CN102573917A

CN102573917A - 聚乙二醇化的l-天冬酰胺酶

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Publication number: CN102573917A
Application number: CN2010800303926A
Authority: CN
Inventors: T·阿布里巴
Original assignee: Alize Pharma 2 SAS
Current assignee: Jazz Pharmaceuticals PLC
Priority date: 2009-07-06
Filing date: 2010-07-06
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2030-07-06
Also published as: AU2010270294A1; USRE49736E1; WO2011003886A1; KR101731999B1; AU2010270294B2; SG176984A1; KR20120104154A; FI2451486T4; NZ597912A; US20210348151A1; IL217392A; DK2451486T3; EA021168B1; ES2636476T5; DK2451486T4; US20160060613A1; CO6612174A2; PE20161325A1; LT2451486T; US20200347374A1

Abstract

公开了具有实质上的L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白与聚乙二醇的缀合物。特别地，聚乙二醇具有的分子量小于或等于约5000Da并且所述蛋白为来自欧文氏菌的L-天冬酰胺酶。本发明的缀合物显示了优越的特性，例如维持高水平的体外活性和出人意料的体内半衰期的增加。还公开了生产所述缀合物的方法和所述缀合物在治疗中的用途。特别地，公开了使用所述缀合物治疗癌症的方法，特别是急性淋巴细胞白血病(ALL)。更特别地，公开了使用所述缀合物作为二线疗法而用于下列患者的方法：所述患者在用其它L-天冬酰胺酶制备物治疗后产生了超敏性或具有疾病复发。

Description

聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶

发明背景

发明领域

本发明涉及具有实质性的L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白质与聚乙二醇的缀合物，特别是其中所述聚乙二醇具有低于或等于约5000Da的分子量，特别涉及其中所述蛋白质是来自欧文氏菌(Erwinia)的L-天冬酰胺酶的缀合物，以及其在治疗中的用途。

背景技术

具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白(通常被称作L-天冬酰胺酶)已经多年被成功地用于治疗儿童中的急性淋巴细胞白血病(ALL)。ALL是最常见的儿童恶性肿瘤(Avramis and Panosyan，Clin.Pharmacokinet.(2005)44：367-393)。

L-天冬酰胺酶还被用于治疗何杰金氏病，急性骨髓白血病，急性骨髓单核细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，淋巴肉瘤，网状细胞肉瘤和黑素肉瘤(Kotzia and Labrou，J.Biotechnol.127(2007)657-669)。L-天冬酰胺酶的抗肿瘤活性被相信是由于某些恶性细胞不能合成L-天冬酰胺或降低了合成L-天冬酰胺的能力(Kotzia andLabrou，J.Biotechnol.127(2007)657-669)。这些恶性细胞依赖于L-天冬酰胺的细胞外供给。然而，L-天冬酰胺酶催化L-天冬酰胺水解为天冬胺酸和氨，从而耗尽循环的L-天冬酰胺库并杀死肿瘤细胞，所述肿瘤细胞在没有L-天冬酰胺时不能进行蛋白质合成(Kotzia andLabrou，J.Biotechnol.127(2007)657-669)。

来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶是用于ALL治疗的第一种酶药物并且在美国已作为

上市，或者在欧洲作为

和L-天冬酰胺酶

上市。也从其它的微生物中分离了L-天冬酰胺酶，例如，来自菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)的L-天冬酰胺酶蛋白，被命名为克立他酶(crisantaspase)，其作为

上市(Wriston Jr.，J.C.(1985)″L-asparaGlnase″Meth.Enzymol.113，608-618；Goward，C.R.等人.(1992)″Rapid large scalepreparation of recombinant Erwinia chrysanthemiL-asparaGlnase″，Bioseparation 2，335-341)。还鉴别了来自其它欧文氏菌菌种的L-天冬酰胺酶，包括例如菊欧文氏菌3937(Genbank登录号AAS67028)，菊欧文氏菌NCPPB 1125(Genbank登录号CAA31239)，胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)(Genbank登录号AAP92666)和胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种(Erwiniacarotovora subsp.Astroseptica)(Genbank登录号AAS67027)。这些菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶彼此间具有大约91％-98％的氨基酸序列同一性，而胡萝卜软腐欧文氏菌L-天冬酰胺酶与菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶具有大约75％-77％的氨基酸序列同一性(Kotzia and Labrou，J.Biotechnol.127(2007)657-669)。

细菌来源的L-天冬酰胺酶具有高免疫原和抗原潜力并且经常引起不良反应，所述不良反应的范围从轻度过敏反应到敏化患者中的过敏性休克(Wang，B.等人.(2003)″Evaluation of immunologic crossreaction of anti-asparaGlnase antibodies in acutelymphoblastic leukemia(ALL and lymphoma patients)，Leukemia 17，1583-1588)。大肠杆菌L-天冬酰胺酶是特别有免疫原性的，据报道在i.v.或i.m.施用之后，存在抗大肠杆菌L-天冬酰胺酶的抗天冬酰胺酶抗体：在成年人中高达78％；在儿童中为70％(Wang，B.等人.(2003)Leukemia 17，1583-1588)。

来自大肠杆菌和菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶在其药代动力学性质方面不同并且分别具有不同的免疫原性特征谱(Klug Albertsen，B.等人.(2001)″Comparison of intramuscular therapy with ErwiniaasparaGlnase and asparaGlnase Medac：pharmacokinetics，pharmacodynamics，formation of antibodies and influence on thecoagulation system″Brit.J.Haematol.115，983-990)。此外，已显示了在用来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶处理后产生的抗体不与来自欧文氏菌的L-天冬酰胺酶交叉反应(Wang，B.等人.，Leukemia 17(2003)1583-1588)。因此，来自(菊)欧文氏菌的L-天冬酰胺酶在对大肠杆菌L-天冬酰胺酶有反应的患者中，被用作ALL的二线治疗(Duval，M.等人.(2002)″Comparison of Escherichiacoli-asparaGlnase with Erwinia-asparaGlnase in the treatment ofchildhood lymphoid malignancies：results of a randomizedEuropean Organisation for Research and Treatment of Cancer，Children′s Leukemia Group phase 3 trial″Blood 15，2734-2739；Avramis and Panosyan，Clin.Pharmacokinet.(2005)44：367-393)。

在另一个为了减少与施用微生物的L-天冬酰胺酶相关的免疫原性的尝试中，产生了经甲氧基-聚乙二醇(mPEG)修饰的大肠杆菌L-天冬酰胺酶。此方法通常被称作″聚乙二醇化″并已经显示出改变蛋白质的免疫原性性质(Abuchowski，A.等人.(1977)″Alteration ofImmunological Properties of Bovine Serum Albumin by CovalentAttachment of Polyethylene Glycol，″J.Biol.Chem.252(11)，3578-3581)。这种所谓的mPEG-L-天冬酰胺酶，或培门冬酶(pegaspargase)作为

(Enzon Inc.，USA)上市，并于1994年首先在美国被批准作为ALL的二线治疗，并从2006年起被批准作为儿童和成人的ALL的一线疗法。具有延长的体内半衰期和降低的免疫原性/抗原性。

是大肠杆菌L-天冬酰胺酶，使用5kDa的mPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)对其在多个赖氨酸残基处进行了修饰(美国专利号4,179,337)。SS-PEG是第一代的PEG试剂，其含有对酶的水解敏感的、或者在微碱性pH值时不稳定的酯键(美国专利号4,670,417；Makromol.Chem.1986，187，1131-1144)。这些性质降低了体外和体内的稳定性并且可损害药物安全性。

此外，已显示了所产生的抗大肠杆菌L-天冬酰胺酶的抗体将与

交叉反应((Wang，B.等人.(2003)″Evaluation ofimmunologic cross-reaction of anti-asparaGlnase antibodies inacute lymphoblastic leukemia(ALL and lymphoma patients)，″Leukemia 17，1583-1588)。虽然这些抗体不是中和性的，但是这一发现清楚地表明了在体内的交叉超敏性或交叉失活的高可能性。的确，在一个报导中，30％-41％的接受了培门冬酶的儿童具有过敏反应(Wang，B.等人.(2003)Leukemia 17，1583-1588)。

除了外在的过敏反应之外，最近报导了“沉默超敏性”的问题，其中患者产生抗天冬酰胺酶抗体，但不显示出任何超敏反应的临床迹象(Wang，B.等人.(2003)Leukemia 17，1583-1588)。这种反应可引起形成抗大肠杆菌L-天冬酰胺酶和培门冬酶的中和抗体；然而，这些患者不被转向欧文氏菌L-天冬酰胺酶，因为没有外在的超敏迹象，因此，他们接受较短时期的有效治疗(Holcenberg，J.，J.Pediatr.Hematol.Oncol.26(2004)273-274)。

菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶治疗通常被用于对源自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶超敏的情形中。然而，观察到了多至30％-50％接受欧文氏菌L-天冬酰胺酶的患者是抗体阳性的(Avramis and Panosyan，Clin.Pharmacokinet.(2005)44：367-393)。此外，由于菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶比大肠杆菌L-天冬酰胺酶具有显著更短的清除半衰期，其必须被更经常地施用(Avramis and Panosyan，Clin.Pharmacokinet.(2005)44：367-393)。在Avramis等人的研究中，欧文氏菌天冬酰胺酶与差的药代动力学特征谱相关联(Avramis等人.，J.Pediatr.Hematol.Oncol.29(2007)239-247)。因此，相对于欧文氏菌L-天冬酰胺酶，大肠杆菌L-天冬酰胺酶和培门冬酶是优选的ALL的一线疗法。

许多生物制药品成功地被聚乙二醇化并上市了许多年。为了将PEG与蛋白质偶联，PEG必须在其OH端被活化。基于将被聚乙二醇化的蛋白质上可获得的反应基团来选择活化基团。在蛋白质的情形中，最重要的氨基酸是赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸，C-末端羧酸和N-末端氨基。鉴于蛋白质中广泛的反应基团，几乎整个肽化学均被应用于活化PEG部分。这种活化的PEG试剂的实例是活化的碳酸酯，例如，对硝基苯基碳酸酯、琥珀酰亚胺碳酸酯；活性酯，例如，琥珀酰亚胺酯；对于位点特异性偶联开发了醛和马来酰亚胺(Harris，M.，Adv.Drug Del.Rev.54(2002)，459-476)。用于PEG修饰的各种化学方法的可得性显示出对于聚乙二醇化蛋白的每种新开发都将是个案研究。除了化学过程之外，附着于蛋白的PEG的分子量对于聚乙二醇化的蛋白的药学性质也有强大的影响。在多数情况中，预期PEG的分子量越高，药学性质的改进越好(Sherman，M.R.，Adv.Drug Del.Rev.60(2008)，59-68；Holtsberg，F.W.，Journal of ControlledRelease 80(2002)，259-271)。例如，Holtsberg等人发现当PEG与精氨酸脱氨酶(分离自微生物来源的另一个氨基酸降解酶)缀合时，当PEG附着物的大小从分子量为5000Da增加到20,000Da时，酶的药代动力学和药效功能增加了(Holtsberg，F.W.，Journal ofControlled Release 80(2002)，259-271)。

然而，在许多情形中，与未修饰的的生物制药品相比，聚乙二醇化的生物制药品显示出显著减少的活性(Fishburn，C.S.(2008)Review″The Pharmacology of PEGylation：Balancing PD with PKto Generate Novel Therapeutics″J.Pharm.Sci.，1-17)。在来自胡萝卜软腐欧文氏菌的L-天冬酰胺酶的情形中，观察到了聚乙二醇化使其体外活性降低至大约57％(Kuchumova，A.V.等人.(2007)″Modification of Recombinant asparaGlnase from Erwiniacarotovora with Polyethylene Glycol 5000″Biochemistry(Moscow)Supplement Series B：Biomedical Chemistry，1，230-232)。来自胡萝卜软腐欧文氏菌的L-天冬酰胺酶与菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶(克立他酶)仅具有大约75％的同源性。对于

也已知与未修饰的大肠杆菌L-天冬酰胺酶相比，其体外活性为大约50％。

目前可得的L-天冬酰胺酶制备物不提供这样的备选或互补疗法-特别是治疗ALL的疗法：其特征在于高的催化活性和显著改进的药理学和药代动力学特性，以及降低的免疫原性。

发明简述

本发明涉及具有实质性的L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白与聚乙二醇的缀合物，其中聚乙二醇具有的分子量小于或等于大约5000Da，特别涉及其中所述蛋白质是来自欧文氏菌的L-天冬酰胺酶的缀合物。在一个实施方式中，所述缀合物包含来自欧文氏菌的L-天冬酰胺酶和聚乙二醇(PEG)，所述L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO：1的氨基酸具有至少80％的同一性，其中PEG具有的分子量小于或等于大约5000Da。在一个实施方式中，L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO：1的氨基酸具有至少大约80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一性。在一些实施方式中，PEG具有的分子量为大约5000Da，4000Da，3000Da，2500Da或2000Da。在一个实施方式中，与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物的体外活性为至少60％，65％，70％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在另一个实施方式中，与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有的L-天冬酰胺消耗活性为至少约10，20，30，40，50，60，70，80，90或100倍更有效。在另一个实施方式中，所述缀合物将血浆L-天冬酰胺水平消耗至检测不到的水平持续至少约12，24，48，96，108或120小时。

在一个实施方式中，与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有更长的体内循环半衰期。在具体的实施方式中，所述缀合物比以同等的蛋白剂量(例如以μg/kg测量的)施用的培门冬酶(即PEG缀合的、来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶)具有更长的t_1/2。在更具体的实施方式中，在于小鼠中i v施用之后，在剂量约50μg/kg(基于蛋白质含量)时，所述缀合物具有至少约58至约65小时的t_1/2，并且在剂量约10μg/kg(基于蛋白质含量)时，所述缀合物具有至少约34至约40小时的t_1/2。在另一个具体实施方式中，在大约10,000至大约15,000IU/m²(约20-30mg蛋白/m²)的剂量范围内，所述缀合物具有至少约100至约200小时的t_1/2。在一个实施方式中，与未和PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有更大的曲线下面积(AUC)。在具体的实施方式中，在相等的蛋白剂量，所述缀合物具有的平均AUC比培门冬酶大至少约3倍。

在一个实施方式中，PEG与L-天冬酰胺酶的一个或多个氨基共价连接(其中″氨基″包括赖氨酸残基和/或N-末端)。在更具体的实施方式中，PEG通过酰胺键与一个或多个氨基共价连接。在另一个具体的实施方式中，PEG共价连接于至少大约40％至大约100％可用的氨基(例如，赖氨酸残基和/或蛋白的N-末端)或者至少约40％至约90％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或蛋白的N-末端)。在一个实施方式中，缀合物具有下式：

Asp-[NH-CO-(CH2)x-CO-NH-PEG]n

其中Asp是L-天冬酰胺酶；NH是Asp的赖氨酸残基和/或N-末端的一个或多个NH基团；PEG是聚乙二醇部分；n是个数字，其代表Asp中至少约40％至约100％的可用的氨基(例如赖氨酸残基和/或N-末端)，而x是大约1至大约8、更特别地，大约2至大约5的整数。在具体的实施方式中，PEG为单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。

另一方面，本发明涉及制造缀合物的方法，其包括在经缓冲的溶液中使一定量的PEG与一定量的L-天冬酰胺酶相结合足以使PEG共价连接至L-天冬酰胺酶的一段时间。

另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的缀合物。

另一方面，本发明涉及治疗疾病的方法，所述疾病可由消耗患者中的L-天冬酰胺而治疗，所述方法包括施用有效量的本发明的缀合物。在一个实施方式中，所述疾病为癌症。在具体的实施方式中，所述癌症为ALL。在另一个具体的实施方式中，以大约5U/kg体重至大约50U/kg体重的量施用所述缀合物。在另一个具体实施方式中，所施用的缀合物的剂量范围为约10,000至约15,000 IU/m²(大约20-30mg蛋白/m²)。在一些实施方式中，所述施用可以是静脉内的或肌肉内的并且可以是少于每周一次(例如，每月一次或隔周一次)，每周一次，每周2次，或每周3次。在其它的具体实施方式中，所述缀合物作为单一疗法被施用，且更特别地，不含天冬酰胺合成酶抑制剂。在其它的实施方式中，所述缀合物作为组合疗法的一部分被施用(但是在一些实施方式中，所述组合疗法不包括天冬酰胺合成酶抑制剂)。在具体的实施方式中，接受治疗的患者对于大肠杆菌天冬酰胺酶或其聚乙二醇化的形式或者对于欧文氏菌天冬酰胺酶具有既往的超敏性。在另一个具体实施方式中，接受治疗的患者具有疾病复发，特别是在用大肠杆菌天冬酰胺酶或其聚乙二醇化的形式治疗后的复发。

附图说明

图1：纯化的重组菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在SDS-PAGE上分析纯化的重组的菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶(r-克立他酶)。用硝酸银对蛋白质条带进行染色。道1：分子量标记物(116，66.2，45，35，25，18.4和14.4kDa)，道2：纯化的重组菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶(r-克立他酶)。

图2：mPEG-r-克立他酶缀合物的SDS-PAGE分析。

图3：单一静脉内剂量的

(5U/kg，25U/kg，125U/kg和250U/kg体重)之后，血浆L-天冬酰胺的水平。

图4：在小鼠中单一的静脉内注射mPEG-r-克立他酶缀合物后，与

相比的血浆L-天冬酰胺水平。数字″40％″和″100％″分别表示大约40％-55％(部分聚乙二醇化的)和大约100％(最大程度聚乙二醇化的)可用的氨基的聚乙二醇化的大概程度。

图5：在小鼠中单一的静脉内注射mPEG-r-克立他酶缀合物后，从L-天冬酰胺酶特征谱计算出的曲线下面积(AUC)(残余酶活性)。

图6：在小鼠中单一静脉内剂量的下列之后的血浆L-天冬酰胺水平：2kDa-100％mPEG-r-克立他酶(5U/kg，25U/kg和50U/kg体重)(图6A)，5kDa-100％mPEG-r-克立他酶(5U/kg，25U/kg和50U/kg体重)(图6B)或2kDa-100％mPEG-r-克立他酶(5U/kg)，5kDa-100％mPEG-r-克立他酶(5U/kg)和培门冬酶

(1U/kg)(图6C)。施用等量的蛋白(10μg/kg)在72小时中产生相似的L-天冬酰胺消耗，所述蛋白为2kDa-100％mPEG-r-克立他酶(5U/kg)，5kDa-100％mPEG-r-克立他酶(5U/kg)，或培门冬酶

1U/kg)。

图7：2kDa-100％聚乙二醇化的r-克立他酶与5kDa-100％聚乙二醇化的r-克立他酶相比的剂量-效应关系。图7A显示以5U/kg(基于蛋白质含量为10μg/kg)，25U/kg和50U/kg时，单一静脉内剂量的2kDa-100％聚乙二醇化r-克立他酶之后，血浆中的残余酶活性。图7B显示以5U/kg(基于蛋白质含量为10μg/kg)，25U/kg和50U/kg时，单一静脉内剂量的5kDa-100％聚乙二醇化的r-克立他酶之后，血浆中的残余酶活性。

图8：2kDa-100％聚乙二醇化的r-克立他酶相比于5kDa-100％聚乙二醇化的r-克立他酶的剂量-效应关系。单一静脉内剂量的2kDa-100％或5kDa-100％mPEG-缀合物后，在小鼠中测量的残余酶活性的AUC。总的来说，当在相同的剂量水平进行比较时，对于5kDa-100％mPEG-r-克立他酶测量的AUC高于对于2-kDa-100％mPEG-r-克立他酶所观察到的。在5，25和50U/kg剂量时，分别观察到了31％，37％和14％的差别。

图9：小鼠中，mPEG-r-克立他酶缀合物相对于培门冬酶

的药代动力学。图9A代表单一静脉内剂量的2kDa-100％mPEG-r-克立他酶，5kDa-100％mPEG-r-克立他酶或培门冬酶

之后，在小鼠中测量的残余酶活性。图9B代表单一静脉内剂量的2kDa-100％mPEG-r-克立他酶，5kDa-100％mPEG-r-克立他酶或培门冬酶后，在小鼠中测量的残余酶活性的AUC。

图10：用mPEG-r-克立他酶缀合物或

处理后，抗克立他酶特异性抗体的血清水平。抗体针对的是克立他酶。数据表示为平均值±SD(N＝8)。

图11：用mPEG-r-克立他酶最大程度(100％)聚乙二醇化的缀合物处理后，抗缀合物特异性抗体的血清水平。图11A：结果表示为平均值±SD(n＝8)；图11B：结果表示为在抗缀合物ELISA中，具有＞0.5的吸光度值的动物的百分率。

发明详述

一方面，本发明要解决的问题是提供具有下列的L-天冬酰胺酶制备物：

-高的体外生物活性；

-稳定的PEG-蛋白质连接；

-延长的体内半衰期；

-显著减少的免疫原性，如下列所证明的：例如重复施用后减少或去除抗L-天冬酰胺酶制备物的抗体应答；和

-对于产生了对使用例如源自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶的一线疗法的敏感性的患者，作为二线疗法的用途。

已知的L-天冬酰胺酶缀合物没有解决这个问题，其具有与经修饰的L-天冬酰胺酶制备物的显著的交叉反应性(Wang，B.等人.(2003)Leukemia 17，1583-1588，在此以其全部通过引用而并入)，或具有显著降低的体外活性(Kuchumova，A.V.等人.(2007)Biochemistry(Moscow)Supplement Series B：Biomedical Chemistry，1，230-232，在此以其全部通过引用而并入)。根据本发明，通过提供欧文氏菌L-天冬酰胺酶与亲水性聚合物(更具体地，分子量为5000Da或更少的聚乙二醇)的缀合物、制备此类缀合物的方法和所述缀合物的用途而解决了这一问题。

本文中描述的是来自欧文氏菌的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶，与未修饰的L-天冬酰胺酶蛋白以及来自大肠杆菌的培门冬酶制备物相比，其具有改进的药理学特性。本文中描述的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶缀合物(例如被分子量为5000Da的PEG聚乙二醇化的菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶)作为治疗剂，特别用于对用来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶或聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶，或者来自欧文氏菌的未修饰的L-天冬酰胺酶进行的治疗显示出超敏(例如过敏反应或沉默超敏性)的患者。本文中所描述的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶缀合物也可用作治疗剂而用于具有疾病复发(例如ALL的复发)且以前用另一种形式的天冬酰胺酶(例如用来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶或聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶)治疗过的患者中。

如本文中所详述的，与已知的L-天冬酰胺酶(例如培门冬酶)制备物相比，本发明的缀合物显示出出人意料的优越特性。例如，与来自大肠杆菌的未修饰的L-天冬酰胺酶相比，来自菊欧文氏菌的未修饰的L-天冬酰胺酶(克立他酶)具有显著更低的半衰期(Avramis andPanosyan，Clin.Pharmacokinet.(2005)44：367-393，在此以其全部通过引用而并入)。以相等的蛋白质剂量，本发明的聚乙二醇化的缀合物具有的半衰期大于来自大肠杆菌的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶。

定义

除非另外明确地定义，本文中所使用的术语将根据它们在本领域中的通常含义来理解。

如本文中所使用的，术语″包括″指″包括但不限于″，并且以单数形式使用的术语应当包括复数，反之亦然，除非上下文另有指示。

如本文中所使用的，术语“可通过消耗天冬酰胺而治疗的疾病”是指这样的病况或病症，其中参与或促成所述病况或病症的细胞缺乏合成L-天冬酰胺的能力或具有降低的合成L-天冬酰胺的能力。L-天冬酰胺的消耗或丧失可以是部分的或基本上完全的(例如，达到使用本领域已知的方法和设备不可检测到的水平)。

如本文中所使用的，术语″治疗有效量″是指产生所希望的治疗效果所需要的蛋白(例如天冬酰胺酶或其缀合物)的量。

L-天冬酰胺酶蛋白

根据本发明的蛋白是具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的酶，即L-天冬酰胺酶。

在本领域中已鉴别了许多L-天冬酰胺酶蛋白，其是通过已知的方法从微生物中分离的(见例如Savitri and Azmi，Indian J.Biotechnol 2(2003)184-194，在此以其全部通过引用而并入)。最广泛使用且商业上可得的L-天冬酰胺酶是源自大肠杆菌或菊欧文氏菌的，二者共享50％或更少的结构同源性。在欧文氏菌的种中，源自菊欧文氏菌与胡萝卜软腐欧文氏菌的酶之间被报道通常有75％-77％的序列同一性，且在菊欧文氏菌的不同亚种之间发现有大约90％的序列同一性(Kotzia GA，Labrou E，Journal of Biotechnology(2007)127：657-669，在此以其全部通过引用而并入)。一些代表性的欧文氏菌L-天冬酰胺酶包括，例如表1中所提供的那些：

表1

表1的欧文氏菌L-天冬酰胺酶的序列以及GenBank登记条目在此通过引用而并入。治疗中所使用的优选的L-天冬酰胺酶是分离自大肠杆菌和欧文氏菌(特别是菊欧文氏菌)的L-天冬酰胺酶。

L-天冬酰胺酶可以是分离自微生物的天然的酶。它们也可以是通过重组酶技术在生产性微生物(例如大肠杆菌)中产生的。作为示例，在本发明的缀合物中所使用的蛋白可以是在重组大肠杆菌生产性菌株中产生的来自大肠杆菌的蛋白，或者在重组大肠杆菌生产性菌株中产生的来自欧文氏菌的种(特别是菊欧文氏菌)的蛋白。

可通过其特定的活性来鉴别酶。此定义因而包括也存在于其他生物(更特别地，在其它微生物中)中的具有所定义的特定活性的所有多肽。通常可通过它们被分组到某些如PFAM或COG所定义的家族中而鉴别具有相似活性的酶。PFAM(比对和隐马尔科夫模型的蛋白质家族数据库；http://pfam.sanger.ac.uk/)代表蛋白质序列比对的大的集合。每个PFAM都有可能使得多个比对可视化，见到蛋白质结构域，评价在生物间的分布，获得访问其它数据库以及使已知的蛋白结构可视化。COG(蛋白质的直系同源物组的群集；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CQG/)是通过比较来自43个完全测序的基因组的蛋白质序列而获得的，所述43个完全测序的基因组代表30个主要的系统发育系。每个COG都是从至少三个系确定的，这允许鉴别以前的保守结构域。

鉴别同源序列和它们的同源性和/或同一性百分比的手段是本领域技术人员熟知的，并且特别包括BLAST程序，其可从网站http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi而被使用，使用所述网站上显示的默认参数。然后可以开发(例如比对)所获得的序列，使用例如程序CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)或MULTALIN(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/mutalin.html)，使用所述网站上所示的默认参数。使用GenBank上对于已知的基因所给出的参考，本领域技术人员能够确定其它生物体、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等价的基因。使用共有序列有利地进行这一常规的工作并设计简并的探针来克隆另一个生物体中相应的基因，所述共有序列可通过用源自其它微生物的基因进行序列比对而确定。这些分子生物学的常规方法是本领域技术人员所熟知的，并且被描述于，例如Sambrook等人(1989MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL.2nd ed.Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York)中。

的确，本领域技术人员将理解，如何选择和设计实质上保持其L-天冬酰胺酶活性的同源蛋白。通常，使用Nessler测定法，根据Mashburn和Wriston描述的方法(Mashburn，L.，and Wriston，J.(1963)″Tumor Inhibitory Effect of L-AsparaGlnase，″BiochemBiophys Res Commun 12，50，在本文中以其全部通过引用而并入)来确定L-天冬酰胺酶活性。

在本发明的缀合物的特定实施方式中，L-天冬酰胺酶蛋白与包含SEQ ID NO：1的序列的蛋白具有至少约80％的同源性或同一性，更特别地与包含SEQ ID NO：1的序列的蛋白具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同源性或同一性。SEQ ID NO：1如下：

ADKLPNIVILATGGTIAGSAATGTQTTGYKAGALGVDTLINAVPEVKKLANVKGEQFSNMASENMTGDVVLKLSQRVNELLARDDVDGVVITHGTDTVEESAYFLHLTVKSDKPVVFVAAMRPATAISADGPMNLLEAVRVAGDKQSRGRGVMVVLNDRIGSARYITKTNASTLDTFKANEEGYLGVIIGNRIYYQNRIDKLHTTRSVFDVRGLTSLPKVDILYGYQDDPEYLYDAAIQHGVKGIVYAGMGAGSVSVRGIAGMRKAMEKGVVVIRSTRTGNGIVPPDEELPGLVSDSLNPAHARILLMLALTRTSDPKVIQEYFHTY(SEQ ID NO：1)。

术语″包含SEQ ID NO：1的序列″是指蛋白的氨基酸序列可不严格地被限制为SEQ ID NO：1，而是可含有其它的氨基酸。

在特定的实施方式中，所述蛋白为菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶，其具有SEQ ID NO：1的序列。在另一个实施方式中，L-天冬酰胺酶来自菊欧文氏菌NCPPB 1066(Genbank登录号CAA32884，在此以其全部通过引用而并入)，其具有或没有信号肽和/或引导序列。

SEQ ID NO：1的蛋白的片段也被包含在本发明的缀合物中所使用的蛋白的定义中。术语″SEQ ID NO：1的片段″是指多肽的序列可包括比SEQ ID NO：1更少的氨基酸，但仍包括足够的氨基酸来赋予L-氨基水解酶活性。

本领域熟知的是，可通过置换、插入、缺失和/或添加一个或多个氨基酸来修饰多肽但同时保留其酶活性。例如，在给定的位置通过化学上等同的氨基酸来置换一个氨基酸而不影响蛋白的功能特性是常见的。置换可以被定义为下列组之一内的交换：

·小的脂肪族、非极性或略微极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro，Gly

·极性、带负电的残基和它们的酰胺：Asp，Asn，Glu，Gln

·极性、带正电的残基：His，Arg，Lys

·大的脂肪族、非极性残基：Met，Leu，Ile，Val，Cys

·大的芳香族残基：Phe，Tyr，Trp。

因此，可预期如下改变将产生功能上等同的产物：产生以一个带负电的残基取代另一个的改变(例如谷氨酸取代天冬氨酸)或产生以一个带正电的残基取代另一个的改变(例如以赖氨酸取代精氨酸)。

对氨基酸序列中氨基酸残基被修饰的位置以及经受修饰的氨基酸的数目没有特别的限制。技术人员能够识别可被引入而不影响蛋白活性的修饰。例如，可预期蛋白的N或C末端部分中的修饰在某些情况下不改变蛋白的活性。特别地，关于天冬酰胺酶已进行了许多表征，特别是关于形成活性催化位点的序列、结构和残基。这关于可被修饰而不影响酶活性的残基提供了指引。所有来自细菌来源的已知L-天冬酰胺酶都具有共同的结构特征。所有的都是在两个相邻的单体的N和C末端结构域之间具有四个活性位点的同四聚体(Aghaipour等人，Biochemistry 40(2001)5655-5664，在此以其全部通过引用而并入)。所有的都在其三级和四级结构中具有高度的相似性(Papageorgiou等人，FEBSJ.275(2008)4306-4316，在此以其全部通过引用而并入)。L-天冬酰胺酶的催化位点的序列在菊欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌和大肠杆菌L-天冬酰胺酶II之间是高度保守的(Papageorgiou等人，FEBS J.275(2008)4306-4316)。活性位点柔性环含有氨基酸残基14-33，且结构分析显示出Thr15，Thr95，Ser62，Glu63，Asp96，和Ala120接触配体(Papageorgiou等人，FEBS J.275(2008)4306-4316)。Aghaipour等人通过检测与其底物复合的酶的高分辨率晶体结构而对菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶的四个活性位点进行了详细的分析(Aghaipour等人，Biochemistry 40(2001)5655-5664)。Kotzia等人提供了来自欧文氏菌的数个种和亚种的L-天冬酰胺酶的序列，虽然菊欧文氏菌和胡萝卜软腐欧文氏菌的蛋白之间仅具有大约75％-77％的同一性，它们各自都仍具有L-天冬酰胺酶活性(Kotzia等人，J.Biotechnol.127(2007)657-669，在此以其全部通过引用而并入)。Moola等人进行了对菊欧文氏菌3937L-天冬酰胺酶的表位定位研究并且在试图降低所述天冬酰胺酶的免疫原性时，甚至在突变了各种抗原性序列后仍能保留酶活性(Moola等人，Biochem.J.302(1994)921-927，在此以其全部通过引用而并入)。上文所引用的每篇文章都在此以其全部通过引用而并入。鉴于对L-天冬酰胺酶已经进行了大量表征，本领域技术人员将确定如何制备片段和/或序列取代而仍保留酶活性。

用于缀合物中的聚合物

从非毒性水溶性聚合物的组中选择聚合物，例如多糖(如羟乙基淀粉)、聚氨基酸(如聚赖氨酸)、聚酯(例如聚乳酸)，和聚烯化氧(如聚乙二醇(PEG))。

聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)是本领域中熟知的并且包括线性和分支的聚合物。一些聚合物(特别是PEG)的实例在下列中提供，其中的每篇都在此以其全部通过引用而并入：美国专利号5,672,662；美国专利号4,179,337；美国专利号5,252,714；美国专利申请公开号2003/0114647；美国专利号6,113,906；美国专利号7,419,600；和PCT公开号WO2004/083258。

此类聚合物的质量由多分散性指数(PDI)表征。PDI反映出给定聚合物样品中分子量的分布并且是由重量平均分子量除以数量平均分子量计算的。其指示批次的聚合物中个别的分子量的分布。PDI的值总是大于1，但是当聚合物的链接近理想高斯分布时(＝单分散性)，PDI接近1。

聚乙二醇有利地具有下列范围内的分子量：大约500Da至大约9,000Da。更具体地，聚乙二醇(例如mPEG)具有选自下列的分子量：2000Da，2500Da，3000Da，3500Da，4000Da，4500Da和5000Da的聚乙二醇。在特定的实施方式中，聚乙二醇(例如mPEG)具有的分子量为5000Da。

用于制备缀合物的方法

为了随后将聚合物与具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白相偶联，聚合物部分含有活化的官能团，其优选与蛋白中的氨基反应。一方面，本发明涉及制备缀合物的方法，所述方法包括使一定量的聚乙二醇(PEG)与一定量的L-天冬酰胺酶在经缓冲的溶液中结合足以使PEG与L-天冬酰胺酶共价连接的一段时间。在特定的实施方式中，所述L-天冬酰胺酶来自欧文氏菌的种，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列。在一个实施方式中，所述PEG为单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。

在一个实施方式中，在经缓冲的溶液中进行聚乙二醇与L-天冬酰胺酶之间的反应。在一些特定的实施方式中，缓冲液的pH值在大约7.0至大约9.0的范围内。最优选的pH值范围是大约7.5至大约8.5，例如，pH值为大约7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0，8.1，8.2，8.3，8.4或8.5。在特定的实施方式中，L-天冬酰胺酶来自欧文氏菌的种，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQID NO：1的序列。

此外，L-天冬酰胺酶的聚乙二醇化在下列蛋白浓度下进行：大约0.5至大约25mg/mL，更特别地大约2mg/mL至大约20mg/mL，最特别地大约3mg/mL至大约15mg/mL。例如，蛋白浓度为大约0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20mg/mL。在在特定的实施方式中，在这些蛋白浓度下聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶来自欧文氏菌的种，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列。

在超过2mg/mL的升高的蛋白浓度下，聚乙二醇化反应快速进行，在少于2小时之内。此外，所应用的聚合物比L-天冬酰胺酶中的氨基的摩尔过量为少于约20∶1。例如，摩尔过量为少于约20∶1，19∶1，18∶1，17∶1，16∶1，15∶1，14∶1，13∶1，12∶1，11∶1，10∶1，9∶1，8∶1，7.5∶1，7∶1，6.5∶1，6∶1，5.5∶1，5∶1，4.5∶1，4∶1，3.5∶1，3∶1，2.5∶1，2∶1，1.5∶1或1∶1。在具体的实施方式中，所述摩尔过量为少于约10∶1，并且在更加具体的实施方式中，摩尔过量为少于大约8∶1。在特定的实施方式中，所述L-天冬酰胺酶来自欧文氏菌的种，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQID NO：1的序列。

可与蛋白偶联的PEG部分的数目将取决于自由氨基的数目，更取决于哪些氨基可用于聚乙二醇化反应。在具体的实施方式中，聚乙二醇化的程度(即与L-天冬酰胺酶上的氨基相偶联的PEG部分的数目)在自由和/或可用的氨基的约10％至约100％的范围内(例如，约10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％)。可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或蛋白的N-末端)的100％聚乙二醇化在本文中也被称作″最大程度聚乙二醇化的″。确定mPEG-r-克立他酶缀合物中经修饰的氨基(聚乙二醇化程度)的一种方法是Habeeb所描述的方法(A.F.S.A.Habeeb，″Determination of free amino groups inproteins by trinitrobenzensulfonic acid″，Anal.Biochem.14(1966)，p.328，在此以其全部通过引用而并入)。在一个实施方式中，PEG部分与L-天冬酰胺酶的一个或多个氨基相偶联(其中氨基包括赖氨酸残基和/或N-末端)。在具体的实施方式中，聚乙二醇化的程度在总的或可用的氨基(例如赖氨酸残基和/或N-末端)的约10％至约100％的范围内，例如，约10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％。在具体的实施方式中，约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)与PEG部分偶联。在另一个具体的实施方式中，约40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)与PEG部分偶联。在具体的实施方式中，40％-55％或100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)与PEG部分偶联。在一些实施方式中，PEG部分通过共价连接与L-天冬酰胺酶偶联。在特定的实施方式中，所述L-天冬酰胺酶来自欧文氏菌的种，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQID NO：1的序列。

在一个实施方式中，本发明的缀合物可由下式表示：

As p-[NH-CO-(CH2)x-CO-NH-PEG]n

其中Asp为L-天冬酰胺酶蛋白，NH为赖氨酸残基和/或蛋白链N-末端的NH基团，PEG是聚乙二醇部分，且n是蛋白中可用氨基(例如赖氨酸残基和/或N-末端)的至少40％至约100％的数字，所有都在上文及下文的实施例中被定义，x是1至8范围内的整数(例如1，2，3，4，5，6，7，8)，优选2至5(例如2，3，4，5)。在特定的实施方式中，所述L-天冬酰胺酶来自欧文氏菌的种，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列。

可用于形成本发明的缀合物的其它聚乙二醇化方法被提供于，例如：美国专利号4,179,337，美国专利号5,766,897，美国专利申请公开号US 2002/0065397A1和美国专利申请公开号US 2009/0054590A1中，其中的每一篇都在此以其全部通过引用而并入。

具体的实施方式包括具有实质上的L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白和聚乙二醇，选自缀合物的组，其中：

(A)

-蛋白与SEQ ID NO：1所示的来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶具有至少90％的结构同源性，

-聚乙二醇具有大约5000Da的分子量，

-蛋白和聚乙二醇部分通过酰胺键与蛋白共价连接，并且

-大约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)或大约80％-90％，特别是大约84％，的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)与聚乙二醇部分相连。

(B)

-蛋白与SEQ ID NO：1所示的来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶具有至少90％的同源性，

-聚乙二醇具有大约5000Da的分子量，

-蛋白和聚乙二醇部分通过酰胺键与蛋白共价连接，并且

-大约40％至大约45％，特别是大约43％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)，或大约36％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)与聚乙二醇部分相连。

(C)

-聚乙二醇具有大约2000Da的分子量，

-蛋白和聚乙二醇部分通过酰胺键与蛋白共价连接，并且

-大约100％的可用氨基(例如，一个或多个赖氨酸残基和/或N-末端)或大约80％-90％，特别是大约84％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)与聚乙二醇部分相连。

(D)

-聚乙二醇具有大约2000Da的分子量，

-蛋白和聚乙二醇部分通过酰胺键与蛋白共价连接，并且

-大约50％至大约60％，特别是大约55％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)或大约47％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)与聚乙二醇部分相连。

L-天冬酰胺酶-PEG缀合物

与未经修饰的L-天冬酰胺酶相比，特别是与未经修饰的欧文氏菌L-天冬酰胺酶相比，更特别地与未经修饰的来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶相比，以及更特别地与具有SEQ ID NO：1的序列的未经修饰的L-天冬酰胺酶相比，本发明的缀合物具有某些优势和出人意料的特性。

在一些实施方式中，当以5U/kg体重(bw)或10μg/kg(基于蛋白含量)的剂量施用时，本发明的缀合物使血浆L-天冬酰胺水平降低至少约12，24，48，72，96或120小时的时间段。在其它的实施方式中，当以25U/kg bw或50μg/kg(基于蛋白含量)的剂量施用时，本发明的缀合物使血浆L-天冬酰胺水平降低至检测不到的水平持续至少约12，24，48，72，96，120或144小时的时间段。在其它的实施方式中，当以50U/kg bw或100μg/kg(基于蛋白含量)的剂量施用时，本发明的缀合物使血浆L-天冬酰胺水平降低至少约12，24，48，72，96，120，144，168，192，216或240小时的时间段。在另一个实施方式中，当以约10,000至约15,000IU/m²(约20-30mg蛋白/m²)的剂量施用时，本发明的缀合物使血浆L-天冬酰胺的水平降低至检测不到的水平持续至少约12，24，48，72，96，120，144，168，192，216或240小时的时间段。在特定的实施方式中，所述缀合物包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列。在特定的实施方式中，所述缀合物包含的PEG(例如，mPEG)具有的分子量少于或等于约5000Da。在更为特定的实施方式中，至少约40％至约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)是聚乙二醇化的。

在一个实施方式中，缀合物包括的mol PEG/mol单体的比例为约4.5至约8.5，特别是约6.5；比活性为约450至约550U/mg，特别是约501U/mg；与相应的未经修饰的L-天冬酰胺酶相比，相对活性为约75％至约85％，特别是约81％。在具体的实施方式中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列，其中约40％-55％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)以5000Da的mPEG聚乙二醇化。

在一个实施方式中，缀合物包括的mol PEG/mol单体的比例为约12.0至约18.0，特别是约15.1；比活性为约450至约550U/mg，特别是约483U/mg；与相应的未经修饰的L-天冬酰胺酶相比，相对活性为约75％至约85％，特别是约78％。在具体的实施方式中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列，其中约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)以5000Da的mPEG聚乙二醇化。

在一个实施方式中，缀合物包括的mol PEG/mol单体的比例为约5.0至约9.0，特别是约7.0；比活性为约450至约550U/mg，特别是约501U/mg；与相应的未经修饰的L-天冬酰胺酶相比，相对活性为约80％至约90％，特别是约87％。在具体的实施方式中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列，其中约40％-55％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)以10,000Da的mPEG聚乙二醇化。

在一个实施方式中，缀合物包括的mol PEG/mol单体的比例为约11.0至约17.0，特别是约14.1；比活性为约450至约550U/mg，特别是约541U/mg；与相应的未经修饰的L-天冬酰胺酶相比，相对活性为约80％至约90％，特别是约87％。在具体的实施方式中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列，其中约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)以10,000Da的mPEG聚乙二醇化。

在一个实施方式中，缀合物包括的mol PEG/mol单体的比例为约6.5至约10.5，特别是约8.5；比活性为约450至约550U/mg，特别是约524U/mg；与相应的未经修饰的L-天冬酰胺酶相比，相对活性为约80％至约90％，特别是约84％。在具体的实施方式中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列，其中约40％-55％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)以2000Da的mPEG聚乙二醇化。

在一个实施方式中，缀合物包括的mol PEG/mol单体的比例为约12.5至约18.5，特别是约15.5；比活性为约450至约550U/mg，特别是约515U/mg；与相应的未经修饰的L-天冬酰胺酶相比，相对活性为约80％至约90％，特别是约83％。在具体的实施方式中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列，其中约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)以2000Da的mPEG聚乙二醇化。

在其它的实施方式中，单次注射后，与相应的未经修饰的L-天冬酰胺酶相比，本发明的缀合物具有至少约10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，90倍或100倍的增加的效力。在具体的实施方式中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列。在特定的实施方式中，缀合物包含的PEG(例如，mPEG)具有的分子量小于或等于约5000Da。在更为特定的实施方式中，至少约40％至约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)是聚乙二醇化的。

一方面，本发明的缀合物具有根据下面的参数的药代动力学特征谱：

参数	定义
		A_max	最大残余酶活性
t_Amax	测试物暴露后达到A_max的时间
		d_Amax	A_max或A在零以上的最长持续时间

血浆中残余酶活性的半衰期时间源自下式：

均值：

t_{1 / 2} = \frac{- In 2 xt}{In (c_{1} / c_{0})}

其中t_1/2是半衰期，t是时间点，c_t是所述时间点的剩余血浆活性，而c₀是开始时的剩余血浆活性。曲线下面积(AUC)是使用药代动力学软件(例如，SigmaPlot版本11)计算的。

在一个实施方式中，本发明的缀合物具有根据下述的单一剂量药代动力学特征谱，特别是其中所述缀合物包含分子量小于或等于2000Da的mPEG和来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列：

A_max：约150U/L至约250U/L；

T_Amax：约4h至约8h，特别是约6h；

d_Amax：约220h至约250h，特别地，约238.5h(在零以上，约90min至约240h)；

AUC：约12000至约30000；以及

t_1/2：约50h至约90h。

在一个实施方式中，本发明的缀合物具有根据下述的单一剂量药代动力学特征谱，特别是其中所述缀合物包含分子量小于或等于5000Da的mPEG和来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列：

A_max：约18U/L至约250U/L；

T_Amax：约1h至约50h；

d_Amax：约90h至约250h，特别地约238.5h(在零以上，约90min至约240h)；

AUC：约500至约35000；以及

t_1/2：约30h至约120h。

在一个实施方式中，单一剂量之后，与同等蛋白量的培门冬酶相比，本发明的缀合物在一段时间中(例如24，48或72小时)产生相似水平的L-天冬酰胺消耗。在具体的实施方式中，缀合物包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列。在特定的实施方式中，所述缀合物包含具有小于或等于约5000Da的分子量的PEG(例如，mPEG)。在更为特定的实施方式中，至少约40％至约100％(更特别地，约40％-55％或100％)的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)是聚乙二醇化的。

在一个实施方式中，与以相等的蛋白剂量施用的培门冬酶相比，本发明的缀合物具有更长的t_1/2。在具体的实施方式中，在约50μg/kg(基于蛋白含量)的剂量下，所述缀合物具有的t_1/2为至少约50，52，54，56，58，59，60，61，62，63，64或65小时。在另一个具体的实施方式中，在约10μg/kg(基于蛋白含量)的剂量下，所述缀合物具有的t_1/2为至少约30，32，34，36，37，38，39或40小时。在另一个具体的实施方式中，在约10,000至约15,000IU/m²(约20-30mg蛋白/m²)的剂量范围内，缀合物具有的t_1/2为至少约100至约200小时。

在一个实施方式中，在相等的蛋白剂量下，本发明的缀合物具有的平均AUC比培门冬酶大至少约2，3，4或5倍。

在一个实施方式中，在施用单一剂量后一段特定的时间内，本发明的缀合物不产生任何显著的抗体应答，所述时间为例如大于约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周等。在特定的实施方式中，本发明的缀合物至少8周不产生任何显著的抗体应答。在一个实施例中，“不产生任何显著的抗体应答”是指接受所述缀合物的受试者在本领域认可的参数中被鉴别为″抗体阴性的″。可通过本领域已知的方法来确定抗体水平，例如ELISA或表面等离子共振(SPR-Biacore)测定(Zalewska-Szewczyk等人.，Clin.Exp.Med.(2009)9：113-116；Avramis等人.，Anticancer Research29(2009)299-302，其中的每一篇都在此以其全部通过引用而并入)。本发明的缀合物可具有这些特性的任意组合。

治疗方法和缀合物的用途

本发明的缀合物可用于治疗可通过消耗天冬酰胺而治疗的疾病。例如，所述缀合物可用于治疗下列或用于制备用于治疗下列的药物：成人和儿童中的急性淋巴细胞白血病(ALL)，以及预期天冬酰胺的消耗将具有有用效果的其它病况。此类病况包括但不限于下列：恶性肿瘤、或癌症，包括但不限于血液恶性肿瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、NK淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金氏病、急性髓细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤和黑色素肉瘤。响应于天冬酰胺消耗的代表性的非恶性血液疾病包括免疫系统介导的血液疾病，例如感染性疾病，如由HIV感染引起的那些(即AIDS)。与天冬酰胺依赖性相关的非血液疾病包括自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎、SLE、自身免疫、胶原血管病、AIDS等。其它的自身免疫疾病包括骨关节炎、伊萨卡斯氏综合征、银屑病、胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化症、致硬化全脑炎、系统性红斑狼疮、风湿热、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎、肾小球肾炎、重症肌无力、寻常天疱疮和格雷夫斯氏病。可在任何合适的体外或体内测定法(例如，其中生长培养基缺乏天冬酰胺的体外测定法)中就天冬酰胺依赖性测试怀疑引起疾病的细胞。因此，一方面，本发明针对的是治疗患者中可治疗的疾病的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本发明的缀合物。在具体的实施方式中，所述疾病为ALL。在特定的实施方式中，用于治疗可通过天冬酰胺消耗而治疗的疾病的缀合物包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ IDNO：1的序列。在特定的实施方式中，所述缀合物包括具有小于或等于约5000Da的分子量的PEG(例如mPEG)。在更为特定的实施方式中，至少约40％至约100％(更特别地大约40％-55％或100％)的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)是聚乙二醇化的。

在一个实施方式中，使用本发明的缀合物进行的治疗将作为一线疗法被施用。在另一个实施方式中，使用本发明的缀合物进行的治疗将作为二线疗法在患者(特别是有ALL的患者)中施用，所述患者对于其它天冬酰胺酶制备物(特别是源自大肠杆菌的天然L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化的变体(培门冬酶))产生了过敏或超敏性(包括“沉默超敏性”)的客观迹象。过敏或超敏性的客观迹象的非限制性实例包括就天冬酰胺酶测试“抗体阳性”。在具体的实施方式中，在用培门冬酶治疗之后，将本发明的缀合物用于二线疗法中。在更为特定的实施方式中，用于二线疗法中的缀合物包括来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列。在更为具体的实施方式中，所述缀合物还包括具有小于或等于约5000Da(更特别地，约5000Da)的分子量的PEG(例如mPEG)。在甚至更为具体的实施方式中，至少约40％至约100％(更特别地，约40％-55％或100％)的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)是聚乙二醇化的。

另一方面，本发明针对的是用于治疗急性淋巴细胞白血病的方法，所述方法包括向需要所述治疗的患者施用治疗有效量的本发明的缀合物。在具体的实施方式中，将以下列剂量施用所述治疗：约1500IU/m²至约15,000IU/m²，通常为约10,000至约15,000IU/m²(约20-30mg蛋白/m²)，方案为约每周两次至约每月一次，通常为每周一次或隔周一次，作为单一的试剂(例如单一疗法)或作为化学治疗药物组合的一部分，所述药物包括但不限于糖皮质激素、皮质类固醇、抗癌化合物或其它试剂，包括但不限于甲氨蝶呤、地塞米松、泼尼松、泼尼松龙、长春新碱、环磷酰胺和蒽环类抗生素。作为实例，可在3个化学治疗期(包括诱导、巩固或强化，以及维持)中作为多试剂化学治疗的组分而向具有ALL的患者施用本发明的缀合物。在具体的实施例中，所述缀合物不与天冬酰胺合成酶抑制剂(例如，PCT公开号WO2007/103290中所示的那些，将其在此以其全部通过引用而并入)一起施用。在另一个具体的实施例中，所述缀合物不与天冬酰胺合成酶抑制剂一起施用，而是与其它的化学治疗药物一起施用。所述缀合物可作为多试剂化学治疗方案的一部分，而在其它化合物之前、之后或与之同时施用。在特定的实施方式中，所述缀合物包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列。在特定的实施方式中，所述缀合物包含具有小于或等于约5000Da的分子量的PEG(例如，mPEG)。在更为特定的实施方式种，至少约40％至约100％(更特别地，约40％-55％或100％)的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)是聚乙二醇化的。

在具体的实施方式中，所述方法包括以下列量施用本发明的缀合物：约1U/kg至约25U/kg(例如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25U/kg)或其等同量(例如基于蛋白含量)。在更为具体的实施方式中，以选自下组的量施用所述缀合物：约5，约10和约25U/kg。在另一个具体实施方式中，以下列范围内的剂量施用所述缀合物：约1,000IU/m²至约20,000IU/m²(例如1,000IU/m²，2,000IU/m²，3,000IU/m²，4,000IU/m²，5,000IU/m²，6,000IU/m²，7,000IU/m²，8,000IU/m²，9,000IU/m²，10,000IU/m²，11,000IU/m²，12,000IU/m²，13,000IU/m²，14,000IU/m²，15,000IU/m²，16,000IU/m²，17,000IU/m²，18,000IU/m²，19,000IU/m²或20,000IU/m²)。在另一个具体实施方式中，以下列剂量施用所述缀合物：对于单一的剂量，其将L-天冬酰胺消耗至使用本领域中已知的方法和仪器检测不到的水平持续约3天至约10天(例如，3，4，5，6，7，8，9或10天)。在另一个实施方式中，所述方法包括施用本发明的缀合物，与未缀合的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物在患者中引起更低的免疫原性应答。在另一个实施方式中，所述方法包括施用本发明的缀合物，与未缀合的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物在单一剂量之后具有更长的体内循环半衰期。在一个实施方式中，所述方法包括施用本发明的缀合物，以相等的蛋白剂量施用时，所述缀合物具有比培门冬酶更长的t_1/2。在具体的实施方式中，所述方法包括施用这样的缀合物，在约50μg/kg(基于蛋白含量)的剂量下，其具有至少约50，52，54，56，58，59，60，61，62，63，64或65小时的t_1/2。在另一个具体实施方式中，所述方法包括施用这样的缀合物，在约10μg/kg(基于蛋白含量)的剂量下，其具有至少约30，32，34，36，37，37，39或40小时的t_1/2。在另一个具体实施方式中，所述方法包括施用这样的缀合物，在约10,000至约15,000IU/m²(约20-30mg蛋白/m²)的剂量范围中，其具有至少约100至约200小时的t_1/2。在一个实施方式中，所述方法包括施用这样的缀合物，在相等的蛋白剂量下，其具有的平均AUC比培门冬酶大至少约2，3，4或5倍。在另一个实施方式中，所述方法包括施用本发明的缀合物，与未经缀合的L-天冬酰胺酶相比，在单一剂量之后其具有更大的AUC值。在特定的实施方式中，所述缀合物包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列。在特定的实施方式中，所述缀合物包含具有小于或等于约5000Da的分子量的PEG(例如，mPEG)。在更为特定的实施方式种，至少约40％至约100％(更特别地，约40％-55％或100％)的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)是聚乙二醇化的。

使用L-天冬酰胺酶治疗后，ALL患者中复发率仍然是高的，其中约10％-25％的儿科ALL患者具有早期的复发(例如，一些在诱导后30-36个月的维持期中)(Avramis and Panosyan，Clin.Pharmacokinet.(2005)44：367-393)。如果经源自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶治疗的患者有复发，随后用大肠杆菌制备物进行的治疗可导致“接种”效果，其中大肠杆菌制备物在随后的施用过程中具有增加的免疫原性。在一个实施方式中，可将本发明的缀合物用于治疗具有复发的ALL的患者的方法中，所述患者之前用其它的天冬酰胺酶制备物治疗过，特别是那些之前用源自大肠杆菌的天冬酰胺酶治疗过的患者。

在一些实施方式中，本发明的用途和治疗方法包括施用具有上文(例如，在标题为“L-天冬酰胺酶PEG缀合物”的部分)或下文所述的特性或特性组合的L-天冬酰胺酶缀合物。

组合物、制剂及施用途径

本发明还包括包含本发明的缀合物的药物组合物。在具体的实施方式中，所述药物组合物被包含在小瓶中作为冻干的粉末而待用溶剂重构，例如目前可得的天然L-天冬酰胺酶，无论用于其生产的细菌来源为何在另一个实施方式中，所述药物组合物是“随时使用”的溶液，例如培门冬酶

其使得能够(在适当的处理后)通过下列施用：例如肌肉内、静脉内(输液和/或推注)。脑-心室内(icv)，皮下途径。

可使用标准技术向患者施用本发明的缀合物，包括包含本发明的缀合物的组合物(例如，药物组合物)。所述技术和制剂通常可在Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack PublishingCo.，Easton，Pa.，1990(在此通过引用而并入)中找到。

合适的剂量形式，一部分取决于应用或进入途径，例如口服、经皮、经粘膜或通过注射(肠胃外)。此类剂量形式应允许治疗剂到达靶细胞，或者另外具有所需的治疗效果。例如，被注射到血流中的药物组合物优选是可溶的。

根据本发明的缀合物和/或药物组合物可被配制为药学上可接受的盐及其复合物。药学上可接受的盐在其被施用的量和浓度存在时是非毒性的盐。制备此类盐可通过改变化合物的物理特征而不防止其发挥其生理学效果来促进药物应用。在物理特性方面有用的改变包括降低熔点以促进经粘膜施用，以及增加溶解性以促进施用更高浓度的药物。天冬酰胺酶的药学上可接受的盐可作为复合物存在，如本领域技术人员将领会的。

药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如含有硫酸盐、盐酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎尼酸盐的那些。药学上可接受的盐可获自酸，包括盐酸、马来酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己基氨基磺酸、延胡索酸和奎尼酸。

药学上可接受的盐也包括碱加成盐，例如当酸性官能团(例如羧酸或酚)存在时，含有苄星青霉素，氯普鲁卡因，胆碱，二乙醇胺，乙二胺，葡甲胺，普鲁卡因，铝，钙，锂，镁，钾，钠，铵，烷基胺和锌的那些。例如，见Remington′s Pharmaceutical Sciences，见上文。可使用合适的相应的碱来制备此类盐。

药学上可接受的载体和/或赋形剂也可被掺入根据本发明的药物组合物中以促进特定天冬酰胺酶的施用。适于实施本发明的载体的实例包括碳酸钙，磷酸钙，各种糖(例如乳糖、葡萄糖或蔗糖)，或各种淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇和生理学上相容的溶剂。生理学上相容的溶剂的实例包括用于注射的无菌水溶液(WFI)，盐溶液和右旋糖。

可通过不同的途径施用根据本发明的药物组合物，包括静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、口服、表面(经皮)或经粘膜施用。对于全身性施用而言，优选的是口服。对于口服，例如，可将化合物配制成为常规的口服剂型，例如胶囊、片剂和液体制备物，如糖浆、酏剂和浓缩滴剂。

备选地，可使用注射(肠胃外施用)，例如肌肉内、静脉内、腹膜内和皮下注射。对于注射，将药物组合物配制于液体溶液中，优选生理学相容的缓冲液或溶液，例如盐溶液、Hank溶液或Ringer溶液。此外，可将化合物配制为固体形式并在即将使用前重新溶解或悬浮。例如，可生产冻干形式的所述缀合物。在具体的实施方式中，肌肉内施用所述缀合物。在另一个具体实施方式中，静脉内施用所述缀合物。

也可通过经粘膜或经皮手段实现全身性施用。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域熟知的，并且包括例如，对于经粘膜施用而言，胆盐和梭链孢酸衍生物。此外，可使用去污剂来促进渗透。经粘膜施用，例如，可以是通过鼻用喷雾、吸入器(用于肺部递送)，直肠栓剂或阴道栓剂。对于表面施用，化合物可被配制为药膏、软膏、凝胶或乳霜，如本领域所熟知的。

待递送的缀合物的量将取决于许多因素，例如化合物的IC₅₀、EC₅₀、生物学半衰期，患者的年龄，体型、重量和身体条件，以及待治疗的疾病或病症。这些因素以及要考虑的其它因素的重要性是本领域普通技术人员所熟知的。通常，待施用的缀合物的量的范围为约10个国际单位/m²患者身体的表面积(IU/m²)至50,000IU/m²，优选的是约1,000IU/m²至约15,000IU/m²的剂量范围，并且更优选的是约6,000IU/m²至约15,000IU/m²的范围，对于治疗恶性血液疾病(例如白血病)而言特别优选的是约10,000至约15,000IU/m²(约20-30mg蛋白/m²)的范围。通常，在治疗过程中，这些剂量是以大约每周3次至约每月一次(通常为每周一次或隔周一次)的间隔，通过肌肉内或静脉内注射施用的。当然，也可采用其它的剂量和/或治疗方案，如由主治医师所确定的。

在特定的实施方式中，本文所描述的待施用的缀合物和/或药物组合物或制剂包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列。在特定的实施方式中，所述缀合物包含来自欧文氏菌的种的L-天冬酰胺酶，更特别地来自菊欧文氏菌，并且更特别地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列。在特定的实施方式中，所述缀合物包含具有小于或等于约5000Da的分子量的PEG(例如，mPEG)。在更为特定的实施方式中，至少约40％至约100％的氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)是聚乙二醇化的。

实施例

实施例1：制备重组的克立他酶

用于制造裸露的重组菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶蛋白(在本文中也称作“r-克立他酶”)的重组细菌菌株为大肠杆菌BL21菌株，其具有缺失的ansB基因(编码内源性大肠杆菌II型L-天冬酰胺酶的基因)以避免此酶对于重组菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶的潜在污染。ansB基因的缺失依赖于同源重组方法和根据下面三个步骤进行的噬菌体转导：

1)用线性质粒(卡那霉素盒)转化表达缺陷性λ噬菌体的细菌菌株(NM 1100)，其中所述λ噬菌体提供在细菌细胞中保护和重组经电穿孔的线性DNA底物的功能，所述线性质粒含有侧翼有FLP识别靶序列(FRT)的卡那霉素基因。发生重组以用卡那霉素替代细菌基因组中的ansB基因，产生ΔansB菌株；2)使用噬菌体转导将来自Δans B NM1100菌株的经整合的卡那霉素盒区域整合至BL21菌株的ansB位点。这产生了具有缺失的ansB基因并且对卡那霉素有抗性的大肠杆菌BL21菌株；3)用FLP-帮助质粒转化此菌株以通过在FRT序列处的同源重组来去除卡那霉素基因。对最终的菌株(BL21ΔansB菌株)的基因组进行测序，证实内源性ansB基因的完全缺失。

将编码与来自枯草芽孢杆菌的ENX信号肽相融合的成熟菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶的大肠杆菌-优化的DNA序列插入表达载体中。此载体允许通过加入异丙基β-D-1-硫代呋喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，而在杂合T5/lac启动子的控制下表达重组菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶并赋予对卡那霉素的抗性。

用此表达载体转化BL21ΔansB菌株。通过在Reisenberg培养基中进行补料分批葡萄糖发酵而将经转化的细胞用于生产r-克立他酶。细胞的诱导是用IPTG作为诱导剂、在23℃下进行16h而完成的。在收获细胞并在10mM磷酸钠缓冲液(pH6，5mM EDTA)(缓冲液A)中通过均质化而进行裂解后，通过以15000g离心两次以及随后0.45μm和0.22μm的过滤步骤，而澄清蛋白质溶液。随后利用一系列色谱法和浓缩步骤来纯化重组菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶。简而言之，菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶的理论等电点(7.23)允许重组酶在pH6吸附于阳离子交换树脂。因此，重组的酶被捕获于Capto S柱上(阳离子交换色谱法)并用缓冲液A中的盐梯度洗脱。汇集含有重组酶的级分。然后在含有盐梯度的缓冲液A中、在Capto MMC柱(阳离子交换色谱)上纯化所汇集的溶液。在于Superdex 200pg尺寸排阻色谱上进行蛋白分离之前，汇集所洗脱的含有菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶的级分并进行浓缩，作为精制步骤。汇集、浓缩并相对于100mM的磷酸钠缓冲液(pH8)透析含有重组酶的级分。通过SDS-PAGE(图1)和RP-HPLC评估最终菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶制备物的纯度：其为至少90％。通过N-末端测序和LC-MS验证重组酶的完整性。使用Nessler′s试剂在37℃测量酶活性。经纯化的重组菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶的比活性为600U/mg左右。一个单位的酶活性被定义为在37℃每分钟从L-天冬酰胺释放1μmol氨的酶的量。

实施例2：制备10kDa mPEG-L-天冬酰胺酶缀合物

在100mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)中、在2.5至4mg/mL的蛋白浓度下、在150mg/mL或36mg/mL 10kDa mPEG-NHS的存在下，于22℃搅拌来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶的溶液2小时。使用Superdex 200pg柱，在Akta纯化仪UPC 100系统上，通过尺寸排阻色谱来纯化所产生的粗制10kDa mPEG-L-天冬酰胺酶。汇集并浓缩含有蛋白的级分以产生2至8mg/mL的蛋白浓度。以这种方式制备了两种10kDa mPEG-L-天冬酰胺酶缀合物，它们在以未经修饰的L-天冬酰胺酶作为参照、通过TNBS测定法而确定的聚乙二醇化程度方面有差别，一种对应于完全聚乙二醇化(100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)残基被缀合，相应于78％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)被聚乙二醇化)；第二种对应于部分聚乙二醇化(39％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)或大约50％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端))。对缀合物的SDS-PAGE分析显示在图2中。所产生的缀合物显示为基本上均一的带并且不含有可检测到的未经修饰的r-克立他酶。

实施例3：制备5kDa mPEG-L-天冬酰胺酶缀合物

在100mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)中、在4mg/mL的蛋白浓度下、在150mg/mL或22.5mg/mL 5kDa mPEG-NHS的存在下，于22℃搅拌来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶的溶液2小时。使用Superdex 200pg柱，在Akta纯化仪UPC 100系统上，通过尺寸排阻色谱来纯化所产生的粗制5kDa mPEG-L-天冬酰胺酶。汇集并浓缩含有蛋白的级分以产生2至8mg/mL的蛋白浓度。以这种方式制备了两种5kDa mPEG-L-天冬酰胺酶缀合物，其在以未经修饰的L-天冬酰胺酶作为参照、通过TNBS测定法而确定的聚乙二醇化程度方面有差别，一种对应于完全聚乙二醇化(100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)残基被缀合，相应于84％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)被聚乙二醇化)；第二种对应于部分聚乙二醇化(36％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)或大约43％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端))。对缀合物的SDS-PAGE分析显示在图2中。所产生的缀合物显示为基本上均一的带并且不含有可检测到的未经修饰的r-克立他酶。

实施例4：制备2kDa mPEG-L-天冬酰胺酶缀合物

在100mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)中、在4mg/mL的蛋白浓度下、在150mg/mL或22.5mg/mL 2kDa mPEG-NHS的存在下，于22℃搅拌来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶的溶液2小时。使用Superdex 200pg柱，在Akta纯化仪UPC 100系统上，通过尺寸排阻色谱来纯化所产生的粗制2kDa mPEG-L-天冬酰胺酶。汇集并浓缩含有蛋白的级分以产生2至8mg/mL的蛋白浓度。以这种方式制备了两种2kDa mPEG-L-天冬酰胺酶缀合物，其在以未经修饰的L-天冬酰胺酶作为参照、通过TNBS测定法而确定的聚乙二醇化程度方面有差别，一种对应于最大程度聚乙二醇化(100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)残基被缀合，相应于86％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)被聚乙二醇化)；第二种对应于部分聚乙二醇化(47％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端)或大约55％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N-末端))。对缀合物的SDS-PAGE分析显示在图2中。所产生的缀合物显示为基本上均一的带并且不含有可检测到的未经修饰的r-克立他酶。

实施例5：mPEG-r-克立他酶缀合物的活性

由通过酶促活性而从L-天冬酰胺释放的氨的奈氏比色法来确定前述实施例中所述的每种缀合物的L-天冬酰胺酶氨基水解酶活性。简而言之，将50μL酶溶液与50mM硼酸钠缓冲液(pH 8.6)中的20mML-天冬酰胺相混合并在37℃下温育10min。通过加入200μL的Nessler试剂而停止反应。在450nm处测量此溶液的吸光度。由校准曲线计算所述活性，所述校准曲线是由硫酸铵作为参照而获得的。结果总结在下面的表2中：

表2：mPEG-r-克立他酶缀合物的活性

*数字“40％”和“100％”表示分别为40％-55％和100％可用氨基的大致聚乙二醇化程度(见实施例2-4，见上文)。

**利用TNBS测定法的数据推知的mol PEG/mol单体比率，假设来自蛋白的所有氨基(例如，赖氨酸残基和N-末端)都是可用的。

mPEG-r-克立他酶缀合物的剩余活性在483至543单位/mg的范围内。这对应于未经修饰的酶的L-天冬酰胺氨基水解酶活性的78％-87％。

实施例6：未经修饰的克立他酶的L-天冬酰胺-消耗效应

在B6D2F1-杂合体(免疫活性的，雌性)(Charles River德国)中测定了

的药效特征谱。

是商业上可得的克立他酶(源自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶)。简而言之，2只动物/组接受了单一的、5，25，125或250单位/kg bw的i.v.注射。在给药前1h和给药后6h、12h、24h和48h，从眼窦收集血浆样品并就L-天冬酰胺的水平分析所述血浆。

用PICO-TAG氨基酸分析试剂盒(Waters)测定血浆氨基酸水平。简而言之，通过甲醇沉淀而使血浆样品去蛋白化。用异硫氰酸苯酯衍生上清液中的自由氨基酸并通过RP-HPLC进行定量。

如图3中所示，iv施用后，5和25U/kg的剂量没有有效地消耗小鼠中的L-天冬酰胺水平。只有250U/kg的剂量在48小时中诱导了完全的消耗。

此结果显示出

(未经修饰的克立他酶)的临床局限性，其需要直至3次/周、作为疼痛的注射在患有ALL的患者中被施用，并且以高剂量施用，这引起常见的过敏反应和免疫原性。

实施例7：单一施用六种mPEG-r-克立他酶缀合物后的L-天冬酰胺-消耗效应和血浆L-天冬酰胺酶活性

在B6D2F1-杂合体(免疫活性的，磁性)(Charles River德国)中测定了6种不同的mPEG-r-克立他酶缀合物的药效和药代动力学特征谱。所测试的六种缀合物在PEG的分子大小(2，5或10kDa)以及聚乙二醇化的程度(最大或部分聚乙二醇化)方面有差别。使用未经修饰的克立他酶

作为参照。简而言之，4只动物/组接受了单一的5单位/kg bw缀合物或250单位/kg bw

的i.v.注射。在给药前1h和给药后6h、24h、48h、96h和192h，从每只动物的眼窦收集血浆样品并分别就L-天冬酰胺的血浆水平和的残余酶活性进行分析。

通过生色测定法来确定血浆中的酶活性。使用L-天冬氨酰β-异羟肟酸(AHA)作为底物。酶将AHA水解为L-Asp和羟胺，在用8-羟基喹啉进行缩合并氧化为indooxine后，在710nm对其进行测定。(Analytical Biochemistry 309(2002)：117-126，在此以其全部通过引用而并入)。

如图4中所示，以5U/kg施用的缀合物显示出的L-天冬酰胺消耗效力至少与

250U/kg同样好，表示聚乙二醇化使蛋白的效力增加至少50倍。所有的缀合物都显示出相似的效力，使L-天冬酰胺的血浆水平消耗2天，除了5kDa-100％缀合物之外(其显示更长的作用持续时间(96h＝4天，相比于其它缀合物的48h＝2天)。

因此，将与r-克立他酶缀合的PEG大小从2kDa增加至5kDa产生了改善的效力和作用持续时间。然而，令人惊讶地，将PEG的大小增加到10kDa没有进一步改善缀合物的效力和作用持续时间，与5kDa最大程度聚乙二醇化的缀合物相比，其甚至引起了下降。

酶促活性与L-天冬酰胺消耗是一致的。如图5中所示，5kDa-100％缀合物显示出最大的AUC，反映出更长的半衰期。相对于PEG-100％(最大程度聚乙二醇化)缀合物，对于2kDa和5kDa候选者的具有PEG-40％(部分聚乙二醇化)的缀合物观察到了更小的AUC而对于10kDa候选物没有观察到差别。

与L-天冬酰胺消耗数据一致，将与r-克立他酶缀合的PEG分子大小从2kDa增加至5kDa产生了更长的循环L-天冬酰胺酶活性。然而，令人惊讶地，将PEG的大小增加到10kDa没有进一步改善缀合物的体内酶促活性，与5kDa最大程度聚乙二醇化的缀合物相比，其甚至引起了下降。另外，值得注意地，当以高分子量(即40kDa)mPEG使r-克立他酶在N-末端单聚乙二醇化时，对酶对于蛋白分解的体外稳定性没有显著影响(数据未显示)。

实施例8：两种mPEG-r-克立他酶缀合物对于血浆L-天冬酰胺的剂量范围效应

在B6D2F1-杂合体(免疫活性的，雌性)(Charles River德国)中测定了2种mPEG-r-克立他酶缀合物与培门冬酶

相比的药效特征谱。所测试的缀合物为3剂量的、2kDa最大程度(100％)聚乙二醇化的r-克立他酶和5kDa最大程度(100％)聚乙二醇化的r-克立他酶。简而言之，8只动物/组接受了单一的、5，25或50单位/kg bw的r-克立他酶缀合物的i.v.注射，相应于10，50或100μg蛋白/kg。作为比较，以1单位/kg(相应于10μg蛋白/kg)测试了

在给药前1h和给药后90min、6h、24h、48h、72h、96h、120h，144h，192h和240h，从眼窦收集血浆样品并就L-天冬酰胺的血浆水平进行分析。

缀合物对于血浆L-天冬酰胺水平的剂量相关效果显示在图6中。如图6A和6B所示，两种缀合物在消耗循环L-天冬酰胺方面都是高度有效的。对于2kDa 100％缀合物，分别以5U，25U和50U/kg的剂量，观察了3，6和至少10天中的总消耗。对于5kDa 100％缀合物，分别以5U，25U和50U/kg的剂量，观察了3，10和10天中的总消耗。对于两种所测试的缀合物，所测试的5、25和50U/kg的剂量对应于10，50和100μg/kg(基于蛋白含量)，与其它可得的L-天冬酰胺酶制备物相比，这是非常低的蛋白量。的确，250U/kg

相应于约520μg/kg，而1U/kg

大致相应于10μg/kg(基于蛋白含量)。图6C显示出施用等量(10μg/kg)的2kDa-100％缀合物、5kDa-100％缀合物或蛋白在72hr中产生相似的L-天冬酰胺消耗。

实施例9：两种mPEG-r-克立他酶缀合物的药代动力学特征谱

在B6D2F1-杂合体(免疫活性的，雌性)(Charles River德国)中测定了mPEG-r-克立他酶缀合物的药代动力学特征谱。所测试的缀合物为3剂量的、2kDa最大程度(100％)聚乙二醇化的r-克立他酶和5kDa最大程度(100％)完全聚乙二醇化的r-克立他酶。还测试了未经修饰的克立他酶

(250U/kg)和

(1U/kg)作为对照。简而言之，8只动物/组接受了单一的、5，25或50单位/kg bw的每种mPEG-r-克立他酶缀合物的i.v.注射(与和相比较)。在给药前1h和给药后90min、6h、24h、48h、72h、96h、120h，144h，192h和240h，从眼窦收集血浆样品并就残余酶活性的血浆水平进行分析。

通过生色测定法来确定血浆中的酶活性。使用L-天冬氨酰β-异羟肟酸(AHA)作为底物。酶将AHA水解为L-Asp和羟胺，在用8-羟基喹啉进行缩合并氧化为indooxine后，在710nm对其进行测定。(Analytical Biochemistry 309(2002)：117-126)。

为了计算半衰期时间，利用MS-excel工具得到了各个剩余血浆活性的指数最适线。从计算中排除了负的活性值。

血浆中残余酶活性的半衰期时间源自下式，其利用MS-excel工具和指数最适线的各自的式：

均值：

t_{1 / 2} = \frac{- In 2 xt}{In (c_{1} / c_{0})}

其中t_1/2是半衰期，t是时间点，c_t在所述时间点时的剩余血浆活性，c₀是开始时的剩余血浆活性。曲线下面积(AUC)是使用SigmaPlot版本11计算的。药代动力学数据总结在下面的表3和4以及图7-9中。

表3：用250U/kg bw的

1U/kg bw培门冬酶

或2kDa mPEG-r-克立他酶100％缀合物进行单一处理的基本药代动力学(剩余血浆酶活性)

表4：用250U/kg bw的

1U/kg bw培门冬酶

或5kDa mPEG-r-克立他酶100％缀合物进行单一处理的基本药代动力学(剩余血浆酶活性)

数据显示出与未经修饰的克立他酶相比，r-克立他酶的聚乙二醇化显著延长了半衰期，并且是以剂量依赖性的方式(表3和4，图7-9)。此外，当在相同的剂量水平进行比较时，对于5kDa-100％所测量的AUC高于对于2-kDa-100％缀合物所观察到的。发现分别在5、25和50U/kg剂量时，对于5kDa-100％缀合物，一致性发现21％，37％和14％的差异(图8)。当在基于蛋白含量的相同剂量测试时，5kDa-100％缀合物也显示出具有比

本身更长的半衰期，如图9和表4中显示的所得出的药代动力学参数所示的。欧文氏菌缀合物的优越的药代动力学特征谱是令人惊讶的，因为已知源自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶在人和动物中比源自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶(克立他酶)具有更长的半衰期。因此，在逻辑上预测聚乙二醇化的大肠杆菌L-天冬酰胺酶(培门冬酶)与聚乙二醇化的r-克立他酶相比具有更长的半衰期。然而，出乎意料地且有利地，聚乙二醇化的r-克立他酶比培门冬酶具有更长的半衰期。

下面的表5总结了从数个实验收集的药代动力学和药效数据，包括本文的实施例7-9中所描述的那些，其显示：1)2kDa-100％和5kDa-100％缀合物在增加效力和克立他酶的作用持续时间方面都是高度有效的，如与比较时所观察到的显著差异所显示的；2)5kDa-100％缀合物比2kDa-100％缀合物和都具有更长期的作用，如在所有所测试的剂量处所观察到的更长的半衰期所显示的。鉴于以10kDa-100％缀合物所获得的令人惊讶地较差结果，这些数据说明聚乙二醇化的益处随着锚定到克立他酶上的PEG部分的大小而增加，直至5kDa。更高分子量的PEG没有增加更多的益处，并且至少在10kDa的情形中，其甚至可能是有害的。这是出乎意料的并且与例如Holtsberg等人所见到的、当不同分子量的PEG与精氨酸脱氨酶(从微生物来源分离的另一个氨基酸降解酶)缀合时的结果相反。在那些研究中，精氨酸脱氨酶的药代动力学和药效功能随着PEG附着物的大小从分子量为5000Da增加至20,000Da而增加(Holtsberg，F.W.，Journal of Controlled Release 80(2002)，259-271)，在此以其全部通过引用而并入)。

表5

此外，如下文中更详细地见到的，免疫原性数据显示出10kDa-100％显示了不可接受的免疫原性特征谱，当考虑到将化合物施用至对大肠杆菌L-天冬酰胺酶过敏或已经产生了抗-L-天冬酰胺酶抗体的患者时，这是主要的缺点。这方面，10kDa-100％缀合物是真正不合适的。2kDa-100％和5kDa-100％是优选的，并且5kDa-100％缀合物是特别优选的。

实施例10：免疫原性

在B6D2F1-杂合体(免疫活性的，雌性)(Charles River德国)中测定了mPEG-r-克立他酶缀合物的免疫原性。在1、2、3、4和8周中一周两次通过i.v.注射250U/kg bw(对于

和5U/kg bw(对于所有r-克立他酶缀合物)处理动物。在给药前1h和1w，2w，4w，6w及8w后，从眼窦收集血清样品。通过ELISA确定血清中抗-克立他酶或抗-mPEG-r-克立他酶抗体的水平。结果总结在图10和11中。

从第2周开始对于

观察到了高的抗克立他酶抗体滴度并且其在整个研究阶段中被维持。相反，对于r-克立他酶缀合物没有观察到显著的抗体水平(图10)。

如图11中所示，抗缀合物抗体的产生对于2kDa和5kDa mPEG-r-克立他酶缀合物保持低强度和频率，而对于10kDa mPEG-r-克立他酶缀合物，其以更高的值和频率增加。对于完全和部分聚乙二醇化的缀合物之间没有观察到明显的差别(未显示)。

因此，这些数据表明，与未经修饰的L-天冬酰胺酶相比，所选择的聚乙二醇化策略降低了缀合物的免疫原性，显著降低了抗克立他酶抗体应答。然而，检测到了抗缀合物抗体，特别是用10kDa缀合物时，用2kDa和5kDa缀合物时有更低的强度。

总之，似乎直至5kDa，聚乙二醇化在改善r-克立他酶的药代动力学特征谱、效力和作用持续时间方面是成功的，并且与未经修饰的蛋白相比降低了免疫原性，随着所使用的聚合物的大小而增加效力和作用持续时间，5kDa mPEG-r-克立他酶缀合比2kDa mPEG-r-克立他酶缀合物略微更有效。然而，进一步将PEG的大小增加到10kDa没有进一步改善效力和作用持续时间，因为在体内10kDa mPEG-r-克立他酶缀合物没有5kDa mPEG-r-克立他酶缀合物有效，虽然体外效力相似。此外，10kDa mPEG-r-克立他酶缀合物显示了不可接受的免疫原性特征谱，鉴于已发表的其它蛋白的结果，这是出人意料的结果。

虽然通过阐释和实施例的方式，在某些细节上描述了本发明的实施方式和应用，本领域技术人员而言将是显然的是：可能进行许多其它的修饰而不偏离本文中所含有的发明概念。在本文中引用的所有参考文献都以其全部而被并入。

Claims

1.缀合物，其包含来自欧文氏菌(Erwinia)的L-天冬酰胺酶和聚乙二醇(PEG)，所述L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO：1的氨基酸具有至少80％的同一性，其中PEG具有的分子量小于或等于约5000Da。

2.权利要求1的缀合物，其中所述L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO：1的氨基酸具有至少90％的同一性。

3.权利要求1的缀合物，其中所述L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO：1的氨基酸具有至少99％的同一性。

4.权利要求1的缀合物，其中所述L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO：1的氨基酸相同。

5.权利要求1-4中任一项的缀合物，其中所述PEG具有约5000Da的分子量。

6.权利要求1-4中任一项的缀合物，其中所述PEG具有的分子量小于约5000Da。

7.权利要求1-4中任一项的缀合物，其中所述PEG具有的分子量小于约4000Da。

8.权利要求1-4中任一项的缀合物，其中所述PEG具有的分子量小于约3000Da。

9.权利要求1-4中任一项的缀合物，其中所述PEG具有的分子量小于约2500Da。

10.权利要求1-9中任一项的缀合物，其中与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有的体外活性为至少60％。

11.权利要求10的缀合物，其中与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有的体外活性为至少70％。

12.权利要求11的缀合物，其中与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有的体外活性为至少78％。

13.权利要求10的缀合物，其中与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有的体外活性为至少80％。

14.权利要求10的缀合物，其中与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有的体外活性为至少87％。

15.权利要求10的缀合物，其中与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有的体外活性为至少90％。

16.权利要求1-15中任一项的缀合物，其中与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有的L-天冬酰胺消耗活性至少约50倍更有效。

17.权利要求1-16中任一项的缀合物，其中所述缀合物消耗血浆L-天冬酰胺水平至检测不到的水平持续至少48小时。

18.权利要求1-16中任一项的缀合物，其中所述缀合物消耗血浆L-天冬酰胺水平至检测不到的水平持续至少96小时。

19.权利要求1-18中任一项的缀合物，其中与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有更长的体内循环半衰期。

20.权利要求1-19中任一项的缀合物，其中在相等的蛋白剂量下，所述缀合物具有比培门冬酶更长的t_1/2。

21.权利要求20的缀合物，其中在约50μg蛋白/kg的剂量下，所述缀合物具有至少约58小时的t_1/2。

22.权利要求20的缀合物，其中在约50μg蛋白/kg的剂量下，所述缀合物具有至少约60小时的t_1/2。

23.权利要求20的缀合物，其中在约50μg蛋白/kg的剂量下，所述缀合物具有至少约63小时的t_1/2。

24.权利要求20的缀合物，其中在约50μg蛋白/kg的剂量下，所述缀合物具有至少约65小时的t_1/2。

25.权利要求20的缀合物，其中在约10μg蛋白/kg的剂量下，所述缀合物具有至少约34小时的t_1/2。

26.权利要求20的缀合物，其中在约10μg蛋白/kg的剂量下，所述缀合物具有至少约36小时的t_1/2。

27.权利要求20的缀合物，其中在约10μg蛋白/kg的剂量下，所述缀合物具有至少约38小时的t_1/2。

28.权利要求20的缀合物，其中在约10μg蛋白/kg的剂量下，所述缀合物具有至少约40小时的t_1/2。

29.权利要求1-28中任一项的缀合物，其中与未与PEG缀合时的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有更大的AUC。

30.权利要求29的缀合物，其中在相等的蛋白剂量下，所述缀合物具有的平均AUC比培门冬酶大至少约3倍。

31.权利要求1-30中任一项的缀合物，其中PEG共价连接于所述L-天冬酰胺酶的一个或多个氨基。

32.权利要求31的缀合物，其中PEG通过酰胺键共价连接于所述一个或多个氨基。

33.权利要求31或32的缀合物，其中PEG共价连接于至少约40％至约100％的可用氨基。

34.权利要求31的缀合物，其中PEG共价连接于至少约40％至约90％的总氨基。

35.权利要求1至34之一的缀合物，其具有下式：

Asp-[NH-CO-(CH2)x-CO-NH-PEG]n

其中Asp为L-天冬酰胺酶，NH为Asp中赖氨酸残基和/或N-末端的一个或多个NH基团，PEG为聚乙二醇部分，n是代表Asp中至少40％至约100％的可用氨基(例如赖氨酸残基和/或N-末端)的数字，且x是1至8范围内的整数。

36.权利要求35的缀合物，其中x是2至5范围内的整数。

37.权利要求35的缀合物，其中n是代表Asp中至少约40％的可用氨基的数字。

38.权利要求37的缀合物，其中n是代表Asp中约100％的可用氨基的数字。

39.权利要求1-38中任一项的缀合物，其中所述PEG为单甲氧基聚乙二醇。

40.用于制备权利要求1-39中任一项的缀合物的方法，所述方法包括使一定量的所述PEG与一定量的所述L-天冬酰胺酶在经缓冲的溶液中结合足以使所述PEG共价连接至所述L-天冬酰胺酶的一段时间。

41.权利要求40的方法，其中所述经缓冲的溶液具有约7.0至约9.0的pH值。

42.权利要求41的方法，其中所述经缓冲的溶液具有约7.5至约8.5的pH值。

43.权利要求40的方法，所述L-天冬酰胺酶的量是约0.5mg/mL至约25mg/mL的蛋白浓度。

44.权利要求43的方法，其中所述L-天冬酰胺酶的量是约2mg/mL至约20mg/mL的蛋白浓度。

45.权利要求43的方法，其中所述L-天冬酰胺酶的量是约3mg/mL至约15mg/mL的蛋白浓度。

46.权利要求40的方法，其中所述PEG的量为：聚合物比所述L-天冬酰胺酶中的氨基的摩尔过量少于约20∶1。

47.权利要求46的方法，其中所述PEG的量为：聚合物比所述L-天冬酰胺酶中的氨基的摩尔过量少于约10∶1。

48.权利要求46的方法，其中所述PEG的量为聚合物比所述L-天冬酰胺酶中的氨基的摩尔过量少于约8∶1。

49.权利要求40-48中任一项的方法，其中所述PEG为单甲氧基聚乙二醇。

50.治疗患者中可通过L-天冬酰胺消耗而治疗的疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的权利要求1-39中任一项的缀合物。

51.权利要求50的方法，其中所述可通过L-天冬酰胺消耗而治疗的疾病是癌症。

52.权利要求51的方法，其中所述癌症选自：急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、NK淋巴瘤和胰腺癌。

53.权利要求52的方法，其中所述癌症为ALL。

54.权利要求53的方法，其中以约5U/kg至约25U/kg的量施用所述缀合物。

55.权利要求54的方法，其中以约25U/kg的量施用所述缀合物。

56.权利要求53-55中任一项的方法，其中以下列剂量施用所述缀合物：其消耗L-天冬酰胺至检测不到的水平持续约3天至约10天。

57.权利要求53-56中任一项的方法，其中与未缀合的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物在所述患者中引起更低的免疫原性应答。

58.权利要求53-57中任一项的方法，其中与未缀合的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物在单一剂量后具有更长的体内循环半衰期。

59.权利要求53-58中任一项的方法，其中与未缀合的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物在单一剂量后具有更大的AUC值。

60.权利要求50-59中任一项的方法，其中所述缀合物被静脉内施用。

61.权利要求50-59中任一项的方法，其中所述缀合物被肌肉内施用。

62.权利要求50-61中任一项的方法，其中每周施用一次所述缀合物。

63.权利要求50-61中任一项的方法，其中每周施用两次所述缀合物。

64.权利要求50-61中任一项的方法，其中少于每周一次施用所述缀合物。

65.权利要求50-64中任一项的方法，其中所述缀合物作为单一疗法被施用。

66.权利要求65的方法，其中所述缀合物不与天冬酰胺合成酶抑制剂一起施用。

67.权利要求50至66中任一项的方法，其中所述患者对大肠杆菌L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式有既往的超敏性。

68.权利要求50至66中任一项的方法，其中所述患者对欧文氏菌L-天冬酰胺酶具有既往的超敏性。

69.权利要求67或68的方法，其中所述超敏性选自过敏反应、过敏性休克和沉默超敏性。

70.权利要求50-69中任一项的方法，其中所述患者有疾病复发。

71.权利要求70的方法，其中所述疾病复发在用大肠杆菌L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化的形式治疗后发生。

72.药物组合物，其包含权利要求1-39中任一项的缀合物。

73.权利要求1-39中任一项的缀合物，其用于治疗。

74.权利要求73的缀合物，其用于治疗可通过L-天冬酰胺消耗而治疗的疾病。

75.权利要求74的缀合物，其中所述疾病为癌症。

76.权利要求75的缀合物，其中所述癌症为ALL。

77.权利要求76的缀合物，其中与未缀合的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物在所述患者中引起更低的免疫原性应答。

78.权利要求73-77中任一项的缀合物，其中所述药物用于治疗对大肠杆菌L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式具有既往的超敏性的患者中的疾病。

79.权利要求73-77中任一项的缀合物，其中所述药物用于治疗对欧文氏菌L-天冬酰胺酶具有既往的超敏性的患者中的疾病。

80.权利要求78或79的缀合物，其中所述超敏性选自过敏反应、过敏性休克和沉默超敏性。

81.权利要求73-80中任一项的缀合物，其中所述药物用于治疗具有疾病复发的患者中的疾病。

82.权利要求81的缀合物，其中所述疾病复发在用大肠杆菌L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式治疗之后发生。

83.治疗患者中可通过L-天冬酰胺消耗而治疗的疾病的方法，所述方法包括选择需要治疗的患者以及向所述患者施用有效量的权利要求1-39中任一项的缀合物，其中所述患者对大肠杆菌L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式有既往的超敏性，和/或其中所述患者对欧文氏菌L-天冬酰胺酶具有既往的超敏性，和/或所述患者具有疾病复发。

84.权利要求83的方法，其中所述超敏性选自过敏反应、过敏性休克和沉默超敏性。

85.权利要求83的方法，其中所述疾病复发在用大肠杆菌L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式治疗之后发生。

86.权利要求83-85之一的方法，其中所述可通过L-天冬酰胺消耗治疗的疾病为癌症，特别是选自急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、NK淋巴瘤和胰腺癌。

87.权利要求83-86之一的方法，其中以约5U/kg至约25U/kg的量、优选约25U/kg的量施用所述缀合物。

88.权利要求83-87中任一项的方法，其中以下列剂量施用所述缀合物：其消耗L-天冬酰胺至检测不到的水平持续约3天至约10天。

89.权利要求83-88中任一项的方法，其中静脉内地或肌肉内地施用所述缀合物。

90.权利要求83至89中任一项的方法，其中每周一次施用所述缀合物。

91.权利要求83-89中任一项的方法，其中每周两次施用所述缀合物。

92.权利要求83-89中任一项的方法，其中少于每周一次施用所述缀合物。

93.权利要求83-92中任一项的方法，其中所述缀合物作为单一疗法被施用。

94.权利要求93的方法，其中所述缀合物不与天冬酰胺合成酶抑制剂一起施用。