EA016397B1 - Генетические варианты гена tcf7l2 как диагностические маркеры риска возникновения сахарного диабета ii типа - Google Patents

Генетические варианты гена tcf7l2 как диагностические маркеры риска возникновения сахарного диабета ii типа Download PDF

Info

Publication number
EA016397B1
EA016397B1 EA200800087A EA200800087A EA016397B1 EA 016397 B1 EA016397 B1 EA 016397B1 EA 200800087 A EA200800087 A EA 200800087A EA 200800087 A EA200800087 A EA 200800087A EA 016397 B1 EA016397 B1 EA 016397B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
diabetes
allele
type
marker
nucleic acid
Prior art date
Application number
EA200800087A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200800087A1 (ru
Inventor
Струан Ф. А. Грант
Original Assignee
Декоуд Дженетикс Ехф.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Декоуд Дженетикс Ехф. filed Critical Декоуд Дженетикс Ехф.
Publication of EA200800087A1 publication Critical patent/EA200800087A1/ru
Publication of EA016397B1 publication Critical patent/EA016397B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

С помощью ассоциативного анализа продемонстрировано, что полиморфизм гена TCF7L2 определяет восприимчивость к диабету II типа. Приведены способы диагностики восприимчивости к диабету, пониженной восприимчивости к диабету и защиты против диабета, а также способы лечения диабета II типа.

Description

Уровень техники изобретения
Сахарный диабет - заболевание, связанное с нарушением метаболизма, при котором снижается утилизация углеводов и усиливается утилизация липидов и белков, возникает вследствие абсолютного или относительного дефицита инсулина. В более тяжелых случаях диабет характеризуется хронической гипергликемией, глюкозурией, потерей воды и электролитов, кетоацидозом и комой. Долговременные осложнения включают развитие нейропатии, ретинопатии, нефропатии, генерализованных дегенеративных изменений в крупных и малых кровеносных сосудах и повышенную чувствительность к инфекциям. Наиболее общей формой диабета является диабет II типа, независимый от инсулина диабет, который характеризуется гипергликемией, обусловленной нарушенной секреций инсулина и резистентностью к инсулину тканей-мишеней. В развитие заболевания вносят вклад генетические факторы и влияние окружающей среды. Например, в развитии заболевания важную роль играет тучность. Диабет II типа часто является мягкой формой постепенного начала сахарного диабета.
Последствия диабета II типа для здоровья являются огромными. В 1995 г. в мире было 135 миллионов людей с диабетом. Подсчитано, что в 2025 г. около 300 миллионов людей будут больны диабетом (Κίη§ Н., е! а1., Э|аЬе1е5 саге, 21(9): 1414-1431 (1998)). Распространенность диабета II типа в популяции взрослых жителей Исландии составляет 2,5% (УПЬегд^оп, 8., е! а1., Э|аЬе1. Меб., 14(6): 491-498 (1997)), что включает приблизительно 5000 людей в возрасте выше 34 лет, которые больны этим заболеванием. Высокая распространенность заболевания и увеличивающаяся популяция больных свидетельствуют о неудовлетворенной потребности в определении генетических факторов, участвующих в развитии диабета II типа, для более точного определения ассоциированных факторов риска. Нужны также терапевтические агенты для предотвращения развития диабета II типа.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к способам диагностики повышенной восприимчивости к диабету II типа, а также к способам диагностики пониженной восприимчивости к диабету II типа или диагностики действия защиты против диабета II типа путем выявления определенных маркеров или гаплотипов, относящихся к гену ТСР7Й2 (фактор транскрипции 2, подобный 7 (специфический по отношению к НМС-боксу Т-клеток), предварительно названный как ТСР4 ген (транскрипционный фактор 4 Т-клеток). Способы включают определение генетического маркера, ассоциированного с блоком ЬИ (нарушение равновесия сцепления) экзона 4 гена ТСР7Ь2.
В первом аспекте изобретение относится к способу диагностики восприимчивости индивидуума к диабету II типа, включающему анализ образца нуклеиновой кислоты, полученного из индивидуума для определения признака или гаплотипа, ассоциированного с блоком ЬИ экзона 4 гена ТСР7Ь2, где присутствие признака или гаплотипа является индикатором восприимчивости к диабету II типа. В одном воплощении признак или гаплотип включает по меньшей мере один признак, выбранный из группы признаков, перечисленных в табл. 6. В другом воплощении признак или гаплотип является маркером.
В одном предпочтительном воплощении маркер или гаплотип является индикатором повышенной восприимчивости к диабету II типа. В одном воплощении повышенная восприимчивость характеризуется относительным риском по меньшей мере 1,2, включая относительный риск по меньшей мере 1,3 и относительный риск по меньшей мере 1,4. В одном воплощении маркер выбирается из группы, состоящей из ΌΟ108478, Т812255372, Щ7895340, Щ11196205, Щ7901695, Щ7903146, Щ12243326 и Щ4506565, где присутствие не нуль-0 аллеля (т.е. -4, 4, 8, 12, 16, 20 или другого не-0 аллеля) в ΌΟ108478, Т аллеля в Т812255372; А аллеля в га7895340; С аллеля в гз 11196205; С аллеля в т§7901695; Т аллеля в т§7903146; С аллеля в т§4506565 или Т аллеля в т§4506565 является индикатором повышенной восприимчивости к диабету II типа. В предпочтительном воплощении маркер выбирается из группы, состоящей из ΌΟ108478 и щ7903146, и где присутствие не ноль-0 аллеля является маркером повышенной восприимчивости к диабету II типа. Еще в одном предпочтительном воплощении маркером является га7903146, где присутствие Т аллеля в т§7903146 является индикатором восприимчивости к диабету II типа.
В другом предпочтительном воплощении маркер или гаплотип является индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа. Пониженная восприимчивость в одном воплощении характеризует относительный риск менее чем 0,7. В одном воплощении маркер выбирается из группы, состоящей из ΌΟ108478, Т812255372, Щ7895340, Щ11196205, Щ7901695, Щ7903146, Щ12243326 и Щ4506565, где присутствие 0 аллеля в ΌΟ108478, С аллеля в 8ΝΡ Щ12255372, С аллеля в т§7895340; Т аллеля в т§7901695; С аллеля в т§7903146; Т аллеля в Щ12243326 или А аллеля в т§4506565 является индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа. В предпочтительном воплощении маркером является ИС108478, где присутствие 0 аллеля в ИС108478 является индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа. В другом предпочтительном воплощении маркером является га7903146, где присутствие С аллеля в Т87903146 является индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к набору реактивов для анализа образца из индивидуума с целью определения восприимчивости к диабету II типа, где набор реактивов включает один или более реагентов для обнаружения одного или более маркеров, ассоциированных с ЬИ экзона 4, блок ТСЕ7Ь2. В одном воплощении один или более реагентов включает по меньшей мере одну прилегающую нуклеотидную последовательность, которая полностью комплементарна области, включающей
- 1 016397 по меньшей мере один маркер, ассоциированный с Б-Ω экзона 4, блок ТСР7Б2. В одном воплощении один маркер выбран из группы, состоящей из ΩΟ108478, гк12255372, гк7895340, г§11196205, гк7901695, Г57903146, Г512243326 и гк4506565. В предпочтительном воплощении маркер является С аллелем в Г57903146.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу анализа индивидуума для определения вероятности ответа на терапевтический агент ТСР7Б2, включающему определение маркера, ассоциированного с ΩΩ экзона 4, блок ТСР7Б2, где присутствие маркера является индикатором вероятности позитивного ответа на терапевтический агент ТСР7Б2. В одном воплощении маркер выбирается из группы, состоящей из ΩΟ108478, ГК12255372, гк7895340, гз11196205, гк7901695, гк7903146, Г512243326 и гк4506565. В другом воплощении маркер является маркером ΩΟ108478 или маркером гк7903146, где присутствие не-0 аллеля в ΩΟ108478 или Т аллеля в гк7903146 является индикатором вероятности позитивного ответа на терапевтический агент ТСР7Б2.
Другой аспект изобретения относится к применению терапевтического агента ТСР7Б2 для производства медикамента для лечения диабета II типа. В одном воплощении терапевтический агент ТСР7Б2 является агентом, который изменяет активность сигнального пути \Уп1 или кадгеринового сигнального пути. В другом воплощении терапевтический агент ТСР7Б2 является агентом, выбранным из группы, указанной выше в таблице агентов.
Краткое описание чертежей
Вышеупомянутые и другие объекты, особенности и преимущества изобретения будут очевидны из следующего более детального описания предпочтительных воплощений изобретения.
Фигура описывает интересующую область ТСР7Б2 по отношению к нарушению равновесия сцепления (ΩΩ) 8ΝΡ в проекте НарМар, версия 16. Участки гена в 215,9 т.п.о. семи ΩΩ блоков, которые указаны схематично черными стрелками (на основе данных NСΒI РсГ8сс.|). показывают направление транскрипции; указаны экзоны с выделенным экзоном 4. ΩΟ108478 расположен в 114,46 м.п.о. на хромосоме 10 (Νί.'ΒΙ конструкция 34) в интроне 3 гена ТСР7Б2, с 74,9 т.п.о. блоком, который включает часть интрона 3, весь экзон 4 и часть интрона 4 (здесь называется блок экзона 4 ТСР7Б2). Маркеры 8ΝΡ размещены равноудалено, а не в соответствии с их физическим расположением. На фигуре показаны два параметра ΩΩ: Ω1 (верхняя левая часть фигуры) и г2 (нижняя правая часть).
Осуществление изобретения
Описание предпочтительных воплощений изобретения даны ниже.
Локусы, ассоциированные с диабетом II типа.
Диабет II типа характеризуется гипергликемией, которая может возникать благодаря таким механизмам, как пониженная секреция инсулина, резистентность к инсулину периферических тканей и повышенная продукция глюкозы печенью. Большинство пациентов с диабетом II типа страдают от серьезных осложнений хронической гипергликемии, включая нефропатию, нейропатию, ретинопатию и ускоренное развитие сердечно-сосудистых заболеваний. Распространенность диабета II типа в мире в настоящее время составляет 6%, но предсказывается увеличение этого параметра в течение следующего десятилетия (1). Это увеличение распространенности диабета II типа является следствием увеличения возраста популяции и роста тучности.
Имеются свидетельства о вкладе генетического компонента в риск возникновения диабета II типа, включая влияние различий между группами различных рас (2, 3), более высокий уровень согласованности между моногомозиготными, чем между дизиготными близнецами (4, 5), и относительный риск появления диабета II типа у братьев и сестер (λ8) в европейской популяции, составляющий приблизительно 3,5 (6).
Таким образом, для поиска генов, ассоциированных с диабетом II типа, было применено два подхода. Для выявления ассоциации с заболеванием в пределах генов-кандидатов тестировали единичный нуклеотидный полиморфизм (8ΝΡ), и в основном он не дал или дал лишь умеренный риск диабета II типа, о котором наиболее широко сообщалось, что он характеризуется защитным Рго-12-А1а полиморфизмом в активированного пролифератором пероксисом рецептором гамма гена (ΡΡΑΒΟ2) (7), и риск полиморфизма в калиевом канале, регулируемом изнутри, подсемейство I, член 11 гена (КЖБД) (8).
Сканирование связей во множестве геномов семейств с общей формой диабета II типа выявило несколько локусов, и первично международный исследовательский консорциум сфокусировался на хромосомах 1, 12 и 20, наблюдаемых во многих популяциях (6). Гены этих локусов до этого не рассматривались. Однако у мексиканских американцев ген кальпаина 10 (ί.ΆΡΝ10) был изолирован из локуса хромосомы 2с.|; это отражало единственный ген для общей формы диабета II, идентифицированный до настоящего времени благодаря позиционному клонированию (9). Редкая Менделева форма диабета II, а именно диабет зрелого возраста у молодых (ΜΟΩΥ), дала при позиционном клонировании семь генов (6).
Предварительно авторы изобретения сообщали о существенной связи диабета II типа с хромосомой 5с.| для исландской популяции для множества геномов (10); в том же исследовании также сообщали о предположительном доказательстве связи с 10ц и 12ц. Связь с 10д областью наблюдалась также для мексиканских американцев (11).
- 2 016397
Ассоциация диабета II типа с геном белка 2. подобного транскрипционному фактору 7 (ТСР7Б2).
Настоящее изобретение относится к идентификации ассоциированного с диабетом II типа блока ('ΈΌ блок экзона 4 ТСР7Б2) в пределах гена, кодирующего транскрипционный фактор 4 (ТСР4 - официальный символ гена ТСБ7Б2). Было обнаружено, что с диабетом II типа ассоциировано несколько маркеров в пределах БН экзона 4 блока ТСР7Б2, включая микросателлитные маркеры Ό6108478 и 8ΝΡ Г87903146 и Г812255372. Оригинальные наблюдения, впервые сделанные в исландской популяции (Р=1,3х10-9; относительный риск=1,45; риск, отнесенный к популяции=22,7%), были впоследствии подтверждены на датской популяции больных диабетом II типа и на популяции белых, больных диабетом, в Соединенных Штатах Америки. ΌΟ108478 находится в интроне 3 гена ТСР7Б2 в 10д25.2 и в пределах хорошо определенного БН блока размером 74,9 т.п.о., который включает часть интрона 3, весь экзон 4 и часть интрона 4. Продукт гена ТСР7Б2 представляет собой высокомобильную группу (НМО) включающего бокс транскрипционного фактора, который играет важную роль в \Уп1 сигнальном пути, известном также как сигнальный путь АРС3/в-катенин/ТСР путь. ТСР7Б2 опосредует специфическую для клеток регуляцию экспрессии гена проглюкагона (ключевого игрока в гомеостазе глюкозы в крови) через участника \¥п1 сигнального каскада β-катенина и киназу-3-бета гликогенсинтазы (12). Кроме того, сигнальный путь \Уп1 поддерживает преадипоциты в недифференцированном состоянии за счет ингибирования белка альфа (С/ЕВР-альфа), связывающегося с энхансером ССАААТ адипогенных факторов транскрипции и активированного пролифератором пероксисом рецептора гамма (РРАК-гамма) (13). Когда \¥п1 сигнальный путь в преадипоцитах предотвращается за счет суперэкспрессии доминантно-негативного ТСР7Б2, эти клетки дифференцируют в адипоциты (13). Кроме того, сообщалось, что сигнальный каскад \νηΙ/βкатенин направлен на РРАК-гамма активность путем физического взаимодействия с β-катенином и ТСР7Б2 в клетках рака кишечника (14). Мультифункциональный белок β-катенин важен также для обеспечения клеточной адгезии через его связывание с кадгеринами (15).
В результате этого открытия в настоящее время доступны способы диагностики восприимчивости к диабету II типа, а также диагностики пониженной восприимчивости к диабету II типа и/или защиты против диабета II типа. В предпочтительных воплощениях изобретения диагностический анализ был применен для идентификации присутствия специфических аллелей, включая 0 аллель в маркере ΌΟ108478 (ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа, который является защитным против диабета II типа); не-0 аллеля (т.е. -4, 4, 8, 12, 16 или 20 или другой аллель) в маркере ΌΟ108478 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа); О аллель в 8ΝΓ Щ12255372 (ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа и являющийся аллелем, защищающим против диабета II типа): Т аллель в 8ΝΓ Щ12255372 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа); О аллель в Г87895340 (ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа и являющийся аллелем, защищающим против диабета II типа); А аллель в 8ΝΓ щ7895340 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа); О аллель в 8ΝΓ Щ11196205 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа); О аллель в г§7895340 (ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа и являющийся аллелем, защищающим против диабета II типа); С аллель в 8ΝΓ г§1196205 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа); Т аллель в г§7901695 (ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа и являющийся аллелем, защищающим против диабета II типа); С аллель в 8NР Г87901695 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа); С аллель в 8ΝΓ Г87903146 (ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа и являющийся аллелем, защищающим против диабета II типа); Т аллель в 8NР г§7903146 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа); С аллель в 8NР Щ12243326 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа) и Т аллель в 8ΝΓ г§4506565 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа). В дополнительных воплощениях изобретения для диагностики восприимчивости к диабету II типа или для идентификации аллеля, который защищает от диабета II типа, могут применяться другие маркеры или 8NР, идентифицированные с применением способов, описанных здесь. Диагностические анализы, представленные ниже, могут применяться для идентификации присутствия или отсутствия этих специфических аллелей.
Диагностические анализы.
Нуклеиновые кислоты, зонды, праймеры и антитела, такие как описанные здесь, могут применяться в различных способах диагностики восприимчивости к диабету II типа, а также в наборах реактивов (например, полезных при диагностике восприимчивости к диабету II типа). Подобным образом, нуклеиновые кислоты, зонды, праймеры и антитела, описанные здесь, могут применяться в способах диагностики пониженной восприимчивости к диабету II типа, а также в способах диагностики защиты против диабета II типа, а также в наборах реактивов. В одном аспекте набор реактивов включает праймеры, которые могут применяться для амплификации интересующих маркеров.
В одном аспекте изобретения диагноз восприимчивости к диабету типа II ставится путем детектирования полиморфизма нуклеиновой кислоты в ТСР7Б2, как описано здесь (например, аллелей в маркере ОО108478 или в 8ΝΗ Щ12255372, Щ7895340, Щ11196205, Щ7901695, Щ7903146, Щ12243326, Щ4506565). Полиморфизм может быть изменением в нуклеиновой кислоте ТСР7Б2, таким как вставка или деления единственного нуклеотида или более чем одного нуклеотида, приводящая к сдвигу рамки считывания;
- 3 016397 изменением по меньшей мере одного нуклеотида, приводящим к изменению кодируемой аминокислоты; изменением по меньшей мере одного нуклеотида, приводящим к генерации преждевременного стопкодона; делецией нескольких нуклеотидов, приводящей к делеции одной или более аминокислот, кодируемых нуклеотидами; вставкой одного или нескольких нуклеотидов, такой как неадекватная рекомбинация или конверсия гена, приводящая к прерыванию кодирующей последовательности гена; дупликацией всего или части гена; транспозицией всего или части гена или реаранжировкой всего или части гена. В единичном гене может быть представлено более чем одно такое изменение. Такие изменения последовательности вызывают различия в полипептиде, кодируемом нуклеиновой кислотой ТСР7Ь2. Например, если различие представляет собой сдвиг рамки считывания, то сдвиг рамки приводит к изменению кодируемых аминокислот и/или может приводить к генерации преждевременного стоп-кодона, вызывая генерацию трункированного (укороченного) полипептида. Альтернативно, полиморфизм, ассоциированный с заболеванием или состоянием или восприимчивостью к заболеванию или состоянию, ассоциированный с нуклеиновой кислотой ТСР7Ь2, может быть синонимичным изменением в одном или более нуклеотидах (т. е. изменением, которое не приводит к изменению в полипептиде, кодируемом нуклеиновой кислотой ТСР7Ь2). Такой полиморфизм может изменять сайты сплайсинга, влиять на стабильность или транспорт мРНК или другим образом влиять на транскрипцию или трансляцию гена. Нуклеиновая кислота ТСР7Ь2, которая имеет любое изменение или перестройки, описанные выше, называется здесь измененная нуклеиновая кислота.
В первом способе диагностики восприимчивости к диабету II типа могут применяться методы гибридизации, такие как саузерн анализ, нозерн анализ или гибридизации ίη зйи (см. Сштеи! Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, АизиЬе1, Р. е! а1., ебз, 1ойи \УПеу & 8оиз, включая все дополнения с 1999 года). Например, биологический образец (тестируемый образец) из тестируемого субъекта (тестируемый индивидуум) геномной ДНК, РНК или кДНК получают из индивидуума (для экзонных маркеров может применяться только РНК и кДНК), такого как индивидуум, подозреваемый в том, что он является восприимчивым к или предрасположенным к или несущим дефект диабета II типа. Индивидуум может быть взрослым, ребенком или плодом. Тестируемый образец может быть из любого источника, который включает геномную ДНК, таким как образец крови, образец амниотической жидкости, образец цереброспинальной жидкости или образец ткани из кожи, мышцы, буккальной слизистой или слизистой оболочки глаза, плацента, желудочно-кишечный тракт или другие органы. Тестируемый образец ДНК из фетальных клеток или ткани может быть получен подходящими способами, такими как амниоцентез или образцы ворсинок хориона. Затем образец ДНК, РНК или кДНК исследуется для определения того, имеется ли полиморфизм в нуклеиновой кислоте ТСР7Ь2 и/или для определения, какой сплайсированный вариант(ы), кодируемый ТСР7Ь2, представлен в нем. Присутствие полиморфизма или сплайсированного варианта(ов) может быть показано гибридизацией гена геномной ДНК, РНК или кДНК с нуклеотидным зондом. Нуклеотидный зонд, как это применяется здесь, может быть зонд ДНК или зонд РНК; нуклеотидный зонд может включать, к примеру, по меньшей мере один полиморфизм нуклеиновой кислоты ТСР7Ь2 и/или включать нуклеиновую кислоту, кодирующую специфический сплайсированный вариант нуклеиновой кислоты ТСР7Ь2. Зонд может быть любой молекулой нуклеиновой кислоты, описанной выше (например, ген или нуклеиновая кислота, фрагмент, вектор, включающий ген или нуклеиновую кислоту, зонд или праймер, и т.д).
Для диагностики восприимчивости к диабету II типа образец для гибридизации может быть сформирован путем контакта нуклеиновой кислоты ТСР7Ь2 по меньшей мере с одним нуклеотидным зондом. Предпочтительным зондом для детектирования мРНК или геномной ДНК является меченый нуклеотидный зонд, способный к гибридизации с последовательностями мРНК или геномной ДНК, описанными выше. Нуклеотидный зонд может быть, к примеру, молекулой нуклеиновой кислоты полной длины или ее частью, такой как олигонуклеотид, имеющий длину по меньшей мере в 15, 30, 50, 100, 250 или 500 нуклеотидов, и достаточный для специфической гибридизации в жестких условиях с подходящей мРНК или геномной ДНК. Зонды, подходящие для применения в диагностических анализах изобретения, описаны выше (см., к примеру, зонды и праймеры, обсуждавшиеся под названием Нуклеиновые кислоты изобретения).
Образец для гибридизации поддерживается в условиях, которые достаточны для того, что позволить специфическую гибридизацию нуклеотидного зонда с нуклеиновой кислотой ТСР7Ь2. Специфическая гибридизация, как это применяется здесь, означает правильную гибридизацию (например, без несоответствий). Специфическая гибридизация может быть выполнена в очень жестких условиях или в умеренных условиях, например, как описано выше. В особенно предпочтительном аспекте условия гибридизации для специфической гибридизации являются очень жесткими.
Специфическая гибридизация, если она присутствует, обнаруживается затем с применением стандартных способов. Если в тестируемом образце имеет место специфическая гибридизация между нуклеотидным зондом и нуклеиновой кислотой ТСР7Ь2, то ТСР7Ь2 имеет полиморфизм или является сплайсированным вариантом, который представлен в нуклеотидном зонде. Одновременно в этом способе может применяться более чем один нуклеотидный зонд. Специфическая гибридизация любого одного из нуклеотидных зондов является индикатором полиморфизма в нуклеиновой кислоте ТСР7Ь2 или присут
- 4 016397 ствия определенного сплайсированного варианта, кодируемого нуклеиновой кислотой ТСР7Ь2, и может быть диагностирована, как восприимчивость к диабету II типа или как пониженная восприимчивость к диабету II типа (или быть указанием на наличие защитного аллеля против диабета II типа).
В нозерн анализе (см. Ситгеи! РгоЮеоб ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Ли8иЬе1, Р. е! а1., ебк, Ιοίιη \УПеу & 8ои5, кирга) применяются способы гибридизации, описанные выше, для идентификации присутствия полиморфизма или специфического сплайсированного варианта, ассоциированного с восприимчивостью к диабету II типа или ассоциированного с пониженной восприимчивостью к диабету II типа. Для нозерн анализа тестируемый образец ДНК получают из индивидуума подходящим способом. Специфическая гибридизация нуклеотидного зонда, как описано выше, с РНК из индивидуума является индикатором полиморфизма в нуклеиновой кислоте ТСР7Ь2, присутствия специфического сплайсированного варианта, кодируемого нуклеиновой кислотой ТСР7Ь2, и является, таким образом, диагностикой восприимчивости к диабету II типа или с пониженной восприимчивостью к диабету II типа (или индикатором защитного аллеля против диабета II типа).
Для репрезентативных примеров применения нуклеотидных зондов см., к примеру, патенты И8 5288611 и 4851330.
Альтернативно, вместо нуклеотидного зонда в способах гибридизации, описанных выше, может применяться зонд из пептидонуклеиновой кислоты (ΡΝΑ). ΡΝΑ является имитатором ДНК, имеющим пептидоподобный неорганический скелет, такой как Л-(2-аминоэтил)глициновые единицы с органическими основаниями (Α, С, С, Т или и), прикрепленными к азоту глицина через метиленкарбонильный линкер (см., например, №е1кеи, Ρ.Ε. е! а1., Вюсоищда!е Сйетщйу 5, Атепсаи Сйетка1 8оае1у, р.1 (1994)). Зонд ΡΝΑ может быть сконструирован для специфической гибридизации с нуклеиновой кислотой ТСР7Ь2. Гибридизация зонда ΡΝΑ с нуклеиновой кислотой ТСР7Ь2 может быть диагностикой восприимчивости к диабету II типа или пониженной восприимчивости к диабету II типа (или индикатором защитного аллеля против диабета II типа).
В другом способе изобретения может быть применен анализ изменения путем рестрикционного переваривания для обнаружения изменения в гене, если изменение (мутация) или полиморфизм в гене является результатом создания или элиминации рестрикционного сайта. Тестируемый образец, включающий геномную ДНК, получают из индивидуума. Для амплификации нуклеиновой кислоты ТСР7Ь2 в тестируемом образце геномной ДНК из тестируемого индивидуума может быть применена полимеразная цепная реакция (ПЦР) (и, если необходимо, фланкирующие последовательности). ΚΕΕΡ анализ проводится, как описано (см. Ситгеи! Ρ^ο!οсο1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Αυκυ^1, Р. е! а1., ебк, 1ойи \УПеу & 8оик, кирга). Профиль переваривания релевантного фрагмента ДНК указывает на присутствие или отсутствие изменения или полиморфизма нуклеиновой кислоты ТСР7Ь2 и, таким образом, указывает на присутствие или отсутствие восприимчивости к диабету II типа или пониженную восприимчивость к диабету II типа (или указывает на наличие защитного аллеля против диабета II типа).
Для обнаружения специфического полиморфизма в нуклеиновой кислоте ТСР7Ь2 может быть также применен анализ последовательности. Тестируемый образец ДНК или РНК получают из тестируемого индивидуума. ПЦР или другие подходящие методы могут быть применены для амплификации гена или нуклеиновой кислоты и/или его фланкирующих последовательностей, если это желательно. Последовательность нуклеиновой кислоты ТСР7Ь2 или фрагмента нуклеиновой кислоты, или фрагмента кДНК, или мРНК или фрагмента мРНК определяется с применением стандартных методов. Последовательность нуклеиновой кислоты ТСР7Ь2 или фрагмента нуклеиновой кислоты, или фрагмента кДНК, или мРНК или фрагмента мРНК сравнивается с известной последовательностью нуклеиновой кислоты или гена, или кДНК, или мРНК, в зависимости от того, что является более подходящим. Присутствие полиморфизма в ТСР7Ь2 показывает, что индивидуум обладает восприимчивостью к диабету II типа или пониженной восприимчивостью к диабету II типа (или указывает на наличие защитного аллеля против диабета II типа).
Специфичные по отношению к аллелю олигонуклеотиды также могут применяться для выявления присутствия полиморфизма в нуклеиновой кислоте ТСР7Ь2 путем применения дот-блот гибридизации амплифицированных нуклеотидов со специфичными по отношению к аллелю олигонуклеотидными зондами (Α8Θ) (см., например, 8а1к1, В. е! а1., ЛаШге. 324:163-166 (1986)). Специфичные по отношению к аллелю олигонуклеотиды (Α8Θ) (называемые здесь также специфичными по отношению к аллелю олигонуклеотидными зондами) представляют собой олигонуклеотиды с длиной приблизительно 10-15 пар оснований, предпочтительно приблизительно 15-30 пар оснований, которые специфически гибридизуются с нуклеиновой кислотой ТСР7Ь2 и которые включают полиморфизм, ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа, или полиморфизм, ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа (или указывает на наличие защитного аллеля против диабета II типа). С применением стандартных способов может быть получен Α8Θ зонд, специфичный для определенного полиморфизма в нуклеиновой кислоте ТСР7Ь2 (см. Сштеи! кго1осо1к 1и Мо1еси1аг Вю1оду, кирга). Для идентификации полиморфизмов в гене, который ассоциирован с диабетом II типа, из индивидуума получают тестируемый образец ДНК. Для амплификации всей нуклеиновой кислоты ТСР7Ь2 или ее фрагмента и ее фланкирующих последовательностей может быть применена ПЦР. ДНК, включающая амплифицированную
- 5 016397 нуклеиновую кислоту ТСЕ7Ь2 или фрагмента гена или нуклеиновой кислоты, подвергается дотблоттингу с применением стандартных способов (см. Сштеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν. кирга), и блот контактирует с олигонуклеотидным зондом. Затем детектируется наличие специфической гибридизации зонда с амплифицированной нуклеиновой кислотой ТСР7Ь2. Гибридизация ΑΟ8 с ДНК из индивидуума является индикатором полиморфизма в нуклеиновой кислоте ТСР7Ь2 и, таким образом, индикатором восприимчивости к диабету II типа или индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа (или указывает на наличие защитного аллеля против диабета II типа).
Дополнительно изобретение обеспечивает ΆΘ8, которые гибридизуются с контрольным или различающимися аллелями гена или нуклеиновой кислоты, включающей единственный нуклеотидный полиморфизм, или к комплементарной ей молекуле. Эти нуклеотиды могут быть зондами или праймерами.
Специфичный к аллелю праймер гибридизуется с участком на ДНК-мишени, перекрывающим полиморфизм, и только начинает амплификацию аллельной формы, к которой праймер демонстрирует совершенную комплементарность. См. С1ЬЬк, Ыис1е1с Лаб Кек. 17, 2427-2448 (1989). Праймер применяется в соединении со вторым праймером, который гибридизуется в дистальном участке. Амплификация происходит с двух праймеров, приводя к получению детектируемого продукта, который указывает на присутствие определенной аллельной формы. Контроль обычно получают со второй парой праймеров, один из которых показывает единственное несоответствующее основание в полиморфном участке, а другой из них демонстрирует совершенную комплементарность с дистальным участком. Единственное несоответствующее основание предотвращает амплификацию, поэтому детектируемый продукт не образуется. Способ работает наилучшим образом, когда несоответствие включено в большинстве случаев в З'-позицию олигонуклеотида, выровненного с полиморфизмом, поскольку эта позиция является наиболее дестабилизирующей для элонгации с праймера (см., например, νθ 93/22456).
С добавлением таких аналогов, как заблокированные нуклеиновые кислоты (ΕΝΑ), размер праймеров и зондов может быть редуцирован лишь до 8 оснований. ΕΝΑ являются новым классом бициклических аналогов ДНК, в которых позиции 2' и 4' в фуранозном кольце соединены через О-метиленовую (окси-ΕΝΑ) или аминометиленовую (амино-ΕΝΑ) группировку. Общим для всех этих вариантов ΕΝΑ является сродство к комплементарной нуклеиновой кислоте, которая общепризнанно является наиболее высоким из известных для аналогов ДНК. Например, было показано, что, в частности, все окси-ΕΝΑ нонамеры имеют температуру плавления 64ЕС и 74ЕС, когда находятся в комплексе с комплементарной ДНК или РНК соответственно в отличие от 28ЕС для ДНК и РНК соответствующих ДНК наномеров. Существенное увеличение температуры плавления получают также, когда ΕΝΑ мономеры применяются в комбинации с мономерами стандартной ДНК или РНК. Для праймеров и зондов, в зависимости от того, где включены ΕΝΑ мономеры (например, на З'-конце, 5'-конце или посредине), температура плавления может быть значительно увеличена.
В другом аспекте матрица олигонуклеотидной пробы, которая является комплементарной к последовательности сегментов нуклеиновой кислоты-мишени из индивидуума, может быть применена для идентификации полиморфизма в нуклеиновой кислоте ТСЕ7Ь2. Например, в одном аспекте может применяться олигонуклеотидная матрица. Олигонуклеотидные матрицы обычно включают множество различных олигонуклеотидных зондов, которые сопряжены с поверхностью субстрата в различных известных местах. Эти олигонуклеотидные матрицы, известные также как СепесЫрк™, были описаны, к примеру, в патенте И8 5143854 и в патентных публикациях РСТ XVО 90/15070 и 92/10092. Эти матрицы в основном могут быть получены с применением методов механического синтеза или направленного светом синтеза, который включает комбинацию фотолитографических методов и методов твердофазного синтеза олигонуклеотидов. См. Робот е! а1., 8с1епсе. 251:767-777 (1991), Рптипд е! а1., патент И8 5143854 (см. также заявку РСТ νθ 90/15070 и Робот е! а1., публикация РСТ νθ 92/10092 и патент И8 5424186, включенные сюда в их целостности путем ссылки). Методы синтеза этих матриц с применением методов механического синтеза описаны, к примеру, в патенте И8 5384261,; включенном сюда в его целостности путем ссылки. В другом примере могут быть применены линейные матрицы.
Как только олигонуклеотидная матрица приготовлена, интересующая нуклеиновая кислота гибридизуется с матрицей и сканируется на полиморфизм. Гибридизация и сканирование проводятся в основном способами, описанными здесь, а также в опубликованной публикации РСТ νθ 92/10092 и νθ 95/11995 и патенте И8 5424186, которые включены сюда в их целостности путем ссылки. Кратко, последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, которая включает один или более предварительно идентифицированных полиморфных маркеров, амплифицируется с применением хорошо известных методов амплификации, например ПЦР. Обычно для этого применяются последовательности праймеров, которые комплементарны двум нитям последовательности-мишени, расположенным ниже и выше полиморфизма. Может применяться техника асимметричной ПЦР. Затем амплифицированная мишень, в основном включающая метку, гибридизуется с матрицей в подходящих условиях. После выполнения гибридизации и промывания матрицы матрица сканируется для определения позиции, с которой гибридизуется последовательность-мишень. Данные гибридизации, полученные из скана, представлены обычно в виде интенсивности флуоресценции как функции расположения матрицы.
- 6 016397
Хотя первично это было описано в терминах детекции единственного блока, например, для детектирования единичного полиморфизма, матрицы могут включать множество блоков детекции и, таким образом, способны анализировать множественные специфические полиморфизмы. В альтернативных аспектах в основном будет понятно, что блоки детекции могут быть сгруппированы в пределах единственной матрицы или множества раздельных матриц, так что различные оптимальные условия могут быть применены во время гибридизации мишени с матрицей. Например, часто может быть желательным обеспечить детекцию таких полиморфизмов, которые попадают в пределы отрезка геномной последовательности, обогащенного С-С. отдельно от тех, которые попадают в сегменты, обогащенные А-Т. Это позволяет провести раздельную оптимизацию условий для каждой ситуации.
Дополнительное применение олигонуклеотидных матриц для детекции полиморфизма может быть обнаружено, к примеру, в патентах И8 5858659 и 5837832, которые включены сюда в их целостности путем ссылки. Другие способы анализа нуклеиновой кислоты могут применяться для детекции полиморфизма в гене диабета II типа или вариантов, кодируемых геном диабета II типа. Репрезентативные способы включают, к примеру, прямое ручное секвенирование (Сйигсй аиб СйЬей, Ргос. №а!1. Асаб; δει. И8А. 81:1991-1995 (1988); 8аидег, Е. е! а1., Ргос. №а!1. Асаб. δει. И8А. 74:5463-5467 (1977), Веау18 е! а1., патент ϋδ 5288644; автоматизированное флуоресцентное секвенирование; анализ полиморфизма одноцепочечной конформации (88СР); зажатый электрофорез в геле в денатурирующих условиях (СИСЕ); градиентный электрофорез в геле в денатурирующих условиях (ЭССЕ) (§НеГПе1б, У.С. е! а1., Ргос. №И1. Асаб. 8сЕ И8А. 86:232-236 (1989); анализ сдвига мобильности (Огйа, М. е! а1., Ргос. №а!1. Асаб. 8сЕ И8А. 86:2766-2770 (1989); рекстрикционный анализ (Е1ауе11 е! а1., Се11. 15:25 (1978); Сгееуег, е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А. 78:5081 (1981); анализ гетеродуплекса; химическое расщепление в точке несоответствия (СМС) (Со!!оп е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А. 85:4397-4401 (1985); анализ защиты от РНКаз (Муегк, К..М. е! а1., 8с1епсе. 230:1242 (1985)); применение полипептидов, которые распознают несоответствие нуклеотидов, таких как ти!8 белок из Е.соИ; специфическая по отношению к аллелю ПЦР.
В одном аспекте изобретения диагноз восприимчивости к диабету II типа или пониженной восприимчивости к диабету II типа (или индикатор защитного аллеля против диабета II типа) может быть сделан также путем экспрессионного анализа путем количественной ПЦР (кинетические температурные циклы). Этот метод с применением ТацМап® анализа может определить присутствие изменения в экспрессии или состав полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой ТСЕ7Ь2 или сплайсированными вариантами, кодируемыми нуклеиновой кислотой ТСЕ7Ь2. Для идентификации полиморфизма могут применяться также ТацМап® зонды, независимо от того, является пациент гомо- или гетерозигоным. Дополнительно экспрессия вариантов может быть оценена количественно как физически или функционально различных.
В другом аспекте изобретения диагноз восприимчивости к диабету II типа или пониженной восприимчивости к диабету II типа (или индикатор защитного аллеля против диабета II типа) может быть сделан путем исследования экспрессии и/или состава полипептида ТСЕ7Ь2 с применением различных способов, включая иммуноферментный анализ с использованием сорбента (ЕЬЕЗА), Вестерн-блоты, иммунопреципитацию и иммунофлуоресценцию. Тестируемый образец из индивидуума оценивается на присутствие изменения в экспрессии и/или изменения в составе полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой ТСЕ7Ь2, или на присутствие определенного варианта, кодируемого нуклеиновой кислотой ТСЕ7Ь2. Изменение в экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой ТСЕ7Ь2, может быть, например, изменением в количественной экспрессии полипептида (т.е. в количестве производимого полипептида); изменением в составе полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой ТСЕ7Ь2, представляет собой изменение в качественной экспрессии полипептида (например, экспрессии измененного ТСЕ7Ь2 полипептида или другого спланированного варианта). В предпочтительном аспекте диагноз восприимчивости к диабету II типа или пониженной восприимчивости к диабету II типа может быть сделан путем детекции определенного сплайсированного варианта, кодируемого этой нуклеиновой кислотой ТСЕ7Ь2, или определенного спектра сплайсированных вариантов.
Могут быть представлены оба таких изменения (количественные и качественные). Термин изменение в экспрессии или составе полипептида, как он применяется здесь, относится к изменению в экспрессии или составе тестируемого образца по сравнению с экспрессией или составом полипептида нуклеиновой кислоты ТСЕ7Ь2 в контрольном образце. Контрольный образец является образцом, который соответствует тестируемому образцу (например, происходит из того же типа клеток и из индивидуума, у которого не затронута восприимчивость к диабету II типа). Изменение в экспрессии или составе полипептида в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом является индикатором восприимчивости к диабету II типа. Подобным образом присутствие одного или более сплайсированных вариантов в тестируемом образце или присутствие значительно различающихся количеств различных сплайсированных вариантов в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом является индикатором чувствительности к диабету II типа. Могут применяться различные способы анализа экспрессии или состава полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой ТСЕ7Ь2, включая спектроскопию, колориметрию, электрофорез, изоэлектрическое фокусирование и иммуноанализ (например, Иау1б е! а1., патент
- 7 016397
И8 4376110), такой как иммуноблоттинг (см. также Сштеи! Рго!осо1в ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν. особенно главу 10). Например. в одном аспекте антитело способно связываться с полипептидом (например. как описано выше). предпочтительно может применяться антитело с детектируемой меткой. Антитела могут быть поликлональными или более предпочтительно. моноклональными. Может применяться интактное антитело или его фрагмент (например. ЕаЬ или Е(аЬ')2). Термин меченый по отношению к зонду или антителу включает непосредственно меченый зонд или антитело. сопряженное (т.е. физически соединенное) с детектируемым веществом зонда. а также непрямо меченый зонд или антитело за счет его взаимодействия с другим реагентом. который помечен непосредственно. Примеры непрямого мечения включают детекцию первичного антитела с применением флуоресцентно меченого вторичного антитела и зонд ДНК. помеченный на конце биотином. так что это может быть обнаружено с флуоресцентно меченым стрептавидином.
Вестерн-блот анализ с применением антитела. как описано выше. которое специфически связывается с полипептидом. кодируемым измененной нуклеиновой кислотой ТСЕ7Б2. или антитела. которое специфически связывается с полипептидом. кодируемым неизмененной нуклеиновой кислотой. или антитела. которое специфически связывается с определенным сплайсированным вариантом. кодируемым нуклеиновой кислотой. может применяться для идентификации присутствия в тестируемом образце определенного сплайсированного варианта или полипептида. кодируемого полиморфной или измененной нуклеиновой кислотой ТСЕ7Б2. или отсутствия в тестируемом образце определенного сплайсированного варианта или полипептида. кодируемого неполиморфной или неизмененной нуклеиновой кислотой. Присутствие полипептида. кодируемого полиморфной или измененной нуклеиновой кислотой. или отсутствие полипептида. кодируемого неполиморфной или неизмененной нуклеиновой кислотой. являются диагнозом на восприимчивость диабета II типа. как и присутствие (или отсутствие) определенных сплайсированных вариантов. кодируемых нуклеиновой кислотой ТСЕ7Б2.
В одном аспекте этого способа уровень или количество полипептида. кодируемого нуклеиновой кислотой ТСЕ7Б2. в тестируемом образце сравнивается с уровнем или количеством полипептида. кодируемого ТСЕ7Б2. в контрольном образце. Уровень или количество полипептида в тестируемом образце. которое является более высоким или низким. чем уровень или количество полипептида в контрольном образце. такие. что различие является статистически значимым. является индикатором изменения в экспрессии полипептида. кодируемого нуклеиновой кислотой ТСЕ7Б2. и диагностикой восприимчивости к диабету II типа. Альтернативно. состав полипептида. кодируемого нуклеиновой кислотой ТСЕ7Б2. в тестируемом образце сравнивается с составом полипептида. кодируемого нуклеиновой кислотой ТСЕ7Б2. в контрольном образце (например. присутствие различных сплайсированных вариантов). Различие в составе полипептида в тестируемом образце по сравнению с составом полипептида в контрольном образце является диагностикой восприимчивости к диабету II типа. В другом аспекте может быть определен и уровень. и состав полипептида в тестируемом и в контрольном образцах. Различие в количестве или уровне полипептида в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом; различие состава в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом или оба различия в количестве или уровне и различие в составе являются индикатором восприимчивости к диабету II типа.
Те же способы могут. наоборот. применяться для идентификации присутствия различия. когда сравниваются с контрольным (при заболевании) образцом. Отличие от контроля является индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа и/или индикатором присутствия защитного аллеля против диабета II типа.
Оценка маркеров и гаплотипов.
Популяции индивидуумов. демонстрирующих генетическое многообразие. не имеют идентичных геномов. Точнее. геном демонстрирует вариабельность последовательности между индивидуумами во многих участках генома; другими словами. в популяции имеется много полиморфных участков. В некоторых случаях делается ссылка на различные аллели в полиморфном участке без выбора аллеля сравнения. Альтернативно. контрольная последовательность может сравниваться с определенным полиморфным участком. Контрольный аллель иногда рассматривают как аллель дикого типа. и он обычно выбирается либо как первый секвенированный аллель. либо как аллель из не подверженного болезни индивидуума (например. индивидуума. который не демонстрирует признаков заболевания или аномального фенотипа). Аллели. которые отличаются от контрольного. называют вариантными аллелями.
Маркер. как описано здесь. относится к последовательности генома. характерной для определенного вариантного аллеля (т.е. полиморфного участка). Маркер может включать любой аллель любого вариантного типа. обнаруженного в геноме. включая 8ΝΡ. микросателлиты. вставки. делеции. дупликации и транслокации.
Номенклатура 8ΝΡ. как сообщается здесь. относится к официальному ГО 8ΝΡ (гв) идентификационному ярлыку. назначенному каждому уникальному 8ΝΡ Национальным Центром Биотехнологической Информации ЩСЫ).
Гаплотип. как это описано здесь. относится к сегменту цепи геномной ДНК. которая характеризуется специфической комбинацией генетических маркеров (аллелей). расположенных внутри сегмента. В определенном воплощении гаплотип может включать один или более аллелей. два или более аллелей.
- 8 016397 три или более аллелей, четыре или более аллелей или пять или более аллелей. Генетический маркер является определенными аллелями в полиморфных участках, ассоциированными с ЕО блоком 4 экзона ТСЕ7Б2. Как это применяется здесь, БЭ блок экзона 4 ТСЕ7Б2 относится к БЭ блоку на С11г1()с.|. в пределах которого наблюдается ассоциация вариантов с диабетом II типа. В соответствии с Νί,'ΒΙ существует 34 позиции этого блока в пределах от 114413084 до 114488013 пар оснований. Термин восприимчивость, как описывается здесь, включает как повышенную, так и пониженную восприимчивость. Таким образом, определенные маркеры и/или гаплотипы изобретения могут характеризовать повышенную восприимчивость к диабету II типа, что характеризуется относительным риском заболевания более чем единица. Более того, маркеры и/или гаплотипы, которые придают повышенную восприимчивость к диабету II типа, рассматриваются как наличие риска, поскольку они обеспечивают повышенный риск заболевания. Альтернативно, маркеры и/или гаплотипы изобретения, характеризующие пониженную восприимчивость к диабету II типа, характеризуются относительным риском менее чем единица.
Позиция нуклеотида, в которой в популяции возможна более чем одна последовательность (либо в природной популяции, либо в синтетической популяции, например в библиотеке синтетических молекул), называется здесь полиморфным участком. Там, где полиморфный участок имеет длину в один нуклеотид, участок называется 3ΝΡ. Например, если в определенном участке хромосомы один член популяции имеет аденин, а другой член популяции имеет тимин в одной и той же позиции, то эта позиция является полиморфным участком, более точно 3ΝΡ. Аллели для маркеров 3ΝΡ, как это называется здесь, относятся к основаниям А, С, С или Т, поскольку они находятся в полиморфном участке в примененном анализе 3ΝΡ. Специалист поймет, что путем определения или чтения противоположной нити в каждом случае может быть определен комплементарный аллель. Таким образом, для полиморфного участка, включающего полиморфизм А/С, примененный анализ может измерить либо процент, либо соотношение двух возможных оснований, т.е. А и С. Альтернативно, путем создания анализа, который определяет противоположную нить на матрице ДНК, может быть измерен процент или соотношение комплементарных оснований Т/С. Количественно (например, в терминах относительного риска) должны быть получены идентичные результаты из измерения любой нити ДНК (+нить или -нить). Участки полиморфизма могут позволить различать последовательности на основании замен, вставок или делеций. Например, полиморфные микросателлиты имеют множественные малые повторы оснований (такие как СА повторы) в определенном участке, в котором ряд дин повторов в основной популяции варьирует. Каждая версия последовательности в отношении участка полиморфизма называется здесь как аллель полиморфного участка. Таким образом, в предыдущем примере 3ΝΡ позволяет присутствие обоих аденинового и тиминового аллелей. Обнаружено, что 3ΝΡ и микросателлитные маркеры, локализованные в пределах БЭ блока экзона 4 ТСЕ7Б2, ассоциированные с диабетом II типа, описаны в табл. 2-7.
Типично контрольная последовательность относится к определенной последовательности. Аллели, которые отличаются от контрольного, называются вариантные аллели. Например, контрольная геномная последовательность ДНК между позициями 114413084 и 114488013 ΝΒΤΊ Конструкция 34 (равная 74929 парам оснований или 74,9 т.п.о.), которая относится к локализации в пределах хромосомы 10, описана здесь как ЗЕО ГО ΝΟ: 1. Вариантная последовательность, как это применяется здесь, относится к последовательности, которая отличается от ЗЕО ГО ΝΟ:1, но во всем остальном, по существу, подобна. Генетические маркеры, которые составляют гаплотипы, ассоциированные с БЭ блоком экзона 4 ТСЕ7Б2, являются вариантными. Дополнительно варианты могут включать изменения, которые влияют на полипептид, например полипептид, кодируемый геном ТСЕ7Б2. Эти различия в последовательности, когда они сравниваются с контрольной нуклеотидной последовательностью, могут включать вставки или делеции единственного нуклеотида или более чем одного нуклеотида. Такие различия в последовательности могут приводить к сдвигу рамки считывания; изменение по меньшей мере одного нуклеотида может приводить к изменению кодируемой аминокислоты; изменение по меньшей мере одного нуклеотида может приводить к генерации преждевременного стоп-кодона; делеция нескольких нуклеотидов может приводить к делеции одной или более аминокислот, кодируемых нуклеотидами; вставка одного или нескольких нуклеотидов, такая как неравная рекомбинация или конверсия гена, может приводить к прерыванию кодирующей последовательности рамки считывания; дупликации всей или части последовательности; транспозиции или реаранжировке нуклеотидной последовательности, как это описано здесь детально. Такие изменения последовательности изменяют полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой. Например, если изменение в последовательности нуклеиновой кислоты вызывает сдвиг рамки, то сдвиг рамки может привести к изменению в кодируемых аминокислотах и/или может привести к генерации преждевременного стоп-кодона, вызывая получение укороченного полипептида. Альтернативно, полиморфизм, ассоциированный с диабетом II типа или с восприимчивостью к диабету II типа, может быть синонимичным изменением в одном или более нуклеотидах (т.е. изменением, которое не приводит к изменению в аминокислотной последовательности). Такой полиморфизм может, например, изменять участки сплайсинга, влиять на стабильность или транспорт мРНК или по-другому влиять на транскрипцию или трансляцию кодируемого полипептида. Он может изменять также ДНК, увеличивая возможность структурных изменений, таких как амплификация или делеция, имеющих место на соматическом уровне в опухолях. Полипептид, кодируемый контрольной нуклеотидной последовательностью, является кон- 9 016397 трольным полипептидом с определенной контрольной аминокислотной последовательностью, и полипептиды, кодируемые вариантными аллелями, называются вариантными полипептидами с вариантными аминокислотными последовательностями.
Полиморфные микросателлиты имеют множественные малые повторы оснований, которые имеют длину в 2-8 нуклеотидов (такие как СА повторы) в определенном участке, в котором ряд длин повторов варьирует в общей популяции. Вставка является общей формой полиморфизма, включающего малые вставки или делеции, которые типично имеют длину лишь несколько нуклеотидов.
Гаплотипы, описанные здесь, представляют собой комбинацию различных генетических маркеров, например 8ΝΡ и микросателлитов, имеющих определенные аллели в полиморфных участках. Гаплотипы могут включать комбинацию различных генетических маркеров, детектирование гаплотипов, таким образом, может быть выполнено способами, известными специалисту, для детектирования последовательностей в полиморфных участках. Например, могут применяться стандартные методы для генотипирования присутствия 8ΝΡ и/или микросателлитных маркеров, такие как основанные на флуоресцентных методах (Сйеп, X. е! а1., Сеиоше Век. 9(5):492-98 (1999)), ПЦР, ЬСВ, вложенная ПЦР и другие методы амплификации нуклеиновой кислоты. Эти маркеры и 8ΝΡ могут быть идентифицированы в гаплотипах, придающих риск возникновения заболевания. Определенные способы идентификации важных маркеров и 8ΝΡ включают ЬЭ и/или оценки ЬОЭ.
В определенных способах, описанных здесь, индивидуум, который имеет риск возникновения диабета II типа, является индивидуумом, у которого идентифицированы маркеры риска или гаплотип риска. В одном аспекте маркер или гаплотип риска является тем, что придает значительно увеличенный риск (или восприимчивость) диабета II типа. В одном воплощении значимость, ассоциированная с маркером или гаплотипом, измеряется относительным риском. В дополнительном воплощении значимость определяется процентом. В одном воплощении значительно увеличенный риск измеряется как относительный риск по меньшей мере примерно 1,2, включая, но не ограничиваясь, 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8 и 1,9. В дополнительном воплощении относительный риск 1,2 является значимым. В дополнительном воплощении относительный риск по меньшей мере 1,5 является значимым. В дополнительном воплощении значимое увеличение риска, являющееся равным по меньшей мере 1,7, является значительным. В дополнительном воплощении значимое увеличение риска составляет по меньшей мере примерно 20%, включая, но не ограничиваясь этим, примерно 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 и 98%. В дополнительном воплощении значимое увеличение риска составляет по меньшей мере примерно 50%.
В других воплощениях изобретения маркер или гаплотип придает пониженный риск (пониженную восприимчивость) диабета II типа. В одном воплощении значимое уменьшение риска измеряется как относительный риск менее чем 0,9, включая, но не ограничиваясь, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5 и 0,4. В дополнительных воплощениях значимый относительный риск составляет менее чем 0,7. В другом воплощении снижение риска (или восприимчивости) составляет по меньшей мере примерно 20%, включая, но не ограничиваясь, примерно 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 и 98%. В дополнительном воплощении значимое уменьшение риска составляет по меньшей мере примерно 30%.
Таким образом, термин восприимчивость к диабету II типа указывает либо на повышенный риск либо на восприимчивость или пониженный риск или восприимчивость диабета II типа в количестве, которое является значимым, когда представлен определенный аллель, маркер, 8ΝΡ или гаплотип; значимость измеряется, как указано выше. Термины пониженный риск, пониженная восприимчивость и защита против, как они применяются здесь, показывают, что относительный риск является пониженным соответственно, когда представлен определенный другой аллель, маркер, 8ΝΡ и/или определенный гаплотип. Понятно, однако, что идентификация того, является ли пониженный или повышенный риск значимым в медицине, может также зависеть от множества факторов, включая специфическое заболевание, маркер или гаплотип и часто факторы окружающей среды.
Маркер или гаплотип риска, включая часть, в гене ТСР7Ь2 является таковым, где маркер или гаплотип наиболее часто представлены у индивидуумов с риском диабета II типа (подверженным) по сравнению с частотой его присутствия у здорового индивидуума (контрольного) и где присутствие маркера или гаплотипа является индикатором восприимчивости к диабету II типа. Примером простого теста на корреляцию будет строгий тест Фишера попарно в таблице. Данная группа хромосом попарно в таблице сконструирована из ряда хромосом, которые включают оба маркера или гаплотипа, один из маркеров или гаплотипов, но не другой, и ни один из маркеров или гаплотипов.
В определенных аспектах изобретения маркер или гаплотип риска является маркером или гаплотипом риска в пределах или вблизи ТСР7Ь2, что значимо коррелирует с диабетом II типа. В других аспектах маркер или гаплотип риска включает маркер или гаплотип риска в пределах или вблизи ТСР7Ь2, что значимо коррелирует с восприимчивостью к диабету II типа. В определенном воплощении маркер или гаплотип ассоциирован с ЬЭ блоком экзона 4 ТСР7Ь2, как это описано здесь.
Могут применяться стандартные способы генотипирования присутствия 8ΝΡ и/или маркера микросателлита, такие как методы, основанные на флуоресценции (Сйеи, е! а1., Сепоте Век. 9, 492 (1999)),
ПЦР, ЬСВ, вложенная ПЦР и другие методы амплификации нуклеиновой кислоты. В предпочтительном аспекте способ включает оценку у индивидуума присутствия или частоты 8ΝΡ и/или, включая часть,
- 10 016397 гена ТСЕ7Ь2, где избыток или более высокая частота 8ΝΡ и/или микросателлитов по сравнению со здоровыми контрольными индивидуумами является индикатором того, что индивидуум восприимчив к диабету II типа. Такие 8ΝΡ и маркеры могут формировать гаплотипы, которые могут применяться как инструмент для скрининга. Эти маркеры и 8ΝΡ могут быть идентифицированы как гаплотипы риска. Например, гаплотип риска может включать маркеры микросателлиты и/или 8ΝΡ, такие как маркер ΌΟ108478 и/или 8ΝΡ Т512255372, Щ7895340, Щ11196205, т§7901695, Т57903146, Т512243326 и гк4506565. Присутствие гаплотипа риска является индикатором повышенной восприимчивости к диабету II типа и, таким образом, индикатором индивидуума, который попадает в популяцию для лечения способами, описанными здесь.
Идентификация вариантов восприимчивости.
Частоты гаплотипов у пациентов и контрольных групп могут быть оценены с применением алгоритма максимизации ожидания (Эетрйег А. с1 а1., I. К. 81а1. 8ос. Ό, 39:1-38 (1977)). Может быть применено осуществление этого алгоритма, которое может контролировать отсутствующие генотипы и неопределенность с фазой. В нулевой гипотезе предполагается, что пациенты и контроли имеют идентичные частоты. С применением вероятностного подхода тестируется альтернативная гипотеза, где кандидату на гаплотип риска, который может включать маркеры, описанные здесь, позволено иметь более высокую частоту у пациентов, чем в контроле, в то время как соотношение частот других гаплотипов предполагается одинаковым в обеих группах. Вероятность максимизируется отдельно для обеих гипотез, и применяется соответствующий 1-б! статистический коэффициент вероятности для оценки статистической значимости.
Для поиска маркеров риска и защитных маркеров в пределах сцепленной области, к примеру, исследуется ассоциация всех возможных комбинаций генотипированных маркеров, в том случае, если эти маркеры простираются в настоящую область. Комбинированные группы пациентов и контрольные группы могут быть беспорядочно разделены на два набора, равные по размеру оригинальной группе пациентов и контрольных индивидуумов. Затем анализ маркера и гаплотипа повторяется, и определяются наиболее значимые зарегистрированные значения р. Эта рандомизированная схема затем может быть повторена, например, более 100 раз для конструирования эмпирического распределения значений р. В предпочтительном воплощении значение р<0,05 является индикатором значимой ассоциации маркера и/или гаплотипа.
Далее следует подробное обсуждение анализа гаплотипа.
Анализ гаплотипа.
Один общепринятый подход к анализу гаплотипа вовлекает применение основанного на вероятности заключения, применимого к №Чеб Мобек (СгеШгхбоШг 8., е1 а1., Ναι. Сепе1. 35:131-38 (2003)). Способ выполняется с помощью программы ΝΕΜΟ, которая учитывает многие полиморфные маркеры, 8ΝΡ и микросателлиты. Метод и программное обеспечение специально созданы для изучения пары случайконтроль, где цель заключается в идентификации группы гаплотипов, которая придает различные риски заболевания. Это также инструмент для исследования ЬИ структур. В ΝΕΜΟ максимальная вероятность оценивается, коэффициенты вероятности и значения р непосредственно рассчитываются с поддержкой ЕМ алгоритма для наблюдаемых данных, обрабатывая их как в случае проблемы отсутствия данных.
Информация об измерениях.
Даже хотя тесты коэффициента вероятности, основанные на вероятности, вычисленной непосредственно для наблюдаемых данных, которые фиксировали информацию о потери, обусловленную неопределенностью в фазе, и отсутствующих генотипах, позволяют надеяться на получение ценных значений р, было бы интересно узнать, как много информации было потеряно, вследствие того, что информация была неполной. Измерение информации для анализа гаплотипа описано у №со1ае апб Копд (Тес11шса1 Керой 537, ИерайтеШ о! 81а11511с5. Ишуегайу о! СЫсадо; Вютейтск, 60(2):368-75 (2004)) как натуральное распространение информационных пределов для анализа связи и выполняется с помощью ΝΕΜΟ.
Статистический анализ.
Для ассоциации единственного маркера с заболеванием может быть применен строгий тест Фишера для расчета двусторонних значений р для каждого индивидуального аллеля. Все значения р представлены не подведенными до множественных сравнений, пока это не указано специально. Представленные частоты (для микросателлитов, 8ΝΡ и гаплотипов) являются частотами аллелей в противоположность несущим частотам. Для минимизации любого смещения, обусловленного связанностью пациентов, которые были набраны как семейства для анализа взаимосвязи, родственники первой и второй степени могли быть удалены из списка пациентов. Более того, тест для ассоциации можно повторить, чтобы ввести поправки на любую сохраняющуюся связанность среди пациентов путем процедуры распространения подведения расхождений, описанной у Ктсй, К&Тепд, I. (Оепоте Кек., 8:1273-1288 (1998)), создания общего фонда ДНК (1Ыб) для кровных родственников так, чтобы он мог применяться для основных семейных взаимоотношений и для сравнения представляться как доведенными, так и не доведенными значениями р. Как ожидалось, различия в основном были незначительными. Для оценки значимости ассоциации с единственным маркером, скорректированной для множественного тестирования, авторы изобретения могли проводить тест рандомизации с применением данных того же генотипа. Группа пациентов и кон
- 11 016397 трольная группа могли быть рандомизированы, и анализ ассоциации сделан повторно много раз (например, до 500000 раз), и значение р представляет собой фракцию повторных анализов, которые дают значение р для того же маркерного аллеля, которое ниже или равно значению р, наблюдаемому с применением оригинальной группы пациентов или контрольной группы. Для обоих типов анализа (единичного маркера и гаплотипа) относительный риск (КК) и приписанный к популяции риск могут быть рассчитаны на основе предположения множественной модели (гаплотип относительно модели риска) (Тег\У111щег, 1.Ό.&Ο!!, I. Нит. Негед. 42:337-46 (1992) апд Еа1к, С.Т.&КиЬтз!ет, Н., Апп. Нит. Сеие!. 51 (Р!. 3):227-33 (1987)), т.е. что риски двух аллелей/гаплотипов индивидуум несет, умножая. К примеру, если КК представляет собой риск А относительно а, то риск гомозиготной персоны АА будет КК раз от такового для гетерозиготы Аа и КК2 раз от риска гомозиготной персоны аа. Мультипликативная модель имеет замечательное свойство, которое упрощает анализ и расчеты - гаплотипы являются независимыми, т.е. находятся в равновесии Харди-Вайнберга в пределах подверженной заболеванию популяции, а также в пределах контрольной популяции. Вследствие этого каждый гаплотип, рассчитанный для подверженных заболеванию и контролей, имеет полиномное распределение, но с различными частотами гаплотипа при альтернативных гипотезах. В частности, для двух гаплотипов, И, и Ь^, риск(й|/й|)=(Г|/р|)(1^/р|), где 1' и р означают соответственно частоты в подверженной заболеванию популяции и в контрольной популяции. В то время как имеется некоторая потеря силы, если истинная модель не является мультипликативной, потеря имеет тенденцию быть умеренной, исключая экстремальные случаи. Наиболее важным является то, что значения р всегда являются правомерными, поскольку они рассчитаны по отношению к нулевой гипотезе.
Нарушение равновесия сцепления с применением ΝΕΜΟ.
ЕЕ между парами маркеров можно рассчитать с применением стандартного определения Ό' и К2 (1.е\уопип. К., Сепейез. 49:49-67 (1964); Н111, А.С.& КоЬег!зоп, Е. ТЬеог. Арр1. Сеие!. 22:226-231 (1968)). С применением программы ΝΕΜΟ частоты комбинаций двух маркерных аллелей оцениваются с максимальной вероятностью, а отклонение от равновесия взаимосвязи оценивается с помощью теста коэффициента вероятности. Определения Ό' и К2 расширены с включением микросателлитов путем усреднения значений для всех возможных аллельных комбинаций двух маркеров, взвешенных посредством крайних вероятностей аллелей. Размещая все комбинации маркеров для выявления структуры ЕЕ в определенной области, помещали Е' в верхний левый угол, а значение р - в нижний правый угол. В ЕЕ графике, если это желательно, маркеры могут быть размещены равноудаленно, а не в соответствии с их физической локализацией.
Статистические способы анализа сцепления.
В анализах оценки свидетельств сцепления может быть применен многоточечный, приписанный только к доле одного аллеля, метод. Результаты, такие как ΕΟΌ баллы и непараметрическая оценка сцепления (ΝΡΕ), могут быть получены с применением программы А11едго (СидЬ)айззоп е! а1., Ναΐ. Сепе!. 25:12-3 (2000)). Наш базовый анализ сцепления применяет бальную функцию 5р;1|гз (АШетоге, А.8., На1реп, 1. Вюте!пез. 50:118-27 (1994); Кгид1уак Е., е! а1., Атег. 1. Нит. Сепе!. 58:1347-63 (1996)), экспоненциальную модель распределения аллеля (Копд, А. апд Сох, N.1. Ат. 1. Нит. Сепе!. 61:1179-88 (1997)) и семейно взвешенную схему, которая на логарифмической шкале представляет собой половину расстояния между равным взвешиванием каждой подверженной заболеванию пары и равным взвешиванием каждой семейной пары. Информационный показатель, который применяется, является частью данных на выходе программы А11едго, и информационный показатель равен нулю, если маркер генотипов является полностью информативным, и равен единице, если генотипы определяют точное количество распределения аллеля среди подверженных заболеванию родственников нестрогим образом (Сге!агздо!йг е! а1., Ат. 1. Нит. Сепе!., 70:593-603 (2002)). Значения Р были рассчитаны двумя различными путями, и здесь приводится менее значимый результат. Первое значение Р может быть рассчитано на основе теории больших выборок; распределение Ζ|Γ Α(2[1ο§β(ΐθ)ΐΌϋ]) аппроксимирует стандартную нормальную переменную в нулевой гипотезе сцепления (Копд, А. апд Сох, N.1. Ат. 1. Нит. Сепе!. 61:1179-88 (1997)). Второе значение Р может быть рассчитано путем сравнения наблюдаемой ΕΟΌ-оценки с его полными данными распределения образца в нулевой гипотезе (например, СидЬ)аг!ззоп е! а1., Ж!. Сепе!. 25:12-3 (2000)).
Когда данные состоят из более чем нескольких семейств, эти два значения Р проявляют тенденцию быть очень похожими.
Определение гаплотипов и гаплотипного блока локуса восприимчивости.
В определенных воплощениях анализ маркера и гаплотипа вовлекает определение локусакандидата на восприимчивость на основе блоков гаплотипа (называемых также 'ΈΌ блоками). Сообщалось о том, что части генома человека могут быть разделены на серии дискретных гаплотипных блоков, включающих несколько общих гаплотипов; для этих блоков данные о нарушении сцепления обеспечивали мало доказательств, указывающих на рекомбинацию (см., например, Аа11 Ι.Ό. апд Ргйсйагд 1.К. Жа!иге Кеу1е^з Сепейез. 6:587-597 (2003); Еа1у, Μ. е! а1., Жа!иге Сепе!. 29:229-232 (2002); Рай1, Ν. е! а1., 8е1епее. 294:1719-1723 (2001); Оа^зоп, Ε. е! а1., Ж!иге. 418:544-548 (2002); РЫШрз, Μ.8. е! а1., ЖШге. Сепе!. 33:382-387 (2003)).
- 12 016397
Существует два основных способа определения этих гаплотипных блоков: блоки могут быть определены как области ДНК, которые имеют ограниченное разнообразие гаплотипов (см., например, Иа1у М. е! а1., На1иге Сепе!. 29:229-232 (2002); РаИ1, N. е! а1., 8с1епсе. 294:1719-1723 (2001); Оа\\ъоп. Е. е! а1., Уинге. 418:544-548 (2002); /апу, К. е! а1., Ргос. №б. Асаб. 8сг И8А. 99:7335-7339 (2002)), или как области между переходными зонами, имеющие большую историческую рекомбинацию, идентифицированную с применением выявлений нарушения сцепления (см., например, СаЬпек 8.В. е! а1., 8с1епсе. 296:2225-2229 (2002); РЫШрк, М.8. е! а1., №!иге Сепе!. 33:382-387 (2003); \\ апа е! а1., Ат. 1. Нит. Сепе!. 71:1227-1234 (2002); 8!итрГ, М.Р., апб Со1бк!еш, Ό.Β. Сигг. Вю1. 13:1-8 (2003)). Как это применяется здесь, термины гаплотипный блок или БЭ блок включают блоки, определенные с помощью любой из двух характеристик.
Репрезентативные способы идентификации блоков гаплотипов приведены выше, например, в опубликованных патентных заявках И8 20030099964, 200330170665, 20040023237 и 20040146870. Блоки гаплотипов могут легко применяться для ассоциации на карте между фенотипов и статусом гаплотипа. Основные гаплотипы могут быть идентифицированы в каждом блоке гаплотипов, а затем может быть идентифицирован набор меченых 8КР или маркеров (самый малый набор 8№ или маркеров, необходимых для различения гаплотипов). Эти меченые 8№ или маркеры могут затем применяться в оценке образцов из группы индивидуумов для идентификации ассоциации между фенотипом и гаплотипом. Если желательно, одновременно могут быть оценены соседние блоки гаплотипов, поскольку может также существовать нарушение сцепления между блоками гаплотипов.
Гаплотипы и диагностика.
Как описано здесь, было обнаружено, что определенные маркеры и гаплотипы, включающие такие маркеры, полезны при определении восприимчивости к диабету II типа, т.е. обнаружено, что они полезны при диагностике восприимчивости к диабету II типа. У индивидуумов с диабетом II типа они обнаруживаются чаще, чем у индивидуумов без диабета II типа. Таким образом, эти маркеры и гаплотипы имеют предсказательное значение для обнаружения диабета II типа или восприимчивости к диабету II типа у индивидуума. Блок гаплотипов (т.е. ЬЭ блок экзона 4 ТСЕ7Ь2), включающий определенные меченые маркеры, может быть обнаружен более часто у индивидуумов с диабетом II типа, чем у индивидуумов без диабета II типа. Таким образом, эти несущие риск меченые маркеры в пределах блока гаплотипов также обладают предсказательной силой для выявления диабета II типа или восприимчивости к диабету II типа у индивидуума. Несущие риск меченые маркеры в пределах гаплотипа или ЬЭ блоков могут также включать другие маркеры, которые проводят различие среди гаплотипов, поскольку они подобным образом имеют предсказательную силу для выявления диабета II типа или восприимчивости к диабету II типа. Вследствие гаплотипной блоковой структуры человеческого генома может быть обнаружено, что большое число маркеров или других вариантов и/или гаплотипов, включающих такие маркеры или варианты, в ассоциации с блоком гаплотипов (ЬЭ блок) ассоциированы с определенной особенностью и/или фенотипом. Таким образом, возможно, что маркеры и/или гаплотипы, находящиеся в пределах ЬЭ блока экзона 4 ТСЕ7Б2, как это определено здесь, или в строгом ЬЭ (характеризуясь г2 более чем 0,2) с ЬЭ блоком экзона 4 ТСЕ7Ь2, ассоциированы с диабетом II типа (т.е. они придают увеличенную или пониженную восприимчивость к диабету II типа). Это включает маркеры, которые описаны здесь (табл. 6), но может также включать другие маркеры, которые находятся в строгом ЬЭ (характеризуясь г2 более чем 0,2) с одним или более маркерами, перечисленными в табл. 6. Идентификация таких дополнительных вариантов может быть достигнута способами, хорошо известными специалисту, например путем секвенирования ДНК ЬИ блока геномной области А у определенной группы индивидуумов, и настоящее изобретение также включает такие дополнительные варианты.
Как это описано здесь, определенные маркеры в пределах ЬИ блока экзона 4 ТСЕ7Б2 обнаруживаются с более низкой частотой у индивидуумов с диабетом II типа, и гаплотипы, включающие два или более таких маркеров, перечисленных в табл. 13, 20 и 21, также обнаруживаются с более низкой частотой у индивидуумов с диабетом II типа. Следовательно, эти маркеры и гаплотипы являются защитными для диабета II типа, т.е. они придают пониженный риск развития диабета II типа для индивидуумов, несущих эти маркеры и/или гаплотипы.
Гаплотипы и маркеры, описанные здесь, являются в некоторых случаях комбинацией различных генетических маркеров, например 8КР и микросателлитов. Таким образом, детектирование гаплотипов может быть проведено способами, известными специалисту и/или описанными здесь для выявления последовательностей в полиморфных участках. Более того, корреляция между определенными гаплотипами или набором маркеров и фенотипом заболевания может быть верифицирована с применением стандартных методов. Репрезентативный пример простого теста для корреляции будет строгий тест Фишера попарно в таблице.
В специфических воплощениях маркер или гаплотип, ассоциированный с ЬИ блоком экзона 4
ТСЕ7Ь2, является таким, в котором маркер или гаплотип наиболее часто представлен у индивидуума с риском для диабета II типа (подверженные заболеванию) по сравнению с частотой его присутствия у здорового индивидуума (контроль), где присутствие маркера или гаплотипа является индикатором диабета II типа или восприимчивости к диабету II типа. В других воплощениях меченые маркеры, несущие
- 13 016397 риск заболевания, в ЬН с одним или более маркерами, ассоциированными с ЬЭ блоком экзона 4 ТСР7Б2, являются мечеными маркерами, которые наиболее часто представлены у индивидуумов с риском диабета II типа (подверженные заболеванию) по сравнению с частотой его присутствия у здорового индивидуума (контроль), где присутствие меченого маркера или гаплотипа является индикатором повышенной восприимчивости к диабету II типа. В дополнительном воплощении маркеры риска в ЬН с одним или более маркерами, ассоциированными с ЬЭ блоком экзона 4 ТСР7Б2, являются маркерами, которые наиболее часто представлены у индивидуума с риском диабета II типа по сравнению с частотой их присутствия у здорового индивидуума (контроль), где присутствие маркеров является индикатором восприимчивости к диабету II типа.
В определенных способах, описанных здесь, индивидуум, который имеет риск развития диабета II типа, представляет собой индивидуума, у которого идентифицирован маркер риска. В одном воплощении сила ассоциации маркера или гаплотипа измеряется относительным риском (ВВ). ВВ является соотношением долей состояния у субъектов, которые несут одну копию маркера или гаплотипа, и долей состояния у субъектов, которые не имеют такой маркер или гаплотип. Это соотношение эквивалентно соотношению доли состояния среди субъектов, которые несут две копии маркера или гаплотипа к доле состояния у субъектов, которые несут одну копию маркера или гаплотипа. В одном воплощении маркер или гаплотип имеет ВВ по меньшей мере 1,2. В другом воплощении маркер или гаплотип имеет ВВ по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 2,0, по меньшей мере 2,5, по меньшей мере 3,0, по меньшей мере 3,5, по меньшей мере 4,0 или по меньшей мере 5,0.
В других способах изобретения индивидуум, который имеет пониженный риск (или пониженную восприимчивость) диабета II типа, является индивидуумом, у которого идентифицирован защитный маркер или гаплотип. В таких случаях ВВ составляет менее чем 1,0. В одном воплощении маркер или гаплотип имеет ВВ менее чем 0,9. В других воплощениях маркер или гаплотип имеет ВВ менее чем 0,8, менее чем 0,7, менее чем 0,6, менее чем 0,5, менее чем 0,4.
Полезность генетического тестирования.
Знание о генетическом варианте, который несет риск развития диабета II, открывает возможность генетического тестирования для разграничения между индивидуумами с повышенным риском развития заболевания (т.е. несущих вариант риска) и теми, кто имеет пониженный риск развития заболевания (т.е. несет защитный вариант). Основным достоинством генетического тестирования для индивидуумов, принадлежащих к обеим упомянутым выше группам, являются возможности диагностики заболевания на ранней стадии и обеспечение информации для клиницистов о прогнозе/агрессивности заболевания, для того чтобы быть способными применить наиболее подходящее лечение. Например, применение генетического теста для диабета II типа может обеспечить возможность детекции заболевания на ранней стадии, которое может привести к использованию терапевтических мер на ранней стадии и, таким образом, может минимизировать неблагоприятные эффекты симптомов и серьезные последствия для здоровья, характерные для диабета II типа.
Способы терапии.
В другом воплощении изобретения могут быть применены способы лечения диабета II типа. Термин лечение, как он применяется здесь, относится не только к облегчению симптомов, ассоциированных с диабетом II типа, но также к предотвращению или задержке начала диабета II типа; к снижению тяжести или частоты симптомов диабета II типа и/или к снижению также потребности в сопутствующей терапии другими лекарствами, которые облегчают симптомы, ассоциированные с диабетом II типа. В одном аспекте индивидуум, который лечится, является индивидуумом, который восприимчив (имеет повышенный риск), диабета II типа (например, индивидуум, у которого присутствуют аллели, иные, чем 0 аллель в маркере ЭС108478. присутствует Т аллель в 8ΝΡ г§ 12255372, присутствует А аллель в 8ΝΡ Г87895340, присутствует С аллель в 8ΝΡ Щ11196205, присутствует С аллель в 8ΝΡ г§7901695, присутствует Т аллель в 8ΝΡ г§7903146, присутствует С аллель в 8ΝΡ г§ 12243326 или присутствует Е аллель в 8ΝΡ Г84506565.
В дополнительном воплощении изобретения могут быть применены способы лечения других заболеваний или состояний, ассоциированных с ТСР7Б2. Терапевтический агент ТСР7Б2 может применяться как в способах лечения диабета II типа, так и в способах лечения других заболеваний или состояний, ассоциированных с ТСР7Б2.
В способах лечения (профилактических и/или терапевтических) применяется терапевтический агент ТСР7Б2. Терапевтический агент ТСР7Б2 представляет собой агент, который изменяет (например, усиливает или ингибирует) активность полипептида и/или экспрессию нуклеиновой кислоты ТСР7Б2, непосредственно или непрямым способом (например, путем изменения активности экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, взаимодействующий с ТСР7Б2, такой как белок в ОТи! сигнальном пути или в кадгериновом сигнальном каскаде (например, β-катенина)). В определенных воплощениях терапевтический агент ТСР7Б2 изменяет активность и/или экспрессию нуклеиновой кислоты ТСР7Б2.
- 14 016397
Терапевтический агент ТСР7Ь2 может изменять активность полипептида ТСР7Ь2 или экспрессию нуклеиновой кислоты различными способами, такими как, к примеру, обеспечение дополнительного полипептида ТСР7Ь2 или путем активации регуляции транскрипции или трансляции нуклеиновой кислоты ТСР7Ь2; путем изменения посттрансляционного процессинга полипептида ТСР7Ь2; путем изменения транскрипции сплайсированных вариантов ТСР7Ь2 или путем вмешательства в активность полипептида ТСР7Ь2 (например, путем связывания с полипептидом ТСР7Ь2) или путем связывания с другим полипептидом, который взаимодействует с ТСР7Ь2, путем изменения (например, путем обратной регуляции) экспрессии, транскрипции или трансляции нуклеиновой кислоты ТСР7Ь2 или путем изменения (например, агонистами или антагонистами) активности.
Репрезентативные терапевтические агенты ТСР7Ь2 включают следующее: нуклеиновые кислоты или фрагменты или производные этого, описанные здесь, определенные нуклеотиды, кодирующие полипептиды, описанные здесь, и векторы, включающие такие нуклеиновые кислоты (например, ген, кДНК и/или мРНК, кодирующие полипептид ТСР7Ь2 или активный фрагмент, или производное этого; или олигонуклеотид, или дополнительный по отношению к нему, или фрагмент, или производное этого, и/или сплайсированные варианты, кодирующие нуклеиновую кислоту диабета II типа; или фрагменты, или производные этого); полипептиды, описанные здесь, и/или сплайсированные варианты, кодируемые нуклеиновой кислотой ТСР7Ь2, или фрагменты, или производные этого; другие полипептиды (например, рецепторы ТСР7Ь2); агенты, связывающие ТСР7Ь2, или агенты, которые влияют (например, увеличивают или уменьшают) на активность, антитела, такие как антитело на неизмененный полипептид ТСР7Ь2 или антитело против определенного сплайсированного варианта, кодируемого нуклеиновой кислотой ТСР7Ь2, как описано выше; имитаторы пептида, слитые белки или пролекарства, рибозимы, другие малые молекулы и другие агенты, которые изменяют (например, усиливают или ингибируют) экспрессию нуклеиновой кислоты ТСР7Ь2, или которые регулируют транскрипцию сплайсированных вариантов ТСР7Ь2 (например, агенты, которые влияют на то, какой из сплайсированных вариантов экспрессируется), или которые влияют на количество каждого сплайсированного варианта, который экспрессируется. Дополнительные репрезентативные терапевтические агенты ТСР7Ь2 включают соединения, которые влияют на сигнальный каскад инсулина и/или глюкагона, СЬР-1 или ОГР сигнальные пути. Если желательно, одновременно может применяться более чем один терапевтический агент ТСР7Ь2.
В предпочтительных воплощениях терапевтический агент ТСР7Ь2 представляет собой агент, который мешает проявлению активности ТСР7Ь2, такой, к примеру, как агент, который мешает связыванию или взаимодействию ТСР7Ь2 с бета-катенином (см., например, Разойш, е! а1., I. Вю1. СНет. 278(23):21092-21096 (2003)) или с другими белками. Другие терапевтические агенты ТСР7Ь2 включают агенты, которые влияют на сигнальный путь \Упк или агенты, которые влияют на кадгериновый сигнальный каскад. Репрезентативные агенты включают агенты, такие как те, что применяются в терапии рака, белки, такие как ΌΚΚ белки; бета-катенинсвязывающий домен АРС или аксин; факторы, такие как ГОАХ, АХАМ и [САТ; антисенс олигонуклеотиды или интерферирующая РНК (РНК-ί), такие как с применением Уйгауек онколитические вирусные векторы и другие соединения (см., к примеру, Ьии, е! а1., Сиггеи! Сапсег Эгид Тагде!. 4:6530671 (2004)); малые молекулы антагонистов, включающие, например, ΖΊΜ00990, РКР118-310, РКР118-584, РКР22-815, СОРО49090, ΝΡΌΌ639.024 и ΝΡΌΌ61.024, как описано у Ьероигсе1е! е! а1. (см., к примеру, Ьероигсе1е! е! а1., Сапсег Са11. 5:91-102 (2004)); соединения, описанные в патенте И8 6762185, соединения, описанные в заявках на патент И8 200400053136, 20040072831, 20040247593 или 20050059628. Другие репрезентативные терапевтические агенты ТСР7Ь2 включают ингибиторы дзк3, включая, к примеру, таковые, описанные в патентах И8 6057117, 6153618, 6417185, 6465231, 6489344, 6512102, 6608063, 6716624, 6800632 и опубликованных заявках на патенты И8 200300088866, 20030077798, 20030130289, 20030207883, 1000092535 и 200500851. Все описанное в этих ссылках, патентах и заявках на патенты повторно цитируется в Спецификации и включено сюда в их целостности.
- 15 016397
Дополнительные репрезентативные терапевтические агенты ТСР7Б2 показаны в таблице агентов. Таблица агентов
Название соединения Название соединения (созданное с помощью АШопот, 1818 Огаду версии 2,5 от МОЬ ЫТогтабоп 8у81етз) Компания Ссылка на соединение Показания
АК-0133418 (8Ν-4521 1 -(4-Метокси-бензил-З(5 -нитротиазо-2-ил)мочевина Аз&а/епеса АО
АК-025028 Νδϋ Аз1га7епеса
СТ-98023 Ν- [4(2,4-дихлорофенил)-5-(1Нимидазол-2-ил)пиримидин-2-ил]-№-(5нитро-пиридин-2-ил)этан-1,2-диамин СЫгоп Согр Инсулиннезависимый диабет
СТ-20026 N80 СЫгоп Согр ’ХУадтап е+ а1., Сил. РНагт. ϋβδ 2004:10(10)1 105-37 Инсулиннезависимый диабет
СТ-21022 Νδϋ СЫгоп Согр Инсулиннезависимый диабет
СТ-20014 Ν8ϋ СЫгоп Согр Инсулиннезависимый диабет
СТ-21018 Ν8ϋ СЫгоп Согр Инсулиннезависимый диабет
СН1К-98025 Νδϋ . СЫгоп Согр Инсулиннезависимый диабет
- 16 016397
СН1К.-99021 Ν8ϋ СЫгоп Согр \7а§тап е! а1., Сигг. РЬапп. Оез 2004:10(10)1 105-37 Инсулиннезависимый диабет
СО-100179 Ν8ϋ Сгуз!а1 бепописз апб Уиуи ΨΟ- 2004065370 Сахарный диабет (Корея)
4-[2-(4-диметидамино- 3-нитрофениламино)пиримидин-4-ил]-3,5диметил-1 Н-пиррол-2карбонитрил Сус1асе1 Ш Инсулиннезависимый диабет среди Других
ΝΡ-01139, ΝΡ-031112, ΝΡ-03112, ΝΡ-036, 4-бензил-2-метил- [ 1,2,4]тиадиазолидин- 3,5-дион ЦеигорЬагта 8А Расстройства ЦНС, Αϋ
3-[9-фтор-2- (пиперидин-1карбонил)-1,2,3,4тетрагидро[1,4]диазепи но [6,71 -хи]индол-7-ил]-4имидазо[ 1,2-а]пиридин- 3 -ил-пиррол-2,5-дион Ε1Ϊ ЫИу&Со Инсулиннезависимый диабет
ΟΨ-784752Χ, ΟΨ-784775, 8В-216763, 8В-415286, Циклопентанкарбоновой кислоты (6- пиридин-3-ил-фуро[2,3<б]пиримидин-4-ил)амид О8К ΨΌ-0302447 (ссылка на соединение 4-[2- (бромфенил)4-(4-фтор фенил)- 1Нимидазол-5ил)пиридин Инсулиннезависимый диабет, нейродегенеративные заболевания
NN0-57-0511, NN0-57-0545, NN0-57-0588 1 -(4-амино-фуразан-Зил)-5 -пиперидин-1 илметил-1Н[1,2,3]триазол-4карбоновой кислоты [ 1 -пиридин-4-ил-мет(Е)-илиден]-гидразид Νονο Νοτάΐδΐί Инсулиннезависимый диабет
СР-70949 Νδϋ Ρβζετ Гипогликемический агент
УХ-608 Ν8ϋ Цереброваскулярная ишемия, Инсулиннезависимый диабет
Класс КР-403 Ν8Ό Кте1ек Модулятор ядерного фактора каппа В, противовоспали-
тельный, ингибитор клеточного цикла, ингибитор киназы-3 гликогенсинтазы
ΒΥΕΤΤΑ (экзенамид) Эксенамид: Обо8 Аминокислотная последовательность: Н-Н1з-С1у-С1и-С1у-ТЬг- Рйе-Тйг-8ег-Азр-Ьеи8ег-Ьуз-С1п-Ме!-Сг1иО1и-С1и-А1а-V а1-Аг§Ьеи-Рйе-Пе-СНи-ТгрЬеи-Ьуз-Азп-СНу-СНуРго-8ег-8ег-О1у-А1аРго-Рго-Рго-Зег-ИНг АтуНп/ЕИ ЬШу&Со Инсулиннезависимый диабет
У1Ма§Нрйп (БАГ237) Ν8ϋ Ыоуагбз Инсулиннезависимый диабет, ингибитор ΏΡΡ-4
Ν8Ώ = структура не раскрыта (в М4Ъ3).
- 17 016397
Терапевтический(е) агент(ы) ТСР7Й2 вводится в терапевтически эффективном количестве (т.е. в количестве, которое достаточно для лечения, как описано выше). Количество, которое будет терапевтически эффективным при лечении определенного индивидуального расстройства или состояния, будет зависеть от симптомов и тяжести заболевания и может быть определено стандартными клиническими методами. Кроме того, необязательно могут применяться анализы ίη У1!го или ίη у1уо, чтобы помочь идентифицировать оптимальные диапазоны дозировки. Точная доза, применяемая в формулировке, будет также зависеть от пути введения и серьезности заболевания или расстройства и должна быть выбрана в соответствии с решением практикующего врача и состоянием каждого пациента. Эффективные дозировки могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных на тест-системах ίη νίΙΐΌ или на животных моделях.
В одном воплощении могут применяться нуклеиновая кислота, например нуклеиновая кислота, кодирующая ТСР7Й2 полипептид, или другая нуклеиновая кислота, которая кодирует полипептид ТСР7Й2 или сплайсированный вариант, производное или фрагмент этого, одна или в фармацевтической композиции, как описано выше. Например, ген ТСР7Й2, или нуклеиновая кислота, или кДНК, кодирующая ТСР7Й2 полипептид, сама по себе или включенная в вектор, могут быть введены в клетки (ίη уйго или ίη У1уо), так что клетки производят нативный полипетид ТСЕ7Й2. Если необходимо, клетки, которые были трансформированы геном или кДНК или вектором, включающим ген, нуклеиновую кислоту или кДНК, могут быть введены (или введены повторно) индивидууму, подверженному заболеванию. Таким образом, клетки, у которых в природе отсутствует нативная экспрессия и активность ТСР7Й2 или которые имеют измененную экспрессию или активность ТСР7Й2 либо имеют экспрессию сплайсированного варианта ТСР7Й2, ассоциированного с заболеванием, могут быть сконструированы для экспрессии полипептида ТСР7Й2 или активного фрагмента полипептида ТСР7Й2 (или отличающегося варианта ТСР7Й2). В определенных воплощениях нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид ТСР7Й2, или активный фрагмент, или производное этого могут быть введены в экспрессионный вектор, такой как вирусный вектор, а вектор может быть введен в подходящие клетки животного. Могут быть применены другие переносящие ген системы, включая вирусные и невирусные системы транспорта. Альтернативно, могут применяться также невирусные способы транспорта генов, такие как совместная преципитация с фосфатом кальция, механические методы (например, микроинъекции); опосредованный слиянием с мембранами транспорт с помощью липосом; прямое поглощение ДНК.
Альтернативно, в другом воплощении изобретения нуклеиновая кислота изобретения; нуклеиновая кислота, комплементарная нуклеиновой кислоте изобретения, или часть такой нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотид, как описано ниже) могут быть применены в антисенс-терапии, в которой нуклеиновая кислота (например, олигонуклеотид), которая специфически гибридизуется с мРНК и/или геномной ДНК гена диабета II типа вводится или производится ίη кйи. Антисенс-нуклеиновая кислота, которая специфически гибридизуется с мРНК и/или геномной ДНК, ингибирует экспрессию полипепти-а ТСР7Й2, например, путем ингибирования трансляции или транскрипции. Связывание антисенс= нуклеиновой кислоты может осуществляться за счет комплементарности традиционных пар оснований или, к примеру, в случае связывания дуплекса ДНК может осуществляться через специфическое взаимодействие в большой борозде двойной спирали.
Антисенс-конструкт настоящего изобретения может доставляться, например, как экспрессионная плазмида, как описано выше. Когда плазмида транскрибируется в клетке, она производит РНК, которая комплементарна части мРНК и/или ДНК, которая кодирует полипептид ТСР7Й2. Альтернативно, антисенс-конструкт может быть олигонуклеотидным зондом, который производится ех у1уо и вводится в клетки; затем он ингибирует экспрессию путем гибридизации с мРНК и/или геномной ДНК полипептида. В одном воплощении олигонуклеотидный зонд модифицируется олигонуклеотидами, которые резистентны к эндогенным нуклеазам, например экзонуклеазам и/или эндонуклеазам, таким образом сохраняя их стабильными ίη у1уо. Типичными молекулами нуклеиновой кислоты для применения в качестве антисенс-олигонуклеотидов являются фосфорамидатные, фосфотиоатные и метилфосфонатные аналоги ДНК (см. также патенты И8 5176996, 5264564 и 5256775). Дополнительно общепринятым подходом к конструированию олигомеров, полезных при антисенс-терапии, являются также описанные, например, у Vаη бег Кго1 е! а1. (Вю1есйшс.|иек. 6:958-976 (1988)) и у 8!еш е! а1. (Самсет Кек. 48:2659-2668 (1988)). По отношению к антисенс-ДНК предпочтительными являются олигодезоксирибонуклеотиды, происходящие из сайта инициации трансляции.
Для осуществления антисенс-терапии конструируются олигонуклеотиды (мРНК, кДНК или ДНК), которые являются комплементарными к мРНК, кодируемой геном ТСР7Й2. Антисенс-олигонуклеотиды связываются с транскриптами мРНК ТСР7Й2 и предотвращают трансляцию. Абсолютная комплементарность, хотя и является предпочтительной, не требуется. Последовательность, комплементарная части РНК, как это называется здесь, показывает, что последовательность имеет достаточную комплементарность, чтобы быть способной гибридизоваться с РНК, образуя стабильный дуплекс; в случае двутяжной антисенс-нуклеиновой кислоты единственная нить дуплекса ДНК может быть тестирована таким образом, или может быть проанализировано образование триплекса. Способность гибридизоваться будет зависеть как от степени комплементарности, так и от длины молекулы антисенс-нуклеиновой кислоты, как
- 18 016397 подробно описано выше. В основном. чем длиннее гибридизуемая нуклеиновая кислота. тем больше оснований. являющихся некомплементарными с РНК. она может включать и все еще образовывать стабильный дуплекс (или триплекс. в случае. если он существует). Специалист может выявить степень толерантности неспаривания путем применения стандартных процедур.
Олигонуклеотиды. применяемые в антисенс-терапии. могут быть ДНК. РНК или химерными смесями или производными либо модифицированными версиями этого. одноцепочечными или двуцепочечными. Олигонуклеотиды могут быть модифицированы по основаниям. сахарам или фосфатному скелету. например. для увеличения стабильности молекулы. гибридизации и т.д. Олигонуклеотиды могут включать другие прикрепленные группы. такие как пептиды (например. для направления их к рецепторам клетки-хозяина ίη у1уо) или агенты. облегчающие транспорт через клеточную мембрану (см.. например. Ье151пдег е! а1.. Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А. 86:6553-6556 (1989); Ьетабге е! а1.. Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А. 84:648-652 (1987); Международная публикация РСТ: №0 88/09810) или через гематоэнцефалический барьер (см.. например. Международную публикацию РСТ №0 89/10134). или запускаемые гибридизацией расщепляющие агенты (см.. например. Кго1 е! а1.. Вю1ес11шс.|ие5. 6:958-976 (1988)). или встраиваемые в ДНК агенты. (См.. например. 2оп. РНагш. Кее. 5:539-549 (1988)). Наконец. олигонуклеотиды могут быть конъюгированы с другими молекулами (например. пептидом. запускаемым гибридизацией кросссшивающим агентом. транспортирующим агентом. запускаемым гибридизацией расщепляющим агентом).
Антисенс-молекулы доставляются к клеткам. которые экспрессируют ТСЕ7Б2 ίη у1уо. Для доставки антисенс-ДНК или РНК в клетки может быть использован ряд способов. например антисенс-молекулы могут быть инъецированы непосредственно в участок ткани. или модифицированные антисенсмолекулы. сконструированные так. чтобы направляться в желаемые клетки (например. антисенсмолекулы связывают с петидами или антителами. которые специфически связываются с рецепторами или антигенами. экспрессируемыми на поверхности клетки-мишени). могут быть введены системно. Альтернативно. в предпочтительном воплощении применяется рекомбинантный ДНК-конструкт. в котором антисенс-олигонуклеотид помещен под контролем сильного промотора (например. ро1 III или ро1 II). Применение такого конструкта для транспорта к клеткам-мишеням у пациента приводит к транскрипции достаточных количеств одноцепочечной РНК. которая будет образовывать комплементарные пары оснований с эндогенным транскриптом ТСЕ7Б2 и таким образом предотвращать трансляцию мРНК ТСЕ7Б2. Например. ίη у1уо может быть введен такой вектор. который аккумулируется клеткой и направляет транскрипцию антисенс-РНК. Такой вектор может оставаться эписомальным или интегрироваться в хромосомы до тех пор. пока он может быть транскрибирован для получения желаемой антисенс-РНК. Такие векторы могут быть сконструированы с применением технологий рекомбинантной ДНК. стандартных для отрасли и описанных выше. Например. плазмида. космида. УАС или вирусный вектор могут применяться для приготовления рекомбинантного конструкта ДНК. который может быть введен непосредственно в участок ткани. Альтернативно. могут применяться вирусные векторы. которые избирательно инфицируют желаемую ткань. в этом случае введение может быть выполнено другим путем (например. системно).
Эндогенная экспрессия полипептида ТСЕ7Б2 может быть также снижена путем инактивации или нокаута гена. нуклеиновой кислоты или его промотора с применением направленных гомологичных рекомбинаций (например. см. 8тйЫев е! а1.. №Ш1ге. 317:230-234 (1985); ТЬотав & СарессЫ. Се11. 51:503512 (1987); ТНотрвои е! а1.. Се11. 5:313-321 (1989)). Например. могут быть применены измененный нефункциональный ген или нуклеиновая кислота (или полностью неродственная последовательность ДНК). фланкированная ДНК. гомологичная эндогенному гену или нуклеиновой кислоте (кодирующими или регуляторными областями нуклеиновой кислоты) с или без маркера для селекции и/или негативного маркера для селекции. для трансфицирования клеток. которые экспрессируют ген или нуклеиновую кислоту ίη у1уо. Встраивание ДНК-конструкта путем направленной гомологичной рекомбинации приводит к инактивации гена или нуклеиновой кислоты. Рекомбинантные ДНК-конструкты могут быть введены непосредственно или направлены к нужному участку ίη у1уо с применением подходящих векторов. как описано выше. Альтернативно. экспрессия неизмененных генов или нуклеиновых кислот может быть увеличена с применением подобного способа: для встраивания ДНК-конструкта. включающего неизмененный функциональный ген или нуклеиновую кислоту в месте измененного ТСЕ7Б2 в клетке. может быть применена направленная гомологичная рекомбинация. как это описано выше. В другом воплощении направленная гомологичная рекомбинация может применяться для встраивания ДНК-конструкта. включающего нуклеиновую кислоту. которая кодирует вариантный полипептид диабета II типа. который отличается от представленного в клетке.
Альтернативно. экспрессия эндогенной нуклеиновой кислоты ТСЕ7Б2 может быть снижена путем направления дезоксирибонуклеотидных последовательностей. комплементарных к регуляторной области нуклеиновой кислоты ТСЕ7Б2 (т.е. к промотору или энхансерам ТСЕ7Б2). для формирования тройных спиральных структур. которые предотвращают транскрипцию нуклеиновой кислоты ТСЕ7Б2 в клеткахмишенях организма (см. в основном Не1еие. С.. Айкатет Огид Оев.. 6(6):569-84 (1991); Не1еие. С.. е! а1..
Агт. Ν.Υ. Асаб. 8сг 660:27-36 (1992) и МаЬег. Ь.Р Вюаввау. 14(12):807-15 (1992)). Подобным образом
- 19 016397 антисенс-конструкты, описанные здесь, за счет антагонизма с нормальной биологической активностью одного из белков ТСР7Й2 могут применяться в манипуляциях с тканью, например в дифференциации ткани, как ίη νίνο, так и ех νίνο в культурах ткани.
Дополнительно антисенс-методы (например, микроинъекция антисенс-молекул или трансфекция плазмидами, транскрипты которых являются антисенс-молекулами по отношению к мРНК гена диабета II типа или к последовательности гена) могут применяться для исследования роли ТСР7Й2 или взаимодействия ТСР7Й2 и связывающих его агентов в процессе развития, а также в нормальном функционировании ТСР7Й2 в клетке, или взаимодействия ТСР7Й2 и связывающих его агентов с тканью взрослых. Такие методы могут применяться на культуре клеток, но могут также применяться в создании трансгенных животных.
Еще в одном воплощении изобретения в обработке гена диабета II типа могут также применяться другие ТСР7Й2 терапевтические агенты, как те, что описаны здесь.
Терапевтические агенты могут доставляться в композиции, как описано выше, или сами по себе. Они могут вводиться системно или могут быть направлены в определенную ткань. Терапевтические агенты могут быть получены различными способами, включая химический синтез; рекомбинантную продукцию; продукцию ίη νίνο (например, в трансгенных животных, таких как в патенте И8 4873316 Меабе е! а1.), и могут быть изолированы с применением стандартных способов, таких как описанные выше.
Могут также применяться комбинации любых из описанных выше способов (например, введение неизмененных полипептидов в сочетании с антисенс-терапией, направляющей измененную мРНК ТСР7Й2; введение первого сплайсированного варианта, кодируемого нуклеиновой кислотой ТСР7Й2 в сочетании с антисенс-терапией, направленной доставкой второго сплайсированного варианта, кодируемого нуклеиновой кислотой ТСР7Й2).
Способы оценки вероятности ответа на терапевтические агенты ТСР7Й2.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способам оценки вероятности ответа индивидуума на терапевтический агент ТСР7Й2. В способах оцениваются маркеры или гаплотипы, относящиеся к ТСР7Й2 гену, как это описано выше в отношении к оценке индивидуума на восприимчивость к диабету II типа. Присутствие аллеля, маркера, 8ΝΡ или гаплотипа, ассоциированного с восприимчивостью (повышенным риском) к диабету II типа (например, аллеля, иного, чем 0 аллель в маркере ОС108478, Т аллель в 8ΝΡ Г812255372, А аллель в 8ΝΡ г§7895340, С аллель в 8ΝΡ Щ11196205, С аллель в 8ΝΡ г§7901695, Т аллель в 8ΝΡ г§7903146, С аллель в 8ΝΡ г§12243326 и Т аллель в 8ΝΡ г§4506565; маркера, ассоциированного с Й-Ό блоком экзона 4 ТСР7Й2, такого как гаплотип риска, ассоциированный с Й-Ό блоком экзона 4 ТСР7Й2), является индикатором вероятности положительного ответа на терапевтический агент ТСР7Й2. Вероятность положительного ответа показывает, что индивидуум наиболее вероятно имеет положительный ответ на терапевтический агент ТСР7Й2, чем индивидуум, не имеющий такого аллеля, маркера, 8ΝΡ или гаплотипа, ассоциированных с восприимчивостью (повышенным риском) к диабету II типа, как описано здесь. Положительный ответ на терапевтический агент ТСР7Й2 является физиологическим ответом, который служит признаком лечения диабета II типа. Как описано выше, лечение относится не только к облегчению симптомов, ассоциированных с диабетом II типа, но также к предотвращению или задержке начала диабета II типа; уменьшение тяжести или частоты симптомов диабета II типа и/или также снижение потребности в сопутствующей терапии другими лекарствами, которые облегчают симптомы, ассоциированные с диабетом II типа.
Фармацевтические композиции.
Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, включающим агенты, которые изменяют активность ТСР7Й2, или которые другим способом влияют на \Уп1 сигнальный каскад илина кадгериновый сигнальный путь, или которые могут применяться как ТСР7Й2 терапевтические агенты. Фармацевтические композиции могут быть составлены с физиологически приемлемым носителем или эксципиентом для приготовления фармацевтической композиции. Носитель и композиция могут быть стерильными. Композиции должны соответствовать способу введения.
Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются этим, воду, солевые растворы (например, ЫаС1), буферно-солевые растворы, спирты, глицерин, этанол, гуммиарабик, растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, углеводы, такие как лактоза, амилоза или крахмал, дестроза, стеарат магния, тальк, кремниевая кислота, вязкий парафин, парфюмерное масло, сложные эфиры жирных кислот, гидроксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон и т.д., а также комбинации этого. Если желательно, то фармацевтические препараты могут быть смешаны со вспомогательными агентами, например смазочными агентами, консервантами, стабилизаторами, увлажняющими агентами, эмульгаторами, солями для воздействия на осмотическое давление, буферами, красителями, вкусовыми и/или ароматическими веществами и подобным, которые не реагируют вредным образом с активными агентами.
- 20 016397
Если желательно, композиции могут также включать минорные количества увлажняющих или эмульсифицирующих агентов или агентов, забуферивающих рН. Композиция может быть жидким раствором, суспензией, эмульсией, таблеткой, пилюлей, капсулой, формулировкой с пролонгированным освобождением или порошком. Композиция может быть составлена как суппозиторий с традиционными связывающими агентами и носителями, такими как триглицериды. Пероральные композиции могут включать стандартные носители, такие как фармацевтической чистоты маннитол, лактоза, крахмал, стеарат магния, поливинилпирролидоны, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т. д.
Способы введения этих композиций включают, но не ограничиваются этим, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутриглазной, внутривенный, подкожный, локальный, пероральный или интраназальный. Другие подходящие способы введения могут включать также генную терапию (как описано ниже), перезаряжаемые или биодеградируемые устройства, устройства, обеспечивающие ускорение частиц (генный пистолет), и медленно освобождающие вещество полимерные устройства.
Фармацевтическая композиция этого изобретения может быть также введена как часть комбинационной терапии с другими агентами.
Композиции могут быть составлены в соответствии с обычными процедурами, как фармацевтические композиции, адаптированные для введения людям. Например, композиции для внутривенного введения типично являются растворами в стериальных изотонических буферах на водной основе. Где это необходимо, композиция может также включать солюбилизирующий агент и локальный анестетик для снижения боли в месте инъекции. В основном ингредиенты поставляются либо отдельно, либо в смешанном виде в единичной форме дозировки, например, как сухой лиофилизированный порошок или свободный водный концентрат в герметически запечатанном контейнере, таком как ампула или саше с указанием количества активного агента. Там, где композиция вводится путем инфузии, она может быть суспендирована в инфузионной бутылочке, включающей стерильную воду фармацевтической чистоты, солевой раствор или смесь дектроза/вода. Там, где композиция вводится путем инъекции, может быть обеспечена ампула со стерильной водой для инъекций или солевым раствором, так что ингредиенты могут быть смешаны до введения.
Для локального введения могут применяться нераспыляемые формы, от вязких до полутвердых или твердых форм, включающих носитель, совместимый с локальным применением и имеющим динамическую вязкость, предпочтительно большую, чем вода. Подходящие композиции включают, но не ограничиваются этим, растворы, эмульсии, кремы, мази, порошки, клизмы, примочки, золи, линименты, бальзамы, аэрозоли и т. д., которые по желанию стерилизуются или смешиваются со вспомогательными агентами, например консервантами, стабилизаторами, увлажняющими агентами, буферами или солями для воздействия на осмотическое давлении и т. д. Агент может быть включен в косметическую композицию. Для локального введения подходящими являются также распыляемые аэрозольные препараты, где активный ингредиент, предпочтительно в комбинации с твердым или жидким инертным носителем упаковывается в запрессованную бутылочку или смешивается с прессуемым летучим веществом, обычно газообразной сжатой в баллончике жидкостью, например со сжатым воздухом.
Агенты, описанные здесь, могут быть сформулированы как нейтральные солевые формы. Фармацевтически приемлемые соли включают те, которые образуются со свободными аминогруппами, такие как происходящие из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и тех, что образуются со свободными карбоксильными группами, такие как происходящие из гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.
Агенты вводятся в терапевтически эффективном количестве. Количество агентов, которое будет терапевтически эффективным, частично зависит от природы расстройства и/или степени симптомов и может быть определено стандартными химическими способами. Кроме того, необязательно могут быть сделаны анализы ίη νίίτο и ίη νίνο с тем, чтобы помочь идентифицировать оптимальные интервалы дозировок. Точная доза для применения в композиции будет также зависеть от способа введения и серьезности симптомов и должна быть определена в соответствии с решением практикующего врача и обстоятельствами болезни каждого пациента. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных на тест-системах ίη νίίτο или на животных моделях.
Изобретение обеспечивает также фармацевтическую упаковку или набор, включающие один (или более) контейнер, заполненный одним (или более) ингредиентом фармацевтических композиций изобретения. Необязательно в наборе с таким контейнером(и) может быть уведомление в форме предписанных государственным агентством правил, регулирующих производство, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, это уведомление отражает разрешение, данное агентством на применение или продажу для введения людям. Упаковка или набор могут быть снабжены информацией относительно способа введения, последовательности введения лекарств (например, отдельно, последовательно или одновременно) или подобной информацией. Упаковка или набор могут также включать средства напоминания пациенту о принятии лекарства. Упаковка или набор могут быть стандартной дозировкой комбинационной терапии или они могут содержать множество стандартных дозировок. В частности, агенты могут быть разделены, смешаны вместе в любой комбинации, представлены в одном пузырьке
- 21 016397 или таблетке. Агенты, смонтированные в блистерной упаковке, или другие средства дозирования являются предпочтительными. Для целей этого изобретения стандартная дозировка означает дозировку, которая зависит от индивидуальной фармакодинамики каждого агента и вводится в одобренных ΕΌΑ дозировках в виде стандартных временных режимов.
Скрининг-анализы и идентифицированные таким образом агенты.
Изобретение обеспечивает также способы идентификации агентов (например, слитых белков, полипептидов, имитаторов пептидов, пролекарств, рецепторов, связывающих агентов, антител, малых молекул или других лекарственных средств, или рибозимов), которые изменяют (например, увеличивают или уменьшают) активность ТСЕ7Б2, которые другим образом взаимодействуют с ТСЕ7Б2 или с другим членом \Уп1 сигнального каскада или кадгеринового сигнального каскада (например, бета-катенин). К примеру, в определенных воплощениях такие агенты могут быть агентами, которые связываются с ТСЕ7Б2, которые производят стимулирующее или ингибирующее воздействие, например на активность ТСЕ7Б2; или которые изменяют (например, усиливают или ингибируют) способность ТСЕ7Б2 взаимодействовать с другими членами \Уп1 сигнального пути или с членами кадгеринового сигнального пути, или которые изменяют посттрансляционный процессинг ТСЕ7Б2. В других воплощениях такие агенты могут быть агентами, которые изменяют активность или функцию \¥п1 сигнального каскада или кадгеринового сигнального пути.
В одном воплощении изобретение обеспечивает анализы для скрининга кандидатов или тестовых агентов, которые связываются с или модулируют активность белка ТСЕ7Б2 (или биологически активных частей этой молекулы), а также агенты, идентифицируемые этим анализом. Тестируемые агенты могут быть получены с применением любого из многочисленных подходов методами комбинаторной библиотеки, известными специалисту, включая биологические библиотеки; библиотеки, пространственно расположенные параллельно твердой фазе или жидкой фазе; способы создания синтетических библиотек, требующие деконволюции; метод библиотек одна бусина-одно соединение) и методы синтетической библиотеки с применением селекции путем аффинной хроматографии. Подход с применением биологической библиотеки ограничен полипептидными библиотеками, в то время как другие четыре подхода применимы к полипептидам, непептидным олигомерам или библиотекам малых молекул (Ьат, К.З., АпЕсапсег Эгид Цез. 12:145 (1997)).
В одном воплощении для идентификации агентов, которые изменяют активность ТСЕ7Б2, клетка, клеточный лизат или раствор, включающий или экспрессирующий ТСЕ7Б2, или фрагмент, или производное этого, может контактировать с тестируемым агентом; альтернативно, белок может контактировать непосредственно с тестируемым агентом. Оценивается уровень (количество) активности ТСЕ7Б2 (например, измеряется уровень (количество) активности ТСЕ7Б2 либо непосредственно, либо непрямым способом) и сравнивается с уровнем активности в контроле (т.е. с уровнем активности белка ТСЕ7Б2 или активного фрагмента, или производного этого в отсутствие тестируемого агента). Если уровень активности в присутствии агента отличается на количество, которое является статистически значимым, от уровня активности в отсутствие агента, то агент является агентом, который изменяет активность ТСЕ7Б2. Увеличение в уровне активности относительно контроля указывает, что агент является агентом, который усиливает (является агонистом) активность. Подобным образом уменьшение уровня активности относительно контроля указывает, что агент является агентом, который ингибирует (является антагонистом) активности. В другом воплощении уровень активности ТСЕ7Б2 или производного, или фрагмента этого в присутствии тестируемого агента сравнивается с контрольным уровнем, который был установлен предварительно. Уровень активности в присутствии агента, который отличается от контрольного уровня по количеству, которое является статистически значимым, указывает, что агент изменяет активность ТСЕ7Б2.
Настоящее изобретение относится также к любому способу анализа по идентификации агентов, которые изменяют экспрессию гена ТСЕ7Б2 (например, антисенс-нуклеиновые кислоты, слитые белки, полипептиды, имитаторы пептидов, рецепторы, связывающие агенты, антитела, малые молекулы или другие лекарственные средства, или рибозимы), которые изменяют (например, увеличивают или уменьшают) экспрессию (например, транскрипцию или трансляцию) гена или которые другим образом взаимодействуют с ТСЕ7Б2, а также агентов, идентифицируемых анализом. Например, раствор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую ТСЕ7Б2, может контактировать с тестируемым агентом. Раствор может включать, к примеру, нуклеиновую кислоту или клеточный лизат, включающий нуклеиновую кислоту; альтернативно, раствор может быть иным раствором, который включает элементы, необходимые для транскрипции/трансляции нуклеиновой кислоты. По желанию могут быть также применены клетки, которые не суспендируются в растворе. Оценивается уровень и/или характер экспрессии ТСЕ7Б2 (например, уровень и/или характер экспрессированных мРНК или белка, такой как уровень и/или характер различных сплайсированных вариантов) и сравнивается с уровнем и/или характером экспрессии в контроле (т.е. уровнем и/или характером экспрессии ТСЕ7Б2 в отсутствие тестируемого агента). Если уровень и/или характер в присутствии агента отличается по количеству или по способу, которые являются статистически значимыми, от уровня и/или характера в отсутствие агента, то агент является агентом, который изменяет экспрессию гена диабета II типа. Усиление экспрессии показывает, что агент является
- 22 016397 агонистом активности ТСР7Б2. Подобным образом ингибирование экспрессии показывает, что агент является антагонистом активности ТСР7Б2. В другом воплощении уровень и/или характер полипептида(ов) ТСР7Б2 (т.е. различных сплайсированных вариантов) в присутствии тестируемого агента сравнивается с контрольным уровнем и/или характером, который был установлен предварительно. Уровень и/или характер в присутствии агента, который отличается от контрольного уровня и/или характера по количеству или по способу, которые являются статистически значимыми, указывает, что агент изменяет экспрессии ТСР7Б2.
В другом воплощении изобретения агенты, которые изменяют экспрессию ТСР7Б2 или которые другим образом взаимодействуют с ТСР7Б2 или с другими членами \Уп1 сигнального пути или кадгеринового сигнального пути, могут быть идентифицированы с применением клетки, клеточного лизата или раствора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую область промотора гена ТСР7Б2 или нуклеиновй кислоты, операбельно связанной с репортерным геном. После контакта с тестируемым агентом определяется уровень экспрессии репортерного гена (например, уровень экспрессируемых мРНК или белка) и сравнивается с уровнем экспрессии в контроле (т.е. уровнем экспрессии репортерного гена в отсутствие тестируемого агента). Если уровень в присутствии агента отличается по количеству или по способу, которые являются статистически значимыми, от уровня в отсутствие агента, то агент является агентом, который изменяет экспрессию ТСР7Б2, как показано по его способности изменять экспрессию гена, который операбельно связан с промотором гена ТСР7Б2. Усиление экспрессии репортера показывает, что агент является агонистом ТСР7Б2 активности. Подобным образом ингибирование экспрессии репортера показывает, что агент является антагонистом активности ТСР7Б2. В другом воплощении уровень экспрессии репортера в присутствии тестируемого агента сравнивается с контрольным уровнем, который установлен предварительно. Уровень в присутствии агента, который отличается от контрольного уровня по количеству или по способу, которые являются статистически значимыми, показывает, что агент изменяет экспрессию.
Агенты, которые изменяют количество различных сплайсированных вариантов, кодируемых ТСР7Б2 (например, агент, который усиливает активность первого сплайсированного варианта и который ингибирует активность второго сплайсированного варианта), а также агенты, которые являются агонистами активности первого сплайсированного варианта и антагонистами второго сплайсированного варианта, могут быть легко идентифицированы с применением способов, описанных выше.
В другом воплощении изобретения для оценки вклада тестируемого агента в активность полипептида в отношении связывающего ТСР7Б2 агента могут быть применены анализы. Например, клетка, которая экспрессирует соединение, взаимодействующее с полипептидом ТСР7Б2 (называемое здесь агент, связывающий ТСР7Ь2, который может быть полипептидом или другой молекулой, взаимодействующей прямо или непрямо с полипептидом ТСР7Б2, такой как член сигнального пути \Уп1 или член кадгеринового сигнального каскада), контактирует с ТСР7Б2 в присутствии тестируемого агента, и определяется способность тестируемого агента изменять взаимодействие между ТСР7Б2 и агентом, связывающим ТСР7Б2. Альтернативно, может быть использован клеточный лизат или раствор, включающий агент, связывающий ТСР7Б2. Агент, который связывается с ТСР7Б2 или ТСР7Б2 связывающий агент, изменяет взаимодействие, мешая ему, или усиливает способность ТСР7Б2 связываться или ассоциировать либо другим образом взаимодействовать с агентом, связывающим ТСР7Б2. Определение способности тестируемого агента связываться с ТСР7Б2 или агент, связывающий ТСР7Б2, может быть выполнено, к примеру, путем сопряжения тестируемого агента с радиоизотопом или ферментативной такой меткой, что связывание тестируемого агента с полипептидом может быть прямо или непрямо определено путем детекции меченого 125ф 358, 14С или 3Н, а радиоизотоп определяется путем прямого счета радиоэмиссии или путем сцинтилляционного счета. Альтернативно, тестируемые агенты могут быть помечены ферментом, например пероксидазой из хрена, щелочной фосфатазой или люциферазой, и ферментативная метка детектируется путем определения превращения подходящего субстрата в продукт. В рамках этого изобретения находится определение способности тестируемого агента взаимодействовать с полипептидом без мечения любых взаимодействующих компонентов. К примеру, для детектирования взаимодействия тестируемого агента с ТСР7Б2 или ТСР7Б2 связывающего агента без мечения тестируемого агента, ТСР7Б2 или ТСР7Б2 связывающего агента может применяться микрофизиометр. УсСопие11, Н.М. е1 а1., 8с1епсе. 257:1906-1912 (1992). Как это применяется здесь, микрофизиометр (например, Су!о8еп8ог™) представляет собой аналитический инструмент, который измеряет скорость, с которой клетка закисляет свое окружение с применением чувствительного к свету потенциометрического сенсора (ЬАР8). Изменение в скорости закисления может применяться в качестве индикатора взаимодействия между лигандом и полипептидом.
Таким образом, эти рецепторы могут быть полезны для скрининга соединений, которые являются агонистами или антагонистами, для их применения в лечении или исследовании чувствительности к диабету II типа. Могут быть созданы лекарства для регуляции активации ТСР7Б2, которые, в свою очередь, могут применяться для регуляции сигнальных путей и транскрипционных, происходящих ниже гена.
- 23 016397
В другом воплощении изобретения может быть применен анализ для идентификации полипептидов, которые взаимодействуют с ТСЕ7Ь2. Например, для идентификации полипептидов, взаимодействующих с ТСЕ7Ь2, может быть применена дрожжевая двухгибридная система (Е1е1б8, δ. апб 8опд, О., №а!иге. 340:245-246 (1989)). В такой дрожжевой двухгибридной системе конструируются векторы, основанные на гибкости транскрипционного фактора, который имеет два функциональных домена (ДНКсвязывающий домен и домен активации транскрипции). Если два домена разделены, но слиты в два различных белка, которые взаимодействуют друг с другом, может быть достигнута активация транскрипции и транскрипция специфического маркера (например, для идентификации присутствия взаимодействия и активации транскрипции могут применяться маркеры питательной среды, такие как Ηίδ и Абе, или окрашенные маркеры, такие как 1ас2). Например, в способе изобретения применяется первый вектор, который включает нуклеиновую кислоту, кодирующую ДНК-связывающий домен, а также ТСЕ7Ь2, сплайсированный вариант, или фрагмент, или производное этого, и применяется второй вектор, который включает нуклеиновую кислоту, кодирующую домен активации транскрипции, а также нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который потенциально может взаимодействовать с ТСЕ7Ь2 или сплайсированным вариантом, фрагментом или производным этого. Инкубация дрожжей, включающих первый вектор со вторым вектором в подходящих условиях (например, в условиях спаривания, таких как применяются в системе Ма!сЬтакег™ от С1оп!есЬ (Ра1о А1!о, СаШогша, И8А), позволяет идентифицировать колонии, которые экспрессируют интересующий маркер. Эти колонии могут быть исследованы для идентификации полипептида(ов), которые взаимодействуют с ТСЕ7Ь2 или его фрагментом или производным. Такие полипептиды могут применяться как агенты, которые изменяют активность экспрессии ТСЕ7Ь2, как описано в отношении способов лечения.
В более чем одном воплощении приведенного выше способа анализа настоящего изобретения может быть желательным иммобилизовать на твердой подложке либо ТСЕ7Ь2 ген, либо белок ТСЕ7Ь2, либо агент, который связывает ТСЕ7Ь2 (например, другой член \Уп1 сигнального каскада или член кадгеринового сигнального пути) или другие компоненты анализа, для того чтобы облегчить разделение формы в виде комплекса от невзаимодействующих белков, а также для приспособления к автоматизации анализа. Связывание тестируемого агента с белком или взаимодействие белка со связывающим агентом в присутствии или в отсутствие тестируемого агента может быть выполнено в любом сосуде, подходящем для включения реактантов. Примеры таких сосудов включают пластины для микротитрования, пробирки или микроцентрифужные пробирки. В одном воплощении может быть обеспечен слитый белок (например, белок, слитый с глутатион-8-трансферазой), к которому добавлен домен, который позволяет ТСЕ7Ь2, белку ТСЕ7Ь2 или агенту, связывающему ТСЕ7Ь2, быть связанным с матриксом или другой твердой подложкой.
В другом воплощении модуляторы экспрессии молекул нуклеиновой кислоты изобретения идентифицируются способом, в котором клетка, клеточный лизат или раствор, включающий ТСЕ7Ь2, контактирует с тестируемым агентом, и определяется экспрессия подходящей мРНК или полипептида (например, сплайсированного варианта(ов)) в клетке, лизате или растворе. Уровень экспрессии подходящей мРНК или полипептида(ов) сравнивается с уровнем экспрессии мРНК или полипептида(ов) в отсутствие тестируемого агента. Тестируемый агент может быть идентифицирован как модулятор экспрессии на основе этого сравнения. Например, когда экспрессия мРНК или полипептида больше (статистически значимо больше) в присутствии тестируемого агента, чем в его отсутствие, тестируемый агент идентифицируется как стимулятор или энхансер экспрессии мРНК или полипептида. Альтернативно, когда экспрессия мРНК или полипептида меньше (статистически значимо меньше) в присутствии тестируемого агента, чем в его отсутствие, тестируемый агент идентифицируется как ингибитор экспрессии мРНК или полипептида. Уровень экспрессии мРНК или полипептида в клетках может быть определен способами, описанными здесь для детектирования мРНК или полипептида.
Дополнительно, изобретение относится к новым агентам, идентифицированным с помощью описанного выше скринирующего анализа. Соответственно в рамках настоящего изобретения далее применяется агент, идентифицированный, как описано здесь, в способах лечения, описанных здесь. Например, агент, идентифицированный, как описано здесь, может быть применен для изменения активности белка, кодируемого геном ТСЕ7Ь2, или для изменения экспрессии ТСЕ7Ь2 путем контактирования белка или нуклеиновой кислоты (или контактирования с клеткой, включающей полипептид или нуклеиновую кислоту) с агентом, идентифицированным, как описано здесь.
Нуклеиновые кислоты изобретения.
Нуклеиновые кислоты ТСЕ7Ь2, их части и варианты.
Настоящее изобретение относится также к молекулам изолированных нуклеиновых кислот, включающих человеческий ТСЕ7Ь2. Молекулы нуклеиновой кислоты ТСЕ7Ь2 настоящего изобретения могут быть РНК, например мРНК, или ДНК, такой как кДНК и геномная ДНК. Молекулы ДНК могут быть двутяжные или однотяжные, одноцепочечная РНК или ДНК может быть кодирующей или смысловой нитью либо некодирующей или антисмысловой нитью. Молекула нуклеиновой кислоты может включать всю или часть кодирующей последовательности гена и может дополнительно включать дополнительные некодирующие последовательности, такие как интроны и 3' и 5' некодирующие последовательности (вклю- 24 016397 чая, к примеру, регуляторные последовательности).
Дополнительно, молекулы нуклеиновой кислоты изобретения могут быть слиты с маркерной последовательностью, например последовательностью, которая кодирует полипептид, способствующий изоляции или очистке белка. Такие последовательности включают, но не ограничиваются, те, которые кодируют белок, слитый с глутатион-8-трансферазой (С8Т), и те, которые кодируют маркерный полипептид гемагглютинин А (НА) из вируса гриппа.
Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, как это применяется здесь, является такой, которая отделена от нуклеиновых кислот, которые в норме фланкируют ген или нуклеотидную последовательность (как в геномных последовательностях) и/или были полностью или частично очищены от других транскрибируемых последовательностей (например, как в библиотеке РНК). К примеру, изолированная нуклеиновая кислота изобретения может, по существу, быть изолированной по отношению к комплексу клеточной среды, в которой она присутствует, или культуральной среды, когда она производится с помощью рекомбинантных методов, или химических предшественников, или других химических веществ, когда они синтезируются химическим путем. В некоторых случаях изолированный материал будет формировать часть композиции (например, грубый экстракт, включающий другие вещества) буферной системы или смешанных реагентов. В других обстоятельствах материал может быть очищен, по существу, до гомогенности, например, как определяется методом ЭФ в ПААГ колоночной хроматографии, такой как ВЭЖХ. Предпочтительно изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере 50, 80 или 90% (на молярной основе) всех представленных видов макромолекул. По отношению к геномной ДНК термин изолированная также может относиться к молекулам нуклеиновых кислот, которые выделены из хромосомы, с которой геномная ДНК ассоциирована в природе. Например, молекула изолированной нуклеиновой кислоты может включать менее чем примерно 5 т.п.о., но не ограничиваться 4 т.п.о., 3 т.п.о., 2 т.п.о., 1 т.п.о., 0,5 т.п.о. или 0,1 т.п.о. нуклеотидов, которые фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой молекула нуклеиновой кислоты происходит.
Молекула нуклеиновой кислоты может быть слита с другими кодирующими или регуляторными последовательностями и все еще рассматриваться как изолированная. Таким образом, рекомбинантная ДНК, содержащаяся в векторе, также включена в определение изолированная, как это применяется здесь. Также молекулы изолированной нуклеиновой кислоты включают рекомбинантные молекулы ДНК в гетерологичных клетках-хозяевах, а также частично или по существу очищенные молекулы ДНК в растворе. Молекулы изолированной нуклеиновой кислоты включают также транскрипты РНК молекул ДНК настоящего изобретения ш у|уо и ш уйго.
Молекула изолированной нуклеиновой кислоты может включать молекулу нуклеиновой кислоты или последовательность нуклеиновой кислоты, которая синтезирована химическим или рекомбинантным способом. Следовательно, рекомбинантная ДНК, содержащаяся в векторе, включена в определение изолированная, как оно применяется здесь. Также молекулы нуклеиновой кислоты включают рекомбинантные молекулы ДНК в гетерологичных организмах, а также частично или по существу очищенные молекулы ДНК а растворе. РНК транскрипты молекул ДНК настоящего изобретения 1и у|уо и 1и νίΙΐΌ также включены в изолированные последовательности нуклеиновой кислоты. Такие изолированные молекулы нуклеиновой кислоты полезны при получении колируемого полипептида как зондов для выделения гомологичных последовательностей (например, из других видов млекопитающих) для картирования гена (например, путем гибридизации ш кйи с хромосомами) или для детектирования экспрессии гена в ткани (например, ткани человека), такого как анализ с помощью нозерн-блота или саузерн-блота.
Настоящее изобретение относится также к молекулам нуклеиновой кислоты, которые не обнаружены в природе, но которые кодируют полипептид ТСР7Ь2 или другие сплайсированные варианты полипептида ТСР7Ь2 или полиморфных вариантов этого. Таким образом, к примеру, изобретение относится к молекулам ДНК, включающим последовательность, которая отличается от существующей в природе нуклеотидной последовательности, но которая благодаря вырожденности генетического кода кодирует полипептид ТСР7Ь2 настоящего изобретения. Изобретение также включает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие части (фрагменты) или варианты полипептидов, такие как аналоги или производные полипептид ТСР7Ь2. Такие варианты могут существовать в природе, например, в случае аллельных вариаций или 8ΝΡ или неприродных, таких как те, что индуцированы воздействием различных мутагенов и мутагенных процессов. Обозначенные варианты включают, но не ограничиваются этим, вставки, делеции или замены одного или более нуклеотидов, которые могут приводить к консервативным или неконсервативным заменам аминокислот, включая вставки и делеции. Предпочтительно изменение нуклеотида (и/или полученной аминокислоты) является не проявляющимся или консервативным; это означает, что они не изменяют характеристик или активности полипептида ТСР7Ь2. В одном аспекте последовательности нуклеиновой кислоты являются фрагментами, которые включают один или более полиморфных микросателлитных маркеров. В другом аспекте нуклеотидные последовательности являются фрагментами, которые включают один или более 8ΝΡ в гене ТСР7Ь2.
- 25 016397
Другие изменения молекул нуклеиновых кислот изобретения могут включать, например, мечение, метилирование, межнуклеотидные модификации, такие как незаряженные соединения (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы), заряженные соединения (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты), прикрепленные компоненты (например, полипептиды), интеркаляторы (например, акридин, псорален), хелаторы, алкиляторы и модифицированные соединения (например, альфа аномерные нуклеиновые кислоты). Включены также синтетические молекулы, которые имитируют молекулы нуклеиновой кислоты в способности связываться с указанной последовательностью через водородные связи и другие химические интеркаляторы. Такие молекулы включают, к примеру, те, в которых в скелете молекулы пептидные связи заменены на фосфатные связи.
Изобретение относится также к молекулам нуклеиновой кислоты, которые гибридизуются в жестких условиях гибридизации, таких как селективная гибридизация, с нуклеотидной последовательностью, описанной здесь (например, молекулами нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизуется с последовательностью, кодирующей полипептиды, описанные здесь, и необязательно имеет активность полипептида). В одном аспекте изобретение включает варианты, описанные здесь, которые гибридизуются в жестких условиях гибридизации (например, при селективной гибридизации) с нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность или ее полиморфный вариант. В другом аспекте вариант, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации, имеет активность полипептида ТСР7Ь2.
Такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть обнаружены и/или изолированы путем специфической гибридизации (например, в жестких условиях гибридизации).
Специфическая гибридизация, как это применяется здесь, относится к способности первой нуклеиновой кислоты гибридизоваться со второй нуклеиновой кислотой таким способом, что первая нуклеиновая кислота не гибридизуется с любой нуклеиновой кислотой, иной, чем вторая нуклеиновая кислота (например, когда первая нуклеиновая кислота имеет более высокое подобие со второй нуклеиновой кислотой, чем с любой другой нуклеиновой кислотой в образце, где выполняется гибридизация). Жесткие условия гибридизации - это термин, применяемый специалистами, который относится к условиям инкубации и промывания, например, такие условия, как температура и концентрация буфера, которые позволяют осуществить гибридизацию определенной нуклеиновой кислоты с второй нуклеиновой кислотой: первая нуклеиновая кислота может быть полностью (т.е. на 100%) комплементарна второй или первая и вторая могут делить некоторую степень комплементарности, которая меньше, чем полная (например, 70, 75, 80, 85, 90, 95%). Например, могут быть применены определенные жесткие условия, которые позволяют безукоризненно разделить комплементарные нуклеиновые кислоты от таковых с меньшей комплементарностью. Условия высокой жесткости, условия средней жесткости и условия низкой жесткости, так же как и способы гибридизации нуклеиновых кислот, объяснены на страницах 2.10.12.10.16 и страницах 6.3.1-6.3.6 в Ситгеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду (АикиЬе1, Р., Ситгеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬп \νίΚν & 8опк (1998) и Кгаик, М. апб Аагопкоп, 8. Ме11юбк Епгуто1., 200:546-556 (1991)).
Процент гомологии или идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей может быть определен путем выравнивания последовательностей для оптимальных целей сравнения (например, для оптимального выравнивания в первую последовательность могут быть введены пропуски). Затем нуклеотиды и аминокислоты в соответствующих позициях сравниваются, и процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных позиций, общих для двух последовательностей (т.е. % идентичности = # идентичных позиций/общее количество позиций х 100). Когда позиция в одной последовательности занимается тем же нуклеотидом или аминокислотным остатком, что и в соответствующей позиции другой последовательности, то молекулы являются гомологичными в этой позиции. Как это применяется здесь, гомология нуклеиновой кислоты или аминокислоты представляет собой эквивалент идентичности нуклеиновой кислоты или аминокислоты. В определенных аспектах длина последовательности, которая выровнена для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, например по меньшей мере 40%, в определенных аспектах по меньшей мере 60%, и в других аспектах по меньшей мере 70, 80, 90 или 95% от длины последовательности сравнения. Действительное сравнение двух последовательностей может быть выполнено хорошо известными способами, например с применением математических алгоритмов. Предпочтительный нелимитирующий пример такого математического алгоритма описан у Каг1ш е1 а1., Ргос. Асаб. 8с! И8А. 90:5873-5877 (1993). Такой алгоритм включен в программы ХВЬА8Т и ХВЬА8Т (версия 2.0), которые описаны у А1!ксйи1 е! а1., ШсЮс Ас1б Кек. 25:389-3402 (1997). При применении программ ВЬА8Т и Сарреб ВЬА8Т могут применяться параметры дефолта соответствующих программ (например, ХВЬА8Т). В одном аспекте параметры для сравнения последовательностей могут быть установлены с баллами = 100, длиной слова = 12 или могут варьировать (например, ν=5 или ν=20).
Другим предпочтительным нелимитирующим примером математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Мейерса и Миллера (Муегк апб М111ег,
САВЮ8 4(1):11-17 (1988)). Такой алгоритм включен в программу ΛυΟΝ (версия 2.0), которая является частью пакета программ для выравнивания последовательностей ССС (Ассе1гук, СатЬпбде, ИК). Когда
- 26 016397 для сравнения последовательностей применяется программа ЛЬЮИ, могут быть применены параметры РАМ120 взвешенной таблицы остатков, штраф за длину делеции 12, штраф за делению 4. Дополнительные алгоритмы для анализа последовательностей известны специалисту и включают ΛΩνΑΝίΈ и АРАМ, как описано у ТогеШк апб ВоЬоШ, Сотри!. Αρρί. Βίοκοί. 10:3-5 (1994), и ЕА8ТА, описанная у Реагкоп апб Ыртап, Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. И8А. 85:2444-8 (1988).
В другом аспекте процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с применением пакета программ ССС с использованием либо матрикса ВЬО8ИМ, либо матрикса РАМ250 и весом делеции 12, 10, 8, 6 или 4 и весом длины 2, 3 или 4. Еще в одном аспекте процент идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот может быть определен с применением программы САР в пакете программ ССС с применением веса делеции 50 и веса длины 3.
Настоящее изобретение обеспечивает также молекулы изолированных нуклеиновых кислот, которые включают фрагмент или часть, которая гибридизуется в очень жестких условиях с нуклеотидной последовательностью ТСР7Ь2 или комплементом такой последовательности, а также обеспечивает молекулы, которые включают фрагмент или часть, которая гибридизуется в очень жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность или полиморфный вариант этого. Фрагменты нуклеиновой кислоты изобретения имеют длину по меньшей мере примерно 15, предпочтительно по меньшей мере примерно 18, 20, 23 или 25 нуклеотидов и могут быть длиной 30, 40, 50 100, 200 или более нуклеотидов. Более длинные фрагменты, например длиной 30 или более нуклеотидов, которые кодируют антигенные полипептиды, описанные здесь, являются особенно полезными, например, для генерации антител, как описано ниже.
Зонды и праймеры.
В родственном аспекте фрагменты нуклеиновой кислоты изобретения применяются как зонды и праймеры в анализах, таких как те, что описаны здесь. Зонды или праймеры - это нуклеотиды, которые гибридизуются специфическим по отношению к основаниям способом с комплементарной нитью молекул нуклеиновых кислот. Такие зонды и праймеры включают полипептид нуклеиновых кислот, как описано у №е1кеп е! а1., 8с1епсе. 254:1497-1500 (1991).
Зонды и праймеры включают область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется по меньшей мере примерно с 15, например приблизительно 20-25 и в определенных аспектах примерно с 40, 50 или 75 последовательными нуклеотидами молекулы нуклеиновой кислоты, включающей смежную нуклеотидную последовательность ТСР7Б2, или полиморфных вариантов этого. В других аспектах зонд или праймер включает 100 или несколько нуклеотидов, в определенных аспектах от 6 до 50 нуклеотидов, например от 12 до 30 нуклеотидов. В других аспектах зонд или праймер по меньшей мере на 70% идентичен смежной нуклеотидной последовательности или комплементарной нити смежной нуклеотидной последовательности, например по меньшей мере на 80% идентичен, в определенном аспекте по меньшей мере на 90% идентичен и в других аспектах по меньшей мере на 95% идентичен или даже способен селективно гибридизоваться с прилегающей нуклеотидной последовательностью или с нитью, комплементарной прилегающей нуклеотидной последовательности. Часто зонд или праймер дополнительно включает метку, например радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента.
Молекулы нуклеиновой кислоты изобретения, такие как те, что описаны выше, могут быть идентифицированы и изолированы с применением стандартных методов молекулярной биологии, и при этом обеспечивается информация о последовательности. Например, молекулы нуклеиновой кислоты могут быть амплифицированы и изолированы путем ПЦР с применением синтетических олигонуклеотидных праймеров, созданных на основе последовательности ТСР7Б2 или последовательности, комплементарной ей, или созданных на основе нуклеотидных оснований последовательности, кодирующей одну или более аминокислотных последовательностей, обеспеченной при этом. См. в основном РСВ Тес11по1оду: Рппс1р1ек апб Арр1юа!юпк Гог ΌΝΑ Атр11йса!юп (еб. Н.А. Ег1юй, Ргеетап Ргекк, ΝΥ, ΝΥ, (1992)); РСВ Рго!осо1к: А Сшбе !о МеБюбк апб Арр1юа!юпк (Ебк !пп1к е! а1., Асабетю Ргекк, 8ап П1едо, СА, (1990); Ма!!11а е! а1., Ыис1. Ас1бк Век. 19:4967 (1991); Ескег! е! а1., РСВ Ме11юбк апб Аррйсайопк. 1:17 (1991)); РСВ (ебк. МсРйегкоп е! а1., [ВБ Ргекк, ОхГогб и патент И8 4683202). Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть амплифицированы с применением в качестве матрицы кДНК, мРНК или геномной ДНК, клонированы в подходящий вектор и охарактеризованы путем анализа последовательности ДНК.
Другие подходящие способы амплификации включают лигазную цепную реакцию (ЬСВ) (см. \Уи апб ^а11асе, Сепотюк. 4:560 (1989), Ьапбедгеп е! а1., 8с1епсе. 241:1077 (1988)), амплификацию транскрипции (Κ\\ό1ι е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сГ И8А. 86:1173 (1989)) и самоподдерживаемую репликацию последовательности (Сиа!еШ е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сГ И8А. 87:1874 (1990)) и амплификацию последовательности на основе нуклеиновой кислоты (НА8ВА). Последние два способа амплификации вовлекают изотермальную реакцию на основе изотермальной транскрипции, которая производит как одноцепочечную РНК (ккРНК), так и двухцепочечную РНК (бк-РНК) в качестве продуктов амплификации в соотношении примерно 30 или 100 к 1 соответственно.
- 27 016397
Амплифицированная ДНК может быть помечена, например, радиоактивными изотопами и применена как зонд для скрининга библиотеки кДНК, происходящей из клеток человека, мРНК в /ар ехргекк, 2ГРЬ0Х или другом подходящем векторе. Соответствующие клоны могут быть изолированы, с последующим удалением ίπ νίνο может быть получена ДНК, и клонированная вставка может быть секвенирована в одной или обеих ориентациях способом, известным специалисту, для идентификации правильной рамки считывания полипептида подходящего молекулярного веса. Например, прямой анализ нуклеотидной последовательности молекул нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может быть выполнен с применением хорошо известных способов, которые являются коммерчески доступными. См., например, 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошид, А ЬаЬога!огу Мапиа1 (2пб Еб., С8НР, Νονν Уогк. 1989); 2укктб е! а1., КесотЬтап! ΩΝΛ ЬаЬога!огу Мапиа1 (Асаб Ргекк, 1988). Дополнительно, для анализа нуклеиновых кислот и полипептидов полезны также флуоресцентные методы (С’Неп е! а1., Сепоте Кек, 9, 492 (1999)). С применением этих или похожих методов могут быть изолированы, секвенированы и дополнительно охарактеризованы полипептид и ДНК, кодирующая полипептид.
Антисенс-молекулы нуклеиновой кислоты изобретения могут быть придуманы с применением нуклеотидной последовательности ТСР7Ь2 и/или комплементарной ей или ее части, сконструированы с применением химического синтеза и реакций ферментативного лигирования с применением процедур, известных в данной области. Например, антисенс-молекула нуклеиновой кислоты (например, антисенснуклеотид) может быть синтезирована химическим путем с применением природных нуклеотидов или различных модифицированных нуклеотидов, задуманных для увеличения биологической стабильности молекул или для увеличения физической стабильности дуплекса, сформированного между антисенс и смысловой нуклеиновыми кислотами, например могут быть применены фосфоротиоатные производные и замещенные акридином нуклеотиды. Альтернативно, антисенс-молекула нуклеиновой кислоты может быть получена биологически с применением экспрессионного вектора, в котором молекула нуклеиновой кислоты была субклонирована в антисенс-ориентации (т.е. РНК, транскрибированная с встроенной молекулой нуклеиновой кислоты, будет в антисенс-ориентации по отношению к интересующей нуклеиновой кислоте-мишени).
Последовательности нуклеиновых кислот могут также применяться для сравнения с последовательностями эндогенной ДНК у пациентов для идентификации одного или более расстройств, описанных выше, и как зонды, например, для гибридизации и открытие последовательностей родственных ДНК или для вычитания известных последовательностей из образца. Последовательности нуклеиновых кислот могут дополнительно применяться для извлечения праймеров при генетическом фингерпринтинге, для выработки антиполипептидных антител с применением технологии иммунизации ДНК и как антиген для выработки анти-ДНК антител или вызывания иммунного ответа. Части или фрагменты нуклеотидных последовательностей, идентифицированные здесь (и соответствующие полные последовательности гена) могут применяться многими путями, например как полинуклеотидный реагент. К примеру, эти последовательности могут использоваться для (ί) картирования соответствующих им генов в хромосоме, и таким образом, для выявления локализации областей гена, ассоциированных с генетическим заболеванием; (ίί) идентификации индивидуума исходя из мельчайшего образца (типирование ткани) и (ίίί) помощи при судебной идентификации биологического образца. Дополнительно, нуклеотидные последовательности могут применяться для идентификации и экспрессии рекомбинантных полипептидов для анализа, характеристики или терапевтического применения или как маркеры для тканей, в которых экспрессируются соответствующие полипептиды либо конститутивно во время дифференциации ткани, либо при заболевании. Последовательности нуклеиновых кислот могут дополнительно применяться как реагенты в скрининге и/или диагностических анализах, описанных здесь, и могут также включаться как компоненты в наборы (например, наборы реактивов) для применения в скрининге и/или в диагностических анализах, описанных здесь.
Наборы (например, наборы реактивов), полезные в способах диагностики, включают компоненты, полезные в любых методах, описанных здесь, включая, к примеру, зонды или праймеры для гибридизации, как описано здесь (например, меченые зонды или праймеры), реагенты для детекции меченых молекул, рестрикционные ферменты (например, для КРЬР анализа), аллель-специфичные олигонуклеотиды, антитела, которые связываются с измененным или с неизмененным (нативным) полипептидом ТСР7Ь2, средства для амплификации нуклеиновых кислот, включая нуклеиновую кислоту ТСР7Ь2, или для части ТСР7Ь2 или средства для анализа последовательности нуклеиновой кислоты или для анализа аминокислотной последовательности полипептида ТСР7Ь2, как описано здесь, и т.д. В одном аспекте, набор реагентов для диагностики восприимчивости к диабету II типа может включать праймеры для амплификации области нуклеиновой кислоты ТСР7Ь2, включающей маркер ОС108478, 8№ гк12255372, гк7895340, гк11196205, гк7901695, гк7903146, гк12243326 и/или гк4506565, или гаплотип риска, который более часто представлен у индивидуумов, имеющих диабет II типа, или которые восприимчивы к диабету II типа. Праймеры могут быть сконструированы с применением частей нуклеиновых кислот, фланкирующих 8№, которые являются индикаторами диабета II типа.
- 28 016397
Векторы и клетки-хозяева.
Другой аспект настоящего изобретения относится к конструктам нуклеиновой кислоты, включающим молекулы нуклеиновой кислоты, описанные здесь, и комплементарные им молекулы (или часть этого). Конструкты включают вектор (например, экспрессионный вектор, в который встроена последовательность изобретения в смысловой или антисенс-ориентации). Как применяется здесь, термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Один тип векторов является плазмидой, термин, который относится к циклической двутяжной петле ДНК, с которой может быть лигирован дополнительный сегмент ДНК. Другим типом векторов является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы с вирусным геномом. Определенные векторы способны к автономной репликации в клеткаххозяевах, в которые они интродуцированы (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное происхождение репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина при интродукции в клетку-хозяин и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Экспрессионные векторы способны к направленной экспрессии генов, с которыми они операбельно связаны. В основном экспрессионные векторы, полезные в рекомбинантных технологиях ДНК, часто являются плазмидами. Однако изобретение намерено включить такие другие формы экспрессионных векторов, как вирусные векторы (например, дефективные по репликации ретровирусы, аденовирусы и вирусы, ассоциированные с аденовирусами), которые имеют эквивалентные функции.
В определенных аспектах векторы рекомбинантной экспрессии изобретения включают молекулу нуклеиновой кислоты изобретения в форме, подходящей для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Это означает, что векторы рекомбинантной экспрессии включают один или более регуляторных последовательностей, выбранных на основе клеток хозяина для применения при экспрессии, которые операбельно связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая экспрессируется. В пределах рекомбинантного вектора экспрессии операбельно связанный или оперативно связанный предназначается для обозначения того, что интересующая нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью(ями) способом, который позволяет обеспечить экспрессию нуклеотидной последовательности (например, система транскрипции/трансляции ίη νίΐτο или в клетке-хозяине, когда вектор интродуцирован в клетку-хозяин). Термин регуляторная последовательность предназначен для включения промоторов, энхансеров и других регуляторных элементов экспрессии (например, сигналов полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, к примеру, у Соекке1, Сепе Ехргеккюп ТесЬпо1оду, МеШокк ίη Епхуто1оду. 185, Асакетю Ргекк, 8ап О1едо, СА (1990). Регуляторные последовательности включают те, которые направляют конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и те, которые направляют экспрессию нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Специалист оценит, что конструирование экспрессионных векторов может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, которая должна быть трансформирована, и уровня экспрессии желаемого полипептида. Экспрессионные векторы изобретения могут быть введены в клетки-хозяева для производства таким образом полипептидов, включая слитые полипептиды, кодируемые молекулами нуклеиновых кислот, как описано здесь.
Векторы рекомбинантной экспрессии изобретения могут быть сконструированы для экспрессии полипептида изобретения в клетках прокариот и эукариот, например в бактериальных клетках, таких как клетки Е.со11, клетках насекомых (с применением бакуловирусного вектора экспрессии), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева обсуждаются дополнительно у Соекке1, кирга. Альтернативно, векторы рекомбинантной экспрессии могут быть транскрибированы и транслированы ίη νίΐτο, например, с применением регуляторных последовательностей промотора Т7 и Т7 полимеразы.
Другой аспект изобретения относится к клеткам-хозяевам, в которые был интродуцирован вектор рекомбинантной экспрессии. Термины клетка-хозяин и рекомбинантная клетка-хозяин применяются здесь как взаимозаменяемые. Понятно, что такие термины относятся не только к определенным клеткам субъектам, но также к потомкам или потенциальным потомкам такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут иметь место определенные модификации, обусловленные либо мутациями, либо воздействием окружающей среды, такие потомки фактически могут не быть идентичны родительской клетке, но они еще включены в рамки термина, как он применяется здесь.
Клетка-хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой. Например, молекула нуклеиновой кислоты изобретения может быть экспрессирована в бактериальных клетках (например, Е.со11), клетках насекомых, клетках дрожжей или млекопитающих (таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетках СО8). Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам.
Вектор ДНК может быть интродуцирован в прокариотическую или эукариотическую клетку с применением традиционных методов трансформации или трансфекции. Как это применяется здесь, термины трансформация и трансфекция предназначены для отсылки ко многим известным специалистам ме- 29 016397 тодам интродукции чужой молекулы нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяин, включая совместную преципитацию с фосфатом или хлоридом кальция, опосредованную ОЕАЕ-декстраном трансфекцию, липофекцию или электропорацию. Подходящие способы для транформации или трансфекции клеток-хозяев можно найти у ЗатЬгоок е! а1. (зирга) и других лабораторных пособиях.
Известно, что для стабильной трансфекции клеток млекопитающих в зависимости от примененного вектора и техники трансфекции, лишь малая часть клеток может интегрировать чужую ДНК в их геном. Для того чтобы идентифицировать и отобрать эти интегранты в клетку хозяин вместе с интересующим геном вводится обычно маркер для отбора (например, определяющий резистентность к антибиотикам). Предпочтительные маркеры для отбора включают такие, которые придают резистентность к лекарствам, таким как С418, гигромицин и метотрексат. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие маркер для отбора, могут вводиться в клетку-хозяин с тем же вектором, что и молекула нуклеиновой кислоты изобретения, или могут вводиться с помощью отдельного вектора. Клетка, стабильно трансфицированная введенной молекулой нуклеиновой кислоты, может быть идентифицирована путем селекции с применением лекарств (например, клетки, которые имеют включенный маркерный ген для селекции, будут выживать, в то время как другие клетки умрут).
Клетка-хозяин изобретения, такая как прокариотическая или эукариотическая клетка, может применяться в культуре для производства (т.е. экспрессии) полипептида изобретения. Соответственно изобретение дополнительно обеспечивает способы для производства полипептида с применением клетокхозяев изобретения. В одном аспекте способ включает культивирование клетки-хозяина изобретения (в которую был интродуцирован вектор рекомбинантной экспрессии, кодирующий полипептид изобретения) в подходящей среде, так что производится полипептид. В другом аспекте способ дополнительно включает выделение полипептида из среды или клетки-хозяина.
Антитела изобретения.
Обеспечиваются также поликлональные антитела и/или моноклональные антитела, которые специфически связывают одну, но не другую форму продукта гена. Обеспечиваются также антитела, которые связывают часть или вариант, или продукт контрольного гена, который включает полиморфный участок или участки. Термин антитело, как он применяется здесь, относится к молекулам иммуноглобулинов и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулинов, т.е. к молекулам, которые включают антигенсвязывающие участки, которые специфически связывают антиген. Молекула, которая специфически связывает полипептид изобретения, представляет собой молекулу, которая связывается с полипептидом или его фрагментом, но, по существу, не связывается с другими молекулами в образце, например в биологическом образце, который в природе включает полипептид. Примеры активных частей иммуноглобулинов включают Р(аЬ) и Р(аЬ')2 фрагменты, которые можно получить путем обработки антитела ферментом, таким как папаин. Изобретение обеспечивает поликлональные и моноклональные антитела, которые связываются с полипептидом изобретения. Термин моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела, как он применяется здесь, относится к популяции молекул антитела, которая включает только один вид антигенсвязывающего участка, способного к иммунореакции со специфическим эпитопом полипептида изобретения. Таким образом, композиция моноклонального антитела демонстрирует обычно единственную связывающую аффинность к специфическому полипептиду изобретения, с которым оно вступает в иммунную реакцию.
Поликлональные антитела могут быть получены, как описано выше, путем иммунизации подходящего субъекта желаемым иммуногеном, например полипептидом изобретения или его фрагментом. За титром антитела у иммунизированного субъекта можно следить во времени с применением стандартных методов, таких как иммуноферментный анализ на сорбенте (ЕМЗА) с применением иммобилизованного полипептида. Если желательно, молекула полипептида, направленная против полипептида, может быть изолирована из млекопитающего (например, из крови) и дополнительно очищена с помощью хорошо известных методов, таких как хроматография на протеин А, для получения фракции ^С. В подходящее после иммунизации время, например, когда титры антитела являются наиболее высокими, клетки, производящие антитело, могут быть получены из субъекта и применены для приготовления моноклональных антител с использованием стандартных методов, таких как гибридомная техника, оригинально описанная у КоЫег аиб М11з!ет, №11иге. 256:495-497 (1975), техника с использованием человеческих гибридом В-клеток (КохЬог е! а1., Iттиио1. Тобау. 4:72 (1983)), ЕВУ-гибридомная техника (Со1е е! а1., Моиос1оиа1 АийЬоЛез аиб Саисег Тйегару, А1аи В. Ызз, 1985, Шс. р. 77-96) или триомный метод. Технология для производства гибридом хорошо известна (см. главным образом Сиггеи! Рго!осо1з 1и Iттиио1оду (1994) Сойдаи е! а1., (ебз) 1о1т ^йеу & 8оиз, Шс., №\ν Уогк, ΝΥ). Коротко, иммортализованная клеточная линия (обычно миелома) сливается с лимфоцитами (обычно спленоцитами) из млекопитающего, иммунизированного иммуногеном, как описано выше, и супернатанты культуры полученных гибридомных клеток подвергаются скринингу для идентификации гибридомы, производящей моноклональное антитело, которое связывается с полипептидом изобретения.
Для получения моноклонального антитела к полипептиду изобретения может быть применен любой из многих хорошо известных протоколов, применяемых для слияния лимфоциов и иммортализованных клеток (см., к примеру, Сиггеи! Рго!осо1з 1и Iттиио1оду, зирге; Са1Ге е! а1., №11иге. 266:55052 (1977);
- 30 016397
КН. КеппеШ, ίη Мопос1опа; Ап!1Ьоб1ек: А Ыете Эппепбоп Ση Вю1одка1 Апа1укек, Иепит ΡιιΝίκΙιίι^ Согр., №те Уогк, №те Уогк (1980) и Ьетег, Уа1е Σ. Вю1. Меб. 54:387-402 (1081)). Более того, обычный специалист оценит, что имеется много вариаций таких методов, которые также будут полезны.
Альтернативно, для получения гибридом, секретирующих моноклональное антитело, моноклональное антитело к полипептиду изобретения может быть модифицировано и изолировано путем скрининга рекомбинантной комбинаторной библиотеки иммуноглобулинов (например, библиотеки антител фагового дисплея) к полипептиду, к изолированному, таким образом, члену иммуноглобулиновой библиотеки, который связывает полипептид. Наборы реактивов для скрининга библиотек фагового дисплея доступны коммерчески (например, у Ρΐιηηηηαη РесотЫпап! Бйаде АпбЬобу 8ук!ет, каталожный номер 27-9400-01; и 81га!адепе 8πγΣΖΑΡ™ ГИаде 01ьр1ау Кб, каталожный номер 240612). Дополнительно, примеры способов и реагентов, особенно подходящих для применения в получении и скрининге библио
теки антител фагового дисплея, могут быть обнаружены, например, в патенте и8 5223409,
патентной публикации РСТ νο 92/18619; патентной публикации РСТ νο 91/17271;
патентной публикации РСТ νο 92/20791; патентной публикации РСТ νο 92/15679;
патентной публикации РСТ νο 93/01288; патентной публикации РСТ νο 92/01047;
патентной публикации РСТ XVО 92/09690; патентной публикации РСТ XVО 90/02809; Бисйк е! а1., В1о/Тесйпо1оду. 9:1370-1372 (1991); Нау е! а1., Нит. АпбЬоб. НуЬпботак. 3:81-85 (1992); Нике е! а1., 8с1епсе. 246:1275-1281 (1989) и СпййЬз е! а1., ЕМВО Σ. 12:725-734 (1993).
Дополнительно, в рамках изобретения находятся рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные моноклональные антитела, включающие части, происходящие из человека и не из человека, которые могут быть получены с применением стандартных методов рекомбинантной ДНК. Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела могут быть получены с помощью методов рекомбинантной ДНК, известных в отрасли.
В основном антитело изобретения (например, моноклональное антитело) может применяться для выделения полипептида изобретения с применением стандартных методов, таких как аффинная хроматография или иммунопреципитация. Специфичное по отношению к полипептиду антитело может облегчать очистку природного полипептида из клеток и рекомбинантно получаемых полипептидов, экспрессируемых в клетках-хозяевах. Более того, антитело, специфичное по отношению к полипептиду изобретения, может быть применено для детектирования полипептида (например, в клеточном лизате, клеточном супернатанте или образце ткани), для того чтобы оценить концентрацию и характер экспрессии полипептида. Антитела могут применяться диагностически для регистрации уровней белка в тканях как часть клинической процедуры тестирования, например для определения эффективной данной схемы лечения. Антитело может быть сопряжено с детектируемым веществом для облегчения его детектирования. Примеры детектируемых веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентный материал, люминесцентный материал, биолюминесцентный материал и радиоактивный материал. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу из хрена, щелочную фосфатазу, бетагалактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов с простетическими группами включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящего флуоресцентного материала включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлоротриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и акворин, и примеры 125 131 35 3 подходящего радиактивного материала включают I, I, 8 или Н.
Настоящее изобретение теперь иллюстрируется следующими примерами, которые не ограничивают его любым путем.
Примеры
Описанное здесь является идентификацией транскрипционного фактора 7, подобного фактору 2 (ТСБ7Б2 - ранее ТСБ4), как гена, обеспечивающего риск развития диабета II типа путем точечного анализа ассоциаций с применением плотного набора микросателлитных маркеров в пределах локуса 10ц.
Методы.
Исландская группа.
Агентство по Защите Информации Исландии и Национальный Биоэтический Комитет Исландии одобрили это исследование. Все участники исследования дали на него информированное согласие. Все персональные идентификаторы, ассоциированные с образцами крови, медицинской информацией и генеалогией, были сначала зашифрованы Агентством по Защите Информации с применением системы кодирования, полученной от третьей стороны (18).
Для первого исследования было идентифицировано 2400 пациентов с диабетом II типа, которые были диагностированы либо при долговременном эпидемиологическом исследовании, проведенном Исландской Ассоциацией Сердца в последние 30 лет, либо в одном из двух госпиталей в Рейкьявике в течение последних 12 лет. Две трети этих пациентов были живы, представляя примерно половину популяции известных пациентов с диабетом II типа в Исландии в настоящее время. Большая часть пациентов была в контакте с этим исследованием, доля кооперации превышала 80%. Все участники исследования посетили
Исландскую Сердечную Ассоциацию, где они ответили на вопросы и где у них были взяты образцы кро- 31 016397 ви и определен уровень глюкозы натощак. Были включены вопросы о лечении и возрасте, в котором был поставлен диагноз. Пациенты с диабетом II типа этого исследования были диагностированы, как описано в предварительном исследовании, связанном с проектом (10). Коротко, диагноз диабет II типа был подтвержден путем исследования врачами путем ранее сделанных медицинских регистраций, истории лечения и/или новых лабораторный измерений. Для пациентов с ранее диагностированным диабетом II типа, сообщивших о пероральном применении агента, снижающего уровень глюкозы, диагноз диабет II типа был подтвержден. Индивидуумы, которые к моменту исследования применяли инсулин, были классифицированы, как имеющие диабет II типа, если они также применяли или ранее перорально использовали агенты, снижающие уровень глюкозы. В этой группе большинство лечащихся пациентов принимали агенты, снижающие уровень глюкозы, и лишь небольшая часть (9%) нуждалась в инсулине. Не диагностированным до исследования индивидуумам диагноз диабет II типа и нарушение уровня глюкозы натощак (БРС) был дан на основе критериев, перечисленных Американской Ассоциацией Диабета (Экспертный Комитет по Диагностике и Классификации Сахарного Диабета 1997). Средний возраст пациентов с диабетом II типа в этом исследовании составил 69,7 лет.
Дублирующие группы.
Датская группа проекта была отобрана из проекта ΡΕΒΡ (Ргокресйуе Ер1бетю1одюа1 В1§к Рас!ог§ Предполагаемые эпидемиологические факторы риска) в Дании (19). Предварительно было диагностировано 228 женщин, как имеющие диабет II типа и/или уровень глюкозы в крови >7 мМ. В качестве контроля случайным образом были отобраны 539 женщин той же группы, не имеющих диабета II типа.
Проект ΡΕΝΝ САТН в США представляет собой перекрестное исследование ассоциации биохимических и генетических факторов при коронарном атеросклерозе в следующей друг за другом группе пациентов, которые подвергались коронарной катетеризации в Медицинском Центре Университет Пенсильвании между июлем 1998 и мартом 2003 г. Диабет II типа был определен как история повышения уровня глюкозы натощак >126 мг/дл, через 2 ч после обеда >200 мг/дл, пероральное применение гипогликемических агентов или инсулина и оральная гипогликемия у субъектов в возрасте старше 40 лет. XXX Университета Пенсильвании одобрило протокол исследования, и все субъекты дали письменное информированное согласие. Этичность определяли путем самоотчетов. Из этой группы происходил 361 пациент белой расы с диабетом II типа. В том же исследовании 530 неподверженных заболеванию (в отношении диабета II типа и инфаркта миокарда) белых пациентов были отобраны случайным образом в качестве контроля.
ДНК, примененная для генотипирования, была продуктом амплификации всего генома, проведенной с применением набора реактивов Сеηот^ΡЫ АтрНПсабоп. ДНК для амплификации была получена из периферической крови датских пациентов и пациентов из США с диабетом II типа и контрольных субъектов.
Генотипирование.
Новые повторы, полученные при секвенировании (т. е. динуклеотиды, тринуклеотиды и тетрануклеотиды), были идентифицированы с применением программ Тапбет гереаЦ Ппбег (20) и тестированы на полиморфизм у 94 контрольных субъектов. Размер в парах оснований меньшего аллеля СЕРН образца 1347-02 (СЕРН депотюк герокйогу) вычитали из размера ампликона микросателлита и применяли в качестве контроля. 8ΝΡ генотипирование было проведено с применением прямого секвенирования ДНК (Аррйеб ВюкуЦепъ) или платформы Сеп1а1гн5 (Чаподеп).
Статистические методы анализа ассоциации.
Для установления ассоциации единственного маркера с диабетом II типа применяли тест коэффициента вероятности для расчета двусторонних значений р для каждого аллеля. Для исследованных микросателлитов представим частоты аллелей, а не несущую частоту.
Авторы изобретения рассчитали ВВ и риск, приписанный к популяции, на основе мультипликативной модели (16, 17). Для данных по белым пациентам НарМар СЕРН рассчитали БЭ между парами 8ΝΡ с применением стандартного определения Ό' (27) и В2 (22). При построении графика для всех комбинаций 8ΝΡ для выявления БЭ структуры в отдельной области помещали Ό' в верхний левый угол, а значения р в нижний правый угол. В представленном графике БВ маркеры размещены равноудаленно, а не в соответствии с их физическим расположением.
- 32 016397
Результаты
Широколокусное исследование ассоциации.
Предварительно авторы изобретения сообщали о широкогеномной существенной связи сахарного диабета II типа с хромосомой 5 ц в исландской популяции (10); в том же исследовании также сообщали о предположительном доказательстве связи заболевания с 10ц и 12ц. Для завершения исследования локуса 10ц применяли ассоциативный подход, используя высокую плотность генотипированных микросателлитных маркеров в 10,5 м.п.о. области (ХСВ^ версия 34: СБг10:114,2 - 124,7 м.п.о.), соответствующей этому локусу. Идентифицировали и типировали 228 микросателлитных маркеров, т.е. до средней плотности 1 маркер на каждые 46 т.п.о. (табл. 1). Все маркеры были типированы у 1185 исландских пациентов с диабетом II типа и у 931 индивидуума из неродственной контрольной популяции.
Таблица 1
Локализация 228 генотипированных микросателлитов в хромосоме 10 в конструкции человеческого генома ХСВ^ версия 34
Название СТАРТ: Локализация в хромосоме 10, версия 34 КОНЕЦ: Локализация в хромосоме 10, версия 34
01081269 114186051 114186276
00108475 114389853 114390116
0108168 114410102 114410266
00108478 114460845 114461228
00108479 114475488 114475632
00108480 114507574 114507829
00108481 114542657 114542924
001081624 114545990 114546237
001081625 114568323 114568715
00108488 114713594 114714008
001081630 114770344 114770609
001081631 114778307 114778598
00108492 114811884 114812269
00108494 114852114 114852280
00108495 114879344 114879474
00108496 114919414 114919678
00108498 114964123 114964270
00108500 115024471 115024854
00108501 115045332 115045710
00108508 115241356 115241602
001081634 115267106 115267460
00108512 115357290 115357439
00108514 115400157 115400338
0010817 115463773 115464048
001081635 115519619 115519900
00108520 115536945 115537130
0108554 115695920 115696071
01081237 115784580 115784977
00108535 115858565 115858720
01081158 115937134 115937433
001081636 115966165 115966382
00108540 115983225 115983471
001081637 116025219 116025491
ЦОЮ8542 116054130 116054255
001081638 116062921 116063264
01081776 116140681 116140897
ΏΟ108546 116141340 116141590
00108547 116173634 116173887
001081639 116184720 116184898
00108548 116202775 116203174
00108550 116288175 116288560
0108562 116304948 116305132
001081640 116344030 116344279
001081641 116638155 116638540
00108566 116866173 116866431
0108468 116869582 116869674
00108567 116904174 116904433
01081731 117001692 117001870
00108573 117070087 117070192
00108576 117153566 117153823
00108578 117196538 117196813
001081644 117206992 117207391
00108579 117226056 117226234
00108580 117240674 117240858
00108584 117336471 117336821
00108585 117364742 117364845
00108586 117385650 117385816
00108589 117481892 117482165
00108590 117508690 117508966
- 33 016397
06108591 117520912 117521057
06108593 117567541 117567800
01081748 117589638 117589885
06108596 117629981 117630119
06108597 117654759 117654928
06108523 117691905 117692329
06108598 117691905 117692156
01081773 117708786 117708989
06108599 117713714 117714115
06108524 117713997 117714115
06108600 117742602 117743019
06108525 117742701 117742986
061081250 117861226 117861405
06108604 117867801 117868010
061081293 117932494 117932721
061081144 117950298 117950606
06108609 118014503 118014752
06108610 118041410 118041787
061081252 118085912 118086081
06108612 118092869 118093247
06108613 118126058 118126312
06108614 118150018 118150178
0108544 118164684 118164979
01081683 118211053 118211180
01081657 118287426 118287695
0108545 . 118299618 118299851
061081649 118306954 118307121
0108187 118317655 .118317730
061081295 118375973 118376205
06108624 118401694 118402073
061081203 118440472 118440835
06108627 118514695 118515072
061081650 118521021 118521210
061081681 118522946 118523333
06108628 118553693 118553836
06108634 118566844 118567191
06108639 118712208 118712596
06108640 118743450 118743821
ϋΐ 08221 118766458 118766560
061081686 118766464 118766561
06108641 118788135 118788401
061081651 118794961 118795267
061081255 118834290 118834438
06108644 118857362 118857745
061081652 118862172 118862311
061081654 118954536 118954869
061081688 118972583 118972717
061081689 118987319 118987480
061081690 119004704 119004986
01081425 119004742 119004920
- 34 016397
00108651 119030166 119030595
001081655 119044005 119044188
ΌΟ1081691 119078576 119078943
001081207 119094382 119094722
01081693 119109493 119109731
001081258 119131611 119131788
ϋΟΙ 08656 119177278 119177672
001081694 119177430 119177614
001081695 119204432 119204655
00108657 119204769 119205174
00108658 119223917 119224102
001081696 119243071 119243408
001081657 119282299 119282586
001081658 119290241 119290632
00108661 119305067 119305226
00108662 119317406 119317660
00108663 119330718 119331131
001081699 119364904 119365188
00108665 119396863 119397144
001081659 119412611 119412992
00108667 119448478 119448736
001081701 119473676 119473914
01081236 119473739 119473870
00108669 119485378 119485552
00108670 119505799 119505905
0108190 119510348 119510554
001081702 119510362 119510479
001081153 119526060 119526329
00108673 119606691 119606963
001081305 119615268 119615484
00108675 119659153 119659532
001081661 119663175 119663453
001081662 119700563 119700948
001081306 119703996 119704204
001081663 119783538 119783739
001081704 119783569 119783694
00108631 119788517 119788678
01081148 119803465 119803663
01081150 119803465 119803662
0108503 119803476 119803653
00108632 119811193 119811621
00108681 119811347 119811621
00108633 119833701 119833987
01082473 119833724 119833869
00108682 119838539 119838806
00108683 119853558 119853862
00108684 119880412 119880572
00108685 119909682 119910062
00108686 119923527 119923790
00108687 119954835 119955083
- 35 016397
ΌΟ1081212 119972358 119972707
ΏΟ1081261 119995566 119995727
001081350 120004924 120005036
ϋΟ1081 120030830 120031131
ϋ(3108693 120100794 120101005
ΌΟ1081263 120132349 120132528
Ш08542 120417003 120417230
ЭОЮ81664 120444685 120444808
001081163 120506796 120507066
00108703 120538236 120538484
00108704 120570334 120570593
00108706 120642052 120642312
00108708 120699520 120699811
00108709 120723780 120724158
01081701 120849161 120849428
00108716 120893782 120894153
001081669 120969521 120969659
00108720 121016792 121017048
01081792 121042408 121042574
00108722 121070320 121070693
001081181 121101362 121101685
00108724 121117025 121117286
001081670 121162511 121162898
00108726 121217327 121217580
001081167 121247552 121247838
00108729 121283257 121283429
00108730 121318865 121319131
00108731 121342622 121342893
001081278 121384227 121384464
00108734 121425229 121425633
00108735 121446549 121446695
001081185 121466936 121467248
001081129 121472295 121472600
001081085 121494260 121494657
001081327 121526700 121526830
001081271 121559895 121560066
00108741 121638254 121638391
001081087 121647884 121648273
001081359 121713760 121713892
001081120 121726128 121726519
001081671 121750886 121750993
001081673 121823695 121823925
00108749 121841816 121841997
001081134 121901381 121901668
001081674 121931406 121931809
00108755 121976143 121976435
01081757 121989325 121989539
5108209 121995173 121995376
00108757 122029990 122030248
001081283 122045222 122045429
001081191 122071761 122072115
00108761 122141102 122141322
001081678 122146312 122146535
00108762 122167889 122168135
00108763 122185793 122185925
001081284 122207287 122207508
001081137 122220809 122221073
00108766 122257534 122257929
00108767 122283871 122284250
001081361 122318975 122319081
001081680 122390160 122390294
01081230 122407279 122407403
00108772 122421708 122421845
00108775 122463781 122463941
00108777 122524358 122524547
00108779 122580228 122580603
00108784 122719087 122719236
01081483 122948181 122948324
0108587 124728937 124729112
- 36 016397
Анализ ассоциации единичного маркера с маркерами микросателлитами идентифицировал ассоциацию с ΙΧ.ΐ10δ478 (табл. 2 и фигура).
Таблица 2
Ассоциация ΙΧ.ΐ10δ478 с диабетом II типа в Исландии
Аллель Частота у страдающих заболеванием (п=1185) Контрольная частота (п=931) КК [95% Дов.инт] Двустороннее Р
0 0,636 0,724 0,67 2,1 х10’у
4 0,005 0,002 2,36 0,12
О А АГИ А А-^О 1 А 1 Л ААА
О и.иуэ и.и/о 1.Ζ1 иэиуи
12 0,242 0,178 1,48 4,6x10’7
16 0,022 0,015 1,53 0,076
20 0,001 0,003 0,39 0,17
X 0,364 0,276 1,50[1,31; 1,71] 2,1x10*
Наблюдалось шесть аллелей с этим тетрануклеотидным повтором, с аллелями 0, 8 и 12, несущие ответственность за 98% хромосом в контрольной популяции. Аллель 0 демонстрировал ассоциацию с защитой от диабета II типа (Ке1айуе К1§к (КК)=0,67; Р=2,1х10-9) относительно других аллелей, взятых вместе. Это значение Р является двусторонним и принимает во внимание, что некоторые пациенты являются родственниками. ΙΧ.ΐ10δ478 локализован в интроне 3 гена транскрипционного фактора 2, подобного 7 (ТСТ71.2 - бывший ТСЕ4) гена на 10ц25,2. Этот маркер находится в пределах хорошо определенного 14) блока в 74,9 т.п.о. (на основе СЕРН НарМар, фаза II для белой расы), которая включает часть интрона 3, весь экзон 4 и часть интрона 4 (см. фигура).
Когда ΙΧ.ΐ10δ478 был генотипирован в семьях СЕРН НарМар европеоидов, стало ясно, что наблюдается почти совершенная корреляция аллеля С 8№Р г§12255372 с аллелем 0 ΙΧ.ΐ10δ478 (г2=0,95, Р=5,53х10-38), а аллель Т в г§12255372 коррелирует с другими аллелями ΏΟ10δ478. Более того, риск возникновения заболевания, который придается аллелями 8 и 12 ΙΧ.ΐ10δ478, не отличается (Р=0,3). Поэтому естественно свести все не-0 аллели ΙΧ.ΐ10δ478 в составной аллель, который был назван X аллелем. Аллель X имеет частоту 27,6 и 36,4% в контроле и у пациентов соответственно. На основе предположения о мультипликативной модели (16, 17) по сравнению с риском для пациентов, не являющихся носителем, частота аллеля X была оценена значением КК 1,50 на имеющуюся в геноме копию.
Повторное исследование ассоциации ΙΧ.ΐ10δ478 с диабетом II типа.
Для верификации ассоциации ΙΧ.ΐ10δ478 с диабетом II типа микросателлиты были генотипированы в датской популяции для 228 больных пациентов и 539 контрольных. Датская группа была отобрана из проекта РЕКЕ, осуществляемого в Дании (19). Эта женская группа больных диабетом II типа была диагностирована предварительно. Ассоциация, наблюдаемая в Исландии, повторилась (табл. 3).
Таблица 3
Ассоциация ΏΟ10δ478 с диабетом II типа в Дании
Аллель Частота у пораженных заболеванием (п=228) Контрольная частота (п=539) КК [95% Дов.инт.] Двустороннее Р
0 0,669 0,740 0,71 0,0048
4 0,002 0,004 0,59 0,62
8 0,070 0,048 1,49 0,091
12 0,239 0,190 1,34 0,032
16 0,020 0,018 1,12 0,78
X 0,331 0,260 1,41 [1,11;1,79] 0,0048
Составной аллель риска X имеет частоту 26,0% в контроле и 33,1% в случае диабета II типа, давая рассчитанный КК 1,41 (Р=0,0048).
Позднее микросателлиты были генотипированы у представителей белой расы в США в 361 случае и у 530 контролей, участвовавших в исследовании РЕ№№ САТН. Это исследование является перекрестным исследованием ассоциации биохимических и генетических факторов при коронарном атеросклерозе в следующей друг за другом группе пациентов, которые подвергались коронарной катетеризации в Медицинском Центре Университета Пенсильвании. Диабет II типа был определен как история повышения уровня глюкозы натощак >126 мг/дл, через 2 ч после обеда > 200 мг/дл, пероральное применение гипогликемических агентов или инсулина и оральная гипогликемия у субъектов в возрасте старше 40 лет. В этой популяции также повторилась ассоциация, наблюдаемая в Исландии (табл. 4).
- 37 016397
Таблица 4
Ассоциация ΏΘ108478 с диабетом II типа в США
Аллель Частота у пораженных заболеванием (п=361) Контрольная частота (п=530) КВ. [95% Дов.инт.] Двустороннее Р
-4 0,001 0,000 - -
0 0,615 0,747 0,54 зГЗхЮ’9
4 0,003 0,004 0,73 0,72
8 0,085 0,049 1,79 0,0029
12 0,256 0,180 1,57 1,2x1ο·4
16 0,040 0,020 2,07 0,012
X 0,385 0,253 1,85 [1.51, 2.271 3,3x1 (Г9
Составной аллель риска X имеет частоту 25,3% в контроле и 38,5% в случае диабета II типа, давая рассчитанный КК 1,85 (Р=3,3х10-9). Объединение результатов из всех трех групп с применением модели Мантел-Ханесцел (Мап1е1-Напе8/е1) (ΝΟΊΈ 3) дает общее значение двустороннего Р 4,7х10-18.
Ассоциация составного аллеля риска для диабета II типа в трех популяциях дает строгое свидетельство, что варианты гена ТСТ7Г2 вносят вклад в риск развития диабета II типа.
После устранения сомнений относительно ассоциации аллеля X с диабетом II типа исследовали характер наследования более подробно. Доминантная и рецессивная модели могут быть отвергнуты, поскольку гетерозиготные носители явно имели повышенный риск относительно не носителей (Р<1х10-6) и пониженный риск по сравнению с гомозиготными носителями (Р<0,0001). Мультипликативная модель обеспечивает лучшее соответствие, но имеется свидетельство, что риск у гомозиготных носителей относительно гетерозиготных носителей больше, чем таковой у гетерозиготных носителей относительно не носителей. Табл. 5 обеспечивает свободные от модели оценки относительного риска гетерозиготных носителей по сравнению с не носителями.
Таблица 5
Свободные от модели оценки относительных рисков
Относительный риск генотипа 1
Группа 00 ОХ [95% Дов.инт.] XX [95% Дов.инт.]
Исландия 1 1,41 [1,17;1,70] 2,27 [1,70;3,04] 0,21
Дания 1 1.37 [0,98; 1,90] 1.92 [1,13;3,26] 0,17
США 1 1,64 [1,23; 2,19] 3,29 [2,13; 5,07] 0,28
Объединенная 1 1,45 [1,26,1,67] 2,41 [1,94; 3,00] 0,21
Три группы имели похожую популяционную частоту для аллеля риска, но оценки КК варьировали с наиболее сильным эффектом, наблюдаемым в группе из США, и наиболее слабым в датской группе. Хотя нет причины для того, чтобы КК был идентичен в группах, отмечается, что различия в оцененном относительном риске не вполне достигают статистической значимости (Р>0,05). При комбинации результатов из групп и предполагая общие относительные риски, гетерозиготные носители и гомозиготные носители оцениваются, как имеющие относительные риски 1,45 и 2,41 соответственно по сравнению с неносителями (табл. 5). Если предполагать популяционную частоту аллеля риска 26%, то гетерозиготные и гомозиготные носители составляют 38 и 7% популяции соответственно. Следовательно, этот вариант имеет достаточно предсказуемое значение для клинического применения. Соответствующий риск, приписанный популяции, составляет 21%, что является существенным с точки зрения здоровья общества.
Необходимо также отметить, что аллель X имеется в избытке у индивидуумов с нарушением уровня глюкозы в крови натощак (II'С') (концентрация глюкозы в сыворотке крови натощак между 6,1 и 6,9 мМ). Составной аллель X имеет частоту 27,7% у 1393 контролей и 37,1% у 278 НО, давая оцененный КК 1,54 (Р=1,36х10-5).
Ассоциация 8ΝΓ маркеров в ЬР блоке экзона 4 ТСТ7Г2 с диабетом II типа.
В табл. 6 приведен список микросателлитов и 8NР маркеров, находящихся в ГО блоке в пределах экзона 4 ТСТ7Г2. Таблица включает как общедоступные 8NР, так и 8NР, открытые при секвенировании полной области ГО блока. Кроме того, таблица обеспечивает данные о полиморфных микросателлитных маркерах, находящихся в пределах блока.
Полиморфные маркеры, локализованные в пределах ГО блока экзона 4 ТСГ7Г2 (между маркерами г§4074720 и г§7087006, позиции в соответствии с координатами версии 34: г§4074720 (В34: 114413084) г§7087006 (В34: 114488013) = 74929 п.о. Ссылки на идентификацию последовательностей указаны как присвоенные, отсылающие в каждом случае к номеру 8ГГ) ГО для амплимера, включающего полиморфизм, и прямые и обратные праймеры, как раскрыто в Списке последовательностей.
- 38 016397
Таблица 6
Общедоступные 8ΝΡ (включая все этнические группы НарМар)
Название в Локализация в Изменение Зеоиепсе ГО ΝΟ:
общедоступном источнике хромосоме 10, вер.34 основания
Г84074720 114413084 А/О
Г84074719 114413145 С/Т
гз4074718 114413204 С/Т
Г811196181 114413605 А/О
Г81196182 114414744 С/Т
Г84603236 114414765 О/Т
гз7922298 114414856 С/Т
Г817747324 114417090 с/т
Г37901695 114418675 с/т
гз11196185 114420079 с/т 17-19
Г34132115 114420083 А/С
Г84506568 114420628 А/Т
Г87068741 114420845 С/Т 14-16
Г87069007 114420872 с/о
Г87903146 114422936 с/т
Г511196187 114424032 А/О
Г37092484 114425520 А/О
Г310885402 114426284 А/С 11-13
Г812098651 114426306 А/О
Г86585198 114426824 А/О
гз7910244 114427209 С/О
Г812266632 114429546 С/О
186585199 114429758 А/О
Г87896811 114431304 С/Т
гз6585200 114433196 А/О
гз6585201 114433370 А/О
гз4319449 114433993 О/Т
Г812220336 114434854 А/О
Г37896091 114436550 А/О
Г812354626 114437016 А/О
Г87075199 114437307 С/О
Г87904519 114438514 А/О
1813376896 114441336 А/С
Г310885405 114442257 С/Т
Г310885406 114442311 А/О
Г811196192 114446874 О/Т
гз6585202 114447390 С/Т
Г87924080 114451599 С/Т
Г87907610 114451677 А/О
Г812262948 114452313 С/О
Г812243326 114453402 с/т 8-10
Г812265110 114453606 с/т
Г87077039 114453664 с/т
- 39 016397
Г511196198 114456472 А/О
Г312775336 114459590 о/т
Г37904948 114459672 А/Т
гз7100927 114460635 А/О
гз11196199 114460704 А/О
ГЭ17685538 114462058 с/о
гз11592706 114463573 с/т
гз7081912 114463678 А/О
гз7895340 114466112 А/С 23-25
гз11196200 114466525 С/О
гз11196201 114467894 А/Т
гз11196202 114470254 А/О
гз11196203 114470447 А/С
гз11196204 114470518 А/О
гз11196205 114471634 С/О 20-22
Г310885409 114472659 С/Т
Г312255372 114473489 о/т
Г312265291 114474827 с/т 5-7
гз7904443 114475774 А/О
Г511196208 114475903 С/Т
Г37077247 114476658 с/т
гз11196209 114477314 А/О
Г34077527 114477628 А/О
Г312718338 114477634 С/Т
Г511196210 114478558 С/Т
Г57907632 114481823 А/О
гз7071302 114482114 О/Т
Г312245680 114484778 С/Т
гз11196213 114486141 С/Т
гз4918789 114486394 О/Т
гз7085785 114487050 С/Т
гз7085989 114487326 А/О
Г37087006 114488013 А/О
В. Новые 8ΝΡ, открытые и впоследствии подтвержденные в ΡΙ) блоке экзона 4 ТСР7Ь2 (амплимеры ниже). ______________________________________________________________________________
Название согласно бесобе Локализация в хромосоме 10, вер. 34 Замена основания 8едиспсе ГО ΝΟ:
80108405 114418658 С/Т 26-28
80108428 114421901 А/С 29-31
80108422 114457824 А/О 32-34
80108427 114463480 А/Т 35-37
80108408 114466074 А/Т 38-40
80108409 114471574 А/С 41-43
80108406 114471618 С/О 42-44
80108407 114473534 с/о 45-47
С. Полиморфные микросателлиты в пределах РР блока экзона 4 ТСР7Ь2 _ (амплимеры ниже).
Микросателлиты Начало СЮ, вер.34 Конец СЮ, вер.34 Зециепсе ГО ΝΟ:
001082164 114460344 114460627 48-50
ЭО108478 114460845 114461228 2-4
00108479 114475487 114475632 51-53
- 40 016397
Таблица 7 Амплимеры и праймеры для избранных маркеров в пределах I Л) блока экзона ТСР7Б2 4 >00108478
ТТСАООССАТТООТОТТОТАТАТАТТТСААОАТТТОСТСАСАООТССААА
ОСТТААСТТААОСТСССТОАОАСАТАТСАТААААТАТОАТТТООООАААА
АСССТААТОООССАТОАТСАОААСАТТАТТАТТСААСАААООАТОАААТО
СТТААОССААОАТООСС1ТСТ1ТСТ1ТСТТТСТТГСТТТСТТТТТТТТТА
АТОАААОТТОАОСАОАСТСССОТССААСАОТТТТСААТОТАООААТТССС
АСАОССССАТТТОАТТОСАОТТТОТТОААААОТТТААТОТТТТТОТАООС
ААТТСАТААТТТССАСАТТОААСАОССТОАОАООААОАОАОСТООАОССС
АСТОТТОТТТТТОТАОТОООАТООТОООААСТТТ (8Е<2 ГО N0:2)
Праймеры:
Р: ТТСАООССАТТООТОТТОТА (8Е0 ГО N0:3)
К: АААОТТСССАССАТСССАСТ (8Е0 ГО N0:4) >гз12255372
ТТОТСССТТОАООТОТАСТООАААСТААООСОТОАОООАСТСАТАОООО
СТООСТТООАААОТОТАТТОСТАТОТССАОТТТАСАСАТААООАТОТОСА
ААТССАОСАООТТАОСТОАОСТОСССАООААТАТССАООСААОААТ
К
АССАТАТТСТОАТААТТАСТСАООССТСТОССТСАТСТССОСТОСССССС
СОСССССТОАСТСТСТТСТОАОТСССАОАТТСАОССТССАТТТОААТОСС
АААТАОАСАООАААТТАОСАТОСССАОААТССАСОТСТТТАОТОСАСТС;
СТССССАОСТССАААССТОТТАСТОСТТОТОТТСААСАТСТСАОТАААОС
ТСААСААСАТСОАСССАТТ (8Е(? Ю N0:5)
Праймеры:
Р: ТТОТСССТТОАООТОТАСТОО (8Е<3 ГО N0:6)
К.: ААТОООТСОАТОТТОТТОАО (8ЕЦ ГО N0:7)
- 41 016397 >гз12243326
ОСТОТОАААТССССТОТОТАОТОООААСААОАААТАОСАААТСТТАОСТО ССТТООАССТОАТАТААТТАТТТОТСТТСАТТТАСАТООТТ
Υ
АТССТТСААООТТОААТАААТОАТОТОООАОСТАОТСААООООСТТТАОО
ТАТОТОАТТТСАТОССТАСТТТТТТТТАООТАОАОАААСТОАООТСАСАО
00ТАСТА0А0ААТ00АСТСТАА0АТТСА00ТТТСТ0ААТТ0ССТ0Т60ТТ
ТТОТТОАСТСААСТОСТСТТСТОТТОТТТТТТАОССАСАТОССТТОАААС АСгТССТСТТТСССАТОТТТСТТСАТСАОСАССАТТААСССААООТАТАСТ ОТССТСТСТТАТСТТТСАСААООТСТТООАОТТСССАТОССТТТОТААОС атссстссссоаоаттсаосассаассаааатсасатттооаааааттос ТТОТТТСССААОААОСТТТООАООАТАТОАТТТТОТАТАОААСОООТТСА САООТТТТСТОТТСАТТСТТСТАТООТООАОТОТОТОТОТАТСтТОАСТСТ ОТСТТСТСТССАТТСС (8Е() ГО N0:8)
Праймеры:
Р: ОСТОТОАААТССССТОТОТАО (8Е(2 ГО N0:9)
К.: ООААТООАОАОААОАСАОАОТСА (8Е(2 ГО N0: 10) >187903146 ААОООАОАААОСАООАТТОАОСАОООООАОССОТСАОАТООТААТОСАОА ТСгТОАТСАСАТСТСТСССССАССАААСАСгААОАТТССТТТТТАААТООТО
АСАААТТСАТ6ООСТТТСТСТОССТСААААССТАОСАСАОСТОТТАТТТА СТОААСААТТАОАОАОСТААОСАСТТТТТАОАТА
Υ
ТАТАТААТТТААТТОССОТАТОАООСАСССТТАОТТТТСАОАСОАОАААС
САСАОТТАСАОООААООСААОТААСТТАОТСААТОТСАОАТААСТАООАА
АА00ТТА0А0000СССТ06АСАСА00ССТ0Т0Т0АСТ0А0АА0СТТ660С
АСТТСАСТОСТАСАТТТСАТСТСТТСОСТ (8ЕС) ГО ΝΟ: 11)
Праймеры:
Р: ААОООАОАААОСАООАТТОА (8Е(} ГО N0:12)
К: АОСОААОАОАТОАААТОТАОСА (8Е0 ГО N0:13) >гз4506565
СТОАТОАОООТАОООАОСАТСТОТСТОСАОСТТСАТСТТСАТТОТСТАОО ООСТССАОАААТАТСТОТОАОТАААТААОТТАТТТААТСТТТОССТСААА
- 42 016397
ТТТССА0Т0АСТ0ТА600АТАТА0СТ0Т0АСССТСТАС0АССТ0А0АТТТ
ТТТАААТТТСССАСТТАААСАТТТАТТТАААААТТТТОТССТСАССАТОО
АСТААООАСТТТАСАТТСАТТААСТСАТТТАСАОСТТОАТССТАТОСО6Т
ОООСАТТСАТТТАСАСАООАТСССАТТТТАСАОСТОАООААОАООССАОС
ТАООООТОСАОССТАООТТАОТАТТСТАОАОСТСАТСАООСТОТОТТСТС
СССАОТОАААОААТААОСАААОААОТСААТСТТОТОСАТТОАОАААААТС
АСТСТССОАООАбОАТОАОССТСТССбАТАТбСССАССОААОТОАТ
XV
ТООСтОСССТТОТСААСООТСТСТАТТАТСОСАТСААОААААОАТОСТОСТ ТТСОСТОАТОСССОАООАОАОССТСААТАТТТТАСАТОООАААССТАААА ААООО6ССАТОТТОТ6ОТСТСТОСАССТААОА (8Е<Э ГО N0: 14)
Праймеры:
Г: СТСАТСАОСОТАООбАОСА (8Е<Э ГО N0: 15)
К: ТСТТАСОТОСАОАбАССАСААС (8Ер ΙΟΝΟ: 16) >187901695
ТАТТТАОАААССАТААААТССАССТАТТТОАСОТаТАСААТТОАОТОАТТ ТТСТОТАТАОТСАСАОАТСТОТССАОТСАТССАСАСССТСТААСТССАОО АСАТТТТССТСАСССССОАООАОАААССТСССТТАСССАТТАССАОТСАС ТССТСАТТТССТСТССССССАОССССТОССААТСАСТОТ6ОАТТТОССТО ТТСТТОАСАТТТСАТАТАААТООТАТСАТААААТСТА
Υ
СООСТТТТСТОТСТОТСТССТТТСАСТТАОСАТАСОСТТСТСААСОТТСА ТССАОТАТТОТАОСАТСТАТСАСТАТОТСАТТССТТТТТАТООССАААТА АТАТТТТАТТОТАТСОАТАОАСАТТТТОТТТАТТСАТТТАТСТОТТТТТО ОТТАТТАТОАОТААСАСТАСТАТОААСАТТТТОСАСАААТТТТТОТАТТО АСАТОТТТТСАТТТСТССТОСОТАТАСТССТАТОАОТОаААТтеСТСб (8Е0 ГО N0: 17)
Праймеры:
Р: ТАТТТАОАААССАТААААТССАССТАТ (8Е() ГО N0: 18)
К: ССАОСААТТССАСТСАТАООАС (8Е() ГО N0: 19) >гз11196205
ТТОТСТССТТТТОТТТСТОСТАСТОТбААТОАТССТОТОАТОАТСАТСТТ
ТОТОТОТАААТСТТТОТССССТСОСССССТССССТТТТАТТАТТТТСТТО
- 43 016397
ООАТАОАССССАООАСААААООТАОААААОААСАААОТОТТААААААТТТ
СТТОАТАСАТАОССАСАОАТТАТТТТССТОАААОТТСТСААСАТТТАТАА СТАС
АОСАОТАТОТААОАОАОТТАТООТТООААТОАТТТТААТОТСТСТООООА АТТТААСААСАААААААСТТТАООСТТСТТТООАОАОАОАСАТОСССТТА АСТССАССССОСССТАОААСАОАОАСССАОСССАТССААОТСАОССТССС САООТССТССАССТТСААААСАОССАААСОАААТСАТТТСТТОААТААТТ ООТАООСТТСААООТСАОАТОТТ (8Ες ГО N0:20)
Праймеры:
Р: ТТОТСТССТТТТОТТТСТОСТАС (8Е0 ГО N0:21)
К. ААСАТСТОАССТТОААОССТАС (8Е<2 ГО N0:22) >гз7895340
ТСА006АСА0Т0САТА00Т0ТААА0АА0ТТ0СТ00ТТ60000ТТСТААТ0
САСОТТТСТССААААОТОААТОСССТОТТАААААААААТТСТТААСАААТ
АТАСАОАОАТТТТТТТТТТААААААОТОТОАСАОТТСТАОАСАССТАОАО
АОТААА
К
ТОААОААОССТОТТТТСАООТТТСССОССТСССТОААТТТСССАОСАТОО ТССАООСТТТОАААТТТАТТТАТСТОСТТТТООСААТООТТОАТОООААТ ТТСССАСАТТТАТТТТТТАОСТАСАОАОАААООАСАТТАТСТТТААААТС ТСТТСОТТОТТСТСТСТСТТТОА (8Е0 ГО N0:23)
Праймеры:
Р: ТСАОООАСАОТОСАТАООТО (8Е0 ГО N0:24)
К: ТСАААОАОАОАОААСААСОААОА (8Ε(^ ГО N0:25) >80108405
ТАТТТАОАААССАТААААТССАССТАТТТОАООТОТАСААТТОАОТОАТТ ТТСТОТАТАОТСАСАОАТСТОТОСАОТСАТССАСАСССТСТААСТССАОО АСАТТТТССТСАСССССОАООАОАААССТСССТТАСССАТТАОСАОТСАС ТССТСАТТТССТСТССССССАОССССТООСААТСАСТОТООАТТТОССТО ТТСТТОАСАТТТСАТАТААА
Υ
ООТАТСАТААААТСТАТОООСТТТТОТОТСТОТСТОСТТТСАСТТАОСАТ
- 44 016397
АСООТТСТСААООТТСАТССАОТАТТОТАОСАТСТАТСАОТАТОТСАТТС СТТТТТАТООССАААТААТАТТТТАТТОТАТООАТАОАСАТТТТОТТТАТ ТСАТТТАТСТОТТТТТООТТАТТАТОАОТААСАСТАСТАТОААСАТТТТО САСАААТТТТТОТАТТОАСАТОТТТТСАТТТСТССТОООТАТАОТССТАТ ОАОТООААТТОСТОООТСАТАТААТАААТААСТОТТТААСАТТТТООООА ОСТОССАААСТТТТААААССТТОООТТСТОТОАТОТАССАОТТОТОТТАО ОСА(8Е(ЩЖО:26)
Праймеры:
Р: ТАТТТАОАААССАТААААТССАССТАТ (8Ε(} ГО N0:27)
К: ТОССТААСАСААСТООТАСАТС (8Е0 ПЖО:28) >80108428
ТОССАООООТТТТАТООТТААТТТТССТССАТТАТОАОООТТОАСТСАОС СТТОООТАТТАОАТОТСТТТОАОААТССАОООТТСАААТАССАСАОСТОО ТАОААТОТТТСТСААСТТООАОССААТСТССАТСТАСТОААООТАСОСТО ОТТТАОАСАОАСААСАОООАСАТСАОСАТТТТАААААОСООТООАААААО ТТТОСТТОТСТТОАТТООАОССАТОАСАТТТТАТТТТОАААТТТСАААТА АСАТОААОООАООТТТООАОСООТТТТТООТТТАТССАААОООСАОТООА ТТОААООСТОАОАААСАССАООСТОААТОООАОАООООТТООООТССССС ТОТОАОАТАОТОАААСААТООТАОТОССАТССААТОАТАСЮСАСТТТТСТ ОТСАТТСАОААОСАОАААОООООССАОАООСССАТТООССТТАСТООО м АОТААОСТОТАОАОСТОСТОССТТТТСОТОАААОООТТОАСАССААССТТ СТСССССАООААОАОТОАССАОООАССТОАООООСАТООТСОАОСАОАТО АСАОССТТТОТААААСАТСТСС (8Е<2 ГО N0:29)
Праймеры:
Р: ТСгССАСЮОСгТТТТАТбСТТА (8Е<) ГО N0:30)
В: ООАОАТОТТТТАСАААООСТОТС (8Е<2> ГО N0:31) >80108422
ТТООТАОАОАТООООТСТССТАООСТООТСТТОААСТССТОО
В СТСААОСААТСТТССТОССТСАОССТТССАААОТАСТОООАТТАСТООСО
- 45 016397
ТОООССАССАТОССТООСТТОАААТТТТТСТАТОССТТТАТТСТТТСТСС ААОТАСАОАОТСТАСССААССТТСТОАОАТСТТТООТТТТСТТТТССТАО ОТААСТАТАОТАСАТАСТТАТТТАТОТТАААСААСАОСААТСАСАСАТТТ СТТТТТСТАТАСАОТСАТОСТТТАТАООСАААТАААОССТССОТСТТАОО СТТТСТООАТТТТТТСААААОАТОСААТТССТООАОТАТОТТТТТАСТТА ОАОСАААОСАОССТАСТСТССТАТАССТТСТОСАТСТОСАОААААОТТОО ТТАААСАОАСТТТОТААТОАТОССССТТАСААТТСТОААОООАСТТОТОА ААТАОТТТСАСАОАОТТТСАОТОТТАООТАТАТТТОАТСААТОСТААСТТ ТТСгОААААСТТТООТСгССТСгТАТСгАТТСАСАСгСгОТАСОССАбААТАТТАА АТТААТСАСААСТТСТТОТАТТТТААССАТТСТОООТАААТТОООАТТСС ОТОАСОСССАООСААААТТАТ (8Е0 ГО N0:32)
Праймеры:
Р: ТТООТА6АОАТООООТСТСС (8Е(2 ГО N0:33)
К: АТААТТТТОССТОООСОТСА (8Ер ГО N0:34) >80108427 ТАТСТТАТАТССССТССААОСАТТСАТТААСТОАТООАТТАОТОАОТТОО ССТТОАОААОСАТАААООСТСОТСТССАТОТОСТТСТААОСАТТОТОТСТ ААОТТСТОТТТООТТТССТОАОТОАААСТОТСТТААТОТТАССААСАОАА ОТТАААТОССТААОАО
ТТСТТАТАСАТОООСТОАОТАССТСТОТОАСТОООСААОССАССТСАССТ САТТТТАССТТОТСТОСААААТОАООААСТОООТСААСТСАТСОТТСААА ТСТСАСТОАААОСТААТТОАТСОСТТТТОАСАОААОТАОСТСССТТОООС СОТАТАТТТАТТТССТАОСТТООАООААООТООООАСАОАСАОААТТОАТ ОТАСАССТТТАТТТТТАТСТСТАТООТАААССТОТОСАТАСТАААОСАТТ ССТСТООТСТТТТОАСАТОАОТОТАТАСАТТСТОТСТООСССТОТОСАТТ ТТТТАССААОААОТААОТТТТОТТОАОТАААСТТОООТТОТАТОААОААС ТОСАТОСТСАСССтТАСТСААОТАОСТТТТОСТАССТАААООАСАОСТОСТ САТАТОТАСТТОАСТТССТТТАААОТОААООАТОАТОАСАТТТОАААААС ООАООТТОААААСОАО (8Е(2 ГО N0:35)
Праймеры:
Р: ТАТСТТАТАТССССТССАА6САТТС (8Ер ГО N0:36)
- 46 016397
К: СТССТТТТСААССТССОТТТТ (8Е0 ГО N0:37) >80108408 ТТОАОСАТОТОТТАТТТААТОАОТТАТАССТСТОТСАТАТОТОТОТОТТТ АТАТСАСААААТААСТТАТТТТТАТААААССАТАТТТТОАОТСАТСАТТТ ОТОАСААТОТСТТСТТТТСТСТООТАТАААТОАООСАТОТАОАААОААОА ТТОАСАТТТОСТАОААОСТТССССТТТССТСТААСТССАСААТААААТОС АТОСТСАТААТТАСАТСТОСТССТАТААООТСААОАТТТСАОООСТООАА ОТОАССТТАОАТСАТТТАСОСССААСТТОСССТСАООАААООАААСТОАО ОСССАОАОАТОССТТААОТОААТТОСССААТОТСАСАСОСТОАОТСАОТО ОССАОАССААООСТТООАТССАОТТСТСТОСТСССТТТССАОАОССТТОТ ОАТОТСТТСТСТССТАСАООАООТОААААТААСТОСТОТООСТООТТСТО ТТТТОСТОАСТОТАААТТОООТСАТООТСАОООАСАОТОСАТАООТОТАА АОААОТТОСТООТТОООООТТСТААТОСАООТТТСТССААААОТОААТОС ССТОТТАААААААААТТСТТААСАААТАТАСАОАОАТТТТТТТТТ
Ψ
ААААААОТОТОАСАОТТСТАОАСАССТАОАОАОТАААОТОААОААОССТО ТТТТСАООТТТСССОССТСССТОААТТТСССАОСАТОСТССАОССТТТОА ААТТТАТТТАТСТОСТТТТООСААТООТТОАТОООААТТТСССАСАТТТА ТТТТТТАОСТАСАОАОАААООАСАТТАТСТТТААААТСТСТТСОТТОТТС ТСТСТСТТТОАОТОАООАОАОААОАТОТОААТССТООСАОТООТТСАОАО ТООАСАСАОССССТОТОТТТОТСОСАТАООСТСТОТОСОССССАТОССАО ООАОСАОТАСССССОТОТАААООАОТОООООТТТОТССАТТТООАТАОАО САААОАТССТССАССТСАААТСССАСААОААСАОТТОССАСААССТОООС ССТААОСАТСТСАТТТТССТАТОТАОАААТТААТОАТСТООАООАОАТОО СААААСАТТССТТССАОАОССТОТОТООАТТТТОО (8Е(2 ГО N0:38)
Праймеры:
Г: ТТОАОСАТОТОТТАТТТААТОАОТТА (8Е() ГО N0:39)
К: ССААААТССАСАСАООСТСТ (8Ες ГО N0:40) >80108409
ТАОТОСТСАОТАТТТССААСОТТСТОТТТАТТТААОАТОААААТТОСТОТ АОТТААТААОСАСТТССССАТОТСАТТААААТОСТТААООАТТТТТААТО АССАСАТААСАОТССАТААТАТОАТТАААССССААТТТАСТОААТСААТО
- 47 016397
ССАТАТТОТТОООТСТТТАОАТТОТСТССТТТТОТТТСТОСТАСТОТОАА
ТОАТССТОТОАТОАТСАТСТТТОТОТОТАААТСТТТОТССССТСОССССС ТССССТТТТАТТАТТТТСТТОООАТАОАССССАООАСААААООТАОАААА ОААСАААОТОТТААА
М
ААТТТСТТОАТАСАТАОССАСАОАТТАТТТТССТОАААОТТСТСААСАТТ ТАТААСТАСОАОСАОТАТОТААОАОАОТТАТООТТООААТОАТТТТААТО ТСТСТООООААТТТААСААСАААААААСТТТАООСТТСТТТООАОАОАОА САТОСССТТААСТССАССССОСССТАОААСАОАОАСССАОСССАТССААО ТСАОССТССССАООТССТССАССТТСААААСАООСАААСОАААТСАТТТС ТТОААТААТТООТАООСТТСААООТСАОАТОТТ (8Е() ГО N0:41) Праймеры:
Г: ТАОТОСТСАОТАТТТССААСОТТСТ (8Е0 ГО N0:42)
К: ААСАТСТОАССТТОААОССТАСС (8Е() ГО N0:43) >80108406
ТАОТОСТСАОТАТТТССААСОТТСТОТТТАТТТААОАТОААААТТОСТОТ АОТТААТААОСАСТТССССАТОТСАТТААААТОСТТААООАТТТТТААТО АССАСАТААСАОТССАТААТАТОАТТАААССССААТТТАСТОААТСААТО ССАТАТТОТТОООТСТТТАОАТТОТСТССТТТТОТТТСТОСТАСТОТОАА ТОАТССТОТОАТОАТСАТСТТТОТОТОТАААТСТТТОТССССТСОССССС ТССССТТТТАТТАТТТТСТТОООАТАОАССССАООАСААААООТАОАААА ОААСАААОТОТТААААААТТТСТТОАТАСАТАОССАСАОАТТАТТТТССТ ОАААОТТСТ
ААСАТТТАТААСТАСОАОСАОТАТОТААОАОАОТТАТООТТООААТОАТТ ТТААТОТСТСТООООААТТТААСААСАААААААСТТТАООСТТСТТТООА ОАОАОАСАТОСССТТААСТССАССССОСССТАОААСАОАОАСССАОСССА ТССААОТСАОССТССССАООТССТССАССТТСААААСАООСАААСОАААТ САТТТСТТОААТААТТООТАООСТТСААООТСАОАТОТТ (8Е0 ГО N0:44)
Праймеры:
Р: ТАОТОСТСАОТАТТТССААСОТТСТ (8Е0 ГО N0:42)
К: ААСАТСТОАССТТОААОССТАСС (8Е0 ГО N0:43) >80108407
ТОСТАТОТССАОТТТАСАСАТААСОАТОТОСАААТССАОСАООТТАОСТО
- 48 016397
АОСТОСССАООААТАТССАООСААОААТОАССАТАТТСТОАТААТТАСТС
АООССТСТОССТСАТСТССОСТО
ССССССОСССССТОАСТСТСТТСТОАОТОССАОАТТСАОССТССАТТТОА
АТОСС.АААТАОАСАООАААТТАОСАТОСССАОААТССАСОТСТТТАОТОС
АСТСТСТССССАОСТССАААССТОТТАСТОСТТОТОТТСААСАТСТСАОТ
АААОСТСААСААСАТСОАСССАТТАСТТАООССТСАААССТТОООТООСА
ТСОТСОАТТОСТСТТТТСТТТСАТАССССАСАТТСААСССАТСАОСССАТ
СССАСАООСССААОТОТОТССТСТСТАССТТСАААОСОТОТОТООСАТСС АССОСТТАТСАССАССТСТОССАТТАССАСТООАОТССАОТОССАТСАТС ТСТАСТТООАТОТООССАОАОТОТСТТТОСТООТСТССТТСТТССТСС ТАССТТТОТААСАОССТАТСАТСТАТСТСТООТСТССАТАОСТСАСТССС АТАСТТТОАОАОООССТТТОАААОССТТАОАСАОАТСАТАТСАСАОАССТ СТАТАСТОАААОТСООО (8Е(? ГО N0:45)
Праймеры:
Р: ТОСТАТОТССАОТТТАСАСАТААОО (ЗЕС) ГО N0:46)
К: СССОАСТТТСАОТАТАОАООТСТО (8Е<3 ГО N0:47) >001082164
ССАТСТОТООАОСАОАОТСАСТОАААООАААТАСТООАААТАСТООААОС
САСТТООТОТТТТАТСААООАТОТОАООТТТССТООСААСТТТОТСОССА
ТАТСАТСАТСАТСАТСАССАТСАТСАТСАТСАТСАТСАТСАТСАТСАТСА ТСАТСАТСАТСАТСАТСТОСССТТТААОТТТТСТОСТТОТТТАОААААОА ААТТТАТАСАОАОСССССАОТАОСАОСТОТААОООООСАООТТСТТООАО
САОСССАТССТСААСАТТСТТОСТОСТОАТООАА (8Е<2 ГО N0:48)
Праймеры:
Р: ССАТСТОТООАОСАОАОТСА (8Е0 ГО N0:49)
К.: ТТССАТСАОСАОСААОААТО (8Е<3 ГО N0:50) >00108479
ТССАСОСАОАОАООАТСТАААТСТООСТСТТТОСААТТСССТТСАТАСАТ ОТОСАТАСАСАССАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСА САОАСАСАТАСАТАТОСАСАСАССССОАСТСААТООАООАСССТС (8Е0 ГО N0: 51)
Праймеры:
Р: ТССАСОСАОАОАООАТСТААА (8Е<2 Ю N0:52)
К: ОАОООТССТССАТТОАОТСО (8Ер ГО N0:53)
Для дальнейшего исследования возможности того, что другие маркерные аллели в 1.1) блоке экзона 4 ТСР7Ь2 проявляют более высокую корреляцию с диабетом II типа, чем аллель X, использовали данные БС108478 генотипа, полученные в НарМар СЕЬТ образцах. Пять 8ΝΡ из НарМар фаза I были с более сильной корреляцией БС108478, в порядке уменьшения, гз12255372 (г2=0,95), гз7903146 (г2=0,78), Г87901695 (г2=0,61), гз 11196205 (г2=0,43), и гз7895340 (г2=0,42). Генотипировали эти 8ΝΡ в трех группах и корреляции между пятью 8ΝΡ и БС108478, причем последний рассматривали как биаллельный маркер, были очень похожи на те, что наблюдались в СЕИ образцах. Все пять 8ΝΡ продемонстрировали ассоциацию с диабетом II типа. В то время как некоторые 8ΝΡ показали несколько большие рассчитанные относительные риски и более низкие значения р в одной или двух группах, ни один из них не продемонстрировал более сильной ассоциации с диабетом II типа, чем БС108478, когда результаты для всех трех групп были объединены с применением модели Мантеля-Хензеля (Мап!е1-Наепз/е1). Однако, хотя гз11196205 и гз7895340 отчетливо имели более слабую ассоциацию с диабетом II типа по сравнению с аллелем X (КК=1,56, Р=4,7х10-18), сила ассоциации с диабетом II типа аллеля Т для гз12255372 (КК=1,52, Р=2,5х10-16) и аллеля Т для гз7903146 (КК=1,54, Р=2,1х10-17) являются сравнимыми.
Согласно последнему выпуску НарМар, фаза II в октябре 2005 г., были идентифицированы два дополнительных 8ΝΡ, которые демонстрируют сильную корреляцию с микросателлитом БС108478 гз12243326 (г2=0,961) и гз4506565 (г2=0,716). Аллели, ассоциированные с восприимчивостью к диабету II типа, будут С для гз12243326 (С/Т 8ΝΡ) и Т для гз4506565 (А/Т 8ΝΡ).
Необходимо отметить, что среди тех гаплотипов, которые несут С аллель гз7903146, те, что несут аллель А гз 10885406, имеют рассчитанный относительный риск 1,06 по сравнению с индивидуумами, несущими С аллель гз10885406, но различия не являются статистически значимыми (Р=0,22).
- 49 016397
В попытке повторить и детализировать эту ассоциацию с диабетом II типа, генотипировали ПС10Б478, гк12255372 и гк7903146 в дополнительной большой датской группе, состоящей из 1111 больных и 2315 контрольных индивидуумов, а также в более генетически разнородной группе из Западной Африки, состоящей из 618 больных и 434 контрольных пациентов, набранных из Афро-Американского исследования сахарного диабета (23). У датчан все три варианта были строго ассоциированы риском заболевания, как это предварительно наблюдалось в Исландии. Однако ассоциация аллеля Т гк7903146 (ВВ=1,53, Р=4,06х10-14, ΡΑΒ=24,4%) была значительно сильнее, чем того, что обеспечивали два других варианта. В Западно-Африканской группе после введения поправок на родственные связи и этническое происхождении, повторно наблюдали ассоциацию аллеля Т гк7903146 с диабетом II типа (КВ=1,45, 95% дов.инт. = 1,20-1,76, Р=0,000146, ΡΑΒ=22,2%), но не наблюдали ее в случае других двух вариантов. Это позволяет предполагать, что аллель Т гк7903146 является либо вариантом риска сам по себе, либо наиболее близко из известных коррелирует с неидентифицированным вариантом риска. Исключение маркеров ОС108478 и гк12255372 из маркеров риска в Западно-Африканской группе было возможным, поскольку в популяции европейского происхождения, где Т аллель гк7903146 имеется почти исключительно в хромосомах, несущих как аллель X ПС10Б478, так и аллель Т гк12255372, у индивидуумов из Западной Африки Т аллель гк7903146 имеется с обоими аллелями ПС10Б478 и гк12255372. Это согласуется с наблюдением, что Т является исходным аллелем гк7903146, в то время как аллель X ЭС108478 и аллель Т гк12255372 отличаются от контрольной последовательности шимпанзе. Если говорить более широко, то это открытие согласуется с ожиданием, что относительно разнообразные популяции, такие как популяция Западной Африки, обеспечивают возможность для очищения сигналов ассоциации, обнаруженных в областях сильного БЭ в более гомогенных популяциях.
Обсуждение.
В этом исследовании описывается идентификация нового гена-кандидата для диабета II типа в пределах предварительно обнаруженной области взаимодействия в 10ц (10), кодирующего транскрипционный фактор 2, подобный 7 (ТСР7Ь2, бывший ТСР4) на 10д25,2. Показано, что он придает риск развития диабета II типа в Исландии, Дании и США с похожей частотой и относительными рисками. В то время как этот вариант не объясняет существенной части семейного диабета II типа, приданный популяции риск по меньшей мере 20% является существенным с точки зрения здравоохранения. По сравнению с индивидуумами, не являющимися носителями, относительные риски гетерозиготных носителей составного аллеля риска (приблизительно 38% популяции) и гомозиготных носителей (около 7% популяции) составляют 1,45 и 2,41 соответственно. Следовательно, этот вариант имеет достаточное предсказательное значение, чтобы быть клинически применимым.
Авторы изобретения сообщают о варианте, как ассоциированном с диабетом II типа микросателлите, ЭС108478, находящемся в третьем интроне гена ТСР7Ь2. Продукт гена ТСР7Ь2 представляет собой транскрипционный фактор, содержащий бокс группы высокой подвижности (НМС), который играет важную роль в \УШ сигнальном каскаде. Этот каскад рассматривается как один из ключевых в механизмах развития и регуляции роста клетки; он опосредован секретируемыми гликопротеинами, известными как ^и!, которые инициируют многие сигнальные каскады в клетках-мишенях при связывании с родственным рецепторным комплексом, состоящим из члена семейства Бпхх1еб и члена семейства БОБ рецепторов, Ьгр5/6 (24). \УШ каскад обеспечивает несопряженность центрального игрока каскада, β-катенина за счет деградации комплекса и транслокации его в ядро, где он временно превращает ТСР факторы из репрессоров в активаторы транскрипции (25). Белок β-катенин является также важным для клеточной адгезии, благодаря его связыванию с кадгеринами (15).
NСВI БеГ8ес.| для ТСР7Б2 включает 10 экзонов. Однако Дюваль и соавт. (Όιινη1 е! а1.) (26) показали, что ТСБ7Б2 имеет 17 экзонов, 5 из которых являются альтернативными, кроме того, дополнительно сообщалось, что используются три акцепторных участка альтернативного сплайсинга. Это исследование также продемонстрировало альтернативное использование трех следующих друг за другом экзонов, расположенных на 3' конце гена ТСР7Б2, которое изменяет рамку считывания, используемую в последнем экзоне, приводя к синтезу большого количества изоформ ТСБ7Б2 с короткими, средними или длинными С-концами.
Подобно ТСР7Б2, пять из шести позиционно клонированных генов для редких Менделевых форм диабета II типа, а именно диабета зрелого возраста у молодых (МОБУ), являются генами транскрипционных факторов (27). Дополнительные транскрипционные факторы вовлечены в патогенез диабета II типа, включая активированный пролифератором пероксисом рецептор гамма (ΡΡΑΒγ) (7) и ген семейства Гогкйеаб (28, 29). ЛоЬ1е е! а1. описали миссенс-мутацию (С883А) в родственном ТСР7 гене при диабете I типа (30). Однако не ясно, работают ли ТСР7 и ТСБ7Б2 в одном каскаде по отношению к патогенезу диабета.
Были описаны мутации в гене ТСР7Б2, включая делецию А в (А)9 кодирующем повторе (экзон 17) (26, 31-33), и ряд мутаций в колоректальных клеточных линиях (26). БС108478 находится в хорошо определенном ББ блоке в 74,9 т.п.о. (СЕРН НарМар для белой расы, фаза II), который включает экзон 4 и фланкирующие интронные последовательности, расположенные 5' и 3' по отношению к экзону. Возмож
- 50 016397 но. что ЭС10З478 является сам по себе причиной; возможно также. что ΌΟ108478 является заместителем для основного варианта. который влияет на транскрипцию. сплайсинг или стабильность мРНК. Вероятно. такой вариант находится в сильной ЙЭ с ΌΟ108478. т.е. вариант сохраняется в пределах ЬП экзона 4 ЙЭ ТСЕ7Б2.
Несколько линий доказательств позволяют предполагать энтероэндокринную роль этого гена в патогенезе диабета II типа. Во-первых. ТСЕ7Ь2 вовлечен в развитие колоректального рака (34) и уже описаны малые молекулы-антагонисты онкогенного белкового комплекса ТСЕ/ β-катенин (35). Кроме того. у ТС.Т7Е2-[-мышей. которые умирают в течение 24 ч после рождения. отсутствует компартмент стволовых клеток эпителия кишечника (36). Варианты ТСЕ7Ь2 гена могли бы влиять на восприимчивость к диабету II типа через изменение уровней инсулинотропного гормона - глюкагонподобного пептида 1 (СЬР-1). одного из пептидов. кодируемого геном проглюкагона. экспрессия которого в энтероэндокринных клетках на уровне транскрипции регулируется ТСЕ7Ь2. Согласованно с инсулином СЬР-1 оказывает решающее действие на гомеостаз глюкозы в крови (12). Аналоги СЬР-1 и ингибиторы дипептидилпептидазы IV в настоящее время находятся в стадии клинической разработки.
Хотя это изобретение было конкретно продемонстрировано и описано со ссылками на его предпочтительные воплощения. специалисту будет понятно. что могут быть проведены различные изменения в форме и деталях без отклонения от рамок изобретения. охватываемых приложенной формулой изобретения.
Ссылки
1. А.Е. Атов. Ό.Ι. МсСайу. Р. 21тте!. Ь|аЬе1 Меб. 14 Зирр1. 5. Ы (1997).
2. Р. 21тте! е! а1.. Ат. I. Ер1бетю1. 118. 673 Щоу.. 1983).
3. №.С. Кпот1ег. Ό.Ε Ре!йй. М.Е. Зааб. Р.Н. Веппей. Ь|аЬе1ев Ме!аЬ. Кеу. 6. 1 (ЕеЬ.. 1990).
4. В. №ттап е! а1.. П1аЬе!о1од1а 30. 763 (0с!.. 1987).
5. А.Н. Ватей. С. Ей. Κ.Ό. Ьевйе. О.А. Руке. П1аЬе!о1од1а 20. 87 (ЕеЬ.. 1981).
6. А.Ь. С1оуп. Адетд Кев. Кеу. 2. 111 (Арг.. 2003).
7. Ό. А1!вйи1ег е! а1.. №Н. Сенек 26. 76 (Зер.. 2000).
8. А.Ь. С1оуп е! а1.. Ь|аЬе1ев 52. 568 (ЕеЬ.. 2003).
9. Υ. Нопката е! а1.. №Н. Сенек 26. 163 (0с!.. 2000).
10. I. Кеушвбойй е! а1.. Ат. I. Нит. Сенек 73. 323 (Аид.. 2003).
11. К. Пиддпа1а е! а1.. Ат. I. Нит. Сенек 64. 1127 (Арг.. 1999).
12. Е. Υί. Р.Ь. ВгиЬакег. Т. Ιίη. I. Вю1. СНет. 280. 1457 (1ап. 14. 2005).
13. 8.Е. Ковв е! а1.. ЗОепсе. 289. 950 (Аид. 11. 2000).
14. Е.А. Ьтввон е! а1.. Ргос. №11. Асаб. Зск ИЗА. 102. 1460 (ЕеЬ. 1. 2005).
15. №.1. №1воп. К. №вве. Заепсе. 303. 1483 (Маг. 5.2004).
16. С.Т. Еа1к. Р. КиЬтв!ет. Апп. Нит. Сенек 51 (Р!. 3). 227 (1и1.. 1987).
17. Ι.Ό. Тегг1Шдег. I. 0!!. Нит. Негеб. 42. 337 (1992).
18. ЬК. Си1сйег. К. Кг1в1]анввон. Н. СнбЬ]аг1ввон. К. З1еГанввон. Еиг. I. Нит. Сене!. 8. 739 (0с!.. 2000).
19. Υ.Ζ.Κ Ваддег. ВЛ. А1ехапбегвеп. Р. Танко. Ь.В.; Скпвйапвеп. С.. I. Воне Мтег. Кев. Зирр1. 1. 1 (2001).
20. С. Венвон. Кис1ею Ас1бв Кев. 27. 573 (бан. 15. 1999).
21. К.С. Ьетопйп. СепеЕсв 50. 757 (0с!.. 1964).
22. №.С. НШ. А. КоЬейвоп. Сепейсв 60. 615 (№ν.. 1968).
23. С-Ν. Ко!1Ш1 е! а1.. Апп. Ер1бетю1. 11. 51 (1ап.. 2001).
24. С. Ргишег. В.А. Носеуаг. Р.Н. Ноте. Сгот!й Еас!огв. 22.141 (Зер.. 2004).
25. I. Ние1вкеп. №. Вйс1нпе1ег. Сигг. 0рт. Сепе!. Ьег. 11. 547 (0с!.. 2001).
26. А. Оиуа1 е! а1.. Сапсег Кев. 60. 3872 (бн1. 15. 2000).
27. З.З. Еа.)апв. С.Ь Ве11. К.З. Ро1опвку. Ν Епд1. I. Меб. 345. 971 (Зер. 27. 2001).
28. С. №о1£гат. Е. АвПтах. Е. Ьиса. ЕМ. Епебтап. М. З!ойе1. №!1иге. 432. 1027 (Лес. 23. 2004).
29. I. Nакае е! а1.. Νι!. Сепе!. 32. 245 (0с!.. 2002).
30. 1.А. №Ь1е е! а1.. 1)1аЬе(ев 52. 1579 (1ип.. 2003).
31. А. Ьнуа1 е! а1.. Сапсег Кев. 59. 4213 (Зер. 1. 1999).
32. А. Оиуа1 е! а1.. 0псодепе 18. 6806 (№ν. 18.1999).
33. Н.К. СНанд е! а1.. Сапсег Ье!! (Мау 16. 2005).
34. Ν.Ά. №опд. М. Р1дпа!еШ. Ат. I. РаЛо1. 160. 389 (ЕеЬ.. 2002).
35. М. Ьероигсе1е! е! а1.. Сапсег Се11 5. 91 (1ап.. 2004).
36. V. Коппек е! а1.. №!. Сепе!. 19.379 (Аид.. 1998).
- 51 016397
Список последовательностей
<110> ОЕСООЕ СЕЫЕТ1СЗ ЕНЕ. 6ΚΑΝΤ, ЗБгиап Г. А.
<120> ΟΕΝΕΤΙΟ νΆΗΙΑΝΤ3 ΙΝ ТНЕ ТСЕ7Н2 ΞΕΝΕ АЗ МАСИОЗИС МАККЕКЗ ЕОВ.
ΗΙ3Κ ОЕ ΤΥΡΕ 2 ЭТАВЕТЕЗ МЕЬЫТОЗ
<130> 2069-РС
<150> из 60/692,174
<151> 2005-06-20
<150> Н8 60/757,155
<151> 2006-01-06
<160> 53
<170> РаБепЫп νβΓ31οη 3.3
<210> 1
<211> 74930
<212> ΟΝΑ .
<213> Ното зархепз
<400> 1 · .
сЬЪдЪдЪадд аасБсасдсБ ЪЪдЕЪЪаЪЪс адсаакса-Ы: ссЪссадааа Ъаасс1:1:аа1: 60
адсаасаада ааааадаака ддЪдб-ЬЪЪЪЬ дадсБскаБс БдссадЪБЪс ЪсЪаЬаБакд 120
дасаЪЬакаЪ аЕЪдсаасак аасасЬсаса аБдссЪЪБаа асаБсаБссс сдЬБаБасад 180
аЪаадаааас адааЪБЕсаа адааддЪадд ддасБЪдссс адддаБасаЪ адскадсаад 240
ЪддсадсдсБ ддаББдадйс •ЬдддссЪЪд!: скдаддсБсд ддБссБдкса БдсЪсБдсдд 300
ЪЬдсЪакдЪЪ дасакдсааа дддададдса дскдсЪддда дЬсЕаддЪдд дЪБЪсЬсЬЫ: 360
дадаа'Ьдсйа асдЪдаассс ЬсааддЪдаа Ьсадаа'Бсс’Ь кккдсаадкд ааБааксада 420
Ъдкадд'ЬЪсс БдкдйсЬссс ЪдЬааааЪда аадссЪсЬЪЬ Ь-ЬкссааддБ ссадбакада 480
ссБдаадсЕд ддЬкасБсЬд дааЬЕЬсссЬ сЪсБддсБдд адЪдасБдад дссЪБдсасд 540
ЪдасаЕБддЕ даддасЕсдс адссксаддБ сЬддсЪЪссс ЪЪадсаассс ссс-ЬЪЕссЪд 600
ЬсксБдссБс ЪддадЪЪсас саЪБаааааа ааааааадаа ааааадссаа аасасй^аЪ 660
ааадЬЬасаЪ дсЬддд^ББс Ь-ЬсЪаЬд'Ьсс ЪадааасЪдЪ сЪЬаа-ЬксаЪ скЪссссЪ·!:!: 720
асБсБЪаБа!: дадсаддаад аааааааааЪ ЬдсйадБсаа Бдс-Ьаа-ЬааЪ БаЪддсаЪд!: 780
ааЬдкааБЪд да а дБ дБ 1:1: с асбдасаЬдс ЪсаЪдададк Б-ЬдсддсБ-ес аБсББсаддс 840
ЪдддаЪдБад саскадасЪЕ дссЬБдадЪд БсЪдсасаад ссБЕЪда-едс адд-Ьадасса 900
Ъа1:1:а1:ааа1: аддсдсдЪБд сЪаЬддйдад да1:ддсад1:с с-ЬкдскБдс!: дЪдддЬаасс 960
ЪЪйБсЪассЪ БсБсддасас ЬдЬЪББаааа сасадсадсд БдаЬадса-Ы: Бса-ЬЪЕааЫ: 1020
- 52 016397
Еддассаадд ЕддддЕадаЕ даааЕдЕЕда даЕЕЕадаЕс ЕааааЕдЕЕд ЕЕдЕддЕдЕЕ 10В0
ЕсадддддЕЕ сЕддсЕсасс ЕадЕасЕаЕд даадаЕЕЕЕд садаЕЕдддс ЕЕссЕсаЕда 1140
ЕЕЕаЕЕЕада ааЕадаЕЕЕЕ сЕааЕадаЕд дддЕдадддд адддЕддЕдд дсадааддсЕ 1200
дддсЕЕЕсЕЕ сЕсЕЕссссс ЕссЕссЕЕЕс аЕЕдадсдсЕ ЕсЕдсдааЕд ЕдЕЕддсЕЕЕ 1260
даЕдссссад дадсЕсаЕаа адЕдаааЕдд аадЕЕсаддЕ ЕддсасдЕЕд садаааЕдаЕ 1320
ЕаЕЕссЕддЕ адЕасдЕЕЕс ссаЕЕасЕдЕ ЕааЕааЕаЕа аадасааЕЕд ссЕдссЕаЕс 1380
аддасЕссЕд сасдЕддсЕа садЕсаЕЕЕс ЕЕсаЕддааЕ ЕадасасаЕа дсадЕдддда 1440
ссаддадЕдЕ ЕЕЕаЕЕадЕд аЕЕдЕссЕсс ЕдсаадЕЕЕс садддЕаЕсЕ садсЕЕадас 1500
асаЕдааЕЕа ЕЕЕЕЕЕссЕд ЕЕдсЕЕддад ддЕаЕасЕЕЕ ЕааЕЕаЕаЕЕ саЕЕсааЕаа 1560
сададсадЕЕ саддЕЕЕдЕа аааЕаЕЕЕЕЕ ЕсЕсссссаа ссЕЕЕЕсссс адсаЕасаЕс 1620
сссдЕсссдЕ аадЕЕЕсЕдд дсададасаа ЕсЕсаддаас сЕаааддЕЕд сЕааааааЕЕ 1680
адсЕадЕЕдд асаддсдсаЕ дасЕсаЕдсс адЕааЕссса дсасЕЕЕддд аддсЕдаддЕ 1740
дддЕддаЕсд сЕЕдадссса даааЕЕсдад ассадссЕад асаасаЕддс аааасссЕдЕ 1800
сЕсЕасааас аааасааааЕ сЕадсЕдддс аЕддЕддЕдс аЕдссЕдЕад ЕсссадсЕас 1860
ЕддддаддсЕ даддЕдддсд ддсдаЕЕдад сЕсаддаддЕ ссаддсЕдса дЕдадссдЕд 1920
аЕЕдЕдссас ЕдсасЕдсад ссЕддаЕдас ЕдадЕдддас ссЕдЕсЕсаа ЕааЕаааЕаа 1980
аЕаааЕаааЕ ааааааЕааа аааааЕЕадс ЕадссаадсЕ дсЕЕаЕаддЕ сЕЕЕЕасаЕд 2040
дссаадссас ЕЕЕсЕсассЕ ЕЕааааЕддЕ 'ааЕаасдЕЕЕ ссдЕасЕсаЕ сЕсааЕдддЕ 2100
ЕЕЕдадЕдсс аадасадасс дЕЕЕдаЕдда адсссЕсЕдд ддадаааааЕ дсЕасссаад 2160
асаддсЕЕЕЕ сааЕЕддада сЕдаЕссаЕЕ ддЕдЕЕЕЕдд ЕсадЕЕддЕд ЕЕдаааЕссс 2220
ЕаЕЕЕЕЕсса дсЕсаддасЕ дссЕсЕсЕсс сЕддаасЕсЕ ЕсссдаддЕд адЕЕсЕдсад 2280
ссЕЕссЕЕдд даасЕсЕсад ссЕсЕддаЕс ссЕЕсЕЕдсс аддЕддадЕд дасаЕдссаа 2340
адЕЕдЕдддс садасЕсдда сЕдссЕддсЕ ЕдЕсЕсадса ссЕЕЕдддда сссасЕЕссс 2400
сЕсЕсЕддда асЕддддаад сЕаасадада ЕсЕЕдсЕадд ддддЕддааЕ ссЕдЕаЕсса 2460
ЕдЕдаддЕЕд Еасссссадд сЕссЕдадЕд дЕЕЕдааадЕ ддддаасссЕ ддссдддсдс 2520
ддЕддсЕсаЕ дссЕаЕааЕс ссадсасЕЕЕ дддаддсЕда ддсдддсдда ЕсасааддЕс 2580
аддадаЕсда аассаЕссЕд дсЕаасасда Едааассссд ЕсЕсЕаЕдЕд сдЕддЕддсЕ 2640
ддсассЕдЕа дЕсссадсЕд сЕсдддадЕс Едаддсадда дааЕддсдЕд аасссдддад 2700
дсддадсЕЕд садЕдадссд адаЕсдсссс асЕдсасЕсс адссЕдддсд асададсдад 2760
- 53 016397
асЕссаЕсЕс аааааааааа адааадаааа ааааадааад Еддддаассс сЕсссссадд 2820
аЕдадаадад ссаЕддддЕд адЕсЕсЕдсс ассдссаадд ддадЕсадда ЕсададдсЕд 2880
сЕасадддас адссадсЕсЕ сЕЕЕадаЕдд ЕссссассаЕ сЕадЕсаддд сЕЕдЕЕасаЕ 2940
аЕддадсада дасадсдсад дсЕдсЕдсЕд ЕЕЕЕссЕдда дааддссссЕ дЕсддЕсЕдЕ 3000
ЕсадсЕдЕад сЕдассЕЕЕс сЕссЕЕдЕдс ЕЕЕЕЕдддда дддадссЕЕд дааддадЕад 3060
ддсасдЕддд дсасЕсЕдсЕ Есссддсссс асасЕддсда ассЕаЕддаЕ ЕсЕдссЕсЕд 3120
аЕЕссЕдадд ааасаЕсасЕ дЕдааддЕдд ааЕдадссас аЕасададдЕ ддсЕдЕЕддд 3180
дссддддадд ддЕдааасдс ссссадддЕд ЕасаЕЕдсас саааадссад дсЕдсаЕаЕа 3240
дассЕсадда ЕдддсЕддсЕ ЕЕЕсЕаЕЕЕа ЕЕЕадаадЕа ЕЕЕссададд дЕаассЕсаЕ 3300
ЕддсЕасааа дсаЕдЕсЕда асаададсЕс сдЕЕдЕЕсаЕ ЕсссадсссЕ дЕЕасссЕдд 3360
саддаЕдсад асЕссаддсд дссЕдЕЕддЕ саддссЕЕдд асЕсададад садЕдаадсс 3420
Едаддадддд Еддддддсад аддсдЕдадЕ ддЕсЕадддс сЕсадЕсссЕ ссаддасасс 3480
ссЕЕдссаад сдсададааа дсЕсЕдссса ЕссдЕссссЕ саддсадЕдд даЕЕдддсаа 3540
ссЕдддаадс адЕдааЕдЕд сдЕсддЕадс аЕадаЕЕсса ЕЕссдсасдс сасссЕсдсс 3600
Ессдсссссс адсссЕддда дддаЕдсаЕд сссЕссддда дасасссада сссдасадад 3660
аддссЕЕЕдЕ ЕддадсЕдда ддЕдадааЕс ЕдЕдддсдЕЕ дддаЕЕссЕд ддЕЕсдадЕЕ 3720
ссадсЕсасЕ дссааЕЕдсс сдадЕдсЕдд дсдаасаЕЕЕ сЕддааЕсаа ааддадЕдса 3780
дссЕдсссад садддссЕас дддадссдда ддсЕдсаддд ЕдсЕаадаЕЕ дсдЕЕаЕсЕЕ 3840
ЕассаадЕдс ссддадсЕсс Едддадддаа дадададЕсс ЕаддасЕсад даЕаддаддЕ 3900
ддЕЕддадЕЕ ЕсЕсдаддаа дасЕссаЕдс ЕЕЕддЕЕсЕд дссссЕддаа ассссЕссЕд 3960
аддасЕддас сЕссаадсад асссссЕсЕд ЕдасЕссдда аЕдсадЕдЕЕ асЕсЕсЕЕаЕ 4020
аЕЕЕЕЕсЕЕЕ сЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕдадасд дадЕсЕсасЕ сЕдЕсассса ддсЕддадЕд 4080
садЕддсасд аЕсЕсддсЕс асЕдсаассЕ ссдсссЕссд адЕЕсаадсд аЕЕсЕссЕдс 4140
сЕсадссЕсс саадЕадсЕд ддаЕЕасадд ЕдссЕдасас сдсдссЕддс ЕааЕЕЕЕЕЕд 4200
ЕаЕЕЕЕЕадЕ ададаЕдддд ЕЕЕЕассаЕс ЕЕддссаддс ЕддЕсЕЕдаа сЕссЕдассЕ 4260
саЕааЕссас ссдссЕсддс сЕссдааадЕ дсЕдддаЕса саддсдЕдад ссассдсасс 4320
сддссасЕдЕ сЕЕдЕаЕЕЕс ЕаасдЕсссс сЕдасЕЕЕЕс ЕдаЕсаЕдЕа аЕЕсЕЕаасЕ 4380
ЕЕсЕсаааас ЕдадаЕЕЕдЕ сасдЕдЕссЕ сЕссссасЕс саЕЕЕЕдЕда аЕсададЕсЕ 4440
Ессаддддса ддассЕддад ааЕдддЕсЕЕ ЕаЕЕаасаса саЕдЕдаааа ЕдсЕЕЕЕдсс 4500
адсааддсдс ддЕддсЕсаЕ дсаЕдЕааЕс ссддсасЕЕЕ дддаддссда ддсаддсдда 4560
- 54 016397
ЕсасЕЕдадд Есадсскддс саасакддка ааасссЕдЕс ЕсЕасЕаааа аЕасаааааЕ 4620
Еадскдддкд ЕддЕсдЕддд сасскдкадЕ сссассЕасЕ сдададдсЕд аддсакдада 4680
аЕсасЕддаа сссаддаддЕ адаадЕЕдса дЕдадссдад аЕсасассас ЕддасЕссад 4740
сккдддЕдаЕ ададкдадас ЕскдксЕсаа ааааадаааа аааааадааа акдсЕЕЕЕдс 4800
саЕдддсЕдк сЕссЕдсЕЕс ЕдсЕЕЕдсаЕ ЕдддссЕсЕд ЕассЕаддЕЕ дсаадаЕЕсс 4860
Есадддкдса сскдддскка ЕсдЕкакскд ЕаадЕЕаЕсс садсаадсас ЕЕаааасаса 4920
дЕдккддасд акдааЕсссс ЕсЕасаадад адддасаддд сааааасдас ассЕсЕЕдсс 4980
ЕсдсаадсЕд ЕсЕЕдддсса аассксаддк сЕаЕЕсЕЕЕс ЕЕЕЕЕЕЕЕда аадкадкддс 5040
ЕдддсасддЕ ддсЕЕасдсс Едкааксска дсасЕЕЕддд аддссааддс дддсддаЕсЕ 5100
Едаддксадд адкксдадас садсккддсс аасаЕддЕаа ааскссаЕсЕ сЕасЕааааа 5160
ЕасаааааЕЕ адскдддсдЕ ддкддсдсак дссЕдЕадас ссадскасЕс аддаддскда 5220
ддсаддадаа ЕсасЕЕдаас скдададдса даддЕЕдсад ЕЕадсЕдада ссакдссаЕЕ 5280
дсасЕссадс скдддсддса дадсдадаск сЕдЕсЕсааа аааааааааа аадааадЕад 5340
садсЕсЕаск дадакаЕкка дааассакаа ааЕссассЕа ЕЕЕдаддЕдЕ асааЕЕдадк 5400
даЕЕЕЕсЕдк акадксасад акскдкдсад ЕсаЕссасас ссЕсЕаасЕс саддасаЕЕЕ 5460
Ессксасссс сдаддадааа ссксссккас ссаккадсад ЕсаскссЕса ЕЕЕссксЕсс 5520
ссссадсссс Еддсааксас ЕдкддаЕЕЕд сскдЕЕсЕЕд асаЕЕЕсака ЕааакддЕак 5580
сакааааЕсЕ акдддсЕЕЕЕ дЕдксЕдкск дсЕЕЕсаскк адсакасддк ЕсЕсааддЕЕ 5640
сакссадкак Едкадсакск аЕсадЕаЕдЕ саЕЕСсЕЕЕЕ ЕаЕддссааа ЕааЕаЕЕЕЕа 5700
ЕЕдкаЕддак адасаЕЕЕЕд ЕЕЕаЕЕсаЕЕ ЕакскдЕЕЕЕ ЕддЕЕаЕЕак дадкаасаск 5760
аскакдааса ЕЕЕЕдсасаа аЕЕЕЕЕдЕаЕ ЕдасакдЕЕЕ ЕсаЕЕЕсЕсс кдддЕакадЕ 5820
сскакдадкд дааЕЕдакдд дЕсаЕаЕааЕ ааакаасЕдк ЕЕаасаЕЕЕЕ ддддадскдс 5880
сааасЕЕЕЕа ааассккддд ЕЕсЕдЕдаЕд ЕассадЕЕдк дЕЕаддсадс асадсааааЕ 5940
дкдасЕЕЕЕд аккдссадаа асааЕаЕЕЕа аааадкддкк акааааадЕд дЕЕЕдддадд 6000
скдаддсадд аддаксаскк дадсссадда дЕЕЕдадасс адсскдддса асакадкдад 6060
ассскдккаа ааааааадаа ддссаддсас адкддсксак дссЕдкаакс ссадсаскЕЕ 6120
дддадаскда ддсдадсада ЕсассЕаадд ЕсаддадЕЕс садассадсс Еддссаасак 6180
ддсдааассс сакскскасЕ аааааЕасаа аааЕЕадсса ддсскддЕдд Едддсдсскд 6240
Еааксссадс Еасксаддад дсккдаддса ддадааксдс ЕЕдаасскдд дадаскдадд 6300
- 55 016397
ЬЕдсадЬдад сддадакса!: дссаЕЪдсас Ессадсскдд дсаасаадад сдааасЪдкд 6360
ЬсЬсааааса аакдаааада аааддскдЪс аЪдЬЕадаЬс сасссЬсскс сЬсаддддаа 6420
ссссЕдддсЬ дсЕсЕсЕддд Еададакддд аасссаддсс •ЬсдддссадЬ дадкддаадд 6480
ааасЕ'ЬЕддд аЬдаЬЕдасЬ ЬдддасЕддд скададдЕда адаа-ЬоЬссс адкаддсааа 6540
дЬЬсддссЬЬ асдЬЕ-ЬЕЕЫ: дй-ЬЕсаадса аассасакса ЬЬасссасад аддссаЫхдд 6600
ЬдадаБаБ-Ы: дкаадЬсЕсс •Ьдасадйддс ЪддадЬЕсдЪ ЬдсЬЕддЫзд ЕЬдЬЬЕсЬс'Ь 6660
дЕсЕсадссс ЬддадаЪддд адкдассасс ЕдсЕсЕсЕсЬ ддасададдс ЕдЪссасдЫ: 6720
сакдсааЪЪс сЕЕддасасс ддЪддкдсад сдддаддсдЪ ааскдддад'Ь дддадассск 6780
даасЕд'Ьдсс ддЕ-ЬсБ'Ьдса дадЕаксасБ дЕдасЫсад дсдадЬсасс ссасаксадд 6840
садсБсадаа саадддаЪЕд аксЪадаадд ассЬЬЪсасс Едддска-ЬЪс ЬдЬдасЬсаа 6900
аЬЬаХсЬ-Ьс!: ссЬаадссса сЬасЕдссЬд д-ЬдкдЕЬддЬ ЕаааЕЬадсс ЬаааддЕсаЪ 6960
БсссЬсддад аддсссБсЬд ддааассксс скСЬсскдад адЬсасЕдс-Ь БдсЬддсдсс 7020
Едсссскддд дЪ-ессГЬсад адПсдЬдаЬс аБдсссСддс сксЬкссЕ-Ы: аБ-ЬЪддсадЬ 7080
сссЕЕсссЬЕ ссссаБсссЕ дакдадддЬа дддадсаЬсБ д-ЬсЬдсадсЬ Ьса-ЬсЫсак 7140
Ьд'кс'Ьадддд сЪссадаааЪ аЕсЕдЕдад·!: аааЕаадЫ:а Ъ-Ь+ааЕсЬ-Ы: дссксааа!:!: 7200
ЕссадЕдасЕ дЕадддаЬа'Ь адскдЬдадс с-ЬсЬаддадс ЬдадаШЕЕ ЬаааЕЪЕссс 7260
асЕЕааасаЪ ΐΛθΕΐΛβΒΗΒ аЬеЬ-ЬдЬдс!: садсакддас ЕааддасЫЪ аса+Ъса-ЬЕа 7320
асЕса-ЬЕЕас адс-ЬЕдаБсс ЕаЬдсдд'Ьдд дсаЬЬсаЪЪЬ асададдаЬс ссаЪЪЪЕаса 7380
ддЬдаддаад аддссадска ддддЬдсадс с±аддЫадЪ аЬЬсЬададс ЕсаЬсаддсЬ 7440
дСдЪ-ЬдСссс садЕдааада аЕаадсааад аадЕдааЕд-Ь ЬдЕдсаЫзда дааааа-Ьдас 7500
ЕсЪсддадда ддаЕдадссЛ сЕсддаЕа-Ьд дсдассдаад ЪдаЬаБдддд сссЫхд-Ьсаа 7560
дддЪсЕсЕаЬ Еакддса'Ьса адаааадаЕд сЕдс'Ь'ЬЬсдд ЬдаЕдсссда ддададссЪс 7620
аа-ЬаЕЕЫас акдддааасс Ьааааааддд дссакдЕЕдЕ дд-ЬсЬсЕдса ссЕаадакас 7680
ЬаааддаааЕ ак'Ы'Ьа'Ьдда дадакдсаас акдЬсаддсс ЕЕддадддаа ассссаддаЪ 7740
ссадаЬддЕЕ дсасБсксаа ассадддссс сасЪсассЬЕ ддссЪЬсадс аЪЪ^ад-Ьд-Ы: 7800
ддаассааЪа дсаЬаадсЕЬ Ъдд-Ьсаддас сЬЕЬдаЪдда адссасад'Ьд с1:са!:1:адЪд 7860
ассасддЬЬд асЕассЬЕсЪ сЕсЬсскаад сЬдасЬЪсЪд дадддсасок дддаЬЪЬссд 7920
дссадЕдакс адЕдсЕдд+д аадсс-Ьдаад дссааЬдЕдЬ аддЕЫхадск дЕЕсадЬсад 7980
аасссаааад дддссааада даЬдд-ЬЫхсс ЪЬсаассЕсс асЬдадддаа дкдааадЪса 8040
•ЬддЬЕсдЬЬа аааддсйдад скдддассад адЪсЬадддЕ ЕсФададдЬд ддааЬЕЕс'Ьа 8100
- 56 016397
садск-ЬЪддд ддассББдса адддсаЪЪЪд сЪсЪБс-Ьддд ас-Ьдсаддда дас-Ьд-БдсБЕ 8160
сЕсададакд 'ЬБадсаЫз'Ьд дскЬддддад адададдааа ддададдЬЬс акдсЬссдсс 8220
акдакддБдд ааад'Ьдакд'Ь ЪддБдЪддЪд аддадсЬдад сЕдааЪкска адЬдд-ЬЬсса 8280
дддааЪЪаас ааЬдБЬссЕд сссаадБдЬс сБдккссссс асааасйааЪ даддсадсад 8340
дЬдксЪдаад адааасаББд садааЪд-ЬсЬ дссаддддЫ: ЪБа-ЬддБЪаа ίζίΙχΐσαΐοοΒ 8400
Ь'ЬаБдадддЪ Ьдас+садсс ЪкдддЪаЪЬа даЪдБсЬЬкд адаайссадд дББсаааЪас 8460
сасадсЬддЪ адааЬдЫЛс ЬсаасЬЬдда дссааЬсксс аЬсЬасЬдаа ддЬасдскдд 8520
ЫхЬадасада саасадддас аксадсаБЫ: Бааааадсдд •ЬддааааадЬ Ъ-ЬдсЫхдЬсЬ 8580
•Ьда1:1:ддадс саБдаса-Ь-Ьк Ба'Ь'БЪ'Ьдааа ЪЪЬсаааЬаа саЬдааддда ддЪЪЪддадс 8640
дд1:ЪЫ:1:дд1: ЬЬаЪссааад ддсадкддаЬ кдааддскда дааасассад дсЬдаакддд 8700
ададддд-Ь-Ьд ддд'ЬсссссЪ д'Ьдадакад-Ь дааасааЬдд ЬадЬдссаЬс сааЬдакадд 8760
сасф-ЬЬЬсЬд Ъса'Ь'Ьсадаа дсадаааддд ддссададдс ссаЬЬддссЬ БасЪдддсад 8820
ЬаадсЬдЪад адскдскдсс еЬЬЬсдЬдаа адддБЬдаса ссаассБЬск сссссаддаа 8880
дадЬдассад ддассЬдадд ддсаЬддксд адсадаЬдас адссЬ-Ь-Сдка ааасаЬсЬсс 8940
г» я гггтчл^г я 4- +· Г* ГГ 4« Г*/ч+· ΓΫ/·/·“»4- 4* ппР+· г»4-/№ гг ЬааЬ'Б'Ъссак γΥ 4* я /тггя и«4“ гт 9000
дадксаддЬд дадсаадаЪ'Ь ссаЬдБЬддк ЬЬсЬдЬЬддд сскададкдЬ сасасБдада 9060
ссЬааЪЪЬса ЬасЬЬЬа-Ьда аЪЬскадЬас ЪдсЪсЬсдаа ддкаададсс д-ЬссЬсЬЪЬд 9120
дскдааддЬЬ ЫЛдсс-Ьдса асс'ЬЪдсаЪЪ дЬааЪссадЬ дасассЬдас д-БаЪсЬдЪаа 9180
аЬЫхсЬЪсаа аЪЬЬсЬаад'Ь дка-ЬБасаас сссдкдЪдса ааадаЬдакЬ ааЫхааЬЪдс 9240
сЬБдасадБа ааасаааааа саааааааад дЬдкдддддЬ аЪаБдд-Ьа'Ьс сскдаЫгкас 9300
Ьа'ЬадаадаЬ дсададад-Ьд аадддадакд аддьддддад даддддссса ддЬ-ЬсЪддкс 9360
сЕасЬЬЬ ЬЪЪ ЪЬЬЬЬкЪкЪЬ сЬааададак ддадЬсЬЬас сакдЬ-Ьддсс адБсЛаддс-Ь 9420
ЬдааскссЬд дссксаадад дЬдсЬсЬсас аЪсадссЬсс сааадЕдсЬд ддаЪЬакадд 9480
сдкдадссас сдадЬЬЬадс ссадд'ЫхсЬд ЬЕЬсЪЬдсЫ: адксасЪЪЪс ЬдЬ-ЬЬдааса 9540
аааЪ'ЬддааЪ кЬасйЬЬЪЪд даЬс'Ьд'ЬЬЬс БЬЬааЬ'ЬдЬа ааЬ-БдааЬсд даскаааасс 9600
Ъ-ЬЪссааЬБЬ Ь-БЪсасаЪдЬ даадасакас асаааадЪЬ'Ь ЪаЪЪддаддд ЬкдсасаЪдЬ 9660
дааадааааа дддадааадс адда-ЬЬдадс адддддадсс дксадакдд-Ь аакдсада-Ьд 9720
ЪдакдадаЪс ЬсБдссддас сааададаад аЬЬссБЬЫ:!: аааБддЬдас аааЬЬсакдд 9780
дсБЬБс-есЬд ссЪсаааасс БадсасадсЪ дЫхаЬк'ЬасЪ даасааБЪад ададсБаадс 9840
- 57 016397
асЕЕЕЕЕада ЕасЕаЕаЕаа ЕЕЕааЕЕдсс дЕаЕдаддса сссЕЕадЕЕЕ Есадасдада 9900
аассасадЕЕ асадддаадд саадЕаасЕЕ адЕсааЕдЕс адаЕаасЕад дааааддЕЕа 9960
даддддсссЕ ддасасаддс сЕдЕдЕдасЕ дадаадсЕЕд ддсасЕЕсас ЕдсЕасаЕЕЕ 10020
саЕсЕсЕЕсд сЕаЕааасаЕ ЕЕЕадсЕЕЕЕ ЕдЕдЕЕЕдсЕ дасЕддсаас ааЕасаЕадЕ 10080
дааадЕЕсЕа аЕааЕЕЕдЕа аЕдсЕЕЕЕдс аЕдЕсЕЕЕдЕ аЕЕЕЕЕсЕЕд дЕЕаЕсасаЕ 10140
сасаЕсаааЕ ЕаадаЕасЕд аЕсадсадЕд ЕдададдЕЕа ЕЕЕЕЕссаЕд ЕссЕсЕЕсаЕ 10200
ЕадЕдЕЕадс ЕЕдЕддаЕдд аЕЕЕдаддсЕ сЕсЕдЕдсЕЕ Ессссссадс ааадЕдааЕа 10260
ссадасЕЕЕс сЕаЕЕааааа аадЕаЕЕЕЕа ЕЕЕЕЕсадад асадддЕсЕс аЕЕсЕдЕсЕс 10320
ссаддсЕдда дЕдсадЕддс асааЕсаЕад сссасЕдсад ссЕссаасЕс ЕЕдддЕЕсаа 10380
акдаЕссЕсс ЕдссЕсадсс ЕсЕсЕЕаадс адЕдссЕЕЕс сссаЕЕсЕса ЕдддасЕЕЕс 10440
сааЕссаЕда даЕасЕЕЕдс Едсадддаад сссЕдЕсЕдЕ ссаддссЕдЕ дЕааЕадасд 10500
асЕЕсасаЕд дЕссЕдЕдЕЕ дЕЕдЕЕЕдсс ЕЕсЕдЕдЕдд сЕаадЕЕЕсс аЕдассЕддЕ 10560
ддсЕЕддаад ссссаЕсссЕ даЕЕЕдЕддд ададдсаддд аддсассЕЕд ЕадсдсасЕа 10620
ддсдЕЕдддс сЕдаасаадЕ сЕдЕдЕдсЕЕ ссааЕдЕсЕЕ ЕдЕддддадд ЕЕЕасдадЕс 10680
сЕЕсЕЕаЕЕа ЕаЕааЕадЕа ЕсЕЕдЕсЕЕа дсЕЕддЕдсс .ЕЕЕсЕЕсЕса даадсЕЕдад 10740
дсасЕсЕдса даЕассаЕсЕ сааЕЕЕдсЕЕ ЕсЕдддадда ддададдаад сЕасссаааа 10800
даЕдаадЕЕс ЕсЕдЕдаддд дсЕЕдаасас аддЕЕдаЕад сдЕЕдсЕддЕ ЕадЕЕаЕЕсЕ 10860
саЕддЕдЕдд аЕдаааааЕд дааЕасдсЕд аааЕЕЕсадЕ ЕасЕсдЕсас аааааЕаадд 10920
сдЕаЕдЕада ааасаЕссЕд ддсЕаадддЕ ЕЕдсаЕдсЕЕ сЕадаасЕЕс сЕдЕЕасЕЕа 10980
аЕддсЕдЕЕд адЕаЕааасс Есдддаасад ЕддддаЕссЕ Еддадасссс аааЕаасЕЕд 11040
ЕаЕЕЕдЕддЕ ЕасЕссЕдЕс ЕЕдЕсЕаЕса аЕассссЕдЕ сЕаЕаЕсдЕд ЕЕадаасЕад 11100
дасасасада сЕддаЕЕсад аадсЕддссЕ ддддЕЕЕадд адаасаЕддд ассЕааЕссЕ 11160
ддссаЕсЕсд аЕЕЕассЕсс ЕддаЕсЕЕдЕ ЕЕЕсЕсаЕсЕ дЕааааЕдаа ЕЕддддЕдЕд 11220
дасЕдЕЕЕаЕ ддссЕдЕадд аЕдсЕадссс ЕдадааЕЕЕЕ сЕссадаЕаЕ ЕсЕасддЕЕа 11280
адЕааЕЕЕЕа ддддасасЕд ЕсЕаадсадЕ ЕдссЕсЕЕдд адааЕдаада ЕдЕЕсаЕЕад 11340
даЕаЕЕдаад дсЕсЕдадаа дЕссЕааадЕ ЕааадааааЕ сЕдсааЕдЕЕ сЕЕЕдЕддда 11400
ссдааЕааЕд саассЕддда ааЕдадддаЕ ЕадаЕдасас ЕЕдадЕадсс ЕЕссадаЕсЕ 11460
дадасдадЕс ЕсасЕсЕдЕЕ ЕдЕЕЕасЕсс аЕсЕдЕдаЕд ддЕдЕаддса ссаЕсЕЕддд 11520
дадсаадсЕд ЕдаЕададад ддаасааЕас сЕЕдЕЕааЕд ЕЕЕдЕсЕааЕ ЕсасЕассса 11580
ддЕдсайддЕ адЕдааЕЕад асасЕасЕЕЕ дЕаддЕЕсЕд дадддаадаа даааадасда 11640
- 58 016397
дассЕдссйд даскддддсЪ БдадассасЕ дксаааЪаса адЪасад1х1хд ЕасаасЕддб 11700
адддадЪддд ЕсаЕадка-Ьд дссддйсЪйк ЕЪаааддбда ддаай1хс1:Ъа ддсссадааа 11760
ддсааадйда садакссЬдд аЫхБаассад садсссадаЕ ЪЬдаддсска дсасакадса 11820
аадсассака дскаЪксаай адсйдссаад ЕдддадЕЫхд дакдайддсЕ Ъ1хссЕддаса 11880
дсдааадсад 1хда1хд'1хЫхдс •ЬйаддаЕддс сЕЕ'Ьддсад'Ь дсЪдсйд-Ыха ЕсскЪассас 11940
Еддсаадсса Ес'Есасдддо ссддадддда дддсааддаа ЕсаЬааЪбаБ дЪдадааддс 12000
ЬсЕдддйаса ЕдадЬд-едад аЕайддаЕас ссЕаддсЕсЕ дссссЕдаад асадЕддсаЕ 12060
сдда<хГ±ас(х дсасйаЪЕсс адйсддасад дсасскЪаа1х ΙχΙχΙχΈοίχοΕίχΙχ сЪдддЬдййЪ 12120
даЪаЪддЕЕд ддксс'ЬаЕЕ'Ь сЪйсйссйсс ааассссдсй адддссаЕЕс ссссасссйк 12180
сасйЕсссдд ссЕСссасЕд садЕсЕсЕаа ддаЬЕсЕдс-Ь ЕсаЕсЫхЕаЕ д1хд1хдаасад 12240
ддЕСЕйдаса аасаЕдаЫха асЕдддЪаЕй (х'Ь'Еддааддс Ьсаддаддаа сдсададйда 12300
Ессддадддс аддссйддад ЕсаддааЕдс Ъйсскдсаас сйдЪЕсдйдс адЪдадсдкд 12360
ЕсЫхссйсдс ссйдссскЪд дсЕддддаа1х дйдсйддсйй ддадддсадд ададйдасад 12420
дсддй-ЕЪдад аас-Ессдддс ЪсЕсссдЕсЕ ЕсддаЪддсй сс6д1хдааад садддссйда 12480
аас'Ь'Е'Е'ЕаЕс дЕсасБдс-Ьд саддБдааад асЫхЕсай-ЬЕ ддсЪдйадкд дйссаасааа 12540
дадЕаУхЕБа Ых'Ьа!хд1хд±х<х ЕссаадсссЪ ЬаааааЕЕсЕ Е-ЕЪадддсас аБсадкдддд 12600
адЕЪааЪада аасМхйдааа ЪаадаааааЕ дссЕдсаддд ЕаадБадаас сссадссадс 12660
садсЪссдад ЪЕскдБдсЬд ЪЕадс'ЬддЪа дд-ЬЕддЕйсй сададаадЕд дсЬддсйддс 12720
Еддд-ЬЕасдд адсссасайс ЕсЕааЪдссй ЪадЕдЕЪсаа ЬсаккаадЕд даЪЪЪЪйЪйй 12780
(хЪЕсосЕЕсЕ суЫхсЪЫхЪдд ЪМхддаддда ддасйасЕсЬ ааасЪМхасЕ садддсаддд 12840
ЕадсгЬссЕда аадддсЪссс ЕаассЕБЪсЕ дд-ЫхЕа+дас асааадааад ЪЫхддаддЕа 12900
сйдддайаад адаЕддсЕ'Ед ддйдассссс сЕайсакдсс ссс1хаасаса Еасасадсаа 12960
ассааассаа сЕсасссЕЕд аЕсайасксд Ыхд61хЪасас даадддааЫх 1хМхаЕ1хд1ха1х 13020
ЬдкдадкдЪЕ дад-ЬдаЪдаЬ Бааасадаад адакдЪдаск ссаадссйдд сЕЪсасЕаад 13080
а1хад1хс1х1хдЕ ЫхдГ^БсЬЪЬ ЪссЪссааад ЬаайЪйссТха аадааЕЕааа адссссйЕЕд 13140
ааасссадса сЕассЕЪдйс ксйдайкайс адсайаддса ддаадддс-Ых ЫхааддйсЪд 13200
адсссадсйд ίχίχ-ЬададдсЪ асдадасдЬд аддсааа1хсс йддйаЪсЪс-1х с'Ь'ЬЕдддссГ: 13260
садйййсЫхс аЪсйдйдааа кддсасадйа сЪасссЬсса ссааддайда ЕдаЪдадааЪ 13320
йааайддда-Ь дасаддЪЕ-ес айссссадсЬ сс1хд1хЕс<х1ха ддааддаааа асйдЕдасЫх 13380
- 59 016397
аЕдаадссЕд ЕаддЕЕдЕдЕ ЕсаддЕЕЕдЕ аЕдаддссЕс ддасЕЕсаЕа саааддЕаЕс 13440
ааадЕддсаа асссЕдаЕсс адаЕдЕЕЕЕс адЕЕсадЕса дсЕддЕссЕЕ дадссЕдЕЕд 13500
ЕдЕдссадаЕ аЕссЕдасса аадаадсЕад аЕдддадсЕд сЕдЕдЕЕдЕЕ ссЕЕддддсЕ 13560
дсЕддаЕдса адЕЕдЕЕЕад дЕсддсддЕЕ ЕЕсаааЕдсЕ ддЕдаЕЕЕЕд сЕсассадад 13620
дасаЕЕЕддс ааЕдЕсЕада дасаЕЕЕадс аЕддссадЕс аЕЕдддаддЕ асЕссЕддса 13680
ЕсЕсдЕдддс ададдсЕаад даЕдсЕаЕЕд аасаЕссЕдс ааЕдсссадд асадсссссЕ 13740
дЕдасаддад ЕсаЕссадсс саасаЕдЕса сЕадЕдсЕдс адЕддадаад ссоЕддсЕдЕ 13800
дЕдЕдддддЕ дЕдЕдЕдЕдЕ ооЕсЕЕсЕас аЕЕЕдаЕаад дЕаасЕсаса сЕЕдсЕдссс 13860
ссаЕдаЬсдс ЬдЕдддддаЕ дсЕЕаЕсЕаЕ дссссадЕсс ЕддЕдЕЕддЕ ЕдаЕдддаас 13920
аЕсаадаЕЕс аддсаадаЕд дааааЕадсс сЕЕадаасЕа дсаддаааад ааЕсЕссЕЕЕ 13980
саЕЕЕдЕсЕа даддЕЕсЕдЕ ЕааадЕдссЕ ЕЕдсЕЕсЕаЕ ЕЕЕдадасЕЕ дЕЕсЕЕаааа 14040
ааааЕдсдда ЕаЕдааадаа ааЕааааасс асаЕЕаЕссс ЕссасЕЕЕЕЕ сЕЕддаддад 14100
даЕдЕдЕЕда адаадЕсааа дЕЕсассаЕс ссЕЕЕадаЕа дааЕсаЕЕЕЕ даасааЕЕЕс 14160
аЕаЕдЕсааЕ асаЕЕЕЕдсЕ □аЕсЕсЕааа ЕЕЕсаЕЕЕЕа дадссЕдЕдд ЕдЕЕсЕдЕдс 14220
аЕддаЕаЕдЕ дЕдсдЕдЕаЕ дсасасаааа аЕааааддаа аЕаЕЕЕаЕЕс ЕЕаЕдааЕаа 14280
дЕаЕадаааЕ аааЕЕааЕЕЕ ЕЕддааЕсЕс ааасЕаЕсад адасЕЕаЕдЕ ааЕаассада 14340
ддсаддссЕд аЕЕаЕдЕаЕд ддсааадсаЕ ЕЕдЕдаасаа ЕдЕсЕссаЕЕ дЕаЕаасаЕа 14400
саааасаадс ЕЕЕЕсЕЕсса саЕЕддаЕаЕ дсаадЕсддс сЕЕсЕссааЕ аадддссЕдЕ 14460
сЕсЕЕЕссаа сЕссасссас сЕсссассЕЕ Едадсаааса ЕЕаЕЕЕаЕЕд ЕддсЕдаЕдЕ 14520
дЕдаЕсаддЕ сЕЕдаЕЕЕдд ддссЕсЕЕЕЕ ЕдаЕдссЕЕс ЕсЕЕЕдЕддд аЕсЕсассса 14580
сдЕдссссЕд дадасссЕЕЕ ддсЕдссадд дссЕЕЕдЕЕЕ ассадссасс саЕдЕддЕдс 14640
садЕадЕдЕс ЕдсЕЕЕдЕад сдадсЕдЕсс ссададссЕс адсаЕддсЕЕ ддддаЕддЕс 14700
ЕсЕдаддЕЕд ддсЕЕддаЕс ссЕсссасЕЕ ЕЕдддсЕсад ааадааЕдас ЕдсссЕсЕаЕ 14760
ЕЕсссЕдЕсс сЕдсссЕсЕс ЕЕаЕссЕдЕЕ Есссадсссд саЕсаЕдЕЕа ЕсЕЕЕдсЕЕс 14820
ЕЕдЕаасЕЕа ссааасдаЕЕ ЕаЕдддсаад ЕаддддаддЕ даададддаа сЕсаЕсЕаЕс 14880
аадаЕаассЕ асЕЕЕдЕдсс аассасЕдад саЕадсааЕЕ дЕсссЕЕсЕс садсссЕсЕд 14940
аддассдЕдд аЕдддаЕЕсЕ саЕдаааЕда аасаддЕдад даасЕЕЕЕсЕ ЕЕЕадддаас 15000
ЕЕдсЕЕдадд Есссасаддс адсдадЕаЕс ааЕсаасдЕс аддаЕсЕдад сссЕдЕЕсЕд 15060
ЕЕсддсЕдаа ааЕаЕасЕсс сЕдадаЕддЕ дЕаддссасс аЕддсЕЕЕса дсаддсЕсЕд 15120
ЕдсЕЕддЕдд ааддаадсЕд даадсЕдЕдЕ асасасссас ддддаасадд дассаЕадад 15180
- 60 016397
дадсассЕЕЕ ЕдадЕдсада ассЕддсдаа асаЕасассЕ ЕЕададддаЕ ЕЕЕаддЕасс 15240
сЕЕдаддсЕд ддадааЕсаа дсададсЕаа дЕЕЕсссаЕЕ ддддЕдЕсас адасЕдаада 15300
аасададссс ЕаддЕадсас адддаадЕЕд аЕЕдсссадЕ аЕсадЕЕадЕ ЕЕддсЕЕЕаа 15360
ЕдасЕдадаа дадаЕЕссас садЕЕсаЕЕд аадададддс ддасЕЕЕЕЕа ЕЕддаддааа 15420
даададЕдсс ЕдЕаадЕада даадЕсЕссд дддЕдЕадЕд сЕдЕЕЕдддд саддаадаас 15480
адЕдЕдадсс асЪдЕддада дааадсссаа ададЕсЕЕдд садддсаддд адЕаддаЕдд 15540
аЕЕЕдаадсс ададдаадЕа ЕддддЕсЕсЕ дЕадасЕсса ддсаадссаЕ дЕЕааЕаЕЕЕ 15600
Еаддаадссд ЕдакддадсЕ дсадаЕдддЕ дЕддаадЕЕа аадЕЕЕааск дЕЕсаЕЕсас 15660
садЕссЕЕсс ссЕддадааЕ дЕдсадсасд ЕддасадЕдд аасЕЕЕаадд ЕссЕЕддсЕЕ 15720
дЕаЕЕЕсаса сссаададаЕ дааЕаддЕсс аддкаЕдЕса Еадассадас ЕааЕдаааЕа 15780
асаааЕЕЕсЕ ЕЕЕсаааааЕ ЕЕЕасЕЕЕЕЕ дЕаддааадс ЕЕсЕсЕдЕсЕ ддсаЕЕЕЕЕс 15840
ЕЕсЕсссадЕ ЕдЕдасЕсаа ЕсЕЕааасдЕ сЕЕоадасаа ЕЕадсаЕааа аЕЕЕсссаса 15900
дЕдааЕЕдас дЕаЪасЕЕЕЕ дадддЕЕсса ЕЕЕсЕЕЕЕЕЕ аЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕсЕЕЕЕдада 15960
ЕддадЕЕЕсЕ сдЕсасссад дЕЕддадЕдс ааЕддЕдсса ЕсЕЕддсЕсд сЕдсаассЕс 16020
сдссЕсасдд дЕЕсаадсда ЕйсЕссЕдсс ЕсадссЕссЕ дадЕадсЕдд даЕдЕсаддс 16080
асссдссасс аЕдсссддсЕ ааЕЕЕЕсдЕд ЕдЕЕЕЕадЕа дадаЕддддЕ ЕссассдЕдЕ 16140
ЕддссаддсЕ ддЕсасааас ЕсссдассЕс аддсааЕссд сссдссЕсдд ссЕсссааад 16200
дсЕдЕдаЕЕа саддЕдЕдад ссасЕдЕдсс садссЕаддд ЕЕссаЕЕЕсЕ ЕаассссЕсс 16260
ЕЕсЕдаЕдсс ЕсадааадЕс ЕЕдсЕсЕдЕа адссЕсЕЕдЕ адсЕдссЕсд дЕЕсадддда 16320
адддддаддс ЕЕЕЕдЕЕЕЕа ддассдЕсса дассаЕадас асаЕЕЕссЕд дсассЕадса 16380
сдЕдЕЕдддЕ сааасаддаа ЕдаЕдааЕдс аЕдсаЕдааЕ даддЕЕсЕЕа дсдсЕдаада 16440
сддЕдЕсаЕа ддЕддЕсЕас сасдссдссЕ даЕсаЕЕсса аЕддсссаЕЕ аЕдааЕдЕдЕ 16500
дЕдсЕдсадд дсссЕсссас даЕсссдЕса дсасЕдЕдса ЕдЕЕдЕдддд аддЕдсЕддд 16560
адааадасЕд ддЕсЕсадаа даЕдддЕЕад аддЕдддЕсс ЕЕсЕсЕдсЕд сЕддсЕадса 16620
дддЕадсЕдЕ ддаддддЕдс сссаЕсЕЕдс ЕддЕсЕЕааа ЕЕЕЕсЕсасЕ дЕаддсаддд 16680
адсаЕдассЕ ддсЕдааЕЕс ЕаадЕссЕЕЕ ЕсЕасЕсЕда ддЕЕсаЕЕдЕ дддЕдЕдасс 16740
ЕдсЕдддсЕс адсЕсЕддсЕ ЕЕдддадаса сссЕсЕсссс ЕЕдаЕсЕада саассссЕЕа 16800
дсададссса дЕддсЕссЕа садЕдсссЕд адсЕдсЕЕдс ссдааддаЕд сддЕЕдЕддЕ 16860
ЕаЕсЕ сасса ссЕдссаосс ЕдЕЕЕдсдса адддЕЕЕдад аЕЕдЕдЕддс сссЕссЕЕдЕ 16920
- 61 016397
аскЬсддддБ даддсСЕдсЪ ссадаааддБ. дд-БсБдсааа ддддБ.Б.ддсБ дддддддадд 16980
аддаадБсак БсБссаадБд БББдБссБса БсдБ-БаБссс аааББ.дсББд ссБддааБаа 17040
ддааддааад аааааааааЪ асБсББдадБ ддкББдддсс аддаЕББ-Бад сБдаБддаЬс 17100
БддБадБйсс сБсБдБсада ЕББдББББсБ ББдаасБдБс БдддссддБс асадБдБсаБ 17160
БдБББаааБд БддааБдБад дБдББсБдБд ББсБдддааа Бааааассаа аасБддБсса 17220
ддддаЪссас ададдйаада ааадаасаББ ссааБаддаа ЪдББЪсадаа ссаддадддд 17280
аддададааа аасддсБсБд ББддБсБссБ ададдаадаа сББдБйадаБ БЬддддадад 17340
БсаддаБааа БББдассска ададБсБсБд аББссБББЪа дадасЬБББс ББакаадааа 17400
БааааБддаа сББдддадад дсддсаасББ дддааасадс асаБ-БсБдсс дкааЪдааад 17460
БсдЬсссаБа адаак'Ь'ЬсЬс СаБсссЬБка дссааайЬБс ЕдБ-БЬсЬааа аддддаааад 17520
дддсБадада БаддсЕБд-ЬЬ ЬдББББсББа дББдааБсББ асБББББдБа БЬБссадссс 17580
аЕБсБдсадд дБаадаасаа дсасадсссд адддсксасБ садБдБдаБд БЬсБададсс 17640
БддсБсБдсс БсааБсссБс асдсБддадд аБсаддсадс аддддссадБ даБддаБББ-Б 17700
БЕБББсББсс БББссБссоо •БаББааБаББ БасБдаддБа ЕаааЬБасад сааадБдсдс 17760
адассБаддЪ аБсБаддасБ дБдаддББББ ссБдБдББас сЕдБдБаасс асдасссада 17820
БсаадаБаад даасББББск ддсаБсБсад аддсйсББсс БдскссоББЬ садасБссдБ 17880
сБсссадаад даасБасББс ЬдаББссБаБ адссаБадас БдааББББсБ БББссаасББ 17940
саБаБдсаБа ддаБраБсак дддБдББББа аББББааБББ саБдБсБдсБ БдссасБссс 18000
аааЬддаааЬ дБдББддсаЪ сБсБддаБд-Ь ЬБсББсакаа дааасаЬдсс с'Бд'Бддддса 18060
аадсссадда садддсБдБд сБдсБдсБдд аадБссБдБд садскддсса дссЪсБдсБс 18120
ассссБссдд ссасдсБддс асБББсадск БсБссадссБ ссБдсссББс ссасББссад 18180
БссБдсассЬ дсБдЪсскса сБдаБдсасс БдсссЬБББс сББссдБссБ ББаБдБддса 18240
сасссЕБаад ддадасаБсБ ЕссБдБсБдБ дББББдсасс сБсБЬаааас БасакБссББ 18300
БсссББсадс аБЬддсаБсЕ сБдБссББдБ дБаББассБд ддаБдасБаБ БсадББааса 18360
ааБдсБББсЪ БссЬаддсЬд Ьдадсссаад БББдББддаБ даББддаБдд дддсасдББд 18420
БдБдададаа ддаБсаБддд дБадсаБсБд дсБсБсББад аддБдБдБдд дддсд-ЬдБда 18480
БдссБдссаа ддсдсБББсд ЕБсБдддддд ББсБдБдйдБ ББдаадсасБ БдддЪБдБдБ 18540
дБсссБдадд ссБссдксас дддсаасскс аББссББсБс ЬадссБссаБ ссссБдсссс 18600
сБдсссассс саддссБсБд дадсБддсБс ссБББссБдс БсасБсБсББ ББддссадда 18660
ББББаасаБа БаБсасаддс ЕддБаддсБа ададсББддд асББссссБс ассасасБса 18720
- 62 016397
аадссЕЕЕда ЕсЕЕЕЕдсЕЕ Еддаддкаас аЕсаааадда аддскдадда адасадссад 18780
дскдкдаадЕ Есаасдккса адЕЕааЕадс ЕЕдасЕдаад дЕЕдкдскдс дккдкддсад 18840
саксассдад дскддадкаа асададкдак ЕскдссасаЕ ЕЕЕсскддаа акдсасссса 18900
акаЕЕддаад адддсЕЕсЕЕ ЕЕасаЕЕсдд аакдааЕЕса ддсЕдкадкс ададскдсЕЕ 18960
ЕЕсссЕЕЕсс ссаЕЕЕЕсск ЕддаадЕдЕд аааасккддд ддадаадакд ЕЕЕдкаддад 19020
ддсакдакда ддддкададд аадсссааад ададдакскд дддаддддаа дссссакддд 19080
акдадаскск даадЕЕаЕсс ЕЕдссссдаЕ ЕссдддасЕЕ дскакскдсс ЕдссЕЕЕЕдд 19140
сдкддЕдксЕ сЕдЕдссссЕ дасЕдЕЕссЕ даЕЕЕадсда ддкдЕЕЕсЕд ааЕЕсЕдакд 19200
даакксааад аадссЕдддс аддсаддсад сЕкдасЕЕдд ддсккдддда адсдкдсадс 19260
ссадасакад садсдаЕдад адддссЕсад ддсЕдадддс Едадакдада аЕЕЕсаксас 19320
акдсаааадк дааадсдасс саЕсдЕсЕЕс ЕосасЕЕдаЕ сЕсЕЕдскда дсЕЕЕдсада 19380
сасЕЕЕддЕЕ дЕЕдЕЕЕааЕ ЕЕаасаЕЕЕЕ сЕдсааЕдск ссЕЕЕЕЕЕса даЕЕЕЕсакс 19440
сааадскскд ЕаЕдададдЕ ЕЕЕсааассс аЕЕЕЕддсас ЕдаЕЕскаЕЕ Еддсакасда 19500
ЕЕсааскскд дддаЕддЕса ЕсЕЕссссас асскдсдккд ддкассЕЕЕЕ ЕддЕдкакдс 19560
Есададсакс сЕЕддасаЕс ЕЕссЕддЕса дкдкссадса Есдкдаадск дсссЕЕЕадс 19620
сЕсксадкдс ссссадаЕас ассЕдЕсЕсЕ скдсдкадсд дсасксадсд ЕсассЕЕЕск 19680
дкддддЕсЕЕ дадасссЕда ЕдаЕаЕсадс аскакдскдс садааккссс сЕЕддаЕЕск 19740
ЕЕадЕдкддс ЕЕсЕсаадса ЕсссЕЕаЕсд скакаасдсс ЕЕсакддЕЕЕ ЕЕддсакаас 19800
Едкакаскас сЕдЕдсЕаЕЕ аЕЕЕаЕЕЕда Едсакксааа саЕЕЕдаЕЕс аЕЕЕаЕЕЕаа 19860
асксадкскс асЕдкааЕсс Екааккааса сскдкдааак ЕакаддЕЕЕд акдЕдскаск 19920
ЕаЕЕЕаЕЕЕа ЕЕЕЕЕЕаака □асаЕЕадка Еааксссдка асддскааад ЕаасасЕЕЕд 19980
ЕасЕдсскаа аассакдскк дддадсдсса садкккдада аадкдсЕЕад ссЕЕссЕЕЕс 20040
сскссЕЕЕад ЕдасЕЕдкдд ЕЕЕддддсаЕ скдЕЕдасЕс скадддсЕсс сЕЕдЕЕсакс 20100
ЕЕЕскдЕЕсс Еаадсксадд даЕЕадЕЕдс Есаасссадд ЕдЕддсскса аааЕЕскдсЕ 20160
сакддаакад ссксаддсЕЕ скаЕаааЕсЕ саксЕЕЕЕЕЕ дЕЕЕЕдЕЕЕЕ дЕЕЕЕЕдЕЕЕ 20220
ЕЕдадаскда дЕсЕЕдсксЕ дЕЕдсссадд скддадсаса дкддсдааак ссаскдкаас 20280
саЕЕдсдккс ЕдддЕЕсаад сдаксскссс аксксадасЕ сссаадкадс Едддаскдка 20340
ддскддкасс ассаддсссд аскааЕЕЕЕЕ аааЕЕЕЕЕЕд аададакддд дксксасЕак 20400
аккдсссакд ссддаадксЕ адЕЕЕЕакад Едакдадаак ЕсаЕскдддд Ессааддддс 20460
- 63 016397
ссксскдЕдк ЪдсЕЕсс'Ьд'Ь дсЪссссЪск ааакааада'Ь асЬссМсса ад-ЫздЕсскд 20520
ак-Ь'Ь'ЬсаддЪ саЕсассаЕЕ ЬЕБ-едадсЕд дакддддаад ЬЕддссЕдда дсадссЫсс 20530
сЕдкс-Ьссда дЕЪдсаЬЬас скссЪдадад дксксадсаа аБсаскдсса БсЪсЪ'кда'Ес 20640
адад-ЬЕдсЕд дсаададЪсс ЕсЪдЪддЕЪс ЪаддЕЪкХса дсссЬддада сЕс±сдсс±д 20700
сакксаккак асакдкссМ: Ькддкдсс-Ы: дЪЪдааадда аксксоЬдсс ассдаадддЪ 20760
дкдддсЫгсЬ ддааакксЪс адаааасаса а-Ьакдссадс скссадддак дддЕсЬссаа 20820
адскксадда асакаЪсскд дддЕдЪкдад дааасассса сс1:1:аааа1:д кЕссксаадд 20880
дддаакд-ЬЪа сЬдскЕдссс ЪаасссксЫ: дадскдакдс Ьсасакдасд ЬссскдадаЪ 20940
дддсЕЪск'Ы: кйкдсссдЪа сЪЪааадскд Еааадддсса Ъ-Ьд-Ьсааа!:!: едкЪЕадскк 21000
сЪсааЕЪсак дкЪссЪЕада ддаЕддЪааа ЕЪааадЪЪад саЪЪссЕдда сададссШ 21060
сакасаИда адасаасссд дЪдадксФса аддддададд Еаадддадад аЕдаааддИ 21120
Ызскссаддс сЕдМсддса дсаБддасЕд ЕЕсЕЕБЕадд Баа-Ыааддд адассаЕааа 21180
адасааЕСдС дЕдадЕссак ЕЕассШса сЪ-Ьдддддкс ЪкаадЕсЕИ ддЪЪдддсЫ 21240
сМЛаасссЕ дкдЕдЕсасс сасдддсЬсс ЬакдддЬдск д-ЬШсаЕЕд ЪЕссдЕЕаЪс 21300
ЬадЕкддсЕд даасасассЪ ЕЪддддаЪ-Ьд дадаакддад Ысбдддддс ЕЕЬдддаасЪ 21360
ЕЪдадЕЕЕЪс сБдсааЕдЬс сЪа'Ьадаадс ЕЕдад-ЬсЕд'Ь даЪЕссЕддд садддсс^Ъс 21420
Ьсскад-Ь-Ьда дкдадаЫдд Ъддддсаддд садссадЕЪа дддддксакд ддадсаддкд 21480
Еддааааддк ЕакакдЪсЪк адкаакЪскк ЪдЪдасаакс асссксаккс аЪЬда-еаксЕ 21540
Ьс-еЪсскаЕс аЪдЪаккадд дсад-Ьддк-Ьс ссссааЕдЪд сЪдсасаЗДа дд-Ызсасскд 21600
дададсЕЬЕС акаааааЪдс саакдсссдд ддсссасЛ'е'е дддаддадсс аддсаЕсадк 21660
ааЕЕЕсааад дЕсЬсЪаааС даЪЪЪасадЪ ЪЪдддаа'Ьса ссдкакдадд аЪадкаадск 21720
скдадкссЪа ЪдсдЬЪсЪдЪ дссдаасасс саЪдаадсад ЪсЬЪссаадс акШассЬд 21780
саБсакскса ак-Ьсксасас кдБЕааддад аЪадасадка ксайс-Ьсса-Ь ЬЪЪдкадаса 21840
адасаасЕда аЕсЕсадада ддЫхкаадкс йсаддасасс ааддксаЬЪа ЫзааЪсаддд 21900
ддасЪдкдаБ ЕдсксссЪЬЪ акаааакдка ддадакаЕБд Ъддадкасдд ккдадааасс 21960
аЪкдсаакад Е-Ь-ЬЕсЫхасБ ЫдЪЪаадаа аккаддсЪдд дсдкддкддс ЕсаддссЪак 22020
ааксссадса саккдддаа!: ссдаддЬдда садаЕскскк дадсЪсддда дЕкссадасс 22080
адсЫхдддса асаддд1:даа ассссакскс даскаазаа!: асааааакак Ьадссдддсс 22140
еддЕддкдкд сасскдкадЬ сксадсЕаск Ъдададдскд аддЪдддадд аксассЪдад 22200
Ъссддскдса дкдадскддс аИд-Ьдсоас кдЪасйссад ссЪдддсаа-Ь дададЪдада 22260
- 64 016397
ЕссЕдЕсЕса ааааааадаа ааааааддаа аЕЕадЕддЕд дааддЕдасЕ ЕЕдсаЕсЕдд 22320
дсдЕаЕсЕдс сЕдсададЕЕ ддЕдЕссЕЕа ссЕЕдаадаа асссЕдсЕЕЕ адЕЕддадЕа 22380
ЕссЕЕааЕдд ЕЕадЕддсад даддддадда дЕддЕЕссЕд ддадасЕдда асааааЕаЕд 22440
дЕассЕдааЕ дсЕЕааддсЕ ЕддсадаЕда дсадЕсаЕЕЕ ЕсЕЕасасад адсЕЕаддаа 22500
адддсаЕсса ддЕададдаа ЕсадсаЕдаа саааадсаса дддссаЕада дЕЕсЕсадаа 22560
ддааадаЕдд ддЕЕаассдд адссаадсса дадаЕсЕддЕ ддЕадЕдддд ддЕЕЕссаад 22620
сЕадааЕддЕ ЕдЕдЕддЕаЕ ЕсЕдЕссЕса ддддсЕЕЕда асЕсЕдЕдЕд сЕааЕдаддс 22680
сЕсаааЕЕсЕ сЕддддсЕсЕ ддЕЕааааЕд ЕадаЕЕоЕда ЕаЕсадЕЕдд сЕЕдддЕддд 22740
дссЕЕдсаЕЕ ЕсЕдЕаадсс сЕЕадсадЕЕ дсасЕдсЕдс ЕасЕассдЕд адЕаЕЕдсЕд 22800
ЕЕдадсаЕЕа сЕассЕЕдад ЕаЕЕдсЕдЕс аадЕдЕЕасЕ ассЕЕдадЕа ЕЕдсЕдЕЕда 22860
дЕаЕЕасЕдЕ сдааЕЕЕЕас ЕассЕЕдадЕ дЕЕдсЕдЕЕд адЕаЕЕасЕа ссЕЕдадЕдЕ 22920
ЕдсЕдЕЕдаа ЕаЕЕасЕасЕ ЕЕдадЕаЕЕа сЕдЕЕдадса ЕаассасЕЕЕ дадЕаЕЕдсЕ 22980
сЕЕдадЕаЕЕ ассассЕЕда дЕаЕЕдсЕЕЕ ЕдадЕдсЕас ЕдссЕЕдадЕ аЕсдсЕдЕЕд 23040
адЕаЕЕдсЕа асЕЕдааЕаЕ ЕасЕдЕЕдад ЕаЕЕассасс ЕЕдадЕаЕЕд сЕсЕЕдадЕа 23100
ЕЕассаосЕЕ дадЕЕЕЕдЕЕ сЕЕдадЕаЕЕ дсЕассЕЕда дЕаЕЕдсЕдЕ ЕдадсаЕЕас 23160
ЕассЕЕдадЕ аЕЕдсЕдЕЕд адсаЕЕасЕа ссЕЕдадЕаЕ ЕдсЕдЕЕдад саЕЕасЕасс 23220
ЕсааддаЕЕд сЕсЕЕдадсЕ ЕЕассдссЕс аадЕаЕЕдсЕ сЕЕдадсдЕЕ асЕдссЕсда 23280
дЕаЕЕдссдЕ ЕдадЕаЕЕас ЕсссЕЕдадЕ аЕЕдссаЕЕд адЕЕЕадЕсс ЕдЕдадЕаЕЕ 23340
дсЕдсЕасЕд сдссЕЕддса аЕддЕЕЕЕса аасЕЕЕдсаа сасаЕсадаа ЕсасЕЕддда 23400
аассЕЕЕааа аЕЕсЕаасдс ссаддЕсаса ЕсссаЕЕсса асЕадаЕсад аасаЕсЕддд 23460
дааЕдсдадс саЕдсассад ЕадЕЕаЕааа ассЕдсссад дЕдаЕЕссаа адЕдЕдддаа 23520
ссЕЕЕдадаа дсасЕдсЕЕЕ аддддЕЕдда аЕадЕссЕдд сЕдааЕЕЕЕа аЕсадддаад 23580
асЕдасЕдсЕ ссдЕЕЕаЕда аасдЕаддад адЕддадсад ддЕЕдадааа ссаЕсдддаЕ 23640
адЕдЕЕсЕЕа сЕЕЕдЕЕасд ЕдадсааЕаЕ ЕЕдЕЕдадЕс ЕсЕдЕддЕдд дЕЕсЕадддд 23700
ЕЕсададдас адсадЕдЕдс ЕдсЕаддаЕд дЕддЕсЕдаа сЕадЕддааа ддсасЕсааа 23760
ддаадааада садааЕЕсЕа ададдададд ааЕЕЕЕадда аддадаЕасс саддасЕЕЕЕ 23820
дааЕЕасадд ЕааЕЕЕдаЕс адаасссааа асЕдаааЕдЕ сЕсЕдсЕсЕд ЕдаЕдааадд 23880
дЕЕЕдсЕддс аЕЕдадЕаад дадсЕдсадд ааддссЕЕЕа асЕЕдЕсЕсс аддЕсЕсЕЕа 23940
асадсЕЕЕдЕ саЕЕЕасаЕа саадсассЕд ссЕддсЕааа ссаЕЕсаЕЕЕ сЕдЕадсЕЕс 24000
- 65 016397
сЪЕсЪддакс ЕдЕсЪаддда а-ЬаЕЕЪдсЪЬ Ъдаа-ЬаЪЬЬЬ ддддЪБаксЬ каадЕдЬЕкд 24060
ааддаассаа аакак-Ь 1:1:1:0 кХааааакаа сасксаааЕд ЕадЕЕсасаЕ даккааЫзЕЕ 24120
даскдаккЕд ЕдадааЬсад ЪаадЬдскда скдаскдадд сдссссасас аЬссддсЕЕс 24180
сЕЬскдккас Ьскасдсдкд ЕЕдсЪдааао ЬЬаасдаасс саЕд-ЬддддЪ сЕЕсЕсдссЕ 24240
ддкдсадксс ддсссадкаЪ Есакаскдад дкккдсадкд ддадааадда аддка1:ЪЕа1: 24300
ЬЬдкаддкса ссаадсаддд саааЪссадс адсЬсасдск ЕаадассЬда ссЕсксоса-Ь 24360
ддкккакаад саад+ддЪ-Ы: адасЪдад-Ьс ЬЕдсЪоБдкс 24420
асссаддскд дад1:дсад1;д дсдЬдакоЬс адсксаскдс аасскссдос ЬсссаддЬЬс 24480
аадсдак-Ьсб ссЪдссЕсад ссксскдаак адс+дддасЕ асаддодЕдс дсссссасас 24540
сЬддскаадЬ к+кдЕсЕЫ:!: •Ьадкададак ддддккксас сакдккдссо аддс-кадЕЪЬ 24600
ссадс-Ьсскд ассЕсаадЬд аЪссксокдс сЬЕдассЪсс сададЕдоЕд ддак±асддд 24660
саЬдадссас адЬдсскддс сЬдкаадсаа дЕд-ЬЪЕЕЕаа адаааддддЪ аааЬкЛкадд 24720
дааасадаад й-исЕаддсаа аа-ЬддЕаааЪ Еаакасаддд адд-Ьаадаса ккдд'ЬЪ'Ьддс 24780
сЕааааадаЪ дддакак'Ь'Ы: даадЪддддд сЬсаЬаддЪс а-каадкддак ЬЕааадаккк 24840
кЕЬЕддкЬЪд ЪааЕЪдд-ека аддаадакаа дскккдакЬа аадакккддд дЬсадсадаа 24900
адааа-ЬдЬЬа ддкскддсЪс дЬдддсакдк с-ЬЪеЪЪсЕад дссссЬссЫ: ддааадааск 24960
ЪЬададсааа даааддсадЬ Еддадсккад ЬссссасЬШ сЬсскдаксЕ даддкскасд 25020
дассаскдда ЬссаЬ-ЬЬддЬ ддддкссакс ккЬскдаааа асаадЬсадд дасаЪдка!:!: 25080
дадаЬдакаЪ еаЬЬддЬаЕ-е еаЬадддаас сааасаасдс сссакдасЪс 1:1:1:Ы:1:ддс1: 25140
аЪ-едЬ-Ыгкаа дссасЬдЕ'Ы: аЬЬдадЬ-Ьд'Ь ЕаасЪЪа-ЬЫ: ЬЬЕааадска 25200
дскадскдсс Еддаа'Ь'ЬЪсЬ ЬЬадааддаа скдаадк ЬЫ: ЬаааааЪЕЫ: каЪдЬЬдддд 25260
ддка-ЬЪдссс кдсаддсссс Ьааааддддк ссс-ЬдсдсЬд ЬсЬсааааск: ЕддаЬдсааа 25320
аадаадЪЪда дЬйаасасад даддасаддд дкадасдсас саадддсакд ЬдссЬсдад-Ь 25380
дсдкддЕсск ЬаЕЬаадаад ддЕддЛада садддаакдд дЕЬадЕЪасс адд-ксддсак 25440
ЬсадсЬдааа оадкда'ЬддЪ Ьааааккскд ааааакдксс асдсксЕдса кЕсксЕксс!: 25500
аасасссадд асссадкаас ЬаЪааадссс οσ<:3θοο1:ς9 ддсаЪадсад ддддскксад 25560
ддасссакда дааддЬса-Ьс Ьдс-ЬдскадЬ касасЬсскк сЬдддассЕд аккЬадаоад 25620
ЬккддЬддЪа дкккЬдсдад ддЬЕааЕЪЕс адддссаадд аЪдо-ЬЬсЬад аакддааака 25680
ссЬЬсЬ-Ьдас ак'ЬдддадсЕ Ь-ЬаЪЕддБЬд аЬЪаЬдЬсаа кдкдадааЫ: саддаадссс 25740
адкдскаакс скссаксска аааддадкад аккддскддд сдкддкддсд сакдсскдка 25800
- 66 016397
аЪсссадсаа ЕЕЕдддаддс сдадддддсд сддаЕсассЕ даддЕсадда дЕЕсаадасс 25860
аасаЕддсда аассссдЕсЕ сЕасЕааааа ЕасаЕаааЕЕ адссаддЕдЕ ддЕддЕдддс 25Э20
дссЕдЕааЕд ссассЕасЕс дддаддсЕда ддсадддада аЕЕдсЕЕдаЕ сссаддаддс 25980
ддаддсЕдса дЕдадссаад аЕЕдЕдссас ЕдсссЕссад ссЕдддсдас ададсдадас 26040
ЕЕсаЕсЕсас ааааасааас ааасааасаа асааааасЕа аааддадаЕЕ ЕссЕссЕЕсЕ 26100
дЕссЕЕЕаЕд ддадасЕЕса ассЕЕдддаа адЕсЕддааЕ ссЕЕддасаЕ ЕадаааЕЕсЕ 26160
даадЕЕЕЕдд сЕддсЕдЕад ЕддсЕсаЕдс сЕаЕааЕссс адсаадсЕдд даддссдадд 26220
саддЕддЕса сЕЕаддссад дадЕЕЕдада ссадссЕддс саасаЕддЕд ааассссаЕс 26280
ЕсЕасЕаааа аЕасаааааЕ ЕадсЕдддсд ЕддЕадсдда сдссЕдЕаад сссадсЕасЕ 26340
ЕдддаддсЕд аддсаддада аЕсЕссадаа ссЕаЕдаддЕ ддаддЕЕдса дЕдадсЕдад 26400
аЕсасассаЕ ЕдсасЕссад ссЕдддсаас адаасаадаЕ ЕссдЕЕЕсаа дааадсадаа 26460
асЕсЕдаааЕ ЕЕЕЕдссЕдЕ ссаддссаса ЕсааЕсссаЕ ЕссЕсЕдсЕд ЕсЕсЕдсадд 26520
аЕЕсЕдЕдад дааЕааЕЕад ЕЕааЕдЕЕЕд сададсасЕЕ ЕдаааЕссЕс адаЕдааадд 26580
сассддадаа дсасааадЕа ЕЕаЕЕаЕЕЕа ЕЕаЕЕадсЕЕ дссссадааЕ ддаддсдсаЕ 26640
даддсссЕдд садсЕсссЕд ссЕсдЕдсса ддЕдЕдаЕсс ЕссЕдсЕддд сЕЕЕЕссЕдс 26700
сЕдаЕдадсЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ дадаЕсаддЕ ЕсадсЕсЕдЕ сдсссаддсЕ 26760
ддадЕдсадЕ ддсаЕдаааа садЕЕсасЕд сасасадсЕс асЕдсасЕдс адссЕсааас 26820
ассЕдддсЕс аадсааЕссс ссЕдссЕсад ссЕсссаддЕ аасЕдддасЕ аЕаЕасЕаса 26880
ддсаЕдсдсс ассасЕссЕд дсЕааЕЕааа аааааЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕдЕадад аЕдддддЕсЕ 26940
сасЕаЕдЕЕд сссаддсЕдд ЕсЕсааасЕс сЕдддссЕса аадаЕдссаа аддЕЕсасас 27000
сЕЕддссЕсЕ сааадЕдсЕд адаЕдасадд сдЕдадссас ЕдЕдссЕдЕд сЕсааЕЕдаЕ 27060
ЕЕЕсЕЕЕаЕЕ ааадааасаЕ ддаадааадЕ дааддаЕдад ааЕсадЕаас дЕаасдЕдЕд 27120
сЕЕсадаЕЕд ЕддасаадЕд аЕдЕдаадда аасасаЕЕдд ЕсссасЕдЕд дЕдасададс 27180
аддддЕЕЕсс ЕЕассЕддса аддЕЕдсддс ЕдссаЕЕссЕ ЕддддЕсЕдд ддЕЕаадасс 27240
аЕсЕдссЕда дддЕаасдса дЕааЕаааЕс адЕасЕааад ддодЕасЕаа адЕасЕдЕаЕ 27300
ЕдсЕаддсЕа ддссаЕдсЕЕ ддЕдЕаЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕааЕЕдадас ддадЕсЕЕдс 27360
ЕЕЕдЕЕдссс аддсЕддадЕ дсадЕддЕдЕ даЕсЕаддсЕ сасЕасаасс ЕсЕдсЕдссс 27420
адЕЕЕсаадЕ даЕЕсЕссЕд ссЕЕадссЕс сЕдадЕадсЕ дддаЕЕасад дсасдЕдсЕа 27480
ссаЕдсЕЕдд сЕадЕЕЕЕаа ааЕаЕЕЕЕЕа дЕададаЕЕд ддЕЕЕЕдссд ЕдЕЕдЕссаа 27540
- 67 016397
даЕддЕсЕса аасЕссЕдас сЕсаадддаЕ садсссассЕ сддссЕсссд аадЕдсЕддд 27600
аЕЕасаддса ЕдадссЕддс ЕддЕдЕаЕЕЕ дЕЕЕЕаааЕЕ ЕааадЕЕЕас ЕаааЕЕЕааЕ 27660
даЕаЕсЕддд дааЕсадсЕЕ дсЕЕсскддд даЕсЕддаЕд ЕасЕЕдаддЕ дададддЕдд 27720
ддаЕЕсадаа ЕЕаЕссЕЕЕс ЕаЕсдсадса ЕдЕЕсЕддаЕ ЕдаЕЕсаЕдЕ аддЕсЕсаад 27780
ЕдЕдЕдЕааЕ аЕЕЕсаЕЕЕс ЕЕЕдЕдсааЕ ЕЕЕддсаЕдс сдаддсдддс асссЕдаадс 27840
Ессддсадад ссЕддадаса дадЕддддад сЕсЕссдсЕс ЕЕЕсссЕЕсс ЕЕсаЕсссад 27900
сЕдасЕЕсда сЕддааЕЕда аЕЕсаЕсадс ЕдсЕддадад ЕЕдЕЕЕЕаЕЕ ЕдсссЕдсЕд 27960
дЕддададдд аддаааддаа саЕсаЕдддд ссаддсЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕааа ддааадаЕЕЕ 28020
даЕЕЕасЕЕЕ сссссЕЕадЕ адсаЕдаЕдд дсассЕдсас ссдссадсЕа аЕсадаадсс 28080
асЕдЕссссЕ дааЕдссЕсс дсЕдсссасс адаЕссЕдас адсаЕсссас дсдддадсас 28140
ЕсЕсдЕдЕдс сссЕддсадс ЕЕсЕдсЕдса ЕддсадЕЕсЕ сЕааасЕЕдс ЕддЕдЕсЕсЕ 28200
сЕдсссддад дсЕсадааас ссададдасЕ дассасЕЕсЕ ЕдаддсЕсаЕ дЕссадЕЕЕд 28260
сааададссс ссадсаадса дадаадддда ЕЕЕЕЕдЕасс адсдаЕаЕсЕ сЕЕсЕссасЕ 28320
ссЕсаасаса сЕссЕЕЕсса сЕсЕдЕсЕсс ЕаЕааасаЕд даасадссад дааЕасЕсаа 28380
аЕссЕадссЕ дЕсаЕдаадс саааааЕЕда ЕададаЕсЕа сЕдЕссадаа ЕдаЕЕЕсЕЕа 28440
ЕадЕдасссЕ дЕдЕЕЕадЕЕ ддЕаадасЕЕ ЕсЕЕааасса ЕдадддаЕЕс ЕддЕсссаса 28500
дддсадЕааЕ аЕсЕддддса дадссЕдада сЕЕЕЕсЕсаЕ ЕдаЕЕЕссЕс ЕдЕдадссад 28560
дадЕдасЕдс ЕсЕдаЕдсад ддЕдсЕдЕдЕ ддЕЕддЕада адсЕддсдЕЕ аЕсссаЕЕЕЕ 28620
асссасдадд ааасаааЕда ссадЕддЕдд адсдддадсЕ садсаЕссса ЕдЕдсссасЕ 28680
ЕссЕссЕсдд дЕддасЕЕЕЕ сассЕдссса ЕдссдЕсЕЕс ЕЕЕдсааасЕ ЕЕасЕдсадЕ 28740
дасддадаса ЕсЕЕЕаааЕа саааЕЕсЕЕд ддддаасссЕ дЕдЕЕссЕЕд дсЕддадссЕ 28800
ддсЕдддаад даддадддад сададддсЕс ЕсЕЕдддЕдЕ ддссЕаЕЕдс адЕЕдадсса 28860
дддаааддсЕ ддЕссасЕдд адасасссЕс ЕсЕддЕсасс дсадасЕЕсс ЕдсссЕссаЕ 28920
ссадЕдЕссЕ ЕсЕасЕЕдса ддаЕдЕдЕдс ссадсадада дааЕсЕсЕда адссаЕдЕса 28980
ЕЕаЕЕдддаЕ аасаЕЕссЕд ЕсссадЕсас сЕЕаЕЕЕсЕс адааааадда сааЕдддааа 29040
саадЕЕЕЕЕа ЕЕдааЕссЕа ЕдсЕдддссЕ аЕЕааЕдддд ЕсЕсЕЕасЕЕ ЕЕсаЕадсад 29100
сасЕдсааас ададЕЕасдЕ ЕЕсЕаЕЕсаЕ ЕЕЕаЕддаЕЕ адааадсЕда даЕссададс 29160
дддсадаЕдЕ ааассЕдддд ЕсЕЕЕааааЕ дсаЕссЕЕЕЕ Едсааасааа ЕааасЕЕадЕ 29220
дЕаЕЕаааад ддсЕддадад адсададЕаа ддЕаасаЕЕЕ дддЕддЕсад саЕдЕадЕЕс 29280
ЕдддЕсссса садЕддадаЕ ддсасадЕдс ЕдддЕдсЕдд дддаасЕаЕд дЕсасЕаада 29340
- 68 016397
дасаскдаак ааЕЕЕаакдс аЕдссссЕда ЕЕссаЕсасЕ дасЕдЕЕдад дкаасасака 29400
саЕ-ЕЕаЕаЕЕ дксадЕддкд дЕдаЕдаЕЕа саЕдадсЕдс дкааадсдЕЕ Едассадкдс 29460
скдсасакаа сакадкаддк дсЕсааЕааа даЕсасссас ЕсЕЕаададд Едддаддадд 29520
Едаадксакс ЕЕЕскдддда дЕдЕЕдсссЕ дЕЕдЕЕсЕсЕ дсЕдсаЕЕсЕ ЕкскдЕссЕЕ 29580
Едддскссда даакдскддд ЕЕдддсадЕд ЕдадЕддЕсЕ ЕсЕсаддссЕ скдкдасакд 29640
ЕЕдсЕЕЕсаЕ даааддкксс ссЕсЕадсса аадасЕдадЕ ддЕссЕЕдса ддсЕЕЕаксс 29700
ЕдадксаЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕЕааадасад адасЕсЕдЕЕ дссадаккдд 29760
адкдсадкда сдсддксЕсд дсЕсасЕдса ассдсЕдссЕ сссаддЕЕса адсаакскас 29820
аааакдсакс Еакаааакда ЕдсаЕсадсс ЕссЕдадЕаЕ ЕЕдддаЕсас аддкдсссас 29880
Еассакдсск дддкаЕЕЕЕЕ ЕЕдЕаЕЕЕЕЕ адЕададаса дддЕЕЕсасс скдЕЕдасса 29940
дЕЕЕддЕскс аааскссЕда ссЕсдадЕда ЕссдссЕдЕс ЕЕдассЕссс ааадкдскдд 30000
даккасаддс дкдадссаск дсассЕддсс ЕсЕсЕссЕда дЕссЕЕЕЕдЕ ЕкдЕдсскдс 30060
ЕЕЕддддаЕЕ сссЕскддск ддддЕддасЕ дссдддаЕсЕ дЕЕЕдЕссад ЕдкасаЕЕЕс 30120
скддЕсассЕ адсассддсс адсЕдсддЕд сЕдддаддаа садддссЕдд скскдддадд 30180
ПЯ ΛΠ.Ή ПППЯП я гтЬ ГА ППЯ ЯН ^пяяняяяп-Ь — э —— — -а — ηΕ +- γγΉ нпн'Ь --- — э -ТР ЭЧ» — нр· гта Т· гтгг+ гтгг З.Нс1СССЗЗС[С 30240
адсдкссада дддадсасаа дадддаддда саааЕсЕЕдд дадддЕсссд ддссаакддд 30300
асссадкдЕа адаааккдса ссЕдЕссЕдд садаЕадада аддЕддаадс адкдаакддЕ 30360
ададсакссЕ сасЕсЕЕскс ЕсЕдссадса адсассЕЕЕд дддаадЕссЕ сасддасадд 30420
аакдЕсдкдЕ дксЕЕддсЕЕ дадаЕдЕсаа адааасаЕдЕ Еддасасасс акддкдасад 30480
адсаддадкс Есккаасссс ддсдЕддЕЕд аддсЕдссдЕ ЕсЕддЕддда Ескддддкса 30540
дксаддддЕЕ аасадксдск ссЕдсЕЕдсс ЕдаЕЕдасас адЕааЕааад дсадкдасас 30600
сааасЕаддЕ сксаддаакд ЕдЕссЕсдЕЕ адааадасЕс аскааЕддЕЕ дкдддддддк 30660
ддсссакдад ЕссЕЕскддд ЕддЕддсдад аадЕадддда сссЕЕЕдддс ЕЕЕдсссЕЕЕ 30720
ЕЕддксакад дасЕЕсаскс сасадасаЕа аЕЕдаассдЕ ЕдддЕЕЕсЕд садссааакк 30780
сааакдксас сааЕсЕЕддЕ сассссЕЕЕс аЕсЕсЕЕддд ЕссЕсЕдЕаа дЕкакадска 30840
ЕскдакадЕЕ ЕасЕдааааа ЕааасЕдааа аЕаЕдЕЕЕЕа ааЕЕдЕасЕЕ ЕсдаЕЕЕааа 30900
акаакдЕЕка дадасааааа аааадддЕсс ааЕссасЕЕд дадаааадса ЕЕдЕсааадд 30960
ЕддккдаЕЕЕ ЕЕкЕсЕЕЕЕд сЕдЕЕЕЕааа дЕддЕаадЕд даЕдадЕдЕЕ ЕЕддакакак 31020
ЕдаЕЕЕЕЕса ддЕдЕдсадд сддЕсасаЕд аасадсЕдас аЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕсакдЕд 31080
- 69 016397
дасЕЪсадсс адкс-ЬЕдаса ссЪдсссскЪ аасдаааадЪ ааассаЪсдс сййдЬЬкдас 31140
адк'Ь'ЬаадБд садЕдаЕасд дакддаддса ддЪ'ЬЪасд+Ъ аБдЬЪааадд сЪЪдасаасс 31200
садаассссс сЬдЪкдд-ЬЬ-Ь сЬЪЬдкЪдЪа ассккЪдадс сддкддссБд аЪдаааЪд1:с 31260
асск-Ькдссс ЪксЕ1:11аааа дсаддаа1:аа ЪаддЪддЪда дБдддЬддак досксБЪааа 31320
акаскддааа дкдс-Ьд-Ьддс ссдадддкаа дсБккЪЪада адкдад-Ьдкд йдЪдЪЪдкдБ 31380
кдеъ-екаа-Ы: аакдаак οΐ:ΐ: скдддссБда адакаакдад дЬсадБдадд дсадсса-Ьдс 31440
кдссксасад сБсасс'Ь'Ьад ддЬсскЪд'Ы: дкссадаасд ЪдссЪдасск асЪддадддд 31500
ссЪдддааБд сББсЕЕБда-Ь ЪдасдЪдддЪ аддаадасад акдЪддсддс сЕссаЬдсЪд 31560
акдддаддса дсйдддаада аддБсаЬддд сассаксБса ддадЪддсад адссассЬсс 31620
сссЬсксскс ассссд^дкд ЪсЪддаЬкс·!: ЪссадсБдБд кддкссЪЬсЪ БссЬдсскдд 31680
аааЪдадса1: ссБдсададс Бсддсксскд ЪксасасссЪ ссБссЪаасс сссбасЬскс 31740
ссксЬсссЫ: ЪсаБссаддд сБддаддасс адакдддсЕБ БасскдаБдд адкд'БдсЪк'Ь 31800
дсЬдасакдд Ъдсааададс саакБссЪдд Бкдсааадад дсадсЪдддк дсададдсдд 31860
ддБдса-Ъ-Бсс БдЬааЕааЪа аЪаасЪЪдЬд ЬЬЪББаЬаа-Ь асЪЬкасад!: сЬаадЪасЪЬ 31920
ЬБсааэБас!: йдассЕсакк Ъад'Ь'Бсксас сасадсссЕс Ъдаадддака ББаскаББас 31980
сБЪса-Ь-ЬЪ-Ьа Еадакдсд!:!: аассадддск ЪдЪЪккддда ддЬададддд дкдкдадддд 32040
дасададддд адддаассад Бд-ЬЬдааЪда аЪксЪдаддс ссЪдссааад садссадска 32100
дсЪаддБдкЬ д-ЬЕ-Ьаа-Ъдда сБсЪЪЪдсак сЪасадааЕд адддаддкдд дакдадддда 32160
аакйаккЪса саакааскда аддксддада даскаасЪсй сЪдсЪсакБд Бсасасадса 32220
дЪЪдад-кдсс адс-£дддаЪ1: Бдксасссад дБсассЪдас БссЪаадссс Ьд-БдаксдБк 32280
сЪсккскдБс •ЬскадБаЕас соадсакааБ дсссддсааа дЬдсЬддса!; саакааакак 32340
ББдксдааЪд Бкааакдадд сккааадада ассакБсайд сккддсасад дддсасадкд 32400
адасааасаЪ дЪкксскдсс сЪсдкаассБ ЬсдсЪБссаа аЪБсБдкдас сБ1:дддсддд 32460
ББдсскдадс •ЬсЕЪ-ЬЪссад сксадЪЪЬсс Ьдаааас1:са ЪссддааааЪ дддЪаааака 32520
БсададЪдса ЬксйдкаЪдд каадаскдса ааЪдЪЪада!; даЪЬсЬдска сББак'ЬаЪЪд 32580
ЪЪкЪ сЪ’ЬЪЪЪ сЬсассасас асскксссЫ: БккаЪдЪаса ссЬсскадда адкаадкЪкс 32640
БдаБаасаБа с-Ьдса'БЕд-Ъ'Ь ддаЪаасадс аасааааадс асЬЕсскдас аМзаЪЪдссс 32700
аааБсассаа акдаддсаак ЬассаасЬБк ддааБаадаа Бадсаасддк ддБаададск 32760
дасакЬЬсЫ: дадсдсЪЬдс са'Ъа'ЬдсБдд дЬдЪасСасЪ а^аадскдск дссЪдсаакЪ 32820
акдаЫЛддд аасаасЬскд ааадЪадЬЬа ссксссаБЪк Ъакадаадад ЬааасБдадд 32880
- 70 016397
ЕЕсадададд ЕЕаадЕаасс сссссадддЕ сЕсЕсаддаа дЕадЕЕддЕд дссЕдддаЕЕ 32940
сааасассад ааЕЕддЕсЕд асЕЕсссасЕ сЕЕЕааасса сасЕсаааас ЕдаасЕсЕсс 33000
асдЕдЕдЕдЕ дЕЕсЕдддса ЕЕЕЕсдсаЕс ЕсссЕЕддсЕ ЕдЕЕдасадс дЕддасЕЕЕЕ 33060
дсЕЕЕсссаЕ ЕсЕсаЕадаа саЕддссадЕ дсаддаддад даааЕссаса сЕддЕсЕЕЕд 33120
дасЕдаасса даддсЕддсд аЕддЕсссда аасадддЕдс саадЕддсЕд асссЕЕдЕЕЕ· 33180
ЕЕаЕдссЕЕд сдсЕддЕаад сЕЕддддсас саддадЕЕсЕ ЕЕдааЕЕЕсЕ сЕЕЕсЕЕдас 33240
ЕдЕссасдсс ЕЕсЕЕЕаддс ааЕсЕЕЕЕаа саддсЕаЕдЕ ЕЕЕаааЕсЕЕ аЕЕдасаЕсЕ 33300
сЕдаадааад аддаддаааа аааааЕсаад асаЕддссЕЕ ададаадЕда саддЕЕЕЕсЕ 33360
ЕЕдадаЕЕЕЕ дЕЕЕЕсЕдЕЕ ЕЕссЕЕЕЕЕа ЕЕЕЕдЕдсас аЕЕдсаааас сЕсЕЕЕддда 33420
ЕдаЕдаЕЕЕа дЕдЕддЕЕЕс ЕЕддЕадссс ЕЕдддсадсЕ дсЕдссаддЕ ЕЕсасссааа 33480
ЕдсаЕЕдЕда сссссЕдЕЕЕ сдЕдддасдд сЕЕЕдссЕсс асаЕддсЕда ЕЕдЕдсЕсЕд 33540
ЕдЕдЕссдсЕ дЕдддсадад ЕдЕдаЕЕдЕа адааЕсадаа ЕЕсЕдсЕддд сЕЕдсаадса 33600
ЕЕЕааааааЕ сЕсЕаЕаадЕ ЕЕдадаасЕд дЕЕддааддд ададаЕдсад сдасЕЕадаа 33660
сасссддссЕ дсадсЕдадс ЕЕссдЕдЕдс сЕдддаддад сссаЕаЕдда дааасаддаа 33720
ааЕЕссасЕЕ сассадааад сЕддддаааЕ дадЕдддадЕ аддддссадд сЕддЕЕаасЕ 33780
аддаадасЕЕ ЕЕддЕсасЕс ЕдсЕЕЕасЕЕ адссЕааадЕ дЕЕсаЕЕЕсс сссЕЕаадсд 33840
дЕддЕЕааЕа сдсдЕаЕсЕд садаЕЕЕасЕ ЕЕЕЕддаЕда ЕЕЕааааЕсЕ ЕдсаасаЕсЕ 33900
саадддаЕЕд ЕаЕссЕдаЕд аЕасЕдаЕЕа ЕаЕЕааЕаас аадаЕааЕад сЕЕаЕааЕаЕ 33960
ааЕадсЕадс ааЕЕассаад сасЕЕассЕЕ асассаддЕа сааЕдссадд саЕЕЕдаЕсс 34020
ЕЕасасдаас ЕсЕдададаЕ ддсЕдЕЕЕдЕ аЕЕсссаЕЕЕ ЕасадаЕдад ддаадсЕдЕд 34080
сЕдадададд ЕдадЕЕсаЕЕ ЕдсссаадсЕ сасссасЕЕЕ дадаЕддЕсЕ дсЕЕЕЕаЕаЕ 34140
ссЕсЕЕадсс сааЕЕсЕЕЕЕ ддаЕдЕсадс асЕЕддсаЕд ЕаЕЕаддсас ЕддаЕаадЕд 34200
ЕЕЕЕдЕЕдаа ЕдаасааааЕ даЕддаасЕЕ ддаЕЕЕдаас ссаддЕсЕда дсЕддсЕЕЕд 34260
адЕсЕЕсада аЕадЕаддЕс сааЕЕадЕдд адЕдддддсЕ садЕадЕсса аадддааадд 34320
адсааддада саЕЕдЕдддд дссдадаада дддсЕЕсЕдд ддЕдЕЕЕссЕ дддсасаЕЕд 34380
дсаЕЕааадд саЕадЕдЕда адЕдссаЕЕс аадассаЕдЕ дсЕддаЕЕад ЕдЕЕЕЕЕссЕ 34440
сЕссасЕЕда ддЕдсЕЕдсд аЕЕддсЕЕЕд ЕдссссддЕд ЕсЕдсааадЕ дадЕЕдддсЕ 34500
даасЕсадда адассЕЕЕЕд дЕЕдддаЕда сЕдЕдЕаЕЕс ассЕдсассЕ дадЕадддас 34560
ЕдадЕЕЕсас ЕЕдссадЕЕЕ Еассдсадса адассЕсдЕЕ аадЕЕддсЕЕ ссЕсЕсаЕЕЕ 34620
- 71 016397
аддсаЕЕЕдд дааасЕЕЕад дсддсЕддад ЕЕЕааЕЕсЕс ааддсааадс сосЕЕЕЕсаа 34680
дддасаЕдаа даааддсада дддаЕаЕаЕЕ ЕааааЕассЕ дааЕдаасЕд ЕЪЕсЕЕЕЕЕс 34740
ЕЕЕЕСзЕЕЕЕ ЕЪдадаЕдда дЕсЕсссЕсЕ дЕсасссаад сЕддадЕдса дЕддсасдаЕ 34800
сЕсадсЕсас ЕдсаассЕЕс ассЕсссадд ЕЕсаадсдаЕ ЕсЕссЕдссЕ садссЕсссс 34860
адЕадсЕддд асЕдсаддЕд Едсассасса сасссадсЕа аЕЕЕЕЕсЕаЕ ЕдЕЕЕЕаЕЕЕ 34920
ЕаЕЕЕЕаЕЕЕ аЕЕЕЕЕЕааЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕЕд адасддадЕс ЕсдсЕскдЕЕ дсссаддсЕд 34980
дадЕдсааЕд дсдЕдаЕсЕс ддсЕсасЕдс аадсЕссасс ЕсссдддЕЕс айдссаЕЕсЕ 35040
ссЕдааЕсад ссЕсссаадЕ адсЕдддасЕ асаддсассЕ дссассасас ссддсЕсаЕЕ 35100
ЕЕЕкдЕакЕЕ ЕЕадЕадада ЕддддЕЕЕса ссаЕдЕЕддс саддЕсЕсЕЕ дассЪЕдЕда 35160
Ессдсссдсс СсддссЕссс ааадЕдсЕдд даЕЕасаддс дЕдадссасЕ дсдасЕЕдса 35220
ЕдЕадасадЕ ааЕддсаддЕ сасЕаЕсадЕ дддЕсЕдЕЕа аЕсаддЕдЕс саассЕддЕд 35280
сЕдддсЕЕдд ЕддсЕсаЕдс сЕдЕааЕссЕ адсасЕсЕдд даддссаадд сдадЕддаЕс 35340
аЕсЕдаддЕс аддадЕасаа дассадссЕд дссаасаЕад Еаааасссса ЕсЕсЕасЕаа 35400
аааЕасаааа аЕЕадсЕадд саЕддЕддда ЕдсаЕсЕдЕа дЕсссадсЕа сЕсаадаада 35460
Едаддсадда дааЕддсЕЕд аассЕдддад дсддадаЕЕд садЕдадсса адаЕсаЕдсс 35520
асЕдсасксс аЕссадссЕд дасаасааад сдадасЕсйс асаасаааас аааасаааса 35580
аасааасааа сааааадЕса скЕдсЕЕсЪЕ ЕЕЕЕЕдсЕЕд сЕЕаЕддаса ЕааасссЕдЕ 35640
ааасЕаЕсЕс аЕасаЕсаЕд ддадЕдадЕЕ ЕдсадЕдддЕ адасЕдсЕаЕ Есасаааскс 35700
айакасайсс ЕаЕдааддад ЕасаддЪЕаа аЕаассаЕЕа ЕссааааЕдс ЕЕддддскда 35760
аадЕдЕЕЕЕд даЕЕЕЕЕааЕ ЕЕЕЕЕЕсада ЕЕЕЕддааЕа ЕЕсдсаЕаЕа саЕааЕдада 35820
ЕаЕссЕдддд аЕдддассса ааЕсЕдааса ддаааЕЕсаЕ ЕЕаЕдЕЕЕЕа ЕаЕааасссЕ 35880
ΕΕΕΡΐΡΈΕΕΕ ЕЕЕЕЕкЕЕЕд адасададЕЕ ЕсасдсЕЕдЕ ЕссссаддсЕ ддааЕдсадЕ 35940
ддЕдкдаЕсЕ сддсЕсасЕд саассЕсЕас сЕсссаддЕс дааасдаЕЕс ЕссЕдссЕса 36000
дсскссЕдад ЕадсЕдадаЕ ЕасаддддсЕ Есссассасд сасадсЕааЕ ЕЕЕЕдЕаЕЕЕ 36060
ЕЕадЕадада ЕдаддЕЕЕса сссЕдЕЕадс саддсЕддЕс ЕсдаасЕссЕ дассЕсаадЕ 36120
даЕссасссд с-ЕЕЕддссЕс ссааадЕдсЕ дддаЕкасаа ЕдЕдадссас ЕдЕдсаЕддс 36180
сЕЕаЕаЕааа ссЕЕаддЕаа ЕЕЕЕаЕасаа ЕаЕЕЕЕаааЕ ааЕЕЕЕЕдЕд саЕдааасад 36240
адЕЕЕЕдасЕ дса-ЕЕЕЕдас ЕдЕдасЕссЕ сасЕЕдаддЕ саддЕдЕада сЪЕЕЕссасЕ 36300
ЕдЕддЪдйса ааЕЕЕсадаЕ ЕЕЕдаадсЕЕ ЕаЕаЕааЕда даЕадддЕсЕ ЕдсЕсЕдЕЕд 36360
сссаддсЕда адЕасддЕдд сасааЕсаса дсЕсасЕдса ассаЕдассЕ ссЕдддсЕса 36420
- 72 016397
адбдабссбс ссабсбсадс сассбдадба дсбдддасба саддсабдса сбдбдасбдд 36480
аббббббббб 6666666666 ббббдадасд дадбсбддаа бсбсаадбсб сдсбсбддбд 36540
сссаддсбдд адбдсаадбд дсдсдббсбб ддсбсасбдс аабсбссдсс бссбдддббс 36600
аадбдаббсб ссбдбсбсад ссбссбдадб адсбдддабб абаддсдбдб дссассасбб 36660
сбддсбаабб бббдбадббб бадбадддбс ддадбббсас бдбдббддсс аддббддбсб 36720
бдаасбссбд аасбдаадбд абсбдсссас сббддссбсс сададбдабд ддаббабадд 36780
сабдадссас сдбдсссадс сббддсбааб бббббабабб ббббдбадад асадддбббс 36840
дсбабдббдс ссаддббддб сббдааббсс бддасбсаад саабсбдссс ассбсддссб 36900
сдсааадбдс бдддаббаса ддбдбдадбс ассдсбссбд дссбдаадса ббббддаббб 36960
ббдддббада дббдсасадс сбббасбдбб аббабссбда бдббаббабс сасаббббас 37020
аддсааддаб сбддаддсдб адададдбаа аабсаббббб бсааадсссс адаадбасба 37080
адссдсадаб Бсбдаабббд аасбсаддса ббсбдддбса дааббадбда ддббббаадб 37140
666666666а дабададбсб бдсбсбдбба сссадддбдд адбдасадбд 37200
дбдсбабсбс ддсбсасбдс аассбсбдсс бсссдддббс аадбдаббсб ссбдссбсад 37260
сббсбададб адсбдддасб асадасабдб дссассасдс сбддсбаабб бббдбабббб 37320
баббададаб ддбдбббсдс сасдббддсс аддсбддбсб бдаасбссбд ассбсаддбд 37380
абсбаассас сбсддссбсс адаадбдсбд ддаббасадд сдбдадссас бдсдссбддс 37440
сбасссссбд бсдсссаддс бддадбдсаа дбддсасадб сбсддсбсас бдсаассбсб 37500
дссбсссадд ббсаадсдаб Бсбссбдссб садссбссбд адбадсбддд аббасадаба 37560
сссассасса Бдссбддсба 3666666666 бббаадбабб бббадбадад асададбббс 37620
аасаадббдд бсаддсбссб сббдаасббс бдассбсабд абсбдссбдс сбсддссбсс 37680
сааадбдсбд ддаббасадд сабдадссас сабдссбддс сбаадбббдд бббббаасса 37740
бдсбдсбббб бсбадасасб бсбдбсадсс адсбссасаа бддбдаабса дддадббадд 37800
бссдбсбдба адададддсс саддадсбдд дбсадабадд бааададаса ббссббадбб 37860
сббабссбсб дсбассаадс сабббсббдд дабсаадссс Бсбббддссб дбдбсаббсс 37920
ассбссабба адббсадссб бсбббссббс 666ссасабс бббссасбдс бдббдаааас 37980
ббдадассбд ааабсссабс бссбдааббс сбдддадсбс бадаадбдда дабддссадд 38040
ббсбдбддбс ададсбддбб дддаббасаа абааассааа дссбдддааа сбббсббдсб 38100
аббаабадсд садассбббб ддддадддаа басссааасб сдабдсбдбб ддааббдабБ 38160
- 73 016397
ЕЕдссЕдЕсЕ адаЕдасаЕа сЕааЕдадсЕ аадЕддЕЕад сЕЕсддаЕса ЕЕаЕЕдсЕсЕ 38220
ЕЕсссаадсс аадЕЕсЕЕЕЕ ааадасЕааа ассасаааад сададаасда дЕЕдддЕЕад ЗВ280
ададдсаЕад ЕддсЕдддЕс сададааддд ададЕддЕса дсссЕддссЕ ЕааасаЕдад 38340
ааааЕааадд ЕддЕссЕЕдс ЕЕЕддааЕда дЕЕадЕддЕд сЕдасЕааЕЕ саасЕддЕЕЕ 38400
ЕЕсЕЕЕЕЕсЕ ЕЕЕЕддаадЕ ддааЕЕЕдаЕ ЕЕддЕдЕсЕд даЕЕЕЕдаЕа дддссаЕЕЕа 38460
ЕаЕЕЕсЕЕса дсасЕЕЕЕЕд дЕЕсЕЕдсад ааадЕЕасаЕ ЕссЕадЕЕсс ЕсаасЕдсЕЕ 38520
аЕЕЕсЕЕЕЕЕ ддЕЕЕЕЕдаа дсаддааЕЕЕ даЕЕЕддЕдЕ сЕдддЕЕЕЕд аЕаддддЕдЕ 38'580
ЕЕаЕдЕЕЕса ЕсааЕдЕсЕЕ ЕЕддЕЕсЕЕЕ садсдЕЕЕсЕ сЕссЕЕдЕсЕ дЕсаЕдЕдЕс 38640
адададддЕд ссЕдЕсаасд аЕЕсЕсЕсЕс Ессадддада аадЕсЕЕЕсЕ Еаааасадсс 38700
сЕаадаЕссЕ ЕаЕсЕссЕса ааЕсасссас ЕЕЕдаЕдаЕа аЕаЕссаЕЕд ЕЕсЕсЕЕсЕс 38760
ЕдсЕЕсЕЕдд саЕаЕЕсЕад ЕсадЕсЕаЕд ЕаЕасааЕЕа аааааасааа асадсссЕсЕ 38820
дЕдЕссааад ЕдсЕЕддааЕ аЕсссадЕдЕ ЕЕсасаддад асЕЕЕддаад Еддасаааас 38880
ЕдЕаЕЕЕссЕ ЕссссаааЕд аддЕЕаЕЕдЕ дсЕсдаааЕа ЕсЕссЕддЕа дЕЕЕаЕЕааа 38940
ддааассдса ддсаддддЕа адададдсад ЕЕЕсЕасадс сЕдсаасссЕ аЕЕаЕсЕЕдс 39000
сЕсЕЕсЕЕЕЕ сдасссЕссЕ ЕссЕсссЕсЕ ссЕсЕЕсЕсЕ сссссссЕса сссЕаЕЕсаа 39060
сссадсссса саЕдЕсаЕдс сдЕссссадд аддЕадсссЕ дсадсссЕдс ЕЕсЕсЕддда 39120
ЕддЕсЕдЕЕс ЕЕдссасссд ЕсссаЕддаа сдЕдаадаад дааЕЕЕдддд ЕдЕддасЕЕс 39180
сЕЕдадЕдас ЕаддаЕЕада сссдЕсдддЕ сЕдсадЕсад асдадаадсд ЕдЕдддсааа 39240
дддаасЕаЕЕ дЕдЕдаддсЕ ЕсЕсЕддаса дааадссЕдс сЕЕсаЕсЕЕЕ ЕасЕдЕдссЕ 39300
ааЕддасааЕ ЕдадасаЕЕс адсЕЕаЕдЕс Едаааддааа дЕдддссддд аЕддЕсЕадс 39360
адассЕссса даЕдааддсЕ ЕдЕаддадда дсаааЕадад асааддаЕЕа ссаасадддд 39420
даасаасЕдд ддсададЕсс Едддададаа ЕдЕЕЕаЕЕЕс’ сЕЕдсЕсЕсЕ аддадддаЕЕ 39480
Еддааададс саЕааЕссЕд ддЕЕаддадЕ ааЕЕЕдЕЕас адсаадаЕда ЕасЕЕдадЕд 39540
асаддсЕдсЕ ЕсЕддсЕдад дсадсаадас ЕЕдсаЕдсад дддддЕсдЕд дддссЕссад 39600
ааддЕсадсс ЕсссдЕаааЕ сЕЕсасссЕд дсЕЕЕддддЕ ЕЕдЕЕссЕсс ссаадсаааа 39660
ЕЕаассадад дсасЕдсЕда ссЕЕЕдддсЕ ЕссЕдддЕдЕ адсдЕЕасда адсаЕсЕсса 39720
саЕдЕЕЕдкс асадсЕадаа ЕЕЕдасааЕа ааааЕЕЕдда садддадасс сЕдссададс 39780
сасЕдассЕс ЕЕЕссааЕдЕ дасаадддда ааааааасаа ааддаааасд садсасдддд 39840
ЕдсддЕЕЕса дЕЕдаадЕЕд даддасасдд адсссадссЕ дЕсЕсдсаЕЕ ЕдсЕдЕсЕаЕ 39900
дЕадасЕсас ЕааадсаадЕ ЕааЕЕсаЕЕд сЕсЕЕЕдасс дссаадЕсЕЕ ЕсдЕЕдЕсЕЕ 39960
- 74 016397
ЕЕдЕЕдЕЕдЕ ддааЕддддд ааадаааЕас адааЕдддда ддадаассЕа аЕЕадааааа 40020
ЕсаадссЕЕд ададсЕссса дссаЕддада аадаааддда ЕЕЕЕЕЕадаа дЕЕдЕдаЕЕЕ 40080
ЕааЕаЕсЕдс ЕдсааЕсЕда ЕдаЕЕсаЕдд аЕЕЕааааЕа асссЕЕссад дЕсассадда 40140
сссЕдЕЕасЕ ЕдсЕддсЕЕЕ дЕассЕсЕса ааддЕсаЕЕЕ дЕЕддсЕЕсд ЕсЕсЕЕааса 40200
аЕЕЕссаЕдд ЕадассЕааа аЕЕЕсЕддсЕ дЕдаааЕссс сЕдЕдЕадЕд ддаадаадаа 40260
аЕадсаааЕс ЕЕадсЕдссЕ ЕддассЕдаЕ аЕааЕЕаЕЕЕ дЕсЕЕсаЕЕЕ асаЕддЕЕЕа 40320
ЕссЕЕсаадд ЕЕдааЕаааЕ даЕдЕдддад сЕадЕсаадд ддсЕЕЕаддЕ аЕдЕдаЕЕЕс 40380
аЕдссЕасЕЕ ЕЕЕЕЕЕаддЕ ададааасЕд аддЕсасадд дЕасЕадада аЕддасЕсЕа 40440
адаЕЕсаддЕ ЕЕсЕдааЕЕд ссЕдЕддЕЕЕ ЕдЕЕдасЕса асЕдсЕсЕЕс ЕдЕЕдЕЕЕЕЕ 40500
ЕадссасаЕд ссЕЕдаааса дЕссЕсЕЕЕс ссаЕдЕЕЕсЕ ЕсаЕсадсас саЕЕаассса 40560
аддЕаЕасЕд ЕссЕсЕсЕЕа ЕсЕЕЕсасаа ддЕсЕЕддад ЕЕсссаЕдсс ЕЕЕдЕаадса 40620
ЕсссЕссссд адаЕЕсадса ссаассаааа ЕсасаЕЕЕдд аааааЕЕдсЕ ЕдЕЕЕсссаа 40680
даадсЕЕЕдд аддаЕаЕдаЕ ЕЕЕдЕаЕада асдддЕЕсас аддЕЕЕЕсЕд ЕЕсаЕЕсЕЕс 40740
ЕаЕддЕддад ЕдЕдЕдЕдЕа ЕдЕдасЕсЕд ЕсЕЕсЕсЕсс аЕЕссЕсЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ 40800
4- лггч —ι 4- 4-4- «4- 4-4—4- 1 ζ^ζ-е/-· /Ч ЛЧ —к ΖΥΙΎΑΐΙ· 4- Л№ —» 4“ Ζ-ΓΖ-ΓΖ4 /ч-+- л*е*ч 4- лч4“ лчл-гт-т л пасА
4-^-4-4-4-4- д д д иууааичису и иу и ч-у и чу
сЕсасЕдсаа ссЕссассЕс сЕдддЕЕсаа дсдаЕЕсЕсс ЕдЕсЕсадсс ЕсдсаадЕад 40920
сЕаддаЕЕас аддсаЕдсдс сассасдЕсс адсЕааЕЕЕЕ ЕдЕаЕЕЕЕЕа дЕададаЕдд 40980
адЕЕЕсаЕса сЕЕЕддЕсад ЕсЕддЕсаса сааасЕссЕд ассЕсаддЕд аЕссаассдс 41040
сЕсддссЕсс сааадЕдсЕд ддаЕЕасадд ЕдЕдадссас сдсдссаадс сЕссссаЕсс 41100
ссЕЕЕЕаЕсЕ сЕЕаааЕдаа ЕдЕддЕсасс аЕсааадаЕд дЕдссЬдасЕ сЕЕЕЕЕЕдЕЕ 41160
ЕЕсадЕЕсаЕ сЕЕаааЕЕса саЕаЕааЕЕс асасдЕсаЕа аааЕдЕассс аЕЕЕааддЕд 41220
ЕасадЕЕсад ЕддЕЕЕЕЕЕа дЕсЕаЕЕЕад ЕаЕаЕЕЕаса адаЕЕдЕаса аасаЕассад 41280
ЕаЕсЕЕааЕа ЕЕЕЕЕаЕсаЕ ссссаааада аасасЕдЕаа сссЕадсадс садЕсЕсЕас 41340
ссдссЕЕссс саЕадсЕссЕ ддсааЕсасЕ ааЕЕЕасЕЕс сЕдЕсЕсЕаЕ дааЕЕЕдссЕ 41400
аЕЕЕЕддЕЕа ЕЕЕсаЕаЕаа ааадааЕсаЕ асассаЕдаа асЕЕЕсЕЕса ЕсЕдссЕЕда 41460
адЕЕадсаЕа ЕЕЕЕсааддд сЕассаЕдкЕ дЕддсаЕдЕд ЕсадЕасЕсс аЕЕЕдЕЕЕЕЕ 41520
аЕЕасЕдааЕ адЕаЕЕссаЕ ЕЕЕаЕддсЕд ЕассдсаЕЕЕ ЕадЕЕаЕсса дсЕаЕсддЕЕ 41580
дадасЕЕддЕ дсаЕЕсЕЕаЕ сссадаасаЕ ассаЕаЕЕса дсЕсссадЕд асасссасаЕ 41640
ЕсаЕЕссЕдд дсЕдсЕссЕЕ дЕсЕЕссадс ЕаЕЕЕЕссЕд дЕсЕссЕдЕЕ дссЕсЕдсск 41700
- 75 016397
асЕЕсадсаЕ дсЕдЕадада саЕдддЕадЕ аасЕааааса ЕЕссааЕЕаа сЕдсаЕЕдЕа 41760
сЕЕддссЕЕЕ ЕЕаЕаадаад садЕааЕЕад ааааЕаЕддЕ ддссасаада ЕЕдаЕаЕЕаа 41820
адЕдааадаЕ ЕдЕаааЕасЕ ЕЕЕсЕдссЕд ааддЕадаЕд дссЕсЕддсс ЕдссЕсЕЕад 41880
ЕдддаддЕЕс ЕЕссаддадс ЕЕдсаадсаЕ ссаЕЕаЕЕЕд ЕЕадЕсаЕса дсЕЕадсддс 41940
сааддадсаЕ ЕадссЕдЕсЕ ЕдсЕсЕдЕсЕ дсЕдаадасЕ сЕдададаса Едддадддса 42000
адддсЕдсЕс сЕЕЕЕдааЕЕ сЕЕссааЕдЕ сЕЕсаЕдЕсс ЕЕЕаассЕсс ЕддсЕЕаддд 42060
асЕЕдЕдЕдс ЕддЕддЕдда дсЕдасаЕЕЕ дЕЕЕддааЕс сасадсссЕЕ ЕдддЕдддас 42120
ЕсааЕсЕЕдд ддЕЕдссЕда адасЕЕЕдад аЕддсЕаддЕ сЕдддссЕсЕ ЕЕЕддЕсасЕ 42180
аЕддаасаад асЕдЕсЕсад аддссададЕ сЕдЕсЕсасс адсЕсссЕдЕ сЕЕдддасЕд 42240
сассаЕЕдса дддЕсЕЕЕдс ссЕссссЕдд адаЕЕЕсЕсЕ ЕссЕдссЕдд дсаоссаЕЕд 42300
дссаЕЕсЕдс ссдЕаадсЕс адЕадддЕдЕ аддсаааада дЕЕсЕддссЕ ддаадЕасса 42360
аадЕссЕдсд ЕЕсЕддЕЕЕс адЕсссЕсаЕ аасЕдЕдЕаЕ аасЕаадЕса сЕЕадЕЕЕЕс 42420
ЕдЕдссЕсас ЕЕЕсЕЕсЕдЕ ЕЕЕаадаЕдд аЕЕЕддадаЕ ЕаЕЕддсЕЕЕ дассассЕаа 42480
аааддаЕдЕа дЕдасааЕса аЕЕЕададдЕ сЕаааададс сЕЕЕдаддаа дЕааааЕдда 42540
аЕсЕЕсаааЕ ддасЕасаЕд сЕдаЕЕаЕЕд асасЕдсссЕ адсасЕдаЕа дЕЕдаЕдЕЕд 42600
асЕдаЕддЕс адааЕЕдсЕЕ ддсаадЕЕдд аааааадЕас дЕасадаЕсс ЕдддссасЕа 42660
ссаадЕЕЕса ЕЕЕаасадаЕ сЕддадЕдса Есаддааааа адЕсссЕсЕа аасаадссад 42720
сааддЕЕЕдд аЕасЕдЕдса ассЕЕЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕЕссЕЕЕЕда даЕддадЕсЕ 42780
ддсЕсЕдЕЕд сссаадсЕдд адЕдсадЕЕд сасааЕсЕЕд дсЕсасЕаЕа ассЕсЕдссЕ 42840
сссаддЕЕса адсааЕЕсЕс сЕдсЕЕЕадс сЕсссдадЕа дсЕддсаЕаа саддсдссЕд 42900
ссассасасс садсЕааЕЕЕ ЕЕаЕаЕЕЕЕЕ ЕддададаЕд дддЕсЕсасс аЕдЕЕддсса 42960
ддсЕддЕсЕс даасЕасЕда ссЕсааадЕд аЕссдсссас сЕсЕдссЕсЕ ЕааадЕдсЕд 43020
ддаЕЕасадд саЕдадссас ЕдЕдЕсЕддс ссЕасЕЕасс ЕЕсЕЕЕдЕдЕ ЕааЕЕссЕдс 43080
ассаЕЕдаЕЕ адсЕЕаЕЕдЕ сссаЕЕдасЕ дЕдЕсЕЕЕад аЕдасЕЕсЕс ЕдддссЕсад 43140
ааЕаЕсЕадЕ ссаЕадсЕда сасададсаЕ сЕдЕЕЕааЕд дЕаааЕдсЕд саддааЕсса 43200
ЕдсаЕЕддад ЕадааададЕ ЕЕЕадаЕсаЕ дЕЕссЕсаЕЕ ЕсЕЕдсЕаса дасЕЕаддса 43260
аадсдЕддад аададдЕЕдЕ ссааЕдаада ааЕдаадЕда саЕдссаддЕ садЕддсада 43320
дсЕаддссЕд дааааЕаддЕ ЕЕссадасЕс ЕЕсссЕЕЕсЕ ассаЕасЕЕЕ ЕссЕдддадЕ 43380
асдсасЕсдЕ ааЕЕЕдаада дсдасЕЕЕЕд ддададддЕд дааддааддс сЕдддссЕса 43440
дссЕаадддд сссаЕЕддЕЕ дЕдададдад ддЕсЕддЕда ааЕЕссаЕас сдаЕЕдЕссд 43500
- 76 016397
ЕдЕдЕдадсЕ дсЕдЕассаЕ адссЕсссЕд оадаассасЕ аассЕдЕсаа аЕдсадаааЕ 43560
адЕЕсаддда сададсЕдЕЕ аааддаЕЕдд сдддЕЕааад аааасадЕда аЕсссаадЕЕ 43620
ЕЕдЕЕааЕЕд даЕЕЕЕЕЕЕд ЕЕЕдЕЕадЕЕ аЕЕЕдЕЕЕЕд сЕЕсаЕЕдЕс ЕЕсаЕсасас 43680
саддддссЕс сЕЕаааЕсЕд дЕддаааааЕ ЕЕссЕЕддаа аасааЕЕсад ЕдЕЕЕдЕсса 43740
ЕадасЕЕддд адддададаЕ дсЕадаЕдсЕ ддааадЕсЕЕ дсЕЕаЕЕасЕ ЕЕддддасас 43800
ЕдадаЕдЕЕс ссЕЕсассаЕ дЕасЕЕЕдад асасасаЕсс ЕддЕЕдадЕЕ саддсаадда 43860
ЕдссЕаасад ЕЕдаЕаадаа аасЕдддааа даЕадааддд аЕЕЕдЕаадд ЕаадЕсаддд 43920
ЕдадЕдаааа сасаЕссддЕ аЕдсЕддада ссЕадаЕдсЕ ЕдасЕдссас ЕсдсЕссЕдЕ 43980
сассЕсадЕс ааЕсЕдддЕс ЕЕдсЕсЕдЕЕ ддссЕЕадЕЕ ЕссЕссЕЕдс ЕаасаддЕЕа •44040
дЕЕссассЕЕ ЕсЕдсссаЕЕ ЕаЕЕЕЕдЕад ддЕЕаЕЕдЕд даЕдЕсаЕЕс ЕдаасЕсЕаа 44100
ааЕасссЕсЕ аааЕаЕдаад ЕдаЕаЕЕадЕ дсЕсЕЕЕаса ЕЕдЕЕаЕдаЕ ЕаааааЕаЕЕ 44160
ЕаЕдадаааа аддЕЕаасЕд ЕааддаЕЕЕс аЕЕдааааЕс ЕЕаЕаасаас саасЕдаЕад 44220
адаЕадаада ЕааддсЕаЕЕ аааЕЕдЕЕса сасадаЕдсс ЕЕдаЕаЕссЕ ассЕЕЕЕЕсс 44280
сссЕаЕаЕЕс сЕЕЕЕаЕдЕд адаааЕдада ЕадЕдаЕЕЕа адддааааас ЕЕаааададЕ 44340
д 4* С, +-+-/»//+-+-+-++-+- '-ьау-.ись.. ЕсаассЕЕаа ЕаЕсЕЕасЕЕ аааЕсЕЕЕЕЕ 44 400
сЕЕЕЕЕЕаЕс ЕЕЕЕсЕЕЕЕс ЕЕЕЕЕЕЕсЕЕ ЕЕсссЕсссЕ сссЕссЕЕЕс сЕссЕссЕсс 44460
ЕЕсссЕЕссЕ ссЕссЕссЕЕ сЕдсЕдсЕЕс ЕсЕсЕсЕсЕс ЕсЕсдЕЕЕсс ЕЕЕЕсЕЕЕЕс 44520
ЕаЕЕсЕЕссЕ ЕЕЕЕсЕЕЕЕд адассаддЕс ЕЕдсЕсЕдЕЕ дсЕсаддсЕд дадЕдсадЕд 44580
дсассЕЕсЕЕ ддсЕЕаЕЕдс аассЕсЕдсс ЕссЕдддсЕс аадЕдаЕссЕ сссассЕсад 44640
ссЕсссаадЕ адсЕдддасс асаддсасдс дссассасас ЕсадсЕааЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ 44700
ддЕададаЕд дддЕсЕссЕа ддсЕддЕсЕЕ даасЕссЕдд асЕсаадсаа ЕсЕЕссЕдсс 44760
ЕсадссЕЕсс ааадЕасЕдд даЕЕасЕддс дЕдддссасс аЕдссЕддсЕ ЕдаааЕЕЕЕЕ 44820
сЕаЕддсЕЕЕ аЕЕоЕЕЕсЕс саадЕасада дЕсЕасссаа ссЕЕсЕдада ЕсЕЕЕддЕЕЕ 44880
ЕсЕЕЕЕссЕа ддЕаасЕаЕа дЕасаЕасЕЕ аЕЕЕаЕдЕЕа аасаасадса аЕсасасаЕЕ 44940
ЕсЕЕЕЕЕсЕа ЕасадЕсаЕд сЕЕЕаЕаддс аааЕааадсс ЕссдЕсЕЕад дсЕЕЕсЕдда 45000
ЕЕЕЕЕЕсааа адаЕдсааЕЕ ссЕддадЕаЕ дЕЕЕЕЕасЕЕ ададсааадс адссЕадЕсЕ 45060
ссЕаЕассЕЕ сЕдсаЕсЕдс адаааадЕЕд дЕЕааасада сЕЕЕдЕааЕд аЕдссссЕЕа 45120
сааЕЕсЕдаа дддасЕЕдЕд аааЕадЕЕЕс асададЕЕЕс адЕдЕЕаддЕ аЕаЕЕЕдаЕс 45180
ааЕдсЕаасЕ ЕЕЕддаааас ЕЕЕддЕдссЕ дЕаЕдаЕЕса дадддЕаддд садааЕаЕЕа 45240
- 77 016397
ааЕЕааЕсас аасЕЕсЕЕдЕ аЕЕЕЕаасса ЕЕоЕдддЕаа аЕЕдддаЕЕс сдЕдасдссс 45300
аддсааааЕЕ аЕЕЕдЕЕЕаЕ адаадаЕддд сЕдааЕЕЕЕс саЕсдЕссаЕ ЕЕсЕдадааа 45360
ЕдаддЕаддЕ ЕЕадааадад асааЕсаддс сЕсЕЕсЕЕЕа асадаааЕдЕ ЕЕдЕдЕсЕас 45420
ЕаддЕдЕдЕд ЕсасааЕаЕд адЕЕссЕдаа даааЕаадЕд Ес.сдсЕаЕЕд ддЕЕдЕаЕас 45480
ЕЕдЕасЕЕсс ЕаЕЕЕЕсЕЕа ЕЕЕЕдсасаЕ ЕЕЕЕсЕддЕа ЕЕЕсссЕЕЕс ЕаЕддЕдадЕ 45540
ддсЕЕсЕдаЕ сдЕсЕЕЕссЕ ЕЕЕдЕааадЕ дЕааЕдаЕаЕ дадааЕсаЕа аЕсдЕддЕдс 45600
ддЕсЕЕЕЕдЕ дЕЕдсаЕаЕЕ ЕдЕадддддЕ садЕаЕдааЕ ддсссдЕддЕ даддсЕдсас 45660
ЕдааадаЕЕа ддадсадсса ссЕЕдаЕдсд даддаддсЕЕ адЕдасЕЕЕд дасаЕдаЕдд 45720
дсЕаЕддсЕд дсЕаЕасЕсЕ садсЕЕЕддд сдсаЕаадса дадЕаЕЕдаЕ ЕЕЕдЕаЕЕЕд 45780
дЕЕаааасса даадЕасаас ЕЕЕсЕддсас сададдаЕЕа ддааааЕЕЕа асадсддааа 45840
дссаЕсаЕда ддаЕадЕаас сааЕЕааЕЕс даЕЕЕЕЕЕЕд дЕсадасаЕд дсЕсссассЕ 45900
дЕааЕсссад сасЕЕЕддда ддсЕдаддЕд ддадддЕсаЕ сЕдаддЕсад дадЕЕЕдада 45960
ссадссЕдас саасаЕддЕа ааасссдаЕс ЕсЕасЕаааа аЕасаааааЕ ЕадссЕддсд 46020
ЕддЕдаЕасд сдссЕдЕааЕ сссадсЕасЕ сдддаддсЕд аддсаддада аЕсасЕЕдаа 46080
дсЕддааддЕ ададдЕЕдса дЕдадЕсдад сЕЕдсдЕсас ЕдсасЕссад ссЕаддсаас 46140
ададЕаадас ЕдЕаЕсЕсаа аааЕассаЕа аЕЕсдЕЕЕЕд ЕсЕЕЕЕсЕЕЕ асЕЕЕЕЕЕсЕ 46200
ЕЕссЕЕЕЕсс ЕЕссссЕсЕс сссЕссссЕс сЕЕсссЕЕЕс сЕссссЕЕЕс сЕЕсссЕЕЕс 46260
саЕсЕсЕЕЕс сЕЕссЕЕЕсЕ ЕЕЕсЕсЕсЕЕ ЕсЕсЕсЕЕЕс ЕЕЕсаасадд дЕсЕсдсЕсЕ 46320
даассЕЕЕЕс садЕсадааЕ ЕдсЕсаддда ЕЕЕЕЕадасЕ ЕссаЕЕсЕдд аааададддд 46380
дЕадЕЕаЕЕЕ ЕддЕдадаЕЕ дЕддЕсЕЕдЕ ддЕЕадассЕ ЕдЕдаЕдддд дссЕсадсса 46440
аадддЕЕсад даЕЕЕЕЕЕЕс саадсЕЕЕЕс ссЕсасаасЕ ЕдадЕЕааЕс сдааасдЕЕд 46500
сЕаЕЕаддсс ассддасаЕд сЕЕЕЕсЕдса ЕдссЕдЕдЕЕ дддсЕдЕЕЕд даЕЕдааддс 46560
ссадсааддд ааддсасссЕ сдсссаЕсЕд асасаддсад дссЕсЕасаа ЕЕЕЕаЕЕссс 46620
Еаассадддс аЕдасааасЕ аЕддсссаЕа дассааааЕЕ ддсЕЕдссас дЕдсЕЕЕЕЕЕ 46680
сЕддссадЕд адЕЕаадааЕ дасЕЕЕЕЕаЕ ЕаЕсаЕЕаЕЕ аЕЕааЕаЕЕЕ ЕЕЕдадссад 46740
дЕЕсЕсаЕЕЕ ЕдЕсасссад дсЕддадЕдс адЕддЕдсаа ЕсасддсЕсс ЕдсадсдЕда 46800
аасЕссЕддд сЕсЕадсааЕ саЕссЕдсЕа асЕЕЕЕЕЕЕа ЕЕЕЕЕдЕаса дЕсЕЕдсЕдЕ 46860
ЕдЕЕдсссад дсЕддЕсЕдд аасЕссЕддс сЕЕаадсааЕ сЕЕссддссЕ ЕддссЕЕсса 46920
аааЕдЕЕддд асЕасаддсс ЕдадссдсЕд саЕссадсас ЕЕЕЕаЕЕаЕЕ ЕЕЕаааЕддЕ 46980
ЕдааасасаЕ саадададда аЕааЕаЕЕЕЕ сЕдасасадд ааааЕдаЕаЕ даааЕЕсаса 47040
- 78 016397
ЕЕЕсадЕаЕс ЕдЕаааЕаад сЕЕЕЕаЕЕдд адсасадсса ЕдаЕасаада саЕаЕасЕда 47100
сЕдссЕдЕдд сЕдсЕЕЕсда дЕЕасааЕдд сЕдадЕсдад ЕадЕЕаЕдас ададаЕЕдЕд 47160
Едддссдсаа адссЕаадаЕ аЕЕЕдсЕдЕс ЕддсасЕЕЕд садааааадЕ ЕЕдссаассс 47220
ЕдсссЕдаас аааЕаааддд асаааЕЕсса сЕЕдссссдЕ ссаЕсЕдЕдд адсададЕса 47280
сЕдаааддаа аЕасЕддааа ЕасЕддаадс сасЕЕддЕдЕ ЕЕЕаЕсаадд аЕдЕдаддЕЕ 47340
ЕссЕддсаас ЕЕЕдЕсдсса ЕаЕсаЕсаЕс аЕсаЕсасса ЕсаЕсаЕсаЕ саЕсаЕсаЕс 47400
аЕсаЕсаЕса ЕсаЕсаЕсаЕ саЕсаЕсЕдс ссЕЕЕаадЕЕ ЕЕсЕдсЕЕдЕ ЕЕадаааада 47460
ааЕЕЕаЕаса дадсссссад ЕадсадсЕдЕ аадддддсад дЕЕсЕЕддад садсссаЕсс 47520
ЕсаасаЕЕсЕ ЕдсЕдсЕдаЕ ддаадаЕЕсЕ сааддаЕдаа ддссссЕсЕа Едддадсадд 47580
аЕсадЕсЕдд сЕЕЕадЕада ЕдссааЕЕЕс ЕдсЕаадасЕ аЕЕЕссЕааа ддадссЕсЕс 47640
сЕсаЕЕЕдсс ЕЕЕЕсЕсссЕ дЕЕЕЕсаЕЕд ддддаддЕдд аададдадаа аааЕааЕЕад 47700
адаЕдсЕсас сЕЕЕЕЕсЕЕЕ ЕЕдсЕддсаа ЕЕЕаасадкс ЕЕЕЕсадсЕд сЕЕЕдаЕЕсс 47760
ЕЕЕсаддсса ЕЕддЕдЕЕдЕ аЕаЕаЕЕЕса адаЕЕЕдсЕс асаддЕссаа адсЕЕаасЕЕ 47820
аадсЕсссЕд адасаЕаЕса ЕааааЕаЕда ЕЕЕддддааа аасссЕааЕд ддссаЕдаЕс 47880
Э.С[ЗЗСЗЪЪз.Ъ ягтгхя·}” ггя я я+* ггг’+'+'аа /’гллп я ГГ я + п Г~> Г· + + сЪ'Ь Ъ сЪ 47940
— 3 ”3 - * 3 - ** **
ЕЕсЕЕЕсЕЕЕ сЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ааЕдааадЕЕ дадсадасЕс ссдЕссааса дЕЕЕЕсааЕд 48000
ЕаддааЕЕсс сасадсссса ЕЕЕдаЕЕдса дЕЕЕдЕЕдаа аадЕЕЕааЕд ЕЕЕЕЕдЕадд 48060
сааЕЕсаЕаа ЕЕЕссасаЕЕ даасадссЕд ададдаадад адсЕддадсс сасЕдЕЕдЕЕ 48120
ЕЕЕдЕадЕдд даЕддЕддда асЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕсссЕссссс ааааддаЕаЕ аааасЕаадЕ 48180
садаЕддЕЕд ддаааасдЕд дсасадддЕЕ ссадсссЕЕЕ ЕдЕаааЕсЕд адаЕдссссс 48240
ЕссЕЕЕаддЕ сЕЕссЕЕЕад дасссаасад ааЕадаааЕЕ ссЕдсЕдсЕЕ ааЕдЕсЕсса 48300
ддааддаааа аааЕЕЕЕссЕ сЕаддсЕдЕа аЕадЕассЕа аЕЕЕссЕЕЕЕ ЕсЕЕсЕсЕЕЕ 48360
аЕЕЕаЕЕЕаЕ ЕЕЕсссЕаЕЕ ааЕаадсасс ааЕЕдЕадаа даЕдааддаа дсЕдддааас 48420
ссаЕсасЕЕЕ ЕддадааддЕ ЕааЕадсЕЕс сЕЕЕадаааа ЕссЕдасаЕа аЕасЕЕаЕЕЕ 48480
ссссаааадд сасЕЕсаЕса дссЕдааЕдс садЕЕаадаЕ ЕсааддааЕд ддсЕЕддаЕЕ 48540
ЕдЕдЕдЕасс садсддЕЕсЕ дЕддсаЕсаа дЕЕдсасЕдд дааддададЕ ЕЕддддсЕдЕ 48600
сасЕдЕддад ЕсссЕдсаад Есадсаддас садддсЕдЕс ЕЕссЕдсасс аЕсЕддаЕЕЕ 48660
ддЕЕадсЕсЕ сЕсЕдддсад Еддддссдад ЕсЕсаЕЕЕсс ЕссаасааЕа аЕдЕЕаЕаЕа 48720
ддсааЕдаЕс сЕдддсЕдсс сЕаасаЕааЕ ЕдааааЕЕаЕ дЕдЕаЕЕдЕа ддсЕЕддадЕ 48780
- 79 016397
дсЕдаааЕдЕ дддсЕсаЕаа аааЕаЕдЕдд ЕдсаддЕадс сЕаЕддадаЕ ЕддаЕдЕддс 48840
асасааЕдаа дсЕЕЕЕаЕдЕ ааадЕаадаа ЕЕаЕаадЕсЕ ссаЕдЕЕааЕ аЕЕдЕаЕЕаЕ 48900
дадЕаЕдаса дЕЕсЕЕдддЕ дддЕссЕсад ддсаддЕсЕд ЕсассЕЕсаа сааадсссда 48960
дЕЕЕссЕааЕ ЕсЕасададс ЕддЕаЕЕЕдд аЕдЕааЕсаа аЕсддЕЕЕЕд саддЕддсса 49020
аадаЕдаааа сЕЕдЕссасс ааЕссадсЕс ЕссссасЕда дддаЕадсаЕ дддаЕдЕада 49080
ЕдддЕЕЕдас ЕссаЕЕЕддс аЕЕЕЕЕдЕЕс асдддЕЕЕЕЕ аЕдадаЕдда даддЕдадЕд 49140
ЕЕддЕдддЕд ЕссаЕЕЕЕдд ЕЕддссЕсаа ддаааЕдасЕ сЕаЕЕдадЕд дЕЕЕЕдасса 49200
аЕдсадсЕса ЕаЕадЕЕаЕд ЕддЕаадЕда дааЕдддаад аадЕЕдддаЕ дадаЕддддс 49260
адЕЕЕадаЕЕ сссададссс ЕсЕддссЕдд дЕЕасадаЕд дадасЕддаа аЕаЕЕЕасЕЕ 49320
ЕадЕддЕЕсЕ саасЕЕдада ЕдаЕасЕдсЕ сссададаад дЕаЕЕЕддаа дЕдаЕдадаЕ 49380
ддЕааддаЕа ассааддддд ЕЕссЕдЕЕдд ЕаЕЕЕасЕдЕ сЕдддддсЕЕ ддадЕссЕас 49440
аадЕссЕЕса дЕдЕЕЕдддд садасЕсссс ассЕааЕасс сЕдЕсдсада ЕаддасаасЕ 49500
саЕЕсадЕас асадаЕдааа аааасадада ЕсасЕдаадс ааддддадЕс даЕдсадддЕ 49560
сЕЕдЕддсаа даЕдсадаса саассддасЕ ааЕаасЕадд ЕЕдсЕсасса сдддаддссЕ 49620
сЕаддЕдааа дсЕсЕдааЕЕ ЕдЕадсадас асасссассЕ сдЕаЕадаЕс сЕадасдЕса 49680
ЕдддааааЕс дасЕдЕдЕас ЕЕЕддсаадЕ адЕЕсЕЕддд сааЕдаЕсЕЕ ссадсЕЕЕад 49740
дЕаЕаассаа аЕЕЕддЕЕЕд ааЕЕЕдссаа дсадЕсдЕаЕ сЕЕсдаддаа сЕссдЕсддс 49800
ЕддоЕЕдЪдд аЕддсЕЕЕдд сасЕЕсЕдЕс ЕсЕсдЕддда ЕЕЕдЕдсааа сссЕЕсЕЕЕс 49860
ЕдЕаЕЕаЕсс ЕЕЕссЕдЕсЕ ЕЕЕЕЕсЕЕЕс ЕаЕЕдаааЕЕ дЕЕсЕдасса ЕсаадассЕа 49920
асЕсЕдЕдса дссЕЕсссса дЕсЕаЕЕдЕс ссадаааЕЕс ЕдЕсаЕсЕЕЕ сЕЕддсаЕЕЕ 49980
ссЕдадЕссс ЕдадЕсЕсЕд ЕсасадЕдЕс ассаЕдЕЕсЕ дЕсЕЕдаЕЕЕ ассЕдЕдЕсЕ 50040
дЕааддсЕсс ЕсаЕдсЕддс аааасЕсссс дададсддас аЕсЕЕЕдЕсЕ сЕссЕадЕдс 50100
ЕЕдЕсасадс сЕдЕасасаа адсаадЕадЕ асЕсадЕдЕЕ саЕЕдадЕаа адЕЕЕЕсЕаЕ 50160
адааЕЕааЕа ЕЕааааосад ссаЕЕЕаЕЕЕ ЕдсЕЕдадда ддЕсЕссдаа аЕдассаадд 50220
ЕдЕоЕссЕЕа ЕаЕсЕЕаЕаЕ ссссЕссаад саЕЕсаЕЕаа сЕдаЕддаЕЕ адЕдадЕЕдд 50280
ссЕЕдадаад саЕаааддсЕ сдЕсЕссаЕд ЕдсЕЕсЕаад саЕЕдЕдЕсЕ аадЕЕсЕдЕЕ 50340
ЕддЕЕЕссЕд адЕдааасЕд ЕсЕЕааЕдЕЕ ассаасадаа дЕЕаааЕдсс ЕаададЕЕЕс 50400
ЕЕаЕасаЕдд дсЕдадЕасс ЕсЕдЕдасЕд ддсаадссас сЕсассЕсаЕ ЕЕЕассЕЕдЕ 50460
сЕдсааааЕд аддаасЕддд ЕсаасЕсаЕс дЕЕсаааЕсЕ сасЕдааадс ЕааЕЕдаЕсд 50520
сЕЕЕЕдасад аадЕадсЕсс сЕЕдддссдЕ аЕаЕЕЕаЕЕЕ ссЕадсЕЕдд аддааддЕдд 50580
- 80 016397
ддасадасад ааббдабдба сассбббабб бббабсбсба бддбааассб дбдсабасба 50640
аадсаббссб сбддбсбббб дадабдадбд бабасаббдб дбсбддсссб дбдсаббббб 50700
бассаадаад баадббббдб бдадбааасб бдддббдбаб даадаасбдс абдсбсассд 50760
басбсаадба дсббббдсба ссбаааддас адсбдсбсаб абдбасббда сббссбббаа 50820
адбдааддаб дабдасаббб дааааасдда ддббдаааад дадсадаббб ддааббдабд 50880
дбббссбадд асасббсбдд сббдадаббб дбдббббасб ббсббссббб ддаабадсбс 50940
бабаббсббб ссбсбсссбс сссассбсбс ссасбссссб ссадссссса ссаадббаад 51000
дбадбадбаа бдааабсабб ббббсбдаад сбасссбдба сбббдаабдс ааадасаааа 51060
аабасадббд сбадбаасаб баабсббсба бабдбдбасб басбдаасбб дадсбсбдад 51120
даадасссба ббддааббдс абдсбббббб абббббббаа бдаббабббд сабдсббдба 51180
бдбббббсад бббсбдассс абдбсасадб бабббсббдд дсбадббдбб сбдсабббас 51240
бббсбдаабб саббдббббб сабббсасбб ббдбббссбс бсдссадбаб сбссадабда 51300
аабддссасб дсббдабдбс саддсаддда дссбссадад бадасаадсс сбсааддабд 51360
сссддбсссс абсассддса сасаббдбод баадбаассб сссададабд абддсббссб 51420
ббаббдаддд ддбдааааад аааабдсббб бббдабдаба асаддссбба бббдбсаббб 51480
ббббсбббсб ббааасасаб бббсбббдда аабаббдббд ддбабадббб абабсбабаа 51540
ддбаббсабб ббсбдсбабб ддассббааб даббдбаасс бассбддааа ббббасааас 51600
сбббссбсса сбсббббсса бдбабббддб баааабсбад ссббдбдддс бсбадбббаб 51660
аддасасааб сассабддба бддаддадас бададдбддб абсааадсад ббабаааааб 51720
асаббсаддд саддбдаадб даадаададд дааббадааа асбсаааадд дддбссбдда 51780
бббдааасбб дссбаббабс сбсбссссса абббабсбба абабббдббд дсаасаббсб 51840
асасбаасаб ьадааааабб бсабсбдддс бддсбдасбб дбааассбап а гг+· я ггя я а +- η — Я--- -у 51900
аасбббдааа ддсбаааабд даабббаабс бабасабсса бддсбббдаа адбабдбадд 51960
бббдабадад ааадсабббд бббббадбас баададасба саадбдбдбд бсбасабаба 52020
бббббаабдб аббббсббад ддббббдбад дсбсбаадад бддаабббаб аааббаассб 52080
сббдадаада бадсбсадсс ббабббдаад аббсссббсб абдбабббаб абсабдадсб 52140
ддасббсаба сббббдаааб ааббаабдда аддсабаббб ббабаабдаа бссабссабд 52200
асаддбадаа ббабдсааад сабдаабсаа бсабдддббб ббсабббдад бабсасаааа 52260
бдббаабсаб ааабасаббб бдссбсбаба ббдбаабббс баааааббдс аааабаадбб 52320
- 81 016397
ЕсЕЕаадЕад аааааЕсЕЕа адаЕдсаЕЕс ЕдссаЕЕЕЕд ддсЕаасЕдс сЕссЕЕаЕЕЕ 52380
ЕддадсЕЕдс ЕдЕааЕЕдад саЕдЕдЕЕаЕ ЕЕааЕдадЕЕ аЕассЕсЕдЕ саЕаЕдЕдЕд 52440
ЕдЕЕЕаЕаЕс асааааЕаас ЕЕаЕЕЕЕЕаЕ аааассаЕаЕ ЕЕЕдадЕсаЕ саЕЕЕдЕдас 52500
ааЕдЕсЕЕсЕ ЕЕЕсЕсЕддЕ аЕаааЕдадд саЕдЕадааа даадаЕЕдас аЕЕЕдсЕада 52560
адсЕЕссссЕ ЕЕссЕсЕаас ЕссасааЕаа ааЕддаЕдсЕ саЕааЕЕаса ЕсЕдсЕссЕа 52620
ЕааддЕсаад аЕЕЕсадддс ЕддаадЕдас сЕЕадаЕсаЕ ЕЕаддсссаа сЕЕдсссЕса 52680
ддаааддааа сЕдаддссса дадаЕдссЕЕ аадЕдааЕЕд сссааЕдЕса сасдсЕдадЕ 52740
садЕддссад адсааддсЕЕ ддаЕссадЕЕ сЕсЕдсЕссс ЕЕЕссададс сЕЕдЕдаЕдЕ 52800
сЕЕсЕсЕссЕ асаддаддЕд ааааЕаасЕд сЕдЕддсЕдд ЕЕсЕдЕЕЕЕд сЕдасЕдЕаа 52860
аЕЕдддЕсаЕ ддЕсадддас адЕдсаЕадд ЕдЕааадаад ЕЕдсЕддЕЕд ддддЕЕсЕаа 52920
ЕдсаддЕЕЕс ЕссаааадЕд ааЕдсссЕдЕ Еааааааааа ЕЕсЕЕаасаа аЕаЕасадад 52980
аЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕаааааадЕд ЕдасадЕЕсЕ адасассЕад ададЕааадЕ даадаадссЕ 53040
дЕЕЕЕсаддЕ ЕЕсссдссЕс ссЕдааЕЕЕс ссадсаЕддЕ ссаддсЕЕЕд аааЕЕЕаЕЕЕ 53100
аЕсЕдсЕЕЕЕ ддсааЕддЕЕ даЕдддааЕЕ ЕсссасаЕЕЕ аЕЕЕЕЕЕадс Еасададааа 53160
ддасаЕЕаЕс ЕЕЕааааЕсЕ сЕЕсдЕЕдЕЕ сЕсЕсЕсЕЕЕ дадЕдаддад адаадаЕдЕд 53220
ааЕссЕддса дЕддЕЕсада дЕддасасад ссссЕдЕдЕЕ ЕдЕддсаЕад дсЕсЕдЕддд 53280
ссссаЕдсса дддадсадЕа сссссдЕдЕа ааддадЕддд ддЕЕЕдЕсса ЕЕЕддаЕада 53340
дсааадаЕсс ЕссассЕсаа аЕсссасаад аасадЕЕдсс асаассЕддд СссЕаадсаЕ 53400
сЕсаЕЕЕЕсс ЕаЕдЕадааа ЕЕааЕдаЕсЕ ддаддадаЕд дсаааасаЕЕ ссЕЕссадад 53460
ссЕдЕдЕдда ЕЕЕЕддссад дддЕдсадса адддддсЕЕа ддсассЕЕЕЕ ЕссЕсЕдсЕд 53520
ЕдЕсЕЕадса ддсдЕдЕЕда ссаЕадсаас ЕссссЕдддд саЕасасасс сЕсЕЕдЕада 53580
ЕддадассЕЕ ЕдЕссааадс адссасадсЕ ддсаасЕдЕс ЕаоааЕсЕЕЕ ЕдддсЕЕЕсЕ 53640
дсЕдЕдсЕса аддддаЕсЕд ддааЕддсса ЕЕдссЕадад дддаЕдддсЕ ддЕддаддаа 53700
ддЕдддсЕсЕ дддадссддд дадаадддаа аадссаЕдаа ЕЕЕддасааа аддасаааЕд 53760
ЕддЕЕЕасаЕ ЕЕдЕдаааЕа сЕЕдааЕдсЕ ЕдЕсаЕдааЕ ддЕдасЕЕЕд дЕЕсЕаЕдад 53820
ЕсадсссЕдЕ даЕддддЕаЕ ЕЕсЕдсадЕс ЕЕсассЕдас ассаддддЕд адааддадда 53880
ЕЕЕсЕдддда ддаддааада дЕЕдадддад аЕаддааадЕ ададЕддаад аааддссЕЕд 53940
сдЕЕдЕЕдас сЕсЕаЕссас сЕддЕсассЕ аЕадЕЕЕЕЕд ддаЕЕдадда ЕдсаЕасасс 54000
ЕЕдадасЕас аааЕЕЕаЕда ЕЕаЕаЕЕЕЕЕ дсЕдаасаЕа аддсааЕдЕд ссаассаааа 54060
ссадсЕдЕЕс ЕЕЕддсЕддЕ асадЕдЕдЕс ЕЕЕдЕЕЕдЕа аадддЕдсаЕ ЕсЕдааЕддЕ 54120
- 82 016397
ддаЕдайаса Еса-ЫхЪдддЕ сЕБЕдкасад ЕЕааасаЕЪд дссададддк сЕдд-Ыхсдкд 54180
ЪйЪададксд ссдайдаадд дскаасЪЕЕЕ сБссадасас ЫхддддсйсЛ йдЪЪсасасЛ 54240
ЕЕдсЕйЫхса сЪсЪЕЬБаад Ьаадасайад Есасайсаса дйдЫхЕсаЕс адасакдкйк 54300
саааайаайБ дЪсйааддак ЕдсйЕсЫхаа Е'Ыхссссдаа айЪЪддаайй дкйдйаасйй 54360
Ъ-Ьдддссаад сбаЬЫхсайа ΗίχϊβίΙχΕσίχΗ аЕдйсЕсдсб ЕдаадааЕад ддайдйаЪЪс 54420
адЕдЕЕдакЬ аЕБаайсаГЛ сдааасЬаса асЪЛЛхасада Ьйдсйаадаа даайаасЫхс 54480
ЕЕссадТхасс саЬаЕддддс адаабсЪЪса сдЕдддааЕй сададсаЪЪЕ ЬдЕЕддасЕа 54540
Е'Ых'ЬааЪс'Ьд акЬддайЕай ййксаЪдйдд ЪайсгЬдддЕЕ ассасаЫхад ааасдакЕда 54600
ЕдЪд-Ьадаа'Ь ааайдрйскк аасаадйдда дд1хсаасЪ1ха Есааа1хда1ха ЕйЕасакйаа 54660
даа!:адас1хс сасазайЕЕЕ адРЕссйдЕа дсйдакайад саЪсЕса'Е'Ы: дГХакаЪааЪ 54720
ссадЕдабкс сйааЪсЬдЪд Ейсададдад ададдааайс дакЬдсааса дддасдайдс 54780
сЕЕса-Ыхддс бддсссаааа сйдддадЪЕк акасааддсд ЬсадЕсйй'Ьд ссйкссйссй 54840
сссйдссЕЕс ссЕсЕЕссЕЕ сЕЪссйкссс сайасйсссс аасааа-ЬЕса ЬддасЕйсЬЪ 54900
аасаасйсад адасаййадс сасаадкйсс аадасасссс сассссссад сскссссадй 54960
ссЪа-ЬЕЪЕсд сакксайаЕа аскааасйск ЪЪЬксЕкЪсБ ЪддЬддадйЕ ЕЪдааайЕЪа 55020
ЬаЕЕЕ'Ыхаа'Е ЪскЬЕдсЕсс сЪЪСЪЫхссЪ сЪЪасаааай дадйдссаад садсЕаадЫх 55080
дкдсЬдадйд дкададЕЕЕд адйсадксМх ддсйддйаад сЛдЪддддБЕ аддадссдсЕ 55140
сссЕддайас сассЬсйддб дЕскккдска Ьасааадас<х Ыхсайййадс сйссйЪЪдйа 55200
Ьссадсаааа ааада'Ыхсад Ьасссаааак ддйддкаЕЕЪ ЬддЪакадЕа ЛхдЪаксЪЕас 55260
аааасддсаа аадас-Ыхсаа аадЕЕссйас ΒβΙχΈΐ^ΙχσΕ едддддЫхЕс сФЫхЪдаадй 55320
рдаЪдкадаа ЫхЕЕассЛЕд дддЪдда-ЬЕЪ йЪйдЪасЪЬс •ЕЕддЪскддЪ дЕдЕЛхЕйдк-Ь 55380
дЕдЕааЕдад сакддаддйд Ъдддайаада аадсадасЬд аайсссдадд аасааадссй 55440
дссадасЕдй ддкддЪдЪас ЪЫхЕсЕ1хдЫх дЪЕаЕЪдсйй аааЪдсйдса адададйдда 55500
ааасЕсСйас даааЪаайдс асдаЕдддйа даасЫхсада даааа'ЬсЬсЕ дссдЪсйасс 55560
скд-ЬдсаМ:!: йсдаддаадс Есададддса кдайдаассй МхдсйЪйЕЕд ЬйксЬдаада 55620
дйЕсадддда ассЪасссаЪ ΗβΙχίχββΐιίχΊχί: ЬйаааасасЕ ассйададад сасссЕаЪЕд 55680
дЕ'Еа'ЬЕааас асайдсдоЬд йЪбсдакддд айдЫхйдасс йдда-ЬЕдкдд аЕдсЪйдсЪд 55740
ддасдЕддса йдЕдЕЕддда ддс-есЪдйдс Ъдсс1хдс1хда доассадсаа адссасадЕд 55800
дссссТхассЪ сйдбдддадд сссЕдЕдсса дд-Ьдсссйса аададйаддд ддсссайдад 55860
- 83 016397
ддРаРдасса дддддассКд аРРРсддсРд адаадРРддс ддддаЕЕаса ддссРдддсд 55920
дсРсссРдад даааЕЕдсаЕ РаааааРдад аЕсЕдааддс ЕЕдаЕЕдддд ЕЕддсссааЕ 55980
даадддаРад дадаадддаЕ ддддадрддд садааддааа сасаЕдЕдЕд ааддРссРса 56040
адддаааадр дсРРддсЕРд дасададдса ддаааЕсадд ЕаддаддсЕа даддрсдддс 56100
адддсрссдд дададЕдасЕ рддддРдсад саРаРддрда ддаЕсЕдаса срддддадрс 56160
аРРРдадсад дРРддсРдРР ЕсЕдЕаддад сдЕдЕдЕЕаа дсЕдсЕддса дрддддардд 56220
РдааааРада дардрддадд ааааадсадс ддаасЕЕдсЕ дасаддЕЕад аРаРРддсаР 56280
Рдадддадаа ,аддададЕса ааддЕаддЕа даЕддадаЕд сЕЕсасЕдад РддддадРаР 56340
Рддаддадда дсаддРРРдд ддрддаадсд РРдРссЕЕРР адададаРРд РаРРРдссаР 56400
РдаРРдаРЕс аРРсаРРдРР ЕсЕдсаааЕа РРРадРдЕдд дааааадсаР дсРадасасс 56460
аададададр ддадРсааРд аадаасдаЕа асадсаасаа адасЕдЕадс дсРРссРаРд 56520
сдаддсРРдР РссадРРдсР ЕсададдсЕд РдРРассссР дЕЕсЕадада ддаддаасРа 56580
ддсссаддда ддЕддддаРР ЕдсссадЕсд ЕдддадЕсад даРдРдааас ааддсасссЕ 56640
ддсРссадад сасассдРсс ЕсЕсаассас Едсададаад сРдддааада дасаааЕаад 56700
РдддЕдсРРа дадсасааЕд ЕдЕдЕддЕдЕ дсааададса дсЕдддадсс сРдддасссс 56760
садддаассс садссссасс РдддсаРддР дддсаРддсР ддаддаддсс РдсРддсРРР 56820
дсрддададр дддасаРдса ЕсааддЕддс сададасРдд дсЕЕсЕдддЕ дЕсдЕдсЕдЕ 56880
дасЕдсРдса аадддсЕсаЕ ЕдасаЕаЕдд Еддддадддс садсдЕаЕЕЕ РсРдсдддса 56940
ддасаРРРдд дддаРаРддд дрдрдассср дРасРаРсРа аааксЕЕЕЕа сРРсРддаРР 57000
аЕсЕссасЕЕ ЕсЕсЕасЕдс аЕаЕаЕасЕЕ РдРРРЕЕаЕР РаРРРРаРРс аРРРаРсРаР 57060
дасЕсадсса дасРсЕсРаа аададЕЕдас РРдРдРРРсс Еадсадссас ЕдадРсадаа 57120
сЕЕЕсссаЕЕ ЕсдсадЕсад ддсрдрддрс адддЕдЕоЕд РдРРдРсРаа ддаРаРааад 57180
саадссЕЕсд ддсасРасса ааасаЕЕаЕЕ ЕЕаЕааддад аасЕаЕдадЕ ассРааЕадд 57240
аадаассадд сааРсаддРР аЕсЕЕЕЕддЕ даддаадаад ЕддЕадаЕдд дарсаррддр 57300
дсЕЕЕдаадд дадрдддрдд РдРадасЕсс ааадЕдЕаса РддддссаРд аРададРсРа 57360
ЕдЕсадаЕдЕ ссааадсЕЕс сЕЕсЕсЕссЕ сссадааасЕ сЕдЕссЕсЕд дрдаададрр 57420
ррдаадРРРс сРдаддРРРд ддЕЕсаЕддЕ дрддсаддрд аРассаЕддс ааРадааааР 57480
аЕсссаЕсаа дааддаЕЕдЕ дЕдассЕсад ЕЕдЕадсссс ЕдсаЕдЕЕдд ааРсасааса 57540
аЕЕЕдсаддд ссРЕааааЕс аааЕдссаЕЕ ЕсассаасЕд сссРсссссд РРРРРРРсад 57600
сас'Ьдк'Ькдд ЕадсЕаЕсЕд ЕЕЕссссЕда ЕаЕЕсЕЕдда сасЕЕссада даРдддддсР 57660
- 84 016397
сЕаЕсЕссЕд дЕддЕадасЕ дЕЕЕсЕЕЕЕЕ ддЕасааЕаЕ даасЕсЕЕаа дададЕЕсЕа 57720
ссЕЕЕаддда дсЕдсадЕсЕ сЕсЕссЕдда ааЕдсЕсаас ЕссЕЕааЕЕс аЕдЕЕЕЕдсЕ 57780
дЕЕаааЕЕсЕ дсЕааЕдссЕ сассЕЕасаЕ дЕсЕЕдасаа ЕЕЕдааддЕа дсЕаЕЕдЕаЕ 57840
Ессссдсаас ссоаадЕсЕЕ сЕсЕЕсаааа ЕдаЕЕаЕЕаа ЕЕдЕааЕЕса ааЕсаЕсадЕ 57900
дасЕддЕаЕс ЕЕадасЕасЕ ЕааддаЕддд ааЕЕдсЕааЕ ЕЕЕдЕаЕЕЕа ааадЕЕдЕас 57960
сЕсЕааадЕа адЕдаааЕЕЕ аЕЕЕЕЕааас дЕадсЕЕЕсЕ ЕсаЕЕсаЕаа адЕЕЕаЕдЕЕ 58020
саЕЕдЕаддс адЕЕЕддааа асадсссаЕа аЕсЕсассас ЕсддадаЕЕа саЕЕдЕдааЕ 58080
ааЕЕЕддЕаЕ аЕЕЕссЕЕЕЕ адаааЕаЕас саааЕЕаЕсс ЕЕЕЕЕЕссЕс ЕдадЕдЕаЕд 58140
ааЕаЕЕЕаЕа ЕЕЕдЕЕЕЕЕа асаЕасЕЕда дсЕсаЕадЕд сЕсадЕаЕЕЕ ссаасдЕЕсЕ 58200
дЕЕЕаЕЕЕаа даЕдааааЕЕ дсЕдЕадЕЕа аЕаадсасЕЕ ссссаЕдЕса ЕЕааааЕдсЕ 58260
ЕааддаЕЕЕЕ ЕааЕдассас аЕаасадЕсс аЕааЕаЕдаЕ Еааассссаа ЕЕЕасЕдааЕ 58320
сааЕдссаЕа ЕЕдЕЕдддЕс ЕЕЕадаЕЕдЕ сЕссЕЕЕЕдЕ ЕЕсЕдсЕасЕ дЕдааЕдаЕс 58380
сЕдЕдаЕдаЕ саЕсЕЕЕдЕд ЕдЕаааЕсЕЕ ЕдЕссссЕсд сссссЕсссс ЕЕЕЕаЕЕаЕЕ 58440
ЕЕсЕЕдддаЕ адассссадд асааааддЕа даааадааса аадЕдЕЕааа аааЕЕЕсЕЕд 58500
аЕасаЕадсс асадаЕЕаЕЕ ЕЕссЕдааад ЕЕсЕсаасаЕ ЕЕаЕаасЕас дадсадЕаЕд 58560
ЕаадададЕЕ аЕддЕЕддаа ЕдаЕЕЕЕааЕ дЕсЕсЕдддд ааЕЕЕаасаа сааааааасЕ 58620
ЕЕаддсЕЕсЕ ЕЕддададад асаЕдсссЕЕ аасЕссассс сдсссЕадаа сададассса 58680
дсссаЕссаа дЕсадссЕсс ссаддЕссЕс сассЕЕсааа асаддсааас даааЕсаЕЕЕ 58740
сЕЕдааЕааЕ ЕддЕаддсЕЕ сааддЕсада ЕдЕЕЕаЕЕЕЕ адаЕааЕЕса садсаЕаааЕ 58800
ЕЕаЕаЕдЕЕЕ ЕаддЕассЕЕ адссссЕдаа ЕаЕасЕсадЕ ЕсаЕЕЕадда сЕаЕЕЕЕада 58860
ддЕсЕЕдадЕ ЕЕасЕсЕЕаЕ аассЕсасаЕ ЕЕЕЕЕЕдЕда аЕЕЕЕЕадЕЕ сЕаЕЕаЕсЕЕ 58920
ЕдЕЕЕЕсаЕд дсаЕаЕЕаЕЕ дддсааадаЕ асЕаЕЕЕаЕЕ сдаЕдсЕаЕд ЕдЕдадсЕдд 58980
дЕсаддаЕЕа ЕдасссЕдад ЕЕаЕдЕЕЕсЕ дддааааЕдЕ асссасЕЕдЕ сааадаЕдсс 59040
дЕЕддсЕссЕ дЕдаЕЕаадд Есадсссаса аЕдааЕдЕдд ддадддсЕдд садссЕсЕса 59100
ааЕсадсЕсЕ ЕдассаЕЕЕс ЕсаадсЕддд дссЕдЕЕдЕд сЕЕдддддаа дадЕсЕЕЕдд 59160
садсЕсадсЕ сддддсЕадс дЕЕЕссЕдас аЕЕЕдЕЕЕсд сЕдааЕдЕЕа асааддЕЕас 59220
Еддаааааад ддЕЕсЕсЕсс ЕааааЕаддЕ ЕЕадддаадс асЕдддаЕаЕ дсдаадЕдаа 59280
ЕдадЕЕЕсЕЕ Еадддсадда ЕсЕЕдасЕсЕ дсадддддсЕ ЕддаддссЕЕ сссЕададЕд 59340
дддсЕЕссЕа асасЕдсада дсЕсЕЕссса ддасдадддд саадаЕЕддд ассЕасЕЕЕд 59400
- 85 016397
дааддЕЕдЕЕ ЕЕЕдЕЕЕсдд сассЕдсЕсЕ дЕЕЕасдаад сдЕдддадсс ЕдЕЕЕЕаааЕ 59460
ЕааЕдЕдсдс сЕасЕЕадад сЕасасЕсаЕ ддЕЕЕЕдасЕ аЕдЕЕЕаЕсЕ ЕЕссадЕааа 59520
Еаааасаааа ЕЕдЕЕсаЕЕЕ ддсасссадс сЕдЕссЕдсЕ ЕдЕсаЕЕЕсЕ ЕдЕсЕЕдсЕд 59580
аЕЕаасЕсЕа ЕддаЕддддс аЕдЕЕЕсЕсс аассадаЕЕд ЕаадЕЕЕсЕЕ даадссаадд 59640
адсссЕдЕдд ЕЕдаЕЕЕсЕЕ сасаЕдЕддс ЕсЕсЕсЕссЕ сссасааЕдд ЕдсЕЕсдЕЕа 59700
аЕЕаадсада ааасссаЕсЕ оЕддЕЕаддд асЕддадЕЕд аЕЕЕсдЕЕЕд дааЕдадЕдЕ 59760
дасЕЕсаЕса ЕдассЕдааа дЕдЕЕсадаа ссаЕсЕЕддЕ Еадсасаадд дсдЕддасдЕ 59820
дЕдЕсЕасЕЕ ЕсЕассЕдаЕ дддаЕадсаЕ дЕЕЕааЕЕЕд дддЕЕаЕдас асЕдааЕддЕ 59880
ЕЕдссадЕаа сЕЕдсЕааЕс саассЕЕаЕа ааЕЕссадсЕ сасадЕддад сдЕдксЕааЕ 59940
Едссасадса дсаЕЕЕаЕдЕ ддаасдЕддЕ Едсасаааад сЕссадааад ЕсаддсЕдад 60000
ддсЕссЕаЕс ЕсЕссЕсааЕ сЕЕддЕЕЕас даЕдЕсЕдЕЕ ЕсЕдаддааЕ ссЕдддаЕдд 60060
ддссасЕддс ЕсЕЕЕаадад ададсссдаЕ ЕЕддаааЕсЕ аддасЕЕдаЕ ЕдЕЕдаЕЕаЕ 60120
дддсааЕада ЕасаЕЕЕЕаа дааЕдаЕдЕЕ дЕаддсЕдЕа ЕдаадЕсаЕЕ ЕдаЕдаЕЕдЕ 60180
ЕЕЕдЕЕааЕд дсЕЕдсаддЕ садаЕЕЕЕса ЕсЕЕЕЕЕааа ЕЕааЕЕаЕса Еадааддада 60240
ааасаасЕдд аЕЕЕсадааЕ ЕдЕсссЕЕда ддЕдЕасЕдд ааасЕааддс дЕдадддасЕ 60300
саЕаддддЕс ЕддсЕЕддаа адЕдЕаЕЕдс ЕаЕдЕссадЕ ЕЕасасаЕаа ддаЕдЕдсаа 60360
аЕссадсадд ЕЕадсЕдадс Едсссаддаа ЕаЕссаддса адааЕдасса ЕаЕЕсЕдаЕа 60420
аЕЕасЕсадд ссЕсЕдссЕс аЕсЕссдскд сссссссдсс сссЕдасЕсЕ сЕЕсЕдадЕд 60480
ссадаЕЕсад ссЕссаЕЕЕд ааЕдссаааЕ адасаддааа ЕЕадсаЕдсс садааЕссас 60540
дЕсЕЕЕадЕд сасЕсЕсЕсс ссадсЕссаа ассЕдЕЕасЕ дсЕЕдЕдЕЕс ааааЕсЕсад 60600
ЕааадсЕсаа саасаЕсдас ссаЕЕасЕЕа ддссЕсааас сЕЕдддЕддс аЕсдЕсдаЕЕ 60660
дсЕсЕЕЕЕсЕ ЕЕсаЕасссс асаЕЕсаасс саЕсадссса Есссасаддс ссаадЕдЕдЕ 60720
ссЕсЕсЕасс ЕЕсааадсдЕ дЕдЕддсаЕс сассдсЕЕаЕ сассассЕсЕ дссаЕЕасса 60780
сЕддадЕсса дЕдссаЕсаЕ сЕсЕсасЕЕд даЕдЕддсса дадЕдЕсЕЕЕ дсЕддЕсЕсс 60840
ЕЕсЕЕдсЕЕс сЕассЕЕЕдЕ аасадссЕаЕ саЕсЕаЕсЕс ЕддЕсЕссаЕ адсЕсасЕсс 60900
саЕасЕЕЕда дадддссЕЕЕ дааадссЕЕа дасадаЕсаЕ аЕсасадасс ЕсЕаЕасЕда 60960
аадЕсдддаЕ аааЕЕЕЕаЕс ЕсЕддааада дЕсссааадс адсдаЕдаас адаЕаЕЕЕЕд 61020
ЕссЕдЕсасЕ ЕдаЕдаадад дЕддддсЕЕЕ дадасссаад адсЕЕадааЕ ддададссЕа 61080
даЕдссасЕа адсссаддса сЕддссаЕдс ЕЕсдадЕдда дсЕЕЕЕдЕдс ЕддЕддадда 61140
дадаЕддсЕд ддддасассЕ дЕаддсЕдад саадЕссссд ЕЕсаЕсадас ссЕддсЕсаЕ 61200
- 86 016397
ссадсадддс дЕддсЕдаЕд ЕЕЕЕсааЕдЕ ЕдЕаЕссЕда дЕдддассса даЕдсЕЕссс 61260
аасЕдЕдсса саЕсЕдадсс сЕдсаЕдсса ЕсЕдЕссадЕ ЕдсадссЕда сЕдсааЕдЕд 61320
аддсЕдсЕда ададсЕсЕдд аЕддЕдЕдаа дсааЕсЕдЕЕ ЕЕсЕадсссд адссЕдсаЕа 61380
дсЕддЕддаЕ ссЕддассдЕ даЕЕаадЕдс аЕсассЕадд сЕЕсааЕдад аЕддадЕсас 61440
ЕдЕдЕдЕсса аасадЕддда ЕаааддсЕЕЕ асЕсЕЕЕдЕс ЕЕссЕдсЕсЕ дадддсасаа 61500
дсЕдсЕЕдЕЕ ЕсЕсЕсасаа ддасассдЕс ЕдЕдЕЕдсЕс аддЕдсЕддд дЕдааааааа 61560
садсаадсаЕ ЕЕдааааддс Едаадаадда аадааадсЕд ададсддЕас адссЕЕдддд 61620
асЕдадссаЕ сссаЕЕдЕсс сададдЕддд ддЕдЕЕаЕса адассЕдЕЕЕ ЕЕдадссаЕа 61680
ссЕсЕдасЕс ЕЕссЕддааа дЕЕадассса асЕсаадаас асасЕаадад аадЕдЕЕЕсс 61740
сссЕадсссЕ ЕЕсадаЕЕда ааддадасдс саассЕЕдаЕ дддЕддаддЕ адааааЕааа 61800
дЕсссаааас адЕдЕсЕЕдЕ аадсдааддд даасаЕддсЕ дддсададдд сЕЕсЕддЕда 61860
аасЕЕЕЕддд адЕаЕЕсадЕ ЕддаасЕсад дааааааааа ЕЕдЕЕЕЕЕЕЕ ддааададдЕ 61920
адсадссссс ЕЕсадссааа дсЕсаЕаааЕ дааддааЕдЕ сЕдадасЕса дааЕЕасадЕ 61980
дассааддса адасаЕЕдЕс аааддсЕдаа ЕаадЕдадЕЕ ЕдасЕдасад аддссаЕсЕс 62040
саЕЕЕЕЕадЕ аЕаЕддссаа дсаЕсЕЕЕсс сасадЕсЕЕс сЕЕдадсссс ЕЕсссаЕссс 62100
асЕЕсЕдааа адсасЕдадЕ ЕддссаЕЕаЕ ЕаЕдсЕЕЕЕЕ ЕсЕЕаааЕЕа ЕдаадЕЕдЕЕ 62160
ЕЕсаддЕаЕЕ дадааЕааса сссаддЕдсЕ даасЕсссад саЕаадаааЕ сааасаЕЕса 62220
аааЕддадЕа аддЕЕсЕдаа дсЕдасаЕсЕ дЕсЕсЕасас аЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕЕсЕдаЕааЕ 62280
ддсаЕЕЕссЕ аЕсЕссассс ЕсасЕсЕЕЕЕ ЕдЕЕдЕддЕд аасЕасасЕЕ сссЕЕдЕЕсс 62340
асЕсддЕЕсЕ дЕЕдсасаЕд ЕдаЕЕаддса аддддсадаЕ аЕдЕдаЕаЕЕ ЕаЕЕаЕдадЕ 62400
сЕЕЕЕссасд садададдаЕ сЕаааЕсЕдд сЕсЕЕЕдсаа ЕЕдссЕЕсаЕ асаЕдЕдсаЕ 62460
асасассаса сасасасаса сасасасаса сасасасаса сасасадаса саЕасаЕаЕд 62520
сасасасссс дасЕсааЕдд аддасссЕса ЕЕЕдЕадаад ддЕааааЕдд дЕдаддсдда 62580
ааЕдссЕдЕа ЕддсассаЕд дадЕЕсЕдЕд ЕадссадЕЕс ЕааЕссЕддд сЕаЕЕЕддЕа 62640
аддааЕдаад ЕЕддадаЕад ЕсЕЕсЕдЕсс сЕЕасаасса ааддааЕЕсЕ аасЕааЕадЕ 62700
ЕЕдссаадЕЕ ЕЕаЕдЕЕЕаЕ ааЕааааааЕ дасаЕдсЕЕЕ ЕЕсЕЕЕЕдда ЕЕЕЕЕааЕдс 62760
ЕЕЕЕдааЕЕа ааааЕдсЕад аасаЕдаасЕ даЕЕсЕЕсЕа ЕсдсЕаЕЕЕа даЕададссЕ 62820
Едсаададса дадсасдсаЕ дсЕЕЕсЕЕЕа адаасаддЕЕ ддЕЕЕдЕддЕ сдЕсЕдадда 62880
сЕдЕЕЕЕаад дадасЕЕаЕЕ аЕасасааЕс аЕсссссаса ааЕдаЕЕЕсЕ ааадададдс 62940
- 87 016397
ЕддЕаЕдааа дааддадЕЕЕ ссаЕдаЕЕсЕ дЕссЕдЕддЕ ЕсЕддддааЕ ЕсЕдааааЕд 63000
аасЕЕЕадаЕ аЕЕЕЕЕдЕда ааЕЕсЕЕаЕЕ ЕЕсаЕаЕЕЕЕ ЕддЕаЕсЕса дадЕЕЕЕсЕЕ 63060
ЕЕсЕддсЕЕс ЕдЕЕЕаасаЕ асЕсЕЕсЕЕЕ дсссЕаааЕс ЕсЕсЕЕаЕЕЕ ЕЕдсЕссЕЕд 63120
ддасаасЕда адааЕссЕЕа даЕааЕЕааЕ адЕаЕдаааЕ асЕдсссЕЕЕ ЕадЕЕдаааа 63180
аЕдЕсааааЕ ааЕдЕааЕаа даЕаааЕаад даддЕдЕсдс ЕЕЕаассЕдЕ аЕсдЕдЕадЕ 63240
сЕссЕсЕасЕ ЕасЕаасасЕ ЕасЕЕдЕаЕЕ асЕадаадса ЕЕаЕЕЕЕЕЕа ааЕсаЕддаа 63300
ааЕЕддЕддс аадсЕдадса ЕасадЕЕдЕЕ ЕаЕЕЕсЕдЕЕ ЕдасЕдаЕЕа ЕЕасаасЕЕс 63360
аЕЕаЕЕЕдаЕ дааддЕЕсЕд ЕасдЕЕЕЕсс ЕЕЕаадасас аЕадаааЕЕд ЕдадаадаЕс 63420
сЕдсадсссс даааддсЕас адЕдЕЕдаЕс сааддасЕсЕ дадссдадЕд садддЕЕЕдЕ 63480
асЕЕддассЕ дсаддсЕддд ЕддсдЕсЕдЕ дддадсадЕд ЕдЕЕдадада даЕЕсЕдадд 63540
сЕдЕаЕдЕдЕ садддссЕсс аддддаадда ЕдсаЕЕдаЕд даЕЕааЕЕЕс ЕдссааддсЕ 63600
дааададдад ададЕаадад дсЕдЕададд ЕдЕсасадсЕ дЕсаЕЕдсЕд ЕЕЕЕаддсад 63660
ЕсаадсЕЕЕЕ дддааадЕдЕ садаааЕЕда дсссссЕасЕ ддаЕсЕаЕсд дадсссЕдЕс 63720
аааЕдЕссаЕ ЕЕадаЕдЕсс ЕддЕдаасаа аадЕЕсЕсЕд асЕсассаЕЕ ЕааааасЕЕд 63780
ЕЕссаааЕда ааЕЕаЕддда даааддааса ЕЕЕЕЕсаЕсс даасссадаа ЕдаддаЕдЕа 63840
сссааддааа аддаадЕадд сЕсаддадсЕ ддасЕдЕддс ЕсадсЕддсс ЕдаЕдЕаЕсс 63900
сасЕЕЕдЕЕс сЕсссаЕддс ЕдддаЕдЕсЕ сЕЕЕдсЕсЕс саЕдасссаЕ дЕаЕсЕЕдад 63960
дасаЕдасас аЕддассаад сЕЕдаасЕдс ддаЕЕсаЕЕЕ ЕЕаЕдсаЕЕс ЕассЕдЕдаа 64020
ЕдаЕЕдсадс ддаЕсЕадЕс дЕаЕЕЕсЕда дадЕЕасЕса аасЬддасЕЕ садсадЕдаа 64080
сЕсЕасадЕЕ сЕсЕЕЕЕссЕ сссассЕЕЕс ЕаЕЕадасаЕ ЕдсаЕдаЕас аааааЕсаад 64140
аЕаЕЕЕсЕаа дадддЕдаЕа асЕЕсааЕдЕ ЕаЕсЕааасЕ ЕЕЕааЕЕЕдд аадаададдд 64200
дЕЕсЕЕЕдЕЕ сЕЕЕЕЕаааа адаЕасааас даасЕЕсЕЕЕ аЕсЕдаЕЕсЕ ЕЕЕЕЕЕддЕд 64260
сааасссаЕд аЕдссЕЕсЕЕ ссЕдаЕЕсаЕ сЕдсЕасасЕ дЕдадЕЕсаа дссЕддсдЕд 64320
ддасасаддс асадсЕсЕса ЕдссаасдаЕ сЕсаЕддЕЕа адЕЕЕЕддаа саЕааЕЕЕда 64380
ааааЕдЕаас ссаЕЕдадад дсадЕаадда саЕасддЕда дсЕадЕдсдЕ дЕЕЕддасдЕ 64440
сЕдЕдЕддаа ЕаадЕдадЕд ддЕадададд асаЕЕЕдЕса аддадсддда дддсдддсса 64500
ЕЕддсЕЕддд ддаааЕдддс ЕдадасЕсЕа ддддЕддсса дсассдсаЕа сддаддссад 64560
садддЕЕддд сЕЕддсЕаад ЕдсЕдЕддЕд ЕсЕддаЕдсс ЕаЕдЕдадЕЕ ЕссЕссадаа 64620
дЕЕЕЕсадЕЕ ддсааадЕад аассЕдсЕдд аЕаЕдЕадса адддЕдЕдда ЕЕдЕсдддаЕ 64680
ссЕдсЕдддс дсаддсдЕдЕ даЕассадад дЕсадаасад аадсЕдаддд аЕдаддсЕЕЕ 64740
- 88 016397
дддадсЪБЪ+ ЬдЪсаЪдсас ЪдЬссЛддад ссксадЪЪас Ьасааадкс!: дсаааЪдаЬа 64800
дассддадск ЬБддкБсЬдс скдаБдсЬад скссссЬд'Ь'Ь ссЪдаЪЬЬЫ: сЬБЕБсаака 64860
ЪБадасккаа ЬсссадаакЪ сасаЪдЬЪда аадаааасБЪ ададдЬсБад ЪдасаБаааа 64920
дсаЬсаЬЪЪЬ дайсдЪБаса даасЬдакдс сккдадааа-Ь ддадададаа дЪасасда'Ьс 64980
акддЪааЪас ЬддаЪдЬЬса скдадсасЪс асЪадсЪсса ддссЬкЬЬсБ аадкаа-Ых-Ьа 65040
БдаадкЬд'Ьс адд-ЬЪЪааЬс сЬсасаасдс ссЬЬа-кдаа1: дадсЬа-Ыхдк ЪаЪкаЬсссд 65100
аЬЬ-Сддаада ЬдаддааасЬ даддсЬЬдад дддаддакда сдкасЪсаад дЪсасасадс 65160
Сдддаддсдд саадспддаа дьсдаассСа аддад-сс'сса сагсддадсс аддасссгса 65220
сссЛЬсадБд ЬЪаБдсЬдсс ЕЬааЬсаддс асасаЪасад дсддддадад дсаддЫЛсс 65280
ддасассада сЬаддсЪддЪ дссддЪсадд сЪасассадд даассБддад дсскд-ЬсаБЪ 65340
сЪЪБЬдЬдак дсЬдЬкадЪС сскдЪЬдадд аадкдаддсЪ ЪЬд-ЬдддЬЬс ссаддаддаа 65400
ааддкаЪдаа сЬса-Бддсаа аадаааддаа ссаааааадд дада-ЬкЬдса ЬсасааБдад 65460
ссЪксЪаБЬс аЪссЬаааЪ-и аЬассБссЬБ ЪЪа'Ьасса'Ьд ЬдЪдЬс-Ьдса аасЬЬдЪддд 65520
Ьаааксасаа а-Ьс-ЬЫзскдд ЬзадЬБасаа ЬддаБддаад дЬЪЬЬБдсаЬ Ь-ЬсЬсЬсааа 65580
Бсассаасса ЬЪЬаа'ЬдсЬа БдЬдЪад'Ьса сЬсссЬаакс ЪаЪсЬБЪЪдЪ а1:ааа-Ы:1:дд 6564.0
аЬскЪкдадЬ а-ЬБддддЬБЬ Ьсса'ЬдаЪдЬ ЬБддсадЬЪс ссс'ЬЬаддд'Ь дксЬаЬсЬса 65700
аадЬЬЪдкса сасЪдасаад С'ЬБ.Ъддддад адаадкЬада ддкдддсЬБс ссБдЬББЬБа 65760
дЬддсЬдкдк скдаЪЬдЪЪс Ьд-ЬсЬдЬБс!: ссаддасадд ададаЬЪдаЪ ЬдскБЪсЬад 65820
с'ЬЫх'ЬЪЬЬаа ааЪЪааааса асаасаасаа ааааакасад аааддкасаа аддаЪаасаа 65880
асасаЪЬса-Ь д+ассЪдсса ссЪааааБаа сааЪЬасЬаа Ьс-ЬЪЪЬсасс сЪсс-Ьадссс 65940
акдакск-Ьсс сЬсссаддск дЬБаЬЬаака Ъдаааассда дЬЪсаддЬ-БЪ йЬаЬасЪЬЫ: 66000
сдасаксЬа!: ЕБаЬаББаас дкакдЬаЬЬа ЬаааЬааЪсЬ Ьад-ЬадЬЬ'Ь-Ь ЬаасЬЬкдас 66060
аЬаадЬддск Ьсааа1:1:с:са сакаасакЬс ЬдсадсаЪдБ Б1:1:сЪЫ:1:аЬ ЪЬСЪакБЪЫ: 66120
гЬсЬЬЬаЪЫ: ·Εΐ:33.3·ΕΈ·ΕΊ:·Ε аЬБЪЪдсадс аЬдсЬЬЬЬсЬ ЬаБЬсаасак ЬасаЫхЬдаа 66180
БЬЪЬЬЬсаас аЬЬдБасаБ-Ь даааЬЬ-Ьадс БсаЪ^сЬБЫ: ЬаасЬдсЪсЬ дБадЪаЕЬЪа 66240
ЬБдБаЬдса-Ь аЪасЬасадс ЬЬЪсЬаЪЬБс ЬдЪаЬЬдаЬд дЬЬааББадд БЪдсЪкасад 66300
ЬЬЫЛЬаада гХасадакЬс ЬдсЬдкааБа аосакссЬМ: дддсаадЬдЬ а-ЬдЪаддЬас 66360
скаЬаЬакда дЬЬЬсЪсЪад даЪЪсаЪасс ааадкададд ааЬБдд-Ьадд дсаЬЬддЬЫ: 66420
дскддЪЬЪЬа θίΣΐίΐαβϋϋο асаБдсЪа-Ы: дЬсаадсЪсЬ ссадаасаас ЬддаЬдадЬЬ 66480
- 89 016397
даккддакса акдадкаккк ссаксассад сакакаааск скккссксак ааксасасса 66540
акдскЕдакс скдккддаск 1:33331:1:1:1:-1: дссааккЪдс Ъдддкакдса асддсакскк 66600
асскаакккд сскккакккд акдасксскд аддк-кдааса кскддксака кдкккакккк 66660
сксскскдкд дсккдсскдд к-к-каа-кдсск кск’ксакккк ааадааксад акадккккск 66720
дккаккдакк какаддааск скккакакаа дккдааааск кдаккакакд кдккддааа-к 66780
аскккккска ддскдкдакд ккккаааака ккдскккада кдддккккса кккккасскк 66840
ккаккккада да-кддадкск саскдсаккд сссаддскдд аккдсадкдд скакксасад 66900
дааададсак адкакдккас адсскссасс ксскддкасс аададдксск сскдссссад 66960
ссксскдаак аддкдддасс асадд-кдсас аксаскдкдс скадскккдд акдддккккд 67020
ааадааадаа дккккааакк ккаакдссск сааакксакс кдкакккксс кскдкдсккк 67080
каккккдкас ссаскскаад кадскссдаа ккскдсадак адккддкдса ддааккскда 67140
ккккдадкдд асакскдскс кскаасадкс асаккдаадд азаккаддЕк кккккддкад 67200
даакскаадс ааддддккда кккдкаааск аддскккааа какдакккка адсаасксас 67260
ккадаасаад акасааааак кдкддаскдд асскакакск ддаааасккд ааадкдскад 67320
ддсаакааак аакксккддк сасакасадс сдадаксскд ддсксскдас кскдддасад 67380
аадс-кЕ-кска каккккакск саксадкскк кдсаасаддс кссккдаадс ааккккаксс 67440
ссаккккада дакаадаааа ссададскка аадсадккад акаакккакд аадкаадкдд 67500
сададссаад акксаааксс адасскккск дассасааад сксдккдскд аакассдсдс 67560
сксаккдсск ксккдсдаак касккдддак ккдкккдаак сссаааакск ккакакдкка 67620
ккккаааккк даакскаакк ддаадкдддд садкдадддк ададдасада аадаадддда 67680
ададсккдад асксаакаак адааасаааа аасссдкскс саддадддсд дкксаааадд 67740
аадаакксса каккксакдк ааскдааасд ккаааадссс ааакааккдс аксакдсаад 67800
кскдакдскд адкааксасс сксссссака ккаккдддда дадддддсаа даадкскддд 67860
аадскдкккк кдсскаадда аккасакксс аддддаскск даддакккад дкаассасаа 67920
аадссаккка ккксдадкас аскдадаккк скассасккк дакссскаак ссакадсака 67980
аккаакааак дааакдкдск дкадсакддд ккккккасаа адкдкасккк каааакддск 68040
кккддкскда сакдакксак ккдссасБкд даааадсдкс аксдссксад акдддсаддс 68100
кдддададдс кдоскддкдд дкадскдадд дсддккксск ддддсасадк ксскдссккд 68160
ддсскскаса дадсддкскс акссааасак сксссадаск скдсдккккс саддаадсдк 68220
дсадааакад даддссадка скдааакдск акскдскскд кдкакдксад аадассасаа 68280
- 90 016397
ассаскка+а асааакдаад акскккккак ккдкксккак сссккка-ЬдЪ оасккдадда 68340
аадккдскдк дадкаддкда кдаксаккас адкдаксаск ддккдссоаа аскдадаадс 68400
садасакккд дсккддкккс 1:01:0001:1:00 ксккдкскск сскаосскдк ааасасакас 68460
ккддкдакка сссакдддда дасаадасад дскдддаака какасккокд оаасккоадс 68520
сксскдддкк ссадсдаккс ксскдсскса дкскссадаа дадсксддак касаддкдкд 68580
сассассадд сссадскаас кккккдкакк кккадкааад акддддкккс аксакдккдд 68640
ссаддскддк сксдаасксс кдассксадд кдакскдссс кксксддсск сссдаадкдд 68700
кдддаккака ддсдкдадкс асодадсокд дссссаддса акаакакасс адкдддсаад 68760
аааакаккск кдсксксакд ддасккскдк кдддддксад ддкакаддда ддааддоака 68820
дадакдаааа ссадкааака адкаасаддд даааасаккк кааакасакк аакааскаак 68880
аааакадааа кааакскдкк ддскасккаа саддакдкдс сасаккссад акасаккасд 68940
ккааксскка кдакскккдд дддскаадка ккадкакксс аккккасдда кдаададаск 69000
даддсксада дддаадддад дкддсккккс ксаддкддаа адссадасск ккксадкддк 69060
сакксадккс акадскаадд ксккаккккс кдкдскскск дксддскдаа аакдддсаад 69120
дЕааккксас акадкдасад дадссакдкс ададааадад саддасадкд ддасададад 69180
ддассаддск дддддскдкк кдадакддад ддксаддаад аассаааска адакдкдаас 69240
адкдддаддк дккддадскд .кддкдсккдс скадааддас ссксаксдад сааакадаад 69300
сккскддсад даадаадкка акдксккдсд кдкдссскак дкаддкксак кадддссккк 69360
ааадддддаа дааддкддкд дскакааакд ккасаакскк асскккддсс сскадддакк 69420
скдкскккса ассккддккс адЕаасааск кдкдаскдоо сааоадддск косккксддд 69480
ададаакддс ккдккасакк сааакакдсс акдааадкак сасоакккак кксадкдкск 69540
дакдссссад сккдддсадс скдадсаддс кскдаакддд кскдаададд соскккадад 69600
кададакдаа дадддддкдд ддааксскса аккскаааса аададкскдс аакдддаада 69660
кддссааакд скдкккккдд адкдддкдад адддаааада ааддкакада кддкксдккд 69720
даааакдкдд ккккакассд ддккккддкд ксаддксосс дадддсааса кддаскссас 69780
аскдкдаксс кссдддсадс ксакадсссс адсссокксо ккккдскксс кддксадккк 69840
дкдадаадда ддддккдкдк скссаакскд адсаакаадд ддкскдаддд дддккддакс 69900
сакдкддскк ксскдкдкск кдккссккдк аааадкксоа ддккккдддк сдкдадскдк 69960
дкдкдкдкдк дкдсдкдкдк дкдсдскдка сдккаакакд дададакддд сккдддссад 70020
- 91 016397
ЕдддаааЕад ададасссдс аадаасадад ЕдасадддЕЕ ЕдаЕадЕаад садсаддсса 70080
дсдЕЕдсЕдс ЕЕЕЕаЕЕссЕ сддЕаааЕсс ЕЕдсасааЕд ссаЕаЕдсЕс ЕЕдсаЕЕссд 70140
ЕадсЕдсЕдс аЕадддЕдЕд аЕЕЕадЕЕаа ЕдсссдсЕсЕ дсааасадда аасддЕдсЕс 70200
асЕдсЕдЕдЕ аЕдсЕЕЕЕса ЕддадаЕааа дЕдЕсаддад саадасссса аассЕдсдаа 70260
аЕсасЕааЕд саассдсссс ссаЕдсссса аааддЕддда дЕдддддаЕа аааададЕад 70320
дааадЕддЕд Еддддадддд аадсЕЕЕадд дссаЕаасЕс адасааЕЕЕд ЕсаддсадЕд 70380
дсаЕсддЕЕд ддаддааааЕ аЕЕдаЕдЕас асЕЕЕЕЕдЕЕ ЕЕЕдаассЕд аадЕЕЕдддЕ 70440
ЕЕЕЕЕсддаЕ дсаЕЕддадд асЕЕЕЕаааЕ дЕЕЕЕсддад ЕдссададЕЕ ЕддасЕдЕЕа 70500
ддЕсассдЕа ддЕассддсЕ ЕдсаЕаЕсаЕ ЕЕсададдаа ЕаЕЕЕЕсааа асЕссаЕааа 70560
аасаЕдсддс ЕЕЕсааддсЕ ддассасЕЕд ЕЕсаддЕссЕ □сЕсссассс сссасссЕЕЕ 70620
ЕЕддсаааас саЕдсаааса ЕЕддЕаЕЕса ааааЕаЕЕЕЕ дЕЕасЕЕЕЕс ЕЕддсааадЕ 70680
дЕЕссаадаа ддааЕЕдсаа сасадЕсЕса дадЕЕаддад дсаасЕЕЕсЕ ддддаааадд 70740
сдддддЕЕдд ддаддЕЕЕдд адЕЕЕдааЕс ааааасадас ассдаадсЕЕ ЕааЕааааЕа 70800
ааЕдаадсдд адсссЕЕЕса дсЕсасддЕд дасЕдЕдЕЕд дЕдсдсдддЕ саддсЕЕЕаа 70860
сдЕдссЕадЕ ддаааЕЕдас адЕсЕдадаа сЕдддасаЕа аасаааааЕд ЕсадЕсссЕд 70920
ддадЕсЕЕдЕ ЕсасЕддаса аЕдЕсЕсааЕ ЕдЕЕссЕЕЕд дЕЕЕЕсаадд садсадддад 70980
адЕддааЕаЕ ЕаасЕдЕЕЕа сЕдсссааад сЕддсЕсдда ааЕЕдсЕЕдд адааддддад 71040
аааааадаса дааааЕсаса ЕЕЕЕЕЕаЕЕЕ адааасЕаЕЕ ааасаЕдЕса дЕаададаЕа 71100
ддаааададс адаЕЕдЕЕЕЕ сЕссЕЕааЕЕ аЕсЕдссаЕЕ сасЕЕссаЕа ЕЕЕсЕдсаЕа 71160
.ссаЕЕЕЕЕдд ддЕдЕдЕдЕд ЕдЕдааддаа садсадддЕд ЕЕЕсЕЕЕЕЕа ааЕЕЕдааЕд 71220
ЕЕадссЕЕдс аЕаЕЕдЕсад ЕЕЕЕЕааадс ЕЕдсЕддсаЕ дЕадаЕЕаЕс сдсссссддЕ 71280
ддаЕаЕдаса дЕдддсЕЕЕа ддаааддаад ЕдЕдаЕЕЕсЕ даЕаасаЕЕЕ асаЕсЕЕадс 71340
ЕдЕЕсадсдд аЕасссЕдЕЕ адЕдЕЕЕдЕЕ сЕЕсадааЕд сЕсадаЕада асаааааЕса 71400
адЕддЕЕдда аЕЕЕЕааааа асааааЕдЕа ЕЕЕддсЕсЕс саЕаааааЕд саЕЕЕадЕда 71460
Еааадддддд садсаадЕаа сЕаЕдЕсЕда дадааддааЕ Едсаддсаса даддадаЕсс 71520
адааЕЕсЕдЕ ЕсасасЕЕда аЕЕЕасЕЕда ЕЕсдадааас ааасадсааа дСсЕддЕдЕа 71580
ЕЕддссЕЕЕа ЕсЕдддсааа дЕЕсаааасЕ саасЕддЕаа ЕЕаЕдЕссЕЕ адаадссЕЕа 71640
аааддасЕдЕ дЕЕдЕЕасаа аадсадЕдас ЕдадсЕЕасЕ ЕсЕЕсаддас сдааЕдсасЕ 71700
сдадЕЕдЕЕЕ дЕЕадаЕааа сЕЕдЕЕЕЕаа ЕаааЕддддд ддЕсадддда даддЕЕЕсЕд 71760
ЕЕсЕЕддаад аЕЕсссЕдаЕ аадЕадсЕЕЕ сЕЕсЕсЕЕдд адаасЕЕсад дсЕЕЕсЕсЕс 71820
- 92 016397
саадсдаддд дЕЕЕдсаддс адсЕааадЕс адсЕЕсддсЕ ЕсЕдсЕЕссЕ дЕсадЕсадд 71880
аадЕсасЕЕс сЕЕаасссаа аЕЕасаадсЕ ададсаоаас Ессссадсса Еассдаааад 71940
адсаддЕЕЕЕ Есссадаада сЕдЕдЕЕЕсЕ адаЕдсддаа дЕдЕаааЕЕд дЕасдсЕдЕд 72000
ЕдаЕсаЕдда аЕдсссаааа ЕасаЕаддда асадЕдЕЕдЕ Еддааададд сдсЕдЕдЕсс 72060
ссааддадаа дасдссдссс адааЕддсЕд даЕсдссЕдЕ ЕдЕддсЕдад Едсдаддсад 72120
сЕдЕддсЕдд сЕдсЕдЕдЕд асдаЕдассЕ адЕадссасс саЕдЕддадЕ ссЕддсЕдсс 72180
ЕсадаасссЕ аЕсасаЕсЕа ддсааааЕсЕ ЕдсаЕЕЕЕЕЕ аЕсЕдддадд ссЕдаддасЕ 72240
ЕсадддсЕдд ЕддаЕадЕаа дсЕссЕЕддЕ ЕаЕсЕсасад аЕасаададд ЕсЕЕдддааЕ 72300
ссасдаЕсаа асЕЕдаЕдЕд ЕдсдЕЕЕасс сЕссЕсссЕЕ ЕдааЕсЕдЕЕ аЕЕсаааЕаЕ 72360
ЕЕаадссЕсс аассЕЕдЕдд ссссЕассЕд сассассссЕ сасссссссд асаааааЕса 72420
адсЕсЕЕдас сЕсаЕддсЕЕ сЕЕЕсадЕда сссЕЕддддд асадддЕЕЕс ссааддсЕдд 72480
ЕЕдссадсЕд дсаЕддЕссс ссдЕЕддЕда адЕддадасс ЕдЕдЕЕЕЕЕЕ ЕддЕсаЕЕЕЕ 72540
дсааададсЕ ЕаЕддаЕдас адсадЕЕсЕс ЕдЕдссЕсдс Едддасадад ЕдЕаЕЕсЕда 72600
ддЕссадсдЕ сЕдсаЕддад аЕсЕдссЕаЕ ссЕЕсасЕЕд дддЕдсЕсад ЕадаЕаасдс 72660
ддссасЕЕЕс сЕаЕасаЕЕЕ ссЕЕааЕЕЕа адддаасадс дЕааасЕсад сссаддЕдда 72720
ЕЕааЕсЕсЕс садЕдасЕЕЕ ЕдааасЕЕса аЕЕЕссааЕЕ ЕсссЕсЕЕаЕ дЕсЕаддЕдЕ 72780
дадЕдаддаЕ асдЕдЕадЕа аЕЕдЕсдсад дЕаЕЕадЕда дааадддЕдс адаЕсасаса 72840
ааЕаЕЕЕсас асдЕЕаЕЕад ЕЕддассада сЕЕЕддаддс аадддадддс сдЕдЕсассЕ 72900
аддаааЕЕЕд сЕсЕЕссдЕд дадаЕдааад ддсадЕдааЕ ЕаадЕдссЕд сЕЕЕЕЕсЕсс 72960
сЕЕЕЕЕсссЕ сЕдасддЕЕа ЕЕдаЕссЕсс ссЕддаасЕд ЕасадЕЕсас дЕЕсЕдаЕсЕ 73020
ЬкЕЕсЕЕдас ааадддааЕЕ сссадЕЕЕдЕ ЕсдсЕддсда асдсасЕадс аддЕдаддад 73080
ЕЕаааадЕЕд дсаасдссЕд сссЕсЕсдад адЕдЕсадда ЕЕЕЕЕадЕсЕ сЕЕссЕЕдад 73140
адсЕадаада ЕдЕЕЕсЕааа адааЕсЕсЕЕ ЕддЕдасЕЕа даадЕддада дадсЕЕЕада 73200
адсаЕддсас аааЕаааадд ааададдсаа асассдЕсаЕ ЕсЕасаЕсЕд ЕЕЕаЕЕЕЕдЕ 73260
ЕаЕЕаасааа аддсааддсд аЕЕЕЕсаЕЕа аадЕЕЕЕдсЕ ддддЕЕдддд ЕЕдадддЕдЕ 73320
адададсааа адЕдЕдадЕЕ дЕасассаЕд асЕддааЕсд сЕЕддасаЕа сЕсЕЕсадса 73380
дасаЕсдЕдЕ дасЕдЕддаа даааЕдадЕЕ ЕсаЕдаадаЕ дасЕдаЕада аддаадссас 73440
ЕдаассадЕс сЕсЕаЕсасс ЕсЕЕссаадд сЕааадЕЕЕд дадссасЕЕд садааддсЕс 73500
ЕссЕсааасс ссЕдЕдЕЕсЕ ЕЕдссЕассс сЕдсЕдЕЕдс сасаЕсаЕсЕ ЕддададсЕд 73560
- 93 016397
дсЕдаЕЕссс ЕссЕсаасЕа даадЕЕссЕа дЕдссЕдсЕЕ адЕЕсЕЕдЕс ЕсЕЕдсЕЕсс 73620
саадЕдсЕса сааааЕасаЕ ссаЕдЕЕсдс Еасдаддааа ЕддассасаЕ ааддЕЕЕссд 73680
ЕдаааассЕЕ адсссЕЕадд ЕсЕаасасад Еаддаасада адЕЕааЕдЕЕ ЕЕссЕдасдЕ 73740
адаадЕЕЕсЕ сЕЕдсЕдсЕЕ сЕддЕсасаЕ ЕЕсЕЕЕсЕЕд ЕдЕддЕЕсЕЕ сЕаЕддсЕас 73800
ЕдсасЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕсЕЕ асЕдЕсЕссс соЕЕссссса сасассассЕ ЕЕЕддддаЕа 73860
дддЕддсадд ЕдадааЕаЕа аасадаЕааЕ ддЕЕаадада ЕадЕЕЕадЕс ЕЕЕсЕаддсс 73920
адаЕЕаЕЕЕа дЕЕЕЕЕдсса ЕсЕаддЕааа аЕЕсддЕсса аЕЕаадсдЕс саЕЕаадЕдЕ 73980
ЕЕЕааЕаЕаа дсЕддадаад дадЕЕдаасс ЕддаддЕсад ддсЕсЕдЕдд ЕсЕаЕЕасад 74040
ЕсссссЕддд дЕсЕсЕадсс саадддадас ЕссадддЕсЕ ЕааЕаааЕда сЕдддддЕЕЕ 74100
саЕЕЕЕдадд ссЕЕЕасЕас сааадасЕда аЕааЕасаЕЕ дддсаЕдаЕд дЕЕЕЕдЕссЕ 74160
ааасаЕЕаас адссасаааа ддЕадададЕ дЕдЕсЕдЕЕЕ аЕадаЕасас аЕдЕаЕсаЕд 74220
ааЕааЕЕадЕ кддддаскдк дсаЕсаддЕс ЕсЕсаЕЕЕЕа саЕЕсдадда адсааЕдсас 74280
ддааЕдааЕЕ сЕддассЕдс даасЕсЕдаа ЕЕЕсааЕЕсЕ сЕдЕсЕссЕа сЕЕЕЕасЕдд 74340
адЕдсЕЕдса аасадЕасад ЕдЕЕЕЕЕдЕЕ дЕдаадЕЕаЕ ассдЕдссЕд ЕааЕсЕсЕсЕ 74400
дсдддЕддсс сЕссЕаадсс сЕасЕЕсаад аааЕадсЕсЕ аадсЕсаЕда сасссдсссс 74460
асссдаЕдсс ЕасаЕаЕдЕс ЕЕаЕаЕссЕЕ ддадЕадЕдЕ ЕЕддддЕЕдс аааЕЕЕдасЕ 74520
ЕЕадддадас аЕасЕсЕсЕд аЕдаЕаддсЕ ааЕдсЕЕаЕа ЕЕЕасЕдаЕа аасЕЕссЕЕЕ 74580
ЕЕдасддЕса ЕдддсЕЕсдд дддссассса ассааасЕдЕ дЕддсЕдсЕЕ ЕЕаЕдЕЕддд 74640
ссаааадаса ддсЕссЕЕдЕ дЕссЕсссад ЕЕЕсЕЕааас ааЕдаадЕса ЕддсаЕЕЕЕа 74700
садЕдсЕддЕ дааЕддаЕЕд адаЕЕдЕддЕ ддсссЕддаа ЕдЕддсасЕд сЕсЕддсЕдд 74760
адддаадаЕд ададЕдаддд аЕддададда даддададсд ддадаЕддда ассЕддЕдда 74820
сасаддаддд адЕдЕдадЕЕ сЕдадддсса ааддааасЕЕ дасассддаЕ дддасаЕЕаа 74880
ЕсЕдаЕЕсЕд ЕЕаЕсЕдадд сЕдЕсассад ЕссЕсссЕдЕ ссЕссЕддса 74930
<210> 2 <211> 384 <212> ϋΝΑ <213> Ното зар1епз
<400> 2
ЕЕсаддссаЕ ЕддЕдЕЕдЕа ЕаЕаЕЕЕсаа даЕЕЕдсЕса саддЕссааа дсЕЕаасЕЕа 60
адсЕсссЕда дасаЕаЕсаЕ ааааЕаЕдаЕ ЕЕддддаааа. асссЕааЕдд дссаЕдаЕса 120
даасаЕЕаЕЕ аЕЕсаасааа ддаЕдаааЕд сЕЕаадссаа даЕддссЕЕс ЕЕЕсЕЕЕсЕЕ 180
- 94 016397
ЕсЕЕЕсЕЕЕс ЕЕЕЕЕЕЕЕЕа аЕдааадЕЕд адсадасЕсс сдЕссаасад ЕЕЕЕсааЕдЕ 240
аддааЕЕссс асадссссаЕ ЕЕдаЕЕдсад ЕЕЕдЕЕдааа адЕЕЕааЕдЕ ЕЕЕЕдЕаддс 300
ааЕЕсаЕааЕ ЕЕссасаЕЕд аасадссЕда даддаадада дсЕддадссс асЕдЕЕдЕЕЕ 360
ЕЕдЕадЕддд аЕддЕдддаа сЕЕЕ 384
<210> 3 <211> 20 <212> ОНА <213> Ното зарЕепз
<400> 3 ЕЕсаддссаЕ ЕддЕдЕЕдЕа 20
<210> 4 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> Ното зархепз
л ааадЕЕссса ссаЕсссасЕ 20
<210> 5 <211> 366 <212> ϋΝΑ <213> Ното зарЕепз •
<400> 5 ' ЕЕдЕсссЕЕд аддЕдЕасЕд дааасЕаадд сдЕдадддас ЕсаЕаддддЕ сЕддсЕЕдда 60
аадЕдЕаЕЕд сЕаЕдЕссад ЕЕЕасасаЕа аддаЕдЕдса ааЕссадсад дЕЕадсЕдад 120
сЕдсссадда аЕаЕссаддс аадааЕкасс аЕаЕЕсЕдаЕ ааЕЕасЕсад дссЕсЕдссЕ 180
саЕсЕссдсЕ дсссссссдс ссссЕдасЕс ЕсЕЕсЕдадЕ дссадаЕЕса дссЕссаЕЕЕ 240
дааЕдссааа Еадасаддаа аЕЕадсаЕдс ссадааЕсса сдЕсЕЕЕадЕ дсасЕсЕсЕс 300
ссоадсЕсса аассЕдЕЕас ЕдсЕЕдЕдЕЕ саасаЕсЕса дЕааадсЕса асаасаЕсда 360
сссаЕЕ 366
<210> 6 <211> 21 <212> ΟΝΑ <213> Ното зар1епз
<400> 6 ЕЕдЕсссЕЕд аддЕдЕасЕд 9 21
<210> 7 <211> 20
- 95 016397 <212> ША <213> Ното зархепз <400>7 ааБдддБсда БдЫзд-Ыздад . .20 <210> 8 <211>558 <212> ЖА <213> Ното зархепз <400> 8
дсБдЪдаааЕ ссссБдБдЕа дЕдддаадаа даааЬадсаа аЕсБЪадскд ссББддассЪ 60
даЪаБааБЪа ЬБЬдБсББса ЕЕЪасаБддБ БуаБссБЪса аддЬБдааЪа ааБдаЪдЪдд 120
дадсБадБса а9999сБББа ддЪаБдБдаЪ ББсаБдссБа сББЪЪББЪБа ддБададааа 180
сБдаддЪсас адддБасБад адааБддасБ сБаадаБЬса ддЪБЕсБдаа ББдееБдБдд 240
БЪЬЬдББдас ЪсаасЕдсБс ЕЪсЬдББдББ БЪЪБадссас аЬдссББдаа асадЪссБсЪ 300
ЪБсссакдЪБ БсЪЬсаБсад сассаЪБаас ссааддЪаБа сБдБссксЪс ЬБаБсББЪса 360
сааддЪсББд дадББсссаЪ дссБЪБдБаа дсаЬсссБсс ссдадаБЪса дсассаасса 420
аааБсасаББ БддаааааББ дсБЬдЪББсс саадаадсЕЪ ЪддаддаЪаЪ даБББЪдЪаБ 480
адаасдддББ сасаддБББЕ сБдБЪсаББс ББсЬаБддБд дадЪдБдБдБ дБаБдБдасЬ 540
сЬдксЪБсБс ЪссаЕБсс 558
<210> 9.
<211> 21 <212> ΟΝΑ.
<213> Ното зархепз <40Ο>9 дсЬд+даааБ ссссЬдБдЕа д21 <210> 10 <211>23 <212> ΡΝΑ <213> Ното зархепз <400>10 ддааБддада даадасадад Беа23 <210> 11 <211>364 <212> ΡΝΑ <213> Ното зар1епз <400> 11' аадддадааа дсаддаББда дсадддддад ссдБсадаЪд дБаабдсада БдБдаБдада 60
- 96 016397
РсРсРдссдд ассааадада адаРРссРРР ЪРаааРддРд асаааРРсаР дддсРРРсРс 120
РдссРсаааа ссРадсасад сРдРРаРЕРа сРдаасааРР адададсРаа дсасРРРРРа 180
даРауРаРаР ааРРРааРРд ссдРаРдадд сасссРРадР РРРсадасда дааассасад 240
РРасадддаа ддсаадраас РРадРсааРд РсадаРаасР аддааааддР Рададдддсс 300
сРддасасад дссрдрдрда сРдадаадсР РдддсасРРс асРдсРасаР РРсаРсРсРР 360
сдсР 364 <210> 12 <211> 20 <212> ΡΝΑ <213> Ното зархелз
<400> 12
аадддадааа дсаддаРРда 20
<210> 13
<211> 22
<212> ΏΝΑ
<213> Ното зар±епз
<400> 13
адсдаадада РдаааРдРад са 22
<210> 14 <211> 579 <212> ϋΝΑ <213> Ното зар1епз
<400> 14 сРдаРдаддд РадддадсаР срдрордсад сРРсаРсРРс аРРдРсРадд ддсРссадаа 60
аРаРсРдРда дРаааРаадР РаРРРааРсР РРдссРсааа РРРссадРда □РдРадддаР 120
аРадсРдРда дссРсРадда дсРдадаРРР РРРаааРРРс ссасРРааас аРРРаРРРаа 180
аааРРРРдРд сРсадсаРдд асРааддасР РРасаРРсаР РаасРсаРРР асадсРРдаР 240
ссРаРдсддР дддсаРРсаР РРасададда РсссаРРРРа саддрдадда ададдссадс 300
РаддддРдса дссРаддРРа дРарРсРада дсРсаРсадд сРдРдРРдРс сссадрдааа 360
даараадсаа адаадРдааР дРРдРдсаЕЕ дадааааард асРсРсддад даддаРдадс 420
сРсРсддаРа Рддсдассда адРдаРиРдд ддсссРРдРс аадддРсРсР аРРаРддсаР 480
саадаааада РдсРдсРРРс ддрдаРдссс даддададсс РсааРаРРРР асаРдддааа 540
ссЕаааааад дддссаРдРР дРддРсРсЕд сассРаада 579
- 97 016397
ЕаЕЕЕадааа соаЕааааЕс сассЕаЕЕЕд аддЕдЕасаа ЕЕдадЕдаЕЕ ЕЕсЕдЕаЕад 60
ЕсасадаЕсЕ дЕдсадЕсаЕ ссасасссЕс ЕаасЕссадд асаЕЕЕЕссЕ сасссссдад 120
дадааассЕс ссЕЕасссаЕ ЕадсадЕсаа ЕссЕсаЕЕЕс сЕсЕсссссс адссссЕддс 180
ааЕсасЕдЕд даЕЕЕдссЕд ЕЕсЕЕдасаЕ ЕЕсаЕаЕааа ЕддЕаЕсаЕа аааЕсЕаудд 240
дсЕЕЕЕдЕдЕ сЕдЕсЕдсЕЕ ЕсасЕЕадса ЕасддЕЕсЕс ааддЕЕсаЕс садЕаЕЕдЕа 300
дсаЕсЕаЕса дЕаЕдЕсаЕЕ ссЕЕЕЕЕаЕд дссаааЕааЕ аЕЕЕЕаЕЕдЕ аЕддаЕадас 360
аЕЕЕЕдЕЕЕа ЕЕсаЕЕЕаЕс ЕдЕЕЕЕЕддЕ ЕаЕЕаЕдадЕ аасасЕасЕа ЕдаасаЕЕЕЕ 420
дсасаааЕЕЕ ЕЕдЕаЕЕдас аЕдЕЕЕЕсаЕ ЕЕсЕссЕддд ЕаЕадЕссЕа ЕдадЕддааЕ 480
ЕдсЕдд 486
<210> <211> <212> <213> 19 22 ША Ното зар1епз
<400> 19
- 98 016397 <210> 20 <211>428 <212> ϋΝΑ <213> Ното зар!епз <400> 20
ббдбсбссбб ббдбббсбдс басбдбдааб дабссбдбда бдабсабсбб бдбдбдбааа 60
бсбббдбссс сбсдсссссб ссссбЪббаб баббббсббд ддабадассс саддасаааа 120
ддбадаааад аасааадбдб бааааааббб сббдабасаЬ адссасадаб баббббссбд 180
ааадббсбса асабббабаа сбасзадсад бабдбаадад адббабддбб ддаабдаббб 240
баабдбсбсб ддддааббЪа асаасааааа аасбббаддс ббсбббддад ададасабдс ' 300
ссббаасбсс ассссдсссб адаасадада сссадсссаб ссаадбсадс сбссссаддб 360
ссбссассбб саааасаддс ааасдааабс абббсббдаа бааббддбад дсббсааддб 420
садабдбб 428
<210> 21 <211>23 <212> ϋΝΑ <213> Ното зархепз <400> 21
ббдбсбссбб ббдбббсбдс бас 23
<210> 22 <211> 22 <212> ϋΝΑ <213> Ното зарЬепз <400> 22 аасабсбдас сббдаадссб ас 22
<210>23 <211>330 <212> ϋΝΑ <213> Ното зарбепз <400>23
Ъсадддасад бдсабаддбд бааадаадбб дсбддббддд ддбЪсбаабд саддбббсбс60 саааадбдаа бдсссбдбба аааааааабб сббаасаааб абасададаб бббббббЪба120 ааааадбдбд асадббсбад асассбадад адбааагбда адаадссбдб бббсаддббб180 сссдссбссс бдаабббссс адсабддбсс аддсбббдаа аббЪабббаб сбдоЬбббдд240 саабддббда бдддаабббс ссасабббаб бббббадсба сададааадд асаббабсбб300
- 99 016397
ЕааааЕсЕсЕ ЕсдЕЕдЕЕсЕ сЕсЕсЕЕЕда <210>24 <211> 20 <212> ΟΝΆ <213> Ното зараепз <400> 24.
Есадддасад ЕдоаЕаддЕд <210>25 <211>23 <212> ϋΝΑ <213> Ното зар1епз <400>25
Есааададад адаасаасда ада
330 <210> 26 <211>574 <212> ϋΝΑ <213> Ното зараепз <400> 26
ЕаЕЕЕадааа ссаЕааааЕс сассЕаЕЕЕд аддЕдЕасаа ЕЕдадЕдаЕЕ ЕЕсЕдЕаЕад 60
ЕсасадаЕсЕ дЕдсадЕсаЕ с-сасасссЕс ЕаасЕссадд асаЕЕЕЕссЕ сасссссдад 120
дадааассЕс ссЕЕасссаЕ ЕадсадЕсас ЕссЕсаЕЕЕс сЕсЕсссссс адссссЕддс 180
ааЕсасЕдЕд даЕЕЕдссЕд ЕЕсЕЕдасаЕ ЕЕсаЕаЕааа уддЕаЕсаЕа аааЕсЕаЕдд 240
дсЕЕЕЕдЕдЕ сЕдЕсЕдсЕЕ ЕсасЕЕадса ЕасддЕЕсЕс ааддЕЕсаЕс садЕаЕЕдЕа 300
дсаЕсЕаЕса дЕаЕдЕсаЕЕ ссЕЕЕЕЕаЕд дссаааЕааЕ аЕЕЕЕаЕЕдЕ аЕддаЕадас 360
аЕЕЕЕдЕЕЕа ЕЕсаЕЕЕаЕс ЕдЕЕЕЕЕддЕ ЕаЕЕаЕдадЕ аасасЕасЕа ЕдаасаЕЕЕЕ 420
дсасаааЕЕЕ ЕЕдЕаЕЕдас аЕдЕЕЕЕсаЕ ЕЕсЕссЕддд ЕаЕадЕссЕа ЕдадЕддааЕ 480
ЕдсЕдддЕса ЕаЕааЕаааЕ аасЕдЕЕЕаа саЕЕЕЕдддд адсЕдссааа сЕЕЕЕаааас 540
сЕЕдддЕЕсЕ дЕдаЕдЕасс адЕЕдЕдЕЕа ддса 574
<210>27 <211>27 <212> ϋΝΑ <213> Ното зар1епз <400>27
ЕаЕЕЕадааа ссаЕааааЕс сассЕаЕ27 <210> 28 <211> 22
- 100 016397 <212> ϋΝΑ <213> Ното зар!епз' <400>28
ЕдссЕаасас аасЕддЕаса Ес22
<210> <211> <212>. <213> 29 571 ΩΝΑ Ното зархепз
<400> 29
ЕдссаддддЕ ЕЕЕаЕддЕЕа аЕЕЕЕссЕсс аЕЕаЕдаддд ЕЕдасЕсадс сЕЕдддЕаЕЕ 60
адаЕдЕсЕЕЕ дадааЕссад ддЕЕсаааЕа ссасадсЕдд ЕадааЕдЕЕЕ сЕсаасЕЕдд 120
адссааЕсЕс саЕсЕасЕда аддЕасдсЕд дЕЕЕадасад асаасаддда саЕсадсаЕЕ 180
ЕЕааааадсд дЕддааааад ЕЕЕдсЕЕдЕс ЕЕдаЕЕддад ссаЕдасаЕЕ ЕЕаЕЕЕЕдаа 240
аЕЕЕсаааЕа асаЕдааддд аддЕЕЕддад сддЕЕЕЕЕдд ЕЕЕаЕссааа дддсадЕдда 300
ЕЕдааддсЕд адааасасса ддсЕдааЕдд дададдддЕЕ ддддЕссссс ЕдЕдадаЕад 360
ЕдааасааЕд дЕадЕдссаЕ ссааЕдаЕад дсасЕЕЕЕсЕ дЕсаЕЕсада адсадааадд 420
дддссададд сссаЕЕддсс ЕЕасЕдддта дЕаадсЕдЕа дадсЕдсЕдс сЕЕЕЕсдЕда 480
аадддЕЕдас ассаассЕЕс Есссссадда ададЕдасса дддассЕдад дддсаЕддЕс 540
дадсадаЕда садссЕЕЕдЕ аааасаЕсЕс с 571
<210>30 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> Ното зархепз <400>30
ЕдссаддддЕ ЕЕЕаЕддЕЕа
<210> <211> <212> <213> 31 23 ΕΝΑ Ното зархепз
<400> 31· ддадаЕдЕЕЕ ЕасаааддсЕ дЕс23
<210> <211> <212> <213> 32 614 ϋΝΑ Ното зархепз ,
<400>32
ЕЕддЕадада ЕддддЕсЕсс ЕаддсЕддЕс ЕЕдаасЕссЕ ддгсЕсаадс ааЕсЕЕссЕд 60
- 101 016397
ссЕсадссЕЕ ссааадЕасЕ дддаЕЕасЕд дсдЕдддсса ссаЕдссЕдд сЕЕдаааЕЕЕ 120
ЕЕсЕаЕддсЕ ЕЕаЕЕсЕЕЕс ЕссаадЕаса дадЕсЕассс аассЕЕсЕда даЕсЕЕЕддЕ 180
ЕЕЕсЕЕЕЕсс ЕаддЕаасЕа ЕадЕасаЕас ЕЕаЕЕЕаЕдЕ Еааасаасад сааЕсасаса 240
ЕЕЕсЕЕЕЕЕс ЕаЕасадЕса ЕдсЕЕЕаЕад дсаааЕааад □сЕссдЕсЕЕ аддсЕЕЕсЕд 300
даЕЕЕЕЕЕса ааадаЕдсаа ЕЕссЕддадЕ аЕдЕЕЕЕЕас ЕЕададсааа дсадссЕадЕ 360
сЕссЕаЕасс ЕЕсЕдсаЕсЕ дсадаааадЕ ЕддЕЕаааса дасЕЕЕдЕаа ЕдаЕдссссЕ 420
ЕасааЕЕсЕд аадддасЕЕд ЕдаааЕадЕЕ ЕсасададЕЕ ЕсадЕдЕЕад дЕаЕаЕЕЕда 480
ЕсааЕдсЕаа сЕЕЕЕддааа асЕЕЕддЕдс сЕдЕаЕдаЕЕ сададддЕад ддсадааЕаЕ 540
ЕаааЕЕааЕс асаасЕЕсЕЕ дЕаЕЕЕЕаас саЕЕсЕдддЕ аааЕЕдддаЕ ЕссдЕдасдс 600
ссаддсаааа ЕЕаЕ 614
<210>33 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> Ното зархепз <400> 33
ЕЕддЕадада ЕддддЕсЕсс 20
<210> 34
<211> 20
<212> ϋΝΑ
<213> Ното зарбепз
<400> 34
аЕааЕЕЕЕдс сЕдддсдЕса 20
<210>35 <211>633 <212> ϋΝΑ <213> Ното зархепз <400>35
ЕаЕсЕЕаЪаЕ ссссЕссаад саЕЕсаккаа сЕдаЕддаЕЕ адЕдадЕЕдд ссЕЕдадаад60 саЕаааддсЕ сдЕсЕссаЕд ЕдсЕЕсЕаад саЕЕдЕдЕсЕ аадЕЕсЕдЕЕ ЕддЕЕЕссЕд120 адЕдааасЕд ЕсЕЕааЕдЕЕ ассаасадаа дЕЕаааЕдсс ЕаададиЕЕс ЕЕаЕасаЕдд180 дсЕдадЕасс ЕсЕдЕдасЕд ддсаадссас сЕсассЕсаЕ ЕЕЕассЕЕдЕ сЕдсаааакд240 аддаасЕддд ЕсаасЕсаЕс дЕЕсаааЕсЕ сасЕдааадс ЕааЕЕдаЕсд сЕЕЕЕдасад300 аадЕадсЕсс сЕЕдддссдЕ аЕаЕЕЕаЕЕЕ ссЕадсЕЕдд аддааддЕдд ддасадасад360 ааЕЕдаЕдЕа сассЕЕЕаЕЕ ЕЕЕаЕсЕсЕа ЕддЕааассЕ дЕдсаЕасЕа аадсаЕЕссЕ420
- 102 016397
сЕддЕсЕЕЕЕ дадаЕдадЕд ЕаЕасаЕЕдЕ дЕсЕддсссЕ дЕдсаЕЕЕЕЕ Еассаадаад 480
ЕаадЕЕЕЕдЕ ЕдадЕааасЕ ЕдддЕЕдЕаЕ даадаасЕдс аЕдсЕсассд ЕасЕсаадЕа 540
дсЕЕЕЕдсЕа ссЕаааддас адсЕдсЕсаЕ аЕдЕасЕЕда сЕЕссЕЕЕаа адЕдааддаЕ 600
даЕдасаЕЕЕ дааааасдда ддЕЕдаааад дад 633
<210>36 <211> 25.
<212> ОНА <213> Ното зарЕепз <400>36
ЕаЕсЕЕаЕаЕ ссссЕссаад саЕЕс25 <210>37 <211> 21 <212> ЭМА <213> Ното зар1епз <400>37 сЕссЕЕЕЕса ассЕссдЕЕЕ Е <210>38 <211> 1081 <212> ϋΝΑ <213> Ното зарЕепз <400> 38
ЕЕдадсаЕдЕ дЕЕаЕЕЕааЕ дадЕЕаЕасс ЕсЕдЕсаЕаЕ дЕдЕдЕдЕЕЕ аЕаЕсасааа 60
аЕаасЕЕаЕЕ ЕЕЕаЕаааас саЕаЕЕЕЕда дЕсаЕсаЕЕЕ дЕдасааЕдЕ сЕЕсЕЕЕЕсЕ 120
сЕддЕаЕааа ЕдаддсаЕдЕ адааадаада ЕЕдасаЕЕЕд сЕадаадсЕЕ ссссЕЕЕссЕ 180
сЕаасЕссас ааЕааааЕдд аЕдсЕсаЕаа ЕЕасаЕсЕдс ЕссЕаЕаадд ЕсаадаЕЕЕс 240
адддсЕддаа дЕдассЕЕад аЕсаЕЕЕадд оссаасЕЕдс осЕсаддааа ддааасЕдад 300
дсссададаЕ дссЕЕаадЕд ааЕЕдсссаа ЕдЕсасасдс ЕдадЕсадЕд дссададсаа 360
ддсЕЕддаЕс садЕЕсЕсЕд сЕсссЕЕЕсо ададссЕЕдЕ даЕдЕсЕЕсЕ сЕссЕасадд 420
аддЕдааааЕ аасЕдсЕдЕд дсЕддЕЕсЕд ЕЕЕЕдсЕдас ЕдЕаааЕЕдд дЕсаЕддЕса 480
дддасадЕдс аЕаддЕдЕаа адаадЕЕдсЕ ддЕЕдддддЕ ЕсЕааЕдсад дЕЕЕсЕссаа 540
аадЕдааЕдс ссЕдЕЕаааа аааааЕЕсЕЕ ааоаааЕаЕа сададаЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕиаааа 600
аадЕдЕдаса дЕЕсЕадаса ссЕадададЕ ааадЕдаада адссЕдЕЕЕЕ саддЕЕЕссс 660
дссЕсссЕда аЕЕЕсссадс аЕддЕссадд сЕЕЕдаааЕЕ ЕаЕЕЕаЕсЕд сЕЕЕЕддсаа 720
ЕддЕЕдаЕдд дааЕЕЕссса оаЕЕЕаЕЕЕЕ ЕЕадсЕасад адаааддаса ЕЕаЕсЕЕЕаа 780
- 103 016397
ааЕсЕсЕЕсд ЕЕдЕЕсЕсЕс ЕсЕЕЕдадЕд аддададаад аЕдЕдааЕсс ЕддсадЕддЕ 840
ЕсададЕдда сасадссссЕ дЕдЕЕЕдЕдд саЕаддсЕсЕ дЕдддсссса Едссадддад 900
садЕассссс дЕдЕааадда дЕдддддЕЕЕ дЕсоаЕЕЕдд аЕададсааа даЕссЕооас 960
сЕсаааЕссс асаадаасад ЕЕдссасаас сЕдддсссЕа адсаЕсЕсаЕ ЕЕЕссЕаЕдЕ 1020
адаааЕЕааЕ даЕсЕддадд адаЕддсааа асаЕЕссЕЕс сададссЕдЕ дЕддаЕЕЕЕд 1080
д 1081 <210> ЗЭ <211> 26 <212> ΏΝΑ <213> Ното зархепз
<400> 39 ЕЕдадсаЕдЕ дЕЕаЕЕЕааЕ дадЕЕа 26
<210> 40
<211> 20
<212> ϋΝΑ
<213> Ното зарЕепз
<400> 40
ссааааЕсса сасаддсЕсЕ 2.0
<210> 41
<211> 599
<212> ЙЫА
<213> Ното зархепз
<400> 41
ЕадЕдсЕсад ЕаЕЕЕссаас дЕЕсЕдЕЕЕа ЕЕЕаадаЕда аааЕЕдсЕдЕ адЕЕааЕаад 60
сасЕЕсссса ЕдЕсаЕЕааа аЕдсЕЕаадд аЕЕЕЕЕааЕд ассасаЕаас адЕссаЕааЕ 120
аЕдаЕЕааас сссааЕЕЕас ЕдааЕсааЕд ссаЕаЕЕдЕЕ дддЕсЕЕЕад аЕЕдЕсЕсоЕ 180
ЕЕЕдЕЕЕсЕд сЕасЕдЕдаа ЕдаЕссЕдЕд аЕдаЕсаЕсЕ ЕЕдЕдЕдЕаа аЕсЕЕЕдЕсс 240
ссЕсдссссс ЕссосЕЕЕЕа ЕЕаЕЕЕЕсЕЕ дддаЕадасс ссаддасааа аддЕадаааа 300
даасааадЕд ЕЕааатааЕЕ ЕсЕЕдаЕаса Еадсоаоада ЕЕаЕЕЕЕссЕ дааадЕЕсЕс 360
аасаЕЕЕаЕа асЕасдадса дЕаЕдЕаада дадЕЕаЕддЕ ЕддааЕдаЕЕ ЕЕааЕдЕсЕс 420
кддддааЕЕЕ аасаасаааа ааасЕЕЕадд сЕЕсЕЕЕдда дададасаЕд сссЕЕаасЕс 480
сассссдссс Еадаасадад асссадссса ЕссаадЕсад ссЕсоссадд ЕссЕссассЕ 540
Есааааоадд сааасдаааЕ саЕЕЕсЕЕда аЕааЕЕддЕа ддсЕЕсаадд ЕсадаЕдЕЕ 599
- 104 016397
<210> 42
<211> 25
<212> ϋΝΑ
<213> Ното зараепз ·
<400> 42 .
ЕадЕдсЕсад ЕаЕЕЕссаас дЕЕсЕ 25
<210> 43
<211> 23
<212> ϋΝΑ
<213> Ното зараепз
<400> 43
аасаЕсЕдас сЕЕдаадссЕ асе 23
<210>44 <211>599 <212> ϋΝΆ <213> Нолю зараапз
ЕадЕдсЕсад ЕакЕЕссаас дЕЕсЕдЕЕЕа ЕЕЕаадаЕда аааЕЕдсЕдЕ адЕЕааЕаад 60
сасЕЕсссса ЕдЕсаЕЕааа аЕдсЕЕаадд аЕЕЕЕЕааЕд ассасаЕаас адЕссаЕааЕ 120
аЕдаЕЕааас сссааЕЕЕас ЕдааЕсааЕд ссаЕаЕЕдЕЕ дддЕсЕЕЕад аЕЕдЕсЕсоЕ 180
ЕЕЕдЕЕЕсЕд сЕасЕдЕдаа ЕдаЕссЕдЕд аЕдаЕсаЕсЕ’ ЕЕдЕдЕдЕаа аЕсЕЕЕдЕсс 240
ссЕсдссссс ЕссссЕЕЕЕа ЕЕаЕЕЕЕсЕЕ дддаЕадасс ссаддасааа аддЕадаааа 300
даасааадЕд ЕЕааааааЕЕ ЕсЕЕдаЕаса Еадссасада ЕЕаЕЕЕЕссЕ дааадЕЕсЕз 360
аасаЕЕЕаЕа асЕасдадса дЕаЕдЕаада дадЕЕаЕддЕ ЕддааЕдаЕЕ ЕЕааЕдЕсЕс 420
ЕддддааЕкЕ аасаасаааа ааасЕЕЕадд сЕЕсЕЕЕдда дададасаЕд сссЕЕаасЕс 480
сассссдссс Еадаасадад асссадссса ЕссаадЕоад ссЕссссадд ЕссЕссассЕ 540
Есаааасадд сааасдаааЕ саЕЕЕсЕЕда аЕааЕЕддЕа ддсЕЕсаадд ЕсадаЕдЕЕ 599
<210>45 <211>641 <212> ϋΝΑ <213> Ното зараепз
<400> 45 ЕдсЕаЕдЕсс адЕЕЕасаса ЕааддаЕдЕд саааЕссадс аддЕЕадсЕд адсЕдсссад 60
дааЕаЕссад дсаадааЕда ссаЕаЕЕсЕд аЕааЕЕасЕс аддссЕсЕдс сЕсаЕсЕссд 120
сЕдзсссссс дсссссЕдас ЕсЕсЕЕсЕда дЕдссадаЕЕ садссЕссаЕ ЕЕдааЕдсса 180
ааЕадасадд аааЕЕадсаЕ доссадааЕс сасдЕсЕЕЕа дЕдсасЕсЕс ЕссссадсЕс 240
- 105 016397
сааассЕдЕЕ асЕдсЕЕдЕд ЕЕсаасаЕсЕ садЕааадсЕ саасаасаЕс дасссаЕЕас 300
ЕЕаддссЕса аассЕЕдддЕ ддсаЕсдЕсд аЕЕдсЕсЕЕЕ ЕсЕЕЕсаЕас сссасаЕЕса 360
асссаЕсадс ссаЕсссаса ддсссаадЕд ЕдЕссЕсЕсЕ ассЕЕсааад сдЕдЕдЕддс 420
аЕссассдсЕ ЕаЕсассасс ЕсЕдссаЕЕа ссасЕддадЕ ссадЕдссаЕ саЕсЕсЕсас 480
ЕЕддаЕдЕдд ссададЕдЕс ЕЕЕдсЕддЕс ЕссЕЕсЕЕдс ЕЕссЕассЕЕ ЕдЕаасадсс 540
ЕаЕсаЕсЕаЕ сЕсЕддЕсЕс саЕадсЕсас ЕсссаЕасЕЕ Едададддсс ЕЕЕдааадсс 600
ЕЕадасадаЕ саЕаЕсасад ассЕсЕаЕас ЕдааадЕсдд д 641
<210>46 <211>25 <212> ΟΝΑ <213> Ното зар!епз <400>46
ЕдсЕаЕдЕсс адЕЕЕасаса Еаадд .25 <210>47 <211>24 <212> ϋΝΑ <213> Ното зархепз <400>47 сссдасЕЕЕс адЕаЕададд ЕсЕд24 <210>48 <211>284 <212> ϋΝΑ <213> Ното зар1епз <400> 48
ссаЕсЕдЕдд адсададЕса сЕдаааддаа аЕасЕддааа ЕасЕддаадс сасЕЕддЕдЕ 60
ЕЕЕаЕсаадд аЕдЕдаддЕЕ ЕссЕддсаас ЕЕЕдЕсдсса ЕаЕсаЕсаЕс аЕсаЕсасса 120
ЕсаЕсаЕсаЕ саЕсаЕсаЕс аЕсаЕсаЕса ЕсаЕсаЕсаЕ саЕсаЕсЕдс ссЕЕЕаадЕЕ 180
ЕЕсЕдсЕЕдЕ ЕЕадаааада ааЕЕЕаЕаса дадсссссад ЕадсадсЕдЕ аадддддсад 240
дЕЕсЕЕддад садсссаЕсс ЕсаасаЕЕсЕ ЕдсЕдсЕдаЕ ддаа 284
<210>49 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> Ното зархепз <400>49 ссаЕсЕдЕдд адсададЕса20 <210>50 <211> 20 <212> ΟΝΑ <213> Ното зархепз <400>50
ЕЕссаЕсадс адсаадааЕд20 <210>51 <211>145 <212> ΏΝΑ <213> Ното зар!епз <400>51
Ессасдсада даддаЕсЕаа аЕсЕддсЕсЕ ЕЕдсааЕЕдс сЕЕсаЕасаЕ дЕдсаЕасаа 60 ассасасаса сасасасаса сасасасаса сасасасаса садасасаЕа саЕаЕдсаса 120 сассссдасЕ сааЕддадда сссЕс145 <210>52 <211> 21 <212> ϋΝΑ <213> Ното зарФепз <400>52
Ессасдсада даддаЕсЕаа а .21 <210> 53' <211> 20 <212> ΟΝΑ <213> Ното заркепз <400>53 дадддЕссЕс саЕЕдадЕсд20
- 106 016397

Claims (22)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ диагностики восприимчивости к диабету II типа у индивидуума, включающий анализ образца нуклеиновой кислоты, полученного из индивидуума, на маркер или гаплотип в ЬИ блоке экзона 4 ТСЕ7Б2, между маркерами гк4074720 и гк7087006 или с сильным нарушением равновесия сцепления с ЬИ блоком экзона 4 ТСЕ7Б2, характеризующимся численным значением г2 более чем 0,2, где присутствие маркера или гаплотипа является индикатором восприимчивости к диабету II типа.
  2. 2. Способ по п.1, где маркер или гаплотип включает по меньшей мере один маркер, выбранный из маркеров, перечисленных в табл. 6, или по меньшей мере один маркер с сильным нарушением равновесия сцепления по меньшей мере с одним маркером, перечисленным в табл. 6, характеризующимся численным значением г2 более чем 0,2.
  3. 3. Способ по п.2, где маркер или гаплотип включает по меньшей мере один маркер, выбранный из маркеров, перечисленных в табл. 6.
  4. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где маркер или гаплотип являются маркером.
  5. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где маркер или гаплотип являются индикатором повышенной восприимчивости к диабету II типа.
  6. 6. Способ по п.5, где повышенная восприимчивость характеризуется относительным риском по меньшей мере 1,2, включая относительный риск по меньшей мере 1,3 и относительный риск по меньшей мере 1,4.
  7. 7. Способ по любому из пп.1-4, где маркер или гаплотип являются индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа.
  8. 8. Способ по п.6, где пониженная восприимчивость характеризуется относительным риском менее чем 0,8, включая относительный риск менее чем 0,7.
  9. 9. Способ по любому из пп.4-6, где маркер выбирают из группы, состоящей из ΌΟ108478, ГК12255372, гк7895340, гк11196205, гк7901695, гк7903146, гк12243326 и гк4506565, и где присутствие не-0 аллеля в ΌΟ108478; Т аллеля в гк12255372; А аллеля в гк7895340; С аллеля в гк11196205; С аллеля в гк7901695; Т аллеля в гк7903146; С аллеля в гк12243326 или Т аллеля в гк4506565 является индикатором повышенной восприимчивости к диабету II типа.
  10. 10. Способ по п.9, где маркером является гк7903146 и где присутствие Т аллеля в гк7903146 является индикатором повышенной восприимчивости к диабету II типа.
  11. 11. Способ по п.7 или 8, где маркер выбирают из группы, состоящей из ΌΟ108478, гк12255372, гк7895340, гк11196205, гк7901695, гк7903146, гк12243326 и гк4506565, и где присутствие 0 аллеля в ΌΟ108478; О аллеля в 8ΝΡ гк12255372; О аллеля в гк7895340; О аллеля в гк11196205; Т аллеля в гк7901695; С аллеля в гк7903146; Т аллеля в гк12243326 или А аллеля в гк4506565 является индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа.
  12. 12. Способ по п.11, где маркером является гк7903146 и где присутствие С аллеля в гк7903146 является индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа.
  13. 13. Набор для анализа образца из индивидуума для обнаружения восприимчивости к диабету II типа, где набор включает один или более реагентов для обнаружения одного или более маркеров в ЬИ блоке экзона 4 ТСЕ7Б2, между маркерами гк4074720 и гк 7087006 или с сильным нарушением равновесия сцепления с ЬИ блоком экзона 4 ТСЕ7Б2, характеризующимся численным значением г2 более чем 0,2.
  14. 14. Набор по п.13, где один или более маркеров выбраны из маркеров, перечисленных в табл. 6.
  15. 15. Набор реактивов по п.14, где один или более маркеров выбраны из группы, состоящей из ΌΟ108478, ГК112255372, гк7895340, гк11196205, гк7901695, гк7903146, гк12243326 и гк4506565.
  16. 16. Набор по любому из пп.13-15, где один или более маркеров являются маркером гк7903146.
  17. 17. Набор реактивов по п.16, где маркером является С аллель в гк7903146.
  18. 18. Набор по любому из пп.13-17, где один или более реагентов включает по меньшей мере одну прилегающую нуклеотидную последовательность, которая полностью комплементарна области, включающей один или более маркеров.
  19. 19. Способ оценки индивидуума на вероятность ответа на терапевтический агент ТСЕ7Б2, включающий детекцию маркера в ЬИ блоке экзона 4 ТСЕ7Б2, между маркерами гк4074720 и гк7087006 или с сильным нарушением равновесия сцепления с ЬИ блоком экзона 4 ТСЕ7Б2, характеризующимся численным значением г2 более чем 0,2.
  20. 20. Способ по п.19, где маркер выбирают из группы, состоящей из ΌΟ108478, гк 12255372, гк7895340, гк11196205, гк7901695, гк7903146, гк12243326 и гк4506565.
  21. 21. Способ по п.20, где маркер является маркером гк7903146 и где присутствие Т аллеля в гк7903146 является индикатором вероятности позитивного ответа на терапевтический агент ТСЕ7Б2.
  22. 22. Способ по любому из пп.19-21, где терапевтический агент ТСЕ7Б2 является агентом, выбранным из группы, приведенной в таблице агентов.
EA200800087A 2005-06-20 2006-06-16 Генетические варианты гена tcf7l2 как диагностические маркеры риска возникновения сахарного диабета ii типа EA016397B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69217405P 2005-06-20 2005-06-20
US75715506P 2006-01-06 2006-01-06
PCT/IS2006/000014 WO2006137085A1 (en) 2005-06-20 2006-06-16 Genetic variants in the tcf7l2 gene as diagnostic markers for risk of type 2 diabetes mellitus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200800087A1 EA200800087A1 (ru) 2008-06-30
EA016397B1 true EA016397B1 (ru) 2012-04-30

Family

ID=37036993

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800087A EA016397B1 (ru) 2005-06-20 2006-06-16 Генетические варианты гена tcf7l2 как диагностические маркеры риска возникновения сахарного диабета ii типа

Country Status (14)

Country Link
US (3) US7585630B2 (ru)
EP (1) EP1907569B1 (ru)
JP (1) JP5301987B2 (ru)
KR (1) KR101374304B1 (ru)
CN (1) CN101238222B (ru)
AU (1) AU2006260477B2 (ru)
BR (1) BRPI0612301A2 (ru)
CA (1) CA2612475C (ru)
EA (1) EA016397B1 (ru)
IL (1) IL188147A (ru)
MX (1) MX2007015848A (ru)
NO (1) NO341910B1 (ru)
NZ (1) NZ564285A (ru)
WO (1) WO2006137085A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2521202C1 (ru) * 2013-04-12 2014-06-27 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" Способ прогнозирования риска развития сахарного диабета второго типа у больных гипертонической болезнью

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7407955B2 (en) 2002-08-21 2008-08-05 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg 8-[3-amino-piperidin-1-yl]-xanthines, the preparation thereof and their use as pharmaceutical compositions
US7501426B2 (en) 2004-02-18 2009-03-10 Boehringer Ingelheim International Gmbh 8-[3-amino-piperidin-1-yl]-xanthines, their preparation and their use as pharmaceutical compositions
DE102004054054A1 (de) 2004-11-05 2006-05-11 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Herstellung chiraler 8-(3-Amino-piperidin-1-yl)-xanthine
BRPI0612301A2 (pt) * 2005-06-20 2009-01-27 Decode Genetics Ehf mÉtodo para diagnosticar uma suscetibilidade para a diabete tipo ii em um indivÍduo, kit, e, mÉtodo para avaliar um indivÍduo quanto a probabilidade de resposta a um agente terapÊutico de tcf7l2
DE102005035891A1 (de) 2005-07-30 2007-02-08 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg 8-(3-Amino-piperidin-1-yl)-xanthine, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel
MX2008014024A (es) 2006-05-04 2008-11-14 Boehringer Ingelheim Int Formas poliformas.
PE20110235A1 (es) 2006-05-04 2011-04-14 Boehringer Ingelheim Int Combinaciones farmaceuticas que comprenden linagliptina y metmorfina
EP1852108A1 (en) 2006-05-04 2007-11-07 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG DPP IV inhibitor formulations
KR20090087486A (ko) * 2006-11-30 2009-08-17 디코드 제네틱스 이에이치에프 타입 ２ 당뇨병의 유전적 감수성 변이
EP2057183A2 (en) * 2007-03-01 2009-05-13 Novetide Ltd. High purity peptides
US20100184839A1 (en) * 2007-04-30 2010-07-22 Avishay Vaknin Allelic polymorphism associated with diabetes
PE20140960A1 (es) 2008-04-03 2014-08-15 Boehringer Ingelheim Int Formulaciones que comprenden un inhibidor de dpp4
KR20200118243A (ko) 2008-08-06 2020-10-14 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 메트포르민 요법이 부적합한 환자에서의 당뇨병 치료
UY32030A (es) 2008-08-06 2010-03-26 Boehringer Ingelheim Int "tratamiento para diabetes en pacientes inapropiados para terapia con metformina"
CN102149407A (zh) 2008-09-10 2011-08-10 贝林格尔.英格海姆国际有限公司 治疗糖尿病和相关病症的组合疗法
US20200155558A1 (en) 2018-11-20 2020-05-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Treatment for diabetes in patients with insufficient glycemic control despite therapy with an oral antidiabetic drug
CN107011345A (zh) 2008-12-23 2017-08-04 勃林格殷格翰国际有限公司 有机化合物的盐形式
TW201036975A (en) 2009-01-07 2010-10-16 Boehringer Ingelheim Int Treatment for diabetes in patients with inadequate glycemic control despite metformin therapy
US8796182B2 (en) 2009-07-10 2014-08-05 Decode Genetics Ehf. Genetic markers associated with risk of diabetes mellitus
EP2504002B1 (en) * 2009-11-27 2019-10-09 Boehringer Ingelheim International GmbH Treatment of genotyped diabetic patients with dpp-iv inhibitors such as linagliptin
KR101927068B1 (ko) 2010-05-05 2018-12-10 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 체중 감소 치료에 후속하는 dpp-4 억제제에 의한 순차적 병용 요법
KR20200028498A (ko) 2010-06-24 2020-03-16 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 당뇨병 요법
AR083878A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Boehringer Ingelheim Int Terapia antidiabetica vasoprotectora y cardioprotectora, linagliptina, metodo de tratamiento
HUE061596T2 (hu) 2011-07-15 2023-07-28 Boehringer Ingelheim Int Szubsztituált dimer kinazolin származék, annak elõállítása és alkalmazása az I. és II. típusú cukorbetegség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményekben
US9555001B2 (en) 2012-03-07 2017-01-31 Boehringer Ingelheim International Gmbh Pharmaceutical composition and uses thereof
ES2929025T3 (es) 2012-05-14 2022-11-24 Boehringer Ingelheim Int Linagliptina, un derivado de xantina como inhibidor de dpp-4, para su uso en el tratamiento del SRIS y/o de la septicemia
US20130303462A1 (en) 2012-05-14 2013-11-14 Boehringer Ingelheim International Gmbh Use of a dpp-4 inhibitor in podocytes related disorders and/or nephrotic syndrome
WO2013174767A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh A xanthine derivative as dpp -4 inhibitor for use in modifying food intake and regulating food preference
AU2014236386A1 (en) * 2013-03-14 2015-10-01 The Children's Hospital Of Philadelphia TCF7L2 variant and methods of use thereof in diagnostic and drug screening assays
EP3110449B1 (en) 2014-02-28 2023-06-28 Boehringer Ingelheim International GmbH Medical use of a dpp-4 inhibitor
CN103882127B (zh) * 2014-03-13 2016-03-16 河北联合大学 用于预测患2型糖尿病肾病发生风险的试剂盒
WO2016201438A1 (en) * 2015-06-11 2016-12-15 The Children's Hospital Of Philadelphia New targets modulated by a casual variant of type 2 diabetes (t2d) embedded within the tcf7l2 gene and methods of use thereof for identifying agents having efficacy for the treatment of type 2 diabetes and other metabolic disorders
BR112018072401A2 (pt) 2016-06-10 2019-02-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh combinações de linagliptina e metformina
CN109182508A (zh) * 2018-10-22 2019-01-11 北京华夏时代生物工程有限公司 Tcf7l2基因单核苷酸多态性的荧光原位杂交测序方法
TWI702292B (zh) * 2018-12-28 2020-08-21 薩摩亞商康多富國際有限公司 個人化新陳代謝疾病保健食品組合的決定方法及非暫態電腦可讀取儲存媒體

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004042358A2 (en) * 2002-11-01 2004-05-21 Decode Genetics Ehf. HUMAN TYPE II DIABETES GENE-SLIT-3 LOCATED ON CHROMOSOME 5q35

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4376110A (en) * 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
DE131052T1 (de) * 1983-01-10 1987-03-19 Gen-Probe Partners, San Diego, Calif. Verfahren zum aufspueren, identifizieren und quantifizieren von organismen und viren.
US5288611A (en) * 1983-01-10 1994-02-22 Gen-Probe Incorporated Method for detecting, identifying, and quantitating organisms and viruses
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DE3534934A1 (de) * 1985-10-01 1987-04-02 Draegerwerk Ag Kolorimetrisches gasdosimeter
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5176996A (en) * 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5256775A (en) * 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5424186A (en) * 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5264564A (en) * 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5384261A (en) * 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
US5858659A (en) * 1995-11-29 1999-01-12 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
US5837832A (en) * 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US6057117A (en) * 1996-04-04 2000-05-02 Chiron Corporation Identification and use of selective inhibitors of glycogen synthase kinase 3
WO1998016528A1 (en) * 1996-10-11 1998-04-23 Chiron Corporation Purine inhibitors of glycogen synthase kinase 3 (gsk3)
CN1312807A (zh) * 1998-06-19 2001-09-12 希龙公司 糖元合成酶激酶3的抑制剂
US6512102B1 (en) * 1998-12-31 2003-01-28 Chiron Corporation Compositions and methods of diagnosis and treatment using casein kinase I
CN1272328C (zh) * 1999-12-17 2006-08-30 希龙公司 糖元合成酶激酶3的基于吡嗪的抑制剂
EP1240168B1 (en) * 1999-12-17 2005-08-31 Chiron Corporation Bicyclic inhibitors of glycogen synthase kinase 3
CN1276974C (zh) * 2000-07-27 2006-09-27 希龙公司 Gsk3多肽
AU785425B2 (en) * 2001-03-30 2007-05-17 Genetic Technologies Limited Methods of genomic analysis
JP2004536113A (ja) * 2001-07-03 2004-12-02 カイロン コーポレイション チロシンキナーゼおよびセリン／スレオニンキナーゼのインヒビターとしてのインダゾールベンズイミダゾール化合物
AU2002324649A1 (en) * 2001-08-04 2003-02-24 General Hospital Corporation Haplotype map of the human genome and uses therefor
WO2003024447A1 (en) * 2001-09-20 2003-03-27 Smithkline Beecham Corporation Inhibitors of glycogen synthase kinase-3
US20040072831A1 (en) * 2001-10-12 2004-04-15 Choongwae Pharma Corporation Reverse-turn mimetics and method relating thereto
US20040023237A1 (en) * 2001-11-26 2004-02-05 Perelegen Sciences Inc. Methods for genomic analysis
US6762185B1 (en) * 2002-03-01 2004-07-13 Choongwae Pharma Corporation Compounds useful for treatment of cancer, compositions containing the same, and methods of their use
EP1380644A1 (en) * 2002-07-08 2004-01-14 Kylix B.V. The use of specified TCF target genes to identify drugs for the treatment of cancer, in particular colorectal cancer, in which TCF/beta-catenin/WNT signalling plays a central role
BR0313743A (pt) * 2002-08-23 2005-07-05 Chiron Corp Benzimidazol quinolinonas e usos destas
US20040247593A1 (en) * 2002-10-04 2004-12-09 Regents Of The University Of California, Methods for treating cancer by inhibiting Wnt signaling
US20040146870A1 (en) * 2003-01-27 2004-07-29 Guochun Liao Systems and methods for predicting specific genetic loci that affect phenotypic traits
CN1548553A (zh) * 2003-05-21 2004-11-24 中国医学科学院基础医学研究所 用于预测2型糖尿病易感性的试剂盒及引物
US6991110B2 (en) * 2003-07-02 2006-01-31 Inficon, Inc. Package for storing sensor crystals and related method of use
CN1871239A (zh) * 2003-08-28 2006-11-29 (株)中外制药 β－联蛋白/TCF激活转录的调节
BRPI0612301A2 (pt) * 2005-06-20 2009-01-27 Decode Genetics Ehf mÉtodo para diagnosticar uma suscetibilidade para a diabete tipo ii em um indivÍduo, kit, e, mÉtodo para avaliar um indivÍduo quanto a probabilidade de resposta a um agente terapÊutico de tcf7l2

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004042358A2 (en) * 2002-11-01 2004-05-21 Decode Genetics Ehf. HUMAN TYPE II DIABETES GENE-SLIT-3 LOCATED ON CHROMOSOME 5q35

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE SNPDB NCBI, "rs4506565", 16.03.2003, Naydeno v Internet:<URL::http://www.ncbi.nlm.nih.gov, 02.06.2008 *
DATABASE SNPDB NCBI, "rs7903146", 04.07.2003, Naydeno v Internet:<URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=7903146, 02.06.2008 *
HALPERIN E. et al. "Tag SNP selection in genotype data for maximizing SNP prediction accuracy". Bioinformatics, 2005 Jun., 21 Suppl. 1; 195-203, referat [Naydeno v Internet 04.06.2008], Medline [on-layn], PMID: 15961458 *
Twyman R.M. Snp discovery and typing technologies for pharmacogenomics. Curr Top Med Chem, 2004; 4(13):1423-31, referat [Naydeno v Internet 04.06.2008], Medline [on-layn] PMID: 15379655 *
Yi F. "TCF-4 Mediates Cell Type-specific Regulation of Proglucagon Gene Expression by B-Catenin and Glycogen Synthase Kinase-3B", Journal of Biological Chemistry, 2005, January 14; 280(2): 1457-64 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2521202C1 (ru) * 2013-04-12 2014-06-27 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" Способ прогнозирования риска развития сахарного диабета второго типа у больных гипертонической болезнью

Also Published As

Publication number Publication date
NO341910B1 (no) 2018-02-19
WO2006137085A1 (en) 2006-12-28
BRPI0612301A2 (pt) 2009-01-27
US7585630B2 (en) 2009-09-08
JP2008546403A (ja) 2008-12-25
HK1117569A1 (en) 2009-01-16
CA2612475C (en) 2015-07-28
IL188147A0 (en) 2008-03-20
NO20080389L (no) 2008-01-21
EA200800087A1 (ru) 2008-06-30
MX2007015848A (es) 2008-04-22
CN101238222A (zh) 2008-08-06
KR101374304B1 (ko) 2014-03-14
US20120149016A1 (en) 2012-06-14
AU2006260477B2 (en) 2012-02-23
IL188147A (en) 2013-02-28
AU2006260477A8 (en) 2006-12-28
US20060286588A1 (en) 2006-12-21
AU2006260477A1 (en) 2006-12-28
NZ564285A (en) 2010-03-26
CN101238222B (zh) 2013-04-10
EP1907569A1 (en) 2008-04-09
CA2612475A1 (en) 2006-12-28
US20090275043A1 (en) 2009-11-05
EP1907569B1 (en) 2013-04-10
JP5301987B2 (ja) 2013-09-25
KR20080051128A (ko) 2008-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA016397B1 (ru) Генетические варианты гена tcf7l2 как диагностические маркеры риска возникновения сахарного диабета ii типа
JP6316994B2 (ja) 心筋梗塞に関連する遺伝的多型、その検出方法および使用
US20210164050A1 (en) Genetic polymorphisms associated with cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof
US20050287551A1 (en) Susceptibility gene for human stroke; methods of treatment
JP2017063795A (ja) スタチンの応答および心血管疾患に関連する遺伝子多型、その検出方法ならびに使用
US20030054531A1 (en) Human stroke gene
US20050164220A1 (en) Susceptibility gene for human stroke: method of treatment
US20160040239A1 (en) Methods for predicting cardiovascular risks and responsiveness to statin therapy using snps
EP1871908B1 (en) Susceptibility gene for myocardial infarction and acute coronary syndrome
US20050272051A1 (en) Methods of preventing or treating recurrence of myocardial infarction
US20100167285A1 (en) Methods and agents for evaluating inflammatory bowel disease, and targets for treatment
US6228581B1 (en) Human intronic and polymorphic SR-BI nucleic acids and uses therefor
US7198898B2 (en) PHOX2B polymorphisms as Hirschsprung&#39;s disease diagnostic markers and methods based thereon
US20060141462A1 (en) Human type II diabetes gene-slit-3 located on chromosome 5q35
US20040014099A1 (en) Susceptibility gene for human stroke; methods of treatment
US20070111209A1 (en) Inversion on chromosome 8p23 is a risk factor for anxiety disorders, depression and bipolar disorders
US20050239077A1 (en) Diagnosing predisposition to fat deposition and associated conditions
US6130041A (en) Human intronic and polymorphic SR-BI nucleic acids and uses therefor
US20090208945A1 (en) Method for the Prediction of Adverse Drug Responses to Stains
US20080167326A1 (en) Method For Assessing the Predisposition and/or Susceptibility to Copd by Analysing Fgf-Bp1
WO2001073116A2 (en) Method for determining osteoporosis susceptibility and/or low bone density and reagents therefor
CA2499320A1 (en) Susceptibility gene for human stroke; methods of treatment

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY RU