EA020612B1 - ПРИМЕНЕНИЕ 7-ХЛОР-N,N,5-ТРИМЕТИЛ-4-ОКСО-3-ФЕНИЛ-3,5-ДИГИДРО-4Н-ПИРИДАЗИН[4,5-b]ИНДОЛ-1-АЦЕТАМИДА В КАЧЕСТВЕ БИОМАРКЕРА УРОВНЕЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО БЕНЗОДИАЗЕПИНОВОГО РЕЦЕПТОРА - Google Patents

Abstract

Применение меченной радиоактивным изотопом формы 7-хлор-N,N,5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4H-пиридазин[4,5-b]индол-1-ацетамида в качестве биомаркера для определения у пациента уровней PBR, связанных с нормальным и патологическим состояниями. Способ определения уровней PBR, связанных с нормальными и патологическими состояниями. Диагностический набор.

Description

Настоящее изобретение относится к применению 7-\лор-НН5-тримстил-4-оксо-3-фснил-3.5дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамида в качестве биомаркера для определения у индивидуума уровней РБК (периферического бензодиазепинового рецептора), связанных с нормальным и патологическим состояниями. Настоящее изобретение также касается способа определения уровней РВК для указанных выше целей.

При нормальных физиологических условиях РВК, также известный как транслокаторный белок 18 кДа (Т8РО) (Рараборои1ок В. е! а1. (2006) Тгепбк Рйатшас. δει. 27: 402-409) экспрессируется в низких уровнях в мозге, главным образом, в микроглиацитах и экспрессируется в значительных концентрациях в многочисленных периферических тканях, таких как надпочечники, эпифиз, слюнные железы, половые железы, почка, легкое, сердечные и скелетные мышцы (СЬеп, М-К. аиб Ош1ат1е, Т. (2008) РЬагтасо1оду аиб ТЬетареиЬск 118: 1-17; УеппеЬ δ. е! а1. (2006) Ргодгекк ίη №итоЬю1. 80: 308-322). Исследования по субклеточной локализации с референтным РВК лигандом [³Н]РК11195 показали, что РВК локализуется на внешней мембране митохондрий (АпЬо1! К.К. е! а1.(1986) 1. Вю1. СЬет. 261: 576-583; Лщк1е\ую/МюЬа1ик Ь. е! а1. (1988) Мо1. РЬагтасо1. 34: 272-278). Однако иммуно-гистохимические исследования также показали, что РВК экспрессируется в клетках крови (лишенных митохондрий) (О1коп, 1.М. е! а1. (1988) Еиг. 1. РЬагтасо1. 152: 47-53) и может локализоваться на плазматической мембране (О'Ве1гпе, С. е! а1. (1990) Еиг. 1. ВюсЬет. 188: 131-138; \ообк М.1. е! а1. (1996) ВоюЬет. РЬагтасо1. 51: 1283-1292). Ядерная или приядерная локализация РВК также наблюдалась при раке груди (Нагб\\юк М. е! а1. (1999) Сапсег Кек. 59: 831-841), клетках глиомы человека (Вго\\и К.С. е! а1. (2000) Сапсег Ье!!. 156: 125-132), клетках опухоли печени (Согк1 Ь. е! а1. (2005), ЬЬе δα. 76: 2523-2533) и клетках глии (КиЬ1тапп, А.С. апб Сш1айе, Т.К. (2000) 1. ЫеитосЬет. 74: 1694-1704).

Значительное повышение уровней РВК наблюдают после повреждения клеток, воспаления или деления и связано с большим числом острых и хронических патологических состояний (СЬеп М-К. апб Сш1айе, Т. (2008) РЬагтасо1оду апб ТЬетареиЬск 118: 1-17; УеппеЬ δ. е! а1. (2006) Ргодгекк ш №итоЬю1оду. 80: 308-322). Такие состояния включают повреждения мозга, такие как инсульт и ишемически-реперфузионное повреждение (СегЬагб, А. е! а1. (2000) Ыеитогероп 11: 2957-2960; СегЬагб А. е! а1. (2005) Ыештатаде 24: 404-412), травматические повреждения мозга (КадЬауепбта К. е! а1. (2000) Ехр. №иго1. 161: 102-114); инфекции мозга, такие как энцефалит (ВапаЬ К.В. е! а1. (1999) №ито1оду 53: 21992203; Садш А. е! а1. (2001) Вташ 124: 2014-2027); неврологические заболевания, такие как множественный склероз (ВапаЬ К. В. е! а1. (2000) Вташ 123: 2321-2337), болезнь Альцгеймера и слабоумие (Садшп А. е! а1. (2001) Ьапсе! 358: 461-467; Уеткур!, 1.1. е! а1. (2003) Еиг. Ыеиго1. 50: 39-47), болезнь Паркинсона (Оиск Υ. е! а1. (2005) Апп. Ыеиго1. 57: 168-175; СегЬагб А. е! а1. (2006) №итоЬю1. Όίκ. 21: 404-412), амиотрофический латеральный склероз (Титпет М.К. е! а1. (2004) №итоЬю1. Όίκ. 15: 601-609), кортикобазальная дегенерация (СегЬагб А. е! а1. (2004) Моу. Бкотб. 19: 1221-1226; Непке1 К. е! а1. (2004) Моу. Э1когб. 19: 817-821), синдром Хантингтона (Мекктег К. апб Кеупо1бк, С.Р. (1998) №итокск ЬеЬ. 241: 53-56; Рауеке N. е! а1. (2006) №ито1оду 66: 1638-1643) и эпилепсия ^аиуадеаи А. е! а1. (2002) Ме!аЬ. Вташ ЭЬ. 17: 3-11). Повышенные уровни РВК при патологиях ЦНС главным образом наблюдают в микроглиацитах (СЬеп, М-К. апб Сш1апе Т. (2008) РЬагтасо1оду апб ТЬетареиЬск 118: 1-17; УеппеЬ δ. е! а1. (2006) Ргодгекк ш №итоЬю1оду. 80: 308-322).

Сильное повышение РВК также наблюдают при раке (Согпи Р. е! а1. (1992) Ас!а №ипс1йг. 119: 146152; Натбмтск М. е! а1. (1999) Сапсег Кек. 59: 831-841; Маакег К. е! а1. (2002) Сапсег Кек. 8: 3205-3209), воспалении легких (Аиб1 δ.Η. е! а1. (2002) Ьипд. 180: 241-250; Нагб\\юк М. 1. е! а1. (2005) Мо1. 1тадшд 4: 432-438), сердечной ишемии (Ма//опе А. е! а1. (2000) 1. Ат. Со11. Сагбю1. 36: 746-750), почечной ишемии (2Ьапд К. е! а1. (2006) 1. Ат. Со11. διι^. 203: 353-364), ревматизме (фибромиалгия) (РаддюЬ Р. е! а1. (2004) КЬеита!о1оду (ОхЬогб) 43: 1224-1225), регенерации седалищного нерва (МШк, СО. е! а1. (2005) Мо1. Се11. №игокск 30: 228-237), псориатическом артрите (Сшкй Ь. е! а1. (2004) СЬп. ВюсЬет. 37: 61-66) и атеросклерозе (Риртита Υ. е! а1. (2008) А!Ьетокс1еток1к, 201: 108-111; ЬаЬтеп, I. е! а1. (2008) Еиг. 1. Шс. Меб. Мо1. 1тадтд 36: 73-80).

Напротив, повышение уровней РВК наблюдают в мозге пациентов, страдающих шизофренией (Кигитар А. е! а1. (1997) 1. №ита1. Тгапкт. 104: 1361-1370; \обаг/ N. е! а1. (1998) РкусЫаЬу Кек. 14: 363-369) и при ревматоидном артрите (ВпЬек Е. е! а1. (2002) Еиг. 1. РЬагтасо1. 452: 111-122) и остеоартрите (Ва/ζίсЫ Ь. е! а1. (2003) СЬп. ВюсЬет. 36: 57-60).

Возможность получать изображения уровней РВК ш У1уо в мозге и других тканях, таким образом, могла бы служить в качестве важного биомаркера прогрессии заболевания, для определения и оценки эффективности терапевтического лечения и оценки заполненности РВК рецептора ш У1уо.

Для ш У1уо получения изображения уровней РВК при большом числе нейропатологических состояний широко использовался РЕТ РВК лиганд [^ПС]РК11195 (СЬеп М-К. апб Сш1апе, Т. (2008) РЬагтасо1оду апб ТЬетареиЬск 118: 1-17; УеппеЬ δ. е! а1. (2006) Ргодгекк ш №итоЬю1оду. 80: 308-322). В то же время, [^ПС]РК11195 демонстрирует довольно низкое поглощение мозгом, высокую степень неспецифического связывания и довольно низкий сигнал по отношению к коэффициенту шума. Указанные свойства ограничивают чувствительность [^ПС]РК11195 для получения изображения РЕТ уровней РВК и оценки заполненности в ЦНС. Разработка усовершенствованных РЕТ РВК лигандов с более специфическим свя- 1 020612 зыванием и большей чувствительностью по сравнению с [¹¹С]РК11195 обеспечило бы, таким образом, значительный прорыв в получении изображения уровней РБК в мозге и других тканях.

Среди соединений, описанных и заявленных в документах νθ 99/06406 и \νϋ 00/44384 производное пиридазин[4,5-Ь]индола, 7-хлор-Н,Ы,5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5Ь]индол-1-ацетамид, было идентифицировано как в особенности интересное для использования в качестве РЕТ (или БРЕСТ) лиганда для РВК. Указанное соединение имеет высокое сродство к РВК ίη νίΐτο и ίη νίνο (Рсг/а/. В. βΐ а1. (2002) 1. РЬагт. Ехр. ТЬегар. 301: 1067-1078).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к применению 7-хлор-М,Ы,5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамида в качестве биомаркера для определения уровней РВК, связанных с нормальным состоянием, и уровней РВК, связанных с патологическими состояниями.

Настоящее изобретение также касается способа определения уровней РВК, связанных с нормальным состоянием, и уровней РВК, связанных с патологическими состояниями, при использовании меченной радиоактивным изотопом формы 7-хлор-М,Ы,5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Нпиридазин [4,5-Ь] индол-1 -ацетамида.

Настоящее изобретение также касается диагностического набора для определения уровней РВК. Определения

Для удобства и облегчения чтения соединение 7-хлор-М,Ы,5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро4Н-пиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамида в некоторых главах настоящей заявки было переименовано в А.

Для настоящего изобретения последующие слова следует понимать таким образом.

Биомаркер: характеристика, которая может быть объективно измерена (т.е. с приемлемой точностью и воспроизводимостью) и использована в качестве индикатора нормального физического или патологического процесса и для оценки действия медицинской терапии. Биомаркер может быть биологическим, анатомическим, физиологическим, биохимическим или молекулярным параметром, который может быть определен в ткани или биологической жидкости.

Воспаление: ответ на повреждение или разрушение тканей. На периферии острое воспаление состоит из лейкоцитарных инфильтратов, характеризующихся полиморфно-ядерными клетками (нейтрофилы) и хроническое воспаление состоит из мононуклеарных клеток (макрофагов, лимфоцитов, плазматических клеток). В мозге воспаление объединяет широкий спектр клеточных ответов, которые включают активацию микроглии и астроцитов и участие в цитокинезе и хемокинезе, белках комплемента, белках острой фазы, окислительном повреждении и родственных молекулярных процессах. Указанные события могут оказывать вредное воздействие на нейронную функцию, приводя к повреждению нейронов и дальнейшей глиальной активации и в конечном итоге нейродегенерации. В ответ на воспаление мозга клетки глии (главным образом, микроглии) активируются и повышают экспрессию РВК. Уровни РВК в мозге представляют собой, таким образом, индикатор воспаления мозга и могут рассматриваться в качестве биомаркеров нейровоспаления по настоящему изобретению.

Патологические состояния: такие состояния могут включать неврологические заболевания: любое повреждение, нарушение или заболевание, которое влияет на функцию центральной нервной системы. Такие состояния могут включать острые повреждения мозга, такие как инсульт, ишемическиреперфузионное повреждение и травматические повреждения мозга; мозговые инфекции, такие как энцефалит; неврологические заболевания, такие как множественный склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амиотрофический латеральный склероз, слабоумие, кортикобазальную дегенерацию, синдром Хантингтона и эпилепсию; патологические состояния могут также включать психиатрические состояния, такие как шизофрения; периферические воспалительные процессы, такие как воспаление легких, атеросклероз, сердечная ишемия, почечная ишемия, ревматизм (фибромиалгия), псориазный артрит, ревматоидный артрит и остеоартрит; пролиферативные заболевания, такие как рак.

Заполнение рецептора: показатель количества связывания с биохимической мишенью или рецептором. Уровень заполнения рецептора для лекарственного средства может быть измерен путем сравнения измерений времени-активности, полученных с меченным радиоактивным изотопом лигандом РЕТ самим по себе и когда РЕТ лиганд применяют после введения немеченого лекарственного средства. РЕТ лиганд должен связываться с тем же рецептором, что и немеченое лекарственное средство. Количество меченного радиоактивным изотопом РЕТ лиганда, связывающегося с рецептором, уменьшается в присутствии повышенных концентраций немеченого лекарственного средства. Величину этого уменьшения определяют как заполнение рецептора немеченым лекарственным средством.

РЕТ получение изображения: позитрон-эмиссионная томография представляет собой способ получения изображения, при помощи которого получают трехмерное изображение или карту функциональных процессов в организме. Система определяет пары гамма-лучей, испускаемых непосредственно испускающим позитроны радионуклидом (индикаторная добавка), который вводят в организм на биологически-активной молекуле. Изображения концентрации индикаторной добавки в 3-мерном пространстве в организме потом реконструируют при помощи компьютерного анализа. Материалы, используемые для РЕТ, представляют собой сцинтилляторы, такие как германат висмута, оксиортосиликат лютеция или

- 2 020612 ортосиликат гадолиния, в связи с их высокой способностью останавливать γ-лучи и скоростью превращения сигнала. Микро РЕТ представляет собой применение РЕТ для получения изображения у небольших животных.

БРЕСТ получение изображения компьютерной томографией одиночных фотонов представляет собой другой способ получения изображения, при помощи которого получают трехмерное изображение или карту функциональных процессов в организме. Система непосредственно отображает гамма-лучи, испускаемые радионуклидом, испускающим одиночные фотоны (индикаторная добавка), который вводят в организм на биологически-активной молекуле. Получение изображения концентрации индикаторной добавки в 3-мерном пространстве в организме потом реконструируют при помощи компьютерного анализа.

Меченная радиоактивным изотопом форма: любая молекула, в которой один или несколько атомов были замещены на изотопы, позволяющие ее детектировать. Радиоизотопы, испускающие позитроны, наиболее часто использующиеся для РЕТ получения изображения, представляют собой углерод-11 (или ^ПС, С/2=20 мин), азот-13 (или ¹³Ν, й/2=10 мин), кислород-15 (или ¹⁵О, 11/2=2 мин). Также можно рассматривать молекулы, в которых были добавлены дополнительные атомы для метки производных с другими испускающими позитрон изотопами для РЕТ получения изображения, такие как фтор-18 (или ¹⁸Р, !1/2=110 мин), а также галлий-68 (или ⁶⁸Са, ΐ1/2=68 мин), медь-64 (или ⁶⁴Си, 11/2=12,7 ч), бром-76 (или ⁷⁶Вг, !1/2=16,1 ч) и йод-124 (или ¹²⁴1, !1/2=4,2 дня). Наконец, также следует принять во внимание молекулы, в которые были введены другие дополнительные атомы для маркировки производных радиоизотопами, испускающими одиночные фотоны для БРЕСТ получения изображения, такие как йод-123 (или ¹²³1, !1/2=13,1 ч) или технеций-99т (или ⁹⁹Тс, й_/2=6,0 ч).

Синтез меченных радиоактивным изотопом лигандов и замещение атома изотопом можно проводить несколькими способами, известными специалисту в данной области техники. Например, для замещения атома углерода на углерод-11, заявители использовали несколько производных, таких как [¹¹С]метилиодид или [^пС]метилтрифталат (Уе1сй М.1. е! а1. (2003) Ιη НапйЪоок оГ Кайюрйагтасеийса1з РайюсНстМгу апй Аррйсайопз (Уе1сй М1, Кейуап1у СБ Ейз.) №\у Уогк-Сйюйез!ег-В1гзЪапе-Тогоп!о, ХУПеу-йНегзаепсе РиЪ., 1-848). В случае А несколько метильных групп могут быть меченными углеродом-11, такие как Ν,Ν-диметилацетамид или Ν-метилиндольные функциональные группы.

В случае метки фтором-18, радиоизотоп можно непосредственно присоединять к структуре остова (А) при помощи нуклеофильных алифатических или ароматических (включая гетероароматические ЛоПе Р. е! а1. (2005) Сигг. Рйатт. Оез1дп 11: 3221-3235)) заместителей или электрофильных заместителей, или связанных через дополнительную спейсерную группу, оба способа известны специалисту в данной области техники (КйЪоитп МК. (1990) Ιη Р1иопЪе-18 ЬаЪейпд оГ Кайюрйагтасеи!юа1з, №с1еат Баепсе Бепез (КйЪоитп МК Ей.), №йопа1 Асайету Ргезз, УазЫпдЮп, О.С., 1-149; Ьазпе М.-С. е! а1. (2002) Торюз ш Сиггеп! Сйет1з!гу 222: 201-258; Са1 Ь. е! а1. (2008) Еиг. I. Огд. Сйет. 17: 2853-2873; По11е Р. е! а1. 1п Р1иоппе апй Неа1!й: Мо1еси1аг 1тадшд, Вютейюа1 Ма!ейа1з апй Рйагтасеийса1з, Тгеззаий А, НаиГе С (Ейз). Е1зу1ег: Атз1егйат-Воз1оп-Не1йе1Ьегд-Еопйоп-№\у Уогк-ОхГогй-Райз-Бап П1едо-Бап Ртапазсо-БшдарогеБуйпеу-Токуо, 3-65). В особенности интересным представляется использование алкильных, алкенильных или алкинильных линкеров для присоединения атома фтор-18 ЛатоШ А. е! а1 (2008) I. ЬаЪек Сотрйз Кайюрйагт. 51: 286-292; По11е Р. е! а1. (2006) Вюогд. Мей. Сйет 14: 1115-1125; По11е Р. е! а1. (2007) I. ЬаЪе1. Сотрйз Кайюрйагт. 50: 716-732).

В случае метки другим галогеном (таким как бром-76, иод-123 или иод-124) радиоизотоп можно также непосредственно присоединять при помощи нуклеофильных или электрофильных заместителей к структуре остова (А) или связывать путем добавления спейсерной группы, оба способа известны специалисту в данной области техники (Ма/1еге В. е! а1. (2001) Сигг. Рйагт. Оез. 7: 1931-1943; Соепеп Н.Н. е! а1. (2006) в Райююйтайоп теасйопз Гог Рйаттасеийса1з - Сотрепйшт Гог еГГесйуе зуййез1з зйа!ед1ез, Соепеп Н.Н. Мейепз 1., Ма/1еге В. (Ейз), Бргтдег Ует1ад, Вегйп-Не1йе1Ъегд, 1-101).

В случае метки изотопами металлов (такими как галлий-68, медь-64 или технеций-99т) используемый предпочтительный подход, который будет приниматься во внимание специалистом в данной области техники, состоит в использовании бифункционального хелатирующего агента, на основе, например, открытоцепных полиаминокарбоксилатов этилендиамин тетрауксусной кислоты (ЭДТУ) и диэтилентриамин пентауксусной кислоты (ЭТРА), полиаминокарбоксильного макроцикла 1,4,7,10тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (ЭОТА), меркаптоацетилди- и триглицина (МАС2, МАС3), бис-(Б-бензоилтиогликолоил)диаминопропаноата ((БВТ)₂ПАР) и гидразиноникотиновой кислоты (НУЛ1С), облегчающих комплексообразование катионов радиометалла в одной функциональной группе и ковалентное присоединение к молекуле остова в другой (Вгиппег и.К. е! а1. (1995) Кайю!гасег ртойисйоп - Кайюше!а1з апй !йей сйе1а!ез ш Ртшар1е оГ Шскаг Мейесше, ХУадпег ΚΝ. (Ей) Баипйегз: Рййайе1рЫа, 220-228; ХУетег К.Е. е! а1. (2003) Сйетез1гу оГ даШит тйшт гайюрйагтасеийса1з 1п НапйЪоок оГ Кайюрйагтасеийса1з - РайюсйепйзРу апй Аррйсайопз (ХУе1сй М1, Кейуап1у СБ Ейз), №\у Уогк-СЙ1сйез!ег-Вг1зЪапе-Тогоп!о, Уйеу-1п!егзс1епсе РиЪ., 363-400; Апйегзоп С.1. е! а1. (2003) Сйет1з!ту оГ соррег гайюписЮйез апй гайюрйагтасеи!юа1 ргойис!з ш НапйЪоок оГ Кайюрйагтасеи!юа1з - Райюсйепйз!гу апй Аррйсайопз (ХУе1сй МТ Кейуап1у СБ Ейз.), №\у Уогк-Сйюйез!ег-В1гзЪапе-Тогоп!о, ХУйеу- 3 020612

1п1ег8С1епсе РиЪ., 401-422; Майтоой А. с1 а1. (2003) Тесйпейит гайюрйагтасеиНсаН Ιη НапйЪоок οί ΡαάίοркагтасеиИса18 - РаШоскетМгу апй АррНсаИопз (\Ме1сН М1, Кейуап1у С8 Εάδ.), №\ν Уогк-СЫскеЧегВг18Ъапе-Тогоп1о, ХУПеу-ЕИегзаепсе РиЪ., 323-362).

Может осуществляться непосредственное присоединение атома фтора-18 (или брома-76, йода-123 или йода-124), например, в 3-фенильных и/или пиридазин[4,5-Ъ]индольных ароматических циклах, а также в любом другом химически приемлемом положении (таком, как ацетамидная функциональная группа). Непрямое присоединение указанных радиогалогенов (например, при использовании спейсерной группы) или добавление металлических радиоактивных изотопов, упомянутых выше (галлий-68, медь-64 или технеций-99т при использовании хелатирующего агента), можно также проводить в любое химически приемлемое положение остова НН5-триметил-4-оксо-3-фенил-3.5-дигидро-4Н-пиридазин|4.5Ъ]индол-1-ацетамида (А) (см. ссылки выше).

Введение: предпочтительно введение меченного радиоактивным изотопом биомаркера проводят путем внутривенного введения.

Первый вариант осуществления представляет собой применение 7-\лор-НН5-триметил-4-оксо-3фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ъ]индол-1-ацетамида в качестве биомаркера для определения у индивидуума, уровней РВК (периферического бензодиазепинового рецептора) и воспаления, ассоциированного с патологическими состояниями, где указанное соединение представляет собой меченное радиоактивным изотопом, где радиоактивный изотоп выбран из углерода-11, радиогалогенов или радиометаллов. Предпочтительно указанное соединение представляет собой меченное радиоактивным изотопом углерод-11 и более предпочтительно меченным углеродом-11 в положении углерода метильной группы, расположенной в 5 положении индольного ядра.

В другом варианте осуществления 7-хлор-Н,Ы,5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Нпиридазин[4,5-Ъ]индол-1-ацетамид мечен радиоактивным изотопом радиометаллов, предпочтительно в 3-фенильном кольце в пара-положении в 7-положении пиридазин[4,5-Ъ]индола, замещая атом хлора (с или без спейсерной группы, см. ниже), или в любом Ν-метильном положении (Ν,Ν-диметилацетамидной функциональной группы или метильной группы, располагающейся в 5-положении индольного ядра).

В другом варианте осуществления 7-хлор-^^5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Нпиридазин[4,5-Ъ]индол-1-ацетамид мечен радиоактивным изотопом радиогалогенидами, предпочтительно мечен радиоактивным изотопом радиогалогенида фтор-18, предпочтительно в 3-фенильном кольце пара-положении, в 7 положении пиридазин[4,5-Ъ]индола, замещая атом хлора (с или без спейсерной группы, см. ниже), или в любом Ν-метильном положении (Ν,Ν-диметилацетамидной функциональной группы или метильной группы, располагающейся в 5-положении индольного ядра).

В некоторых вариантах осуществления изобретения определение уровней РВК и воспаления осуществляют при применении РЕТ получения изображения (позитрон-эмиссионная томография) или БРЕСТ получением изображения (компьютерная томография одиночных фотонов).

В некоторых вариантах осуществления изобретения используют меченную радиоактивным изотопом форму 7-хлор-Н,^5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ъ]индол-1-ацетамида в качестве биомаркера для определения изменения уровней РВК или воспаления, связанных с патологическими состояниями, где указанные паталогические состояния выбирают из повреждений мозга, таких как инсульт, ишемически-реперфузионное повреждение и травматическое повреждение мозга; инфекций мозга, таких как энцефалит, неврологических заболеваний, таких как множественный склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амиотрофический латеральный склероз, слабоумие, кортикобазальная дегенерация, синдром Хантингтона и эпилепсия; психиатрических состояний, таких как шизофрения; периферических воспалительных процессов, таких как воспаление легких, атеросклероз, сердечная ишемия, почечная ишемия, ревматизм (фибромиалгия), псориазный артрит, ревматоидный артрит и остеоартрит; пролиферативных заболеваний, таких как рак.

В некоторых вариантах осуществления меченную радиоактивным изотопом форму 7-хлор-^Л,5триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ъ]индол-1-ацетамида используют в качестве биомаркера уровней РВК и воспаления в том случае, когда воспаление представляет собой нейровоспаление.

В некоторых вариантах осуществления изобретения меченную радиоактивным изотопом форму 7\лор-N,N,5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ъ]индол-1-ацетамида используют для оценки эффективности терапевтического лечения.

Настоящее изобретение также касается способа определения РВК и воспаления, связанного с патологическими состояниями при применении меченной радиоактивным изотопом формы 7-хлор-^Л,5триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ъ]индол-1-ацетамида.

В некоторых вариантах осуществления меченная радиоактивным изотопом форма 7-хлор-^^5триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ъ]индол-1-ацетамида содержит радиоактивную метку, выбранную из углерода-11, радиогалогенов и радиометаллов. В некоторых вариантах осуществления меченная радиоактивным изотопом форма 7-хлор-Н,^5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро4Н-пиридазин[4,5-Ъ]индол-1-ацетамида мечена углеродом-11.

В некоторых вариантах осуществления меченная радиоактивным изотопом форма 7-хлор-^Л,5- 4 020612 триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамида мечена радиоактивным изотопом по углероду метильной группы, расположенной в 5-положении индольного ядра.

В некоторых вариантах осуществления 7-хлор-Ч,Ч,5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Нпиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамид мечен радиометаллами, предпочтительно по 3-фенил кольцу в параположении, в 7-положении пиридазин[4,5-Ь]индола, замещая атом хлора (с или без спейсерной группы, см. ниже), или в любом Ν-метильном положении (Ν,Ν-диметилацетамидной функциональной группы или метильной группы, располагающейся в 5-положении индольного ядра).

В некоторых вариантах осуществления 7-\лор-ИН5-триметил-4-оксо-3-фенил-3.5-дигидро-4Нпиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамид мечен радиогалогенидами, предпочтительно мечен радиоактивным изотопом радиогалогенида фтор-18, предпочтительно по 3-фенил кольцу в пара-положении, в 7положении пиридазин[4,5-Ь]индола, замещая атом хлора (с или без спейсерной группы, см. ниже), или в любом Ν-метильном положении (Ν,Ν-диметилацетамидной функциональной группы или метильной группы, располагающейся в 5 положении индольного ядра).

В некоторых вариантах осуществления изобретения патологические состояния выбраны из повреждений мозга, таких как инсульт, ишемически-реперфузионное повреждение, травматическое повреждение мозга; инфекций мозга, таких как энцефалит; неврологических заболеваний, таких как множественный склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амиотрофический латеральный склероз, слабоумие, кортикобазальная дегенерация, синдром Хантингтона и эпилепсия; психиатрических состояний, таких как шизофрения; периферических воспалительных процессов, таких как воспаление легких, атеросклероз, сердечная ишемия, почечная ишемия, ревматизм (фибромиалгия), псориазный артрит, ревматоидный артрит и остеоартрит; пролиферативных заболеваний, таких как рак.

Другой вариант осуществления согласно изобретению представляет собой способ определения РВК и воспаления, связанного с патологическими состояниями, где воспаление представляет собой нейровоспаление.

Другой вариант осуществления соглавно изобретению представляет собой способ определения РВК и воспаления, связанного с патологическими состояниями, который проводят для исследования заполнения.

Другой вариант осуществления представляет собой способ определения РВК и воспаления, связанного с патологическими состояниями, указанный способ, включает следующие стадии:

a) Введение меченной радиоактивной меткой формы 7-хлор-Н,^5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамида;

b) Получение изображения интересующей области головного мозга или других периферических тканей при применении способа РЕТ (или БРЕСТ);

c) Количественная оценка уровней РВК в интересующей области путем количественной оценки РЕТ сигнала, ассоциированного с меченной радиоактивной меткой формы 7-хлор-Л,Ц5-триметил-4оксо-3 -фенил-3,5 -дигидро-4Н-пиридазин[4,5 -Ь] индол-1 -ацетамида;

ά) Сравнение РЕТ (БРЕСТ) сигнала, полученного в стадии с) с сигналом, полученным в интересующей области в контрольном эксперименте;

е) Определение присутствия воспаления, связанного с патологическими состояниями.

Настоящее изобретение также относится к диагностическому набору для определения уровней РВК, связанных с нормальными состояниями и изменениями уровней РВК, связанными с патологическими состояниями, включающему меченную радиоактивной меткой форму 7-хлор-Н,^5-триметил-4-оксо-3фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамида.

Последующие примеры допролнительно иллюстрируют настоящее изобретение и не предназначены для ограничения изобретения. С точки зрения облегчения чтения соединение 7-хлор-Н,^5-триметил-4оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамид на чертежах и в результатах было переименовано как А.

Фиг. 1: Кривые активность-время [^ПС]-А и |^НС|РК11195 в поврежденном и интактном полосатом теле крысы. Данные представлены как процент инъецированной дозы на кубический сантиметр как функция от времени после инъекции (мин).

Фиг. 2: Соотношение поглощения [^ПС]-А и [^ПС]РК11195 в поврежденном и интактном полосатом теле крысы.

Фиг. 3: Кривые активность-время [^ПС^]-А в поврежденном (ίρδί) и интактном (сойто) полосатом теле крысы. Стрелка указывает добавление избытка 1 мг/кг РКП195 через 20 мин после инъекции [^ПС]-А в поврежденное (ίρδί+РК) и интактное контролатеральное (сойто+РК) полосатое тело крысы. Данные выражены как процент инъецированной дозы на кубический сантиметр как функция времени после инъекции (мин).

Фиг. 4: Кривые активность-время [^!1С]-А в поврежденном (ίρδί А) и интактном (сойго А) полосатом теле крысы. Стрелка указывает добавление избытка 1 мг/кг А через 20 мин после инъекции [^ПС]-А в поврежденное (ίρδί А+А) и интактное контролатеральное (сойто А + А) полосатое тело крысы. Данные выражены как процент инъецированной дозы на кубический сантиметр как функция времени после инъекции (мин).

- 5 020612

Фиг. 5: Авторадиография [^ПС]-А в срезе (20 мкм) головном мозге крысы через 7-8 дней после повреждения. Неспецифическое связывание достигали при использовании избытка немеченого [^ПС]РК11195 (23 мМ) или А (22 мМ). Специфичность РБК по отношению к бензодиазепиновых участков связывания оценивали при использовании избытка немеченого Флюмазенила (27 мкМ). Данные выражены как доза в месяц (брт) на произвольную область. * обозначает значительное различие по сравнению с [¹¹С]-А (18 нМ) связыванием в поврежденном полосатом теле.

Фиг. 6: Кривые активность-время [¹¹С]-А и [¹¹С]РК11195 в полном головном мозге (мозжечок исключен) 11-12 месячных АРР/81 и дикого типа Р81 трансгенных мышей. Данные представлены как процент инъецированной дозы на кубический сантиметр как функция от времени после инъекции (мин).

Фиг. 7: Авторадиография |С|-А (18 нМ) в срезе целого головного мозга 20-23 месячных АРР/81 и дикого типа Р81 трансгенных мышей. Неспецифическое связывание достигали при использовании избытка или немеченого [³¹С]РК11195 (23 мкМ), или А (22 мкМ). Специфичность РВК по отношению к бензодиазепиновым участкам связывания оценивали при использовании избытка немеченого Флюмазенила (27 мкМ). Данные выражены как доза в месяц (брт) на условную область.

Фиг. 8: Кривые активность-время [¹³С]-А в четырех различных областях мозга у примата, отличного от человека (правое и левое полосатые тела, префронтальная кора, мозжечок) и соответствующие совокупности РЕТ изображений избранных сечений коронального головного мозга в течение 120 мин при различных моментах времени исследования: исходный (А,В) и через 24 ч после повреждения правого полосатого тела (С, Ό). Панель (Е, Р) показывает время активности [^ПС]-А через 48 ч после повреждения в левом полосатом теле и через 7 месяцев после повреждения в правом полосатом теле. Данные представлены как процент инъецированной дозы на 100 мл (%ГО/100 мл) как функция от времени после инъекции (мин).

Фиг. 9: Кривые активность-время [¹³С]-А в четырех различных областях мозга (правое и левое полосатые тела, префронтальная кора, мозжечок) и соответствующие совокупности РЕТ изображений избранных сечений коронального головного мозга в течение 120 мин при различных моментах времени исследования: исходный (А,В) и через 48 ч после повреждения (С, Ό), на 9 день после повреждения (Е, Р) и 16 день после повреждения в левом полосатом теле и 48 ч после повреждения в правом полосатом теле (С, Н). Стрелка указывает добавление избытка немеченого РК11195 (1 мг/кг). Данные выражены как процент инъецированной дозы на 100 мл (%ГО/100 мл) как функция от времени после инъекции (мин).

Фиг. 10: Анализ [^ПС]-А метаболитов в плазме и мозге.

Фиг. 11: выбранные меченные углеродом-11 и фтором-18 формы А.

Способы

Радиосинтез лигандов.

Метка углеродом-11 [^ПС]РК11195 ((К)-Щ^пС]метил-^(1-метилпропил)-1-(2-хлорфенил)изохинолин-3-карбоксамида,

К-энантиомер).

Получение [^ПС]РК11195 основывается на минимальных модификациях опубликованного способа (Саткоппе С. е! а1., (1984) 1. ЬаЬе1. Кабюрйагт 21: 985-991; Сгетег ЕЕ. е! а1. (1992) Ιηΐ. I. Каб. Арр1. Ιη51гит. В. 19: 159-66; Воибп Н. е! а1. (2007) Сйа 55: 1459-68; Воибп Н. е! а1. (2007) I. ЫисЕ Меб. 48: 573581) и включает следующие стадии: (1) поглощение при -10°С [^пС]метилиодида в ДМФА/ДМСО (2/1 (об./об.), 300 мкл), содержащего от 1,5 до 2,0 мг предшественника для мечения и 15-20 мг порошкообразного гидроксида (избыток); (2) нагревание при 110°С в течение 3 мин; (3) прием смеси в 0,5 мл мобильной фазы ВЭЖХ и (4) очистка полупрепаративной ВЭЖХ. Контроль качества, в особенности определения радиохимической и химической чистоты, проводили в аликвоте партии конечного продукта.

[^ПС]-А мечение по Ν-метилиндольной функциональной группе: 7-хлор-Х,Ы-диметил-5-[¹¹С]метил4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамида). Получение [^ПС]-А включает следующие стадии: (1) поглощение при -10°С [^пС]метилтрифталата в ДМФА (300 мкл), содержащего от 0,2 до 0,3 мг предшественника для мечения и 4 мг порошкообразного карбоната калия (избыток); (2) нагревание при 120°С в течение 3 мин; (3) прием смеси в 0,5 мл мобильной фазы ВЭЖХ и (4) очистка полупрепаративной ВЭЖХ. Контроль качества, в особенности определения радиохимической и химической чистоты, проводили в аликвоте партии конечного продукта.

[^ПС]-А (мечение по Ν,Ν-диметилацетамидной функциональной группе:

7-хлор^-[^пС]метил-^5-диметил-4-оксо-3 -фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамида)

Получение [^ПС]-А также включает следующие стадии: (1) поглощение при -10°С [^пС]метилиодида в 1/2 (об./об.) смеси ДМФА/ДМСО (100/200 мкл), содержащего от 0,5 до 1,0 мг предшественника для мечения и 5 мкл 1М раствора тетрабутиламмоний гидрохлорида в метаноле; (2) нагревание при 120°С в течение 3 мин; (3) прием смеси в 0,5 мл мобильной фазы ВЭЖХ и (4) очистка полупрепаративной ВЭЖХ. Контроль качества, в особенности определения радиохимической и химической чистоты, проводили в аликвоте партии конечного продукта.

Мечение фтором-18.

Получение всех меченных фтором-18 производных А включало, по крайней мере, следующие ста- 6 020612 дии: (1) фторирование при использовании источника [¹⁸Р]фторида при от умеренной до высокой температуре в выбранном растворителе (от 300 до 900 мкл), содержащем от 1 до 10 мг пригодного предшественника для мечения и (2) очистки при применении, например, полупрепаративной ВЭЖХ. Как описано выше, контроль качества, в особенности определение радиохимической и химической чистоты, проводили в аликвоте партии конечного продукта.

Нет особенного ограничения в отношении природы источника анионов [¹⁸Р]фторида для применения в настоящей реакции, и любые источники аниона [¹⁸Р]фторида, условно используемые в реакциях этого типа, могут быть в равной степени использованы здесь, обеспечивая, чтобы не оказывалось отрицательного влияния на другие части молекулы. Примеры пригодных источников анионов [¹⁸Р]фторида включают [¹⁸Р]фториды щелочного металла, такие как [¹⁸Р]фторид натрия, [¹⁸Р]фторид калия, [ Р]фторид цезия, [ Р]фторид аммония, [ Р]фториды тетраалкиламмония, такие как [ Р]фторид тетрабутиламмония. Из них [¹⁸Р]фториды щелочного металла, особенно фторид калия, представляют собой предпочтительные. Источник анионов [¹⁸Р]фторида может быть активирован присутствием лиганда, способного образовывать комплекс с противокатионной разновидностью источника анионов [¹⁸Р]фторида. Лиганд может в особенности представлять собой циклический или полициклический мультидентатный лиганд. Примеры пригодных лигандов включают в особенности краун-эфиры, такие как 1,4,7,10,13пентаоксациклооктадекан (18-С-6) или криптанды, такие как 4,7,13,16,21,24-гексаокса-1,10диазабицикло-[8,8,8]гексакозан, продаваемый под названием К222®.

Предпочтительно источник анионов [¹⁸Р]фторида представляет собой криптатный комплекс щелочного металла [¹⁸Р]фторида, особенно криптатный комплекс [¹⁸Р]фторида калия, предпочтительно [¹⁸Р]фторид 4,7,13,16,21,24-гексаокса-1,10-диазабицикло-[8,8,8]гексакозана калия (К[¹⁸Р]/К222). Комплекс К[¹⁸Р]/К222® может быть получен любыми традиционными способами (Эо11е Р. с1 а1. (1999) 1. Меб. Сйет. 42: 2251-2259 ог Όοίοί Ь. е! а1. (1999) Вюогд. Меб. СЬет. 7: 467-479).

Реакцию фторирования можно проводить в различных растворителях, и она может происходить в широком диапазоне температур. В общем, удобно проводить реакцию при температуре от 50 до примерно 200°С и более часто используемые растворители представляют собой диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид (ДМФА) и ацетонитрил. Время, необходимое для прохождения реакции может также широко варьировать (например, от 5 до 15 мин) в зависимости от многочисленных факторов, особенно температуры реакции, природы реакционных агентов и растворителей и количества используемого меченного предшественника (КбЪоит МК. (1990) Ιη: Р1иогше-18 ЬаЪебпд оГ КабюрЬагтасеибса1к, №ю1еаг 8с1епсе 8епек (КбЪоигп МК Еб.), Ыабопа1 Асабет1 ргекк, УакЫпд!оп, Ό.Ο, 1-149$ Ьакпе М.-С. е! а1. (2002) Торюк т Сиггеп! СЬетшбу, 222: 201-258; Юо11е Р. е! а1. (2005) Сигг. РЬагт. Эебдп 11: 3221-3235: Са1 Ь. е! а1. (2008) Еиг. I. Огд. СЬет. 17: 2853-2873: Юо11е Р. е! а1. (2008) ш Р1оиоппе апб Неа1!Ь: Мо1еси1аг 1тадшд, Вютебюа1 Ма!епа1к апб РЬагтасеибса1к, Тгеккаиб А, НаиГе О (Ебк). Е1ке\аег: Атк!егбат- Вок!опНе1бе1Ъегд-Еопбоп Ыете Уогк-О\Гогб-Рапк-8ап Э|едо-8ап Ргапсбсо-8б1дароге-8убпеу-Токуо. 3-65). Меченные радиоактивным фтором соединения, полученные таким образом, обычно очищают ВЭЖХ, как описано для производных, меченных углеродом-11, но их можно также выделять или предварительно очищать из реакционной смеси путем применения других известных хроматографических технологических способов или простой фильтрацией на предварительно упакованной разделительной колонке.

[¹⁸Р]фторэтокси-А (7-хлор-^^5-триметил-4-оксо-3-(4-[¹⁸Р]фторэтокси)фенил-3,5-дигидро-4Нпиридазин [4,5-Ъ] индол-1 -ацетамид)

Получение [¹⁸Р]фторэтокси-А включает следующие стадии:

(1) поглощение К[¹⁸Р]Р-Кгур!ой\®222 комплекса с раствором ДМСО (600 мкл), содержащим тозилокси предшественник для мечения (2,0-8,0 мг); (2) нагревание при 165°С в течение 3-10 мин; (3) предварительная очистка при использовании С-8 или С-18 Ргер8ер картриджа и (4) очистка при использовании полупрепаративной ВЭЖХ. Контроль качества, в особенности определения радиохимической и химической чистоты, проводили в аликвоте партии конечного продукта.

Мечение другими галогенами (бром-76, йод-123, йод-124)

При получении всех прочих радиогалогенированных производных (бром-76, йод-123, йод-124) следуют стандартным технологическим способам и процедурам, известным специалисту в данной области техники (Ма/1еге В. е! а1. (2001) Сигг. РЬагт. Оек. 7: 1931-1943; Соепеп Н.Н. е! а1. (2006) 1п Кабююбтабоп геасбопк Гог РЬагтасеибсаЛ - Сотрепбшт Гог еГГесбуе куп!Ьек1к к!га!ед1ек, Соепеп Н.Н., Мебепк I., Ма/1еге В. (Ебк.), 8рппдег Уег1ад, Вегбп-Не1бе1Ъегд, 1-101).

Мечение радиометаллами (галлий-68, медь-64 и технеций-99т)

При получении производных, меченных радиометаллами (галлий-68, медь-64 и технеций-99т), также следуют стандартным технологическим способам и процедурам, известных специалисту в данной области техники (Вгиппег и.К. е! а1., (1995) Кабюбасег ргобисбоп - Кабюте1а1к апб !Ьеб сЬе1а1ек ш Рбпар1е оГ Хис1еаг Мебюше, Уадпег Η.Ν. (Еб.) 8аипбегк : РЬбабе1рЫа, 220-228; Уешег К.Е. е! а1. (2003) СЬетшбу оГ даШит апб шбшт габюрЬагтасеибса1к т НапбЪоок оГ КабюрЬагтасеибса1к - КабюсЬетшбу апб Аррбсабопк (Уе1сЬ МР Кебуап1у С8 Ебк.), Νον Уогк - СЫсЬек!ег - ВпкЪапе - Тогоп!о, Убеу-Шегкшепсе РиЪ., 262-400; Апбегкоп С.1. е! а1. (2003) СЬетгкбу оГ соррег габюпискгбек апб габюрЬагтасеибса1к ргоб- 7 020612 ис!5 ίη НапбЪоок οί КабюрЪаттасейюак - РабюсНепизЦу апб ΑρρΙίοαίίοηδ (^е1сЪ М.к, Кебуап1у Сз Ебз.), Νον Уогк-СЫсЪейег-ВпкЪапе-ТогоШо, ХУПеубйегзОепсе РиЪ., 401-422; Мактооб Α. е! а1. (2003) ТескпеΙίιιιη табюркаттасейюак т НапбЪоок оГ КабюркаттасейюаН - РабюскепизЦу апб АррИсакопз (^е1ск М.к, Кебуап1у С8 Ебз.), Νον Уогк - СЫске5!ег - ВбзЪапе -Тогоп!о, ХУПеу-кИегзаепсе РиЪ., 323-362).

Состав

Состав [¹¹С] РК11195, [¹¹С]-А или любых других несущих радиоактивную метку производных А, как в растворе для внутривенных (ί.ν.) инъекций часто включают удаление ВЭЖХ растворителей на основе картриджа \Уа1ег5 ЗерРак® и/или простое разбавление водным 0,9% раствором ЫаС1 (физиологический раствор) до концентрации этанола ниже 10%.

Экспериментальные модели на животных

Все исследования проводили в соответствии с законодательством Франции или Европейскими указаниями.

Экспериментальная модель нейровоспаления на крысе

Крыс \У151аг (средний размер тела 300 г, сейте б'Е1е\'аде Кепе 1а^1ет, Ргапсе) держали при условиях терморегуляции в условиях контроля влажности при цикле свет/темнота 12 ч/12 ч (свет включен в диапазоне от 7 утра до 7 вечера) и предоставляли свободный доступ к пище и воде. Нейровоспаление индуцировали стереотаксической инъекцией АМРА (альфаамино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионат) (15 мМ в РВЗ буфере, Зщта*) при использовании 1 мкл микрошприца и микронасоса (скорость инъекции 0,5 мкл/мин, ийтаМютоРитр II® и Мюто4® СойтоПет, \УР1 1пс., υδΑ), как было описано ранее (Воибпе! а1., (2007) Ока 55: 1459-68; Воибп е! а1. (2007) I. Ыиск Меб. 48: 573-581). АМРА (0,5 мкл) инъецировали в правое полосатое тело (+0,7 мм от брегмы, 2,7 мм от сагиттального шва, глубина от поверхности мозга 5,5 мм). Животных поддерживали при нормальной температуре тела (температура тела 36,7±0,5°С, среднее ± δΌ) в ходе хирургической операции путем использования термоодеяла (Нотео!кеттю В1апке! Сойто1 ипк, Нагмиб Аррагайз Ь1ткеб®, ЕбепЪпбде, Кей, иК).

Экспериментальная модель нейровоспаления на приматах

Макак-крабоедов (Масаса Газсюйапз) весом 4-5 кг поселяли в условиях с возможностью регуляции температуры и влажности при световом/темновом цикле 12 ч/12 ч (свет между 7 ч утра и 7 ч вечера) и им предоставляли свободный доступ к пище и воде. Нейровоспаление индуцировали стереотаксической инъекцией хинолиновой кислоты (хинолиновая кислота, Зщта, δΐ Ьошз, МО; растворенная в 0,1 М РВЗ рН 7,2) в полосатое тело приматов (1 точка инъекции хвостатое ядро и 2 точка инъекции путамен) в ходе двух различных хирургических вмешательств, в ходе которых хинолиновую кислоту инъецировали в один день в одно полушарие и во второе полушарие 2 недели или 7 месяцев спустя (фиг. 8 и 9). В ходе каждого хирургического вмешательства животные получали 60 нмоль хинолиновой кислоты, распределенной в три различные точки полосатого тела, точка 5 мкл в хвостатое ядро и две точки 10 мкл в путамен при использовании 10 мкл шприца Гамильтона, присоединенного к игле 26. Стереотактические координаты, определенные согласно стереотактическому атласу З\\аЬо апб Со\уап (1984), представляли собой следующее каудальная точка [АР: +19 мм, МЬ±6 мм, Όν -14 мм от синуса] ; путаминальная точка 1 [АР + 19 мм, МЬ±12 ММ, Όν -17 мм от стереотаксического нуля] ; путаминальная точка 2 [АР: +17 мм, МЬ: ± 13 мм, Όν: -16 мм от синуса]. Эксайтотоксин инъецировали со скоростью 0,1 мкл/мин и инъекционный шприц оставляли на месте на дополнительные 5 мин для того, чтобы избежать обратного потока токсина. В ходе хирургического вмешательства поддерживали нормальной температуру тела примата (ректальная температура 36°С±0,6°С, среднее ± δΌ). После извлечения иглы кожу зашивали и животных оставляли оправляться от анестезии и возвращали в их клетки, когда они были полностью бодрствующими.

Трансгенные мыши

Получение и характеристику мышей, трансгенных по одному РЗ1М146Ь (РЗ1) и двум АРР751ЗРхРЗ1М146Ь (АРРхР31) достигали, как описано ранее (В1апскатб V. е! а1. (2003) Ехр. №ито1 184: 247-263). У таких животных АРР экспрессировался на высоких уровнях во всех кортикальных нейронах под контролем промотора ТНу-1. Человеческий РЗ1 с мутацией М146Ь экспрессировался под контролем промотора НМО-СоА редуктаза. Было обнаружено, что уровень амилоидной нагрузки был в достаточной степени воспроизводимым для заданного возраста. И одиночных РЗ1, и двойных АРРхРЗ1 мыши, обеспечиваемые δаηοί^-Ανеηΐ^5, использовали для РЕТ получения изображения в возрасте 11-12 месяцев и для авторадиографии в возрасте 20-23 месяца.

МтегоРЕТ сканирования и получение данных Крысы и трансгенные мыши

МютоРЕТ получение изображения производили через 7 дней после инъекции АМРА крысам и трансгенным мышам в возрасте 11-12 месяцев. И крысам и мышам вводили для анастезии изофлуран 5% и после чего поддерживали на растворе 2-2,5% изофлурана в смеси 70%/30% ΝΟ₂/Ο₂. Для РЕТ сканирований голову крысы помещали в стереотаксическую рамку собственного изготовления, совместимую с получением данных РЕТ и у крыс поддерживали нормальную температуру (ректальная температура 36,7°С±0,5°С, среднее ± δΌ). Мышей помещали на подложку, оснащенную маской для анастезии, позво- 8 020612 ляющей нагревать поток воздуха, и отслеживали ректальную температуру при использовании Нотео(Нетис В1апке1 Сои1го1 Итк Все протоколы получения изображений проводили при использовании Соисогбе Роси8 РЕТ сканирования при использовании или [^ПС]РК11195, или [¹¹С]-А.

У крыс меченные радиоактивными изотопами соединения и немеченные лиганды инъецировали в хвостовую вену при использовании катетера 24. Меченные радиоактивным изотопом соединения инъецировали в сочетании с началом получения данных РЕТ и немеченые соединения инъецировали через 20 мин после инъекции радиоактивной метки. Данные РЕТ получали в течение 80 мин. У мышей меченные радиоактивным изотопом соединения инъецировали в хвостовую вену при использовании иглы 28 непосредственно перед началом РЕТ сканирования. Данные РЕТ собирали в течение 60 мин.

Приматы

Сеансы получения изображений проводили перед и через различное время после инъекции хинолиновой кислоты (24, 48, 9 дней, 16 дней и 7 месяцев после повреждения). Инъецировали [¹¹С]-А и исследовали кинетику головного мозга при помощи РЕТ в течение 90 мин.

За один час до РЕТ получения изображения животных анастезировали внутримышечной инъекцией смеси кетамина/ксилазина (15/1,5 мг/кг) и интубировали. Затем ставили катетеры в подкожную вену ноги и бедренную артерию для отбора крови. Животных поддерживали в анастезированном состоянии путем внутривенной инъекции пропофола (Όίρτίναη® 1%; 0,05 мг-кг^-1-мин^-1).

Для обеспечения корректного положения животного в аппарате голову животного закрепляли в стереотаксической рамке собственного изготовления. РЕТ сканирования проводили при использовании Роси8 М|сго-Ре1 высокого разрешения (СТ1-§1етеи8, Клю-ХуШе, ТЫ), который собирает данные в 95 последовательных плоскостях одновременно. Для поправки на затухание сначала проводили трансмиссионное сканирование при использовании крутящегося стержня источника ⁶⁸Се. Макак инъецировали внутривенно 192,29±33,67 МБк [¹¹С]-А и проводили сбор данных в течение 90 мин. Весь сбор данных РЕТ проводили в режиме 1Ϊ81 тобе (3Ό режим) и изображения реконструировали при использовании следующего временного интервала: (4 изображения в 25 с) + (4 изображения в 30 с) + (2 изображения в 1 мин) + (5 изображений в 2 мин) + (3 изображения в 5 мин) и (3 изображения в 10 мин), и (1 изображение в 15 мин), в течение общего времени 90 мин для [¹¹С]-А.

Анализ изображений

РЕТ анализ изображений проводили при использовании АМРто УМ™ (СТ1 Соисогбе МюгоууЧепъ' Аиа1у818 Тоок аиб §у81ет ЗеФр/Изадиокбск Тоо1) и Вгашука/АгаЮтк! (Ьйр://Ьга1№ка.ш£б/).

Анализ метаболитов в крови и головном мозге крыс

Неподвергнутым воздействию или оперированным самцам \Ук1аг крыс (вес тела 300-400 г) инъецировали внутривенно в хвостовую вену [¹¹С]-А. Животных умерщвляли через 10, 20 или 30 мин. Отбирали образец крови и изолировали плазму центрифугированием (5 мин, 3000 об./мин). Белки плазмы осаждали из 400 мкл плазмы путем добавления 400 мкл ацетонитрила. После центрифугирования (5 мин, 3000 об./мин.) супернатант вкалывали в колонку ВЭЖХ. У крыс изолировали головной мозг и разделяли полушария. Гомогенизацию ультразвуком проводили в 1 мл ацетонитрила на полушарие. После быстрого центрифугирования отделяли супернатант от центрифугированного осадка и концентрировали при пониженном давлении перед вкалыванием в ВЭЖХ (см. радиохимическую часть для условий ВЭЖХ).

Авторадиография [¹¹С]-А авторадиографию проводили при использовании 20 мкм срезов головного мозга крыс (7-8 дней после повреждения) или мышей (20-23 месяца). Неспецифическое связывание оценивали при использовании избытка или немеченного РК11195, или А. Специфичность РВК по отношению к центральным сайтам связывания бензодиазепина оценивали при использовании избытка немеченного флюмазенила. Срезы инкубировали в течение 20 мин в Трис буфере (ТКЕМА предварительно установленные кристаллы, §1§та®, установленный при рН 7,4 при 4°С, 50 мМ при использовании 120 мМ ЫаС1), затем промывали 2 раза в течение 2 мин холодным буфером с последующим быстрым промыванием холодной дистиллированной водой. Срезы затем помещали в непосредственный контакт с экраном РЬокрЬот1тадег и оставляли на ночь. Авторадиограммы анализировали при использовании программного обеспечения 1тадеОиаШ^т™.

Пример 1. Радиосинтез [^ПС]РК11195

Конечную очистку ВЭЖХ [^ПС] РК11195 проводили при использовании полупрепаративной \Уа1ег5 Зуттейу® С-18 ВЭЖХ колонке (элюент:вода/ацетонитрил/ТФУ : 40/60/0,1 [об.:об.:об.]; скорость потока: 7 мл/мин) и собирали пик, соответствующий радиохимически чистому [^1!С]РК11195 (реальное время: 6,5-7,0 мин). Обычно, начиная с циклотронной партии продукции 55,5 ГБк [^ПС]СО₂, примерно 4,5-5,0 ГБк [^ПС]РК11195 получали в течение 30 мин радиосинтеза (включая ВЭЖХ очистку и составление).

Радиохимическая чистота (определенная аналитической ВЭЖХ на \Уа1ег5 Зуттейу-М® С-18 колонке) составляла более чем 95% и конкретные радиоактивности составляли в диапазоне от 50 до 90 ГБк/мкмоль (в конце радиосинтеза).

Пример 2. Радиосинтез [^ПС]-А (меченного по Ν-метилиндольной функции

Конечную очистку ВЭЖХ [^!1С]-А проводили при использовании полупрепаративной 2отЬах® 8В- 9 020612

С-18 ВЭЖХ колонке (элюент: 0,9% водный ЫаС1/Е1ОН/1М водного фосфатного буфера (рН 2,3): 50/50/0,1 [об.:об.:об.]; скорость потока: 6 мл/мин) и собирали пик, соответствующий радиохимически чистому [¹¹С]-А (реальное время : 8,0-8,5 мин). Обычно, начиная с циклотронной партии продукции 55,5 ГБк [¹¹С]СО₂, примерно 4,5-6,0 ГБк [¹¹С]-А получали в течение 25 мин радиосинтеза (включая ВЭЖХ очистку и составление). Радиохимическая чистота (определенная аналитической ВЭЖХ на \Уа1сг5 БуттейуМ® С-18 колонке) составляла более чем 95% и конкретные радиоактивности составляли в диапазоне от 50 до 90 ГБк/мкмоль (в конце радиосинтеза).

Пример 3. Радиосинтез [¹¹С]-А (меченного по Ν,Ν-диметилацетамидной функции

Конечную очистку ВЭЖХ [¹¹С]-А проводили при использовании полупрепаративной БуттейуРтер® С-18 ВЭЖХ колонке (элюент: вода/ацетонитрил/ТФУ: 50/50/0,1 [об.:об.:об.]; скорость потока: 5 мл/мин) и собирали пик, соответствующий радиохимически чистому [^ПС]-А (реальное время: 8,08,5 мин). Обычно, начиная с циклотронной партии продукции 55,5 ГБк [^ПС]СО₂, примерно 3,5-5,0 ГБк А получали в течение 25 мин радиосинтеза (включая ВЭЖХ очистку и составление).

Радиохимическая чистота (определенная аналитической ВЭЖХ на \Уа1ег5 §уттейу-М® С-18 колонке) составляла более чем 95% и конкретные радиоактивности составляли в диапазоне от 50 до 90 ГБк/мкмоль (в конце радиосинтеза).

Пример 4.

ί) Синтез 4-гидрокси-А.

4-гидрокси-А можно повторно синтезировать согласно УО 00/44384. К_£:0,15 (§Ю₂-ТЬС (СН₂С1₂/МеОН: 95/5 об.:об.)). ^!Н-ЯМР (ДМСО-б6) δ 9,71 (с, 1Н), 7,94 (с, 1Н), 7,86 (д, 1Н, 1: 8,4 Гц), 7,39 (д, 1Н, 1: 8,4 Гц), 7,32 (д, 2Н, 1: 8,8 Гц), 6,84 (д, 2Н, 1: 8,8 Гц), 4,27 (с, 3Н), 4,20 (с, 2Н), 3,16 (с, 3Н), 2,84 (с, 3Н). ¹³С-ЯМР (ДМСО-б6) δ 168,6 [С], 157,1 [С], 154,8 [С], 141,2 [С], 140,9 [С], 133,6 [С], 132,1 [С], 130,9 [С], 127,8 [2.СН], 124,0 [СН], 122,6 [СН], 118,9 [С], 117,3 [С], 115,3 [2.СН], 111,6 [СН], 40,0 [СН₂], 37,4 [СН3], 35,4 [СН3], 32,0 [СН3].

ϊϊ) Радиосинтез [^пС]метокси-А.

Мечение углеродом-11 и конечную ВЭЖХ очистку можно производить, как описано для получения [^ПС]-А (пример 2/пример 3) при использовании 4-гидроксипроизводного А, синтезированного непосредственно выше (пример 4ί).

Пример 5. Общая процедура синтеза (фтор)алкокси-А и тозилоксиалкокси-А.

К суспензии К₂СО₃ (101 мг, 0,7 3 ммоль) в безводном ДМФ (8-12 мл) добавляли 4гидроксипроизводное А (150 мг, 0,36 ммоль, см. УО00/44384) в растворе в безводном ДМФ (2 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, с последующим постепенным добавлением подходящего алкилирующего агента (2 экв.) в растворе в ДМФ (2 мл). Всю смесь затем перемешивали в течение 2 ч при 70°С и перемешивали в течение дополнительного часа при комнатной температуре. Смесь затем гасили добавлением насыщенного водного раствора ΝΉ₄Ο и экстрагировали СН₂С1₂. Органические слои соединяли, промывали рассолом, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали досуха. Осадок очищали хроматографией на колонке с силикагелем (СН₂С1₂/МеОН 98:2 до 95:5 об./об. в качестве элюента) для получения ожидаемого (фтор)алкокси-А в виде белого порошка или белого рыхлого твердого вещества.

Пример 6. Синтез метокси-А.

Общую процедуру, описанную выше (пример 5), использовали с метилиодидом с предоставлением целевого соединения с выходом 40%. К_£: 0,35 (§Ю₂-ТЬС (СН₂С1₂/МеОН: 95/5 об.:об.)). 'Н-ЯМР (СЭС1₃) δ 7,94 (д, 1Н, 1: 8,4 Гц), 7,53 (м, 3Н), 7,33 (дд, 1Н, 1: 8,4, 1,6 Гц), 7,00 (д, 2Н, 1: 8,8 Гц), 4,32 (с, 3Н), 4,18 (с, 2Н), 3,86 (с, 3Н), 3,22 (с, 3Н), 3,00 (с, 3Н). ¹³С \МН (СЭС1₃) δ 168,4 [С], 158,9 [С], 155,3 [С], 141,6 [С],

140.1 [С], 134,6 [С], 133,2 [С], 131,3 [С], 127,3 [2.СН], 123,3 [СН], 123,0 [СН], 119,0 [С], 117,4 [С], 113,9 [2.СН], 110,6 [СН], 55,5 [СН₃] , 39,6 [СН₂], 37,6 [СН₃] , 35,7 [СН₃], 31,6 [СН₃].

Пример 7. Синтез фторэтокси-А.

Общую процедуру, описанную выше (пример 5), использовали с 2-фторэтил-4метилбензолсульфонатом (синтезированным согласно ЭатоШ А. е1 а1. (2008) 1. 1аЬе1. СотрФ Кабюрйатт. 51: 28 6-2 92) с предоставлением целевого соединения с выходом 63%. К_£ : 0,38 (§Ю₂-ТЬС (СН₂С1₂/МеОН: 95/5 об.:об.)). ^!Н-ЯМР (СЭ2С12) δ 7,89 (д, 1Н, 1: 8,8 Гц), 7,58 (д, 1Н, 1: 1,6 Гц), 7,54 (д, 2Н, 1: 9,2 Гц), 7,34 (дд, 1Н, 1: 8,8, 1,6 Гц), 7,03 (д, 2Н, 1: 9,2 Гц), 4,78 (дт, 2Н, 1²Н-Р: 47,6, 1³Н-Н: 4,0 Гц), 4,32 (с, 3Н), 4,27 (дт, 2Н, 1³Н-Р: 28,4 Гц, 1³Н-Н: 4,0 Гц), 4,16 (с, 2Н), 3,19 (с, 3Н), 2,96 (с, 3Н). ¹³С-ЯМР (СЭ₂С1₂) δ

168.2 [С], 157,6 [С], 155,1 [С], 141,3 [С], 140,7 [С], 140,3 [С], 135,4 [С], 132,8 [С], 127,4 [2.СН], 123,2 [СН], 122,6 [СН], 118,9 [С], 117,2 [С], 114,3 [2.СН], 110,7 [СН], 82,0 [д, 1^!С-Р: 169 Гц, СН₂], 67,5 [д, 1²С-Р: 20 Гц, СН₂], 39,5 [СН₂], 37,4 [СН₃], 35,2 [СН₃] , 31,6 [СН₃]. Анализ, вычислено для С₂₃Н₂₂С1РК,О₃.0,15 Н₂О: С, 60,11, Н, 4,89, Ν, 12,19, найдено : С, 60,00, Н, 4,96, Ν, 12,18.

Пример 8. Синтез фторпропокси-А.

Общую процедуру, описанную выше (пример 5), использовали с 3-фторпропил-4метилбензолсульфонатом с предоставлением целевого соединения с выходом 58%. К_£:0,39 (§Ю₂-ТЬС (СН₂С1₂/МеОН: 95/5 об.: об.) ). ^!Н-ЯМР (СЭ₂С1₂) δ 7,89 (д, 1Н, 1: 8,4 Гц), 7,58 (д, 1Н, 1: 1,6 Гц), 7,52 (д,

- 10 020612

2Н, 1: 9,2 Гц), 7,34 (дд, 1Н, 1: 8,4, 1,6 Гц), 7,01 (д, 2Н, 1: 9,2 Гц), 4,67 (дт, 2Н, 1²Н-Г: 46,8 Гц, 1³н._н : 6,0 Гц), 4,31 (с, 3Н), 4,16 (м, 4Н), 3,19 (с, 3Н), 2,96 (с, 3Н), 2,20 (йц⁵, 2Н, 1³Н-Г: 26,0 Гц, 1³н._н: 6,0). ¹³С-ЯМР (СЭ₂С1₂) δ 168,2 [С], 158,0 [С], 155,1 [С], 141,3 [С], 140,3 [С], 135,0 [С], 132,8 [С], 131,3 [С], 127,3 [2.СН],

123.2 [СН], 122,5 [СН], 119,0 [С], 117,2 [С], 114,2 [2.СН], 110,7 [СН], 80,8 [д, .1..: 163 Гц, СН₂], 63,9 [д, 1³С-Г: 6,0 Гц, СН₂], 39,5 [СН₂], 37,4 [СН₃], 35,2 [СН₃], 31,5 [СН₃], 30,3 [СН₂, 1²С-Г: 20,0 Гц].

Пример 9. Синтез фторбутокси-А.

Общую процедуру, описанную выше (пример 5), использовали с 4-фторбутилбромидом с предоставлением целевого соединения с выходом 70%. К_£:0,40 (§Ю₂-ТЬС (СН₂С1₂/МеОН: 95/5 об.:об.)).

Ή-ЯМР (СЭ₂С1₂) δ 7,90 (д, 1Н, 1: 8,8 Гц), 7,58 (д, 1Н, 1: 1,6 Гц), 7,51 (д, 2Н, 1: 9,2 Гц), 7,34 (дд, 1Н, 1: 8,8, 1,6 Гц), 6,99 (д, 2Н, 1: 9,2 Гц), 4,54 (дт, 2Н, 1²Н-Г: 47,2 Гц, 1³Н-Н : 5,6 Гц), 4,33 (с, 3Н), 4,16 (с, 2Н), 4,08 (т, 2Н, 1: 5,6 Гц), 3,19 (с, 3Н), 2,96 (с, 3Н), 1,97-1,85 (м, 4Н). ¹³С-ЯМР (СЭ₂С1₂) δ 168,2 [С], 158,2 [С], 155,1 [С], 141,3 [С], 140,2 [С], 134,9 [С], 132,8 [С], 131,4 [С], 127,3 [2.СН], 123,2 [СН], 122,5 [СН], 119,0 [С],

117.2 [С], 114,2 [2.СН], 110,7 [СН], 83,8 [д, Й¹С-Р:163 Гц, СН₂], 67,6 [СН₂], 39,5 [СН₂], 37,4 [СН₃], 35,2 [СН₃], 31,5 [СН₃], 27,1 [СН₂, 1%: 20,0 Гц], 25,1 [СН₂, К.: 5,0 Гц].

Пример 10. Синтез 2-(фторэтокси)этокси-А.

Общую процедуру, описанную выше (пример 5), использовали с 2-(2-фторэтокси)этил-4метилбензолсульфонатом с предоставлением целевого соединения с выходом 69%. К_£: 0,45 (§Ю₂-ТЬС (СН2С12/ацетон: 80/20 об.:об.)). Ή-ЯМР (СЭ₂С1₂) δ 7,91 (д, 1Н, 1: 8,4 Гц), 7,60 (д, 1Н, 1: 1,6 Гц), 7,54 (д, 2Н, 1: 8,8 Гц), 7,36 (дд, 1Н, 1: 8,4, 1,6 Гц), 7,04 (д, 2Н, 1: 8,8 Гц), 4,61 (дт, 2Н, 1²Н-Г: 48,0 Гц, 1³Н-Н : 4,0 Гц), 4,34 (с, 3Н), 4,22 (т, 2Н, 1: 4,8 Гц), 4,17 (с, 2Н), 3,91 (т, 2Н, 1: 4,8 Гц), 3,83 (дт, 2Н, 1³Н-Г: 30,0, 1³Н-Н: 4,0 Гц), 3,21 (с, 3Н), 2,98 (с, 3Н). ¹³С-ЯМР (СЭ₂С1₂) δ 168,2 [С], 157,9 [С], 155,1 [С], 141,3 [С], 140,3 [С], 135,1 [С], 132,8 [С], 131,4 [С], 127,3 [2.СН], 123,2 [СН], 122,5 [СН], 119,0 [С], 117.2 [С], 114,3 [2.СН], 110,7 [СН],

83.2 [д, 1¹С-Г: 167 Гц, СН₂], 70,4 [д, 1²С-Г: 19 Гц, СН₂], 69,7 [СН₂], 67,8 [СН₂], 39,5 [СН₂], 37,4 [СН₃], 35,2 [СН₃], 31,6 [СН₃].

Пример 11. Синтез 2-(2-(фторэтокси)этокси)этокси-А.

Общую процедуру, описанную выше (пример 5), использовали с 2-(2-(2-фторэтокси)этокси)этил-4метилбензолсульфонатом с предоставлением целевого соединения с выходом 63%. К_£:0,32 (§Ю₂-ТЬС (СН₂С1₂/ацетон: 80/20 об.:об.)). Ή-ЯМР (СЭ₂С1₂) δ 7,91 (д, 1Н, 1: 8,8 Гц), 7,60 (д, 1Н, 1: 1,6 Гц), 7,54 (д, 2Н, 1: 8,8 Гц), 7,36 (дд, 1Н, 1: 8,8, 1,6 Гц), 7,04 (д, 2Н, 1: 8,8 Гц), 4,57 (дт, 2Н, 1²Н-Г: 47,6 Гц, 1³Н-Н: 4,4 Гц), 4,33 (с, 3Н), 4,21 (т, 2Н, 1: 4,4 Гц), 4,17 (с, 2Н), 3,88 (т, 2Н, 1: 4,8 Гц), 3,80-3,65 (м, 6Н), 3,21 (с, 3Н), 2,98 (с, 3Н). ¹³С-ЯМР (СЭ₂С1₂) δ 168,2 [С], 158,0 [С], 155.1 [С], 141,3 [С], 140,3 [С], 135,1 [С], 132,8 [С], 131,4 [С],

127.3 [2.СН], 123,2 [СН], 122,5 [СН], 119,0 [С], 117,2 [С], 114,3 [2.СН], 110,7 [СН], 83,2 [д, 1¹С-Г: 167 Гц, СН₂], 70,7 [СН₂], 70,6 [СН₂], 70,3 [д, 1²С-Г: 19 Гц, СН₂], 69,6 [СН₂], 67,8 [СН₂], 39,5 [СН₂], 37,4 [СН₃], 35,2 [СН₃], 31,6 [СН₃].

Пример 12. Синтез тозилэтокси-А.

Общую процедуру, описанную выше(пример 5), использовали с этан-1,2-диил бис(4метилбензолсульфонатом) (синтезированным согласно ЭатоЩ А. е1 а1. (2008) 1. 1аЪе1. Сотрйк Кайюрйагт. 51: 286-292) с предоставлением целевого соединения с выходом 45%. К_£: 0,72 (§Ю₂-ТЬС (СН₂С1₂/МеОН: 95/5 об.: об.) ). Ή-ЯМР (СЭ₂С1₂) δ 7,89 (д, 1Н, 1: 8,8 Гц), 7,84 (д, 2Н, 1: 8,4 Гц), 7,60 (д, 1Н, 1: 1,6 Гц), 7,53 (д, 2Н, 1: 8,8 Гц), 7,41 (д, 2Н, 1: 8,4 Гц), 7,36 (дд, 1Н, 1: 8,8, 1,6 Гц), 6,91 (д, 2Н, 1: 8,8 Гц), 4,40 (т, 2Н, 1: 4,4 Гц), 4,32 (с, 3Н), 4,22 (т, 2Н, 1: 4,4 Гц), 4,17 (с, 2Н), 3,21 (с, 3Н), 2,98 (с, 3Н), 2,48 (с, 3Н). ¹³С-ЯМР (СЭ₂С1₂) δ 168,1 [С], 157,2 [С], 155,0 [С], 145,2 [С], 141,2 [С], 140,3 [С], 135,5 [С], 132,8 [С], 132,7 [С], 131,3 [С], 129,9 [2.СН], 127,9 [2.СН], 127,4 [2.СН], 123,2 [СН], 122,6 [СН], 118,9 [С], 117.2 [С],

114.4 [2,СН], 110,7 [СН], 68,3 [СН₂], 65,8 [СН₂], 39,5 [СН₂], 37,4 [СН₃], 35,2 [СН₃], 31,6 [СН₃], 21,3 [СН₃].

Тозилоксипропокси-А, тозилоксибутокси-А, 2-(тозилоксиэтокси)этокси-А и 2-(2-(тозилоксиэтокси)этокси)этокси-А в качестве предшественников для мечения фтором-18 описанных выше фторалкокси-А производных могут быть получены, как описано непосредственно выше при использовании подходящего алкилирующего реакционного агента.

Пример 13.

Радиосинтез [¹⁸Г]фторэтокси-А: конечную ВЭЖХ очистку [¹⁸Р]фторэтокси-А осуществляли при использовании полупрепаративной §уттейу® С-18 ВЭЖХ колонке (элюент: вода/ацетонитрил/ТФУ: 60/40/0,1 [об.:об.:об.]; скорость потока: 5 мл/мин) и собирали пик, соответствующий радиохимически чистому [¹⁸Г]фторэтокси-А (реальное время : 11,0-13,0 мин). Начиная с циклотронной партии продукции 37 ГБк [¹⁸Г]фторид, примерно 3,7 ГБк [¹⁸Г]фторэтокси-А получали в течение 90 мин радиосинтеза (включая ВЭЖХ очистку и составление).

Радиохимическая чистота (определенная аналитической ВЭЖХ на №а!ег8 §уттейу-М® С-18 колонке) составляла более чем 95% и конкретные радиоактивности составляли более чем 50 ГБк/мкмоль (в конце радиосинтеза).

[ Г]фторпропокси-А, [ Г]фторбутокси-А, 2-([ Г]фторэтокси)этокси-А и 2-(2-([ Г]фторэтокси) этокси)этокси-А могут быть получены как описано непосредственно выше из соответствующих тозилалкокси-А производных (пример 12) в качестве предшественников для фтор-18 мечения.

- 11 020612

Пример 14.

Поглощение [^ПС]-А представляет собой значительно более высокое в поврежденном полосатом теле крыс, инъецированных АМРА (область, в которой индуцируется экспрессия РВК) по сравнению с интактным контралатеральным полосатым телом, которое, как ожидается, не экспрессирует или экспрессирует незначительные количества РВК (фиг. 1). Поглощение [^ПС]-Л также представляет собой значительно более высокое по сравнению с поглощением, наблюдаемым с лигандом сравнения РВК РЕТ, [^ПС]РК11195 в поврежденном полосатом теле (фиг. 1). Отношение поглощения в поврежденном по сравнению с интактным полосатым телом также представляет собой значительно более высокое для [^ПС]-Л по сравнению с |С|РК11195 (фиг. 2). Связывающий потенциал и К1 представляют собой значительно более высокие для [^ПС]-Л по сравнению с [^ПС]РК11195 (ВР=1,65±0,36 по сравнению с 0,66±0,15; К1 = 1,26±0,08 по сравнению с 1,10±0,05).

Оба немеченых РК11195 (фиг. 3) и А (фиг. 4) (1 мг/кг внутривенно, через 20 мин после инъекции [^ПС]-Л) значительно понижали поглощение мозгом [^ПС]-А в поврежденном полосатом теле. Оба немеченых компонента индуцируют слабое повышение связывания [^ПС]-Л в контралатеральной стороне, что, по-видимому, обусловлено увеличением концентрации в крови [^!1С]-А из-за высвобождения [^ПС]-А из экстра-церебральных связывающих сайтов.

Анализ метаболитов, присутствующих в крови и плазме крыс через 10 и 20 мин после инъекции [¹¹С]-А, и метаболитов, присутствующих в мозге крыс через 10, 20 и 30 мин после инъекции [^ПС]-А, в значительной степени определял только исключительно исходное соединение (фиг. 10).

Дополнительно, авторадиография связывания [¹³С]-А в срезах мозга отражала результаты полученных изображений с высоким отношением ипсилатеральным к контралатеральному (3,8), которое нивелировалось избытком немеченых РК11195 или А (фиг. 5). Небольшое, но значимое уменьшение [^ПС]-А связывания наблюдали с немеченым флумазенилом, антагонистом бензодиазепина (фиг. 5).

Пример 15.

У обоих АРРхР81 и диком типе Р81 трансгенных мышей поглощение [^ПС]-А в целом головном мозге (исключая мозжечок) представляет собой боле высокое по сравнению с поглощением [^!1С]РК11195 (фиг. 6). Однако поглощение и [^ПС]-А, и [^ПС] РК11195 не представляло собой значительно более высокое у АРРхР81 по сравнению с диким типом Р81. Напротив, специфическое [³Н]-А связывание представляет собой примерно в 2 раза выше в срезах целого мозга у АРРхР81 мышей по сравнению с диким типом мышей Р81 (фиг. 7).

Указанные данные демонстрируют, что [¹³С]-А может специфическим образом детектировать увеличенное связывание РВК и воспаление в острой модели нейровоспаления крыс и мышиной модели болезни Альцгеймера. Получение изображение РЕТ ίη νίνο подтверждает, что [¹³С]-А может быть использовано для получения изображений повышенной экспрессии РВК рецептора и нейровоспаления у грызунов. Более того, связывание РВК рецептора, наблюдаемое при получении изображений РЕТ с [¹³С]-А представляет собой большее, чем наблюдается с лигандом сравнения рецептора РЕТ [^ПС]РК11195.

Пример 16.

Поглощение [¹³С]-А представляет собой значительно более высокое в поврежденном правом полосатом теле у приматов, инъецированных хинолиновой кислотой по сравнению с поглощением [¹³С]-А В контролатеральном неинъецированном полосатом теле и двух неинъецированных контрольных областях головного мозга (мозжечке, префронтальной коре головного мозга) через 24 ч после инъекции эксайтотоксина (фиг. 8). Поглощение [¹³С]-А в контралатеральном неинъецированном полосатом теле оставалось стабильным и на том же самом уровне, что и поглощение [³¹С]-А в областях головного мозга у неинъецированных приматов (фиг. 8). Увеличение поглощения [^ПС]-А может быть все еще визуализировано через 48 ч после инъекции эксайтотоксина (в левом полушарии), тогда как поглощение [^ПС]-А через 7 месяцев после инъекции эксайтотоксина (кинетики в правом полосатом теле поврежденном 7 месяцев ранее) не показал исходных уровней. Более подробная характеристика ранней фазы нейровоспаления демонстрирует, что увеличение поглощения [³¹С]-А может быть визуализировано в диапазоне от 24 ч до 16 дней (фиг. 9). Системное введение большого избытка немеченого РК11195 через 30 мин после введения радиометки приводит к специфическому замещению [³¹С]-А связывания в поврежденном полосатом теле на незаметные изменения, наблюдаемые в неповрежденных контрольных областях головного мозга (фиг. 9).

Применения

Настоящее изобретение можно применять в качестве инструмента диагностики и в качестве инструмента для прослеживания эволюции и прогресса патологий, при которых изменяются уровни РВК и при которых присутствует воспаление. Изобретение можно также применять для изучения занятости рецепторов и оценки эффективности терапевтического лечения при патологических состояниях и в качестве трансляционного биомаркера для исследования от моделей на животных до человека.

Claims (26)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение меченного радиоактивным изотопом 7-хлор-Н,Ы,5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5- 12 020612 дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамида в качестве биомаркера для определения уровней РВК у субъекта, связанных с нормальным и патологическим состояниями, где радиоактивная метка выбрана из углерода-11, радиогалогенов и радиометаллов.
2. 2. Применение по п.1, где 7-хлор-Ы,^5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5Ь]индол-1-ацетамид представляет собой меченный радиоактивной меткой углеродом-11.
3. 3. Применение по пп.1 и 2, где 7-хлор-Ы^,5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Нпиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамид представляет собой меченный радиоактивной меткой углеродом-11 по углероду метильной группы, расположенной в 5-положении индольного ядра.
4. 4. Применение по п.1, где 7-хлор-Ы,^5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5Ь]индол-1-ацетамид представляет собой меченный радиоактивной меткой радиогалогенами.
5. 5. Применение по п.1 или 4, где 7-хлор-Ы,^5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Нпиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамид представляет собой меченный радиоактивной меткой радиогалогеном фтор-18.
6. 6. Применение по п.1 или 5, где 7-хлор-Ы,^5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Нпиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамид представляет собой меченный радиоактивной меткой фтор-18 в параположении 3-фенильного кольца.
7. 7. Применение по пп.1-6, где патологические состояния, относящиеся к изменению уровней РВК, выбраны из повреждения головного мозга, инфекций головного мозга и неврологических заболеваний.
8. 8. Применение по пп.1-6, где патологические состояния, относящиеся к изменению уровней РВК, выбраны из психиатрических заболеваний.
9. 9. Применение по пп.1-6, где патологические состояния, относящиеся к изменению уровней РВК, выбраны из пролиферативных заболеваний.
10. 10. Применение по пп.1-6, где патологические состояния, относящиеся к изменению уровней РВК, выбраны из периферических воспалительных процессов.
11. 11. Применение по пп.1-6, где определение уровней РВК производят при исследовании заполнения.
12. 12. Применение по пп.1-7, где определение уровней РВК производят для оценки эффективности терапевтического лечения.
13. 13. Способ определения уровней РВК, связанных с нормальными состояниями и изменениями в уровнях РВК, связанными с патологическими состояниями, где определение производят при использовании меченной радиоактивным изотопом формы 7-хлор-Ы^,5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Нпиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамида, где радиоактивная метка выбрана из углерода-11, радиогалогенов и радиометаллов.
14. 14. Способ по п.13, где меченный радиоактивной меткой 7-хлор-Ы,^5-триметил-4-оксо-3-фенил3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамид содержит углерод-11.
15. 15. Способ по пп.13, 14, где 7-хлор-Ы,^5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5Ь]индол-1-ацетамид представляет собой меченный радиоактивной меткой углеродом-11 по углероду метильной группы, расположенной в 5-положении индольного ядра.
16. 16. Способ по п.13, где 7-хлор-Ы,^5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5Ь]индол-1-ацетамид представляет собой меченный радиоактивной меткой фтором-18.
17. 17. Способ по п.13, где 7-хлор-Ы,^5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5Ь]индол-1-ацетамид представляет собой меченный радиоактивной меткой фтором-18 в пара-положении 3-фенильного кольца.
18. 18. Способ по пп.13-17, где патологические состояния, относящиеся к изменению уровней РВК, выбраны из повреждения головного мозга, инфекций головного мозга и неврологических заболеваний.
19. 19. Способ по пп.13-17, где патологические состояния, относящиеся к изменению уровней РВК, выбраны из психиатрических заболеваний.
20. 20. Способ по пп.13-17, где патологические состояния, относящиеся к изменению уровней РВК, выбраны из пролиферативных заболеваний.
21. 21. Способ по пп.13-17, где патологические состояния, относящиеся к изменению уровней РВК, выбраны из периферических воспалительных процессов.
22. 22. Способ по пп.13-17, где определение уровней РВК производят при исследовании заполнения.
23. 23. Способ по пп.13-17, где определение уровней РВК производят для оценки эффективности терапевтического лечения.
24. 24. Способ по пп.13-17, где определение уровней РВК и воспаления проводят при помощи получения изображений (РЕТ) позитрон-эмиссионной томографии или получения изображений (БРЕСТ) компьютерной томографии одиночных фотонов.
25. 25. Способ по пп.13-17, где определение уровней РВК и воспаления производят при помощи получения изображений (РЕТ) позитрон-эмиссионной томографии.
26. 26. Диагностический набор для определения уровней РВК, связанных с нормальными состояниями и изменениями в уровнях РВК, связанными с патологическими состояниями, включающий форму 7хлор-Ы,^5-триметил-4-оксо-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-пиридазин[4,5-Ь]индол-1-ацетамида, меченную радиоактивным изотопом.