EA021168B1 - Пегилированная l-аспарагиназа - Google Patents

Пегилированная l-аспарагиназа Download PDF

Info

Publication number
EA021168B1
EA021168B1 EA201270134A EA201270134A EA021168B1 EA 021168 B1 EA021168 B1 EA 021168B1 EA 201270134 A EA201270134 A EA 201270134A EA 201270134 A EA201270134 A EA 201270134A EA 021168 B1 EA021168 B1 EA 021168B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
asparaginase
conjugate
peg
activity
protein
Prior art date
Application number
EA201270134A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201270134A1 (ru
Inventor
Тьерри Абриба
Original Assignee
Ализе Фарма Ii
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ализе Фарма Ii filed Critical Ализе Фарма Ii
Publication of EA201270134A1 publication Critical patent/EA201270134A1/ru
Publication of EA021168B1 publication Critical patent/EA021168B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01001—Asparaginase (3.5.1.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Описан конъюгат белка, обладающего значительной аминогидролазной активностью в отношении L-аспарагина, и полиэтиленгликоля. В частности, полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да, а белок представляет собой L-аспарагиназу из Erwinia. Конъюгат по изобретению продемонстрировал превосходные качества, например, сохранение высокого уровня активности in vitro и неожиданное возрастание времени полувыведения in vivo. Также описаны способы получения конъюгата и использования конъюгата в терапии. В частности, описан способ использования конъюгата в лечении рака, особенно острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ). Более конкретно, описан способ использования конъюгата в качестве терапии второй линии для пациентов, у которых развилась гиперчувствительность или у которых случился рецидив заболевания после лечения другими препаратами L-аспарагиназы.

Description

Настоящее изобретение относится к конъюгату белка, обладающего значительной аминогидролазной активностью в отношении Ь-аспарагина, и полиэтиленгликоля, особенно когда полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да, в частности к конъюгату, в котором белок представляет собой Ь-аспарагиназу из ΕΓ^ίηία. и его использованию в терапии.
Уровень техники
Белки с аминогидролазной активностью в отношении Ь-аспарагина, обычно известные как Ьаспарагиназы, на протяжении многих лет успешно использовались для лечения острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) у детей. ОЛЛ является наиболее распространенным злокачественным заболеванием у детей (Лугаш18 апй Рапокуап, С’Пп. Ркагшасокше!. (2005) 44: 367-393).
Ь-аспарагиназу также использовали для лечения болезни Ходжкина, острого миелолейкоза, острого миеломоноцитарного лейкоза, хронического лимфолейкоза, лимфосаркомы, ретикулосаркомы и меланомы (КоШа апй ЬаЬгои, 1. Вю!ескпо1. 127 (2007) 657-669). Противоопухолевая активность Ь-аспарагиназы, как полагают, объясняется неспособностью или пониженной способностью некоторых злокачественных клеток синтезировать Ь-аспарагин (КоШа апй ЬаЬгои, 1. Вю!ескпо1. 127 (2007) 657-669). Эти злокачественные клетки нуждаются во внеклеточном источнике Ь-аспарагина. Однако фермент Ь-аспарагиназа катализирует гидролиз Ь-аспарагина до аспарагиновой кислоты и аммиака, тем самым истощая пул циркулирующего Ь-аспарагина и уничтожая опухолевые клетки, не способные осуществлять синтез белка без Ь-аспарагина (КоШа апй ЬаЬгои, 1. Вю!ескпо1. 127 (2007) 657-669).
Ь-аспарагиназа из Е. сой была первым ферментативным лекарственным средством, использованным в терапии ОЛЛ, и была выведена на рынок под торговой маркой Е1краг® в США или под торговыми марками К1йго1аке® и Ь-аспарагиназа Мейас® в Европе. Ь-аспарагиназы также были выделены из других микроорганизмов, например, белок Ь-аспарагиназа из Егунйа скгукаШкетг названный кризантаспаза, продающийся на рынке под торговой маркой Егушаке® (АпкЮп 1г., ТС. (1985) Ь-акрагадшаке, Ме!к. Еп/уто1. 113, 608-618; Соуагй, СК. е! а1. (1992) КарЮ 1агде кса1е ргерагакоп о! гесотЬтап! Егунпа скгукап!кет1 Ь-акрагад1паке, Вюкерагакоп 2, 335-341). Были также идентифицированы Ь-аспарагиназы из других видов Егу1ша, включая, например, Егунпа скгукаШкепп 3937 (регистрационный № в СепЬапк АА867028), Егунпа скгукаШкепп ЫСРРВ 1125 (регистрационный № в СепЬапк САА31239), Егунйа сагоЮуога (регистрационный № в СепЬапк ААР92666) и Егузша сагоЮуога подвид АкЕокерОса (регистрационный № в СепЬапк АА867027). Эти Ь-аспарагиназы из Егуппа скгукаШкепп имеют между собой приблизительно 91-98% идентичности аминокислотной последовательности, тогда как Ь-аспарагиназы из ЕгугШа сагоЮуога имеют приблизительно 75-77% идентичности аминокислотной последовательности с Ь-аспарагиназами из Егуппа скгукаШкепп (КоШа апй ЬаЬгои, 1. Вю!ескпо1. 127 (2007) 657-669).
Ь-аспарагиназы бактериального происхождения обладают сильным иммуногенным и антигенным потенциалом и часто вызывают побочные реакции, начиная с легких аллергических реакций до анафилактического шока у сенсибилизированных пациентов (Аапд, В. е! а1. (2003) Еуа1иаОоп о! пппшпоЮдю сгокк геаскоп о! апк-акрагад1паке апкЬой1ек т аси!е 1утркоЬ1аккс 1еикеппа (АЬЬ апй 1утркота ракеп!к), Ьеикет1а 17, 1583-1588). Ь-аспарагиназа из Е. сок особенно иммуногенна, сообщалось, что частота появления анти-аспарагиназных антител к Ь-аспарагиназе Е. сок после в/в или в/м введения достигала 78% у взрослых и 70% у детей (Аапд, В. е! а1. (2003) Ьеикеш1а 17, 1583-1588).
Ь-аспарагиназы из ЕкскепсЫа сок и Егуппа скгукап!кеш1 различаются по своим фармакокинетическим свойствам и имеют различные профили иммуногенности, соответственно (К1ид А1Ьейкеп, В. е! а1. (2001) Сотрапкоп о! ш!гатикси1аг Легару У!к Егуппа акрагадшаке апй акрагадшаке Мейас: ркагтасокк пекск, ркагтасойупатюк, !огта!юп о! апОЬоЛек апй 1пйиепсе оп !ке соади1а!юп кук!ет, Вгк. 1. Наета!о1. 115, 983-990). Кроме того, показано, что антитела, которые развивались после лечения Ь-аспарагиназой из Е. сок, перекрестно не реагируют с Ь-аспарагиназой из Егу1Ша (Аапд, В. е! а1., Ьеикеш1а 17 (2003) 1583-1588). Таким образом, Ь-аспарагиназу из Егуша (кризантаспазу) использовали в качестве терапии второй линии у пациентов с ОЛЛ, у которых развивалась реакция на Ь-аспарагиназу Е. сок (Пиуа1, М. е! а1. (2002) Сотрапкоп о! ЕкскепсШа сок-акрагад1паке укк Егуппа-акрагадтаке ш !ке !геа!теп! о! скййкоой 1утрко1й такдпапшек: гекикк о! а гапйопп/ей Еигореап ОгдаШкакоп !ог Кекеагск апй Тгеа!теп! о! Сапсег, СкЛйгеп'к Ьеикет1а Сгоир ркаке 3 кта1, В1оой 15, 2734-2739; Аугатк апй Рапокуап, Скп. Ркагтасокше!. (2005) 44: 367-393).
С очередной попыткой уменьшить иммуногенность, связанную с введением микробных Ьаспарагиназ, была создана Ь-аспарагиназа Е. сок, модифицированная с помощью метоксиполиэтиленгликоля (мПЭГ) (тРЕС). Этот метод широко известен как пегилирование и было показано, что он изменяет иммунологические свойства белков (АЬискоуккц А. е! а1. (1977) Акегакоп о! 1шшипо1одюа1 Ргорегкек о! Воуше 8егит А1Ьитт Ьу Соуа1еп! Акасктеп! о! Ро1уе!ку1епе С1усо1, 1. Вю1. Скет. 252 (11), 35783581). Эта так называемая мПЭГ-Ь-аспарагиназа, или пегаспаргаза, продаваемая под торговой маркой Опсакраг® (Еп/оп 1пс., И8А), была впервые одобрена в США для терапии второй линии от ОЛЛ в 1994 г. и была одобрена для терапии первой линии от ОЛЛ у детей и взрослых с 2006 г. Опсакраг® имеет длительное время полувыведения ш У1уо и пониженную иммуногенность/антигенность.
- 1 021168
Опсакраг® представляет собой Ь-аспарагиназу Е. сой, модифицированную по множественным остаткам лизина с помощью 5-кДа мПЭГ-сукцинимидилсукцината (СС-ПЭГ) (δδ-РЕО) (патент США № 4179337). СС-ПЭГ представляет собой реагент ПЭГ первого поколения, содержащий нестабильную сложноэфирную связь, чувствительную к гидролизу ферментами или при слабощелочных значениях рН (патент США № 4670417; Макгото1. Сйет. 1986, 187, 1131-1144). Эти свойства снижают стабильность как ίη νίίτο, так и ίη νίνο и могут отрицательно сказываться на безопасности лекарственного средства.
Кроме того, показано, что антитела, развивающиеся против Ь-аспарагиназы из Е. сой, перекрестно реагируют с Опсакраг® (\Уапд. В. е! а1. (2003) Еуа1найоп о! 1ттипо1одю сгокк-геасйоп о! апй-акратад1паке апйЪоФек ш аси!е 1ушркоЪ1акйс 1еикепиа (АЕЬ апй 1утрйота райеШк), Бенкеина 17, 1583-1588). Даже если эти антитела не являются нейтрализующими, данный факт четко продемонстрировал высокий потенциал для перекрестной гиперчувствительности или перекрестной инактивации ш νί\Ό. Действительно, согласно одному из отчетов, 30-41% детей, получавших пегаспаргазу, имели аллергическую реакцию (№апд, В. е! а1. (2003) Ееикепиа 17, 1583-1588).
В дополнение к внешним аллергическим реакциям недавно также появилось сообщение о проблеме латентной гиперчувствительности, когда у пациентов развиваются анти-аспарагиназные антитела без видимых клинических проявлений реакции гиперчувствительности (\Уапд, В. е! а1. (2003) Ьеикет1а 17, 1583-1588). Такая реакция может приводить к образованию нейтрализующих антител к Ь-аспарагиназе Е. сой и пегаспаргазе; однако данных пациентов не переводят на Ь-аспарагиназу из Етдаша, поскольку отсутствуют внешние признаки гиперчувствительности, и, следовательно, они имеют меньшую продолжительность эффективного лечения (Но1сепЪегд, ί., ί. РеФай. Нета!о1. Опсо1. 26 (2004) 273-274).
Лечение Ь-аспарагиназой из Егуйиа скгукаШкепи часто используют в случае гиперчувствительности к Ь-аспарагиназам из Е. сой. Однако было отмечено, что 30-50% пациентов, получающих Ьаспарагиназу из Ету1ша, были положительными по наличию антител (Аугапик апй Рапокуап, Сйп. Ркагшасокшей (2005) 44: 367-393). Более того, поскольку Ь-аспарагиназа из Егуйиа скгукаШкепи имеет значительно более короткое время полувыведения, чем Ь-аспарагиназы из Е. сой, ее необходимо вводить более часто (Ауташ1к апй Рапокуап, Сйп. РкатшасоктеЬ (2005) 44: 367-393). В исследовании Аугапик с соавторами аспарагиназа из Епуййа отличалась худшими по качеству фармакокинетическими профилями (Аутатщ е! а1., ί. Рей1а1т. Нета!о1. Опсо1. 29 (2007) 239-247). Вследствие этого, Ь-аспарагиназе из Е. сой и пегаспаргазе было отдано предпочтение в качестве терапии первой линии при ОЛЛ перед Ьаспарагиназой из Егуйиа.
За многие годы множество биофармацевтических препаратов было успешно пегилировано и выведено на рынок. Для присоединения ПЭГ к белку ПЭГ нужно активировать на его ОН-конце. Активирующую группу выбирают на основании доступной реакционноспособной группы на белке, который предстоит пегилировать. В случае белков наиболее важными аминокислотами являются лизин, цистеин, глютаминовая кислота, аспарагиновая кислота, С-концевая карбоновая кислота и Ν-концевая аминогруппа. Учитывая широкий спектр реакционноспособных групп в белках, почти все методы белковой химии применяют для активации фрагмента ПЭГ. Примерами реагентов для таких активированных ПЭГ являются активированные карбонаты, например, п-нитрофенилкарбонат, сукцинимидилкарбонат; активные сложные эфиры, например, сукцинимидильные сложные эфиры; и для сайт-специфического присоединения разработаны альдегиды и малеимиды (Натк, М., Айу. Эгид Ье1. Кеу. 54 (2002), 459-476). Наличие различных химических методов для ПЭГ-модификации показывает, что каждая новая разработка пегилированного белка будет отличаться индивидуальным подходом. Помимо химических методов, сильное влияние на фармацевтические свойства пегилированного белка оказывает молекулярная масса ПЭГ, присоединенного к белку. В большинстве случаев предполагается, что, чем выше молекулярная масса ПЭГ, тем больше улучшаются фармацевтические свойства (Бйеттап, М.К., Айу. Эгид Ье1. Кеу. 60 (2008), 59-68; НоЙкЪетд, Р. 1оигпа1 о! Соп!го11ей Ке1еаке 80 (2002), 259-271). Например, НоЙкЪегд с соавторами обнаружили, что, когда РЕО конъюгируют с аргининдезаминазой, другим разрушающим аминокислоту ферментом, выделенным из микробного источника, фармакокинетические и фармакодинамические функции фермента возрастают с увеличением размера присоединенного ПЭГ от молекулярной массы 5000 до 20000 Да (НоЙкЪетд, Р.^., 1оигпа1 о! Соп!го11ей Ке1еаке 80 (2002), 259-271).
Однако во многих случаях пегилированные биофармацевтические препараты демонстрируют существенно сниженную активность по сравнению с немодифицированными биофармацевтическими препаратами (РщйЪитп, С.8. (2008) обзор Тке Ркагтасо1оду о! РЕОу1айоп: Ва1апсшд РЬ уйй РК !о Оепега!е №те1 Тйетареийск, ί. Ркагт. δει., 1-17). В случае Ь-аспарагиназы из Етота сагоЮуога было обнаружено, что пегилирование снижало ее активность ш уйго до приблизительно 57% (Кискитоуа, А.У. е! а1. (2007) МойШсайоп о! КесотЬтаШ акрагад1паке !гот Егуйиа сагоЮуога укк Ро1уе!ку1епе О1усо1 5000, Вюскет1кйу (Моксоу) δирр1етеηΐ δе^^ек В: Вютейюа1 СкетЫгу, 1, 230-232). Ь-аспарагиназа из Егу1та сагоЮуога имеет только приблизительно 75% гомологии с Ь-аспарагиназой Егу1ша скгукаШкет! (кризантаспазой). Для Опсакраг® также известно, что его активность ш уйго составляет приблизительно 50% по сравнению с немодифицированной Ь-аспарагиназой Е. сок.
Существующие в настоящее время препараты Ь-аспарагиназы не являются альтернативными или
- 2 021168 дополнительными лекарственными средствами - особенно средствами для лечения ОЛЛ - отличающимися высокой каталитической активностью и значительно улучшенными фармакологическими и фармакокинетическими свойствами, а также пониженной иммуногенностью.
Краткая сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к конъюгату белка, обладающего значительной аминогидролазной активностью в отношении Ь-аспарагина, и полиэтиленгликоля, в котором полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да, в частности к конъюгату, в котором белок представляет собой Ь-аспарагиназу из Епуииа. В одном варианте осуществления конъюгат содержит Ь-аспарагиназу из Επνίηία. имеющую по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО №: 1, и полиэтиленгликоль (ПЭГ), при этом ПЭГ имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да. В одном варианте осуществления Ь-аспарагиназа имеет по меньшей мере приблизительно 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО №: 1. В некоторых вариантах осуществления ПЭГ имеет молекулярную массу приблизительно 5000, 4000, 3000, 2500 или 2000 Да. В одном варианте осуществления конъюгат имеет активность ίη νίίτο по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению с Ь-аспарагиназой, не конъюгированной с ПЭГ. В другом варианте осуществления конъюгат имеет активность по истощению Ьаспарагина, по меньшей мере приблизительно в 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз большую, чем у Ь-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ. В другом варианте осуществления конъюгат истощает Ьаспарагин в плазме до не поддающихся обнаружению уровней по меньшей мере приблизительно на 12, 24, 48, 96, 108 или 120 ч.
В одном варианте осуществления конъюгат имеет более длительное время полувыведения при циркуляции ίη νίνο по сравнению с Ь-аспарагиназой, не конъюгированной с ПЭГ. В конкретном варианте осуществления конъюгат имеет более длительное ΐ1/2, чем пегаспаргаза (то есть конъюгированная с ПЭГ Ь-аспарагиназа из Е. сой), при введении в эквивалентной дозе белка (например, измеренной в мкг/кг). В более конкретном варианте осуществления конъюгат имеет ί1/2 по меньшей мере от приблизительно 58 до приблизительно 65 ч в дозе приблизительно 50 мкг/кг, исходя из содержания белка, и ί1/2 по меньшей мере от приблизительно 34 до приблизительно 40 ч в дозе приблизительно 10 мкг/кг, исходя из содержания белка, после в/в введения мыши. В другом конкретном варианте осуществления конъюгат имеет ί1/2 по меньшей мере от приблизительно 100 до приблизительно 200 ч в диапазоне доз от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м2 (приблизительно 20-30 мг белка/м2). В одном варианте осуществления конъюгат характеризуется большей площадью под кривой (ЛИС) по сравнению с Ь-аспарагиназой, не конъюгированной с ПЭГ. В конкретном варианте осуществления конъюгат имеет среднюю величину АиС, которая по меньшей мере приблизительно в 3 раза больше, чем у пегаспаргазы при эквивалентной дозе белка. В одном варианте осуществления ПЭГ ковалентно связан с одной или более аминогруппами (где аминогруппы включают остатки лизина и/или Ν-конец) Ь-аспарагиназы. В более конкретном варианте осуществления ПЭГ ковалентно связан с одной или более аминогруппами амидной связью. В другом конкретном варианте осуществления ПЭГ ковалентно связан с по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца белка) или с по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 90% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца белка). В одном варианте осуществления конъюгат обладает формулой
где Акр представляет собой Ь-аспарагиназу, ΝΗ представляет собой одну или более из ΝΗ-групп остатков лизина и/или Ν-конца в Акр, ПЭГ представляет собой фрагмент полиэтиленгликоля, η представляет собой число, соответствующее по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) в Акр, а х равен целому числу в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 8, более конкретно от приблизительно 2 до приблизительно 5. В конкретном варианте осуществления ПЭГ представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ).
В другом аспекте изобретение относится к способу получения конъюгата, включающему объединение некоторого количества ПЭГ с некоторым количеством Ь-аспарагиназы в буферном растворе в течение периода времени, достаточного для ковалентного соединения ПЭГ с Ь-аспарагиназой.
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат по изобретению.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения заболевания, поддающегося лечению истощением Ь-аспарагина, у пациента, включающему введение эффективного количества конъюгата по изобретению. В одном варианте осуществления заболевание представляет собой рак. В конкретном варианте осуществления рак представляет собой ОЛЛ. В другом конкретном варианте осуществления конъюгат вводят в количестве от приблизительно 5 Ед/кг массы тела до приблизительно 50 Ед/кг массы тела. В другом конкретном варианте осуществления конъюгат вводят в дозе, находящейся в диапазоне от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м2 (приблизительно 20-30 мг белка/м2). В некото- 3 021168 рых вариантах осуществления введение может быть внутривенным или внутримышечным и может иметь место реже одного раза в неделю (например, один раз в месяц или один раз в две недели), один раз в неделю, два раза в неделю или три раза в неделю. В других конкретных вариантах осуществления конъюгат вводят в качестве монотерапии и, более конкретно, без ингибитора аспарагинсинтетазы. В других вариантах осуществления конъюгат вводят в составе комбинированной терапии (но в некоторых вариантах осуществления комбинированная терапия не включает ингибитора аспарагинсинтетазы). В конкретном варианте осуществления пациент, получающий лечение, прежде имел гиперчувствительность к аспарагиназе из Е. сой или ее пегилированной форме, либо к аспарагиназе из Етдаша. В другом конкретном варианте осуществления пациент, получающий лечение, прежде имел рецидив заболевания, в частности рецидив, произошедший после лечения аспарагиназой из Е. сой или ее пегилированной формой.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Электрофорез в δΌδ-полиакриламидном геле очищенной рекомбинантной Ь-аспарагиназы из Егуййа сЬтукайЬетг Очищенную рекомбинантную Ь-аспарагиназу из Егуййа скгукаШкепи (ркризантаспазу) анализировали в δΌδ-ПААГ. Белковые полосы окрашивали нитратом серебра. Дорожка 1: маркер молекулярной массы (116, 66,2, 45, 35, 25, 18,4 и 14,4 кДа), дорожка 2: очищенная рекомбинантная Ь-аспарагиназа из Епуийа сйтукап1Ьет1 (р-кризантаспаза).
Фиг. 2. Анализ в δΌδ-ПААГ конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы.
Фиг. 3. Уровни Ь-аспарагина в плазме после одной внутривенной дозы Егуапаке® (5, 25, 125 и 250 Ед/кг массы тела).
Фиг. 4. Уровни Ь-аспарагина в плазме после одной внутривенной инъекции конъюгатов мПЭГ-ркризантаспазы по сравнению с Етушаке у мышей. Цифры 40% и 100% показывают примерную степень пегилирования, соответственно, приблизительно 40-55% (частичное пегилирование) и приблизительно 100% (максимальное пегилирование) доступных аминогрупп.
Фиг. 5. Площадь под кривыми (АИС) (остаточная ферментативная активность), рассчитанная из профилей Ь-аспарагиназы после одной внутривенной инъекции конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы у мышей.
Фиг. 6. Уровни Ь-аспарагина в плазме у мышей после одной внутривенной дозы 2-кДа-100% мПЭГр-кризантаспазы (5, 25 и 50 Ед/кг массы тела) (фиг. 6А), 5-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы (5, 25 и 50 Ед/кг массы тела) (фиг. 6В) или 2-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы (5 Ед/кг), 5-кДа-100% мПЭГ-ркризантаспазы (5 Ед/кг) и пегаспаргазы (Опсакраг®) (1 Ед/кг) (фиг. 6С). Введение эквивалентного количества белка (10 мкг/кг) либо 2-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы (5 Ед/кг), 5-кДа-100% мПЭГ-ркризантаспазы (5 Ед/кг) или пегаспаргазы (Опсакраг®) (1 Ед/кг) приводило к аналогичному истощению Ь-аспарагина в течение 72 ч.
Фиг. 7. Дозозависимый эффект 2-кДа-100% пегилированной р-кризантаспазы по сравнению с 5кДа-100% пегилированной р-кризантаспазой. На фиг. 7А показана остаточная ферментативная активность в плазме после одной внутривенной дозы 2-кДа-100% пегилированной р-кризантаспазы в концентрации 5 Ед/кг (10 мкг/кг, исходя из содержания белка), 25 и 50 Ед/кг. На фиг. 7В показана остаточная ферментативная активность в плазме после одной внутривенной дозы 5-кДа-100% пегилированной ркризантаспазы в концентрации 5 Ед/кг (10 мкг/кг, исходя из содержания белка), 25 и 50 Ед/кг.
Фиг. 8. Дозозависимый эффект 2-кДа-100% пегилированной р-кризантаспазы по сравнению с 5кДа-100% пегилированной р-кризантаспазой. АИС остаточной ферментативной активности, измеренной у мышей после одной внутривенной дозы 2-кДа-100% или 5-кДа-100% мПЭГ-конъюгатов. В целом, при сравнении на том же уровне дозы, АИС, измеренные для 5-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы, были выше, чем таковые, наблюдаемые для 2-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы. Разницу в 31, 37 и 14% наблюдали при дозах 5, 25 и 50 Ед/кг, соответственно.
Фиг. 9. Фармакокинетика конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы в сравнении с пегаспаргазой (Опсакраг®) у мышей. На фиг. 9А представлена остаточная ферментативная активность, измеренная у мышей после одной внутривенной дозы 2-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы или пегаспаргазы (Опсакраг®). На фиг. 9В представлены АИС остаточной ферментативной активности, измеренной у мышей после одной внутривенной дозы 2-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы, 5-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы или пегаспаргазы (Опсакраг®).
Фиг. 10. Уровни в сыворотке специфических антител против кризантаспазы после введения конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы или Етдапаке®. Антитела направлены против кризантаспазы. Данные представлены в виде среднего ± δΌ (N=8).
Фиг. 11. Уровни в сыворотке специфических антител против конъюгата после введения максимально (100%) пегилированных конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы. Фиг. 11А. Результаты представлены в виде среднего ±δΌ (п=8); фиг. 11В: результаты представлены в виде количества животных в процентах с величинами поглощения >0,5 в анализе ЕЫБА антител против конъюгата.
Подробное описание изобретения
В одном аспекте изобретение направлено на решение проблемы создания препарата Ь-аспарагиназы с
- 4 021168 высокой биологической активностью ίη νίίτο; стабильной связью ПЭГ-белок;
пролонгированным временем полувыведения ίη νίνο;
значительно сниженной иммуногенностью, о чем свидетельствует, например, пониженная или отсутствующая продукция антител против препарата Ь-аспарагиназы после повторяющихся введений; и возможностью применения в качестве терапии второй линии для пациентов, у которых развилась чувствительность к терапии первой линии при использовании, например, Ь-аспарагиназ из Е. сой.
Данная проблема не была решена с помощью известных конъюгатов Ь-аспарагиназы, которые либо имеют значительную перекрестную реактивность с модифицированными препаратами Ь-аспарагиназы (статья \Уапд. В. е( а1. (2003) Ьеикет1а 17, 1583-1588, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки), либо имеют существенно сниженную активность ίη νίίτο (статья Кисйитονа, Α.ν. еί а1. (2007) ВюсНетМгу (Моксоте) 5>ирр1етеп1 §ейе8 В: Вютебюа1 Сйет18йу, 1, 230-232, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Данная проблема решается в настоящем изобретении путем предложения конъюгата Ь-аспарагиназы из Еглуииа с гидрофильным полимером, более конкретно, полиэтиленгликолем с молекулярной массой 5000 дА или менее, способа получения такого конъюгата и использования конъюгата.
В данном документе описана пегилированная Ь-аспарагиназа из Еглуииа с улучшенными фармакологическими свойствами по сравнению с немодифицированным белком Ь-аспарагиназой, а также по сравнению с препаратом пегаспаргазы из Е. сой. Пегилированный конъюгат Ь-аспарагиназы, описанный в данном документе, например, Ь-аспарагиназа из Еглуииа сйтукаПйетц пегилированная при помощи ПЭГ с молекулярной массой 5000 Да, служит в качестве терапевтического средства, в частности, для использования в случае пациентов, демонстрирующих гиперчувствительность (например, аллергическую реакцию или латентную гиперчувствительность) к лечению Ь-аспарагиназой или пегилированной Ьаспарагиназой из Е. сой., либо немодифицированной Ь-аспарагиназой из Епуийа. Пегилированный конъюгат Ь-аспарагиназы, описанный в данном документе, также полезен в качестве терапевтического средства для использования в случае пациентов, у которых случился рецидив заболевания, например, рецидив ОЛЛ, или которых прежде лечили другой формой аспарагиназы, например, Ь-аспарагиназой или пегилированной Ь-аспарагиназой из Е. сой.
Как подробно описано в данном документе, конъюгат по изобретению неожиданно демонстрирует превосходные свойства по сравнению с известными препаратами Ь-аспарагиназы, такими как пегаспаргаза. Например, немодифицированная Ь-аспарагиназа из ЕтМша сНгуъатйепи (кризантаспаза) имеет гораздо менее длительное время полувыведения, чем немодифицированная Ь-аспарагиназа из Е. сой (статья АугатС апб Рапокуап, Сйп. РйаттасоктеЕ (2005) 44: 367-393, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Пегилированный конъюгат по изобретению имеет время полувыведения гораздо более длительное, чем пегилированная Ь-аспарагиназа из Е. сой при эквивалентной дозе белка.
Определения
Если прямо не указано иное, термины, используемые в данном документе, следует трактовать в соответствии с их общепринятым значением в данной области.
Используемый в данном документе термин включая означает включая, без ограничений и термины, используемые в единственном числе, должны включать множественное число, и наоборот, если из контекста не следует иное.
Используемый в данном документе термин болезнь, поддающаяся лечению путем истощения аспарагина означает патологическое состояние или заболевание, при котором клетки, вовлеченные или ответственные за патологическое состояние или заболевание, либо лишены, либо имеют пониженную способность синтезировать Ь-аспарагин. Истощение или лишение Ь-аспарагина может быть частичным или практически полным (например, до уровней, не поддающихся определению методами и приборами, известными в данной области).
Используемый в данном документе термин терапевтически эффективное количество означает количество белка (например, аспарагиназы или ее конъюгата), необходимое для достижения желаемого терапевтического эффекта.
Белок Ь-аспарагиназа
Белок по изобретению представляет собой фермент с аминогидролазной активностью в отношении Ь-аспарагина, а именно Ь-аспарагиназу.
Множество белков Ь-аспарагиназы идентифицировано в данной области, выделено известными методами из микроорганизмов (см., например, статью 5>а\'Пп апб А/тй 1пб1ап 1. Вю1есНпо1 2 (2003) 184-194, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Наиболее широко используемые и коммерчески доступные Ь-аспарагиназы получают из Е. сой или из Епуийа сйтукайНетц обе из которых имеют 50% или менее структурной гомологии. Среди видов ЕтЩша, как правило, сообщают о 75-77% идентичности последовательности между ферментами, полученными из Епуийа сНгукап(Нени и Епуийа саго1оуога, и приблизительно 90% идентичности последовательности обнаружено между
- 5 021168 различными подвидами ЕгМша сйгузап!йет1 (статья Κοΐζϊα О.А., ЬаЬгои Е., 1оигпа1 о£ Вю1есйпо1о§у (2007) 127: 657-669, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Некоторые представители Ь-аспарагиназ из ЕгМша включают, например, те, что приведены в табл. 1.
Таблица 1
Виды Регистрационный № в ОепВапк % идентичности с Бгкз.П1а сйгузапСЬетл ΝΟΡΡΒ 1066
Егы1П1а сЬгузапЬЬет! 3937 АА367028 91%
Егк1П1а сЬтузалСкет! ЫСРРВ 1125 САА31239 98%
Бгк1П1а сагосотога подвид АзСгозерЫса АА367027 75%
Егк1П1а сагоСоуога ААР92666 77%
Последовательности Ь-аспарагиназ из ЕгМша и регистрационные номера в ОепВапк из табл. 1 включены в данный документ посредством ссылки. Предпочтительными Ь-аспарагиназами, используемыми в терапии, являются Е-аспарагиназы, выделенные из Е. сой и из ЕгМша, в частности ЕгМша сйгузап1йеш1.
Е-аспарагиназы могут представлять собой природные ферменты, выделенные из микроорганизмов. Их также можно получать методами получения рекомбинантных ферментов в продуцирующих микроорганизмах, таких как Е. сой. В качестве примеров, белок, используемый в конъюгате по изобретению, может представлять собой белок из Е. сой, продуцируемый в рекомбинантном продуцирующем штамме Е. сой, белок из видов ЕгМша, в частности ЕгМша сйгузап1йеш1, продуцируемый в рекомбинантном продуцирующем штамме Е. сой.
Ферменты можно идентифицировать по их специфическим активностям. Таким образом, это определение охватывает все полипептиды, обладающие определенной специфической активностью, которые также присутствуют в других организмах, более конкретно в других микроорганизмах. Часто ферменты со сходными активностями можно идентифицировать, группируя их в определенные семейства, определяемые как РЕАМ или СОО. РЕАМ (база данных выравниваний и скрытых моделей Маркова белковых семейств; ййр://р£ат.зап§ег.ас.ик/) представляет большую коллекцию выравниваний белковых последовательностей. Каждая РЕАМ дает возможность визуализировать множество выравниваний, видеть белковые домены, оценивать распределение между организмами, получать доступ к другим базам данных и визуализировать известные белковые структуры. СООз (кластеры ортологичных групп белков; йЦр://м^^.псЬтп1т.шй.§оу/СОО/) получают путем сравнения белковых последовательностей из 43 полностью секвенированных геномов, представляющих 30 основных филогенетических линий. Каждый СОО определяют из по меньшей мере трех линий, что позволяет идентифицировать бывшие консервативные домены.
Способы определения гомологичных последовательностей и процента их гомологии и/или идентичности хорошо известны специалистам в данной области и включают, в частности, программы ВкА8Т, которые можно найти по сетевому адресу ййр://Ь1аз1.псЬьп1т.тй.§оу/В1азкс§1 с параметрами по умолчанию, указанными на этом сетевом адресе. Полученные последовательности затем можно использовать (например, выравнивать) при помощи, например, программ СкОбТАкА' (ййр://м^^.еЬьас.ик/Гоо1з/с1из1а1м2/тйех.й1т1) или МНЕТАЫЫ (ййр://Ьют£о.§епо1ои1Тг/тиЙайп.й1т1) с параметрами по умолчанию, указанными на этих сетевых адресах. Используя ссылки, данные в ОепВапк для известных генов, специалисты в данной области способны определять эквивалентные гены в других организмах, штаммах бактерий, дрожжах, грибах, млекопитающих, растениях и так далее. Эту рутинную работу предпочтительно выполнять, используя консенсусные последовательности, которые можно определять, проводя выравнивание последовательностей с генами из других микроорганизмов и разрабатывая вырожденные зонды для клонирования соответствующего гена в другом организме. Данные рутинные методы молекулярной биологии хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в 8атЬгоок е! а1. (1989 МОЕЕСИЕАК С1.( )ΝΙΝΟ: А ЕАВОКАТОКУ МАЫиАЕ. 2-е Изд. Со1! 8рг1п§ НагЬог ЕаЬ., Сок! 8рппд НагЬог, Ие\у Уогк). Действительно, специалисту в данной области известно, как выбирать и разрабатывать гомологичные белки, в значительной степени сохраняющие их Ьаспарагиназную активность. Как правило, анализ Несслера используют для определения Е-аспарагиназной активности по методу, описанному МазйЬигп ап! АпзЮп (статья МазйЬигп, Е., ап! Апзкоп I. (1963) Титог ЫиЬйогу ЕР'ес! о£ к-Азрагадтазе, Вюсйет Вюрйуз Кез Соттип 12, 50, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки).
В конкретном варианте осуществления конъюгата по изобретению белок Е-аспарагиназа имеет по меньшей мере приблизительно 80% гомологии или идентичности с белком, содержащим последовательность 8Е^ ГО №: 1, более конкретно по меньшей мере приблизительно 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гомологии или идентичности с белком, содержащим последовательность 8Е^ ГО №: 1. 8Е^ ГО №: 1 является следующей:
- 6 021168
ΜΙΚΒΡΝίνΐΙΛΤΟσΤΙΑαΒΑΑΤΟΤΟΤΤΟΥΚΑδΑΒΟνΒΤΣΙΝΑνΡΕνΚΚΙΛΝνκαΕΟΡΞ М4А.ЗЕМТ0Е77ЬКЪ50Р.™ЕЬ1ЛКПВУОСУУ1ТНСТОТОЕЕ8АУРЬНЬТУК5ОКРУ7РУААМ Ρ.ΡΑΤΑΪΗΜΗΡΜΝΕβΕΑνΡ.νΑαθΚ03Ρ.αΕθνΜννϋΙΟΚΙ33ΑΚΥΙΤΚΤΝΑ8ΤΙ,ΟΤΡΚΑΝΕΕαΥ ΣανίΙΟΝΚΙΥΥΟΝΚΙΌΚΙ,ΗΤΤΚΒνΡΌνΚσΐ,ΤδΙ,ΡΚνηΐΙ,ΥΟΥΟΌΟΡΕΥΙ,ΥΒΑΑΙΟΗΗνΚαΐνΥ АЗМЗАЗЗУЗУЕС1А(ЗМККАМЕК(3¥УУ1ЕЗТЕТЗНа1УРРОЕЕЬРаЬУЗЕЗЬЫРАНАЕ1ЬЬМ1Д ΕΤΕΤ3ϋΡΚνΐΟΕΥΡΗΊΎ (3Ε<2 ΙΌ 8’: 1) .
Термин содержащий последовательность ЗЕЦ ГО №: 1 означает, что аминокислотная последовательность белка может не быть четко ограниченной последовательностью ЗЕЦ ГО №: 1, но может содержать дополнительные аминокислоты.
В конкретном варианте осуществления белок представляет собой Ь-аспарагиназу из Ептийа сЬгуваШЬетк обладающую последовательностью ЗЕЦ ГО №: 1. В другом варианте осуществления Ьаспарагиназа происходит из Ептийа сЬгтваШЬепй ЫСРРВ 1066 (регистрационный № в ОепЬапк САА32884, полное содержание литературного источника включено в данный документ посредством ссылки) с наличием или отсутствием сигнальных пептидов и/или лидерных последовательностей.
Фрагменты белка с ЗЕЦ ГО №: 1 также попадают под определение белка, используемого в конъюгате по изобретению. Термин фрагмент ЗЕЦ ГО №: 1 означает, что последовательность полипептида может содержать меньше аминокислот, чем ЗЕЦ ГО №: 1, однако все еще достаточно аминокислот для проявления Ь-аминогидролазной активности.
В данной области хорошо известно, что полипептид можно модифицировать путем замены, вставки, делеции и/или добавления одной или нескольких аминокислот с сохранением его ферментативной активности. Например, замена одной аминокислоты в определенном положении эквивалентной с химической точки зрения аминокислотой, которая не влияет на функциональные свойства белка, является общепринятой. Замены можно определить как произведенный обмен внутри одной из следующих групп:
небольшие алифатические неполярные или слабо полярные остатки: А1а, Зет, ТЬг, Рго, О1у; полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Авр, Авп, О1и, О1п; полярные положительно заряженные остатки: Ηίβ, Агд, Ьув;
большие алифатические неполярные остатки: Ме1, Ьеи, 11е, Уа1, Сув; большие ароматические остатки: РЬе, Туг, Тгр.
Таким образом, можно ожидать, что в результате изменений, которые приводят к замене одного отрицательно заряженного остатка на другой (например, глютаминовая кислота вместо аспарагинговой кислоты) или одного положительно заряженного остатка на другой (например, лизин вместо аргинина), получится функционально эквивалентный продукт.
Положения, в которых аминокислоты подвергаются модификации, и число аминокислот, подвергающихся модификации, в аминокислотной последовательности не имеют конкретных ограничений. Квалифицированные специалисты в данной области способны определять модификации, которые можно вносить без оказания влияния на активность белка. Например, можно ожидать, что модификации в Νили С-концевой части белка не окажут влияния на активность белка при определенных обстоятельствах. В частности, что касается аспарагиназ, было получено много информации, особенно в отношении последовательностей, структур и остатков, образующих активный каталитический центр. Из этих данных можно получить указания на то, какие остатки можно модифицировать без оказания влияния на активность фермента. Все известные Ь-аспарагиназы из бактериальных источников имеют общие структурные особенности. Все являются гомотетрамерами с четырьмя активными центрами между Ν- и С-концевыми доменами двух соседних мономеров (статья АдЬа1роит е( а1., ВюсЬеийв1гу 40 (2001) 5655-5664, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Все имеют высокую степень сходства их третичных и четвертичных структур (статья Рарадеотдюи е( а1., РЕВЗ 1. 275 (2008) 43064316, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Последовательности каталитических центров Ь-аспарагиназ являются высококонсервативными у Ь-аспарагиназы II Ег\тийа сЬтувайЬетц Ептийа сагоЮуога и Е. соЬ (Рарадеотдюи е( а1., РЕВЗ I. 275 (2008) 4306-4316). Гибкая петля активного центра содержит аминокислотные остатки 14-33, и структурный анализ показывает, что ТЬг15, ТЬг95, Зег62, О1и63, Авр96 и А1а120 контактируют с лигандом (Рарадеотдюи е( а1., РЕВЗ I. 275 (2008) 4306-4316). АдЬатроит с соавторами провели подробный анализ четырех активных центров Ьаспарагиназы из Ептийа сЬгтваШЬепй путем изучения полученных с высоким разрешением кристаллических структур фермента в комплексе с его субстратами (АдЬатроит е( а1., ВюсЬеийв1гт 40 (2001) 56555664). КоГОа с соавторами предоставили последовательности Ь-аспарагиназ из нескольких видов и подвидов Ептийа и, хотя белки имеют только приблизительно 75-77% идентичности между Ептийа сЬгувап1Ьет1 и Ептийа сагоЮуога, каждая из них все еще обладает Ь-аспарагиназной активностью (статья Ко1/1а е( а1., I. Вю1есЬпо1. 127 (2007) 657-669, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Моо1а с соавторами провели исследования по картированию эпитопов Ь-аспарагиназы из Ептийа сЬтувап1Ьет1 3937 и показали возможность сохранения ферментативной активности даже после внесения мутаций в различные антигенные последовательности в попытке снизить иммуногенность аспарагиназы (статья Моо1а е( а1., ВюсЬет. I. 302 (1994) 921-927, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Полное содержание каждой из приведенных выше статей вклю- 7 021168 чено в данный документ посредством ссылок. Учитывая всестороннее исследование Ь-аспарагиназ, специалист в данной области сможет определять, как создавать фрагменты и/или вносить замены в последовательности без утраты ферментативной активности.
Полимеры для использования в конъюгате
Полимеры выбирают из группы нетоксичных водорастворимых полимеров, таких как полисахариды, например, гидроксиэтилкрахмал, полиаминокислоты, например, полилизин, сложные полиэфиры, например, полимолочная кислота, и полиалкиленоксиды, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Полиэтиленгликоль (ПЭГ) или монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ) хорошо известны в данной области и включают линейные и разветвленные полимеры. Примеры некоторых полимеров, в частности, ПЭГ, приведены в следующих литературных источниках, полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылок: патент США № 5672662; патент США № 4179337; патент США № 5252714; публикация патентной заявки США № 2003/0114647; патент США № 6113906; патент США № 7419600 и РСТ публикация № АО 2004/083258.
Качество таких полимеров характеризуется индексом полидисперсности (ΡΌΙ). ΡΌΙ отражает распределение молекулярных масс в данном образце полимера и рассчитывается как отношение среднемассовой молекулярной массы к среднечисленной молекулярной массе. Он указывает на распределение отдельных молекулярных масс в партии полимеров. Значение ΡΌΙ всегда больше 1, но по мере приближения полимерных цепей к идеальному распределению Гаусса (= монодисперсности), ΡΌΙ приближается к 1.
Предпочтительно полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу, находящуюся в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 9000 Да. Более конкретно, полиэтиленгликоль (например, мПЭГ) имеет молекулярную массу, выбранную из группы, состоящей из полиэтиленгликолей с массой 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 и 5000 Да. В конкретном варианте осуществления полиэтиленгликоль (например, мПЭГ) имеет молекулярную массу 5000 Да.
Способ получения конъюгата
Для последующего присоединения полимера к белкам с аминогидролазной активностью в отношении Ь-аспарагина полимерный фрагмент содержит активированную функциональную группу, которая предпочтительно вступает в реакцию с аминогруппами в белке. В одном аспекте изобретение относится к способу получения конъюгата, включающему объединение некоторого количества полиэтиленгликоля (ПЭГ) с некоторым количеством Ь-аспарагиназы в буферном растворе в течение периода времени, достаточного для ковалентного соединения ПЭГ с Ь-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления Ьаспарагиназа происходит из видов Εηνίηία. более конкретно Епуииа скгухаШкспп. еще более конкретно Ь-аспарагиназа содержит последовательность ЗЕО ГО №: 1. В одном варианте осуществления ПЭГ представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ).
В одном варианте осуществления реакцию между полиэтиленгликолем и Ь-аспарагиназой проводят в буферном растворе. В некоторых конкретных вариантах осуществления значение рН буферного раствора находится в диапазоне от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0. Наиболее предпочтительное значение рН находится в диапазоне от приблизительно 7,5 до приблизительно 8,5, например, значение рН, равное приблизительно 7,5; 7,6; 7,7; 7,8; 7,9; 8,0; 8,1; 8,2; 8,3; 8,4 или 8,5. В конкретном варианте осуществления Ь-аспарагиназа происходит из видов Ету1та, более конкретно Егуийа сЬтукайкетц еще более конкретно Ь-аспарагиназа содержит последовательность ЗЕО ГО №: 1.
Кроме того, пегилирование Ь-аспарагиназы проводят при концентрациях белка от приблизительно 0,5 до приблизительно 25 мг/мл, более конкретно от приблизительно 2 до приблизительно 20 мг/мл, наиболее конкретно от приблизительно 3 до приблизительно 15 мг/мл. Например, концентрация белка составляет приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мг/мл. В конкретном варианте осуществления при данных концентрациях белка пегилируют Ь-аспарагиназу из видов ΕΓνίηία, более конкретно Егуииа сЬтукайкетц еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность ЗЕО ГО №: 1.
При повышенных концентрациях белка, составляющих более чем 2 мг/мл, реакция пегилирования происходит быстро, в течение менее чем 2 ч. Кроме того, используют молярный избыток полимера над аминогруппами в Ь-аспарагиназе менее чем приблизительно 20:1. Например, используют молярный избыток менее чем приблизительно 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7,5:1, 7:1, 6,5:1, 6:1, 5,5:1, 5:1, 4,5:1, 4:1, 3,5:1, 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,5:1 или 1:1. В конкретном варианте осуществления молярный избыток составляет менее чем приблизительно 10:1 и в более конкретном варианте осуществления молярный избыток составляет менее чем приблизительно 8:1. В конкретном варианте осуществления Ь-аспарагиназа происходит из видов Ету1та, более конкретно Егуийа сЬтукайкетц еще более конкретно Ь-аспарагиназа содержит последовательность ЗЕО ГО №: 1.
Число фрагментов ПЭГ, которые можно присоединять к белку, будет зависеть от числа свободных аминогрупп и, даже более того, тех аминогрупп, которые доступны для реакции пегилирования. В конкретном варианте осуществления степень пегилирования (то есть число фрагментов ПЭГ, присоединенных к аминогруппам на Ь-аспарагиназе) находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 100% свободных и/или доступных аминогрупп (например, приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60,
- 8 021168
70, 80, 90 или 100%). 100% Пегилирование доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Νконца белка) также называют в данном документе максимальным пегилированием. Одним из методов определения модифицированных аминогрупп в конъюгатах мПЭГ-р-кризантаспазы (степени пегилирования) является метод, описанный НаЬееЬ (статья Ά.Ρ.δ.Ά. НаЬееЬ, ОеЮгттаОоп οί Ггее аш1ио дтоирк ίη ρτοίοίηδ Ьу 1пш1гоЬеп/еп5и1Гошс асИ, Апа1. Вюсйет. 14 (1966), р. 328, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). В одном варианте осуществления фрагменты ПЭГ связаны с одной или более аминогруппами (которые включают остатки лизина и/или Ν-конец) Ьаспарагиназы. В конкретном варианте осуществления степень пегилирования находится в диапазоне от приблизительно 10% до приблизительно 100% всех или доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца), например, приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100%. В конкретном варианте осуществления приблизительно 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) связано с фрагментом ПЭГ. В другом конкретном варианте осуществления приблизительно 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) связано с фрагментом ПЭГ. В конкретном варианте осуществления 40-55% или 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) связано с фрагментом ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления фрагменты ПЭГ связаны с Ь-аспарагиназой ковалентной связью. В конкретном варианте осуществления Ь-аспарагиназа происходит из видов Ег\униа, более конкретно Ег\\лша сйгукаййетц еще более конкретно, Ь-аспарагиназа содержит последовательность 8ЕО ГО №: 1.
В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению можно представить формулой Азр-[ЫН-СО-(СН2)х-СО-ЫН-ПЭГ]η где Акр представляет собой белок Ь-аспарагиназу, ΝΗ представляет собой ΝΗ-группу остатка лизина и/или Иле Ν-конца белковой цепи, ПЭГ представляет собой фрагмент полиэтиленгликоля и η представляет собой число, соответствующее по меньшей мере от 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) в белке, все это определено выше или ниже в примерах, х равен целому числу в диапазоне от 1 до 8 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8), предпочтительно от 2 до 5 (например, 2, 3, 4, 5). В конкретном варианте осуществления Ь-аспарагиназа происходит из видов ΕΓνίηιη, более конкретно Ег\\лша сйгукаййетц еще более конкретно Ь-аспарагиназа содержит последовательность 8ЕО ГО №: 1.
Другие способы пегилирования, которые можно использовать для получения конъюгатов по изобретению, предложены, например, в патенте США № 4179337, патенте США № 5766897, публикации патентной заявки США № И8 2002/0065397А1 и публикации патентной заявки США № И8 2009/0054590А1, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.
Конкретные варианты осуществления включают белки, имеющие значительную аминогидролазную активность в отношении Ь-аспарагина, и полиэтиленгликоль, выбранные из группы конъюгатов, в которых (A) белок имеет по меньшей мере 90% гомологии структуры с Ь-аспарагиназой из Ег\\лша сйгукаШйетц описываемой в 8ЕО ГО №: 1, полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 5000 Да, белок и фрагменты полиэтиленгликоля ковалентно связаны амидными связями, и приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) или приблизительно 80-90%, в частности, приблизительно 84% всех аминогрупп ((например, остатков лизина и/или Ν-конца) связаны с фрагментом полиэтиленгликоля;
(B) белок имеет по меньшей мере 90% гомологии структуры с Ь-аспарагиназой из Ег\\лша сйтукаШйетц описываемой в 8ЕО ГО №: 1, полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 5000 Да, белок и фрагменты полиэтиленгликоля ковалентно связаны амидными связями, и приблизительно от 40% до приблизительно 45% и, в частности, приблизительно 43% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) или приблизительно 36% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) связаны с фрагментом полиэтиленгликоля;
(C) белок имеет по меньшей мере 90% гомологии структуры с Ь-аспарагиназой из Ег\\лша сйгукаШйетц описываемой в 8ЕО ГО №: 1, полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 2000 Да, белок и фрагменты полиэтиленгликоля ковалентно связаны амидными связями, и приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, один или более остатков лизина и/или Νконца) или приблизительно 80-90%, в частности, приблизительно 84% всех аминогрупп (например, ос- 9 021168 татков лизина и/или Ν-конца) связаны с фрагментом полиэтиленгликоля;
(О) белок имеет по меньшей мере 90% гомологии структуры с Ь-аспарагиназой из Ег\\зша еНгу5ап1Нст1. описываемой в §ЕЦ ГО №: 1, полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 2000 Да, белок и фрагменты полиэтиленгликоля ковалентно связаны амидными связями, и приблизительно от 50% до приблизительно 60% и, в частности, приблизительно 55% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) или приблизительно 47% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) связаны с фрагментом полиэтиленгликоля.
Конъюгаты Ь-аспарагиназы с ПЭГ
Конъюгаты по изобретению имеют определенные преимущества и неожиданные свойства по сравнению с немодифицированными Ь-аспарагиназами, в частности по сравнению с немодифицированными Ь-аспарагиназами из Ετνίηία, более конкретно по сравнению с немодифицированной Ь-аспарагиназой из Επνίηία сНглъаШНст! еще более конкретно по сравнению с немодифицированной Ь-аспарагиназой, имеющей последовательность §ЕЦ ГО №: 1.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат по изобретению снижает уровни Ь-аспарагина в плазме на период времени по меньшей мере приблизительно 12, 24, 48, 72, 96 или 120 ч при введении в дозе 5 Ед/кг массы тела (Ь\у) или 10 мкг/кг (исходя из содержания белка). В других вариантах осуществления конъюгат по изобретению снижает уровни Ь-аспарагина в плазме до не поддающихся определению уровней на период времени по меньшей мере приблизительно 12, 24, 48, 72, 96, 120 или 144 ч при введении в дозе 25 Ед/кг Ον или 50 мкг/кг (исходя из содержания белка). В других вариантах осуществления конъюгат по изобретению снижает уровни Ь-аспарагина в плазме на период времени по меньшей мере приблизительно 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 или 240 ч при введении в дозе 50 Ед/кг Ον или 100 мкг/кг (исходя из содержания белка). В другом варианте осуществления конъюгат по изобретению снижает уровни Ь-аспарагина в плазме до не поддающихся определению уровней на период времени по меньшей мере приблизительно 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 или 240 ч при введении в диапазоне доз от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м2 (приблизительно 20-30 мг белка/м2). В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит Ь-аспарагиназу из видов Егдаша, более конкретно Επνίηία сНгу^аШНст! еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность §ЕЦ ГО №: 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40% до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) являются пегилированными.
В одном варианте осуществления конъюгат имеет соотношение моль ПЭГ/моль мономера от приблизительно 4,5 до приблизительно 8,5, в частности приблизительно 6,5; специфическую активность от приблизительно 450 до приблизительно 550 Ед/мг, в частности приблизительно 501 Ед/мг; и относительную активность от приблизительно 75 до приблизительно 85%, в частности приблизительно 81% по сравнению с соответствующей немодифицированной Ь-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит Ь-аспарагиназу из видов Ете1ша, более конкретно Ег\\зша сИгу^нИНст! еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность §ЕЦ ГО №: 1, с пегилированием приблизительно 40-55% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Νконца) за счет 5000 Да мПЭГ.
В одном варианте осуществления конъюгат имеет соотношение моль ПЭГ/моль мономера от приблизительно 12,0 до приблизительно 18,0, в частности приблизительно 15,1; специфическую активность от приблизительно 450 до приблизительно 550 Ед/мг, в частности приблизительно 483 Ед/мг; и относительную активность от приблизительно 75 до приблизительно 85%, в частности приблизительно 78% по сравнению с соответствующей немодифицированной Ь-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит Ь-аспарагиназу из видов Ете1ша, более конкретно Ег\\зша сИгу^нИНст! еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность §ЕЦ ГО №: 1, с пегилированием приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Νконца) за счет 5000 Да мПЭГ.
В одном варианте осуществления конъюгат имеет соотношение моль ПЭГ/моль мономера от приблизительно 5,0 до приблизительно 9,0, в частности приблизительно 7,0; специфическую активность от приблизительно 450 до приблизительно 550 Ед/мг, в частности, приблизительно 501 Ед/мг; и относительную активность от приблизительно 80 до приблизительно 90%, в частности приблизительно 87% по сравнению с соответствующей немодифицированной Ь-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит Ь-аспарагиназу из видов Ете1ша, более конкретно Ег\νίηί;·ι сИгу^нИНст! еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность §ЕЦ ГО №: 1, с пегилированием приблизительно 40-55% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Νконца) за счет 10000 Да мПЭГ.
В одном варианте осуществления конъюгат имеет соотношение моль ПЭГ/моль мономера от приблизительно 11,0 до приблизительно 17,0, в частности приблизительно 14,1; специфическую активность
- 10 021168 от приблизительно, 450 до приблизительно 550 Ед/мг, в частности приблизительно 541 Ед/мг; и относительную активность от приблизительно 80 до приблизительно 90%, в частности приблизительно 87% по сравнению с соответствующей немодифицированной Ь-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит Ь-аспарагиназу из видов Егууийа, более конкретно Ег\уийа скгузайкетр еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность 8ЕС ГО №: 1, с пегилированием приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Νконца) за счет 10000 Да мПЭГ.
В одном варианте осуществления конъюгат имеет соотношение моль ПЭГ/моль мономера от приблизительно 6,5 до приблизительно 10,5, в частности приблизительно 8,5; специфическую активность от приблизительно 450 до приблизительно 550 Ед/мг, в частности приблизительно 524 Ед/мг; и относительную активность от приблизительно 80 до приблизительно 90%, в частности приблизительно 84% по сравнению с соответствующей немодифицированной Ь-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит Ь-аспарагиназу из видов Егууийа, более конкретно Егνίηία скгузайкетр еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность 8ЕС ГО №: 1, с пегилированием приблизительно 40-55% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Νконца) за счет 2000 Да мПЭГ.
В одном варианте осуществления конъюгат имеет соотношение моль ПЭГ/моль мономера от приблизительно 12,5 до приблизительно 18,5, в частности приблизительно 15,5; специфическую активность от приблизительно 450 до приблизительно 550 Ед/мг, в частности приблизительно 515 Ед/мг; и относительную активность от приблизительно 80 до приблизительно 90%, в частности приблизительно 83% по сравнению с соответствующей немодифицированной Ь-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит Ь-аспарагиназу из видов Егууийа, более конкретно Ег\уийа скгузайкетр еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность 8ЕО ГО №: 1, с пегилированием приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Νконца) за счет 2000 Да мПЭГ.
В других вариантах осуществления конъюгат по изобретению имеет эффективность, повышенную по меньшей мере приблизительно в 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз после одной инъекции по сравнению с соответствующей немодифицированной Ь-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит Ь-аспарагиназу из видов Егтоша, более конкретно Егуийа скгувайкетр еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность 8ЕО ГО №: 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) являются пегилированными.
В одном аспекте конъюгат по изобретению имеет фармакокинетический профиль в соответствии со следующими параметрами:
Параметр Определение
Ащах Максимальная остаточная ферментативная активность
Время до Адах после воздействия тестируемым веществом
Сайтах Максимальная продолжительность Атах или А выше нуля
Время полувыведения остаточной ферментативной активности в плазме выводят из следующей формулы.
Среднее
-7и2х?
Г‘/2 /и(с,/с0) где ΐι/2 представляет собой время полувыведения, 1 представляет собой момент времени, сг представляет собой остаточную активность в плазме в момент времени и С0 представляет собой остаточную активность в плазме в начальный момент времени. Площадь под кривой (ЛИС) рассчитывают при помощи компьютерной программы для фармакокинетики, например, 8щтаР1о1 версия 11.
В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению имеет фармакокинетический профиль одной дозы в соответствии со следующими далее параметрами, особенно когда конъюгат содержит мПЭГ с молекулярной массой, меньшей чем или равной 2000 Да, и Ь-аспарагиназу из видов Егуу|И1а, более конкретно Егуийа скгузаШкетк еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность 8ЕС ГО №: 1:
Атах: от приблизительно 150 до приблизительно 250 Ед/л;
Τα™χ: от приблизительно 4 до приблизительно 8 ч, в частности, приблизительно 6 ч;
ДАтах: от приблизительно 220 до приблизительно 250 ч, в частности, приблизительно 238,5 ч (выше нуля, от приблизительно 90 мин до приблизительно 240 ч) ;
АИС: от приблизительно 12000 до приблизительно 30000; и ΐι/2: от приблизительно 50 до приблизительно 90 ч.
- 11 021168
В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению имеет фармакокинетический профиль одной дозы в соответствии со следующими далее параметрами, особенно когда конъюгат содержит мПЭГ с молекулярной массой, меньшей чем или равной 5000 Да, и Ь-аспарагиназу из видов Егуйна, более конкретно Егуийа сНгу^аШНетк еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность §ЕЦ ГО №: 1:
Атах: от приблизительно 18 Ед/л до приблизительно 250 Ед/л;
ТАтах: от приблизительно 1 ч до приблизительно 50 ч;
йАтах: от приблизительно 90 ч до приблизительно 250 ч, в частности, приблизительно 238,5 ч (выше нуля, от приблизительно 90 мин до приблизительно 240 ч);
АиС: от приблизительно 500 до приблизительно 35000; и ΐ1/2: от приблизительно 30 ч до приблизительно 120 ч.
В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению приводит к получению такого же уровня истощения Ь-аспарагина в течение периода времени (например, 24, 48 или 72 ч) после одной дозы, что и эквивалентное количество белка пегаспаргазы. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит Ь-аспарагиназу из видов Егузша, более конкретно Егузша сНгухаШНетк и еще более конкретно Ьаспарагиназу, содержащую последовательность §ЕЦ ГО №: 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) являются пегилированными, более конкретно, приблизительно 40-55% или 100%.
В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению имеет более длительное 11/2, чем пегаспаргаза, введенная в эквивалентной дозе белка. В конкретном варианте осуществления конъюгат имеет 02, равное по меньшей мере приблизительно 50, 52, 54, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 или 65 ч при дозе приблизительно 50 мкг/кг (исходя из содержания белка). В другом конкретном варианте осуществления конъюгат имеет 11/2, равное по меньшей мере приблизительно 30, 32, 34, 36, 37, 38, 39 или 40 ч при дозе приблизительно 10 мкг/кг (исходя из содержания белка). В другом конкретном варианте осуществления конъюгат имеет 11/2, равное по меньшей мере от приблизительно 100 до приблизительно 200 ч в диапазоне доз от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м2 (приблизительно 20-30 мг белка/м2).
В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению имеет среднюю величину АИС, которая по меньшей мере приблизительно в 2, 3, 4 или 5 раз выше, чем у пегаспаргазы при эквивалентной дозе белка.
В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению не вызывает существенной продукции антител в течение конкретного периода времени после введения одной дозы, например, большего чем приблизительно 1 неделя, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель и так далее. В конкретном варианте осуществления конъюгат по изобретению не вызывает существенной продукции антител в течение по меньшей мере 8 недель. В одном примере не вызывает существенной продукции антител означает, что субъекта, получающего конъюгат, определяют в соответствии с признанными в данной области параметрами как отрицательного по наличию антител. Уровни антител можно определять методами, известными в данной области, например, методом ЕЬ18А или методом поверхностного плазмонного резонанса (8РР-В1асоте) (статьи 2а1е\\ъка8/е\ус/ук е1 а1., С1ш. Ехр. Мей. (2009) 9: 113-116; Аутат18 е1 а1., Аийсаисет Резеатсй 29 (2009) 299-302, полное содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки). Конъюгаты по изобретению могут иметь любое сочетание данных свойств.
Способы лечения и использования конъюгата
Конъюгаты по изобретению можно использовать в лечении заболевания, поддающегося лечению путем истощения аспарагина. Например, конъюгат полезен при лечении или производстве лекарственного средства для использования в лечении острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) как у взрослых, так и у детей, а также других патологических состояний, где, как ожидается, истощение аспарагина произведет полезный эффект. Такие патологические состояния включают, но не ограничиваются ими, следующие: злокачественные заболевания или рак, включая, но не ограничиваясь ими, гематологические злокачественные заболевания, неходжкинскую лимфому, ΝΚ лимфому, рак поджелудочной железы, болезнь Ходжкина, острый миелолейкоз, острый миеломоноцитарный лейкоз, хронический лимфолейкоз, лимфосаркому, ретикулосаркому и меланому. Типичные не злокачественные гематологические заболевания, отвечающие на истощение аспарагина, включают опосредованные иммунной системой заболевания крови, например, инфекционные заболевания, такие как те, что вызваны инфекцией ВИЧ (то есть, СПИД). Не гематологические заболевания, связанные с зависимостью от аспарагина, включают аутоиммунные заболевания, например, ревматоидный артрит, СКВ, аутоиммунные коллагенозы сосудов, СПИД и так далее. Другие аутоиммунные заболевания включают остеоартрит, синдром Исаака, псориаз, инсулинзависимый сахарный диабет, рассеянный склероз, склерозирующий панэнцефалит, системную красную волчанку, ревматизм, воспалительное заболевание кишечника (например, неспецифический язвенный колит и болезнь Крона), первичный билиарный цирроз, хронический активный гепатит, гломерулонефрит, тяжелую
- 12 021168 миастению, обыкновенную пузырчатку и болезнь Грейвса. Клетки, предположительно вызывающие заболевание, можно проверять на аспарагиновую зависимость в любом подходящем ίη νίίτο или ίη νίνο анализе, например, в ίη νίίτο анализе, в котором в ростовой среде отсутствует аспарагин. Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу лечения заболевания, поддающегося лечению, у пациента, включающему введение пациенту эффективного количества конъюгата по изобретению. В конкретном варианте осуществления заболевание представляет собой ОЛЛ. В конкретном варианте осуществления конъюгат, используемый в лечении заболевания, поддающегося лечению путем истощения аспарагина, содержит Ь-аспарагиназу из видов Εηνίηία. более конкретно Εηνίηία сйгукаПйетц еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность §ЕЦ ГО №: 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) являются пегилированными, более конкретно приблизительно 40-55% или 100%.
В одном варианте осуществления лечение конъюгатом по изобретению будет проводиться в качестве терапии первой линии. В другом варианте осуществления лечение конъюгатом по изобретению будет проводиться в качестве терапии второй линии у пациентов, в частности у пациентов с ОЛЛ, у которых развились объективные признаки аллергии или гиперчувствительности, включая латентную гиперчувствительность, на другие препараты аспарагиназы, в частности природную Ь-аспарагиназу из Е§сйепсЫа сой или ее пегилированный вариант (пегаспаргазу). Неограничивающие примеры объективных признаков аллергии или гиперчувствительности включают положительный тест на антитела к ферменту аспарагиназе. В конкретном варианте осуществления конъюгат по изобретению используют в терапии второй линии после лечения пегаспаргазой. В более конкретном варианте осуществления конъюгат, используемый в терапии второй линии, содержит Ь-аспарагиназу из видов Егдаша, более конкретно Ег\уийа сйгукаййетц еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность §ЕЦ ГО №: 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) являются легилированными, более конкретно приблизительно 40-55 или 100%.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения острого лимфобластного лейкоза, включающему введение пациенту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества конъюгата по изобретению. В конкретном варианте осуществления терапевтическое средство вводят в дозе, находящейся в диапазоне от приблизительно 1500 до приблизительно 15000 МЕ/м2, как правило, от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м2 (приблизительно 20-30 мг белка/м2) по схеме лечения в диапазоне от приблизительно двух раз в неделю до приблизительно одного раза в месяц, как правило, один раз в неделю или один раз в две недели, в виде одного средства (например, монотерапия) или как часть комбинации химиотерапевтических лекарственных средств, включая, но не ограничиваясь ими, глюкокортикоиды, кортикостероиды, противораковые соединения или другие средства, включая, но не ограничиваясь ими, метотрексат, дексаметазон, преднизон, преднизолон, винкристин, циклофосфамид и антрациклин. В качестве примера, пациентам с ОЛЛ будут вводить конъюгат по изобретению в качестве компонента многокомпонентной терапии в течение 3 фаз химиотерапии, включая индукцию, консолидацию или интенсификацию и поддерживающую фазу. В конкретном примере конъюгат не вводят с ингибитором аспарагинсинтетазы (например, таким, который описан в РСТ публикации № νθ 2007/103290, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). В другом конкретном примере конъюгат не вводят с ингибитором аспарагинсинтетазы, но вводят с другими химиотерапевтическими лекарственными средствами. Конъюгат можно водить до, после или одновременно с другими соединениями как часть схемы многокомпонентной химиотерапии. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит Ь-аспарагиназу из видов Егдаша, более конкретно Егдаша сйгукап1йетк еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность §ЕЦ ГО №: 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) являются пегилированными, более конкретно приблизительно 40-55 или 100%.
В конкретном варианте осуществления способ включает введение конъюгата по изобретению в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 25 Ед/кг (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 Ед/кг) или эквивалентном этому количестве (например, исходя из содержания белка). В более конкретном варианте осуществления конъюгат вводят в количестве, выбранном из группы, состоящей из приблизительно 5, приблизительно 10 и приблизительно 25 Ед/кг. В другом конкретном варианте осуществления конъюгат вводят в дозе, находящейся в диапазоне от приблизительно 1000 до приблизительно 20000 МЕ/м2 (например, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000 или
- 13 021168
20000 МЕ/м2). В другом конкретном варианте осуществления конъюгат вводят в дозе, которая приводит к истощению Ь-аспарагина до уровней, не поддающихся определению с помощью методов и приборов, известных в данной области, на период времени от приблизительно 3 дней до приблизительно 10 дней (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней) при введении одной дозы. В другом варианте осуществления способ включает введение конъюгата по изобретению, который вызывает более слабый иммуногенный ответ у пациента по сравнению с не конъюгированной Ь-аспарагиназой. В другом варианте осуществления способ включает введение конъюгата по изобретению, который имеет более продолжительное время полувыведения при циркуляции ίη νίνο после одной дозы по сравнению с не конъюгированной Ьаспарагиназой. В одном варианте осуществления способ включает введение конъюгата, имеющего более продолжительное 11/2, чем пегаспаргаза, введенная в эквивалентной дозе белка. В конкретном варианте осуществления способ включает введение конъюгата с 11/2, составляющим по меньшей мере приблизительно 50, 52, 54, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 или 65 ч при дозе приблизительно 50 мкг/кг (исходя из содержания белка). В другом конкретном варианте осуществления способ включает введение конъюгата с 11/2, составляющим по меньшей мере приблизительно 30, 32, 34, 36, 37, 37, 39 или 40 ч при дозе приблизительно 10 мкг/кг (исходя из содержания белка). В другом конкретном варианте осуществления способ включает введение конъюгата с 11/2, составляющим по меньшей мере от приблизительно 100 до приблизительно 200 ч при дозе, находящейся в диапазоне от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м2 (приблизительно 20-30 мг белка/м2). В одном варианте осуществления способ включает введение конъюгата, имеющего среднюю величину ЛИС, которая по меньшей мере приблизительно в 2, 3, 4 или 5 раз выше, чем у пегаспаргазы при эквивалентной дозе белка. В другом конкретном варианте осуществления способ включает введение конъюгата по изобретению с большей величиной ЛИС после одной дозы по сравнению с не конъюгированной Ь-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит Ь-аспарагиназу из видов Εηνίηία. более конкретно Епуииа сйгукаШйетк еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность 8ΕΟ ГО №: 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) являются пегилированными, более конкретно приблизительно 40-55% или 100%.
Частота рецидивов у пациентов с ОЛЛ после лечения Ь-аспарагиназой остается высокой, составляя приблизительно 10-25% у педиатрических пациентов с ОЛЛ с ранним рецидивом (например, в течение поддерживающей фазы через 30-36 месяцев после индукции) (Аугапщ апб Рапокуап, Сйп. РйагтасокшеЕ (2005) 44: 367-393). Если у пациента, проходящего лечение Ь-аспарагиназой из Е. сой, случается рецидив, последующее лечение препаратами из Е. сой может приводить к эффекту вакцинации, при котором препараты из Е. сой имеют повышенную иммуногенность при последующих введениях. В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению можно использовать в способе лечения пациентов с рецидивом ОЛЛ, которых ранее лечили другими препаратами аспарагиназы, в частности, тех, которых ранее лечили аспарагиназами из Е. сой.
В некоторых вариантах осуществления варианты применения и способы лечения по изобретению включают введение конъюгата Ь-аспарагиназы, имеющего свойства или сочетания свойств, описанные выше в данном документе (например, в разделе, озаглавленном Конъюгаты Ь-аспарагиназы с ПЭГ) или ниже в данном документе.
Композиции, препараты и способы введения
Изобретение также включает фармацевтическую композицию, содержащую конъюгат по изобретению. В конкретном варианте осуществления фармацевтическая композиция находится во флаконе в виде лиофилизированного порошка, который вновь растворяют в растворителе, так же, как и доступные в настоящее время природные Ь-аспарагиназы, независимо от того, какой бактериальный источник использовали для их получения (К1бго1а8е®, ЕПраг®, Епуите®...). В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой готовый к употреблению раствор, такой как пегаспаргаза (Опсакраг®), который можно, после соответствующей подготовки, вводить, например, внутримышечно, внутривенно (инфузией и/или болюсной инъекцией), интрацеребровентрикулярно (юу), подкожно.
Конъюгаты по изобретению, включая композиции, содержащие конъюгаты по изобретению (например, фармацевтическую композицию), можно вводить пациенту стандартными методами.
Методы и препараты, как правило, можно найти в книге Кетшдоп'к Рйагтасеийса1 §аепсе8 (18-е изд., Маск Риййкйтд Со., ЕакЮп, Ра., 1990 (включенной в данный документ посредством ссылки)).
Подходящие лекарственные формы частично зависят от применения или способа введения, например, перорального, трансдермального, через слизистую оболочку или путем инъекции (парентеральной). Такие лекарственные формы должны позволять терапевтическому средству достигать клетки-мишени, либо иным образом производить желаемый терапевтический эффект. Например, фармацевтические композиции, вводимые инъекцией в кровоток, предпочтительно являются растворимыми.
Конъюгаты и/или фармацевтические композиции по изобретению можно получать в виде фармацевтически приемлемых солей или их комплексов. Фармацевтически приемлемые соли представляют
- 14 021168 собой соли, нетоксичные в количествах и концентрациях, в которых их вводят. Препарат таких солей может облегчать фармацевтическое применение путем изменения физических характеристик соединения без помехи для оказания им физиологического эффекта. Полезные изменения физиологических свойств включают снижение температуры плавления для облегчения введения через слизистую оболочку и увеличение растворимости для облегчения введения лекарственного средства в более высоких концентрациях. Фармацевтически приемлемая соль аспарагиназы может присутствовать в виде комплекса, признанного в данной области.
Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли, например, содержащие сульфат, гидрохлорид, фумарат, малеат, фосфат, сульфамат, ацетат, цитрат, лактат, тартрат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, циклогексилсульфамат и хиннат. Фармацевтически приемлемые соли можно получать из кислот, включая соляную кислоту, малеиновую кислоту, серную кислоту, фосфорную кислоту, сульфаминовую кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, молочную кислоту, винную кислоту, малоновую кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, бензолсульфоновую кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту, циклогексилсульфамовую кислоту, фумаровую кислоту и хинную кислоту.
Фармацевтически приемлемые соли также включают основно-аддитивные соли, например, содержащие бензатин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, меглумин, прокаин, алюминий, кальций, литий, магний, калий, натрий, аммоний, алкиламин и цинк, если присутствуют кислые функциональные группы, такие как карбоновая кислота или фенол (см., например, ΡαηίηβΙοη'κ РНагтасси11са1 Зйепсек, выше). Такие соли можно получать, используя соответствующие основания.
Фармацевтически приемлемые носители и/или эксципиенты можно также включать в фармацевтическую композицию по изобретению для облегчения введения конкретной аспарагиназы. Примеры носителей, подходящих для использования в практике изобретения, включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, такие как лактоза, глюкоза или сахароза, или различные типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла, полиэтиленгликоли и физиологически совместимые растворители. Примеры физиологически совместимых растворителей включают стерильные растворы воды для инъекций (ΑΡΙ), солевой раствор и декстрозу.
Фармацевтические композиции по изобретению можно водить различными способами, включая внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное, внутримышечное, пероральное, местное (трансдермальное) или через слизистую оболочку введение. В качестве системного введения предпочтительно пероральное введение. Для перорального введения, например, соединения можно формулировать в виде общепринятых пероральных лекарственных форм, таких как капсулы, таблетки и жидкие препараты, например, сиропы, эликсиры и концентрированные капли.
Альтернативно, можно использовать инъекции (парентеральное введение), например, внутримышечные, внутривенные, внутрибрюшинные и подкожные инъекции. Для инъекций фармацевтические композиции формулируют в виде жидких растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах или растворах, таких как физиологический раствор, раствор Хэнкса или раствор Рингера. Кроме того, соединения можно формулировать в твердой форме и растворять или суспендировать непосредственно перед использованием. Например, можно получать лиофилизированные формы конъюгата. В конкретном варианте осуществления конъюгат вводят внутримышечно. В другом конкретном варианте осуществления конъюгат вводят внутривенно.
Системное введение можно также осуществлять через слизистую оболочку или трансдермально. Для введения через слизистую оболочку или трансдермального введения в препарате используют смачивающие реагенты, соответствующие преодолеваемому барьеру. Такие смачивающие реагенты хорошо известны в данной области и включают, например, в случае введения через слизистую оболочку, соли желчных кислот и производные фузидиевой кислоты. Кроме того, для облегчения проникновения можно использовать детергенты. Для введения через слизистую оболочку можно использовать, например, назальные спреи, ингаляторы (для доставки в легкие), ректальные суппозитории или вагинальные суппозитории. Для местного введения соединения можно формулировать в виде растираний, мазей, гелей или кремов, хорошо известных в данной области.
Количество доставляемого конъюгата будет зависеть от множества факторов, например, 1С50, ЕС50, биологического времени полувыведения соединения, возраста, размеров, веса и физического состояния пациента, а также от заболевания или расстройства, от которого предстоит лечение. Важность этих и других факторов, которые следует учитывать, хорошо известны рядовым специалистам в данной области. Как правило, количество конъюгата для введения будет находиться в диапазоне от приблизительно 10 международных единиц на квадратный метр площади поверхности тела пациента (МЕ/м2) до 50000 МЕ/м2, с предпочтительным диапазоном доз от приблизительно 1000 до приблизительно 15000 МЕ/м2, с более предпочтительным диапазоном доз от приблизительно 6000 до приблизительно 15000 МЕ/м2 и с особенно предпочтительным диапазоном доз от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м2 (приблизительно 20-30 мг белка/м2) для лечения злокачественных гематологических заболеваний, например, лейкоза. Как правило, такие дозы вводят посредством внутримышечной или внутривенной инъекции с интервалом от приблизительно 3 раза в неделю до приблизительно одного раза в месяц, как пра- 15 021168 вило, один раз в неделю или один раз в две недели в ходе терапии. Разумеется, можно использовать другие дозировки и/или схемы лечения, определяемые лечащим врачом.
В конкретных вариантах осуществления конъюгат и/или фармацевтическая композиция или препарат для введения, описанные в данном документе, содержат Ь-аспарагиназу из видов Египта, более конкретно Ег\\киа скгукаШкетг, еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность δΞΟ ГО №: 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит Ь-аспарагиназу из видов Египта, более конкретно Египта скгукаткетг, еще более конкретно Ь-аспарагиназу, содержащую последовательность δΞΟ ГО №: 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) являются пегилированными.
Примеры
Пример 1. Получение рекомбинантной кризантаспазы
Рекомбинантным штаммом бактерий, используемым для производства голого рекомбинантного белка Ь-аспарагиназы из Египта скгукаШкепи (также называемого в данном документе ркризантаспаза) являлся штамм ВЬ21 Е. сок с делетированным геном апкВ (ген, кодирующий эндогенную Ь-аспарагиназу типа II Е. сок), чтобы избежать потенциального загрязнения рекомбинантной Ьаспарагиназы Епуииа скгукаШкепи этим ферментом. Для делеции гена апкВ используют методы гомологичной рекомбинации и фаговой трансдукции, выполняемой согласно следующим трем этапам:
1) бактериальный штамм (ΝΜ 1100), экспрессирующий дефектный фаг лямбда, который обеспечивает функции защиты и рекомбинации введенного электропорацией линейного ДНК субстрата в бактериальной клетке, трансформировали линейной плазмидой (канамициновая кассета), содержащей ген канамицина, фланкированный целевой последовательностью узнавания РЬР (РКТ). Происходила рекомбинация для замены гена апкВ канамициновой кассетой в бактериальном геноме, приводящая к созданию штамма АапкВ;
2) фаговую трансдукцию использовали для интеграции области интегрированной канамициновой кассеты из штамма АапкВ ΝΜ 1100 в локус апкВ штамма ВЬ21. Это привело к созданию штамма ВЬ21 Е. сок с делетированным геном апкВ, обладающего устойчивостью к канамицину;
3) этот штамм трансформировали РЬР-хелперной плазмидой для удаления гена канамицина путем гомологичной рекомбинации по последовательности РКТ. Геном конечного штамма секвенировали (штамм ВЬ21 АапкВ), подтверждая полную делецию эндогенного гена апкВ.
Оптимизированную последовательность ДНК Е. сок, кодирующую зрелую Ь-аспарагиназу из Египга скгукаШкетг, слитую с сигнальным пептидом ΞΝΧ из ВасШик киЫШк, встраивали в экспрессионный вектор. Этот вектор делает возможной экспрессию рекомбинантной Ь-аспарагиназы из Епуииа скгукаШкетг под контролем гибридного промотора Т5/1ас, индуцируемого добавлением изопропил-в-Э-1тиогалактопиранозида (1РТО), и придает устойчивость к канамицину.
Штамм ВЬ21 АапкВ трансформировали данным экспрессионным вектором. Трансформированные клетки использовали для продукции р-кризантаспазы путем ферментации глюкозы по технологии ГеекЫа1ск в среде Рейзенберга. Индукцию клеток проводили в течение 16 ч при 23°С с 1РТО в качестве индуктора. После сбора клеток и лизиса путем гомогенизации в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 6, 5 мМ ЭДТА (буфер А), раствор белка осветляли центрифугированием дважды при 15000 д, с последующими этапами фильтрования через 0,45- и 0,22-мкм фильтры. Затем рекомбинантную Ь-аспарагиназу из Епуина скгукаШкетг очищали с помощью последовательных этапов хроматографии и концентрирования. Вкратце, теоретическая изоэлектрическая точка Ь-аспарагиназы Египта скгукаШкетг (7,23) позволяет рекомбинантному ферменту адсорбироваться на катионообменных смолах при рН 6. Таким образом, рекомбинантный фермент оставался на колонке Сар1о δ (катионообменная хроматография) и элюировался градиентом соли в буфере А. Фракции, содержащие рекомбинантный фермент, объединяли. Затем объединенный раствор очищали на колонке Сар1о ММС (катионообменная хроматография) в буфере А с градиентом соли. Элюированные фракции, содержащие Ь-аспарагиназу Египта скгукаШкетг, объединяли и концентрировали перед разделением белков методом гель-фильтрации на колонке с δире^кеx 200 пг в качестве завершающего этапа очистки. Фракции, содержащие рекомбинантный фермент, объединяли, концентрировали и диафильтровали против 100 мМ натрий-фосфатного буфера рН 8. Чистоту конечного препарата Ь-аспарагиназы Египта скгукаШкетг оценивали методом δΌδ-ПААГ (фиг. 1) и ОФ-ВЭЖХ, и она составляла по меньшей мере 90%. Целостность рекомбинантного фермента проверяли Ν-концевым секвенированием и ЖХ-МС. Активность фермента измеряли при 37°С с помощью реагента Несслера. Специфическая активность очищенной рекомбинантной Ь-аспарагиназы Епуииа скгукаШкетг составляла приблизительно 600 Ед/мг. Одну единицу ферментативной активности определяют как количество фермента, высвобождающее 1 мкмоль аммиака из Ь-аспарагина в минуту при 37°С.
Пример 2. Получение конъюгатов 10-кДа мПЭГ-Ь-аспарагиназы
Раствор Ь-аспарагиназы из Египта скгукаШкетг перемешивали в 100 мМ натрий-фосфатном буфере
- 16 021168 при рН 8,0 с концентрацией белка от 2,5 до 4 мг/мл в присутствии 150 или 36 мг/мл 10-кДа мПЭГ-ΝΗδ в течение 2 ч при 22°С. Полученную неочищенную 10-кДа мПЭГ-Ь-аспарагиназу очищали гельхроматографией на колонке с 8ирегбех 200 пг, используя систему Ак(а рштйег ИРС 100. Содержащие белок фракции объединяли и концентрировали, получая концентрацию белка от 2 до 8 мг/мл. Таким способом получали два конъюгата 10-кДа мПЭГ-Ь-аспарагиназы, различающиеся по степени пегилирования, что определяли анализом ΤΝΒδ с немодифицированной Ь-аспарагиназой в качестве образца сравнения, один из них соответствовал полному пегилированию (100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца), при этом конъюгируемые остатки соответствовали пегилированию 78% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца)); а второй соответствовал частичному пегилированию (39% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) или приблизительно 50% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца)). Анализ в δΌδ-ПААГ конъюгатов представлен на фиг. 2. Полученные конъюгаты выглядели как практически гомогенные полосы и не содержали поддающейся определению немодифицированной р-кризантаспазы.
Пример 3. Получение конъюгатов 5-кДа мПЭГ-Ь-аспарагиназы
Раствор Ь-аспарагиназы из Ег\уииа сНгу-каШНени перемешивали в 100 мМ натрий-фосфатном буфере при рН 8,0 с концентрацией белка 4 мг/мл в присутствии 150 или 22,5 мг/мл 5-кДа мПЭГ-ΝΗδ в течение 2 ч при 22°С. Полученную неочищенную 5-кДа мПЭГ-Ь-аспарагиназу очищали гель-хроматографией на колонке с δире^беx 200 пг, используя систему Ак(а рипйег ИРС 100. Содержащие белок фракции объединяли и концентрировали, получая концентрацию белка от 2 до 8 мг/мл. Таким способом получали два конъюгата 5-кДа мПЭГ-Ь-аспарагиназы, различающиеся по степени пегилирования, что определяли анализом ΤΝΒδ с немодифицированной Ь-аспарагиназой в качестве образца сравнения, один из них соответствовал полному пегилированию (100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Νконца), при этом конъюгируемые остатки соответствовали пегилированию 84% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца)); а второй соответствовал частичному пегилированию (36% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) или приблизительно 43% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца)). Анализ в δΌδ-ПААГ конъюгатов представлен на фиг. 2. Полученные конъюгаты выглядели как практически гомогенные полосы и не содержали поддающейся определению немодифицированной р-кризантаспазы.
Пример 4. Получение конъюгатов 2-кДа мПЭГ-Ь-аспарагиназы
Раствор Ь-аспарагиназы из Епуииа сНгу-каШНени перемешивали в 100 мМ натрий-фосфатном буфере при рН 8,0 с концентрацией белка 4 мг/мл в присутствии 150 или 22,5 мг/мл 2-кДа мПЭГ-ΝΗδ в течение 2 ч при 22°С. Полученную неочищенную 2-кДа мПЭГ-Ь-аспарагиназу очищали гель-хроматографией на колонке с δире^беx 200 пг, используя систему Ак(а ригШег ИРС 100. Содержащие белок фракции объединяли и концентрировали, получая концентрацию белка от 2 до 8 мг/мл. Таким способом получали два конъюгата 5-кДа мПЭГ-Ь-аспарагиназы, различающиеся по степени пегилирования, что определяли анализом ΤΝΒδ с немодифицированной Ь-аспарагиназой в качестве образца сравнения, один из них соответствовал полному пегилированию (100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Νконца), при этом конъюгируемые остатки соответствовали пегилированию 86% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца)); а второй соответствовал частичному пегилированию (47% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца) или приблизительно 55% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Ν-конца)). Анализ в δΌδ-ПААГ конъюгатов представлен на фиг. 2. Полученные конъюгаты выглядели как практически гомогенные полосы и не содержали поддающейся определению немодифицированной р-кризантаспазы.
Пример 5. Активность конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы
Аминогидролазную активность Ь-аспарагиназы каждого конъюгата, описанного в предшествующих примерах, определяли методом Несслера на основании количества аммиака, высвобождающегося из Ьаспарагина в результате ферментативной активности. Вкратце, 50 мкл раствора фермента смешивали с 20 мМ Ь-аспарагином в 50 мМ натрий-боратном буфере, рН 8,6, и инкубировали в течение 10 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл реактива Несслера. Поглощение этого раствора измеряли при 450 нм. Активность рассчитывали на основании калибровочной кривой, полученной с сульфатом аммония в качестве образца сравнения. Результаты приведены в табл. 2 ниже.
- 17 021168
Таблица 2. Активность конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы
Образец* Моль ПЭГ/моль мономера** Специфическая активность [Ед/мг] Относительная активность %
10-кДа мПЭГ-р- кризантаспаза 40% 7,0 543 87
10-кДа мПЭГ-р- кризантаспаза 100% 14,1 541 87
5-кДа мПЭГ-р- кризантаспаза 40% 6,5 501 81
5-кДа мПЭГ-р- кризантаспаза 100% 15,1 483 78
2-кДа мПЭГ-р- кризантаспаза 40% 8,5 524 84
2-кДа мПЭГ-р- кризантаспаза 100% 15,5 515 83
р-кризантаспаза - 622 100
* цифры 40% и 100% указывают примерную степень пегилирования, соответственно, 40-55 и 100% доступных аминогрупп (см. примеры 2-4, выше). ** отношение моль ПЭГ/моль мономера экстраполировано из данных анализа ΤΝΒ3, который предполагает, что все аминогруппы из белка (например, остатки лизина и Ν-конец) доступны.
Остаточная активность конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы находилась в диапазоне от 483 до 543 ед./мг. Это соответствует 78-87% аминогидролазной активности в отношении Ь-аспарагина немодифицированного фермента.
Пример 6. Ь-аспарагин-истощающий эффект немодифицированной кризантаспазы
Фармакодинамический профиль Егушаке® определяли у гибридов Β6Ό2Ρ1 (иммунокомпетентных самок), приобретенных у компании Скаг1е8 Ыуег, Германия. Егдаиаке® является коммерчески доступной кризантаспазой (Ь-аспарагиназой из Егу1та скгукаШкепн). Вкратце, 2 животных в группе получали одну в/в инъекцию 5, 25, 125 или 250 ед./кг Ьу Егушаке®. В моменты времени -1 ч до введения и 6, 12, 24 и 48 ч после введения образцы плазмы собирали из орбитального синуса и анализировали на уровни Ьаспарагина в плазме.
Уровни аминокислот в плазме определяли с помощью набора для анализа аминокислот ΡΚ.'Θ-ΤΛΟ (Аа1ег§). Вкратце, образцы плазмы депротеинизировали осаждением метанолом. Свободные аминокислоты в супернатанте дериватизировали фенилизотиоцианатом и количественно определяли методом ОФВЭЖХ.
Как показано на фиг. 3, дозы 5 и 25 Ед/кг не были эффективны в истощении уровней Ь-аспарагина у мышей после в/в введения. Только доза 250 Ед/кг вызывала полное истощение на протяжении 48 ч.
Этот результат свидетельствует о клинических ограничениях Егушаке®, немодифицированной кризантаспазы, которую необходимо вводить вплоть до 3 раз в неделю болезненными инъекциями пациентам, страдающим от ОЛЛ, и которая в высоких дозах приводит к быстрому появлению аллергических реакций и иммуногенности.
Пример 7. Ь-аспарагин-истощающий эффект и активность Ь-аспарагина в плазме после однократного введения шести конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы
Фармакодинамические и фармакокинетические профили 6 различных конъюгатов мПЭГ-ркризантаспазы определяли у гибридов Β6Ό2Ρ1 (иммунокомпетентных самок), приобретенных у компании Скаг1е8 Кгуег, Германия. Шесть тестированных конъюгатов отличались молекулярным размером ПЭГ (2, 5 или 10 кДа) и степенью пегилирования (максимальное против частичного пегилирования). Немодифицированную кризантаспазу (Егушаке®) использовали в качестве образца сравнения. Вкратце, 4 животных в группе получали одну в/в инъекцию 5 Ед/кг Ьу конъюгата против 250 Ед/кг Ьу Егу1иа8е®. В моменты времени -1 ч до введения и 6, 12, 24, 48, 96 и 192 ч после инъекции образцы плазмы собирали из орбитального синуса каждого животного и анализировали на уровни Ь-аспарагина в плазме и остаточную ферментативную активность, соответственно.
Уровни аминокислот в плазме определяли с помощью набора для анализа аминокислот ΡΚ.'Θ-ΤΛΟ (Аа1ег§). Вкратце, образцы плазмы депротеинизировали осаждением метанолом. Свободные аминокислоты в супернатанте дериватизировали фенилизотиоцианатом и количественно определяли методом ОФВЭЖХ.
Ферментативную активность в плазме определяли хромогенным анализом. β-Гидроксамат Ьаспарагиновой кислоты (АНА) использовали в качестве субстрата. Ферменты гидролизовали АНА до ЬАкр и гидроксиламина, который определяли при 710 нм после конденсации с 8-гидроксихинолином и окисления до индооксина (статья Аиа1уйса1 ВюскеиикЦу 309 (2002): 117-126, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки).
Как показано на фиг. 4, конъюгаты, введенные в дозе 5 Ед/кг, демонстрировали эффективность истощения Ь-аспарагина, по меньшей мере, такую же высокую, как и у Егу1иа8е 250 Ед/кг, из чего следует, что пегилирование повышает эффективность белка по меньшей мере в 50 раз. Все конъюгаты демонст- 18 021168 рировали сходную эффективность, истощая уровни Ь-аспарагина в плазме в течение 2 дней, за исключением 5-кДа-100% конъюгата, который отличался более длительным действием (96 ч = 4 дня по сравнению с 48 ч = 2 дня для других конъюгатов).
Таким образом, увеличение размера ПЭГ, конъюгированного с р-кризантаспазой, с 2 до 5 кДа приводило к возрастанию эффективности и продолжительности действия. Однако, на удивление, увеличение размера ПЭГ до 10 кДа больше не увеличивало эффективность и продолжительность действия конъюгата, это даже приводило к снижению по сравнению с 5-кДа максимально пегилированным конъюгатом.
Ферментативная активность согласовалась с истощением Ь-аспарагина. Как показано на фиг. 5, 5кДа-100% конъюгат отличался наибольшей величиной АИС, что отражало более длительное время полувыведения. Более низкие величины АИС наблюдали в случае ПЭГ-40% (частично пегилированных) против ПЭГ-100% (максимально пегилированных) конъюгатов для 2- и 5-кДа кандидатов и не наблюдали никакой разницы в случае 10-кДа кандидатов.
В соответствии с данными по истощению Ь-аспарагина, увеличение молекулярного размера ПЭГ, конъюгированного с р-кризантаспазой, с 2 до 5 кДа приводило к более длительной циркуляции Ьаспарагиназной активности. Однако, на удивление, увеличение размера ПЭГ до 10 кДа больше не увеличивало ферментативную активность конъюгата ίη νίνο, это даже приводило к снижению по сравнению с 5-кДа максимально пегилированным конъюгатом. Кроме того, примечательно, что когда р-кризантаспаза была монопегилирована по Ν-концу с помощью мПЭГ с высокой молекулярной массой (то есть 40 кДа), не было никакого существенного влияния на устойчивость фермента к протеолизу ίη νίΐτο (данные не представлены).
Пример 8. Дозозависимые эффекты двух конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы на Ь-аспарагин в плазме
Фармакодинамический профиль 2 конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы в сравнении с пегаспаргазой (С^абрат ) определяли у гибридов Β6Ό2Ρ1 (иммунокомпетентных самок), приобретенных у компании Сйаг1ек Ыуег, Германия. Тестированными конъюгатами были 2-кДа максимально (100%) пегилированная р-кризантаспаза и 5-кДа максимально (100%) пегилированная р-кризантаспаза в 3 дозах. Вкратце, 8 животных в группе получали одну в/в инъекцию 5, 25 или 50 Ед/кг Ьу конъюгатов р-кризантаспазы, что соответствовало 10, 50 или 100 мкг белка/кг. Для сравнения тестировали Оηсакρа^® в дозе 1 Ед/кг, что соответствовало 10 мкг белка/кг. В моменты времени -1 ч до введения и 90 мин, 6, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 192 и 240 ч после введения образцы плазмы собирали из орбитального синуса и анализировали на уровни Ь-аспарагина в плазме.
Уровни аминокислот в плазме определяли с помощью набора для анализа аминокислот Р1СО-ТАО (^а!егк). Вкратце, образцы плазмы депротеинизировали осаждением метанолом. Свободные аминокислоты в супернатанте дериватизировали фенилизотиоцианатом и количественно определяли методом ОФВЭЖХ.
Дозозависимые эффекты конъюгатов на уровни Ь-аспарагина в плазме представлены на фиг. 6. Как показано на фиг. 6А и 6В, оба конъюгата были высокоэффективны в истощении циркулирующего Ьаспарагина. В случае 2-кДа-100% конъюгата, полное истощение наблюдали на протяжении 3, 6 и по меньшей мере 10 дней при дозах 5, 25 и 50 Ед/кг, соответственно. В случае 5-кДа-100% конъюгата, полное истощение наблюдали на протяжении 3, 10 и 10 дней при дозах 5, 25 и 50 Ед/кг, соответственно. В случае обоих протестированных конъюгатов дозы 5, 25 и 50 Ед/кг соответствовали 10, 50 и 100 мкг/кг, исходя из содержания белка, что является очень малым количеством белка в сравнении с другими имеющимися в продаже препаратами Ь-аспарагиназы. Действительно, 250 Ед/кг Егутаке®® соответствует приблизительно 520 мкг/кг, а 1 Ед/кг Оηсакρа^® соответствует приблизительно 10 мкг/кг (исходя из содержания белка). На фиг. 6С показано, что введение эквивалентного количества белка (10 мкг/кг) либо 2кДа-100% конъюгата, 5-кДа-100% конъюгата, либо Оηсакρа^® приводило к сходному истощению Ьаспарагина на протяжении 72 ч.
Пример 9. Фармакокинетические профили двух конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы
Фармакокинетический профиль конъюгатов мПЭГ -р-кризантаспазы определяли у гибридов Β6Ό2Ρ1 (иммунокомпетентных самок), приобретенных у компании Сйаг1ек Ыуег, Германия. Тестированными конъюгатами были 2-кДа максимально (100%) пегилированная р-кризантаспаза и 5-кДа максимально (100%) пегилированная р-кризантаспаза в 3 дозах. Немодифицированная кризантаспаза (Епутаке®®) в дозе 250 Ед/кг и Онсакраг®® в дозе 1 Ед/кг также тестировали в качестве контролей. Вкратце, 8 животных в группе получали одну в/в инъекцию 5, 25 или 50 Ед/кг Ьу каждого из конъюгатов мПЭГ-ркризантаспазы в сравнении с Егушаке® и Онсакраг®®. В моменты времени -1 ч до введения и 90 мин, 6, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 192 и 240 ч после введения образцы плазмы собирали из орбитального синуса и анализировали на уровни в плазме остаточной ферментативной активности.
Ферментативную активность в плазме определяли хромогенным анализом. β-Гидроксамат Ьаспарагиновой кислоты (АНА) использовали в качестве субстрата. Ферменты гидролизовали АНА до ЬАкр и гидроксиламина, который определяли при 710 нм после конденсации с 8-гидроксихинолином и окисления до индооксина. (Аηа1уΐ^са1 Вюсйетлкйу 309 (2002): 117-126).
- 19 021168
Для расчета времени полувыведения строили экспоненциальные наилучшие эмпирические кривые соответствующих остаточных активностей в плазме, используя функциональные возможности и инструменты М§-ехсе1. Отрицательные значения активности исключали из расчетов.
Параметр Определение
Атах Максимальная остаточная ферментативная активность
Время до Атах после воздействия тестируемым веществом
Максимальная продолжительность А™»-, или А выше нуля
Время полувыведения остаточной ферментативной активности в плазме выводили из следующей формулы, используя функциональные возможности и инструменты М8-ехсе1 и соответствующие формулы экспоненциальных наилучших эмпирических кривых.
Среднее
-7«2х/ 1/2 /и(с,/с„) где ί1/2 представляет собой время полувыведения, ί представляет собой момент времени, с представляет собой остаточную активность в плазме в момент времени и С0 представляет собой остаточную активность в плазме в начальный момент времени.
Площадь под кривой (АИС) рассчитывали при помощи программы δίβΐηαΡΙοΙ версия 11. Фармакокинетические данные приведены в табл. 3 и 4 ниже и на фиг. 7-9.
Таблица 3. Первичная фармакокинетика при однократном воздействии 250 Ед/кг Е\у Ег\утаке®, 1 Ед/кг
Εν пегаспаргазы (ΟικαφαΓ®) или 100% конъюгатов 2-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы (остаточная ферментативная активность в плазме)
Параметр Егмьпазе’ Пегаспаргаза 1 Ед/кг Εν 2-кДа/100% 5 Ед/кг Εν 2-кДа /100% 25 Ед/кг Εν 2-кДа /100% 50 Ед/кг Ем
Атах 83,9 Ед/л б Ед/л 14 Ед/л 153 Ед/л 208 Ед/л
кдлих б Ч 90 мин 90 мин б ч 6 ч
ЙАтах выше нуля 18 ч бч - 24 ч 46,5 ч 90 мин -48 ч 70,5 ч 90 мин - 72 238,5 ч 90 мин - 24 0 ч 238,5 ч 90 мин - 240 ч
АИС (средняя) 1205 222 627 12446 28349
Чг/г б Ч 28 ч 31 Ч 55 ч 85 ч
Таблица 4. Первичная фармакокинетика при однократном воздействии 250 Ед/кг Εν Енуите®, 1 Ед/кг Εν пегаспаргазы (ΟικαφαΓ®) или 100% конъюгатов 5-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы (остаточная ферментативная активность в плазме)
Параметр Егмлпазе Пегаспаргаза 1 Ед/кг Ьм 5-кДа /100% 5 Ед/кг Εν 5-кДа /100% 25 Ед/кг Εν 5-кДа /100% 50 Ед/кг Εν
83,9 Ед/л 6 Ед/л 13 Ед/л 188 Ед/л 226 Ед/л
Ц.., 6 ч 90 мин 90 мин 6 ч 48 ч
выше нуля 18 ч 6ч - 24 ч 46,5 ч 90 мин - 48 94,5 ч 90 мин - 96 ч 238,5 Ч 90 мин - 240 ч 238,5 ч 90 мин - 240 ч
дис (средняя) 1205 222 798 19748 33151
Εΐ/2 б ч 28 Ч 38 ч 63 ч 104 Ч
Данные свидетельствуют о том, что пегилирование р-кризантаспазы значительно продлевает время полувыведения по сравнению с немодифицированной кризантаспазой, к тому же дозозависимым образом (табл. 3 и 4, фиг. 7-9). Кроме того, при сравнении в одинаковых уровнях доз величины АИС, измеренные для 5-кДа-100%, были выше, чем таковые, наблюдаемые в случае 2-кДа-100% конъюгатов. Постоянно наблюдали разницу в 21, 37 и 14% в пользу 5-кДа-100% конъюгата при дозах 5, 25 и 50 Ед/кг, соответственно (фиг. 8). 5-кДа-100% Конъюгат, судя по всему, также имел более продолжительное время полувыведения по сравнению с собственно Οκα^αι® при тестировании в той же дозе, исходя из содержания белка, как показано на фиг. 9 и в выведенных фармакокинетических параметрах, приведенных в табл. 4. Превосходящие фармакокинетические профили для конъюгатов из Енуи®! были неожиданными, поскольку известно, что Ь-аспарагиназа из Е. той имеет более продолжительное время полувыведения в организме человека и животных, чем Ь-аспарагиназа из Е^ν^п^а сй^уκαпίйет^ (кризантаспаза). Следовательно, логично было бы предположить, что у пегилированной Ь-аспарагиназы из Е. той (пегаспаргазы) будет более продолжительное время полувыведения по сравнению с пегилированной р-кризантаспазой. Однако неожиданным и благоприятным фактом явилось то, что пегилированная р-кризантаспаза имеет более продолжительное время полувыведения, чем пегаспаргаза.
Ниже в табл. 5 приведены фармакокинетические и фармакодинамические данные, собранные из нескольких экспериментов, включая те, которые описаны в примерах 7-9 в данном документе, демонстрирующие, что: 1) как 2-кДа-100%, так и 5-кДа-100% конъюгаты были высокоэффективными с точки зрения возрастания эффективности и продолжительности действия кризантаспазы, о чем свидетельствуют заметные различия, наблюдаемые в сравнении с Епуишке®; 2) 5-кДа-100% конъюгат действовал более продолжительное время, чем оба 2-кДа-100% конъюгат и Οικ^ιρη®, о чем свидетельствует более про- 20 021168 должительное время полувыведения, наблюдаемое при всех тестируемых дозах. С учетом удивительно невысоких результатов, полученных с 10-кДа-100% конъюгатом, эти данные свидетельствуют о том, что преимущество от пегилирования возрастает с увеличением размера фрагмента ПЭГ, заякоренного на кризантаспазе, вплоть до 5 кДа. Более высокая молекулярная масса ПЭГ не добавляет дополнительных преимуществ и, по меньшей мере, в случае 10 кДа может даже наносить вред. Это неожиданно и противоречит результатам, полученным, например, когда НоБзЪегд с соавторами конъюгировали ПЭГ, имеющий различную молекулярную массу, с аргининдезаминазой, другим разрушающим аминокислоту ферментом, выделенным из микробного источника. В этих исследованиях фармакокинетическая и фармакодинамическая функция фермента аргининдезаминазы возрастала с увеличением размера присоединенного фрагмента ПЭГ от молекулярной массы 5000 до 20000 Да (статья Но11зЪег§, Б. V., 1оигпа1 о£ Соп1го11еб Ке1еазе 80 (2002), 259-271, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки).
Таблица 5
ЕгуИпаве* 2-кДа-100% мПЭГ-р- кризантаспаза 5-кДа-100% мПЭГ-р- кризантаспаза Опсазраг
Доза (мкг/кг) 520 10 50 10 50 10 50
Доза (Ед/кг) 250 5 25 5 25 1 5
Т1/5 (ч) б 31 55 38 63 28 51
Продолжительность истощения Ь- аспарагина (дни) 2 2-3 € 3-4 10+ 3 8 +
Кроме того, как показано ниже более подробно, данные по иммуногенности свидетельствуют о том, что 10-кДа-100% конъюгат отличался неприемлемым профилем иммуногенности, основным недостатком с точки зрения введения соединения пациентам, страдающим аллергией к Б-аспарагиназе Е. соН или вырабатывающим антитела против Б-аспарагиназы. В этом отношении 10-кДа-100% конъюгат действительно не годится. Предпочтительными являются 2-кДа-100% и 5-кДа-100% конъюгаты, и 5-кДа-100% конъюгат является особенно предпочтительным.
Пример 10. Иммуногенность
Иммуногенность конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы определяли у гибридов Β6Ώ2Ε1 (иммунокомпетентных самок), приобретенных у компании Сйаг1ез К^ег, Германия. Животные получали дважды в неделю в недели 1, 2, 3, 4 и 8 введенные внутривенной инъекцией 250 Ед/кг Ъ\у Епутазе® и по 5 Ед/кг Ъ\у всех конъюгатов р-кризантаспазы. Образцы сыворотки собирали в моменты времени -1 ч до введения и через 1 неделю, 2 недели, 4 недели, 6 недель и 8 недель из орбитального синуса. Уровни в сыворотке антител против кризантаспазы или против мПЭГ-р-кризантаспазы определяли методом ЕБ18А. Результаты приведены на фиг. 10 и 11.
Высокие титры анти-кризантаспазных антител были обнаружены в случае Епутазе®, начиная с недели 2, и сохранялись в течение всего периода исследования. Напротив, никаких существенных уровней антител не наблюдали в случае конъюгатов р-кризантаспазы (фиг. 10).
Как показано на фиг. 11, продукция антител против конъюгата отличалась низкой интенсивностью и частотой в случае конъюгатов 2-кДа и 5-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы, и более высокие значения и частота наблюдались в случае конъюгатов 10-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы. Не было замечено четких различий между полностью и частично пегилированными конъюгатами (не показано).
Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что выбранная стратегия пегилирования снижала иммуногенность конъюгатов по сравнению с немодифицированной Б-аспарагиназой, значительно уменьшая продукцию анти-кризантаспазных антител. Однако антитела против конъюгатов были обнаружены, особенно в случае 10-кДа конъюгатов, и с меньшей интенсивностью в случае 2-кДа и 5-кДа конъюгатов.
В заключение, представляется, что пегилирование вплоть до 5 кДа было способно улучшать фармакокинетический профиль, эффективность и продолжительность действия р-кризантаспазы, при этом снижая иммуногенность по сравнению с немодифицированным белком, причем эффективность и продолжительность действия возрастали с увеличением размера используемого полимера и конъюгат 5-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы был немного более эффективным, чем конъюгат 2-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы. Однако дальнейшее увеличение размера ПЭГ до 10 кДа больше не увеличивало эффективность и продолжительность действия, поскольку конъюгат 10-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы был менее эффективен ίη ν^νο, чем конъюгат 5-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы, несмотря на сходную эффективность ίη ν^ΐ^ο. Кроме того, конъюгаты 10-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы демонстрировали неприемлемый профиль иммуногенности, неожиданный результат с учетом опубликованных результатов с другими белками.
Хотя варианты осуществления и применения настоящего изобретения были описаны более подробно в качестве иллюстраций и примеров, для специалистов в данной области очевидно, что возможны различные дополнительные модификации без отклонения от концепций изобретения, содержащихся в данном документе. Полное содержание всех цитированных в данном документе литературных источников включено в него посредством ссылок.

Claims (19)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Конъюгат, содержащий Ь-аспарагиназу из Епсийа сНгукаШНстк имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности ЗЕО ГО №: 1, и полиэтиленгликоль (ПЭГ), где ПЭГ имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да, а конъюгат имеет активность ίη νίίτο, составляющую по меньшей мере 60% активности Ь-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ.
  2. 2. Конъюгат по п.1, где указанная Ь-аспарагиназа имеет по меньшей мере 99% идентичности аминокислотной последовательности ЗЕО ГО №: 1.
  3. 3. Конъюгат по п.1, где указанная Ь-аспарагиназа представляет собой аминокислотную последовательность ЗЕО ГО №: 1.
  4. 4. Конъюгат по п.1, обладающий активностью истощения Ь-аспарагина, по меньшей мере приблизительно в 50 раз более сильной, чем у Ь-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ.
  5. 5. Конъюгат по п.1, снижающий уровни Ь-аспарагина в плазме до не поддающихся определению величин в течение по меньшей мере от 48 до 96 ч.
  6. 6. Конъюгат по п.1, где ПЭГ ковалентно связан с одной или более аминогруппами указанной Ьаспарагиназы.
  7. 7. Конъюгат по п.6, где ПЭГ ковалентно связан с указанными одной или более аминогруппами амидной связью.
  8. 8. Конъюгат по п.6, где ПЭГ ковалентно связан с по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп.
  9. 9. Конъюгат по п.1, имеющий формулу где Акр представляет собой Ь-аспарагиназу, ΝΗ представляет собой одну или более из ΝΗ-групп остатков лизина и/или Ν-конца в Акр, ПЭГ представляет собой фрагмент полиэтиленгликоля, η представляет собой число, соответствующее по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп в Акр, а х равен целому числу в диапазоне от 1 до 8.
  10. 10. Конъюгат по п.1, где указанный ПЭГ представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль.
  11. 11. Способ получения конъюгата по п.1, включающий объединение некоторого количества указанного ПЭГ с некоторым количеством указанной Ь-аспарагиназы в буферном растворе в течение периода времени, достаточного для ковалентного связывания указанного ПЭГ с указанной Ь-аспарагиназой.
  12. 12. Способ по п.11, где указанный буферный раствор имеет величину рН от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0.
  13. 13. Способ по п.11, где количество указанного ПЭГ соответствует молярному избытку полимера над аминогруппами в указанной Ь-аспарагиназе, меньшему чем приблизительно 20:1.
  14. 14. Способ по п.11, где указанный ПЭГ представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль.
  15. 15. Конъюгат по п.1, где указанный конъюгат имеет активность ίη νίίτο, составляющую по меньшей мере 70% активности Ь-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ.
  16. 16. Конъюгат по п.1, где указанный конъюгат имеет активность ίη νίίτο, составляющую по меньшей мере 80% активности Ь-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ.
  17. 17. Конъюгат по п.1, где указанный конъюгат имеет активность ίη νίίτο, составляющую по меньшей мере 87% активности Ь-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ.
  18. 18. Конъюгат, содержащий Ь-аспарагиназу из ЕгМша сНгукаШНстк имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности ЗЕО ГО №: 1, и полиэтиленгликоль (ПЭГ), где ПЭГ имеет молекулярную массу приблизительно 5000 Да, а конъюгат имеет повышенную остаточную ферментативную активность ίη νίίτο по сравнению с Ь-аспарагиназой Епуйиа сНгукаШНстк конъюгированной с ПЭГ с молекулярной массой приблизительно 10000 Да.
  19. 19. Конъюгат, содержащий Ь-аспарагиназу из ЕгМша сНгукаШНстк имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности ЗЕО ГО №: 1, и полиэтиленгликоль (ПЭГ), где ПЭГ имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да, а конъюгат имеет пониженную иммуногенность при введении субъекту-человеку с гиперчувствительностью к Ьаспарагиназе Е.сой.
EA201270134A 2009-07-06 2010-07-06 Пегилированная l-аспарагиназа EA021168B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22332009P 2009-07-06 2009-07-06
PCT/EP2010/054156 WO2011003633A1 (en) 2009-07-06 2010-03-30 Pegylated l-asparaginase
PCT/EP2010/059599 WO2011003886A1 (en) 2009-07-06 2010-07-06 Pegylated l-asparaginase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201270134A1 EA201270134A1 (ru) 2012-07-30
EA021168B1 true EA021168B1 (ru) 2015-04-30

Family

ID=42232655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201270134A EA021168B1 (ru) 2009-07-06 2010-07-06 Пегилированная l-аспарагиназа

Country Status (26)

Country Link
US (6) US20120100121A1 (ru)
JP (1) JP6014956B2 (ru)
KR (1) KR101731999B1 (ru)
CN (1) CN102573917B (ru)
AU (1) AU2010270294B2 (ru)
BR (1) BR112012000367A2 (ru)
CA (1) CA2767149C (ru)
CO (1) CO6612174A2 (ru)
DK (1) DK2451486T4 (ru)
EA (1) EA021168B1 (ru)
ES (1) ES2636476T5 (ru)
FI (1) FI2451486T4 (ru)
HK (1) HK1173092A1 (ru)
HU (1) HUE035771T2 (ru)
IL (1) IL217392A (ru)
IN (1) IN2012DN00958A (ru)
LT (1) LT2451486T (ru)
MA (1) MA33503B1 (ru)
MX (1) MX2012000424A (ru)
MY (1) MY180758A (ru)
NZ (1) NZ597912A (ru)
PE (2) PE20120501A1 (ru)
PT (1) PT2451486T (ru)
SG (1) SG176984A1 (ru)
UA (1) UA104634C2 (ru)
WO (2) WO2011003633A1 (ru)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE531779C2 (sv) * 2007-11-26 2009-08-04 Promimic Ab Framställning av kalciumfosfatpartiklar i nanostorlek som pulver eller beläggning via bifunktionella prekursorer
WO2011003633A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Alize Pharma Ii Pegylated l-asparaginase
WO2015033344A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Methods and kits for inhibiting pathogenicity of group a streptococcus (gas) or group g streptococcus (ggs)
WO2015038639A1 (en) * 2013-09-10 2015-03-19 Sandia Corporation Therapeutic asparaginases
CN104046600B (zh) * 2013-12-30 2019-04-05 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 多臂聚乙二醇修饰剂的新用途及其在修饰门冬酰胺酶中的应用
BR102014000585B1 (pt) 2014-01-10 2021-01-12 Coppe/Ufrj-Instituto Alberto Luiz Coimbra De Pós-Graduação l-asparaginase recombinante de zymomonas
US9808011B2 (en) 2014-12-15 2017-11-07 Biovectra Inc. Pentacyclic triterpene compounds and uses thereof
CN105802948B (zh) 2014-12-29 2020-06-09 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 聚乙二醇定点修饰的门冬酰胺酶及其制备方法与应用
ES2839212T3 (es) 2015-09-29 2021-07-05 Inst Nat Sante Rech Med Métodos para determinar el estado metabólico de linfomas B
CA3054286A1 (en) * 2016-03-01 2017-09-08 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois L-asparaginase variants and fusion proteins with reduced l-glutaminase activity and enhanced stability
HUE057856T2 (hu) 2016-06-01 2022-06-28 Servier Ip Uk Ltd Polialkilén-oxid-aszparagináz készítményei és eljárás ezek elõállítására és alkalmazására
US11602513B1 (en) 2016-07-22 2023-03-14 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11986451B1 (en) 2016-07-22 2024-05-21 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11504347B1 (en) 2016-07-22 2022-11-22 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
UY37341A (es) 2016-07-22 2017-11-30 Flamel Ireland Ltd Formulaciones de gamma-hidroxibutirato de liberación modificada con farmacocinética mejorada
US11602512B1 (en) 2016-07-22 2023-03-14 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11504418B2 (en) * 2016-11-04 2022-11-22 Crowpierce Technologies, Llc Endotoxin free asparaginase
BR112019027479A2 (pt) * 2017-06-21 2020-09-15 Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited l-asparaginase modificada
EP3418383A1 (en) * 2017-06-21 2018-12-26 XL-protein GmbH Modified l-asparaginase
US10174302B1 (en) 2017-06-21 2019-01-08 Xl-Protein Gmbh Modified L-asparaginase
SG11202002943PA (en) 2017-10-27 2020-05-28 Pfenex Inc Method for production of recombinant erwinia asparaginase
AU2018354068C1 (en) 2017-10-27 2023-03-23 Pelican Technology Holdings, Inc. Method for production of recombinant E. coli asparaginase
US20230173042A1 (en) * 2017-11-30 2023-06-08 Jazz Pharmaceuticals Ireland Ltd. Methods of treatment with asparaginase
EP3781197A4 (en) * 2018-04-19 2022-03-16 Kindred Biosciences, Inc. ASPARAGINASE VARIANT POLYPEPTIDES FOR MEDICAL USE
US20210299233A1 (en) 2018-07-12 2021-09-30 The Children's Medical Center Corporation Method for treating cancer
JP2022514942A (ja) * 2018-12-24 2022-02-16 ジェノバ バイオファーマスーティカルズ リミテッド ペグアスパラガーゼの凍結乾燥組成物
BR112021013766A2 (pt) 2019-03-01 2021-09-21 Flamel Ireland Limited Composições de gama-hidroxibutirato com farmacocinética melhorada no estado alimentado
GB201912020D0 (en) * 2019-08-21 2019-10-02 Porton Biopharma Ltd Therapeutic Conjugate
JP2022553399A (ja) * 2019-10-25 2022-12-22 ジャズ ファーマシューティカルズ アイルランド リミテッド 組換えｌ－アスパラギナーゼ
KR102269634B1 (ko) * 2019-10-31 2021-06-25 대상 주식회사 ansB 유전자 불활성화에 의해 아미노산 생산능력이 향상된 균주
KR20230125179A (ko) 2020-12-23 2023-08-29 재즈 파마슈티칼즈 아일랜드 리미티드 전하-차폐 융합 단백질의 정제 방법
WO2022211829A1 (en) 2021-03-30 2022-10-06 Jazz Pharmaceuticals Ireland Ltd. Dosing of recombinant l-asparaginase
US11779557B1 (en) 2022-02-07 2023-10-10 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11583510B1 (en) 2022-02-07 2023-02-21 Flamel Ireland Limited Methods of administering gamma hydroxybutyrate formulations after a high-fat meal
WO2024008659A1 (en) 2022-07-04 2024-01-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of a l-asparaginase in combination with a ferroptosis inducer for the treatment of extranodal natural killer/t-cell lymphoma
WO2024015529A2 (en) 2022-07-14 2024-01-18 Jazz Pharmaceuticals Ireland Ltd. Combination therapies involving l-asparaginase

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003018742A2 (fr) * 2001-08-22 2003-03-06 Gosudarstvennoe Uchrezhdenie Nauchno-Issledovatelsky Institut Biomeditsinskoy Khimii Im. Orekhovicha Rossiiskoy Akademii Meditsinskikh Nauk L-asparaginase recombinante d'erwinia carotovora

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5766897A (en) 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
GB9017002D0 (en) 1990-08-02 1990-09-19 Health Lab Service Board Improved method for the purification of erwina l-asparaginase
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5776746A (en) 1996-05-01 1998-07-07 Genitope Corporation Gene amplification methods
US6309633B1 (en) 1999-06-19 2001-10-30 Nobex Corporation Amphiphilic drug-oligomer conjugates with hydroyzable lipophile components and methods for making and using the same
US20020065397A1 (en) 2000-10-12 2002-05-30 Joseph Roberts Protecting therapeutic compositions from host-mediated inactivation
US6913915B2 (en) * 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
US7803777B2 (en) 2003-03-14 2010-09-28 Biogenerix Ag Branched water-soluble polymers and their conjugates
US7985548B2 (en) 2006-03-03 2011-07-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Materials and methods directed to asparagine synthetase and asparaginase therapies
US20090167164A1 (en) 2006-04-21 2009-07-02 Konica Minolta Holdings, Inc. Gas barrier film, resin base for organic electroluminescent device, organic electroluminescent device using the same, and method for producing gas barrier film
AU2008225859B2 (en) * 2007-03-09 2014-06-26 Novozymes A/S Thermostable asparaginases
WO2011003633A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Alize Pharma Ii Pegylated l-asparaginase
US11433136B2 (en) 2015-12-18 2022-09-06 The General Hospital Corporation Polyacetal polymers, conjugates, particles and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003018742A2 (fr) * 2001-08-22 2003-03-06 Gosudarstvennoe Uchrezhdenie Nauchno-Issledovatelsky Institut Biomeditsinskoy Khimii Im. Orekhovicha Rossiiskoy Akademii Meditsinskikh Nauk L-asparaginase recombinante d'erwinia carotovora

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AVRAMIS VASSILIOS I. ET AL.: "Pharmacokinetic/pharmacodynamic relationships of asparaginase formulations: the past, the present and recommendations for the future". CLINICAL PHARMACOKINETICS, ADIS INTERNATIONAL LTD., AUCKLAND, NZ LNKD-DOI: 10.2165/00003088-200544040-00003, [Online] vol. 44, no. 4, 1 April 2005 (2005-04-01), pages 367-393, XP008105154, ISSN: 0312-5963. Retrieved from the Internet: URL:http://pharmacokinetics.adisonline.com/pt/re/cpk/abstract.00003088-200544040-00003.htm> Chapter 5.3 *
BILLETT A. L. ET AL.: "Allergic reactions to Erwinia asparaginase in children with acute lymphoblastic leukemia who had previous allergic reactions to Escherichia coli asparaginase". CANCER, 1 JUL 1992, LNKD-PUBMED: 1606543, vol. 70, no. 1, 1 July 1992 (1992-07-01), pages 201-206, XP002587207, ISSN: 0008-543X, "Discussion" *
DUVAL MICHEL ET AL.: "Comparison of Escherichia coli-asparaginase with Erwinia-asparaginase in the treatment of childhood lymphoid malignancies: results of a randomized European Organisation for Research and Treatment of Cancer-Children's Leukemia Group phase 3 trial". BLOOD, 15 APR 2002, LNKD-PUBMED: 11929760, vol. 99, no. 8, 15 April 2002 (2002-04-15), pages 2734-2739, XP002587208, ISSN: 0006-4971, "Discussion" *
GRAHAM MICHAEL L.: "Pegaspargase: a review of clinical studies". ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, 26 SEP 2003, LNKD-PUBMED: 14499708, vol. 55, no. 10, 26 September 2003 (2003-09-26), pages 1293-1302, XP002587206, ISSN: 0169-409X, pegaspargase *
KLUG ALBERTSEN B. ET AL.: "Comparison of intramuscular therapy with Erwinia asparaginase and asparaginase Medac: Pharmacokinetics, pharmacodynamics, formation of antibodies and influence on the coagulation system". BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY, 2001, GB LNKD-DOI: 10.1046/J.1365-2141.2001.03148.X, vol. 115, no. 4, 2001, pages 983-990, XP002587209, ISSN: 0007-1048, "Discussion" *
KUCHUMOVA A. V., KRASOTKINA Y. V., KHASIGOV P. Z., SOKOLOV N. N.: "Modification of recombinant asparaginase from Erwinia carotovora with polyethylene glycol 5000". BIOCHEMISTRY (MOSCOW) SUPPLEMENTAL SERIES B: BIOMEDICAL CHEMISTRY, vol. 1, no. 3, 4 September 2007 (2007-09-04), pages 230-232, XP002587203, DOI: 10.1134/S1990750807030092, whole document, in particular conjugate PEG-asparaginase *
ROBERTS M. J. ET AL.: "Chemistry for peptide and protein PEGylation". ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, ELSEVIER BV, AMSTERDAM, NL LNKD-DOI: 10.1016/S0169-409X(02)00022-4, vol. 54, no. 4, 17 June 2002 (2002-06-17), pages 459-476, XP002293146, ISSN: 0169-409X. Whole document, in particular abstract *
SOKOLOV N. N. ET AL.: "Design of recombinant L-Asparaginase erwinia carotovora drug with an antitumor action". MOLEKULYARNAYA MEDITSINA, IZDATEL'STVO MEDITSINA, RU, vol. 1, 1 January 2005 (2005-01-01), pages 45-53, XP008123303, ISSN: 1728-2918, figure 2 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012532185A (ja) 2012-12-13
HUE035771T2 (en) 2018-05-28
ES2636476T3 (es) 2017-10-05
CO6612174A2 (es) 2013-02-01
US20120100121A1 (en) 2012-04-26
AU2010270294B2 (en) 2015-06-25
USRE49736E1 (en) 2023-11-28
CN102573917A (zh) 2012-07-11
US11046946B2 (en) 2021-06-29
PE20161325A1 (es) 2016-12-30
US9920311B2 (en) 2018-03-20
WO2011003633A1 (en) 2011-01-13
FI2451486T4 (fi) 2023-04-25
NZ597912A (en) 2014-01-31
WO2011003886A1 (en) 2011-01-13
MA33503B1 (fr) 2012-08-01
ES2636476T5 (es) 2023-06-01
PT2451486T (pt) 2017-08-09
JP6014956B2 (ja) 2016-10-26
DK2451486T4 (da) 2023-04-17
CN102573917B (zh) 2015-06-17
US20210348151A1 (en) 2021-11-11
SG176984A1 (en) 2012-01-30
CA2767149A1 (en) 2011-01-13
MX2012000424A (es) 2012-07-23
US20160060613A1 (en) 2016-03-03
KR20120104154A (ko) 2012-09-20
LT2451486T (lt) 2017-11-10
US20200347374A1 (en) 2020-11-05
BR112012000367A2 (pt) 2018-01-02
KR101731999B1 (ko) 2017-05-11
UA104634C2 (en) 2014-02-25
EA201270134A1 (ru) 2012-07-30
MY180758A (en) 2020-12-08
US20180346900A1 (en) 2018-12-06
DK2451486T3 (en) 2017-08-28
IN2012DN00958A (ru) 2015-04-10
PE20120501A1 (es) 2012-05-31
HK1173092A1 (en) 2013-05-10
IL217392A0 (en) 2012-02-29
IL217392A (en) 2017-06-29
AU2010270294A1 (en) 2012-02-23
CA2767149C (en) 2019-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA021168B1 (ru) Пегилированная l-аспарагиназа
EP2451486B1 (en) Pegylated l-asparaginase
EP3642340B1 (en) Modified l-asparaginase
JP2024069234A (ja) アスパラギナーゼを用いた治療法
EP3418383A1 (en) Modified l-asparaginase
US11021690B2 (en) Mutant-type uricase, PEG modified mutant-type uricase, and application thereof
US11103565B2 (en) Site-specific polyethylene glycolylated (pegylated) asparaginase, preparation method therefor and use thereof
US10406235B2 (en) Use of multi-arm polyethylene glycol modifier and application of multi-arm polyethylene glycol modifier in L-asparaginasum modification
CN109963597A (zh) 聚乙二醇化血管内皮抑制素类似物及其应用
AU2018375183B2 (en) Methods of treatment with asparaginase
CN114854729A (zh) 定向化学偶联门冬酰胺酶突变体及其制备方法和应用
CN118497178A (zh) 精氨酸脱亚胺酶突变体、共价二聚体及其偶联物和应用
WO2006015512A1 (fr) Arginine déiminase modifiée

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU