Группа	Средняя масса печени граммах
2-е сутки	7-е сутки	14-е сутки	21-е сутки	28-е сутки
Резекция печени	5,1±0,01*	4,2±0,01*	5±0,01*	5,9±0,01*	6,3±0,02*
Резекция печени + ДИП	5,3±О,О1**	7,1±0,01**	8,0±0,01**	8,5±0.021**	9,2±0,02**

Примечание:

При микроскопии на отдаленных сроках в контрольной группе сохранялось неравномерное кровенаполнение сосудов всех типов, наблюдались очаги зернистой дистрофии гепатоцитов, очаги склерозирования и воспалительной инфильтрации портальных трактов. Восстановление печеночной ткани происходило за счет гипертрофии одноядерных гепатоцитов, полиплоидии и амитотического деления двуядерных гепатоцитов. В группе с введением эритропоэтина на отдаленных сроках нарушений микроцир- 3 024104 куляции и признаков повреждения гепатоцитов не выявлено, определяется равномерно выраженная гипертрофия цитоплазмы и ядер гепатоцитов. Восстановление печеночной ткани происходило за счет полиплоидии, амитотического деления двуядерных гепатоцитов и митотического деления одноядерных гепатоцитов, т.е. были задействованы все виды регенерации печени. Основная нагрузка приходилась на одноядерные гепатоциты с размером ядра 9 мкм на 2-е и 7-е сутки, что свидетельствовало о стимуляции генетического аппарата клетки.

Полученные результаты позволяют констатировать возможность стимуляции регенерации резецированной печени у крыс дистантным ишемическим прекондиционированием.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ стимуляции регенерации резецированной печени, отличающийся тем, что резекцию печени осуществляют лабораторному животному на вторые сутки эксперимента в объеме 70%, дистантное ишемическое прекондиционирование проводят 10-минутным пережатием бедренной артерии, посредством наложения жгута на верхнюю треть левого бедра на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.