EA016059B1

EA016059B1 - Фосфонированные рифамицины и их применение для профилактики и лечения костных и суставных инфекций

Info

Publication number: EA016059B1
Application number: EA200800570A
Authority: EA
Inventors: Янник Стефан Роуз; Стефан Циблат; Тинг Канг; Адель Рафэи Фар; Евелин Дитрих; Яник Лафонтэн; Ранга Редди
Original assignee: Тарганта Терапьютикс Инк.
Priority date: 2005-08-11
Filing date: 2006-08-11
Publication date: 2012-01-30
Also published as: US8404664B2; JP5368092B2; AU2006339058A1; BRPI0614758A2; AU2006339058B2; EA200800570A1; EP1928890B1; WO2007096703A2; EP1928890A4; EP1928890A2; CA2618741A1; JP2009505974A; IL189270A0; KR20080035687A; CA2618741C; CN101282981A; US20110263534A1; CN101282981B; IL189270A; KR101327635B1

Abstract

Настоящее изобретение относится к фосфонированным рифамицинам и способам получения и применения таких соединений. Указанные соединения являются полезными в качестве антибиотиков для профилактики и/или лечения костных и суставных инфекций, главным образом для профилактики и/или лечения остеомиелита.

Description

Изобретение относится к фосфонированным рифамицинам. Указанные соединения полезны как антибиотики для профилактики и/или лечения костных и суставных инфекций, в особенности для профилактики и/или лечения остеомиелита.

Уровень техники

Остеомиелит является воспалением костей, которое вызывается множеством микроорганизмов, в основном 81арйу1ососси5 аигеик (Сагек е! а1., Атепсап РатПу Рйу81С1аи (2001), νοί. 12, 12:2413-2420). Это болезненное и истощающее заболевание проявляется наиболее часто у детей. Среди взрослых также уязвимы пациенты с диабетом и проходящие гемодиализ. Острая форма заболевания может быть пролечена антибиотиками, но требует длительного периода ежедневной терапии. Оно может тем не менее переходить в рецидивирующую или хроническую форму, требующую повторных госпитализаций и интенсивного лечения.

Рифамицины являются классом полусинтетических антибиотиков ансамицинов, некоторые представители которых в настоящее время используются клинически или проходят клинические исследования (Вигтап е! а1., С1т. Рйагтасокше!. (2001), 40:327-341). Рифамицины нацелены на бактериальную ДНК-зависимую РНК-полимеразу с большим на 2-4 порядка сродством, чем к эквивалентным эукариотическими ферментам (Р1о§8 апб Уц, Сйет Рет. (2005), 105:621-632). Рифамицины действуют путем связывания точно определенного сайта β-субъединиц голофермента РНК-полимеразы и как результат нарушают и ингибируют начальную фазу синтеза РНК. Общая структура этих ингибиторов представляет вполне определенное положение, которое предусматривает модулирование их фармакокинетических и фармакодинамических свойств без существенного изменения их способа связывания. Это привело к описанию ряда хорошо изученных соединений данного класса, включая рифампицин (И8 3342810), рифапентин (И8 4002752), рифандин (И8 4353826), рифабутин (И8 4219478), рифалазил (И8 4983602) и рифаксимин (И8 4341785). В последнее время было показано, что несколько 25-деацетильных аналогов являются перспективными антибактериальными средствами (заявка И8 2005/043298). Рифамицины исключительно активны в отношении грамположительных патогенов, несколько менее в отношении грамотрицательных, и проявляют побочные эффекты обычно только при высоких дозах или в присутствии ингибиторов цитохрома Р3 А. Их уникальная способность воздействовать на бактерии в состоянии покоя, что может быть обусловлено необходимостью в коротких вспышках синтеза РНК бактерий даже при отсутствии роста, делает их первыми кандидатами при хронических инфекциях, часто в комбинации, с тем, чтобы избежать относительно высокой частоты устойчивости. В этом отношении рифампицин обычно в комбинации с другими антибактериальными средствами приводит к хорошим результатам в лечении инфекций костей и суставов (Эаг1еу апб МсСо\гап. 1. АпйткгоЬ. СйетоШег. (2004), 53, 928-935; \\к1теге!а1., С1ш. 1пРес!. ϋΐδ. (1992), 14, 1251-1253).

Бисфосфонаты являются хорошо изученными агентами, тройными к костной ткани. Эти соединения, как было выяснено, обладают высоким сродством к костям за счет их способности связывать ионы Са²⁺, обнаруживаемые в гидроксиапатитах, образующих костные ткани (НйаЬауакЫ апб Рищакг С1т. Рйагтасокше!. (2003), 42(15):1319-1330). Следовательно, много различных видов бисфосфонатконъюгированных соединений было разработано для нацеливания лекарств избирательно на кость, включая белки (и1ибад е! а1., Вю!есйпо1 Ргод. (2000), 16:1115-1118), витамины (И8 6214812, И8 2003/0129194 и \О 02/083150), ингибиторы тирозинкиназы (\О 01/44258 и \О 01/44259), гормоны (И8 5183815 и И8 2004/0116673) и агенты для сканирования костей (И8 4810486). Эти и другие производные бисфосфонатов применяются в качестве терапевтических агентов для лечения заболеваний костей, таких как артрит (И8 4746654), остеопороз (И8 5428181 и И8 6420384), гиперкальциемия (И8 4973576) и раки костей (И8 6548042). Некоторые стратегии также были изучены на предмет адресной доставки антибиотиков (И8 5900410, И8 2002/0142994; И8 2004/0033969, И8 2005/026864). Для нацеленной на кости доставки антибиотиков некоторые авторы предполагают использование бисфосфонированных антибиотиков. Тем не менее только некоторые из таких соединений фактически были синтезированы, включая тетрациклины, β-лактамы и фторхинолоны (И8 5854227; И8 5880111; ΌΕ 19532235; Р1ерег апб Керр1ег, Рйокрйогик, 8и11иг апб 8Шсоп (2001), 170:5-14; апб Негсхедй е! а1. 1. Меб. Сйет (2002), 45:2338-41). Более того, ни одно из этих соединений не вводили ш т1то, и не была показана их нацеленная на кости активность.

Несмотря на прогресс, который был достигнут в последние годы, нацеленная на кости доставка до сих пор ограничена из-за уникальных анатомических свойств костей. Хотя модификация бисфосфонатов может быть перспективным способом, нет уверенности в успехе, поскольку несколько десятилетий прогресса показывают, что терапевтически оптимизированные производные бисфосфонатов должны быть разработаны и оптимизированы по схеме соединение-к-соединению (НйаЬакакЫ апб Рищакг С1ш Рйагтасокте! (2003), 42(15):1319-1330). Ввиду вышесказанного существует необходимость в более подходящих для введения лекарственных препаратах для профилактики и лечения инфекций костей и суставов. Конкретнее, существует необходимость в высокоактивных фосфонатных производных рифамицинов, способных обеспечить как контролируемую по времени (или замедленную) и контролируемую по

- 1 016059 месту (или нацеленную) доставку лекарственного средства в кости. Настоящее изобретение удовлетворяет эти потребности и также другие потребности, что будет очевидным среднему специалисту после прочтения нижеследующего описания.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение направлено на антибактериальные соединения, которые имеют сродство для связывания костей. В особенности, изобретение направлено на фосфонированные рифамицины. Эти соединения являются полезными в качестве антибиотиков для профилактики и/или лечения костных и суставных инфекций, главным образом для профилактики и/или лечения остеомиелита.

В одном из воплощений соединения по изобретению представлены формулой (I) или их фармацевтически приемлемой солью или пролекарством:

[ В--О-А

I 1η 0) где В представляет собой фосфонированную группу;

Ь представляет собой расщепляемый линкер связывания В с А;

η имеет значение 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, предпочтительно 1, 2 или 3;

А представляет собой рифамицин.

В предпочтительном воплощении В представляет собой фосфонированную группу, имеющую высокое сродство к костным тканям. Предпочтительно В представляет собой бисфосфонат. Более предпочтительно В представляет собой бисфосфонат, выбранный из группы, состоящей из:

где каждый Я* независимо выбран из группы, состоящей из Н, низшего алкила, циклоалкила, арила и гетероарила, при условии, что по крайней мере два Я* представляют собой Н;

X представляет собой Н, ОН, ΝΗ₂ или галогеновую группу;

оба Х₁ представляют собой Н или каждый независимо выбран из группы, состоящей из Н, ОН, ΝΗ₂и галогеновой группы.

В другом предпочтительном воплощении Ь представляет собой расщепляемый линкер для ковалентного и реверсивного связывания В с А.

Предпочтительно Ь связывает В с А через одну или большее количество гидроксильных групп на А, через один или большее количество атомов азота на А или через одну или большее количество гидроксильных групп и один или большее количество атомов азота на А. Когда Ь связывает В с А через гидроксильную группу на А, предпочтительно Ь представляет собой один из следующих линкеров:

- 2 016059

где η равно целому числу <10, предпочтительно 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно 1 или 2;

каждый р независимо равен 0 или целому числу <10, предпочтительно 0, 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно 0 или 1;

с.| имеет значение 2 или 3;

г имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5;

и \\₂ являются целыми числами >0, такими, что их сумма (^₁+^₂) равна 1, 2 или 3;

- 3 016059 каждый независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила, предпочтительно Н;

В представляет собой фосфонированную группу;

часть структуры ' линкера представляет собой гидроксильный остаток А.

Когда Ь связывает В с А через атом азота на А, предпочтительно Ь представляет собой один из сле дующих линкеров:

где η равен целому числу <10, предпочтительно 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно 1 или 2;

с.| имеет значение 2 или 3;

каждый К.|. независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила, предпочтительно Н;

Κι представляет собой С_хН_у, где х является целым числом от 0 до 20 и у является целым числом от 1 до 2х+1;

X представляет собой СН₂, -СОХК_Ъ-, -СО-О-СН₂- или -СО-О-;

А_а представляет собой атом азота на А.

В дополнительном предпочтительном воплощении по крайней мере один из В-Ь- связан с гидроксильной функциональной группой на рифамицине А. Предпочтительно, когда В-Ь- связан с гидроксильной функциональной группой, В-Ь- является одной из следующих структур:

- 4 016059

где В представляет собой фосфонированную группу;

каждый р независимо равен 0 или целому числу <10, предпочтительно 0,1, 2, 3 или 4, более предпочтительно 0 или 1;

с.| имеет значение 2 или 3;

η равно целому числу <10, предпочтительно 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно 1 или 2;

г имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5;

и те₂, каждый, являются целыми числами >0, такими, что их сумма (^₁+^₂) равна 1, 2 или 3.

В дополнительном предпочтительном воплощении по крайней мере один из В-Ь- связан с атомом азота на рифамицине А. Предпочтительно, когда В-Ь- связан с атомом азота, В-Ь- является одной из сле дующих структур:

- 5 016059

где В представляет собой указанную фосфонированную группу;

η равен целому числу <10, предпочтительно 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно 1 или 2;

каждый К_ъ независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила, предпочтительно Н;

с.| имеет значение 2 или 3;

X представляет собой СН₂, -ΟΘΝΚ_Σ-, -СО-О-СН₂- или -СО-О-;

В,, представляет собой СхН_у, где х является целым числом от 0 до 20 и у является целым числом от 1 до 2х+1.

В дополнительном предпочтительном воплощении η равен целому числу от 2 до 7, по крайней мере один из В-Ь- связан с гидроксильной функциональной группой на рифамицине А, и по крайней мере один из В-Ь- связан с атомом азота на рифамицине А. Предпочтительно, когда В-Ь- связан с гидроксильной функциональной группой, В-Ь-является одной из следующих структур:

I

	I й
) 1	V

и

- 6 016059

каждый Ку независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила, предпочтительно Н;

с.| имеет значение 2 или 3;

г имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5;

и те₂, каждый, являются целыми числами >0, такими, что их сумма (^₁+^₂) равна 1, 2 или 3. Предпочтительно, когда В-Ь- связан с атомом азота, В-Ь- является одной из следующих структур:

каждый К независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила, предпочтительно Н;

с.| имеет значение 2 или 3;

X представляет собой СН₂, -ΟΟΝΚ_Σ-, -СО-О-СН₂- или -СО-О-;

К_а представляет собой СДу, где х является целым числом от 0 до 20 и у является целым числом от 1 до 2х+1.

В дополнительном предпочтительном воплощении η имеет значение 1, 2 или 3.

Предпочтительно рифамицин А имеет структуру, представленную следующей формулой А1:

где X представляет собой Н- или К|СО-. где К₁ представляет собой замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-6 атомов углерода;

- 7 016059 каждый Υ независимо выбран из группы, состоящей из Н- и КО-, где Я представляет собой Н-, Κι-, или К^СО-, с К₁, определенным выше;

выбран из группы, состоящей из соединений формул А2-А10:

А9

А10 где К₂ представляет собой Н-, замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-10 атомов углерода, или диалкиламиногруппу, предпочтительно указанная диалкиламиногруппа представляет собой замещенный пиперидин, замещенный морфолин или замещенный пиперазин;

К₃ представляет собой Н- или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-7 атомов углерода;

К₄ представляет собой гидроксильную группу, сульфогидрильную группу или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-3 атомов углерода;

ν₁ представляет собой кислород или -ΝΚ₂ с К₂, определенным выше;

\ν₂ представляет собой замещенный или незамещенный метилен, включая где К₅ и К₆ независимо представляют собой Н- или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-5 атомов углерода, и Ζ' представляет собой атом кислорода, атом серы, замещенный метилен, карбонил, -ΝΚ₁ или -Ν(Ο)Κ₁, где К₁ определен выше;

Т представляет собой галоген или К₂, где К₂ определен выше;

Ζ представляет собой О, 8 или ΝΚ₃, где К₃ определен выше.

Более предпочтительно рифамицин А имеет структуру, представленную одной из следующих формул или ее антимикробное производное:

- 8 016059

Также предпочтительно рифамицин А представляет собой рифампицин, рифапентин, рифабутин, рифалазил, рифаксимин, рифандин или антимикробное производное одного из этих соединений.

В другом воплощении соединения по изобретению представлены формулой (II) или их фармацевтически приемлемой солью либо пролекарством

где Οι представляет собой Н-, К₁СО- или Ц-, где Κι представляет собой замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-6 атомов углерода;

каждый независимо выбран из группы, состоящей из Н-, КО- и Ь₂О-, где К представляет собой Н-, К₁- или К₁СО-, с К₁, определенным выше;

каждый О;, независимо выбран из группы, состоящей из Н- и Ь₃-;

⁴ выбран из группы, состоящей из соединений формул А2-А10:

- 9 016059

где Я₂ представляет собой Н-, замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-10 атомов углерода, или диалкиламиногруппу, предпочтительно указанная диалкиламиногруппа представляет собой замещенный пиперидин, замещенный морфолин или замещенный пиперазин, где когда Я₂ представляет собой замещенную алкильную цепь из 1-10 атомов углерода, замещенный пиперидин, замещенный морфолин или замещенный пиперазин, то заместитель является одним из членов, выбранных из группы, состоящей из Ь₄О-, Ь₅8- и Ε₆ΝΚ₇-, где Я- представляет собой замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-7 атомов углерода;

Я₃ представляет собой Н-, замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-7 атомов углерода или Ь₇-;

Я₄ представляет собой гидроксильную группу, сульфогидрильную группу или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-3 атомов углерода, Ь₈О- или Ь₉8-;

представляет собой кислород или -ΝΚ₂, с Я₂, определенным выше;

\ν₂ представляет собой замещенный или незамещенный метилен, включая . где Я₅ и Я·, независимо представляют собой Н- или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-5 атомов углерода, и Ζ' представляет собой атом кислорода, атом серы, замещенный метилен, карбонил, -ΝΒ₁ или -Ν(Ο)Κ.|. где Я! определен выше;

Т представляет собой галоген или Я₂, где Я₂ определен выше;

Ζ представляет собой О, 8 или ΝΒ₃, где Я₃ определен выше;

каждый Ь1, Ь₂, Ь₃, Ь₄, Ь₅, Ь₈ и Ь₉ представляет собой расщепляемый линкер, независимо выбранный из группы, состоящей из:

- 10 016059

с.| имеет значение 2 или 3;

г имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5;

и \\₂ являются целыми числами >0, такими, что их сумма (^₁+^₂) равна 1, 2 или 3; каждый К независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила, предпочтительно Н; каждый Ь₆ и Ь₇ представляет собой расщепляемый линкер, независимо выбранный из группы, состоящей из:

- 11 016059

где η равен целому числу <10, предпочтительно 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно 1 или 2; каждый р независимо равен 0 или целому числу <10, предпочтительно 0, 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно 0 или 1;

с.| имеет значение 2 или 3;

каждый Я|, независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила, предпочтительно Н;

Я_а представляет собой СхН_у, где х является целым числом от 0 до 20 и у является целым числом от 1 до 2х+1;

X представляет собой СН₂, -СОNЯ_^-, -СО-О-СН₂- или -СО-О-;

В представляет собой фосфонированную группу, выбранную из группы, состоящей из:

каждый X! независимо выбран из группы, состоящей из Н, ОН, ΝΗ₂, галогеновой группы; при условии, что по крайней мере один из Ц, Ь₂, Ь₃, Ь₄, Ь₅, Ь₆, Ь₇, Ь₈ и Ь₉ присутствует.

В дальнейших предпочтительных воплощениях соединения по изобретению имеют структуру, выбранную среди структур, представленных ниже, так же как их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства:

- 12 016059

- 13 016059

Особенно предпочтительные соединения по настоящему изобретению имеют структуру, выбранную среди структур, представленных ниже, так же как их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства:

- 14 016059

В другом аспекте настоящее изобретение раскрывает фармацевтические композиции, содержащие одно или большее количество соединений, как определено в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

Настоящее изобретение также охватывает способы лечения бактериальной инфекции у субъекта, включающие введение субъекту, имеющему бактериальную инфекцию или в других обстоятельствах нуждающемуся в таком лечении, фармацевтически эффективного количества из одного или большего количества соединений, как определено в настоящем описании, или фармацевтической композиции, как определено в настоящем описании. Субъектом может быть животное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человек.

Настоящее изобретение, кроме того, охватывает способы профилактики бактериальной инфекции у субъекта, включающие введение субъекту профилактически эффективного количества из одного или большего количества соединений, как определено в настоящем описании, или фармацевтической композиции, как определено в настоящем описании. Профилактически эффективное количество соединения или фармацевтической композиции может быть введено субъекту до, в течение или после инвазивного медицинского лечения. Субъектом может быть животное, предпочтительно млекопитающее, более пред почтительно человек.

Настоящее изобретение также охватывает способы лечения бактериальной инфекции у субъекта, включающие введение субъекту, имеющему бактериальную инфекцию или в других обстоятельствах,

- 15 016059 нуждающемуся в таком лечении, фармацевтически эффективного количества из одного или большего количества соединений, как определено в настоящем описании, или фармацевтической композиции, как определено в настоящем описании, и одновременное введение второго терапевтического агента. Предпочтительно вторым терапевтическим агентом является антибиотик. Более предпочтительно вторым терапевтическим агентом является антибиотик, выбранный из группы, состоящей из тетрациклина, антибактериального агента, представляющего собой тетрациклиновое производное, глицилциклина, антибактериального агента, представляющего собой глицилциклиновое производное, миноциклина, антибактериального агента, представляющего собой миноциклиновое производное, оксазолидинонового антибактериального агента, аминогликозидного антибактериального агента, хинолонового антибактериального агента, ванкомицина, антибактериального агента, представляющего собой ванкомициновое производное, теикопланина, антибактериального агента, представляющего собой теикопланиновое производное, эремомицина, антибактериального агента, представляющего собой эремомициновое производное, хлорэремомицина, антибактериального агента, представляющего собой хлорэремомициновое производное, даптомицина и антибактериального агента, представляющего собой даптомициновое производное.

Изобретение также обеспечивает способ накопления рифамицина в организме у субъекта, включающий введение субъекту одного или большего количества соединений, как определено в настоящем описании, или фармацевтической композиции, как определено в настоящем описании. Такой способ накопления рифамицина в организме у субъекта может также быть использован для пролангирования присутствия рифамицина в организме у субъекта. В каждом случае субъектом может быть животное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человек.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы получения фосфонированного рифамицина, предпочтительно фосфонированного рифамицина формулы (I) и/или формулы (II), как определено в настоящем описании.

Преимуществом изобретения является то, что оно обеспечивает антибактериальные соединения, имеющие повышенное сродство связывания для кости. Изобретение также обеспечивает способы медицинской помощи в профилактики и лечении костных и суставных инфекций.

Дополнительные объекты, преимущества и возможности настоящего изобретения станут более очевидны при изучении последующего неограничивающего описания предпочтительных воплощений со ссылкой к сопутствующим рисункам, которые являются иллюстративными и не должны быть интерпретированы как ограничивающие область настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой гистограмму, демонстрирующую тестирование рифамицинового производного 9 в количестве 20 мг/кг и небольшого, но статистически незначительного эффекта (в сравнении с контролем при отсутствии лечения) его исходного бисфосфонированного пролекарства 11 в количестве 32 мг/кг на бактериальные титры в костной инфекции, когда его вводят или каждые четыре дня, или в течение четырех дней и затем каждую неделю в течение 4 недель после инфицирования.

Фиг. 2 представляет собой гистограмму, демонстрирующую тестирование рифамицина в количестве 20 мг/кг и небольшого, но статистически существенного эффекта (в сравнении с контролем при отсутствии лечения) его исходного бисфосфонатного пролекарства 36 в количестве 33.4 мг/кг на бактериальные титры в костной инфекции, когда его вводят каждые четыре дня в течение 4 недель после инфицирования.

Фиг. 3 представляет собой гистограмму, демонстрирующую тестирование бензоксазинорифамицина 56 в количестве 20 мг/кг и небольшого, но статистически существенного эффекта (в сравнении как с контролем при отсутствии лечения, так и бензоксазинорифамицином 56) его исходного бисфосфонатного пролекарства 62 в количестве 26 мг/кг на бактериальные титры в костной инфекции, когда его вводят в течение четырех дней и затем каждые четыре дня в течение 4 недель после инфицирования.

Фиг. 4 представляет собой гистограмму, демонстрирующую тестирование бензоксазинорифамицина 69 в количестве 20 мг/кг и небольшого, но статистически существенного эффекта (в сравнении как с контролем при отсутствии лечения, так и бензоксазинорифамицином 69) его исходного бисфосфонатного пролекарства 71 в количестве 28 мг/кг на бактериальные титры в костной инфекции, когда его вводят в течение четырех дней и затем каждые четыре дня в течение 4 недель после инфицирования.

Фиг. 5 представляет собой гистограмму, демонстрирующую тестирование рифалазила в количестве 20 мг/кг и небольшого, но статистически существенного эффекта (в сравнении как с контролем при отсутствии лечения, так и рифалазилом) его исходного бисфосфонатного пролекарства 81 в количестве 27.6 мг/кг на бактериальные титры в костной инфекции, когда его вводят в течение четырех дней и затем каждые четыре дня в течение 4 недель после инфицирования.

Фиг. 6 представляет собой гистограмму, демонстрирующую эффект рифампицинового, рифабутинового и рифамицинового производного 9 в количестве 20 мг/кг на бактериальные титры в костной инфекции, когда его вводят ежедневно в течение 4 недель после инфицирования.

Фиг. 7 представляет собой линейный график, демонстрирующий концентрацию соединения 11 в большеберцовой кости, бедре и нижней челюсти крысы через час до 14 дней после IV болюсной инъекции в количестве 32 мг/кг.

- 16 016059

Фиг. 8 представляет собой линейный график, демонстрирующий концентрацию соединения 36 в большеберцовой кости крысы через 0,5 ч до 14 дней после IV болюсной инъекции в количестве 15.5 мг/кг.

Фиг. 9 представляет собой линейный график, демонстрирующий концентрацию соединения 62 в большеберцовой кости крысы через день до 7 дней после IV болюсной инъекции в количестве 26 мг/кг.

Подробное описание изобретения

A) Общее представление об изобретении.

Настоящее изобретение раскрывает фосфонированные рифамицины, в особенности те фосфонированные соединения, которые определены в формуле (I) и формуле (II), как определено выше и в дальнейшем. Эти соединения являются полезными антимикробными агентами, эффективными против ряда человеческих и ветеринарных болезнетворных микроорганизмов. Фосфонированная группа является обратно связанной с рифамицином через расщепляемый линкер.

Фосфонированные рифамицины синтезированы и продемонстрированы, как имеющие повышенное сродство к костным материалам. Ь νίνο эти фосфонированные соединения накапливаются в костях в количестве больше, чем количество нефосфонированных эквивалентов. Наличие рифамицинов в костях может быть продлено путям введения фосфонированных рифамицинов в соответствии с изобретением. Кроме того, значительная ίη νίνο защита против костной инфекции была демонстрирована в течение по крайней мере трех дней до инфекции у животных, инъецированных фосфонированными рифамицинами в соответствии с изобретением. Таким образом, соединения по изобретению особенно полезны для профилактики и/или лечения костных и суставных инфекций, а также костных инфекций, таких как остеомиелит.

B) Определения.

Для того чтобы обеспечить еще более ясное и более последовательное понимание изобретения, включая область, данную в настоящем описании конкретными терминами, предоставлены следующие общие определения.

Термин алкил относится к насыщенным алифатическим группам, включая группы с прямой цепью, группы с разветвленной цепью, циклические группы, и их комбинации, имеющие определенное число атомов углерода или, если число не определено, имеющих от 1 до 12 атомов углерода (предпочтительно от 1 до 6). Примеры алкильных групп включают, но без ограничения группы, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, неопентил, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклобутилметил, циклобутилэтил, циклопентилметил, циклопентилэтил и адамантил. Циклические алкильные группы (например, циклоалкил или гетероциклоалкил) могут состоять из одного кольца, включая, но без ограничения группы, такие как циклогептил, или многочисленные конденсированные кольца, включая, но без ограничения группы, такие как адамантил или норборнил.

Термин алкиларил относится к алкильной группе, имеющей определенное число атомов углерода, присоединенных к одной, двум или трем арильным группам. Термин Ν-алкиламинокарбонил относится к радикалу -Ο(Θ)ΝΗΚ, где Я представляет собой алкильную группу.

Термин Ν,Ν-диалкиламинокарбонил относится к радикалу -Ο(Θ)ΝΒ_ΗΒ_Η1. где Я_а и Я_ь, каждый независимо, представляют собой алкильную группу.

Термин алкилтио относится к радикалу -8Я, где Я представляет собой алкильную группу.

Термин алкокси, как используют в настоящем описании, относится к алкилу, алкенилу или алкинилу, связанным с атомом кислорода и имеющим определенное число атомов углерода или, если число не определено, имеющим от 1 до 12 атомов углерода (предпочтительно от 1 до 6). Примеры алкоксигрупп включают, но без ограничения группы, такие как метокси, этокси, трет-бутокси и аллилокси. Термин алкоксикарбонил относится к радикалу -С(О)ОЯ, где Я представляет собой алкил. Термин алкилсульфонил относится к радикалу -8О₂Я, где Я представляет собой алкильную группу.

Термин алкилен означает насыщенную двухвалентную алифатическую группу, включая группы с прямой цепью, группы с разветвленной цепью, циклические группы и их комбинации, имеющие определенное число атомов углерода или, если число не определено, имеющие от 1 до 12 атомов углерода (предпочтительно от 1 до 6), например, включая метилен, этилен, 2,2-диметилэтилен, пропилен, 2метилпропилен, бутилен, пентилен, циклопентилметилен и им подобные.

Термин замещенный алкил означает алкильную группу, как определено выше, которая является замещенной одним или большим количеством заместителей, предпочтительно от одного до трех заместителей, где заместители предпочтительно выбраны из группы, состоящей из галогена, алкила, арила, алкокси, ацилокси, амино, моно или диалкиламино, гидроксила, меркапто, карбокси, бензилокси, фенила, бензила, циано, нитро, тиоалкокси, карбоксальдегида, карбоалкокси и карбоксамида или функциональности, которая может быть соответствующим образом блокированной, если необходимо для целей изобретения, защитной группой. Фенильная группа может необязательно быть замещенной от одного до трех заместителями, где заместители предпочтительно выбраны из группы, состоящей из галогена, алкила, арила, алкокси, ацилокси, амино, моно или диалкиламино, гидроксил, меркапто, карбокси, бензилокси, бензила, циано, нитро, тиоалкокси, карбоксальдегида, карбоалкокси и карбоксамида. Примеры замещенных алкильных групп включают, но без ограничения, -СР₃, -СР₂-СР₃, гидроксиметил, 1- или 2

- 17 016059 гидроксиэтил, метоксиметил, 1- или 2-этоксиэтил, карбоксиметил, 1- или 2-карбоксиэтил, метоксикарбонилметил, 1- или 2-метоксикарбонил этил, бензил, пиридинилметил, тиофенилметил, имидазолинилметил, диметиламиноэтил и им подобные.

Термин замещенный алкилен означает алкиленовую группу, как определено выше, которая является замещенной одним или большим количеством заместителей, предпочтительно от одного до трех заместителей, где заместители предпочтительно выбраны из группы, состоящей из галогена, алкила, арила, алкокси, ацилокси, амино, моно или диалкиламино, гидроксила, меркапто, карбокси, бензилокси, фенила, бензила, циано, нитро, тиоалкокси, карбоксальдегида, карбоалкокси и карбоксамида или функциональности, которая может быть соответствующим образом блокированной, если необходимо для целей изобретения, защитной группой. Фенильная группа может необязательно быть замещенной от одного до трех заместителями, где заместители предпочтительно выбраны из группы, состоящей из галогена, алкила, арила, алкокси, ацилокси, амино, моно или диалкиламино, гидроксила, меркапто, карбокси, бензилокси, бензила, циано, нитро, тиоалкокси, карбоксальдегида, карбоалкокси и карбоксамида. Примеры замещенных алкильных групп включают, но без ограничения, -СР₂-, -СР₂-СР₂-, гидроксиметилен, 1- или 2-гидроксиэтилен, метоксиметилен, 1- или 2-этоксиэтилен, карбоксиметилен, 1- или 2-карбоксиэтилен и им подобные.

Термин алкенил относится к ненасыщенным алифатическим группам, включая группы с прямой цепью, группы с разветвленной цепью, циклические группы и их комбинации, имеющим определенное число атомов углерода или, если число не определено, имеющим от 1 до 12 атомов углерода (предпочтительно от 1 до 6), которые содержат по крайней мере одну двойную связь (-С=С-). Примеры алкенильных групп включают, но без ограничения, аллилвинил, -СН₂-СН=СН-СН₃, -СН₂-СН₂-циклопентенил и -СН2-СН2-циклогексенил, где этильная группа может быть присоединена к циклопентенильному, циклогексенильному остатку при любой возможной валентности углерода.

Термин алкенилен относится к ненасыщенным двухвалентным алифатическим группам, включая группы с прямой цепью, группы с разветвленной цепью, циклические группы и их комбинации, имеющим определенное число атомов углерода или, если число не определено, имеющим от 1 до 12 атомов углерода (предпочтительно от 1 до 6), которые содержат по крайней мере одну двойную связь (-С=С-). Примеры алкениленовых групп включают, но без ограничения, -СН=СН-, -СН2-СН=СН-СН2-, -СН2СН(циклопентенил)- и им подобные.

Термин алкинил относится к ненасыщенным алифатическим группам, включая группы с прямой цепью, группы с разветвленной цепью, циклические группы и их комбинации, имеющим определенное число атомов углерода или, если число не определено, имеющим от 1 до 12 атомов углерода (предпочтительно от 1 до 6), которые содержат по крайней мере одну тройную связь (-С=С-). Примеры алкинильных групп включают, но без ограничения, ацетилен, 2-бутинил и им подобные.

Термин алкинилен относится к ненасыщенным двухвалентным алифатическим группам, включая группы с прямой цепью, группы с разветвленной цепью, циклические группы и их комбинации, имеющим определенное число атомов углерода или, если число не определено, имеющим от 1 до 12 атомов углерода (предпочтительно от 1 до 6), которые содержат по крайней мере одну тройную связь (-С=С-). Примеры алкиниленовых групп включают, но без ограничения, -С=С-, -С=С-СН2- и им подобные.

Термин замещенный алкенил или замещенный алкинил относится к алкенильным и алкинильным группам, как определено выше, которые замещены одним или большим количеством заместителей, где заместители предпочтительно выбраны из группы, состоящей из галогена, алкила, арила, алкокси, ацилокси, амино, гидроксила, меркапто, карбокси, бензилокси, фенила, бензила, циано, нитро, тиоалкокси, карбоксальдегида, карбоалкокси и карбоксамида или функциональностью, которая может быть соответствующим образом блокированной, если необходимо для целей изобретения, защитной группой. Примеры замещенных алкенильных и алкинильных групп включают, но без ограничения, -СН=СР₂, метоксиэтенил, метоксипропенил, бромпропинил и им подобные.

Термин замещенный алкенилен или замещенный алкинилен относится к алкениленовым и алкиниленовым группам, как определено выше, которые замещены одним или большим количеством заместителей, где заместители предпочтительно выбраны из группы, состоящей из галогена, алкила, арила, алкокси, ацилокси, амино, гидроксила, меркапто, карбокси, бензилокси, фенила, бензила, циано, нитро, тиоалкокси, карбоксальдегида, карбоалкокси и карбоксамида или функциональности, которая может быть соответствующим образом блокированной, если необходимо для целей изобретения, защитной группой.

Термин арил или Аг относится к ароматической карбоциклической группе, состоящей из от 6 до 14 атомов углерода, имеющей одно кольцо (включая, но без ограничения группу, такую как фенил) или многочисленные конденсированные кольца (включая, но без ограничения группы, такие как нафтил или антрил) и включают обе незамещенную и замещенную арильные группы. Замещенный арил представляет собой арильную группу, которая является замещенной одним или большим количеством заместителей, предпочтительно от одного до трех заместителей, где заместители предпочтительно выбраны из группы, состоящей из алкила, арила, алкенила, алкинила, галогена, алкокси, ацилокси, амино, моно или диалкиламино, гидроксила, меркапто, карбокси, бензилокси, фенила, арилокси, бензила, циано, нитро,

- 18 016059 тиоалкокси, карбоксальдегида, карбоалкокси и карбоксамида или функциональности, которая может быть соответствующим образом блокированной, если необходимо для целей изобретения, защитной группой. Типичные примеры включают, но без ограничения, нафтил, фенил, хлорфенил, иодфенил, метоксифенил, карбоксифенил и им подобные. Термин арилокси относится к арильной группе, связанной с атомом кислорода по одному из кольцевых атомов углерода. Примеры алкоксигрупп включают, но без ограничения группы, такие как фенокси, 2-, 3- или 4-метилфенокси и им подобные. Термин арилтиогруппа относится к радикалу -8К_С, где К_с представляет собой арильную группу. Термин гетероарилтиогруппа относится к радикалу -8К1, где К,| представляет собой гетероарил.

Термин арилен относится к двухрадикальному производному от арила (включая замещенный арил), как определено выше, и представлен 1,2-фениленом, 1,3-фениленом, 1,4-фениленом, 1,2нафтиленом и им подобным.

Термин амино относится к группе -ΝΗ₂.

Термин Ν-алкиламино и Ν,Ν-диалкиламино означает радикал -ΝΗΚ и -ΝΚΚ' соответственно, где К и К' независимо представляют собой алкильную группу, как определено в настоящем описании. Типичные примеры включают, но без ограничения, Ν,Ν-диметиламино, Ν-этил-Н-метиламино, Ν,Νди(1-метилэтил)амино, Ν-циклогексил-Н-метиламино, Ν-циклогексил-Н-этиламино, Ν-циклогексил-Нпропиламино, Ν-циклогексилметил-Н-метиламино, Ν-циклогексилметил-Н-этиламино и им подобные.

Термин тиоалкокси означает радикал -8К, где К представляет собой алкил, как определено выше, например, включая метилтио, этилтио, пропилтио, бутилтио и им подобные.

Термин ацильная группа означает радикал -С(О)К, где К представляет собой водород, галоген, алкил, арил, гетероарил, алкокси, арилокси, Ν-алкиламино, Ν,Ν-диалкиламино, Ν-ариламино, тиоалкокси, тиоарилокси или замещенный алкил, где алкил, арил, гетероарил и замещенный алкил являются теми, как определено в настоящем описании.

Термин тиоацильная группа означает радикал -С(8)К, где К представляет собой водород, галоген, алкил, арил, гетероарил, алкокси, арилокси, Ν-алкиламино, Ν,Ν-диалкиламино, Ν-ариламино, тиоалкокси, тиоарилокси или замещенный алкил, где алкил, арил, гетероарил и замещенный алкил являются теми, как определено в настоящем описании.

Термин сульфонильная группа означает радикал -8О₂К, где К представляет собой водород, галоген, алкил, арил, гетероарил, алкокси, арилокси, Ν-алкиламино, Ν,Ν-диалкиламино, Ν-ариламино, тиоалкокси, тиоарилокси или замещенный алкил, где алкил, арил, гетероарил и замещенный алкил являются теми, как определено в настоящем описании.

Термин ацилокси означает радикал -ОС(=О)К, где К представляет собой водород, алкил, арил, гетероарил или замещенный алкил, где алкил, арил, гетероарил и замещенный алкил являются теми, как определено в настоящем описании. Типичные примеры включают, но без ограничения, формилокси, ацетилокси, циклогексилкарбонилокси, циклогексилметилкарбонилокси, бензоилокси, бензилкарбонилокси и им подобные.

Термины гетероалкил, гетероалкенил и гетероалкинил относятся к алкильным, алкенильным и алкинильным группам соответственно, как определено выше, которые содержат определенное число атомов углерода (или если число не определено, имеющих от 1 до 12 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 6), которые содержат один или большее количество гетероатомов, предпочтительно от одного до трех гетероатомов, как часть основной, разветвленных или циклических цепей в группы. Гетероатомы независимо выбраны из группы, состоящей из -ΝΒ-, -ΝΒΒ, -8-, -8(О)-, -8(О)₂-, -О-, -8К, -8(О)К, -8(О)₂К, -ОК, -РК-, -РКК, -Р(О)К- и -Р(О)КК (где каждый К представляет собой водород, алкил или арил); предпочтительно -ΝΒ, где К представляет собой водород, или алкил, и/или О. Гетероалкильные, гетероалкенильные и гетероалкинильные группы могут быть присоединены к остатку молекулы либо по гетероатому (если валентность является допустимой) или по атому углерода. Примеры гетероалкильных групп включают, но без ограничения группы, такие как -О-СН₃, -СН₂-О-СН₃, -СН₂-СН₂-О-СН₃, -8-СН₂-СН₂СН₃, -СН₂-СН(СН₃)-8-СН₃, -СН₂-СН₂-ЛН-СН₂-СН₃, 1-этил-6-пропилпиперидино, 2-этилтиофенил, пиперазино, пирролидино, пиперидино, морфолино и им подобные. Примеры гетероалкенильных групп включают, но без ограничения группы, такие как -СН=СН-СН₂-Ы(СН₃)₂ и им подобные.

Термин гетероарил или Нс1Лр относится к ароматическому одновалентному моноциклическому, двухциклическому или трехциклическому радикалу, содержащему 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- или 18-членные атомы кольца, включая 1, 2, 3, 4 или 5 гетероатомов, предпочтительно от одного до трех гетероатомов, включая, но без ограничения гетероатомы, такие как Ν, О, Р или 8, в кольце. Типичные примеры включают, но без ограничения единственное кольцо, такие как имидазолил, пиразолил, пиразинил, пиридазинил, пиримидинил, пирролил, пиридил, тиофен и им подобные или многочисленные конденсированные кольца, такие как индолил, хинолин, хиназолин, бензимидазолил, индолизинил, бензотиенил и им подобные.

Гетероалкильные, гетероалкенильные, гетероалкинильные и гетероарильные группы могут быть незамещенные или замещенные одним или большим количеством заместителей, предпочтительно от одного до трех заместителей, где заместители предпочтительно выбраны из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, бензила, галогена, алкокси, ацилокси, амино, моно или диалкиламино, гидроксила,

- 19 016059 меркапто, карбокси, бензилокси, фенила, арилокси, циано, нитро, тиоалкокси, карбоксальдегида, карбоалкокси и карбоксамида или функциональности, которая может быть соответствующим образом блокированной, если необходимо для целей изобретения, защитной группой. Примеры таких замещенных гетероалкильных групп включают, но без ограничения, пиперазин, пирролидин, морфолин или пиперидин, замещенный по атому азота или углерода с помощью фенильной или бензильной группы и присоединенный к остатку молекулы при любой допустимой валентности у атома углерода или азота, -ΝΗ-8(=Θ)₂фенил, -ЛН-(С=О)О-алкил, -NΗ-С(=О)О-алкиларил и им подобным. Гетероатом(ы) так же как атомы углерода группы могут быть замещенными. Гетероатом(ы) могут также быть в окисленном виде.

Термин гетероарилен относится к дирадикальной группе, производной от гетероарила (включая замещенный гетероарил), как определено выше, и представлен группами 2,6-пиридинилен, 2,4пиридинилен, 1,2-хиниолинилен, 1,8-хиниолинилен, 1,4-бензофуранилен, 2,5-пиридинилен, 2,5иодоленилен и им подобные.

Термины гетероалкилен, гетероалкенилен и гетероалкинилен относятся к дирадикальной группе, производной от гетероалкила, гетероалкенила и гетероалкинила (включая замещенный гетероалкил, гетероалкенил и гетероалкинил), как определено выше.

Термин карбоксальдегид означает -СНО.

Термин карбоалкокси означает -С(=О)ОК, где К представляет собой алкил, как определено выше, и включает группы, такие как метоксикарбонил, этоксикарбонил и им подобные.

Термин карбоксамид означает -С(=О^НК или -С(=О)ПКК', где К и К' независимо представляют собой водород, арил или алкил, как определено выше. Типичные примеры включают группы, такие как аминокарбонил, Ν-метиламинокарбонил, Ν,Ν-диметиламинокарбонил и им подобные.

Термин карбокси относится к радикалу -С(О)ОН.

Термин карбамоил относится к радикалу -С(О)ПИ₂.

Термин галоген или гало, как используют в настоящем описании, относится к С1, Вг, Р или I заместителям, предпочтительно фтор или хлор.

Термин гидрокси относится к -ОН радикалу.

Термин изомеры. Соединения, которые имеют идентичную молекулярную формулу (или композицию атомов), но различны по природе или последовательности связывания их атомов или расположения атомов в пространстве, определяют как изомеры. Изомеры, в которых связность между атомами является идентичной, но которые отличны по расположению их атомов в пространстве, определяют как стереоизомеры. Стереоизомеры, которые не являются зеркальным отображением друг к другу, определяют диастереомеры и те, которые не накладываются как зеркальное отображение друг друга, определяют как энантиомеры. Когда соединение имеет асимметричный центр, например, который связан с четырьмя различными группами, является возможной пара энантиомеров. Энантиомер может быть определен с помощью полной конфигурации его асимметричного центра и описан с помощью К- и 8секвенированных правил по Кану, Ингольду и Прелогу или с помощью методики, в которой молекула вращается в плоскости поляризованного света и обозначается как правовращающая или левовращающая (т.е. как (+)- или (-)-изомеры соответственно). Хиральное соединение может существовать в виде индивидуального энантиомера или в виде смеси. Смесь, содержащую энантиомеры в одинаковой пропорции, называют рацемическая смесь.

Соединения по настоящему изобретению могут обладать одним или большим количеством асимметричных центров. Поэтому такие соединения могут быть получены как индивидуальные (К)- или (8)стереоизомеры или как их смеси. Например, атомы углерода, пронумерованные 20, 22 и 24 в соединениях 9, 11 и 21, как описано в части иллюстративных примеров, когда каждый из них связан с атомом водорода, метильной группой и двумя различными метиленовыми группами и поэтому эти атомы углерода представляют собой асимметричные центры. Соединения 9, 11 и 21 могут существовать в виде стереоизомеров. Если иное не отмечено в других обстоятельствах, описание или наименование конкретного соединения в описании и формуле изобретения предназначены, чтобы включать оба индивидуальных энантиомера и их смеси, рацемическую или другую. Описание также предназначено, чтобы включать все возможные диастереомеры и их смеси. Способы определения стереохимии и отделения стереоизомеров хорошо известны среднему специалисту (см. исследование в Сйар!ег 4 о£ Абуапсеб Огдашс Сйетщйу, 4111 ебШоп I. Магсй, 1ойп \УПеу апб 8оп§, Νον Уогк, 1992).

Термин оптически чистый. Как в целом понятно среднему специалисту, оптически очищенное соединение является одним из тех, которое является энантиомерно чистым. Как используют в настоящем описании, термин оптически чистый предназначен для обозначения соединения, которое содержит, по крайней мере, достаточное количество одиного из энантиомеров, что дает на выходе соединение, имеющее желаемую фармакологическую активность.

Предпочтительно термин оптически чистый предназначен для обозначения соединения, которое содержит по крайней мере 90% одного изомера (80% энантиомерный избыток), предпочтительно по крайней мере 95% (90% е.е.), более предпочтительно по крайней мере 97.5% (95% е.е.) и более предпочтительно по крайней мере 99% (98% е.е.). Предпочтительно соединения по изобретению являются оптически чистыми.

- 20 016059

Термин защитная группа относится к химической группе, которая демонстрирует следующие характеристики: 1) селективные взаимодействия с желаемой функциональной группой с хорошим выходом, что дает защищенный субстрат, который является стабильным в намеченных реакциях, для которых защита желаема; 2) является селективно удаляемой из защищаемого субстрата, что дает на выходе желаемую функциональность; и 3) является удаляемой с хорошим выходом с помощью реагентов, совместимых с другой функциональной группой(ами), присутствующей или произведенной в таких реакциях по удалению. Примеры подходящих защитных групп могут быть найдены в Сгсспс с1 а1. (1991), Рго1ссйус Огоцрк ίη Огдашс Синтез, 2ηά Εά. Ποίιη \УПсу & §оп8, 1пс., Νο\ν Уогк). Предпочтительные аминозащитные группы включают, но без ограничения, бензилоксикарбонил (ΟΒζ), трет-бутилоксикарбонил (Вос), трет-бутилдиметилсилил (ΤΒΌΜ8), 9-флуренилметилоксикарбонил (Етос) или подходящие фотолабильные защитные группы, такие как 6-нитровератрилоксикарбонил (Жос). нитропиперонил, пиренилметоксикарбонил, нитробензил, диметилдиметоксибензил, 5-бром-7-нитроиндолинил и им подобные. Предпочтительные гидроксилзащитные группы включают ацетил (Ас), бензоил (Βζ), бензил (Вп), тетрагидропиранил (ТНР), ΤΒΌΜ8, фотолабильные защитные группы (такие как нитровератрилоксиметиловый эфир (Жот)), Мот (метоксиметиловый эфир) и Мет (метоксиэтоксиметиловый эфир). Особенно предпочтительные защитные группы включают ΝΡΕΟΟ (4-нитрофенэтилоксикарбонил) и ΝΡΕΟΜ (4-нитрофенэтилоксиметилоксикарбонил).

Термин пролекарство относится к соединению, которое может подвергаться обработке, чтобы высвободить активную молекулу лекарственного средства. Соединения формулы (I) и формулы (II) в соответствии с изобретением представляют собой пролекарства, поскольку линкер Ь может быть расщеплен, чтобы высвободить рифамицин. В особенности, пролекарства по настоящему изобретению включают соединения, которые высвобождают ίη угуо активный исходное лекарственное средство (т.е. соединения формулы А1, как определено в настоящем описании), когда такое пролекарство введят субъекту.

Пролекарства также включают комплекс пролекарственных соединений, который подвергается двум или большему количеству событий при обработке пролекарства. В соответствии с этим воплощением комплекс пролекарства высвобождают при обработке пролекарства формулы (I) или формулы (II), которое в свою очередь подвергается расщеплению, чтобы высвободить желаемый рифамицин.

Комплекс пролекарственных соединениий, в соответствии с настоящим изобретением, может быть получен путем модификации функциональной группы, присутствующей в фосфонированных рифамицинах, таких как гидроксильная и аминогруппы. Примеры комплекса пролекарств включают, но без ограничения, сложные эфиры (например, включая ацетатные, формиатные и бензоатные производные) и карбаматы (например, включая Ν,Ν-диметиламинокарбонил) гидроксифункциональных групп фосфонированных рифамицинов.

Термин фармацевтически приемлемое пролекарство предназначен для обозначения пролекарства фосфонированного рифамицина, такого как пролекарство соединения формулы (I) и/или формулы (II), в составе, который может быть введен субъекту, такому как млекопитающее, предпочтительно человек. Например, пролекарство может быть в составе, содержащим фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

Термин фармацевтически приемлемый активный метаболит предназначен для обозначения фармакологически активного продукта, полученного через метаболизм соединения формулы (I) или формулы (II) в организме, как определено в настоящем описании.

Термин фармацевтически приемлемый сольват предназначен для обозначения сольвата, который сохраняет биологическую эффективность и свойства биологически активных компонентов соединений формулы I и/или формулы II. Примеры фармацевтически приемлемых сольватов включают, но без ограничения, воду, изопропанол, этанол, метанол, ДМСО, этилацетат, уксусную кислоту и этаноламин.

Термин фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель означает любое соединение, раствор, субстанцию или продукт, который может быть использован в составе соединений по настоящему изобретению, чтобы быть введенным субъекту. В особенности, носители и наполнители по настоящему изобретению являются также полезными при получении фармацевтической композиции, которая в целом является безопасный, нетоксичной и ни биологически, ни каким-то другим причинам нежелательной и, которая может представлять фармакологически подходящие совокупности параметров и, которая включает носители и наполнитель, которые являются приемлемыми для ветеринарных применений, так же как для фармацевтического применения в отношении человека. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и наполнители хорошо известны среднему специалисту и могут быть определены среднем специалистом в виде клинических ситуационных предписаний. Среднему специалисту будет понятно, что разбавители включены в область терминов носителей и наполнителей. Примеры подходящих носителей и наполнителей включают физиологический раствор, буферный физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол, в особенности: (1) фосфатный буферный физиологический раствор Дульбекко, значение рН равно приблизительно 7.4, содержащему около от 1 до 25 мг/мл человеческого сывороточного альбумина, (2) 0.9% физиологический раствор (0.9% (вес./об.) ΝαΟ), (3) 5% (вес./об.) декстрозу и (4) воду.

Термин фармацевтически приемлемая соль предназначен для обозначения соли фосфонированно

- 21 016059 го рифамицина, такой как соль соединения формулы (I) и/или формулы (II), в составе, который может быть введен субъекту, такому как млекопитающее, предпочтительно человек. Например, соль может быть в составе, содержащем фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

Термин соль. Фосфонированные рифамицины по настоящему изобретению может находиться в виде соли. Определение соли фосфонированных рифамицинов по настоящему изобретению означает соль, которая сохраняет или улучшает биологическую эффективность и свойства свободных кислот и оснований исходного соединения, как определено в настоящем описании, или которая использует преимущество заряженной функциональности на молекуле и которая не является биологически или иначе нежелательной. Такие соли включают следующие:

(1) кислотно-аддитивные соли, образованные неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и им подобные; или образованные органическими кислотами, такими уксусная кислота, пропионовая кислота, капроновая кислота, циклопентанпропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, молочная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, 3-(4-гидроксибензоил)бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 1,2этандисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 4хлорбензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 4-толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота, 3-фенилпропионовая кислота, триметилуксусная кислота, третичная бутилуксусная кислота, лаурилсерная кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гидроксинафтойная кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, муконовая кислота и им подобные;

(2) соли, образованные, когда кислотный протон, присутствующий в исходном соединении, или замещается ионом металла, например, ионом щелочного металла, ионом щелочно-земельного металла или ионом алюминия; или координируется органическим основанием, таким как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, трометамин, Ν-метилглюкамин и им подобные; или (3) соли образованные, когда заряженная функциональность присутствует на молекуле и присутствует подходящий противоион, такой как функциональность тетраалкил(арил)аммония и ион щелочного металла, функциональность тетраалкил(арил)фосфония и ион щелочного металла, функциональность имидазолия и ион щелочного металла и им подобные.

Как используют в настоящем описании, термины кость, костная ткань или костные ткани относится к плотной, полуригидной, пористой, окаменелой соединительной ткани, формирующей основную часть скелета большинства позвоночных животных. Он также охватывает зубы, костно-суставные ткани и кальцинаты, которые часто встречаются на стенках атеросклеротических сосудов.

Как используют в настоящем описании, термины рифамицин и рифамицины означают оба соединения, идентифицированные как сам рифамицин, так же как все производные соединения, имеющие антимикробную активность, понятные среднему специалисту, чтобы быть отнесенным к рифамициновому классу соединений. Эти производные соединения могут быть по-разному определены в настоящем изобретении как рифамициновые производные антимикробных молекул, рифамициновые производные молекул, рифамициновые производные антибактериальных агентов и рифамициновые производные. Такие связанные термины имеют идентичные значения и относятся к антимикробным агентам, которые являются частью хорошо известного класса рифамицины, как описано более подробно в настоящем изобретении. Такие производные соединения являются химическими аналогами рифамицина, которые имеют антимикробную (например, включая антибактериальную) активность. Эти производные определены для среднего специалиста, как аналогичные по структуре рифамицина, но они также включают те химические соединения, которые традиционно не определены как рифамицин. Рифамициновые производные включают, но без ограничения, такие соединения формулы (ΙΑ) по настоящему изобретению. Конкретные примеры включают рифампицин (И8 3342810), рифапентин (И8 4002752), рифандин (И8 4353826), рифабутин (И8 4219478), рифалазил (И8 4983602) и рифаксимин (И8 4341785).

Термин фосфонированная группа предназначен для обозначения любого соединения, нетоксичного человеку, имеющего по крайней мере один атом фосфора, связанный по крайней мере с тремя атомами кислорода, и имеющего определяемое сродство к костным тканям, как описано в дальнейшем.

Термин антибактериальный включает те соединения, которые ингибируют, останавливают или обращают рост бактерии, те соединения, которые ингибируют, останавливают или обращают рост бактериальных ферментов или биохимические пути метаболизма, те соединения, который убивают или повреждают бактерию, и те соединения, который блокируют или замедляют развитие бактериальной инфекции.

Термины обработка и лечение предназначен для обозначения, по крайней мере, облегчения патологического состояния, связанного с бактериальной инфекцией у субъекта, включая млекопитающих, таких как человек, которое облегчают путем подавления роста, репликации и/или распространения любой бактериальной инфекции, такой как грамположительные или грамотрицательные организмы, и включает лечение, заживление, ингибирование, снижение от улучшения и/или облегчения, полностью или частично, патологического состояния.

- 22 016059

Термин профилактика предназначен для обозначения, по крайней мере, в подавлении вероятности, что условие болезни, связанное с бактериальной инфекцией, разовьется у субъекта, такого как млекопитающее, предпочтительно человек. Термины предотвращать и предупреждение предназначены для обозначения блокирования или остановки патологического состояния, связанного с развитием бактериальной инфекцией у субъекта, такого как млекопитающее, предпочтительно человек. В особенности, термины связаны с лечением субъекта, чтобы уменьшить вероятность (профилактика) или предотвратить возникновение бактериальной инфекции, такой как бактериальная инфекция, которая может встречаться во время или после хирургии, вовлекающей репарацию кости или реплантацию. Термины также включают ослабление вероятности (профилактика) или предотвращение бактериальной инфекции, когда у млекопитающего найдена предрасположенность к приобретению условия заболевания, но еще не диагностированно его наличие. Например, можно уменьшить вероятность или предотвратить бактериальную инфекцию у субъекта путем введения соединения формулы (I) и/или формулы (II) или его фармацевтически приемлемого пролекарства, соли, активного метаболита или сольвата, перед возникновением такой инфекции.

Термин субъет предназначен для обозначения животного, таких птиц или млекопитающие, включая людей и ветеринарных животных или важных для сельского хозяйства, таких как собаки, кошки, лошади, овцы, козы и крупный рогатый скот.

С) Соединения по изобретению.

Как будет описано в дальнейшем в эксперементальной части, получены фосфонированные рифамицины, имеющие высокое сродство связывания с костными тканями.

Г _В----(_]---д

I (I) где В представляет собой фосфонированную группу;

Ь представляет собой расщепляемый линкер связывания В с А; η имеет значение 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, предпочтительно 1, 2 или 3; А представляет собой рифамицин.

Как упомянуто ранее, сущность изобретения заключается в присутствии фосфонированной группы, обратно связанной с рифамицином через расщепляемый линкер с целью увеличения сродства, связывания, накопления и/или времени удержания рифамицина на или в костях, допуская его постепенное высвобождение через распад расщепляемого линкера или высвобождение соединения из кости.

Фосфонаты.

Все нетоксичные фосфонированные группы, имеющие высокое сродство к кости, из-за их способности связать ионы Са²⁺, найденные в гидроксиапатите, формирующем костные ткани, являются подходящими в соответствии с настоящим изобретением. Подходящие примеры фосфонированных групп могут быть найдены в XVО 04/026315 (Пех Опсо1о§у Кекеагсй), И8 6214812 (МВС Кекеагсй), И8 5359060 (Р&ег), И8 5854227 и И8 6333424 (Εΐί/апог Рйагш.), И8 6548042 (Лг51аб апб 8ка11е1Ьо1) и νΟ 2004/089925 (8ешарйоге РйагшасеиИсаП).

Примеры бисфосфонатных и трисфосфонатных групп, подходящих для настоящего изобретения, включают, но без ограничения, те, которые имеют формулы:

где каждый К* независимо выбран из группы, состоящей из Н, низшего алкила, циклоалкила, арила и гетероарила, при условии, что по крайней мере два, предпочтительно три К* представляют собой Н;

К₄ представляет собой СН₂, О, 8 или ΝΗ;

каждый К₅ независимо выбран из группы, состоящей из Н, К₆, ОК₆, ΝΚ₆ и 8К₆, где К₆ представляет собой Н, низший алкил, циклоалкил, арил, гетероарил или ΝΗ₂;

Хотя монофосфонаты, бисфосфонаты и трис- или тетрафосфонаты могут потенциально быть использованы, бисфосфонаты являются предпочтительными. Более предпочтительно бисфосфонатная

- 23 016059 группа представляет собой бисфосфонат -СН(Р(О)(ОН)₂)₂-. Как показано в примере 3 в дальнейшем, рифамицины, обладающие такой бисфосфонатной группой, имеют сильное сродство связывания с костным порошком. Конечно, могут быть выбраны другие виды фосфонированной группы и синтезированы средним специалистом. Примером фосфонированной группы может быть эстераз-активированный бисфосфонатный радикал (УеркаЫиеи 1., Сиггеи! Мебюта1 Сйетщйу, 9, 1201-1208, 2002) или им может быть любое другое подходящее пролекарство. Эти и другие подходящие фосфонированные группы охвачены настоящим изобретением.

Рифамицины.

Рифамицины представляют собой хорошо известный класс полусинтетических антимикробных агентов. Рифампин (также, как правило, описан как рифампицин) (И8 3342810), рифапентин (И8 4002752), рифабутин (И8 4219478) и рифалазил (И8 4983602) находятся в числе хорошо известных соединений в этом классе. Эти лекарственные препараты являются хорошо проверенными экономически и клинически. Настоящее изобретение не ограничено конкретным рифамицином, но охватывает рифамициновые производные антимикробных молекул, имеющих подходящую антимикробную активность, включая, но без ограничения, рифандин (И8 4353826) и рифаксимин (И8 4341785), так же как другие рифамициновые производные и гибриды, такие как те, которые описаны в И8 2003/0105086, 2005/0043298, 2005/0143374, 2005/0203076, 2005/0203085, 2005/0209210, 2005/0256096, 2005/0261262, 2005/0277633, 2006/0019985 и 2006/0019986 или те, которые описаны в \УО 03045319 и 03051299, так же как заявках 2004034961 и 2005062882. Средний специалист быстро получит рифамициновые производные антимикробных молекул в соответствии с изобретением. Если необходимо, средний специалист может обратиться к ряду литературных источников из уровня техники, включая И8 патенты, РСТ патентные заявки и научные публикации, перечисленные выше и включенные в настоящее изобретение как ссылка.

В соответствии с одним из воплощений рифамицины для применения в соответствии с изобретением выбирают из соединений, попадающих в следующую общую формулу (А1), представленную ниже:

где X представляет собой Н- или К1СО-, где Κι представляет собой замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-6 атомов углерода;

каждый Υ независимо выбран из группы, состоящей из Н- и КО-, где Κ представляет собой Н-, Κιили К1СО-, с Κι, определенным выше;

он о он о о он он

где Κ2 представляет собой Н-, замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-10 ато мов углерода, или диалкиламиногруппу, предпочтительно указанная диалкиламиногруппа представляет собой замещенный пиперидин, замещенный морфолин или замещенный пиперазин;

Κ3 представляет собой Н- или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-7 атомов углерода;

Κ4 представляет собой гидроксильную группу, сульфогидрильную группу или замещенную или не- 24 016059 замещенную алкильную цепь, состоящую из 1-3 атомов углерода;

V представляет собой кислород или -ΝΚ₂ с Κ₂, определенным выше;

ίΗ \ν₂ представляет собой замещенный или незамещенный метилен, включая - где К₅ и К₆ независимо представляют собой Н- или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-5 атомов углерода и Ζ' представляет собой атом кислорода, атом серы, замещенный метилен, карбонил, -ΝΚι или -Ν(Ο)Κι, где Κι определен выше;

Т представляет собой галоген или Κ₂, где К₂ определен выше;

В соответствии с одним из особенных воплощений рифамицин представляет собой рифампицин, его хиноновую форму, его деацетилированную форму или деацетилированную форму его хиноновой формы. В соответствии с другим особенным воплощением рифамицин представляет собой гидразон 1амино-4-(2-гидроксиэтил) пиперазина и 3-формилрифамицина 8 (соединение 9 в примере 1), его хиноновую форму, его деацетилированную форму или деацетилированную форму его хиноновой формы. В соответствии с другим особенным воплощением рифамицин представляет собой рифабутин или его деацетилированную форму. В соответствии с другим особенным воплощением рифамицин представляет собой рифапентин, его хиноновую форму, его деацетилированную форму или деацетилированную форму его хиноновой формы. В соответствии с другим особенным воплощением рифамицин представляет собой рифалазил или его деацетилированную форму. В соответствии с другим особенным воплощением рифамицин представляет собой рифамиксин или его деацетилированную форму. В соответствии с другим особенным воплощением рифамицин представляет собой рифандин, его хиноновую форму, его деацетилированную форму или деацетилированную форму его хиноновой формы. В соответствии с другим особенным воплощением рифамицин представляет собой соединение 56 в примере 1 или его деацетилированную форму. В соответствии с другим особенным воплощением рифамицин представляет собой соединение 63 в примере 1 или его деацетилированную форму. В соответствии с другим особенным воплощением рифамицин представляет собой соединение 69 в примере 1 или его деацетилированную форму. Химические структуры этих молекул представлены в дальнейшем. Стрелки показывают предпочтительные места присоединения фосфонированной группы.

- 25 016059

- 26 016059

- 27 016059

Рифамиксин

Деацетилированный рифамиксин

- 28 016059

- 29 016059

Конкретные примеры фосфонированных рифамицины в соответствии с изобретением представлены в эксперементальной части. Настоящее изобретение также охватывает фосфонированные рифамицины, имеющие более чем одну фосфонированную группу. Как упомянуто ранее, указанные выше установленные места присоединения являются только предпочтительными местами привязывания фосфонированной группы и всех других потенциальных мест (например, на любом из гидроксильных групп рифамицина) входят в область настоящего изобретения.

Линкеры.

Расщепляемый линкер Ь ковалентно и обратимо связывает фосфонированную группу В с рифамицином А. Как используют в настоящем описании, термин расщепляемый относится к группе, которая химически или биохимически является нестабильной в физиологических условиях. Химическая нестабильность предпочтительно заканчивается непосредственным распадом из-за обратимого химического процесса, внутримолекулярной химической реакции или гидролиза (т.е. расщепление молекулы или группы на две или большее число новых молекулы или групп благодоря решетчетому внедрению одной или большего числа молекул воды), когда это зависит от межмолекулярной химической реакции.

Расщепление линкера может быть очень быстрым или очень медленным. Например, период полураспада расщепляемого линкера может быть от приблизительно 1 мин, приблизительно 15 мин, приблизительно 30 мин, приблизительно 1 ч, приблизительно 5 ч, приблизительно 10 ч, приблизительно 15 ч, приблизительно 1 день или приблизительно 48 ч. Расщепляемый линкер может быть линкером, чувствительным к ферменту, который расщепляется селективно под воздействием определенных ферментов (например амидаза, эстераза, металлопротеиназа, и так далее) или может быть восприимчив к расщеплению другими химическими средствами, такими как, но без ограничения, катализом кислотой/основанием или саморасщеплением. Например, чувствительный эстеразо-линкер, который является расщепляемым только костно-специфическими эстеразами (Собшд е! а1. ВюсЫт Вюрйук Ас1а (2003), 1638(1):1-19) или костно-специфическими металлпротеиназами (ММР) (Казаке е! а1., Сйи Ортор. (1986), 211:244-51; Тискегтапп е! а1., ПШегеийаИои (2001), 69(1):49-57; §е11ег8 е! а1., Вюсйет 1. (1978), 171 (2):493-6) или путем воздействия щелочных фосфатаз, высвобождая таким образом, что может быть использовано в нужном месте воздействия рифамицина. Подобным образом может быть использован расщепляемый линкер, который не является слишком легко расщепляемым в плазме, позволяя таким образом достигнуть и накопиться внутри костных тканей достаточному количеству фосфонированного рифамицина, прежде, чем быть расщепленным, чтобы высвободить его. Например, линкер может быть отобран таким образом, что только 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 или 70% костно-связанного антибиотика высвобождается через период в пределах до 1 мин, 15 мин, 30 мин, 1 ч, 5 ч, 10 ч, 15 ч, 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, одной недели, двух недель, трех недель или более после введения соединения по изобретению. Предпочтительно линкер выбирают таким образом, чтобы высвобождалось в день только приблизительно от 1 до приблизительно 25% костно-связанного рифамицина. Выбор линкера может варьи- 30 016059 роваться в соответствии с факторами, такими как (1) место присоединения фосфонированной группы к рифамицину, (ίί) применяемый тип фосфонированной группы; (ш) применяемый тип рифамицина и (ίν) желаемая легкость расщепления линкера и сопутствующее высвобождение рифамицина.

Предпочтительно линкер Ь связывает фосфонированную группу В с рифамицином А через одну или большее количество гидроксильных групп на А, через один или большее количество атомов азота на А, через одну или большее количество сульфгидрильных групп на А или комбинации из одной или большего количества гидроксильных групп, одного или большего количества атомов азота и/или одной или большего количества сульфгидрильных групп на А. Между 1 и 7 фосфонированными группами может быть связано с А через любую комбинацию линкеров Ь.

Когда Ь связывает В с А через гидроксильную группу на А, предпочтительно Ь представляет собой один из следующих линкеров:

- 31 016059

с.| имеет значение 2 или 3;

г имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5;

и \\₂ являются целыми числами >0, такими, что их сумма (^₁+^₂) равна 1, 2 или 3; каждый Я_ъ независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила, предпочтительно Н; В представляет собой фосфонированную группу;

Когда Ь связывает В с А через атом азота на А, предпочтительно Ь представляет собой один из следующих линкеров:

о ° (НО)Х'

с.| имеет значение 2 или 3;

каждый Я. независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила, предпочтительно Н;

Я_а представляет собой С_хН_у, где х является целым числом от 0 до 20 и у является целым числом от 1 до 2х+1;

X представляет собой СН₂, -СОХЯ_Ь-, -СО-О-СН₂- или -СО-О-;

А_а представляет собой атом азота на А.

Когда Ь связывает В с А через сульфогидрильную группу на А, предпочтительно Ь представляет собой один из следующих линкеров:

- 32 016059

с.| имеет значение 2 или 3;

г имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5;

и \\₂ являются целыми числами такими, что их сумма (^₁+^₂) равна 1, 2 или 3;

каждый К_ъ представляет собой независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила, предпочтительно Н;

- 33 016059

часть структуры ' линкера представляет собой сульфогидрильный остаток А.

В соответствии с другим особенным воплощением соединения по изобретению представлены формулой (II) или их фармацевтически приемлемой солью либо пролекарством

(И) где Οι представляет собой Н-, Я1СО- или Ц-, где Я1 представляет собой замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-6 атомов углерода;

каждый независимо выбран из группы, состоящей из Н-, ЯО- и Ь₂О-, где Я представляет собой Н-, Я1- или Я1СО-, с Я1, определенным выше;

каждый 0₃, независимо выбран из группы, состоящей из Н- и Ь₃-;

ОН О ОН О О ОН

А2

АЗ

А4

А9 ‘2

Р4

А10 где Я₂ представляет собой Н-, замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-10 атомов углерода, или диалкиламиногруппу, предпочтительно указанная диалкиламиногруппа представляет собой замещенный пиперидин, замещенный морфолин или замещенный пиперазин, где когда Я₂ замещен алкильной цепью, состоящей из 1-10 атомов углерода, замещенный пиперидин, замещенный морфолин или замещенный пиперазин, то заместитель является одним из членов, выбранных из группы, состоящей из Ь₄О-, Ь₅8- и Ε₆ΝΚ₇-, где Я₇ представляет собой замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-7 атомов углерода;

Я3 представляет собой Н-, замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-7 атомов углерода или Ь₇-;

Я4 представляет собой гидроксильную группу, сульфогидрильную группу или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-3 атомов углерода, Ь₈О- или Ь₉О-;

\ν₂ представляет собой замещенный или незамещенный метилен, включая ^к · где Я₅ и Я₆ независимо представляют собой Н- или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-5 атомов углерода, и Ζ' представляет собой атом кислорода, атом серы, замещенный метилен, карбонил, -ΝΕ₁ или -^О)Я_Ь где Я! определен выше;

Ζ представляет собой О, 8 или ΝΚ₃, где Я₃ определен выше;

- 34 016059

с.| имеет значение 2 или 3;

г имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5;

каждый К.|, независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила, предпочтительно Н; каждый Ь₆ и Ь₇ представляет собой расщепляемый линкер, независимо выбранный из группы, состоящей из:

^ΒΧτνν ⁰ _Βί° * °. * ⁰

- 35 016059

с.| имеет значение 2 или 3;

К представляет собой С_хН_у, где х является целым числом от 0 до 20 и у является целым числом от 1 до 2х+1;

и где каждый К* независимо выбран из группы, состоящей из Н, низшего алкила, циклоалкила, арила и гетероарила, при условии, что по крайней мере два К* представляют собой Н;

каждый Х₁ независимо выбран из группы, состоящей из Н, ОН, ΝΗ₂, галогеновой группы; при условии, что по крайней мере присутствует один из Ц, Ь₂, Ь₃, Ь₄, Ь₅, Ь₆, Ь₇, Ь₈ и Ь₉.

Настоящее изобретение также включает использование единственной фосфонированной группы, связанной с двумя или более антибактериальными молекулами. В таких случаях, антибактериальные молекулы могут быть одинаковыми (например, две молекулы рифамицина) или различными (например, одна молекула фторхинолонового антибактериального ципрофлоксацина (С1рго®; И8 4670444) и одна молекула рифамицина). Фосфонированная группа может также быть связана с аналогичными группами (например, гидроксильными группами) или с различными группами (например, карбоксильной группой из одной фторхинолоновой молекулы и гидроксильной группой рифамицина).

Неограничивающий перечень полезных антибиотиков, с которыми соединения по настоящему изобретению могут быть связаны через единственную фосфонированную группу, включают сульфонамиды, бета-лактамы, тетрациклины, хлорамфеникол, аминогликозиды, макролиды, глюкопептиды, стрептограмины, хинолоны, фторхинолоны, оксазолидиноны и липопептиды. В особенности, тетрациклин, антибактериальные агенты, представляющие собой тетрациклиновое производное, глицилциклин, антибактериальные агенты, представляющие собой глицилциклиновое производное, миноциклин, антибактериальные агенты, представляющие собой миноциклиновое производное, оксазолидиноновые антибактериальные агенты, аминогликозидные антибактериальные агенты, хинолоновые антибактериальные агенты, ванкомицин, антибактериальные агенты, представляющие собой ванкомициновое производное, теикопланин, антибактериальные агенты, представляющие собой теикопланиновое производное, эремомицин, антибактериальные агенты, представляющие собой эремомициновое производное, хлорэремомицин, антибактериальные агенты, представляющие собой хлорэремомициновое производное, даптомицин и антибактериальные агенты, представляющие собой даптомициновое производное, являются предпочтительными.

Примеры потенциально полезных, расщепляемых, мультиантибактериальных линкеров в соответствии с изобретением включают, но без ограничения, те, которые имеют структуры:

- 36 016059

где каждый Кд независимо представляет собой алкильную или арильную группу;

р равно 0 или целому числу <10, предпочтительно 0, 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно 0 или 1; часть структуры о ⁴ линкера представляет собой гидроксильный остаток рифамицина А;

А₃ представляет собой аминовую группу рифамицина А;

о часть структуры линкера представляет собой карбоксильный остаток антимикробного фторхинолона.

Из-за их высокого сродства к костным тканям фосфонированная группа В вероятно остается связанной с костными тканями на длительный период времени (до нескольких лет). Поэтому очень важно, что фосфонированная группа имела низкую или предпочтительно не имела определяемую токсичность. Согласно другому воплощению фосфонированная группа В и линкер Ь выбирают таким образом, что линкер гидролизуется или расщепляется ίη νίνο (предпочтительно главным образом в костных тканях) таким образом высвобождая: (1) рифамицин А и (и) выбранную нетоксичную фосфонированную молекулу, имющую проверенную костную терапевтическую активность. Такие соединения, следовательно, несут двойную пользу, а именно: 1) локальное обеспечение, направленное на кости, в течение длительного промежутка времени и/или при увеличенных концентрациях, антибиотика, применяемого в предотвращении и/или лечении бактериальной костной инфекции, и 2) обеспечение, направленное на кости, лекарственного средства, стимулирующего регенерацию кости или ингибирующую резорбцию кости, таким образом облегчая освобождение кости от повреждений, вызванных инфекцией или другой раной. Подходящие фосфонированные молекулы с доказанной костной терапевтической активностью, применимые в соответствии с изобретением, включают, но без ограничения, ризедронат и олпадронат (другие такие как памидронат, алендронат, инкадронат, этидронат, ибандронат, золендронат или неридронат), молекулы, являющиеся известными бисфосфонатными ингибиторами резорбции кости, обычно используют для лечения остеопороза.

- 37 016059

Представленные ниже демонстрируют принципы указанного воплощения:

Настоящее изобретение также включает применение рН-чувствительного линкера, который расщепляют только в предварительно заданном диапазоне рН. В одном из воплощений рН-чувствительный линкер представляет собой чувствительный к основанию линкер, который расщепляют при основном значении диапзона рН от приблизительно 7 до приблизительно 9. В соответствии с другим воплощением линкер представляет собой чувствительный к кислоте линкер, который расщепляют при кислотном значении диапзона рН от приблизительно 7.5 до приблизительно 4, предпочтительно от приблизительно 6.5 и ниже. Предполагают, что такой чувствительный к кислоте линкер позволяет специфическое высвобождение рифамицина А главным образом на участке бактериальной инфекции, потому что известно, что подкисление тканей обычно происходит во время инфекции (О'ВеШеу с1 а1., АпйтюгоЫа1 Адепй апб СйетоШегару (1992), 36(12):2693-97).

Ковалентная связь или нерасщепляемый линкер может также ковалентно связать фосфонированную группу В с рифамицином А. Такая связь или линкер должен быть выбран таким образом, что не будет расщепляться или будет расщепляться в основном с помощью бактерии, присутствующей на фактическом месте инфекции. Предполагают, что для таких соединений фосфонированная группа остается связанной рифамицином А и все соединение постепенно высвобождается из кости и поглощается бактериями, при этом проявляется антибактериальный эффект.

Конечно, могут быть выбраны и синтезированы средним специалистом другие типы линкеров. Например линкер может также содержать ίη νίνο гидролизуемую фосфонированную группу, имеющую сродство к костям, как раскрыто в 11ех Опсо1о§у Векеагсй в АО 04/026315. Линкер может также содержать активную группу (например, высвобождаемая группа, стимулирующая формирование кости или подавляющая резорбцию кости). Эти и другие подходящих линкеры охвачены настоящим изобретением.

В дополнение к указанным соединениям, описанным выше и в эксперементальной части, дополнительные соединения формулы (I) в соответствии с изобретением включают, но без ограничения, те, которые имеют следующие формулы:

- 38 016059

- 39 016059

- 40 016059

- 41 016059

- 42 016059

- 43 016059

- 44 016059

- 45 016059

- 46 016059

- 47 016059

Кроме того, настоящее изобретение охватывает соединения формулы (I) и формулы (II), так же как их фармацевтически приемлемые соли, метаболиты, сольваты и пролекарства. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но без ограничения, сульфаты, пиросульфаты, бисульфаты, сульфиты, бисульфиты, фосфаты, моногидрофосфаты, дигидрофосфаты, метафосфаты, пирофосфаты, хлориды, бромиды, иодиды, ацетаты, пропионаты, деканоаты, каприлаты, акрилаты, формиаты, изобутираты, капроаты, гептаноаты, пропиолаты, оксалаты, малонаты, сукцинаты, субераты, себакаты, фумараты, малеаты, бутин-1,4-диоаты, гексин-1,6-диоаты, бензоаты, хлорбензоаты, метилбензоаты, динитробензоаты, гидроксибензоаты, метоксибензоаты, фталаты, сульфонаты, ксилолсульфонаты, фенилацетаты, фенилпропионаты, фенилбутираты, цитраты, лактаты, гамма-гидроксибутираты, глюколаты, татраты, метансульфонаты, пропансульфонаты, нафталин-1-сульфонаты, нафталин-2- сульфонаты и манделаты.

Если соединение по изобретению представляет собой основание, желаемая соль может быть получена с помощью любого подходящего способа, известного среднему специалисту, включая обработку свободного основания неорганической кислотой, такой как соляная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и им подобные или органической кислотой, такой как как уксусная кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, миндальная кислота, фумаровая кислота, малоновая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, гликолевая кислота, салициловая кислота, пиранозидильные кислоты, такие как глюкуроновая кислота и галактуроновая кислота, альфа-окси кислоты, такие как лимонная кислота и винная кислота, аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, кислоты ароматического ряда, такие как бензойная кислота и коричная кислота, сульфокислоты, такие как п-толуолсульфоновая кислота или этансульфоновая кислота или им подобные.

Если соединение по изобретению представляет собой кислоту, желаемая соль может быть получена с помощью любого подходящего способа, известного среднему специалисту, включая обработку кисло

- 48 016059 ты неорганическим или органическим основанием, таким как амин (первичный, вторичный, или третичный), гидроксидом щелочного или щелочно-земельного металла или им подобные. Иллюстративные примеры подходящих солей включают органические соли, полученные из аминокислот, таких как аминоуксусная кислота и аргинин, аммиак, первичные, вторичные и третичные амины и циклические амины, такие как пиперидин, тетрагидрооксазин и пиперазин и неорганические соли, полученные из натрия, кальция, калия, магния, марганца, железа, меди, цинка, алюминия и лития.

В случае соединений, солей, пролекарств или сольватов, которые представляют собой твердые вещества, среднему специалисту понятно, что соединения по изобретению, соли и сольваты могут существовать в различных кристаллических формах, которые все предназначены, чтобы быть в границах настоящего изобретения.

Соединения по изобретению могут существовать как единственные стереоизомеры, рацематы и/или смеси энантиомеров и/или диастереомеров. Все такие единственные стереоизомеры, рацематы и их смеси предназначены, чтобы быть в границах настоящего изобретения. Предпочтительно соединения по изобретению используют в оптически чистом виде.

Соединения формулы (I) и/или формулы (II) вводят в виде пролекарства, которое распадается в организме человека или животного, что дает соединение формулы (I) или формулы (II). Примеры пролекарства включают ίη νίνο гидролизуемые эфирные соединения формулы (I) и/или формулы (II).

Ση νίνο гидролизуемое эфирное соединение формулы (I) и/или формулы (II), содержащее карбоксильную или гидроксильную группу представляет собой, например, фармацевтически приемлемый эфир, который гидрализуют в организме человека или животного для получения исходной кислоты или спирта. Подходящие фармацевтически приемлемые эфиры для карбоксильной группы включают (16С)алкоксиметиловые эфиры, например метоксиметил, (1-6С)алканоилоксиметиловые эфиры, например пивалоилоксиметил, фталидиловые эфиры, (3-8С)циклоалкоксикарбонилокси(1-6С)алкиловые эфиры, например 1-циклогексилкарбонилоксиэтил; 1,3-диоксолен-2-онилметиловые эфиры, например 5-метил1,3-диоксолен-2-онилметил; и (1-6С)алкоксикарбонилоксиэтиловые эфиры, например 1метоксикарбонилоксиэтил и могут быть образованы при любой карбоксигруппе в соединениях по настоящему изобретению.

Ш νίνο гидролизуемое эфирное соединение формулы (I) и/или формулы (II), содержащее гидроксигруппу, включает неорганические эфиры, такие как фосфатные эфиры и альфа-ацилоксиалкиловые эфиры и связанные соединения, которые в результате ίη νίνο гидролиза эфира распадаются, что дает исходную гидроксигруппу. Примеры альфа-ацилоксиалкиловых эфиров включают ацетоксиметокси и 2,2диметилпропионилоксиметокси. Выбор ίη νίνο гидролизуемого эфира формирующей группы для гидроксильной группы включают алканоил, бензоил, фенилацетил и замещенный бензоил и фенилацетил, алкоксикарбонил (что дает алкилкарбонированные эфиры), диалкилкарбамоил и №(диалкиламиноэтил)-№ алкилкарбамоил (что дает карбаматы), диалкиламиноацетил и карбоксиацетил.

Ό) Способы получения.

Соединения по изобретению и их соли, сольваты, кристаллические формы, активные метаболиты и пролекарства, могут быть получены с помощью применяемых методик, доступных среднему специалисту, используя исходные продукты, которые являются легко доступными. Определенные новые и типичные способы получения соединений по изобретению описаны в эксперементальной части. Такие способы находятся в границах настоящего изобретения.

Е) Антимикробные композиции и способы лечения.

Связанный изобретением аспект касается применение соединений по изобретению в виде активного ингредиента в терапевтической или антибактериальной фармацевтической композиции для лечения, профилактических или предупреждающих целей.

Фармацевтические композиции.

Соединения по настоящему изобретению могут быть составлены в виде фармацевтически приемлемых композиций.

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие соединение по настоящему изобретению (например, включая те соединения формулы (I) и (II)) в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем. Предпочтительно соединение по настоящему изобретению в фармацевтической композиции является терапевтически эффективным количеством соединения. Носители включают, но без ограничения, солевой раствор, буферизованный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации.

Приемлемые способы получения подходящих фармацевтических форм фармацевтических композиций в соответствии с изобретением известны среднему специалисту. Например, фармацевтические приготовления могут быть осуществлены с помощью следующих обычных методик химикомфармацевтом, включая стадии, такие как смешивание, гранулирование и прессование, когда необходимо для таблетированных форм или смешивание, заполнение и растворение ингредиентов как назначено, что дает желаемые продукты для различных путей введения.

Соединения и композиции изобретения разрабатывались как имеющие широкий спектр активности, включая антибиотикорезистентные штаммы, в отношении грамположительных (например, δίαρίκίοοοο

- 49 016059 сик аитеик, 81арРу1ососсик ер1бегт1к, 81тер1ососсик руодепек, Еп1етососсик ГассаПк) и грамотрицательных бактерий (например, Е. со11, СЫатуб1а рпеитошае, Еп1егоЬас1ег кр., Η. тПиеи/а, К. рпеитошае, Ьедюпе11а рпеитошае, Р. аегидтока).

Фармацевтические композиции и второй терапевтический агент.

Широкий спектр вторых терапевтических агентов, таких как антибиотики, может быть использован в комбинации с соединениями, фармацевтическими композициями и способами настоящего изобретения. Антибиотики, используемые в качестве вторых терапевтических агентов, могут действовать путем нарушения синтеза клеточных стенок, сборки плазматических мембран, синтеза нуклеиновых кислот, функционирования рибосом, синтеза фолатов и т.п. Вторые терапевтические агенты могут быть включены в фармацевтическую композицию, содержащую фосфонированное соединение рифамицина настоящего изобретения или могут быть введены одновременно с фармацевтической композицией, содержащей фосфонированное соединение рифамицина настоящего изобретения.

Неисчерпывающий список применимых антибиотиков, с которыми соединения и композиции настоящего изобретения могут быть комбинированы или совместно введены, включает сульфонамиды, бета-лактамы, тетрациклины, хлорамфеникол, аминогликозиды, макролиды, гликопептиды, стрептограмины, хинолоны, фторхинолоны, оксазолидиноны и липопептиды. В частности, тетрациклин, антибактериальные агенты, представляющие собой тетрациклиновые производные, глицилциклин, антибактериальные агенты, представляющие собой глицилциклиновые производные, миноциклин, антибактериальные агенты, представляющие собой миноциклиновые производные, антибактериальные агенты ряда оксазолидинона, антибактериальные агенты ряда аминогликозида, антибактериальные агенты ряда хинолона, ванкомицин, антибактериальные агенты, представляющие собой ванкомициновые производные, теикопланин, антибактериальные агенты, представляющие собой теикопланиновые производные, эремомицин, антибактериальные агенты, представляющие собой эремомициновые производные, хлорэремомицин, антибактериальные агенты, представляющие собой хлорэремомициновые производные, даптомицин и антибактериальные агенты, представляющие собой даптомициновые производные, являются предпочтительными.

Способы ингибирования роста бактерий.

Согласно связанному с настоящим изобретением аспекту описываются способы подавления роста бактерий. Способ включает контакт бактерий с целью ингибирования с эффективным количеством фосфонированного соединения рифамицина согласно изобретению или фармацевтической композиции, содержащей соединения согласно изобретению (или фармацевтически приемлемого пролекарства, соли, активного метаболита или их сольвата). Например, это соединение может ингибировать бактериальную РНК-полимеразу, зависимую от бактериальной РНК-полимеразы транскрипцию ДНК и/или бактериальную трансляцию путем контакта бактерии с соединением изобретения.

Контактирование может быть осуществлено ш νίΙΐΌ (например, в лабораторных тканевых культурах, в биохимических и/или клеточных исследованиях), ш νί\Ό на животных (кроме людей), ш νί\Ό на млекопитающих, включая людей, и/или ех νί\Ό (например, для целей стерилизации).

Активность соединений изобретения в качестве ингибиторов транскрипции и/или трансляции ДНК может быть измерена любым способом, доступным специалисту в данной области, включая исследования ш νί\Ό и ш νίΙΐΌ. Некоторые примеры исследований бактериального фермента РНК-полимеразы описаны в патенте США 5635349 и 8а^абодо и сотрудниками (Ргос. №И. Асаб. 8сг И8А (1985), 82:43944398), Эоап и сотрудниками (РЕМ8 М1сгоЬю1. Ьеб. (2001), 196:135-139) и \Уи и сотрудниками (Апа1. ВюсРет. (1997), 245:226-230).

Способы лечения.

Согласно связанному с настоящим изобретением аспекту охватывается применение соединения изобретения в качестве активного ингредиента в фармацевтической, терапевтической или антибактериальной композиции для лечебных целей. Как определено выше, термины обработка и лечение означают, по меньшей мере, смягчение патологического состояния, связанного с бактериальной инфекцией, у субъекта, включая млекопитающих, таких как человек, которое облегчают путем подавления роста, репликации и/или распространения какой-либо бактерии, такой как грамположительные или грамотрицательные организмы и включают лечение, заживление, ингибирование, облегчение, снижение от улучшения и/или облегчения в целом или частично патологического состояния.

Фармацевтические композиции могут быть введены любым эффективным, традиционным образом, включая помимо прочего, например, введение местным, парентеральным, пероральным, анальным, вагинальным, внутривенным, интраперитонеальным, внутримышечным, внутриглазным, подкожным, интраназальным, внутрибронхиальным или внутрикожным путями.

В частности, в лечении или в качестве профилактики (как также будет описано ниже) соединения и фармацевтические композиции изобретения могут быть введены индивидууму в виде композиции для инъекций, например в виде стерильной водной дисперсии, предпочтительно изотонической. Альтернативно соединения и композиции могут быть приготовлены для местного применения, например, в форме мазей, кремов, лосьонов, глазных мазей, глазных капель, ушных капель, жидкости для полоскания рта, импрегнированных повязок и шовного материала и аэрозолей, и могут содержать соответствующие тра

- 50 016059 диционные вспомогательные вещества, включая, например, консерванты, растворители для облегчения проникновения лекарственного средства, и смягчающие средства в мазях и кремах. Такие местные препараты могут также содержать совместимые традиционные носители, например кремовые или мазевые основы и этанол или олеиловый спирт для лосьонов. Такие носители могут составлять от около 1 до около 98% от веса препарата; наиболее часто они составляют до 80% от веса препарата. Альтернативные средства для системного введения включают введение через слизистую и чрескожное введение с использованием пенетрантов, таких как соли желчных кислот или фузидовые кислоты или другие детергенты. Кроме того, если соединение или фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть приготовлена в виде кишечного или капсулированного препарата, пероральное введение также возможно. Введение этих соединений и композиций может также быть местным и/или ограниченным, в форме мазей, паст, гелей и т. п.

В то время как лечение может быть назначено системно посредством путей, описанных выше, оно также может быть назначено местно. Например, лекарственное средство может быть введено непосредственно в кость, например посредством инъекции в кость. Лекарственное средство может также быть введено другим местным способом, таким как аппликация на рану посредством местной композиции или напрямую на закрытую или другую форму раны.

Активные соединения, фармацевтические композиции и фармацевтически приемлемые пролекарства, соли, метаболиты и сольваты могут быть также введены индивидууму, как часть замещающего кость или восстанавливающего кость соединения, такого как костный цемент или наполнители (например, 8ке1йе™, МШешиш Βίοίοβίοδ. Κίηβδΐοη, ΟΝ, Саиаба) и кальциевые или гидроксиапатитные гранулы.

Доза соединений или фармацевтических композиций содержит, по меньшей мере, фармацевтически или терапевтически эффективное количество активного соединения (т.е. соединения формулы (I), формулы (II) и/или их фармацевтически приемлемое пролекарство, соль, активный метаболит или сольват), и предпочтительно состоит из одного или более фармацевтических лекарственных форм. Выбранная доза может быть введена субъекту, например пациенту-человеку, нуждающемуся в лечении. Термин терапевтически эффективное количество предназначен для обозначения такого количества соединения формулы (I) и/или формулы (II) (и/или их фармацевтически приемлемого пролекарства, соли, активного метаболита или сольвата), которое обеспечивает терапевтическое действие на получающего лечение субъекта. Терапевтический эффект может быть объективным (т.е. измеряемым каким-либо тестом или маркером (например, снижение количества бактерий)) или субъективным (т.е. субъект указывает на эффект или чувствует его).

Количество, которое будет относиться к терапевтически эффективному количеству, будет варьировать в зависимости от факторов, таких как конкретное соединение, путь введения, использование наполнителя, патологическое состояние и степень его тяжести, особенности субъекта, нуждающегося в нем, и возможность совместного использования с другими агентами для лечения заболевания. Тем не менее, терапевтически эффективное количество может быть легко определено специалистом в данной области. Для введения субъекту, такому как млекопитающее, в частности человеку, предполагается, что дневной уровень дозирования активного соединения будет в пределах от 0,1 до 200 мг/кг, обычно около 1-5 мг/кг. В любом случае лечащий врач будет определять адекватную дозировку, которая будет наиболее подходящей для индивидуума, и будет варьировать в зависимости от возраста, массы тела и реакции конкретного индивидуума. Вышеупомянутые дозировки являются примером среднего случая. Несомненно, могут существовать отдельные случаи, когда более высокие или низкие пределы дозировок обладают преимуществами, и это включено в объем данного изобретения.

Хотя изобретение предпочтительно направлено на профилактику и/или лечение связанных с костями инфекций, изобретение охватывает терапевтические и профилактические способы в отношении других заболеваний, вызываемых или связанных с бактериальной инфекцией, включая помимо прочего отит, конъюнктивит, пневмонию, бактериемию, синусит, плевральную эмфизему и эндокардит, слабовыраженные инфекции вблизи от кальцинатов атеросклеротичных сосудов и менингит. В таких способах эффективное терапевтическое или профилактическое количество соединения и/или фармацевтической композиции, как определено выше, вводят субъекту (предпочтительно человеку) в количестве, достаточном для обеспечения терапевтического эффекта, и тем самым предотвращают или лечат инфекцию у субъекта. Точные количества могут быть обычным образом определены специалистом в данной области, и будут варьировать в зависимости от ряда факторов, таких как конкретный задействованный штамм бактерий и конкретное используемое антибактериальное соединение.

Профилактика и предотвращение.

Дополнительное применение, которое, в частности, предполагается для соединений настоящего изобретения, заключается в целях профилактики и предотвращения. В действительности, многие хирурги-ортопеды считают, что люди с протезированными суставами подлежат антибиотикопрофилактике перед лечением, которое может вызвать бактериемию. Глубокая инфекция является тяжелым осложнением, иногда приводящим к потере протезированного сустава, и сопровождается существенной частотой осложнений и летальностью. Соединения и фармацевтические композиции настоящего изобретения могут, таким образом, быть использованы в качестве заместителей профилактических антибиотиков в такой

- 51 016059 ситуации. Например, соединения и/или фармацевтические композиции могут быть введены путем инъекции для достижения системного и/или местного эффекта в отношении соответствующих бактерий незадолго до инвазивного медицинского воздействия, такого как операция или установка вживляемого устройства (например, замена сустава (тазобедренного, коленного, плечевого и т.д.)), пересадка кости, восстановление перелома, имплантация зубов или операция на зубах. Лечение может быть продолжено после инвазивного медицинского воздействия, в виде послеоперационного или в течение всего времени пребывания устройства в организме.

Кроме того, соединения и/или фармацевтические композиции могут также быть введены перед инвазивным медицинским воздействием для обеспечения накопления соединения в тканях костей перед лечением.

В каждом отдельном случае соединения и/или фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть введены однократно, дважды, трижды или более, от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней или более, до 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ч или менее перед операцией для обеспечения уместного системного или местного количества соединений и/или накопления в костях, предпочтительно в областях, потенциально подверженных бактериальному обсеменению во время хирургического вмешательства. Даже более предпочтительно, фосфонированные соединения и/или фармацевтические композиции изобретения могут быть введены таким образом, что они могут достичь локальной концентрации в 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 500 или даже 1000 раз большей, чем концентрация, которая будет обычно достигаться во время введения немодифицированного исходного рифамицина, т.е. нефосфонированного эквивалента. Соединение(я) могут быть введены после инвазивного медицинского воздействия в течение периода времени, такого как 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней, 1, 2, 3 или более недель, или в течение всего времени, которое устройство будет находиться в организме.

Следовательно, изобретение предусматривает способ вызывания накопления рифамицина в костях субъекта, такого как млекопитающее, в котором фосфонированный рифамицин, имеющий высокое сродство к костной ткани, вводится субъекту. Фосфонированный рифамицин связывается с костной тканью и накапливается в костях субъекта в количествах, больших, чем количества нефосфонированного эквивалента рифамицина. Предпочтительно фосфонированная группа сопряжена с рифамицином через отщепляемую соединительную часть.

Изобретение также предусматривает способ продления присутствия рифамицина в костях субъекта, такого как млекопитающее, где фосфонированный рифамицин, обладающий высоким сродством с костными тканями, вводится субъекту. Фосфонированная группа сопряжена с рифамицином через отщепляемую соединительную часть. Фосфонированный рифамицин связывается с костными тканями и накапливается в костях субъекта, и соединительная часть отщепляется постепенно в костях, тем самым, высвобождая рифамицин и продлевая присутствие рифамицина в костях.

Е) Вживляемые устройства и продукты, покрытые фосфонированным рифамицином.

Изобретение также охватывает вживляемые устройства, покрытые соединениями и фармацевтическими композициями изобретения. В данном описании термин вживляемое устройство относится к хирургическим имплантатам, ортопедическим устройствам, протезным устройствам и катетерам, т.е. устройствам, которые вводятся в организм индивидуума и остаются на месте продолжительное время. Такие устройства включают помимо прочего искусственные суставы и имплантаты, клапаны сердца, водители ритма, сосудистые протезы, сосудистые катетеры, шунты спинномозговой жидкости, мочевые катетеры, катетеры для хронического перитонеального диализа в амбулаторных условиях (САРИ).

Согласно одному воплощению, вживляемое устройство ополаскивается или опыляется соединением и/или фармацевтической композицией изобретения в концентрации от около 1 до около 10 мг/мл, перед его введением в организм.

Согласно другому воплощению вживляемое устройство делается или предварительно обрабатывается веществом, подобным костному (например, кальция фосфатом, Са-ионом и гидроксиапатитом (УокЫпап е1 а1., Вюта1епа15 (2001), 22(7): 709-715)). Такое вещество способно выгодно улучшать связывание соединений и фармацевтических композиций изобретения с вживляемым устройством, либо во время покрытия устройства соединениями или фармацевтическими композициями изобретения и/или после их локального или системного введения. Вживляемые устройства могут также быть покрыты костным веществом, предварительно нагруженным или содержащим связанное нацеленное на кости соединение(я) в соответствии с изобретением. Для вышеупомянутых воплощений гидроксиапатит будет предпочтителен в качестве костного вещества. Больше деталей о способах покрытия, применении и преимуществах протезов, покрытых гироксиапатитами, могут быть найдены в обзоре ЭитЫе1оп апб Мап1у (Тйе 1оигпа1 о£ Вопе & Ло1п( 8игдегу (2004), 86А:2526-40), который включен в данное описание посредством ссылки.

С) Способы получения.

Соединения по изобретению и их соли, сольваты, кристаллические формы, активные метаболиты и пролекарства могут быть получены с помощью применяемых методик, доступных среднему специалисту, используя исходные продукты, которые являются легко доступными. Определенные новые и типичные способы получения соединений по изобретению описаны в экспериментальной части. Такие спосо

- 52 016059 бы находятся в границах настоящего изобретения.

Примеры

Примеры, изложенные в настоящем изобретении, обеспечивают иллюстративный синтез типичных соединения по изобретению. Также обеспеченным являются иллюстративные способы анализируемых соединений по изобретению на их активность костного связывания, испытания для определения минимальной ингибиторной концентрации (МШ) соединений по изобретению против микроорганизмов и способы испытания ίη νίνο активности и цитотоксичности.

Пример 1. Синтез фосфонированных рифамицинов.

А) Общие экспериментальные методики.

А1) Получение бисфосфонатных строительных блоков

Как описано в 8уп111. Соттип. (2002), 32; 211-218, тетраэфиры метиленбисфосфоновой кислотыД) могут быть получены из исходного тетрахлорида и спирта.

Следующие методики описаны в Вюогд. Мей. С’Нст. (1999), 7; 901-919, бензилзамещенные бисфосфонированные строительные блоки общих структур III и V могут быть получены путем алкилирования аниона I 4-замещенным бензилбромидом II или бромацетатом IV. Нитросоединение Ша может быть превращено в анилин ШЬ путем восстановления нитрогруппы в условиях гидрогенизации, используя катализатор такой, как ΡΐΟ₂. Сложные эфиры, подобные Шс и να, могут быть превращены в соответствующие кислоты ПИ или νΠ через расщепление сложного эфира. Например, сложный эфир Шс, где Я'=трет-Ви, может быть обработан ТРА, что дает на выходе соответствующую кислоту ПИ. В ных условиях сложный эфир να, где Х=О1-Вц, может быть превращен в кислоту Ш.

аналогич-

Арилзамещенные метиленбисфосфонаты общей формулы IX могут быть получены из бензиловых галоидов VI через последовательность двух реакций разделения по Арбузову с бензилового галогенирования.

исходных помощью

Диэтил(этоксифосфинил)метилфосфонат X может быть получен, используя методику, описанную в 8уп111. Сотт. (2002), 32; 2951-2957 и И8 5952478 (1999). Он может быть связан с 4-замещенным бромбензолом (XI), чтобы получить кислоту ХПЬ, с после расщепления промежуточного сложного эфира ХПа.

- 53 016059

Амин XIII может быть получен из дибензиламина или диаллиламина, диалкилфосфита и триэтилортоформиата с помощью следующей методики, описанной в 8уШ11. Соттип. (1996), 26; 2037-2043 или из триалкилфосфита и соответствующим образом замещенного формамида (такого как аллилформамид), как описано в Ρΐιοφίιοπίδ. 8и1£иг апД 8Шсоп (2003), 178, 38-46. Ацилирование соединения XIII янтарным ангидридом XIV;·! или глутаровым ангидридом ХГУЬ может обеспечить кислоты ХУа и ХУЬ соответственно (I. Эгид ТагдеИпд (1997), 5; 129-138). Аналогичным способом обработка ранее описанных соединений ШЬ или IX соединениями XIV(а-Ь) дает сукцинамовую и глутарамовую кислоты XVГ(а-ά).

Олефин XVII может быть получен из соединения I с помощью следующей методики, описанной в I. Огд. СНет. (1986), 51; 3488-3490. Он может быть превращен в исходную бисфосфономасляную кислоту XVIII, как описано в I. Огд. СНет. (2001), 66; 3704-3708.

Как описано в Рйокрйогик, 8и11иг апД 8Шсоп, (1998), 132; 219-229, спирты общей структуры XX(с-ά) и иодиды общей структуры XXII могут быть получены путем алкилирования аниона I с помощью защищенных ω-гидроксибромидов, имеющих различную длину цепи XIX(а-Ь). После снятие защиты спирты могут быть превращены в соответствующие иодиды через обработку с помощью ш δίΐιι произведенного комплекса трифенилфосфин:иод. Эти спирты XX(с-ά) могут дополнительно быть превращены в кислоты общей структуры XX путем обычных способов окисления, таких как обработка дихроматом пиридиния.

XXIII

Тиол XXIII может быть получен путем алкилирования аниона I защищенным 3-иодпропан-1тиолом, следуя методике, описанной в Вюогд. МеД. СНет. (1999), 7; 901-919.

- 54 016059

Р(ОК)₂ \Р(ОН)г О

Бромацетамиды XXIV и XXV из исходных аминов ШЬ и XIII могут быть получены в соответствии с модификацией методики, описанной в I. Эгид ТагдеИпд (1995).3.273-282.

Бисфосфонированные виниларилкетоны, такие как XXVII(а-Ь), могут быть получены через обработку исходных иодидов XXII(а-Ь) п-гидроксиацетофеноном, с последующей реакцией метиленового переноса, как описано в Огд. 8уп. (1983); 60; 88-91.

Η₂Ν^Ρ(ΟΡ)₂ о

хш

+

Я'

ХХУШа η = 2 ΧΧνίΙΙΒ η = 3

□Η +

η₂ν

шь ί? Ρ(ΟΚ)₂

ХХУШа π = 2

ХХУШЬп = 3

ΧΧΙΧβ η = 2; К = Рб ХХ1ХЬ п = 3; Я = Рб ХХ1Хс η = 2; Р = Н ХХ1ХЙ η = 3; К = Н

О о _о^Р(ОР)₂рг ^п н

ХХХа η = 2; К” = Рб ХХХЬ η = 3; Р = Рб ХХХс г> = 2: Я = Н ΧΧΧά л = 3( Я¹’ я Н н

< Я'

ХХХ1ап = 2

ХХХ1Ьп = 3

ΗζΝ ,Р(ОК)г

О

XIII

Ρί·

К

Κ..,χ₄„ 1 ^к о

ХХХПа п = 2; Н = рб ХХХ11Ь п = 3; Р = Рб ХХХНс п = 2; Η = Н ХХХ1И п Я 3; Я = н

ХХХ1а η = 2

ХХХГЬ η = 3

ХХХШа п = 2; К = ΡΘ ХХХШЬ п = 3; Η = Р6 ХХХШс п = 2; Н = н ΧΧΧΙΙΙά п = 3; Я = Н

Бисфосфонированные амины XXIX(а-ά) и XXX(а-ά), гидразины XXXII(а-ά) и XXXIII(а-ά) получают из соответствующим образом защищенных аминов XXVШ(а-Ь) и гидразинов XXXI(а-Ь) с либо соединением ШЬ или с соединением XIII, в присутствии третичного амина и стандартного амидного агента связывания (ЭСС, ЕЭС!, НВТи, НАТи, РуВОР, ВОР-С'Ч). Во всех этих случаях соединение X представляет собой комбинацию раздельных атомов кислорода и атомов азота и К¹ представляет собой другую комбинацию из атомов, которые могут быть связаны с ними в соединении X.

- 55 016059

ΧΧΧνίβ η г 1; Η' = РС ΧΧΧνΐόπ£ΐ_; Ε?' = Η

ХХХУа η й 1; Η’ = РС ХХХУЬпа1:Н*=Н

Бисфосфонированные амины ХХХУа-Ь и ХХХУТа-Ь легко получают путем ацилирования аминов ХШ и ШЬ соответственно защищенными аминокислотами ХХХГУ в стандартных условиях амидного связывания (третичный амин и стандартный амидный агент связывания, такой как ОСС, ЕЭС!, ΗΒΤϋ, идти, РуВОР, ΒΟΡ-α).

Бисфосфонированные строительные блоки, описанные в этом разделе, находятся в виде их фосфоновых эфиров, К имеет значение Ме, Εΐ, изо-Рг или Βη; или представляет собой бисфосфоновую кислоту.

А2) Синтез рифамицин-бисфосфонатных конъюгатов.

ХХХПс ΧΧΧΙΙά

Бисфосфонированные пролекарства ХХХУШ(а-Ь) и ХХХЕХ(а-Ь) получают путем конденсации 3формилрифамицина 8 ХХХУП гидразинами ХХХЩс-ά) и ХХХШ(с-й) в соответствии с методикой, аналогичной методике, описанной в Еагтасо, Εά. 8с1. (1975), 30, 605-619.

- 56 016059

Взаимодействие рифамициновых производных ХЬ со смешанными ангидридами, полученными из защищенных глицинов, выборочно дает эфирные продукты ХЬПа, в соответствии с методикой, аналогичной методике, описанной для других ангидридов в I. Мо1. 81гис1. (2001), 563-564, 61-78. После снятия защиты с глицинового остатка свободная аминогруппа взаимодействует с кислотой УЬ, что дает желаемые бисфосфонированные рифамициновые производные ХЬШ.

Аналогичным образом, соединения ХЬУПЬ, полученные путем конденсирования бензоксазинорифамицинов ХЬУ(а-Ь) с диаминами ХЬУ! в присутствии мягкого окисления, такого как диоксид магния, как описано в И8 4690919, И8 4983602 и С1ет. Рйагт. Ви11. (1993), 41: 148-155, могут взаимодействовать с винилкетонами ХХУП(а-Ь), что дает на выходе бисфосфонированные пролекарства ХЬУШ(а-Ь).

- 57 016059

Бисфосфонированные бензоксазинорифамициновые производные 1Ь(а-Ь) и Ь(а-Ь) получают через конденсирование бисфосфонированных аминов ХХ1Х(с-ф и ХХХ(с-б) с бензоксазинорифамициновыми производными ХЬУ(а-Ь) в присутствии мягкого окисления, такого как диоксид магния, как описано в И8 4690919, И8 4983602 и СКет. Рйагт. Ви11. (1993), 41:148-155.

Конденсация рифамицина ХЬ с янтарным и глутаровым ангидридами обеспечивает кислоты Ыа и ЫЬ соответственно. Эти кислоты могут быть связаны в стандартных условиях амидного связывания (третичный амин и стандартный амидный агент связывания, такой как ЭСС, ЕЭС1. НВТИ, НАТИ, РуВОР, ВОР-С1) с амином ХШ, что обеспечивает бисфосфонированные пролекарства ЬП(а-Ь), с амином ШЬ, что обеспечивает бисфосфонированные пролекарства ЬШ(а-Ь), с амином ХХХУЬ, что обеспечивает

- 58 016059 бисфосфонированные пролекарства ЫУ(а-Ь) и с аминами ХХХУШ, что обеспечивает бисфосфонированные пролекарства ЬУ(а-Ь).

о

Конденсация рифамицина ХЬ с янтарным и глутаровым ангидридами обеспечивает кислоты Ыа и ЫЬ соответственно. Эти кислоты могут быть связаны в стандартных условиях амидного связывания (третичный амин и стандартный амидный агент связывания, такой как ОСС, ЕЭСЕ НВТи, НАТи, РуВОР, ВОР-С.Ч) с амином XIII, что обеспечивает бисфосфонированные пролекарства ЬП(а-Ь), с амином ШЬ, что обеспечивает бисфосфонированные пролекарства ЬШ(а-Ь), с амином ХХХУЬ, что обеспечивает бисфосфонированные пролекарства ЫУ(а-Ь) и с аминами ХХХУЬ, что обеспечивает бисфосфонированные пролекарства ЬУ(а-Ь).

- 59 016059

Аналогичным образом конденсация бензоксазинорифамицина ЫУ с янтарным и глутаровым ангидридами обеспечивает кислоты Ыа и Ь1Ь, которые могут быть связаны с аминами XIII, ШЬ, ХХХУЬ и ХХХУ1Ь, что дает бисфосфонированные пролекарства ЬУП(а-Ь), ЬУШ(а-Ь), ЫХ(а-Ь) и ЬХ(а-Ь) соответственно.

Обработка рифамицинов ХЬ бромацилбромидами ЬХП(а-с) или смешанными ангидридами ЬХП(бί) в присутствии ненуклеофильного основания, обеспечивает бромациловые эфиры ЬХШ(а-с). Они могут взаимодействовать с сукцинамовыми кислотами ХУа и ХУ!а и гутарамовыми кислотами ХУЬ и ХУ!Ь в присутствии основания, что дает бисфосфонированные пролекарства ЬХТУ(а-Г) и ЬХУ(а-£).

има η = 1 иольп = з 1_ХУ1сп = 4

ЬХНа исиь ЬХИс

ΙΧΙΙό-X =-О_гССМе₃, η = 1 1Х11е -X = -ОгССМез, л = 3 1_Х1И -X = -О_гССМе₃, л = 4

Ρ(ΟΡΙ)2

ЦОЛ1ал= 1, т = 1 Ι_χν»& η = 1, т = 2

ЬХУНс Л = 3, т = 1 ОСЛЫ η = 3, т=2

ЬХУНе л = 4, т ^я 1

ЦСУШ η = 4, т = 2

СХУШап=1,т=1 Ц£ИИЬп = 1,т<=2 иплне л = 3, т = 1 иоли<1п = 3,т = 2 ЦОЛНеп = 4, П1 = 1 ΙΧνΗΚ η = 4, т = 2

- 60 016059

Аналогичным образом бензоксазинорифамицины Ον могут быть обработаны соединением ЬХП(аί) в присутствии основания, что дает бромациловые эфиры ЬХ'УДа-с), которые могут взаимодействовать с кислотами ΧνΓι-Ь) и Х^(а-Ь), что дает бисфосфонированные пролекарства ЕХ^Да-Т) и ^XVIII(а-Γ).

Бисфосфонатные строительные блоки, описанные в настоящем разделе, находятся в виде их фосфоновых эфиров, К имеет значение Ме, Εί, изо-Рг, аллил или Вп; или представляет собой свободные бисфосфоновые кислоты и/или свободные бисфосфонатные соли. Бисфосфоновые эфиры могут быть превращены в свободные кислоты и соли кислот с помощью обычных способы, такой как обработка триметилсилилбромидом или иодидом в присутствии или в отсутствие основания, гидрогенизации, когда бисфосфонатные эфиры представляют собой бензилбисфосфонаты, путем обработки палладиевым катализатором и нуклеофилом, когда бисфосфонатные эфиры представляют собой аллилбисфосфонаты.

Используемые другие защитные группы могут быть введены и удалены, используя обычные способы, описанные в уровне техники, например как рассмотрено в РгсИесЦуе Сгоирк ίη Отдашс §упШе818, Сгеепе. Τ/Ψ. апб ХУиК Р.М.С., ^11еу-1п1егзс1епсе, Νονν Уотк, 1999.

В) Подробные экспериментальные методики.

Схема 1

Синтез тетраэтил(4-(2-(1-аминопиперазин-4-ил)этокси)-4-оксобутаноиламино)метилен-

Тетраэтил Ν,Ν-дибензилЧ-аминометиленбисфосфонат (1). Соединение 1 получают в соответствии с модификацией методики, описанной в 8уп111. Сотт. (1996), 26: 2037-2043. Триэтилортоформиат (8.89 г, 60 ммоль), диэтилфосфит (16.57 г, 120 ммоль) и дибензиламин (11.80 г, 60 ммоль) объединяют в круглодонной колбе, объемом 100 мл, оснащенной прибором для головной отгонки. Реакционную смесь нагревают до температуры 180-195°С в течение 1 ч в атмосфере Аг. Когда отгонка ΕΐΟΗ закончится, реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, разбавляют СНС1₃ (300 мл), промывают водным раствором Ν;·ιΟΗ (2М, 3x60 мл) и рассолом (2x75 мл), затем сушат над Мд§О₄. После упаривания получают сырой выход 25.2 г (87%). Часть 4.95 г сырого масла очищают с помощью хроматографии (смесь этилацетат:гексан:метанол 14:4:1), что дает на выходе очищенное соединение 1 (2.36 г, 41%).

Ή ЯМР (400 МГц, С1)С1_;) δ 1.32 (дт, 1=2.0, 7.0, 12Н), 3.55 (т, 1=25.0, 1Н), 3.95-4.25 (м, 12Н), 7.207.45 (м, 10Н).

Тетраэтил-1-аминометиленбисфосфонат (2). Соединение 1 (2.00 г, 4.14 ммоль) растворяют в ЕЮН (40 мл). К полученному раствору добавляют палладий на угле (10%, 1.5 г) и циклогексан (2.5 мл, 24.7 ммоль). Реакционную смесь нагревают при температуре кипения с обратным холодильником в атмосфере аргона в течение 15 ч, фильтруют через целит и упаривают, что дает соединение 2 в виде слегка загрязненного масла бледно-желтого цвета (1.50 г, 119%), которое используют непосредственно на следующей стадии без дополнительной очистки.

Ή ЯМР (400 МГц, С1)С1_;) δ 1.35 (т, 1=7.0, 12Н), 3.58 (т, 1=20.3, 1Н), 3.65-3.90 (уширенный с, 2Н), 4.20-4.28 (м, 8Н).

1-(трет-Бутилоксикарбониламино)-4-(2-гидроксиэтил)пиперазин (4). 1-Амино-4-(2-гидроксиэтил)пиперазин 3 (1.18 г, 8.1 ммоль) и Вос ангидрид (4.4 г, 20.3 ммоль) добавляют к 100 мл ТГФ и нагревают при температуре 60°С в течение 1.5 ч. Растворитель упаривают в вакууме и образовавшийся остаток рас

- 61 016059 творяют в МеОН (50 мл) и затем добавляют водный раствор (50 мл) ЫОН (970 мг, 40.4 ммоль). Полученный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 16 ч. Образовавшуюся смесь затем разбавляют водой (50 мл) и экстрагируют СН₂С1₂ (3x75 мл), промывают рассолом (75 мл), сушат над №₂8О₄ и концентрируют, что дает бесцветную смолу. Сырой остаток растирают в порошок в ЕьО. охлаждают до температуры 0°С и фильтруют, что дает на выходе твердое вещество (1.21 г, 61%).

¹Н ЯМР (400 МГц, СОС1_;) δ 1.45 (с, 9Н), 2.55 (видимый т, 1=5.4 Гц, 2Н), 2.64 (м, 4Н). 2.83 (м, 4Н), 3.60 (видимый т, 1=5.4 Гц, 2Н), 5.40 (уширенный с, 1Η).

1-(трет-Бутилоксикарбониламино)-4-(2-(4-гидрокси-4-оксобутаноилокси)этил)пиперазин (5). Соединение 4 (250 мг, 1.0 ммоль), янтарный ангидрид (105 мг, 1.05 ммоль) и 4-ΌΜΆΡ (каталитическое количество) растворяют в СНС1₃ (600 мкл) и перемешивают в течение 12 ч. Раствор концентрируют в вакууме и используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

¹Н ЯМР (400 МГц, СОС1_;) δ 1.43 (с, 9Н), 2.60 (с, 4Н), 2.76 (м, 6Н), 2.86 (м, 4Н), 4.23 (т, 1=5.5 Гц, 2Н), 5.71 (уширенный с, 1Η), 10.82 (уширенный с, 1Η).

Тетраэтил (4-(2-(1-(трет-бутилоксикарбониламино)пиперазин-4-ил)этокси)-4-оксобутаноиламино)метилен-1,1-бисфосфонат (6). К раствору соединений 2 (303 мг, 1.0 ммоль) и 5 (345 мг, 1.0 ммоль) в СН₂С1₂ (10 мл) добавляют БОС (230 мг, 1.2 ммоль) и 4-ΌΜΆΡ (каталитическое количество). Полученный раствор перемешивают в течение 4 ч в атмосфере Аг при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляют СН₂С1₂, промывают водой, рассолом и сушат над №₂8О₄. После упаривания остаток очищают с помощью флэш-хроматографии на 81О₂ (градиент от 4 до 10% МеОН/СН₂С1₂), что дает на выходе бесцветную смолу (410 мг, 65%).

¹Н ЯМР (400 МГц, СОСБ) δ 1.33 (т, 1=7.1 Гц, 12Н), 1.45 (с, 9Н), 2.56-2.69 (м, 10Н), 2.81 (уширенный с, 4Н), 4.12-4.26 (м, 10Н), 5.00 (дт, 1=10.1, 21.7 Гц, 1Н), 5.51 (уширенный с, 1Н), 6.50 (уширенный д, 1=8.2 Гц, 1Н).

Тетраэтил (4-(2-(1-аминопиперазин-4-ил)этокси)-4-оксобутаноиламино)метилен-1,1-бисфосфонат (7). Соединение 6 (490 мг, 0.78 ммоль) растворяют в растворе 10% ТРА/СН₂С1₂ (8 мл). Раствор перемешивают при комнатной температуре пока не израсходуется исходный материал (ТСХ контролирование). Летучие вещества упаривают в вакууме и образовавшийся остаток используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Схема 2

Синтез 3 -(((4-(2-гидроксиэтил)-1 -пиперазинил)имино)метил)рифамицина (9)

3-(((4-(2-Гидроксиэтил)-1-пиперазинил)имино)метил)рифамицин (9). 3-Формилрифамицин 8 (8, 724 мг, 1 ммоль) суспендируют в 3 мл ТГФ. Одной порцией добавляют твердый 1-амино-4-(2гидроксиэтил)пиперазин (3, 145 мг, 1 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем ее распределяют между 50 мл СН₂С1₂ и смесью 10 мл насыщенного рассола и раствором 2 г аскорбата натрия в 30 мл воды. Органику собирают и водный слой экстрагируют еще раз 50 мл СН₂С1₂. Объединенную органику сушат над №ь8О₄ и концентрируют в вакууме, что дает 830 мг (0.97 ммолей, 97%) соединения 9 в виде твердого вещества темного цвета.

¹Н ЯМР (400 МГц, СОСБ) δ -0.32 (д, 1=6.9, 3Н), 0.58 (д, 1=6.9, 3Н), 0.86 (д, 1=7.0, 3Н), 1.00 (д, 1=7.0, 3Н), 1.34 (м, 1Н), 1.52 (м, 1Η), 1.69 (м, 1Η), 1.80 (с, 3Н), 2.05 (с, 3Н), 2.08 (с, 3Н), 2.22 (с, 3Н), 2.38 (м, 1Η), 2.91 (уширенный т, 1=4.6, 2Н), 3.04 (перекрытие 3.04 (м, 6Н) и 3.03 (с, 3Н)), 3.33-3.48 (м, 6Н), 3.54 (уширенный с, 1Н), 3.74 (м, 2Н), 3.86 (уширенный т, 1=4.8, 2Н), 4.93 (д, 1=10.6, 1Н), 5.09 (дд, 1=6.6, 12.6, 1Н), 5.36 (уширенный с, 1Η), 5.92 (дд, 1=5.0, 15.4, 1Н), 6.18 (д, 1=12.7, 1Η), 6.38 (д, 1=11.1, 1Н), 6.56 (дд, 1=11.6, 15.5, 1Η), 8.35 (с, 1Η), 12.07 (с, 1Η).

- 62 016059

Схема 3

Синтез 3 -(((4-(2-(3 -((бисфосфонометил)карбамоил)пропаноилокси)этил)-1 пиперазинил)имино)метил)рифамицина (11)

·, ν'—β V

0 ζ- 10Κ=ΕΙ

Κ = Η, Ε1₃Ν

3-(((4-(2-(3 -((бис-(Диэтилфосфоно)метил)карбамоил)пропаноилокси)этил)-1-пиперазинил)имино)метил)рифамицин (10). Соединение 7 (490 мг, 0.78 ммоль) разбавляют ТГФ и затем добавляют ТЕА (560 мкл, 4.0 ммоль). Затем добавляют твердый 3-формилрифамицин 8 8 (537 мг, 0.74 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 ч. Затем ее распределяют между 50 мл СН₂С1₂ и смесью 10 мл насыщенного рассола и 10% водного раствора аскорбата натрия (30 мл). Органику собирают и водный слой экстрагируют СН₂С1₂ (2x50 мл). Объединенную органику сушат над №ь8О₄ и концентрируют в вакууме, что дает сырое соединение 10 в виде твердого вещества багряно-красного цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃,) δ -0.33 (д, 1=6.9 Гц, 3Н), 0.58 (д, 1=6.9 Гц, 3Н), 0.85 (д, 1=7.0 Гц, 3Н), 1.00 (д, 1=7.00 Гц, 3Н), 1.33 и 1.34 (т, 1=7.0 Гц, 12Н), 1.53 (м, 1Н), 1.71 (м, 1Н), 1.80 (с, 3Н), 1.90 (м, 1Н), 2.06 (с, 3Н), 2.08 (с, 3Н), 2.23 (с, 3Н), 2.38 (м, 1Н), 2.56-2.72 (м, 12Н), 3.04 (с, 3Н), 3.00-3.10 (м, 4Н), 3.12-3.19 (м, 2Н), 3.47 (м, 1Н), 3.64 (Ы, 1=4.8 Гц, 1Н), 3.70-3.80 (м, 2Н), 4.14-4.25 (м, 12Н), 4.95 (д, 1=10.5 Гц, 1Н), 5.00 (дт, 1=10А, 21.6 Гц, 1Н), 5.10 (дд, 1=6.8, 12.7 Гц, 1Н), 5.94 (дд, 1=4.9, 15.5 Гц, 1Н), 6.21 (дд, 1=0.8, 12.7 Гц, 1Н), 6.53-6.63 (м, 1Н), 8.27 (с, 1Н), 12.01 (с,1Н).

3-(((4-(2-(3 -((Бисфосфонометил)карбамоил)пропаноилокси)этил)-1-пиперазинил)имино)метил)рифамицин (11). К раствору соединения 10 (1.18 г, 0.96 ммоль) и 2,6-лутидина (5.6 мл, 48 ммоль) в СН₂С1₂ (30 мл) при -78°С добавляют по каплям ТМ8Вг (3.17 мл, 24 ммоль) в атмосфере аргона. Охлаждающую баню удаляют и смесь перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривают досуха в вакууме. Остаток растворяют в 50 ммоль водного раствора ЫН₄ОАС/АсОН, значение рН доводят до 5.1 и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Раствор затем лиофилизуют. Сырой остаток очищают с помощью флэш-хроматографии с обращенной фазой при значении рН 5.1 (линейный градиент от 10 до 40% ацетонитрила в 50 ммоль водного раствора НН₄ОАс/АсОН), что дает на выходе соединение 11 в виде твердого вещества оранжевого цвета (680 мг, 54%).

Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ -0.26 (д, 1=6.6 Гц, 3Н), 0.43 (д, 1=6.5 Гц, 3Н), 0.82 (д, 1=7.6 Гц, 3Н), 0.85 (д, 1=6.7 Гц, 3Н), 1.04 (м, 1Н), 1.30 (м, 1Н), 1.54 (м, 1Н), 1.60 (с, 3Н), 1.87 (с, 3Н), 1.89 (с, 3Н), 1.96 (с, 3Н), 2.13 (м, 1Н), 2.44 (уширенный с, 4Н), 2.48 (м, 10Н), 2.52-2.64 (м, 6Н), 2.81 (уширенный д, 1=9.6 Гц, 1Н), 2.87 (с, 3Н), 3.20 (уширенный д, 1=8.2 Гц, 1Н), 3.70 (уширенный д, 1=8.3 Гц, 1Н), 4.10 (м, 2Н), 4.18 (дт, 1=9.8, 19.1 Гц, 1Н), 4.90 (дд, 1=8.3, 12.7 Гц, 1Н), 5.05 (д, 1=10.7, 1Н), 5.83 (дд, 1=6.5, 15.8 Гц, 1Н), 6.20 (м, 1Н), 6.94 (дд, 1=11.2, 15.6 Гц, 1Н), 7.46 (м, 1Н), 7.95 (с, 1Н), 9.11 (с, 1Н), 12.44 (с, 1Н).

Схема 4

Синтез тетрабензил-1-хлор-1-оксопропилен-3,3-бисфосфоната (16)

Указанную последовательность реакций выполняют, как описано в 1. Огд. СНсш. (2001), 66; 37043708.

Тетрабензилметиленбисфосфонат (13). Смесь сухого бензилового спирта (8.66 мл, 83.0 ммоль) и сухого пиридина (6.15 мл, 76.1 ммоль) добавляют в течение более 80 мин с помощью шприцевого насоса

- 63 016059 к энергично перемешиваемой суспензии метиленбис-(фосфондихлорида) (5.00 г, 20.0 ммоль) в сухом толуоле (10 мл) при температуре 0°С. После завершения добавления реакционную смесь оставляют стоять при комнатной температуре и перемешивают в течение еще 3 ч. Твердые вещества удаляют фильтрованием и промывают дважды толуолом (2x20 мл). Фильтрат промывают 2 М №ЮН (2x15 мл) и водой (15 мл), сушат над Мд8О₄ и концентрируют в вакууме. Удаление примеси бензилового спирта с помощью отгонки дает соединение 13 в виде бесцветного масла (8.1 г, 75%). Спектральные данные подтверждают методику, описанную выше.

Тетрабензил-1-этокси-1-оксопропилен-3,3-бисфосфонат (14). Раствор соединения 13 (1.00 г, 1.87 ммоль) в ТГФ (10 мл.) добавляют к суспензии ΝηΗ (0.047 г, 1.96 ммоль) в ТГФ (20 мл) при температуре 0°С в течение более 5 мин. Раствору дают возможность нагреться до комнатной температуры и перемешивают в течение еще 30 мин. Затем добавляют 220 мкл этилбромацетата (1.98 ммоль). После перемешивания в течение ночи смесь выливают в насыщенный раствор ΝΗ₄Ο и экстрагируют дихлорметаном. Объединенные органические экстракты сушат над Мд8О₄ и концентрируют в вакууме. Остаток подвергают хроматографии на 8Ю₂ (70% смесь ЕЮАс/гексан), что дает на выходе соединение 14 в виде бесцветного масла (0.7 г, 60%). Спектральные данные подтверждают методику, описанную выше.

Тетрабензил-1-карбоксиэтилен-2,2-бисфосфонат (15). Раствор соединения 14 (1.27 г, 2.04 ммоль) в метаноле (6 мл) добавляют к раствору КОН (0.127 г, 2.26 ммоль) в воде (6 мл) и метаноле (6 мл) при температуре 0°С. Реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры в течение более часа и перемешивают при указанной температуре в течение ночи. Метанол удаляют в вакууме и остававшийся раствор промывают диэтиловым эфиром (20 мл). Водный слой подкисляют до значения рН, равного 2, с помощью водного раствора НС1 и затем его экстрагируют СН₂С1₂ (3x20 мл) и ЕЮ Ас (1x20 мл). Объединенные органические экстракты сушат над Мд8О₄ и концентрируют в вакууме, что дает на выходе соединение 15 в виде бесцветного масла (0.95 г, 78%). Спектральные данные подтвер ждают методику, описанную выше.

Тетрабензил-1-хлор-1-оксопропилен-3,3-бисфосфонат (16). К раствору соединения 15 (68 мг, 1.14х10^-4 моль) в 3 мл сухого СН₂С1₂ добавляют 22 мкл (2.6х10^-4 моль) оксалилхлорида, а затем 1 каплю ДМФА. Смесь перемешивают при температуре комнатной температуре в течение 10 мин и затем концентрируют в вакууме, что дает сырое соединение 16, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Схема 5

Синтез рифабутинбисфосфонатного конъюгата 21

ЕОС1, Е1₃М.СН₂О₂

НО^х^Р(ОВп); О 0*Р(ОВп)г 15

- 64 016059

-О-(Ы-((9Н-флуорен-9-ил)метилоксикарбонил)глициноил)-Г,4-дидегидро-1-дезокси-1,4-дигидро5'-(2-метилпропил)-1-оксорифамицин Х1У (18). Пивалоилхлорид (145 мкл, 1.18 ммоль) добавляют по каплям к раствору Ν-Ртос-глицина (351 мг, 1.18 ммоль) и пиридина (95 мкл, 1.18 ммоль) в ТГФ (3 мл) и полученный раствор перемешивают в течение 1 ч перед добавлением к перемешиваемому раствору рифабутина (100 мг, 0.118 ммоль) и пиридина (38 мкл, 0.47 ммоль) в ТГФ (2 мл). Полученный раствор перемешивают в течение 3 дней в атмосфере Аг перед разбавлением ЕьО (10 мл) и Н₂О (10 мл). После отделения водный слой экстрагируют дважды ЕьО (2x10 мл). Объединенные органические слои промывают насыщенным раствором №1С1 (10 мл), сушат над Мд8О₄ и концентрируют в вакууме. Сырой продукт очищают с помощью хроматографии с обращенной фазой, элюируя водным раствором буфера (Εΐ₃,Ν/ί.Ό₂. рН 7)/СΗзСN (от 10 до 100% линейный градиент) и получают на выходе 114 мг (0.102 ммоль, 86%) соединения 18 в виде твердого вещества пурпурно-темного цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃) δ 8.34 (уширенный с, 1Н), 7.94 (уширенный с, 1Н), 7.79-7.71 (м, 4Н), 7.42 (т, 1=3.0 Гц, 2Н), 7.34 (т, 1=3.0 Гц, 2Н), 6.43 (дд, 1=16 Гц, 1Н), 6.14 (д, 1=11 Гц, 1Н), 6.08 (д, 1=11.2 Гц, 1Н), 5.95-5.91 (м, 2Н), 5.19 (д, 1=11.2 Гц, 1Н), 5.05 (дд, 1=9.3, 1.2 Гц, 1Н), 4.97 (д, 1=10.6 Гц, 2Н), 4.51-2.19 (м, 3Н), 3.83 (д, 1=4.6 Гц, 2Н), 3.55 (δ, 1Н), 3.14 (уширенный д, 1=1.2 Гц, 1Н), 3.10 (с, 3Н), 3.08-2.84 (м, 4Н), 2.73-2.52 (м, 4Н), 2.30 (д, 1=6.0 Гц, 2Н), 2.21 (с, 3Н), 2.31 (м, 1Н), 2.05 (с, 6Н), 2.02 (м, 2Н), 1.86-1.79 (м, 4Н), 1.80 (с, 3Н), 1.27 (м, 3Н), 1.08 (д, 1=6.9 Гц, 3Н), 0.95 (д, 1=6.6 Гц, 9Н), 0.53 (д, 1=6.9 Гц, 3Н), -0.75 (д, 1=7.0 Гц, 3Н).

-О-Глициноил-1',4-дидегидро-1-дезокси-1,4-дигидро-5'-(2-метилпропил)-1-оксорифамицин Х1У (19). Пиперидин (100 мкл, 1.02 ммоль) добавляют к перемешиваемому раствору производного Ν-Ртосрифабутина 18 (114 мг, 0.102 ммоль) в СН₂С1₂ (5 мл). Через 24 ч перемешивания при комнатной температуре смесь концентрируют в вакууме. Сырой продукт очищают с помощью хроматографии с обращенной фазой, элюируя водным раствором буфера (ΕρΝ/ΕΌ^ рН 7)/СΗзСN (от 10 до 100% линейный градиент), что дает на выходе 77 мг (0.085 ммоль, 84%) соединения 19 в виде твердого вещества пурпурнотемного цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃) δ 8.32 (уширенный с, 1Н), 7.94 (с, 1Н), 6.41 (т, 1=11.1 Гц, 1Н), 6.12-6.05 (м, 2Н), 5.90 (дд, 1=15.8, 7.4 Гц, 1Н), 5.12 (д, 1=10.3 Гц, 1Н), 5.04 (дд, 1=15.8, 1.5 Гц, 1Н), 3.59 (уширенный с, 1Н), 3.48 (м, 1Н), 3.20 (д, 1=9.5 Гц, 2Н), 3.05 (с, 3Н), 3.04-2.91 (м, 3Н), 2.86 (дд, 1=10.1, 3.0 Гц, 1Н), 2.722.63 (м, 2Н), 2.58-2.47 (м, 2Н), 2.31 (д, 1=7.0 Гц, 2Н), 2.27 (с, 3Н), 2.19-2.09 (м, 2Н), 2.06-1.97 (м, 8Н), 1.931.84 (м, 2Н), 1.84-1.78 (м, 2Н), 1.77 (с, 3Н), 1.24 (м, 1Н), 1.28 (д, 1=7.1 Гц, 3Н), 0.92 (м, 9Н), 0.97 (д, 1=6.9 Гц, 3Н), 0.40 (д, 1=7.1 Гц, 3Н).

21-О-(3,3-бис-(Дибензилфосфоно)пропаноил)глициноил)-1',4-дидегидро-1-дезокси-1,4-дигидро-5'(2-метилпропил)-1-оксорифамицин Х1У (20). К перемешиваемому раствору амина 19 (77 мг, 0.085 ммоль) и кислоте 15 (51 мг, 0.085 ммоль) в СН₂С1₂ (2 мл) добавляют Εΐ₃Ν (24 мкл, 0.170 ммоль) и ЕЭС1 (18 мг, 0.094 ммоль). После перемешивания в течение 24 ч при комнатной температуре смесь концентрируют в вакууме. Сырой продукт очищают с помощью хроматографии с обращенной фазой, элюируя водным раствором буфера (ΕρΝ/ΕΌ^ рН 7)/СΗзСN (от 10 до 100% линейный градиент), что дает на выходе 96 мг (0.065 ммоль, 76%) соединения 20 в виде твердого вещества пурпурно-темного цвета.

21-О-(Ы-3,3-Бисфосфонопропаноил)глициноил)-1',4-дидегидро-1-дезокси-1,4-дигидро-5'-(2метилпропил)-1-оксорифамицин Х1У (21). Перемешиваемый раствор тетрабензилдифосфоната 20 (96 мг, 0.065 ммоль) и ЫаНСОз (22 мг, 0.26 ммоль) в Е1ОН (5 мл) дегазируют в течение 10 мин Аг. К полученной смеси добавляют циклогексадиен (303 мкл, 3.24 ммоль) и 10% Ρά/С (70 мг, 0.065 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение 6 ч в атмосфере Аг до фильтрования через плотный слой из целита (ЕЮН). После удаления растворителя в вакууме сырой продукт очищают с помощью хроматографии с обращенной фазой, элюируя водным раствором буфера (Е1₃Ы/СО₂, рН 7)/СН₃СЫ (от 10 до 50% линейный градиент), что дает на выходе 34 мг (0.065 ммоль, 48%) соединения 21 в виде твердого вещества бледнопурпурного цвета.

ЬС/М8 чистота: 99.2% (254 нм), 94.9% (220 нм), 99.4% (320 нм). М8 (МН^-) 1117.9.

- 65 016059

р-ТЮННаО

МаН, ТГФ, название

Схема 6

Синтез 1-(4-(5,5-бис-(диэтилфосфоно)пентилокси)фенил)проп-2-ен-1-она

... НРг.._ _вг^> нагревайте при температуре кипения с обратным холодильником

О О <ею)А~Лоео5 с обратным холодильником

4-Бром-1-бутанол(22). К 67.5 мл (832.2 ммоль) доведенного до температуры кипения с обратным холодильником тетрагидрофурана добавляют по каплям 31 мл (274 ммоль) 48% бромисто-водородной кислоты и раствор желтого цвета еще раз доводят до температуры кипения с обратным холодильником в течение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры, реакционную смесь осторожно нейтрализуют насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия. Полученную смесь экстрагируют диэтиловым эфиром (3х) и сушат над безводным сульфатом натрия. Удаление растворителя дает продукт 19 в виде масла желтого цвета (10.7 г, 26%).

Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃) δ 1.69-1.76 (м, 2Н), 2.01-1.94 (м, 2Н), 3.46 (т, 1=6.6 Гц, 2Н), 3.70 (т, 1=6.4 Гц, 2Н).

2-(4-Бромбутокси)-тетрагидро-2Н-пиран (23). 3,4-Дигидро-2Н-пиран (8.5 мл, 90.96 ммоль) добавляют по каплям к дихлорметановому (20 мл) раствору соединения 22 (10.7 г, 69.93 ммоль) и моногидрату п-толуолсульфоновой кислоты (26.5 мг, 0.1372 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. После удаления растворителя остаток очищают с помощью флэш-хроматографии на силикагеле со смесью 5:1 гексан/этилацетат в виде элюента, что дает на выходе продукт 23 в виде бесцветного масла (15.3 г, 92%).

Ή ЯМР (400 МГц, СЧМ'Е) δ 1.48-1.62 (м, 4Н), 1.68-1.85 (м, 4Н), 1.94-2.02 (м, 2Н), 3.40-3.53 (м, 4Н), 3.74-3.88 (м, 2Н), 4.57-4.59 (м, 1Н).

Тетраэтил-5-(2-тетрагидро-2Н-пиранилокси)пентилен-1,1-бисфосфонат (24). К суспензии гидрида натрия (60%, 840.5 мг, 21.01 ммоль) в 40 мл ТГФ осторожно добавляют тетраэтилметиленбисфосфонат (6.16 г, 20.95 ммоль) и полученный бледно-желтого цвета прозрачный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем вводят бромид 23 (4.97 г, 20.96 ммоль) и затем промывают 5 мл ТГФ. Реакционную смесь доводят до температуры кипения с обратным холодильником в течение ночи и дают возможность остыть до комнатной температуры перед гашением насыщенным водным раствором хлорида аммония. Еще требуется небольшое количество воды, чтобы растворить твердое вещество. Смесь экстрагируют этилацетатом (3х), сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют в вакууме. Флэш-хроматография на силикагеле со смесью 20:1 (вес./вес.) дихлорметан/метанол в виде элюента дает 7.3 г загрязненного продукта 24 в виде масла слегка желтого цвета. Продукт используют непосредственно на следующей стадии без дополнительной очистки.

Находят '11 ЯМР сигналы (400 МГц, СЧМ'Е) δ 2.28 (тт, 1=6.1, 24.3 Гц, 1Н), 3.37-3.51 (м, 2Н), 3.713.89 (м, 2Н), 4.56-4.58 (м, 1Н).

Тетраэтил-5-гидроксипентилен-1,1-бисфосфонат (25). Сырое соединение 24 растворяют в 20 мл метанола и добавляют 74.6 мг (0.3863 ммоль) моногидрата η-толуолсульфоновой кислоты. После перемешивания в течение ночи при комнатной температуре смесь концентрируют и подвергают флэшхроматографии с градиентом элюирования от 15:1 этилацетат/метанол до 8:1, затем от 6:1 до получения на выходе соединения 25 в виде бесцветного масла (3.1 г, 41% после двух стадий).

Ή ЯМР (400 МГц, СОСГ) δ 1.24-1.36 (м, 12Н), 1.55-1.72 (м, 4Н), 1.89-2.03 (м, 2Н), 2.16 (Ьз, 1Н), 2.29 (тт, 1=6.1, 24.3 Гц, 1Н), 3.66 (Ьз, 2Н), 4.11-4.22 (м, 8Н).

Тетраэтил-5-иодпентилен-1,1-бисфосфонат (26). Спирт 25 (1.419 г, 3.938 ммоль), трифенилфосфин (1.25 г, 4.718 ммоль) и имидазол (325.6 мг, 4.735 ммоль) растворяют в 15 мл сухого ацетонитрила и добавляют 1.196 г (4.703 ммоль) Σ₂ в несколько порций. После перемешивания в течение ночи при комнатной температуре растворитель удаляют в вакууме и образовавшийся остаток переносят в этилацетат и насыщенный водный раствор Να₂8₂Ο₃. Смесь перемешивают пока органический слой не станет бледножелтого цвета и две фазы разделяют. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия и кон

- 66 016059 центрируют. Флэш-хроматография на силикагеле со смесью 15:1 этилацетат/метанол в виде элюента дает продукт 26 в виде масла желтого цвета (1.26 г, 68%).

Ή ЯМР (400 МГц, СЭСГ) δ 1.36 (т, 1=7.0 Гц, 12Н), 1.66-1.72 (м, 2Н), 1.81-1.99 (м, 4Н), 2.35 (тт, 1=5.9, 24.1 Гц, 1Н), 3.20 (т, 1=6.9 Гц, 2Н), 4.17-4.23 (м, 8Н).

1-(4-Гидроксифенил)проп-2-ен-1-он (27). Смесь 4-гидроксиацетофенона (2.719 г, 20 ммоль), параформальдегида (2.702 г, 90 ммоль) и трифторацетат Ν-метиланилиния (6.603 г, 30 ммоль) в 20 мл безводном ТГФ нагревают при температуре кипения с обратным холодильником в течение 3.5 ч и охлаждают до комнатной температуры. К раствору красного цвета добавляют 60 мл диэтилового эфира и смесь энергично перемешивают в течение 15 мин. Полученный желтого цвета раствор декантируют и остаток коричнево-красного цвета липкого глинистого раствора повторно экстрагируют порциями по 50 мл диэтилового эфира, пока он не станет твердым веществом желтого цвета. Объединенные органические экстракты промывают полунасыщенным раствором гидрокарбоната натрия (2х) и водную промывку экстрагируют эфиром (2х). Объединенные органические слои сушат над безводным сульфатом натрия до концентрации. Флэш-хроматография на силикагеле со смесью 5:1 гексан/этилацетат в виде элюента дает продукт 27 (1.21 г, 41%) в виде твердого вещества бледно-желтого цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃,) δ 5.89 (дд, 1=1.8, 10.6 Гц, 1Н), 5.91 (с, 1Н), 6.43 (дд, 1=1.6, 16.9 Гц, 1Н), 6.92 (д, 1=8.4 Гц, 2Н), 7.17 (дд, 1=10.6, 17.2 Гц, 1Н), 7.93 (6, 1=8.4 Гц, 2Н).

1-(4-(5,5-бис-(Диэтилфосфоно)пентилокси)фенил)проп-2-ен-1-он (28). Смесь иодида 26 (1.066 г, 2.267 ммоль), енона 27 (373 мг, 2.514 ммоль) и карбоната калия (369 мг, 2.673 ммоль) в 10 мл ацетона нагревают при температуре кипения с обратным холодильником пока иодид 26 не израсходуется, как определяют с помощью ¹Н ЯМР. Обычно это длится 6-8 ч. После удаления растворителя в вакууме, остаток переносят в дихлорметан и нерастворимые примеси отфильтровывают. Фильтрат промывают насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (2х) и сушат над безводным сульфатом натрия. Концентрация в вакууме дает масло желтого цвета с количественным выходом (1.14 г), которое используют непосредственно на следующей стадии без дополнительной очистки.

Ή ЯМР (400 МГц, СОСС) δ 1.31-1.37 (м, 12Н), 1.70-1.86 (м, 4Н), 1.92-2.08 (м, 2Н), 2.31 (тт, 1=6.2, 24.2 Гц, 1Н), 4.04 (т, 1=6.2 Гц, 2Н), 4.14-4.22 (м, 8Н), 5.87 (дд, 1=1.8, 10.6 Гц, 1Н), 6.42 (дд, 1=1.8, 17.2 Гц, 1Н), 6.93 (д, 1=9.2 Гц, 2Н), 7.17 (дд, 1=10.6, 16.9 Гц, 1Н), 7.95 (д, 1=9.2 Гц, 2Н).

Схема 7

Получение рифабутинбисфосфонатного конъюгата 30

Рифабутинбисфосфонатный конъюгат (29). Смесь рифабутина (573.8 мг, 0.6774 ммоль), бисфосфоната 28 (351.7 мг, 0.7171 ммоль) и ЭВи (0.22 мл, 1.471 ммоль) в 7 мл толуола перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. После удаления растворителя остаток переносят в этилацетат и промывают насыщенным раствором хлорида аммония (2х) перед высушиванием над безводным сульфатом натрия. Флэш-хроматография на силикагеле со смесью 30:1 дихлорметан/метанол, затем 25:1 в виде элюента дает рифабутинбисфосфонатный конъюгат 29 в виде твердого вещества красного цвета (400 мг, 44%), так же как оставшийся непрореагировавший рифабутин (275 мг, 48%), который загрязнен ничтожным количеством примесей, подобных линкеру.

Ή ЯМР (400 МГц, СОСС) δ 0.19 (д, 1=7.0 Гц, 3Н), 0.60 (д, 1=6.6 Гц, 3Н), 0.73 (д, 1=7.0 Гц, 3Н), 0.92 (д, 1=5.9 Гц, 6Н), 0.99 (д, 1=7.0 Гц, 3Н), 1.32 (т, 1=7.0 Гц, 12Н), 1.56-1.85 (м, 13Н), 1.91-2.05 (м, 3Н), 2.07 (с, 3Н), 2.12 (с, 3Н), 2.16-2.45 (м, 9Н), 2.64-2.74 (м, 2Н), 2.80-2.88 (м, 1Н), 2.92-3.04 (м, 3Н), 3.07-3.18 (м, 4Н), 3.24-3.32 (м, 2Н), 3.54-3.58 (м, 2Н), 3.79 (д, 1=9.9 Гц, 1Н), 3.97 (д, 1=5.5 Гц, 1Н), 4.03 (т, 1=5.5 Гц, 2Н), 4.13-4.22 (м, 8Н), 5.15 (д, 1=10.2 Гц, 1Н), 5.25 (дд, 1=4.8, 12.5 Гц, 1Н), 6.02 (дд, 1=6.6, 16.1 Гц, 1Н), 6.206.25 (м, 2Н), 6.90 (д, 1=9.2 Гц, 2Н), 7.04 (дд, 1=10.6, 15.8 Гц, 1Н), 7.88 (д, 1=9.2 Гц, 2Н), 8.19 (с, 1Н).

Рифабутинбисфосфонатный конъюгат (30). К смеси соединения 29 (397.6 мг, 0.2973 ммоль) и триэтиламина (2.10 мл, 15.05 ммоль) в 5 мл безводного дихлорметана добавляют 0.98 мл (7.425 ммоль)

- 67 016059 бромтриметилсилана. Смесь темного цвета перемешивают при комнатной температуре в течение более 20 ч. После концентрации в вакууме остаток перемешивают в смеси 15 мл 0.1 Ν соляной кислоты и 15 мл ацетонитрила при комнатной температуре в течение 2.5 ч до нектрализации 0.38 мл (2.723 ммоль) триэтиламина. Смесь сушат вымораживают и наносят на 10 г (35сс) Vаΐе^8 С18 8ер-Рак картридж с градиентом элюирования элюентом от воды до смеси 10:1 воды/ацетонитрил, затем от 8:1 до 6:1, до 5:1. Фракции желтого цвета концентрируют и сушат вымораживанием, что дает на выходе соединение 30 в виде твердого вещества от оранжевого до желтого цвета (50 мг, 14%).

Выбранный Ή ЯМР (400 МГц, 1)\18О-сГ) δ 0.01 (д, 1=6.9 Гц, 3Н), 0.49 (д, 1=6.6 Гц, 3Н), 0.72 (д, 1=6.9 Гц, 3Н), 0.85 (д, 1=7.0 Гц, 3Н), 0.88 (д, 1=6.6 Гц, 6Н), 1.09 (т, 1=7.3 Гц, 6Н), 1.16 (тт, 1=1.8, 7.3 Гц, 2Н), 1.20-1.28 (м, 3Н), 2.00 (с, 3Н), 2.09 (с, 3Н), 2.98 (с, 3Н), 3.40 (д, 1=6.2 Гц, 1Н), 3.53-3.54 (м, 1Н), 5.07 (дд, 1=6.2, 12.8 Гц, 1Н), 5.18 (д, 1=10.3 Гц, 1Н), 5.92 (д, 1=7.3, 15.4 Гц, 1Н), 6.20-6.23 (м, 2Н), 6.82 (дд, 1=11.0, 15.8 Гц, 1Н), 7.00 (д, 1=8.8 Гц, 2Н), 7.74 (д, 1=8.8 Гц, 2Н), 8.74 (с, 1Н).

³¹Р (162 МГц, ДМСО-Д₆) δ 20.53.

Схема 8

Тетраэтил-4-(2-тетрагидро-2Н-пиранилокси)бутилен-1,1-бисфосфонат (31). К суспензии №1Н (60% суспензия в минеральном масле, 900 мг, 22.0 ммоль) в сухом ТГФ (20 мл) добавляют по каплям тетраэтилметиленбисфосфонат (6.46 г, 22.4 ммоль). Полученный прозрачный раствор перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре, после чего добавляют по каплям 2-(3-бромпропокси)тетрагидро2Н-пиран (5.05 г, 22.6 ммоль). Реакционную смесь нагревают до температуры кипения с обратным холодильником в течение 6 ч, разбавляют СН₂С1₂ (75 мл) и промывают рассолом (2x50 мл), сушат (Мд8О₄) и упаривают. Ее используют без очистки на следующей стадии.

Тетраэтил-4-гидроксибутилен-1,1-бисфосфонат (32). К перемешиваемому раствору сырого продукта 31 (максимум 22.4 ммоль) в МеОН (40 мл) добавляют АтЬегШе ^-120 (0.6 г). Реакционную смесь нагревают до температуры 50°С в течение 4 ч, фильтруют и упаривают. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии на силикагеле с градиентом элюирования из 5-10% смеси метанол/этилацетат, что дает очищенное соединение 32 (2.67 г, 34% из тетраэтилметиленбисфосфоната).

Ή ЯМР (400 МГц, СЭСГ) δ 1.30-1.36 (м, 12Н), 1.75-1.85 (м, 2Н), 1.97-2.13 (м, 2Н), 2.30-2.64 (м, 2Н), 3.66 (т, 1=5.8, 2Н), 4.12-4.23 (м, 8Н).

Тетраэтил-4-иодбутилен-1,1-бисфосфонат (33). К раствору соединения 32 (1.52 г, 4.39 ммоль) в СН₂С1₂ (50 мл) добавляют трифенилфосфин (1.32 г, 5.033 ммоль) и имидазол (0.45 г, 6.61 ммоль). Реакционную смесь охлаждают до температуры 0°С перед добавлением йода (1.22 г, 4.81 ммоль). Смесь затем удаляют из охлаждающей бани, перемешивают в течение 2 ч, разбавляют гексаном (100 мл) и фильтруют, промывая затем осадок гексаном (2x30 мл). Фильтрат упаривают и очищают с помощью флэшхроматографии на силикагеле с градиентом элюирования из 0-10% смеси метанол/этилацетат, что дает очищенное соединение 33 (1.6 г, 80%).

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1_;) δ 1.32-1.38 (м, 12Н), 1.95-2.15 (м, 4Н), 2.28 (тт, 1=24.1, 6.1, 1Н), 3.18 (т, 1=6.6, 2Н), 4.12-4.24 (м, 8Н).

1-(4-(4,4-бис-(Диэтилфосфоно)бутокси)фенил)проп-2-ен-1-он (34). Смесь иодида 33 (3.1 г,

6.8 ммоль), фенола 27 (1.21 г, 8.17 ммоль) и К₂СО₃ (1.033 г, 7.47 ммоль) в ацетоне (75 мл) нагревают при температуре кипения с обратным холодильником в течение 6.5 ч. Смесь охлаждают, фильтруют и упаривают. Остаток повторно растворяют в СН₂С1₂ (170 мл), фильтруют через целит и упаривают, что дает сырое соединение 34 (3.2 г, 99%), которое используют непосредственно на следующей стадии.

Ή ЯМР (400 МГц, СЭСГ) δ 1.28-1.39 (м, 12Н), 1.89-2.25 (м, 4Н), 2.26-2.48 (м, 1Н), 4.05 (т, 1=5.7, 2Н), 4.12-4.26 (м, 8Н), 5.87 (дд, 1=10.6, 1.8, 1Н), 6.42 (дд, 1=16.9, 1.8, 1Н), 6.93 (д, 1=8.8, 2Н), 7.17 (дд, 1=17.0, 10.4, 1Н), 7.95 (д, 1=8.8, 2Н).

- 68 016059

Схема 9

Получение рифабутинбисфосфонатного конъюгата 36

Рифабутинбисфосфонатный конъюгат 35. Смесь 6 г (7.088 ммоль) рифабутина, соединения 34 (3.656 г, 7.431 ммоль) и ΌΒυ (2.20 мл, 14.71 ммоль) в 70 мл толуола перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь промывают насыщенным водным раствором хлорида аммония (дважды) и сушат над безводным сульфатом натрия. Флэш-хроматография на силикагеле, используя градиент элюирования от 40:1, затем 30:1, 20:1, 15:1 и 10:1 (вес./вес.) дихлорметан/метанол, дает продукт 35. Продукт 35 получают в виде твердого вещества красно-коричневого цвета (4.4 г, 47%).

¹Н ЯМР (400 МГц, СЭСТ) δ 0.20 (д, 1=7.0, 3Н), 0.60 (д, 1=6.6, 3Н), 0.72 (д, 1=6.6, 3Н), 0.91 (д, 1=6.6, 3Н), 0.92 (д, 1=6.6, 3Н), 0.99 (д, 1=7.0, 3Н), 1.34 (дт, 1=7.0, 1.1, 12Н), 1.56-1.85 (м, 10Н), 2.00-2.46 (м, 20Н), 2.64-2.74 (м, 2Н), 2.80-2.88 (м, 1Н), 2.92-3.02 (м, 3Н), 3.11 (с, 3Н), 3.12-3.18 (м, 1Н), 3.25-3.32 (м, 1Н), 3.55-3.57 (м, 1Н), 3.79 (д, 1=9.5, 1Н), 3.95 (д, 1=5.1, 1Н), 4.02-4.06 (м, 2Н), 4.14-4.23 (м, 8Н), 5.14 (д, 1=10.2, 1Н), 5.24 (дд, 1=12.6, 5.1, 1Н), 6.02 (дд, 1=16.1, 6.6, 1Н), 6.19-6.24 (м, 2Н), 6.90 (д, 1=9.2, 2Н), 7.06 (дд, 1=16.1, 11,0, 1Н), 7.88 (д, 1=8.8, 2Н), 8.17 (с, 1Н).

³¹Р ЯМР (162 МГц, СЭСТ) δ 24.58.

Рифабутинбисфосфонатный конъюгат 36. Соединение 35 (4.4 г, 3.325 ммоль) растворяют в 50 мл безводного дихлорметана. К полученному раствору добавляют 23 мл (164.1 ммоль) триэтиламина, а затем 11 мл (83.34 ммоль) бромтриметилсилана. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение более 20 ч. После удаления растворителя остаток переносят в смесь 200 мл 0.1 Ν соляной кислоты и 75 мл ацетонитрила и перемешивают при комнатной температуре в течение 5 ч. По окончании обработки добавляют 4.7 мл триэтиламина и нерастворимые примеси отфильтровывают. Органические растворители удаляют и образовавшийся остаток лиофилизуют. Полученный продукт подвергают флэшхроматографии с обращенной фазой на колонке С18 с линейным градиентом элюирования от 20% ацетонитрила в 30 мМ триэтиламин/водный раствор диоксида углерода (рН 6.8) до чистого ацетонитрила. Из фракций, содержащих продукт, ацетонитрил удаляют в вакууме и полученный водный раствор лиофилизуют, что дает на выходе соединение 36 в виде твердого вещества оранжево-коричневого цвета в форме соли бис-триэтиламмония (1.137 г, 24%).

¹Н ЯМР (400 МГц, Ό₂Ο) δ 0.01 (д, 1=6.6, 3Н), 0.63 (д, 1=6.6, 3Н), 0.81 (д, 1=7.0, 3Н), 0.95 (д, 1=7.0, 3Н), 1.01 (д, 1=6.2, 6Н), 1.26 (т, 1=7.3, 18Н), 1.60 (с, 3Н), 1.54-1.62 (м, 1Н), 1.68-2.16 (м, 11Н), 2.03 (с, 3Н), 2.09 (с, 3Н), 2.13 (с, 3Н), 2.30-2.37 (м, 2Н), 2.42-2.50 (м, 2Н), 2.66-2.75 (м, 2Н), 3.00-3.28 (м, 3Н), 3.07 (с, 3Н), 3.18 (кв., 1=7.3, 12Н), 3.53-3.59 (м, 4Н), 3.76 (д, 1=8.8, 1Н), 4.13-4.16 (м, 3Н), 5.10 (д, 1=11, 1Н), 5.35 (дд, 1=12.5, 7.0, 1Н), 6.04 (дд, 1=15.8, 1Н), 6.26 (д, 1=12.5, 1Н), 6.38 (д, 1=11.4, 1Н), 6.74 (дд, 1=16.1, 11.4, 1Н), 6.99 (д, 1=8.8, 2Н), 7.71 (д, 1=8.8, 2Н).

³¹Р ЯМР (162 МГц, Ό₂Ο) δ 21.00.

- 69 016059

Схема 10

Получение рифабутинбисфосфонатного конъюгата 39

2, ЕРС1.НС1,

Ε1₃Ν, ОМАР,

СН_гС1_г

-О-(3 -Карбоксипропаноил)-1',4-дидегидро-1 -дезокси-1,4-дигидро-5'-(2-метилпропил)-1оксорифамицин /IV (37). Рифабутин 17 (153.8 мг, 0.1816 ммоль) нагревают при температуре кипения с обратным холодильником в течение ночи с 44.3 мг (0.4427 ммоль) янтарного ангидрида и 6.4 мг (0.05239 ммоль) ΌΜΆΡ в 3 мл безводного ТГФ. После концентрации полученный продукт подвергают флэш-хроматографии на силикагеле, элюируя смесью дихлорметан/метанол (30:1 (вес./вес.), затем 20:1, затем 10:1), что дает на выходе продукт 37 (136.4 мг, 80%) в виде твердого вещества пурпурно-темного цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, ί.ΌΟ₃,) δ -0.15 (д, 1=7.0, 3Н), 0.50 (д, 1=6.6, 3Н), 0.88-1.00 (м, 9Н), 1.07 (д, 1=7.0, 3Н), 1.20-1.26 (м, 2Н), 1.57 (с, 1Η), 1.79 (с, 3Н), 1.80-1.98 (м, 4Н), 2.02 (с, 3Н), 2.04 (с, 3Н), 2.26 (с, 3Н),

2.30-2.66 (м, 9Н), 2.86-3.21 (м, 5Н), 3.08 (с, 3Н), 3.47 (уширенный с, 1Η), 3.66 (с, 1Н), 4.98-5.06 (м, 2Н),

5.76-5.86 (м, 1Н), 6.02 (д, 1=12.5, 1Н), 6.15 (д, 1=11.0, 1Η), 6.30-6.37 (м, 1Н), 7.99 (с, 1Н), 8.35 (уширенный с, 1Н).

-О-(3 -((бис-( Диэтилфосфоно)метил)карбамоил)пропаноил)-1',4-дидегидро-1-дезокси-1,4-дигидро5'-(2-метилпропил)-1-оксорифамицин ХТУ (38). Кислоту 37 (136 мг, 0.1436 ммоль) и амин 2 (44 мг, 0.1446 ммоль) растворяют в 2 мл безводного дихлорметана и добавляют 40 мкл (0.2854 ммоль) триэтиламина, а затем ΕΌΟ-Ηα (64 мг, 0.3338 ммоль) и ΌΜΆΡ (3.5 мг, 0.02865 ммоль). После перемешивания в течение ночи при комнатной температуре смесь концентрируют и подвергают флэш-хроматографии на силикагеле. Колонку первоначально элюируют смесью 10:1 (вес./вес.) этилацетат/уксусная кислота, пока не вымоют полоску пурпурно-темного цвета непрореагировавшего рифабутина. Затем используют элюирование смесью дихлорметан/метанол (20:1 (вес./вес.), затем 10:1), что дает на выходе продукт 38 (58.9 мг, 33%) в виде твердого вещества пурпурно-темного цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, ί.ΌΟ₃,) δ -0.18 (д, 1=7.3, 3Н), 0.47 (д, 1=7.0, 3Н), 0.92 (д, 1=6.6, 3Н), 0.95-1.03 (м, 9Н), 1.12-1.32 (м, 2Н), 1.35 (т, 1=7.0, 12Н), 1.79 (с, 3Н), 1.80-1.98 (м, 4Н), 2.02 (с, 3Н), 2.08 (с, 3Н), 2.002.10 (м, 3Н), 2.29 (с, 3Н), 2.32-2.76 (м, 8Н), 2.80-3.10 (м, 5Н), 3.07 (с, 3Н), 3.49 (уширенный с, 1Η), 4.144.28 (м, 8Н), 4.95 (д, 1=10.7, 1Η), 4.98-5.12 (м, 2Н), 5.86 (дд, 1=15.4, 7.7, 1Н), 6.08-6.15 (м, 1Η), 6.40 (дд, 1=15.4, 11.4, 1Н), 6.65 (д, 1=10.3, 1Н), 8.15 (с, 1Η), 8.28 (уширенный с,Ш).

-О-(3 -((Бисфосфонометил)карбамоил)пропаноил)-1',4-дидегидро-1 -дезокси-1,4-дигидро-5'-(2метилпропил)-1-оксорифамицин /IV (39). Соединение 38 (57.4 мг, 0.04658 ммоль) растворяют в 0.5 мл безводного дихлорметана и последовательно добавляют 0.33 мл (2.355 ммоль) триэтиламина и 0.16 мл (1.212 ммоль) ΤΜ8Βγ. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи и концентрируют. После высушивания в вакууме в течение по крайней мере 30 мин продукт растворяют в смеси 2.8 мл

- 70 016059

0.1 N НС1 (водный раствор) и 2.8 мл ацетонитрила. После перемешивания в течение 1.5 ч раствор подщелачивают 0.07 мл триэтиламина и органический растворитель осторожно удаляют. Остаток фильтруют и лиофилизуют. Твердый продукт после лиофилизации наносят на С18 колонку в автоматическом аппарате отделения Вю1аде® с линейным градиентом элюирования от 10% ацетонитрила в 30 мМ буфере гидрокарбоната триэтиламмония (рН 6.8) до 60%, а затем промывают чистым ацетонитрилом, что дает на выходе твердое вещество пурпурно-темного цвета 39 в виде соли бис-триэтиламина (20.5 мг, 33%).

Выбранный ¹Н ЯМР (400 МГц, Ό₂Ο) δ 0.16 (уширенный, 3Н), 0.40 (д, 1=5.5, 3Н), 0.74 (уширенный с, 1Н), 0.88 (д, 1=6.6, 3Н), 1.00 (д, 1=6.6, 3Н), 1.06 (д, 1=6.6, 6Н), 1.27 (т, 1=7.3, 18Н), 1.55 (уширенный с, 1Н), 1.78 (с, 3Н), 1.99 (с, 3Н), 2.01 (с, 3Н), 2.19 (с, 3Н), 2.20-2.26 (м, 1Н), 2.39 (уширенный с, 1Н), 2.65 (уширенный с, 5Н), 2.97-3.00 (м, 1Н), 3.02 (с, 3Н), 3.10-3.24 (м, 5Н), 3.19 (кв., 1=7.3, 12Н), 3.29-3.32 (м, 2Н), 3.65 (уширенный с, 5Н), 4.28 (т, 1=19.0, 1Н), 5.01-5.04 (м, 1Н), 5.32 (уширенный, 1Н), 5.99 (дд, 1=15.4, 9.2, 1Н), 6.19 (д, 1=12.5, 1Н), 6.43 (д, 1=11.0, 1Н), 6.80 (уширенный с, 1Н).

³¹Р ЯМР (162 МГц, Ό₂Ο) δ 14.15. М8 (М-Н): 1118.2.

Схема 11

Получение тетраэтил(4-аминобутаноиламино)метилен-1,1 -бисфосфоната

4-(трет-Бутоксикарбониламино)бутановая кислота (41). Аминокислоту 40 (956.2 мг, 9.273 ммоль) перемешивают с ВоС₂О (2.037 г, 9.333 ммоль) и 23 мл 1 N №1ΟΗ (водный раствор) в 5 мл ТГФ при комнатной температуре в течение ночи. Раствор подкисляют разбавленной соляной кислотой пока значение рН не достигнет значения около 2, при этом образуется мутная смесь. Реакционную смесь экстрагируют этилацетатом (3х) и сушат над безводным сульфатом натрия до удаления растворителя, что дает на выходе бесцветное масло 41 (1.759 г, 93%).

Ή ЯМР (400 МГц, СЭСЕ,) δ 1.44 (с, 9Н), 1.83 (квинт. 1=7.0, 2Н), 2.41 (т, 1=7.0, 2Н), 3.12-3.24 (м, 2Н), 4.66 (уширенный с, 1Н).

Тетраэтил (4-(трет-бутоксикарбониламино)бутаноиламино)метилен-1,1-бисфосфонат (42). Кислоту 41 (314.6 мг, 1.547 ммоль) и амин 2 (466.8 мг, 1.539 ммоль) растворяют в 15 мл сухого дихлорметан. Добавляют триэтиламин (0.44 мл, 3.14 ммоль), а затем ОМАР (37.6 мг, 0.3078 ммоль) и ΕΌΟ-ΗΠ (592.4 мг, 3.09 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи перед концентрированием. Флэш-хроматография на силикагеле с элюированием смесью 15:1 (вес./вес.) этилацетат/метанол дает 469.3 мг (62%) соединения 42 в виде масла бледно-желтого цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃) δ 1.34 (т, 1=7.0, 12Н), 1.44 (с, 9Н), 1.83 (квинт. 1=7.0, 2Н), 2.31 (т, 1=7.0, 2Н), 3.16-3.24 (м, 2Н), 4.16-4.26 (м, 8Н), 4.78 (уширенный с, 1Н), 5.06 (дт, 1=21.6, 9.9, 1Н), 6.61 (уширенный д, 1=10.3, 1Н).

Тетраэтил (4-аминобутаноиламино)метилен-1,1-бисфосфонат (43) Соединение 42 (469 мг,

0.9602 ммоль) растворяют в небольшом количестве ТЕА и раствор концентрируют. Остаток переносят в 1 N водный раствор №1ΟΗ и экстрагируют этилацетатом (5х). Объединенные экстракты сушат над сульфатом натрия и концентрируют досуха в вакууме, что дает на выходе соединение 43 в виде бесцветного масла (82 мг, 22%).

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1_;) δ 1.34 (дт, 1=7.0, 2.6, 12Н), 1.79 (квинт. 1=7.0, 2Н), 2.38 (т, 1=7.0, 2Н), 2.79 (т, 1=7.0, 2Н), 4.14-4.26 (м, 8Н), 5.05 (дт, 1=21.3, 8.5, 1Н), 7.08 (уширенный д, 1=8.0, 1Н).

- 71 016059

Схема 12

Получение рифабутинбисфосфонатного коныогата 45

ТМ5Бг, СН_гС1₂(

Е«зМ N. 45Н«Н.Εί₃Ν

-Ο-(3 -(3 -((бис-( Диэтилфосфоно)метил)карбамоил)пропилкарбамоил)пропаноил)-1',4-дидегидро1-дезокси-1,4-дигидро-5'-(2-метилпропил)-1-оксорифамицин XIV (44). Смесь кислоты 37 (432.5 мг, 0.4567 ммоль), амина 43 (176.3 мг, 0.4540 ммоль), ЕЭС1-НС1 (180.1 мг, 0.9394 ммоль), ΌΜΆΡ (11.9 мг, 0.09741 ммоль) и триэтиламина (0.13 мл, 0.9277 ммоль) в 5 мл дихлорметана перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. После концентрации досуха остаток очищают с помощью хроматографии на 8ίΟ₂ в автоматической флэш-системе очистки Вю1аде® с градиентом элюирования 2-10% метанола в дихлорметане с использованием более 15 объемов колонки, что дает соединение 44 в виде твердого вещества пурпурно-темного цвета (404.8 мг, 68%).

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃) δ -0.21 (д, 1=7.0, 3Н), 0.47 (д, 1=7.0, 3Н), 0.91 (д, 1=7.0, 3Н), 0.98 (уширенный с, 3Н), 1.03 (д, 1=7.0, 6Н), 1.41 (т, 1=7.3, 12Н), 1.79 (с, 3Н), 1.72-2.00 (м, 11Н), 2.01 (с, 3Н), 2.02 (с, 3Н), 2.28 (с, 3Н), 2.28-2.54 (м, 10Н), 2.84-2.92 (м, 2Н), 3.05 (с, 3Н), 3.18-3.23 (м, 2Н), 3.32-3.37 (м, 2Н), 3.45-3.49 (м, 2Н), 4.11-4.28 (м, 8Н), 4.96 (д, 1=11.0, 1Н), 5.00-5.14 (м, 2Н), 5.92 (дд, 1=15.4, 7.0, 1Н), 6.07 (д, 1=13.2, 1Н), 6.17 (д, 1=11.4, 1Н), 6.39 (дд, 1=15.4, 11.4, 1Н), 6.68 (уширенный с, 1Н), 6.79 (уширенный с, 1Н), 8.00 (уширенный с, 1Н), 8.18 (уширенный с, 1Н).

-Ο-(3 -(3 -((Бисфосфонометил)карбамоил)пропилкарбамоил)пропаноил)-1',4-дидегидро-1-дезокси1,4-дигидро-5'-(2-метилпропил)-1-оксорифамицин XIV (45). Соединение 44 (396.5 мг, 0.3010 ммоль) растворяют в 3 мл дихлорметана и добавляют 2.1 мл (14.99 ммоль) триэтиламина, а затем 1 мл (7.577 ммоль) ТМ8Вг. Смесь красного цвета перемешивают в течение по крайней мере 20 ч при комнатной температуре и концентрируют досуха. После высушивания в высоком вакууме в течение по крайней мере 30 мин, твердый продукт переносят в смесь 18 мл 0.1 N НС1 и 10 мл ацетонитрила и перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, в течение которого получают прозрачный раствор. После подщелачивания путем добавления 0.43 мл триэтиламина (конечное значение рН 9.6) органический растворитель осторожно удаляют и нерастворимый продукт отфильтровывают. Фильтрат лиофилизуют и образовавшийся остаток подвергают флэш-хроматографии на С18 колонке в автоматической системе Вю1аде® с градиентом элюирования 10-60% ΜеСN в 30 мМ буфере гидрокарбоната триэтиламмония (рН 6.5) с использованием более 15 объемов колонки, что дает на выходе соединение 45 в виде твердого вещества пурпурно-темного цвета (194 мг, 46%) в виде соли бис-триэтиламмония.

Ή ЯМР (400 МГц, Ό₂Ο) δ -0.04 (д, 1=6.6, 3Н), 0.39 (д, 1=6.2, 3Н), 0.76 (уширенный с, 1Н), 0.88 (д, 1=7.0, 3Н), 0.95 (д, 1=6.6, 3Н), 1.08 (д, 1=6.6, 6Н), 1.26 (т, 1=7.3, 18Н), 1.53 (уширенный с, 1Н), 1.80-2.32 (м, 8Н), 1.81 (с, 3Н), 1.98 (с, 3Н), 2.02 (с, 3Н), 2.10 (с, 3Н), 2.32-2.72 (м, 10Н), 2.96-3.02 (м, 2Н), 2.99 (с, 3Н), 3.18 (кв., 1=7.3, 12Н), 3.35 (д, 1=7.3, 1Н), 3.60-3.84 (м, 4Н), 4.33 (т, 1=19.1, 1Н), 4.95 (д, 1=10.3, 1Н), 5.04-5.06 (м, 1Н), 5.21 (дд, 1=12.4, 5.1, 1Н), 5.97 (дд, 1=15.0, 7.7, 1Н), 6.10 (д, 1=12.5, 1Н), 6.39 (д, 1=10.6, 1Н), 6.63 (дд, 1=15.1, 11.4, 1Н).

³¹Ρ ЯМР (162 МГц, Ό₂Ο) δ 13.99; Масс (М-Н): 1203.

- 72 016059

Схема 13

Получение (карбонохлоридоилокси)метил-5,5-бис-(диэтилфосфоно)пентаноата рос, ОМЕ от

ТЕМРО, №ОС1, МаОС1₂ *

(ЕЮ)₂Р''° (ЕЮ)₂Р'

О (ЕЮ)₂Р*° о (ΕίΟ)₂Ρ'^Λχ/Χ/ΛΌΗ

О 46 (л-ВиЦМНЗО₄, ИаНСОэ Н_гО, СН₂С1₂ (ΕΙΟ)₂Ρ^>Ο

5О₂С12 (ΕίΟ)₂Ρ'

Ο ^(ат° I _ I (ΕΙΟ)₂Ρ'^'^^''Ο Ο'^><'3Εί

О

Тетраэтил-5-карбоксипентилен-1,1-бисфосфонат (46). Спирт 25 (1.3942 г, 3.869 ммоль) растворяют в 40 мл безводного ДМФА и добавляют 5.098 г (13.55 ммоль) дихромат пиридиния. Полученный раствор темного цвета перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют до половины от первоначального объема и разбавляют водой. Смесь экстрагируют этилацетатом (3х) и объединенные экстракты сушат над сульфатом натрия и концентрируют досуха. Флэшхроматография на силикагеле с элюированием смесью 15:1 (вес./вес.) дихлорметан/метанол дает кислоту 46 (606 мг, 42%) в виде бесцветного масла. Альтернативно, к смеси спирта 25 (475 мг, 1.318 ммоль), ТЕМРО (15 мг, 0.095 ммоль), МеСN (6 мл) и фосфатно-натриевого буфера (6 мл, 0.67 М, рН 6.7), нагретой до температуры 35 С, добавляют по каплям раствор хлорида натрия (300 мг в 2 мл воды) и разбавленный отбеливатель (0.75 мл раствора 1 мл коммерчески отбеливателя в 19 мл воды) с помощью делительной шприцовки. Смесь изменяет цвет с желтого на красный. Через 5 ч реакция закончивается, как определяют с помощью ТСХ и 'Н ЯМР, и реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры. Добавляют 30 мл воды и значение рН доводят до приблизительно 9 путем добавления 3 мл 1 N №ЮН. Реакцию гасят, выливая в холодный раствор №-ь8О₃, (500 мг в 10 мл воды) и поддерживая температуру ниже 20°С. Через 30 мин перемешивания при той же температуре используют 30 мл диэтилового эфира, чтобы экстрагировать смесь и органическую фазу отбрасывают. Значение рН водной фазы повторно доводят до значения между 3-4 путем добавления 5 мл 1 N НС1 и смесь экстрагируют дихлорметаном (3х). Объединенные экстракты сушат над сульфатом натрия и концентрируют, что дает на выходе кислоту 46 с количественным выходом, которая может быть использована на следующей стадии без дополнительной очистки.

Ή ЯМР (400 МГц, С1)С1_;) δ 1.34 (т, 1=7.0, 12Н), 1.86-2.06 (м, 4Н), 2.33 (тт, 1=24.2, 5.9, 1Н), 2.36 (т, 1=7.3, 2Н), 4.14-4.22 (8Н).

8-Этил-О-(5,5-бис-(диэтилфосфоно)пентаноилокси)метилкарбонотиоат (47). Кислоту 46 (606 мг, 1.619 ммоль), гидросульфат тетрабутиламмония (552 мг, 1.626 ммоль) и гидрокарбонат натрия (274.2 мг, 3.264 ммоль) добавляют к смеси 4 мл воды и 4 мл дихлорметана. После завершения выделения газа добавляют 310.8 мг (1.263 ммоль) 8-этил-О-иодметилкарбонотионата (синтезируют в соответствии с Ро1ктапп, М.; Ьцпб, РР ЗугИНехА 1990, 1159-1166) в 1 мл дихлорметана и смесь перемешивают в течение 2 ч. Органическую фазу отделяют, промывают водой (1х) и сушат над сульфатом натрия. После фильтрования и концентрации остаток перемешивают в эфире в течение 10 мин. Твердое вещество удаляют и фильтрат концентрируют и подвергают флэш-хроматографии на силикагеле с элюированием смесью 20:1 (вес./вес.) дихлорметан/метанол, что дает на выходе соединение 47 (519.2 мг, 83%) в виде бесцветного масла.

Ή ЯМР (400 МГц, СЭСР) δ 1.33 (т, 1=7.3, 3Н), 1.35 (т, 1=7.7, 12Н), 1.86-2.04 (м, 4Н), 2.28 (тт, 1=23.8, 6.2, 1Н), 2.40 (т, 1=7.3, 2Н), 2.90 (кв., 1=7.3, 2Н), 4.14-4.22 (м, 8Н), 5.80 (с, 2Н).

(Карбонохлоридоилокси)метил-5,5-бис-(диэтилфосфоно)пентаноат (48). Очищенное соединение 47 (519.2 мг, 1.054 ммоль) охлаждают на бане воды со льдом и осторожно добавляют сульфурилхлорид (128 мкл, 1.579 ммоль). Реакционной смеси дают возможность нагреться до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. После удаления избытка сульфурилхлорида в вакууме, сырой хлорангидрид кислоты 48 используют непосредственно на следующей стадии без дополнительной очистки.

Ή ЯМР (400 МГц, СОСР) δ 1.35 (т, 1=7.0, 12Н), 1.86-2.06 (м, 4Н), 2.28 (тт, 1=23.8, 6.2, 1Н), 2.45 (т, 1=7.0, 2Н), 2.90 (кв., 1=7.3, 2Н), 4.14-4.24 (м, 8Н), 5.82 (с, 2Н).

- 73 016059

Схема 14

Получение рифабутинбисфосфонатного конъюгата 50

1?

ТМ8Вг, СНгСГгЛ К = Е1

Ε^Ν Ч да к «Ц.ЕШ

Рифабутинбисфосфонатный конъюгат 49. Рифабутин 17 (899 мг, 1.061 ммоль) растворяют в 10 мл ТГФ и добавляют протонную губку (453.5 мг, 2.116 ммоль) и сырой хлорангидрид кислоты 48 (1.054 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи и разбавляют этилацетатом. Раствор промывают водой (2х), сушат над сульфатом натрия и концентрируют досуха. Остаток очищают с помощью флэш-хроматографии на силикагеле, элюируя полоску рифабутина пурпурно-темного цвета смесью 19:1 (вес./вес.) этилацетат/метанол и изменяя градиент элюирования смеси дихлорметан/метанол (от 30:1 (вес./вес.) до 20:1, до 10:1), что дает на выходе соединение 49 (504.3 мг, 37%) в виде твердого вещества темно-красно-оранжевого цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, СССР) δ -0.07 (уширенный д, 1=7.0, 3Н), 0.59 (д, 1=6.6, 3Н), 0.85 (д, 1=7.0, 3Н), 0.96 (д, 1=6.6, 6Н), 1.02 (д, 1=7.0, 3Н), 1.31-1.36 (м, 12Н), 1.50-2.02 (м, 10Н), 1.76 (с, 3Н), 2.05 (с, 3Н), 2.09 (уширенный с, 3Н), 2.20-2.40 (м, 6Н), 2.32 (с, 3Н), 2.84-3.04 (м, 6Н), 3.09 (с, 3Н), 3.38-3.44 (м, 2Н), 3.743.82 (м, 2Н), 4.12-4.22 (м, 8Н), 4.98 (уширенный д, 1=9.5, 1Н), 5.15 (уширенный, с, 1Η), 5.75-5.92 (м, 2Н), 6.00-6.28 (м, 3Н), 6.79 (уширенный с, 1Η), 8.03 (уширенный с, 1Η).

Рифабутинбисфосфонатный конъюгат 50. Соединение 49 (499.1 мг, 0.3907 ммоль) растворяют в 4 мл дихлорметана и последовательно добавляют 2.7 мл (19.27 ммоль) триэтиламина и 1.3 мл (9.850 ммоль) ТМ8Вг. Полученную смесь ярко-красно-оранжевого цвета перемешивают при комнатной температуре в течение по крайней мере 20 ч до концентрации в вакууме. Остаток переносят в смесь разбавленного водного раствора НС1 (20 мл, рН 4.5) и 15 мл МеСЫ и перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, при этом получают прозрачный раствор темно-красного цвета. Добавляют триэтиламин (0.22 мл, 4 экв.), чтобы довести конечное значение рН до 9.4. Органический растворитель осторожно удаляют и нерастворимые продукты отфильтровывают. Полученную водную смесь лиофилизуют для удаления воды. Твердый продукт подвергают флэш-хроматографии на С18 колонке в автоматической системе Вю1аде® с градиентом элюирования 10-60% МеСЫ в 30 мМ буфере гидрокарбоната триэтиламмония (рН 6.5) над 12 объемами колонки, что дает соль бис-триэтиламмония 50 в виде твердого вещества темно-красного цвета (166 мг, 31%).

Ή ЯМР (400 МГц, Ό₂Ο) δ -0.08 (уширенный д, 1=5.9, 3Н), 0.61 (д, 1=6.3, 3Н), 0.89 (д, 1=5.9, 3Н), 0.96 (д, 1=7.0, 6Н), 1.08 (д, 1=6.6, 3Н), 1.09 (д, 1=6.6, 3Н), 1.26 (т, 1=7.3, 18Н), 1.58-2.14 (м, 24Н), 2.20-2.30 (м, 2Н), 2.41 (уширенный с, 3Н), 3.06 (с, 3Н), 3.10-3.22 (м, 2Н), 3.18 (кв., 1=7.3, 12Н), 3.55 (уширенный с, 2Н), 3.72-3.88 (м, 4Н), 3.99 (уширенный с, 1Н), 4.28 (уширенный с, 1Н), 4.98 (уширенный с, 1Н), 5.25 (уширенный с, 1Н), 5.83 (уширенный с, 2Н), 5.96-6.16 (м, 2Н), 6.43 (уширенный с, 1Н), 7.35 (уширенный с, 1Η).

³¹Р ЯМР (162 МГц, Ό₂Ο) δ 20.81; Масс (М-Н):1163.

Схема 15

Получение 3 -[(тетраэтилбисфосфонометил)карбамоил] пропионовой кислоты

3-[(Тетраэтилбисфосфонометил)карбамоил]пропионовая кислота (51). Соединение 51 получают, как описано в 1. Эгид ТагдеРпд, 1997, 5, 129-138. Его получают в виде масла, которое медленно застывает с 57% выходом сырого продукта из соединения 2. Сырой продукт может быть очищен с помощью хроматографии (10% АсОН/ЕЮАс), что дает твердое вещество белого цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, СОСС) δ 1.31 (т, 1=7.0, 6Н), 1.33 (т, 1=7.1, 6Н), 2.61-2.73 (м, 4Н), 4.05-4.28 (м,

- 74 016059

8Н), 5.07 (Ιά, 1=21.6, 1=9.8, 1Η), 7.90 (д, 1=9.4, 1Η).

¹Η ЯМР (400 МГц, СИС1₃) δ -0.18 (д, 1=7, 3Н), 0.48 (д, 1=7, 3Н), 0.92 (д, 1=7, 3Н), 0.94 (м, 6Н), 1.04 (д, 1=7, 3Н), 1.22 (м, 2Н),1.79 (с, 3Н), 1.84-2.15 (м, 9Н), 2.01 (с, 3Н), 2.03 (с, 3Н), 2.25-2.37 (м, 4Н), 2.29 (с, 3Н), 2.50 (м, 1Η), 2.67 (м, 2Н), 2.87 (м, 1Н), 2.93-3.11 (м, 2Н), 3.05 (с, 3Н), 3.35-3.40 (м, 2Н), 3.44 (м, 1Η), 3.57-3.77 (м, 1Η), 4.97 (д, 1=10, 1Η), 5.03 (дд, 1=12,5, 1Η), 5.11 (д, 1=10, 1Η), 5.92 (дд, 1=16, 7, 1Η), 6.08 (д, 1=12, 1Η), 6.12 (д, 1=11, 1Η), 6.42 (дд, 1=16, 11, 1Η), 7.72 (уширенный, 1Η), 8.35 (уширенный, 1Η).

-О-(4-((3-(бис-( Диэтилфосфоно)метил)карбамоил)пропаноилокси)бутаноил)-1',4-дидегидро-1 дезокси-1,4-дигидро-5'-(2-метилпропил)-1-оксорифамицин XIV (53). Раствор соединения 51 (260 мг, 0.65 ммоль), 52 (643 мг, 0.65 ммоль) и С§₂СО₃ (212 мг, 0.65 ммоль) в ДМФА (1 мл) перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере Аг. Смесь разбавляют СН₂С1₂ (20 мл), промывают водой (10 мл), а затем рассолом (10 мл), сушат над №₂8О₄ и концентрируют в вакууме. Сырой продукт используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

-О-(4-((3 -(Бисфосфонометил)карбамоил)пропаноилокси)бутаноил)- 1',4-дидегидро-1-дезокси-1,4дигидро-5'-(2-метилпропил)-1-оксорифамицин XIV (54). Соединение 53 (максимальное количество 857 мг, 0.65 ммоль) растворяют в 20 мл безводного дихлорметана при температуре -78°С. К полученному раствору добавляют 2,6-лутидин (3.8 мл, 32.5 ммоль), а затем бромтриметилсилан (2.2 мл, 16.3 ммоль). Охлаждающую баню удаляют и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 20 ч. После завершения удаления летучих веществ остаток переносят в смесь 50 мл 0.1 Ν соляной кислоты и 10 мл ацетонитрила и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. По окончании обработки значение рН раствора доводят до 7 путем добавления триэтиламина. Органические летучие вещества удаляют в вакууме и образовавшийся остаток лиофилизуют. Полученный продукт подвергают флэшхроматографии с обращенной фазой на колонке С18 с линейным градиентом элюирования от 5% ацетонитрила в 30 мМ триэтиламин/водный раствор диоксида углерода (рН 6.8) до чистого ацетонитрила. Из фракций, содержащих продукт, ацетонитрил удаляют в вакууме и полученный водный раствор лиофилизуют, что дает на выходе соединение 54 в виде твердого вещества пурпурного цвета в форме соли бистриэтиламмония (8.6 мг).

БС/М8 чистота: 97.0% (254 нм), 96.4% (220 нм), 97.6% (320 нм). Μ8 (Μ+Η) 1206.4.

¹Н ЯМР (400 МГц, СОСИ) δ -0.18 (д, 1=7, 3Н), 0.48 (д, 1=7, 3Н), 0.92 (д, 1=7, 3Н), 0.94 (м, 6Н), 1.04 (д, 1=7, 3Н), 1.22 (м, 2Н),1.79 (с, 3Н), 1.84-2.15 (м, 9Н), 2.01 (с, 3Н), 2.03 (с, 3Н), 2.25-2.37 (м, 4Н), 2.29 (с, 3Н), 2.50 (м, 1Н), 2.67 (м, 2Н), 2.87 (м, 1Н), 2.93-3.11 (м, 2Н), 3.05 (с, 3Н), 3.35- 3.40 (м, 2Н), 3.44 (м, 1Н), 3.57-3.77 (м, 1Н), 4.97 (д, 1=10, 1Н), 5.03 (дд, 1=12.5, 1Н), 5.11 (д, 1=10, 1Н), 5.92 (дд, 1=16, 7, 1Н), 6.08 (д, 1=12, 1Н), 6.12 (д, 1=11, 1Н), 6.42 (дд, 1=16, 11, 1Н), 7.72 (уширенный, 1Н), 8.35 (уширенный, 1Н).

-О-(4-((3 -(бис-( Диэтилфосфоно)метил)карбамоил)пропаноилокси)бутаноил)-1',4-дидегидро-1дезокси-1,4-дигидро-5'-(2-метилпропил)-1-оксорифамицин XIV (53). Раствор соединения 51 (260 мг, 0.65 ммоль), 52 (643 мг, 0.65 ммоль) и С§₂СО₃ (212 мг, 0.65 ммоль) в ДМФА (1 мл) перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере Аг. Смесь разбавляют СН₂С1₂ (20 мл), промывают водой (10 мл), а затем рассолом (10 мл), сушат над №ь8О₄ и концентрируют в вакууме. Сырой продукт используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Εί.7Μ8 чистота: 97.0% (254 нм), 96.4% (220 нм), 97.6% (320 нм). Μ8 (Μ+Η) 1206.4.

- 75 016059

Схема 17

Получение 3'-гидроксибензоксазинорифамицинового производного 56

Получение 1',4-дидегидро-1-дезокси-1,4-дигидро-3'-трет-бутилдиметилсилилокси-1 -оксорифамицина VIII (соединение 37) описано у Уатаис с1 а1. (СНст. РНагт. Ви11. (1993), 41:148-155).

1',4-Дидегидро-1 -дезокси-1,4-дигидро-3'-гидрокси-5'-[4-(2-гидроксиэтил)-1 -пиперазинил]-1 оксорифамицин VIII (56). К раствору соединения 1',4-дидегидро-1-дезокси-1,4-дигидро-3'-третбутилдиметилсилилокси-1-оксорифамицина VIII (соединение 55) (2.236 г, 2.44 ммоль) в 60 мл ДМСО добавляют 1-(2-гидроксиэтил)пиперазин (635 мг, 4.88 ммоль) и диоксид магния (2.227 г, 25.62 ммоль). В пределах 30 мин смесь меняет цвет с красного на голубой. После перемешивания в течение ночи при комнатной температуре смесь фильтруют через целит и упаривают в вакууме на половину от первоначального объема. Полученную смесь выливают в воду и экстрагируют СН2С12. Органические экстракты промывают рассолом и сушат над Мд8О₄. После упаривания остаток очищают с помощью флэшхроматографии на 81О₂ (градиент от 0 до 10% МеОН/СН₂С1₂), что дает на выходе соединение 56 в виде твердого вещества голубого цвета (975 мг, 43%).

БСМ8 98.0% (254 нм), 97.1% (220 нм), 96.3% (320 нм).

Вычислено для С₄₉Н₆^₄О_М: 929. Найдено: 929.2

Схема 18

Получение тетраэтил(4-(2-(пиперазин-4-ил)этокси)-4-оксобутаноиламино)метилен-1,1-бисфосфоната

трет-Бутил-4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-карбоксилат (57). К 1-(2-гидроксиэтил)пиперазину (3.0 г, 23.0 ммоль) в ТГФ добавляют ди-трет-бутилдикарбонат (5.5 г, 25.3 ммоль). Смесь перемешивают в течение 2 ч. Растворитель упаривают в вакууме до половины его первоначального объема и полученную смесь выливают в воду, экстрагируют СН₂С1₂, промывают рассолом, сушат над №₂8О₄ и концентрируют, что дает масло бледно-желтого цвета (5.3 г, квант).

¹Н ЯМР (400 МГц, СЭСЕ) δ 1.46 (с, 9Н), 2.44-2.46 (м, 4Н), 2.54-2.57 (м, 2Н), 2.66 (м, 1=5.3, 1Н), 3.423.45 (м, 4Н), 3.62 (кв., 1=5.3, 2Н).

1-(трет-Бутилоксикарбонил)-4-(2-(4-гидрокси-4-оксобутаноилокси)этил)пиперазин (58). Соединение 57 (5.3 г, 23.0 ммоль), янтарный ангидрид (2.30 г, 23.0 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (281 мг, 2.30 ммоль) растворяют в СНС1₃ (14 мл) и перемешивают в течение 18 ч. Раствор концентрируют в вакууме и используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

¹Н ЯМР (400 МГц, СОСБ) δ 1.42 (с, 9Н), 2.54-2.60 (м, 8Н), 2.72 (т, 1=5.6, 2Н), 3.43-3.46 (м, 4Н), 4.23 (т, 1=5.5, 2Н).

Тетраэтил (4-(2-(1-(трет-бутилоксикарбонил)пиперазин-4-ил)этокси)-4-оксобутаноиламино)метилен-1,1-бисфосфонат (59). К раствору соединения 2 (3.0 г, 9.9 ммоль) и 58 (3.3 г, 9.9 ммоль) в СН₂С1₂(50 мл) добавляют БОС (2.08 г, 10.9 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (121 мг, 0.99 ммоль). Полученный раствор перемешивают в течение 3 ч в атмосфере Аг при комнатной температуре. Реакционную смесь выливают в насыщенный раствор NаНСΟз, слои разделяют и водный слой экстрагируют дважды СН₂С1₂. Объединенные органические слои промывают рассолом, сушат над №1₂8О₄ и концентрируют в вакууме. Остаток очищают с помощью флэш-хроматографии на 81О₂ (градиент от 0 до 10% смеси МеОН/СН₂С1₂) с выходом масла бледно-желтого цвета, которое застывает со временем (4.5 г, 74%).

¹Н ЯМР (400 МГц, СЭСЕ) δ 1.33 (т, 1=7.1, 12Н), 1.45 (с, 9Н), 2.42-2.44 (м, 4Н), 2.55-2.60 (м, 6Н),

- 76 016059

3.41-3.43 (м, 4Н), 4.14-4.25 (м, 10Н), 5.00 (дт, 1=21.7, 10.1, 1Н), 6.18 (д, 1=9.9, 1Н).

Тетраэтил (4-(2-(пиперазин-4-ил)этокси)-4-оксобутаноиламино)метилен-1,1-бисфосфонат (60). Соединение 59 (1.0 г, 1.62 ммоль) растворяют в 20% растворе ТЕА/СН₂С1₂ (8 мл). Раствор перемешивают при комнатной температуре пока не израсходуется исходный продукт (ТСХ контролирование). Летучие вещества удаляют в вакууме. ТЕ А соль растворяют в МеОН и обрабатывают смолой 13 ее Ωο\\όχ 1X2 С1^-, которую заранее промывают насыщенным раствором NаΗСΟ₃ (3х), водой (3х) и МеОН (3х). Смолу отфильтровывают и фильтрат концентрируют, что дает на выходе бесцветное твердое вещество (0.85 г, количественный выход), которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃) δ 1.29 (т, 1=7.1, 6Н), 1.35 (т, 1=7.1, 6Н), 2.65-2.74 (м, 4Н), 3.22-3.24 (м, 2Н), 3.44-3.46 (м, 4Н), 3.56-3.59 (м, 4Н), 4.06-4.23 (м, 8Н), 4.38-4.41 (м, 2Н), 5.06 (дт, 1=21.6, 10.0, 1Н), 7.93 (д, 1=10.1, 1Н).

Схема 19

Получение 3'-гидроксибензоксазинорифамицин-бисфосфонатного конъюгата 62

3'-Гидроксибензоксазинорифамицин бисфосфонатный конъюгат 61. Соединение 60 (2.37 г, 4.59 ммоль) добавляют к раствору соединения 55 (2.8 г, 3.06 ммоль) в сухом ДМСО (16 мл). Добавляют NаΗСΟ₃ (2.57 г, 30.6 ммоль) и МпО₂ (2.66 г, 30.6 ммоль). Полученную смесь перемешивают в атмосфере Аг в течение 9 дней при температуре 40°С. Реакционную смесь разбавляют СН₂С1₂, более твердые вещества удаляют фильтрованием над целитом. Твердые вещества промывают СН2С12 и объединенные органические слои промывают полунасыщенным рассолом. Органический слой отделяют и фильтруют над бумагой для удаления остававшегося твердого вещества полностью черного цвета. Фильтрат промывают водой, рассолом, сушат над Мд8О₄. После упаривания остаток очищают с помощью флэшхроматографии на 81О₂ (градиент от 0 до 10% смеси МеОН/СН₂С1₂), что дает на выходе соединение 61 в виде твердого вещества голубого цвета (1.3 г, 33%).

ЬСМ8 чистота: 96.3% (254 нм), 95.9% (220 нм), 94.2% (320 нм).

Вычислено для С₆₂Н₈₅^О₂₂Р₂: 1313. Найдено: 1312.0 (М-Н)^-.

Десилированное соединение 37 также выделяют в виде твердого вещества темно-красного цвета (1.1 г, 45%).

3'-Гидроксибензоксазинорифамицин бисфосфонатный конъюгат 62. К раствору соединения 61 (168 мг, 0.13 ммоль) и 2,6-лутидина (594 мкл, 5.11 ммоль) в СН₂С1₂ (5 мл) при температуре -78°С добавляют по каплям ТМ8Вг (337 мкл, 2.55 ммоль) в атмосфере аргона. Охлаждающую баню удаляют и смесь перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в водном буфере 50 мМ NΗ₄ΟАс/АсΟΗ (рН 5) и перемешивают в течение 18 ч при комнатной температуре, после чего продукт лиофилизуют. Сырой остаток очищают с помощью флэшхроматографии с обращенной фазой при значении рН, равном 5 (линейный градиент от 5 до 100% ацетонитрила в буфере водного раствора 50 мМ NΗ₄ΟАс/АсΟΗ). Объединенные чистые фракции концентрируют и лиофилизуют, что дает на выходе соединение 62 в виде бисаммонийной соли темно-голубого цвета (120 мг, 76%).

ЬСМ8 чистота: 96.2% (254 нм), 96.6% (220 нм), 96.3% (320 нм).

Вычислено для С₅₄Н₆9^О₂₂Р₂: 1201. Найдено: 1200.3 (М-Н)^-.

- 77 016059

Схема 20

Получение 3'-гидроксибензоксазинорифамицинового производного 63

I 63

1',4-Дидегидро-1 -дезокси-1,4-дигидро-3'-гидрокси-5'-[4-гидрокси-1-пиперидинил]-1 -оксорифами цин VIII (63). К перемешиваемому раствору соединения 55 (0.60 г, 0.65 ммоль) в сухом ДМСО (10 мл) добавляют 4-гидроксипиперидин (0.132 г, 1.31 ммоль) и МиО₂ (0.57 г, 6.56 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч. Реакционную смесь разбавляют этилацетатом (100 мл), фильтруют через целит и промывают через этилацетат (100 мл). Объединенные фильтраты промывают последовательно водой (2х75 мл), рассолом (2х75 мл), сушат над №₂8О₄ и концентрируют. Остаток очищают с помощью флэш-хроматографии на 8Ю₂ (8% смесь МеОН/СН₂С1₂), что дает на выходе соединение 63 в виде твердого вещества голубого цвета (197 мг, 33%).

ЬСМ8 чистота: 97.8% (254 нм), 95.1% (220 нм), 97.1% (320 нм).

Вычислено для С₄₈Н₅₇^О1₄: 899. Найдено: 898 (М-Н).

Схема 21

Получение тетраэтил(4-(2-(1-(бензилоксикарбонил)пиперидин-4-ил)этокси)-4оксобутаноиламино)метилен-1,1 -бисфосфоната

^СЬг--М^Х ОМАР. СНС1₃	^αΚ'Ν·'''Ί 2, ЕОС1, Ι^Χ^ϋΜΑΡ, СН₂С1_г	о (ЕС₂О)Р' (Εί₂Ο)!4_ο О
О
	64	65 К = СЬг Ρΰ/С, Н₂ .н > ^Е10н

3-((1-((Бензилокси)карбонил)пиперидин-4-илокси)карбонил)пропионовая кислота (64). Бензил-4гидрокси-1-пиперидинкарбоксилат (1.0 г, 4.25 ммоль), янтарный ангидрид (0.425 г, 4.25 ммоль) и 4ΌΜΑΡ (52 мг, 0.425 ммоль) растворяют в СНС1₃ (10 мл) и перемешивают в течение 24 ч. Летучие вещества удаляют в вакууме. Добавляют водный раствор NаНСОз (100 мл) и смесь промывают Е!₂О (2х50 мл). Водный слой подкисляют до значения рН, равного от 6 до 7, с помощью 2 Ν НС1 и экстрагируют СН2С12 (2х60 мл). Объединенные органические экстракты промывают рассолом (60 мл), сушат над №₂8О₄ и концентрируют в вакууме, что дает на выходе соединение 64 (768 мг, 54%), которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Ή ЯМР (400 МГц, СЭСЕ) δ 1.62 (м, 2Н), 1.85 (м, 2Н), 2.60-2.70 (м, 4Н), 3.38 (м, 2Н), 3.74 (м, 2Н), 4.97 (м, 1Н), 5.12 (с, 2Н), 7.35 (м, 5Н).

Тетраэтил (4-(1-(бензилоксикарбонил)пиперидин-4-илокси)-4-оксобутаноиламино)метилен-1,1бисфосфонат (65). К перемешиваемому раствору соединения 64 (0.76 г, 2.26 ммоль) и соединения 2 (0.687 г, 2.26 ммоль) в СН₂С1₂ (10 мл) добавляют ЕЭС (0.52 г, 2.72 ммоль) и 4-ΌΜΑΡ (55 мг, 0.45 ммоль). Полученный раствор перемешивают в течение 16 ч в атмосфере азота при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляют СН₂С1₂, промывают водным раствором NаНСОз (2х50 мл), рассолом (50 мл) и сушат над №-ь8О₄. После упаривания остаток очищают с помощью флэш-хроматографии на 81О₂ 5% смесью МеОН/СН₂С1₂, что дает на выходе продукт 65 (1.20 г, 85%).

Ή ЯМР (400 МГц, СОСЕ) δ 1.33 (т, 1=7.1 Гц, 12Н), 1.62 (м, 2Н), 1.85 (м, 2Н), 2.57-2.62 (м, 4Н), 3.35 (м, 2Н), 3.76 (м, 2Н), 4.16 (м, 8Н), 4.90-5.08 (м, 2Н), 5.12 (с, 2Н), 6.33 (д, 1=9.8 Гц, 1Н), 7.35 (м, 5Н).

Тетраэтил (4-(пиперидин-4-ил)-4-оксобутаноиламино)метилен-1,1-бисфосфонат (66). К раствору соединения 65 (1.20 г, 1.93 ммоль) в Е!ОН (20 мл) добавляют 10% Ρά/С (200 мг) и смесь перемешивают в атмосфере водорода в течение 3.5 ч. Катализатор фильтруют через целит, промывают этанолом и фильтраты концентрируют досуха, что дает соединение 66 (1.0 г), которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Ή ЯМР (400 МГц, СЭСЕ) δ 1.33 (т, 1=7.1 Гц, 12Н), 1.82 (м, 2Н), 2.08 (м, 2Н), 2.64 (с, 4Н), 3.02 (м, 2Н), 3.20 (м, 2Н), 4.16 (м, 8Н), 4.90-5.08 (м, 2Н), 6.88 (д, 1=9.8 Гц, 1Н).

- 78 016059

Схема 22

Получение 3'-гидроксибензоксазинорифамицин бисфосфонатного конъюгата 68

(«О)гР«_о

К = Е1 ТМЗВг ) 2,6- лупщин 68Η = Η.ΝΗ₄-< СН_гС1_г

3'-Гидроксибензоксазинорифамицин бисфосфонатный конъюгат 67. МпО2 (1.45 г, 16.66 ммоль) добавляют к перемешиваемому раствору соединения 55 (1.52 г, 1.66 ммоль) и соединению 66 (0.81 г, 1.66 ммоль) в сухом ДМСО (20 мл). Смесь перемешивают в атмосфере аргона в течение 4 дней при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляют СН₂С1₂ (50 мл), фильтруют через целит и промывают дополнительно через СН₂С1₂ (100 мл), затем объединенные фильтраты промывают последовательно водой (3x100 мл) и рассолом (2x100 мл), сушат над №₂8О₄ и концентрируют. Остаток очищают с помощью флэш-хроматографии на 81О₂ (градиент от 0 до 5% смеси МеОН/СН₂С1₂), что дает на выходе соединение 67 в виде твердого вещества голубого цвета (0.42 г, 19.7%).

ЬСМ8: Вычислено для С₆1Н₈₂^О₂₂Р₂: 1284. Найдено: 1285 (М+Н).

3'-Гидроксибензоксазинорифамицин бисфосфонатный конъюгат 68. К раствору соединения 67 (0.42 г, 0.32 ммоль) в 10 мл безводного дихлорметана при температуре -78°С добавляют 2,6-лутидин (1.52 мл, 13.08 ммоль), а затем бромтриметилсилан (0.86 мл, 6.54 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч. После удаления растворителя остаток растворяют в 8 мл 50 мМ буфере №Н₄ОАс/АсОН (рН 5) и перемешивают при комнатной температуре в течение 20 ч, после чего лиофилизуют. Остаток растворяют в воде и фильтруют для удаления нерастворимых примесей. Полученный раствор подвергают флэш-хроматографии с обращенной фазой на колонке С18 с линейным градиентом элюирования от 5% ацетонитрила в 50 мМ буфере ΝΠ-ОЛС/АсОН (рН 5) до чистого ацетонитрила. Из фракций, содержащих только продукт, удаляют ацетонитрил в вакууме и полученный водный раствор лиофилизуют, что дает на выходе соединение 68 в виде твердого вещества темно-голубого цвета (0.31 г, 81%).

ЬСМ8 97.9% (254 нм), 97.7% (220 нм), 96.4% (320 нм).

Вычислено для С₅₃,Н₆₆М|О₂₂Р₂: 1172. Найдено: 1171 (М-Н).

Схема 23

Получение 3-гидроксибензоксазинорифамицинового производного 69

1',4-Дидегидро-1-дезокси-1,4-дигидро-3'-гидрокси-5'-[1-пиперазинил]-1-оксорифамицин VIII (69). К перемешиваемому раствору соединения 55 (3.0 г, 3.28 ммоль) в сухом ДМСО (60 мл) добавляют пиперазин (1.13 г, 13.12 ммоль) и МпО₂ (2.85 г, 32.82 ммоль). Смесь перемешивают в течение 48 ч, разбавляют СН₂С1₂ (200 мл), фильтруют через целит и промывают затем через СН₂С1₂ (200 мл). Объединенный фильтрат промывают последовательно водой (2x300 мл) и рассолом (2x200 мл), сушат над №1₂8О₄ и концентрируют. Остаток очищают с помощью флэш-хроматографии на 81О₂ (градиент от 10 до 20% смеси МеОН/СН₂С1₂), что дает на выходе соединение 69 в виде твердого вещества голубого цвета (2.28 г, 78%).

- 79 016059

ЬСМ8 99.2% (254 нм), 99.3% (220 нм), 99.2% (320 нм).

Вычислено для С₄₇Н₅^₄О1₃: 884. Найдено: 883 (М-Н).

Схема 24

Получение 3'-гидроксибензоксазинорифамицин бисфосфонатного конъюгата 71

67Η = Εί ββΚ = Η,ΝΗ₄

ТМ5Вг

2,6- лутидии

СН_гС1_г

3'-Гидроксибензоксазинорифамицин бисфосфонатный конъюгат 70. Смесь соединения 69 (1.92 г, 2.17 ммоль), соединения 34 (1.03 г, 2.17 ммоль) и ΌΒυ (0.714 мл, 4.77 ммоль) в 25 мл толуола перемешивают при комнатной температуре в течение 16 ч и летучие вещества удаляют при пониженном давлении. Остаток растворяют в СН₂С1₂ (200 мл) и промывают насыщенным водным раствором хлорида аммония (2х80 мл), рассолом (1х80 мл), сушат над Να₂8Ο₄ и концентрируют при пониженном давлении. Флэшхроматография на силикагеле с градиентом элюирования, используя 0-6% смесь метанол/дихлорметан, дает продукт 70 (1.92 г, 65%).

ЬСМ8: Вычислено для С₆₈Н₉₀^О₂1Р₂: 1360. Найдено: 1361 (М+Н).

3'-Гидроксибензоксазинорифамицин бисфосфонатный конъюгат 71. Соединение 70 (1.92 г, 1.41 ммоль) растворяют в 25 мл безводного дихлорметана. К полученному раствору добавляют триэтиламин (9.83 мл, 70.58 ммоль), а затем бромтриметилсилан (4.65 мл, 35.29 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 23 ч. После удаления растворителя остаток переносят в смесь 70 мл 0.1 Ν соляной кислоты и 70 мл ацетонитрила и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч, затем нейтрализуют триэтиламином. Органические растворители удаляют в вакууме и образовавшийся остаток лиофилизуют. Остаток растворяют в воде и фильтруют для удаления нерастворимых примесей. Полученный фильтрат подвергают флэш-хроматографии с обращенной фазой на колонке С18 с линейным градиентом элюирования от 0-40% ацетонитрила в 30 мМ триэтиламин/водный раствор диоксида углерода (рН 6.8) до чистого ацетонитрила. Из фракций, содержащих продукт, удаляют ацетонитрил в вакууме и полученный водный раствор лиофилизуют, что дает на выходе соединение 71 в виде твердого вещества темно-голубого цвета (0.82 г, 46%).

ЬСМ8 чистота: 96.0% (254 нм), 92.1% (220 нм), 95.5% (320 нм).

Вычислено для С₆₀Н₇₄^О₂1Р₂: 1248. Найдено: 1247 (М-Н).

Схема 25

Получение тетраэтил(3-аминопропаноиламино)метилен-1,1-бисфосфонат

2, ЕОС1,

ОМАР, Ε1₃Ν,

СНС1_Э

О

РтосНЫ'^-^'ОН

О °''Р(ОЕ1)_г

РтосНЫ ^Н О

Η₂Ν'

О °*Р(Оа)г _Λ И Г о

Тетраэтил (3 -(((9й-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)пропаноиламино)метилен-1,1 -бисфосфонат (73). К раствору соединения 72 (200 мг, 0.642 ммоль) и соединения 2 (195 мг, 0.642 ммоль) в безвод

- 80 016059 ном и свободном от этанола СНС1₃ (5 мл) добавляют ЕЭС1 (147 мг, 0.77 ммоль) и ΩΙΡΕΛ (0.14 мл, 0.77 ммоль). Полученный раствор перемешивают в течение ночи в атмосфере Аг при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрируют досуха и образовавшийся остаток очищают с помощью флэш-хроматографии на 81О₂ (градиент от 5 до 15% МеОН/СН₂С1₂), что дает на выходе бесцветную смолу (240 мг, 65%).

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1_;) δ 1.30-1.34 (м, 12Н), 2.50-2.24 (м, 2Н), 3.51-3.54 (м, 2Н), 4.14-4.24 (м, 8Н), 4.36 (д, 1=7.0 Гц, 2Н), 5.03 (дт, 1=22.0, 9.9 Гц, 1Н), 5.66 (уширенный с, 1Н), 6.21 (уширенный с, 1Н), 7.30 (т, 1=7.3 Гц, 2Н), 7.39 (т, 1=7.7 Гц, 2Н), 7.59 (д, 1=13 Гц, 2Н), 7.75 (д, 1=7.3 Гц, 2Н).

³¹Р ЯМР (162 МГц, СОС1_;) δ 17.46.

Тетраэтил (3-аминопропаноиламино)метилен-1,1-бисфосфонат (74). Пиперидин (1.5 мл, 15.15 ммоль) добавляют к раствору соединения 73 (240 мг, 0.402 ммоль) в ДМФА (3.5 мл). Полученный раствор перемешивают в течение 1 ч в атмосфере Аг при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрируют досуха и образовавшийся остаток очищают с помощью флэш-хроматографии на 81О₂(градиент от 5 до 15% МеОН/СН₂С1₂), что дает на выходе бесцветную смолу (78 мг, 64%).

Ή ЯМР (400 МГц, ГОСТ) δ 1.27-1.31 (м, 12Н), 2.38-2.40 (м, 3Н), 3.00 (м, 2Н), 4.11-4.21 (м, 8Н), 5.04 (т, 1=22.0 Гц, 1Н), 8.20 (уширенный, 1Н).

³¹Р ЯМР (162 МГц, СОС1_;) δ 17.82.

Схема 26

Получение рифалазилбисфосфонатного конъюгата 78

74, ЕОС1, Ε1₃Ν, ОМАР, СНС1з

Получение 1',4-дидегидро-1-дезокси-1,4-дигидро-3'-гидрокси-5'-[4-(2-метилпропил)-1-пиперазинил]1-оксорифамицина VIII (соединение 75) описано у Уатапе с1 а1. (СНет. РНагт. Ви11. (1993),41:148-155).

-О-(3 -Карбоксипропаноил)-1',4-дидегидро-1 -дезокси-1,4-дигидро-3 '-гидрокси-5'-[4-(2метилпропил)-1-пиперазинил]-1-оксорифамицин VIII (76). К раствору соединения 75 (400 мг, 0.425 ммоль) в безводном ТГФ (50 мл) добавляют янтарный ангидрид (376 мг, 3.74 ммоль) и ОМАР (60 мг, 0.49 ммоль). Полученный раствор нагревают до температуры кипения с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют досуха и образовавшийся остаток очищают с помощью флэш-хроматографии на 81О₂ (50/45/5, гексан/смесь ЕЮАс/МеОН), что дает на выходе твердое вещество насыщенного голубого цвета (323 мг, 73%).

Ή ЯМР (400 МГц, СОСУ) δ -0.35 (д, 1=7.0 Гц, 3Н), -0.06 (д, 1=7.0 Гц, 3Н), 0.90-0.99 (м, 15Н), 1.62 (м, 1Н), 1.73-1.77 (м, 2Н), 1.82 (с, 3Н), 1.97 (с, 3Н), 2.13 (с, 3Н), 2.14 (м, 4Н), 2.31 (с, 3Н), 2.49-2.61 (м, 7Н), 2.75 (м, 1Н), 2.99 (с, 3Н), 3.35 (д, 1=7.3 Гц, 1Н), 3.53 (уширенный, 3Н), 4.69 (д, 1=10.6 Гц, 1Н), 4.96 (д, 1=11.0 Гц, 1Н), 5.04 (дд, 1=12.9, 7.3 Гц, 1Н), 5.97 (дд, 1=16.1, 7.3 Гц, 1Н), 6.19-6.26 (м, 2Н), 6.34 (с, 1Н), 6.46 (с, 1Н), 6.83 (дд, 1=16.1, 11.0 Гц, 1Н), 7.90 (с, 1Н), 10.23 (с, 1Н).

- 81 016059

Вычислено для ί^^ΝΟ^: 1041. Найдено: 1042 (М+Н).

-Ο-(3 -(2-((бис-( Диэтилфосфоно)метил)карбамоил)этилкарбамоил)пропаноил)-1',4-дидегидро-1дезокси-1,4-дигидро-3'-гидрокси-5'-[4-(2-метилпропил)-1-пиперазинил]-1-оксорифамицин VIII (77). К раствору соединения 76 (268 мг, 0.257 ммоль) и соединения 74 (78 мг, 0.257 ммоль) в безводном и свободном от этанола СНС1₃ (10 мл) добавляют ЕЭС1 (100 мг, 0.514 ммоль) и ОМАР (63 мг, 0.514 ммоль). Полученный раствор перемешивают в течение ночи в атмосфере Аг при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрируют досуха и образовавшийся остаток очищают с помощью флэшхроматографии на 8ίΟ₂ (элюент СΗ₂С1₂/АсΟΕί/МеΟΗ, 50/40/10), что дает на выходе твердое вещество голубого цвета (52 мг, 15%).

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1_;) δ -0.37 (д, 1=7.0 Гц, 3Н), -0.03 (д, 1=7.0 Гц, 3Н), 0.90-0.99 (м, 15Н), 1.33 (м, 12Н), 1.52-1.75 (м, 2Н), 1.80 (с, 3Н), 1.95 (с, 3Н), 2.09-2.79 (м, 28Н), 2.97 (с, 3Н), 3.32-3.69 (м, 10Н), 4.19 (м, 8Н), 4.75 (д, 1=11.0 Гц, 1Н), 4.99-5.14 (м, 3Н), 5.97 (дд, 1=16.1, 7.3 Гц, 1Н), 6.23 (дд, 1=22.0, 11.0 Гц, 2Н), 6.31 (с, 1Н), 6.45 (с,1Н), 6.88-6.92 (м, 3Н), 7.03 (м,1Н), 7.68 (с, 1Н), 10.11 (с, 1Н).

³¹Р ЯМР (162 МГц, СОС1_;) δ 18.21.

Вычислено для С^Нд^^^Р^ 1396. Найдено: 1398.2 (М+2Н)^-.

-Ο-(3 -(2-((Бисфосфонометил)карбамоил)этилкарбамоил)пропаноил)-1',4-дидегидро-1 -дезокси1,4-дигидро-3'-гидрокси-5'-[4-(2-метилпропил)-1-пиперазинил]-1-оксорифамицин VIII (78). Соединение 77 (50 мг, 0.0358 ммоль) растворяют в 10 мл дихлорметана и добавляют 0.21 мл (1.789 ммоль) 2,6лутидина, а затем 116 мкл (0.8945 ммоль) ТМ8Вг. Полученную смесь красного цвета перемешивают в течение по крайней мере 48 ч при комнатной температуре и концентрируют досуха. После высушивания в высоком вакууме в течение по крайней мере 120 мин твердый продукт переносят в смесь 2.15 мл 0.1 Ν НС1 и 2.5 мл ацетонитрила и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, при этом получают прозрачный раствор. После подщелачивания путем добавления 0.05 мл триэтиламина (конечное значение рН 7.0), органические летучие вещества осторожно удаляют в вакууме и нерастворимый продукт отфильтровывают. Фильтрат лиофилизуют и образовавшийся остаток подвергают флэш-хроматографии на С18 колонке в автоматической системе Вю1аде® с градиентом элюирования 10-60% МеСN в 30 Мм буфере гидрокарбоната триэтиламмония (рН 6.5) с объемом более 15 объемов колонки, что дает на выходе соединение 78 в виде твердого вещества темно-голубого цвета (15 мг, 30%) в форме соли бистриэтиламмония.

¹Н ЯМР (400 МГц, СЭСЕ) ключевые сигналы δ -0.57 (уширенный, 3Н), -0.38 (уширенный, 3Н), 0.88 (с, 6Н), 1.16 (т, 18Н), 3.05 (кв., 12Н), 4.20 (т, 1Н).

³¹Р ЯМР (162 МГц, СОС1_;) δ 14.02.

ЬСМ8 чистота: 99.0% (254 нм), 98.5% (220 нм), 99.1% (320 нм).

Вычислено для СздНд^^^Ру 1284. Найдено: 1283.2 (М-Н)^-.

- 82 016059

Схема 27

Получение рифалазилбисфосфонатного конъюгата 81

-О-(4-Бромбутаноил)-1',4-дидегидро-1-дезокси-1,4-дигидро-3 '-гидрокси-5'-[4-(2-метилпропил)-1пиперазинил]-1-оксорифамицин VIII (79). 4-Бромбутирилхлорид (2.18 мл, 18.82 ммоль) добавляют по каплям к охлажденному (0°С) раствору рифалзила (11.80 г, 12.55 ммоль), пиридина (3.04 мл, 37.65 ммоль) и ΌΜΆΡ (153 мг, 1.25 ммоль) в дихлорметане (150 мл). После перемешивания в течение 16 ч при температуре окружающей среды реакционную смесь разбавляют дихлорметаном (800 мл) и промывают последовательно водой (2x500 мл) и рассолом (2x500 мл), сушат над №₂8О₄, фильтруют и концентрируют досуха. Остаток очищают с помощью хроматографии на силикагеле с 60-100% смесью этилацетат/гексан и затем 1-5% смесью ΜеΟΗ/СΗ₂С1₂, что дает на выходе соединение 79 (12.40 г, 90% выходом).

Вычислено для С₅₅Η₆₉Β^N.|Ο|.·ι: 1090. Найдено: 1091 (М+Н).

-О-(4-((3 -(бис-( Диэтилфосфоно)метил)карбамоил)пропаноилокси)бутаноил)-1',4-дидегидро-1дезокси-1,4-дигидро-3 '-гидрокси-5'-[4-(2-метилпропил)-1-пиперазинил]-1 -оксорифамицин VIII (80).

Смесь соединения 79 (12.40 г, 11.37 ммоль), соединения 51 (4.58 г, 11.37 ммоль) и С§₂СО₃ (3.70 г, 11.37 ммоль) в сухом ДМФА (150 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом (2x700 мл). Объединенные органические экстракты промывают рассолом (2x700 мл), сушат над №₂8О₄ и концентрируют досуха. Остаток очищают с помощью флэш-хроматографии на 81О₂ 5% смесью ΜеΟΗ/СΗ₂С1₂, что дает на выходе продукт 80 (9.20 г, с 57% выходом).

Εί’Μ8: Вычислено для С^дз^О^у 1411. Найдено: 1412 (М+Н).

-О-(4-((3 -(Бисфосфонометил)карбамоил)пропаноилокси)бутаноил)- 1',4-дидегидро-1 -дезокси-1,4дигидро-3'-гидрокси-5'-[4-(2-метилпропил)-1-пиперазинил]-1-оксорифамицин VIII (81). К раствору соединения 80 (9.20 г, 6.52 ммоль) и 2,6-лутидина (30.37 мл, 260.80 ммоль) в СЫ₂С1₂ (180 мл) при температуре -78°С добавляют по каплям бромтриметилсилан (17.21 мл, 130.40 ммоль) в атмосфере аргона. Охлаждающую баню удаляют и смесь перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре. Летучие вещества упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в 240 мл водного раствора 50 мМ ΝΗ/ОАс/АсОН буфера (ρΗ 5) и перемешивают в течение 18 ч при комнатной температуре, после чего остаток лиофилизуют. Полученный продукт подвергают флэш-хроматографии с обращенной фазой на колонке С18 с линейным градиентом элюирования от 0 до 100% ацетонитрила в 50 мМ буфере ΝΗ/ОАс/АсОН (ρΗ 5). Фракции, содержащие продукт, смешивают, ацетонитрил удаляют в вакууме и полученный водный раствор лиофилизуют, что дает на выходе соединение 81 в виде твердого вещества темно-голубого цвета (5.30 г, с 62% выходом).

Εί’Μ8: 94.2% (254 нм), 94.2% (220 нм), 94.2% (320 нм).

Вычислено для С^дд^О^у 1299. Найдено: 1298 (М-Н).

- 83 016059

Схема 28

Получение рифалазилбисфосфонатного конъюгата 84

21-О-(2-Бромацетил)-1',4-дидегидро-1-дезокси-1,4-дигидро-3'-гидрокси-5'-[4-(2-метилпропил)-1пиперазинил]-1-оксорифамицин VIII (82). Бромацетилбромид (37 мкл, 0.42 ммоль) добавляют по каплям к раствору рифалзила (200 мг, 0.21 ммоль), ОМАР (31 мг, 0.25 ммоль) в дихлорметане (10 мл), охлажденному на бане со льдом. После перемешивания в течение 16 ч при температуре окружающей среды реакционную смесь разбавляют дихлорметаном (800 мл) и промывают последовательно водой (2x500 мл) и рассолом (2x500 мл), сушат над Ыа₂8О₄ и концентрируют досуха. Остаток очищают с помощью хроматографии на силикагеле с 60-100% смесью этилацетат/гексан и затем 2-6% смесью МеОН/СН₂С1₂, что дает на выходе соединение 79 (200 мг, 88% выходом).

Вычислено для С₃₃Н₆₉,ВгН.₁О₁.₁: 1062. Найдено 1063 (М+Н).

21-О-(2-((3-(бис-( Диэтилфосфоно)метил)карбамоил)пропаноилокси)ацетил)-1',4-дидегидро-1дезокси-1,4-дигидро-3'-гидрокси-5'-[4-(2-метилпропил)-1-пиперазинил]-1-оксорифамицин УШ (83).

Смесь соединения 82 (200 мг, 0.18 ммоль), соединения 51 (76 мг, 1.88 ммоль) и С§₂СО₃ (61.4 мг, 1.88 ммоль) в сухом ДМФА (8 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакционную смесь разбавляют дихлорметаном (80 мл), промывают водой (2x50 мл) и рассолом (60 мл), сушат над №ь8О₄ и концентрируют досуха. Остаток очищают с помощью флэш-хроматографии на 81О₂, элюируя смесью от 2 до 6% МеОН/СН2С12, что дает на выходе продукт 83 (140 мг, с 54% выходом).

ЬСМ8: Вычислено для С₆₆Н91Ы₅О₂₃Р₂: 1383. Найдено: 1384 (М+Н).

-О-(2-((3 -(Бисфосфонометил)карбамоил)пропаноилокси)ацетил)-1',4-дидегидро-1 -дезокси-1,4дигидро-3'-гидрокси-5'-[4-(2-метилпропил)-1-пиперазинил]-1-оксорифамицин УШ (84). К раствору соединения 83 (140 мг, 0.10 ммоль) и 2,6-лутидина (0.47 мл, 4.0 ммоль) в СН₂С1₂ (10 мл) при температуре -78°С добавляют по каплям бромтриметилсилан (0.26 мл, 20.0 ммоль) в атмосфере аргона. Охлаждающую баню удаляют и смесь перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре. Летучие вещества упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в 10 мл водного раствора 50 мМ ЫН₄ОАс/АсОН буфера (рН 5) и перемешивают в течение 16 ч при комнатной температуре, после чего остаток лиофилизуют. Полученный продукт подвергают флэш-хроматографии с обращенной фазой на колонке С18 с линейным градиентом элюирования от 0 до 100% ацетонитрила в 50 мМ ЫН₄Оас/АсОН буфере (рН 5). Фракции, содержащие продукт, смешивают, ацетонитрил удаляют в вакууме и полученный водный раствор сушат вымораживанием, что дает на выходе соединение 84 в виде твердого вещества темно-голубого цвета (50 мг, с 39% выходом).

ЬСМ8: 95.8% (254 нм), 96.0% (220 нм), 96.3% (320 нм).

Вычислено для С₃₈Н-₃Н₃О₂₃Р₂: 1271. Найдено: 1270 (М-Н).

- 84 016059

Пример 2. Определение ίη νίΐτο антибактериальной активности и цитотоксичности.

Ση νίΐΓΟ антибактериальная активность.

Чувствительность штаммов 8. Лигеик к известным антибиотикам и синтезированным соединениям определяли, следуя рекомендациям, выработанным ЫССЬ8 (М26-А). Соединения разбавляли в два раза последовательно в ДМСО и переносили в подобранную по катионам среду Мюллера-Хинтона (САМНВ; Вес!ои О|ск|и5ои). 50 мкл соединений, разбавленных в САМНВ, смешивали со 100 мкл бактерий, разбавленных в САМНВ в 96-луночных титрационных микропланшетах. Конечная концентрация микроорганизмов в исследовании была 5х10⁵ КОЕ на мл и конечная концентрация ДМСО в исследовании была 1,25%. Исследования были проведены дважды и инкубированы при 37°С в течение 18 ч. Наименьшая концентрация соединения, которая ингибировала видимый рост была отмечена как минимальная ингибирующая концентрация (МГС).

Эксперименты с тестированием чувствительности были также проведены в присутствии сыворотки. Эти эксперименты были проведены схожим образом с тестированием чувствительности со следующими изменениями. 75 мкл соединений, разбавленных в САМНВ, смешивали с 75 мкл бактерий, разбавленных в 100% сыворотке из любого доступного источника (коммерческая смешанная мышиная сыворотка (М8) и человеческая сыворотка (Н8), Ес.|ш1ес11-В|о Шс.) или разбавляли в 8% очищенном сывороточном альбумине человека (Н8А)(Са1Ьюсйет). Конечная концентрация сыворотки животного в исследовании была 50% и конечная концентрация очищенного сывороточного альбумина человека в исследовании была 4%; концентрации всех других компонентов были идентичны таковым, описанным для тестирования чувствительности. Данные сведены в табл. 1.

Таблица 1 Антибактериальная чувствительность бактерий к выбранным соединениям (минимальные ингибирующие концентрации в мг/мл)

	Вид и штамм
	З-аигеги	К соН ЬВВЧЗ?
Соединение	ΒΝ4220	ВК85	АТСС 43300	АТСС 13709	АТСС 13709^е	АТСС 13709 + 50% мыши ная сывор отка	АТСС 13709 + 50 % человеч еская сы ворот ка	АТСС 13709 + 50¾ крысиная сыворотка
Рифампицин	0.008	0.008	0.008	0.008	>128	0.125	0.062	0.125	8
Рифабутин (17)	0.016	0.031	0.0-16	0.031		0.062	0.031	0.031	4
Рифалазил (75)	0.00048	0.001	0.001	0.001	16	0.032	0.032	0.0078	16
9	0.016	0.016	0.016	0.016	-	0.062	0.062	0.062	16
11	0.25	0.25	0.25	0.125	-	0.25	0.25	0.25	32
21	32	16	16	16	-		-	-	>128
30	1	0.5	0.5	1	-	1	1	0.25	1
36	1	1	1	1	>128	2	2	1	128
39	>128	>128	>128	>128	>128	>128	>128	64	128
45	64	64	64	32	>128	128	64	-	>128
	Вид и штамм
	8,аигеи$	е. соИ Г1Ш925

- 85 016059

Соединение	ΚΝ4220	ВК85	АТСС 43300”	АТСС 13709	АТСС 13709'	АТСС 13709 + 50% МЫЦ1Н на я сывор отка	АТСС 13709 + 50 % человеч еская сыворот ка	АТСС 13709 + 50% крысиная сыворотка
50	0.25	0.25	0.25	0.25	>128	0.125	0.125	0.032	16
54	64	64	64	64	>128	>128	>128	>128	>128
56	0.00025	-	0.00025	0.00025	-	0.002	0.001	0.002	8
62	0.0078	0.0078	0.0078	0.0039	>128	0.032	0.032	0.0156	>128
63	0.00048	0.0004 8	0.00048	0.00048	2	0.0156	0.0078	0.032	8
68	0.25	0.25	0.0625	0.0625	>128	1	1	2	64
69	•	0.0002 4	•	0.00048	*	0.0019	0.0019	0.0019	4
71	0.0039	0.0019	0.0019	0.0019	128	0.032	0.032	0.032	>128
78	16	16	8	8	>128	>128	>128	>128	>128
81	0.001	0.001	0.001	0.001	>128	0.0625	0.125	0.03125	>128
84	1	1	1	1	>128	16	16	1	>128

^а: фторхинолон-резистентный МК8Л;

^ь: фторхинолон-чувствительный МК8Л;

^с: новобиоцин и рифампицин резистентный вариант;

^б: до 1 С мутант.

Можно сделать ориентировочное заключение, что бисфосфонированные пролекарства 11, 21, 30, 36, 39, 45, 50, 54, 68, 78 и 84 обладают антибактериальной активностью, которая, по меньшей мере, на порядки величины слабее, чем у исходных лекарственных средств. Фактически, почти полная потеря активности в случаях 39, 45, 54 и 78 предполагает, что введение бисфосфонированной группы оказывает пагубное влияние на антибактериальные свойства молекул. Другие пролекарства 62, 71 и 81 проявляют очень низкую МК, что является предположительным результатом отщепления бисфосфонированных групп и высвобождения активного исходного антибактериального агента в ходе эксперимента. Полное отсутствие активности у пролекарств 36, 39, 45, 50, 54, 62, 68, 71, 78, 81 и 84 в отношении рифампицинрезистентного варианта 8. Лигеик АТСС13709 подтверждает, что эти соединения не обладают антибактериальной активностью опосредованной альтернативным механизмом действия. Табл. 1 также демонстрирует, что исходные антимикробные молекулы 9, 56, 63, 69, рифампицин, рифабутин и рифалазил проявляют антибактериальную активность, которая находится в одних пределах у всех этих соединений.

Влияние сыворотки на значения МК хорошо коррелируют у исходных лекарственных средств и пролекарств. Для рифампицина и в особенности для производных бензоксазинорифамицина (рифалазил и соединения 56, 63 и 69), значения МК.' возрастают значительно (> 4 раз) в присутствии 50% мышиной или крысиной сыворотки. То же самое отмечается для пролекарств бензоксазинорифамицина (62, 68, 71, 78, 81 и 84). Кроме того, не было влияния сыворотки на значения МК соединений 11, 30, 36, 39, 45, 50 и 54, что предполагает, что участие гидролитических ферментов сыворотки маловероятно является необходимым или ответственным за расщепление этих пролекарств в растворе.

Пример 3. Связывание соединений с костным порошком ίη νίΐτο и последующая регенерация исходного лекарственного средства.

Связывание с костным порошком.

Способность молекул из примера 1 связываться с костным порошком была установлена при помощи микробиологического исследования. Одно из соединений было растворено в РВ8 и ресуспендировано при концентрации 1 мг/мл в кашице из порошка костяной муки (Νον Ροοάδ, В1оош1идба1е, Π1ίηοΐ8, И8А) в РВ8 при 10 мг/мл. Суспензия лекарственное средство/пролекарство в порошке костяной муки инкубировали при 37°С в течение 1 ч для достижения связывания и центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 2 мин, перед извлечением надосадочной жидкости. Осадок порошка костяной муки затем отмывали трижды 1 мл РВ8+2% ДМСО. В надосадочной жидкости измеряли количество пролекарства путем измерений микробиологического исследования следующим образом: изолированные колонии индикаторного штамма (8ΐ;·ιρ1ιν1οΜ^ιΐ5 аигеик Κ1758) ресуспендировали в 0,85% физиологическом растворе до ΟΌ₆₀₀=0,1 и засевали штриховым методом на планшеты с подобранным по катионам агаром МюллераХинтона (САМНА). Известные объемы надосадочной жидкости наносили на диски и высушивали. Диски затем помещали на засеянные планшеты САМНА. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 18 ч, после чего измеряли диаметры зон ингибирования, образованных дисками. Количество пролекарства вычисляли по калибровочным кривым известных количеств, которые были использованы в качестве контроля в каждом эксперименте.

Этот эксперимент требует пролекарство, имеющее низкий уровень МГС, чтобы предусмотреть удовлетворительный предел определения. Таким образом, связывание 21 и 62 не могло быть измерено с

- 86 016059 помощью этого метода.

При использовании с соединениями 11, 30, 36, 45, 50, 62, 68, 71, 78, 81 и 84 эксперимент со связыванием ш νίΐτο показал, что >90%, и обычно >95%, каждого соединения был связан с порошком костяной муки, как показано в табл. 2.

Это подтверждает, что бисфосфонированные пролекарства очень эффективно удаляются из раствора с помощью костного вещества. Результаты также бесспорно придают оптимизм в отношении применения бисфосфонатов в качестве медиаторов доставки в кости. Разумно полагать, что часть несвязанного вещества, выявленного этим методом, была не бисфосфонированным пролекарством, а скорее примесью или восстановленным исходным лекарственным средством. Тем не менее, также вероятно, что протяженность связывания с костным веществом отражает кинетику костной абсорбции/адсорбции.

Восстановление лекарственного средства из связанного с костным порошком пролекарства.

Способность пролекарства высвобождать активную субстанцию в месте инфекции является наиболее важной для применения ш νίνο. Это может быть спрогнозировано путем измерения высвобождения лекарственного средства из пролекарства, связанного с костным веществом ш νίΐτο.

Количество исходного лекарственного средства, восстановленного из фосфонированного пролекарства измеряли следующим образом. Отмытые пролекарства, связанные с костным порошком, из вышеописанного эксперимента ресуспендировали в 400 мкл РВ8+2% ДМСО или в 400 мкл 50% (по объему в РВ8+2% ДМСО) человеческой или крысиной сыворотки. Суспензию инкубировали в течение ночи при 37°С, центрифугировали при 13000 об/мин в течение 2 мин и извлекали надосадочную жидкость. Количество восстановленного исходного лекарственного средства в надосадочной жидкости определяли путем измерений с помощью миробиологического исследования, которое было предварительно описано для самих пролекарств. Количество пролекарства вычисляли по калибровочным кривым известных количеств исходного лекарственного средства, которое использовали в качестве контроля в каждом эксперименте. Количество восстановленного лекарственного средства, оцененное в этом биологическом исследовании, подтверждали путем определения МПС. Процент лекарственного средства, восстановленного в РВ8 или сыворотке после инкубации в течение ночи (табл. 2), вычисляли по разнице между количеством связанного пролекарства и количества восстановленного лекарственного средства (не показано).

- 87 016059

Таблица 2 Связывание с костным веществом и превращение пролекарств бисфосфонированного рифамицина в исходные лекарственные средства после связывания с костным веществом (выражается в % пролекарства, превращенного после 24 ч инкубации)

Соединение	Исходное	% связывания с костным веществом	среда	% превращения
11	9	95	РВ8	0.97
50% Человеческая сыворотка	1.01
50% Крысиная сыворотка	1.01
21	Рифабутин	??	РВ8	<1об
50% Человеческая сыворотка	ηά
50% Крысиная сыворотка	0.02
30	Рифабутин	90	РВ8	0.07
50% Человеческая сыворотка	0.05
50% Крысиная сыворотка	0.07
36	Рифабутин	99.4	РВ8	0.38
50% Человеческая сыворотка	0.25
50% Крысиная сыворотка	0.38
39	Рифабутин	??	РВ5	77
50% Человеческая сыворотка	77
50% Крысиная сыворотка	77
45	Рифабутин	99.8	РВ5	<1ос!
50% Человеческая сыворотка	-
50% Крысиная сыворотка	0.002
50	Рифабутин	96.8	РВУ	2.65
50% Человеческая сыворотка	ηά
50% Крысиная сыворотка	2.68
54	Рифабутин	??	РВБ	77
50% Человеческая сыворотка	ηά
50% Крысиная сыворотка	??
62	56	99.8	РВ8	0.21
50% Человеческая сыворотка	0.86
50% Крысиная сыворотка	0.91

- 88 016059

68	63	99.9	РВ8	0.02
50% Человеческая сыворотка	пс!
50% Крысиная сыворотка	0.24
71	69	99.9	РВ8	0.1
50% Человеческая сыворотка	0.46
50% Крысиная сыворотка	0.38
78	Рифалазил	99.9	РВ8
50% Человеческая сыворотка	ηά
50% Крысиная сыворотка	0.01
81	Рифалазил	94.8	РВ8	1.98
50% Человеческая сыворотка	πά
50% Крысиная сыворотка	2.50
84	Рифалазил	99.8	РВ8	<1об
50% Человеческая сыворотка	ηά
50% Крысиная сыворотка	0.12

< 1об: меньше предела определения;

пб: не определялось;

??: не может быть измерено с помощью настоящей методики.

Эти данные показывают, что соединения 21, 39, 45, 78 и 84 не способны восстановить соответствующее им исходное лекарственное средство при связывании с костным веществом и, следовательно, прогнозируется отсутствие проявления какой-либо существенной активности ш νί\Ό. Другие пролекарства высвобождают значительные количества исходных рифамициновых антибактериальных агентов в этих условиях. Сравнение уровней восстановления пролекарств 11 и 62 с существенными уровнями восстановления с одной стороны, и 68, которое лишь незначительно восстанавливается и 39, которое, видимо, не восстанавливается, показывает важность точки прикрепления связывающей группы. Эти пролекарства используют конкретный сложный эфир сукцинамата в качестве связывающей группы, который образует цикл, превращаясь в исходный сукцинимид с течением времени, реакция образования цикла происходит медленнее в случаях, когда имеется экранирование сложных эфиров. Расстояние, отделяющее бисфосфонированную группу от точки расщепления, также важно. Так сравнение степеней расщепления связанных с костным веществом пролекарств 30 с одной стороны и 36 и 71 с другой показывает, что наибольшая длина цепи, приводит к тому, что бисфосфонат в 30 отрицательно воздействует на степень расщепления.

Более того, степени восстановления исходного лекарственного средства из пролекарств 11, 21, 30, 36, 45, 50 и 81 не подверглись существенному влиянию среды, что предполагает достаточность химического расщепления для высвобождения исходных рифамицинов, и этот ферментативно опосредованный процесс либо не требуется, либо не происходит в условиях сыворотки данного исследования (данные не представлены). С другой стороны, отмечается существенное ускорение превращения 62, 68, 71, 78 и 84 в их исходные лекарственные средства в присутствии сыворотки по сравнению с РВ8. Это, само по себе, не означает однозначно, что биокатализ задействован, с потенциально другими источниками вариации, такими как эффекты среды. И вновь, сравнение 62 и 68 с одной стороны и 9 с другой стороны показывает, что сыворотка может оказывать различное влияние на степени расщепления пролекарств, несущих такую же связывающую группу. Схожий вывод может быть сделан при сравнении 36 и 71. Это также подчеркивает, что уникальный характер каждой связующей лекарственное средство комбинации определяет характер (потребность в эстеразе сыворотки, степень) процесса расщепления.

Пример 4. Сравнения профилактической эффективности рифамициновых антибактериальных средств и их бисфосфонированных пролекарств в крысиных моделях инфекций костей.

Для определения ш νί\Ό активности бисфосфонированных пролекарств производных рифамициновых антибактериальных средств в сравнении с их не-бисфосфонированных исходных средств, соединения 11 и его исходного соединения 9, соединений 21, 30, 36, 50 и их исходного лекарственного средства рифабутина, соединения 62 и его исходного соединения 56, соединения 68 и его исходного соединения 63, соединения 71 и его исходного соединения 63, соединения 81 и его исходного соединения рифалазила были использованы в качестве профилактических лекарств в животных моделях инфекции. В частно

- 89 016059 сти, спонтанный резистентный к новобиоцину мутантный штамм 8. аигеик АТСС 13709 (выделенный при клиническом остеомиелите), выращивали в течение ночи при 37°С в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом (ВНШ). Через 16 ч выращивания клетки пересевали в свежий ВШВ и инкубировали в течение 45 ч при 37°С. Клетки отмывали дважды физиологическим раствором с фосфатным буфером (РВ8) и ресуспендировали в ВШВ с добавлением 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки при плотности приблизительно 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл (основываясь на нефелометрии). Суспензию аликвотировали и порцию использовали для проверки подсчета КОЕ. Культуру хранили замороженной (-80°С) и использовали без пересева. Для применения в качестве посевного материала культуру размораживали, разбавляли в РВ8 и содержали в ледяной ванне до использования.

Животных заражали по методике, описанной О'КеШу е1 а1. (АпЧт1сгоЫа1 Адеп18 апД СНетоШегару (1992), 36(12): 2693-97) для развития инфекции костей. Самок крыс линии СО (возраст от 57 до 70 дней; п - 5 на группу; СНаг1е5 ККег, 81-Соп51ап1 СапаДа) обезболивали изофлюраном перед и во время операции. После наступления полной анестезии крысу помещали животом вверх и сбривали шерсть с операционного поля. Кожу на большеберцовой кости очищали и дезинфицировали (повидон-этанолом 70%). Продольный разрез ниже коленного сустава производили в сагиттальной плоскости. Разрез производили над костью ниже коленного сустава (головка большеберцовой кости или мыщелок) но не продолжали вплоть до голеностопного сустава. Скоростная дрель со сверлом с шарообразной головкой 2 мм была использована для просверливания отверстия в костномозговую полость большеберцовой кости. Крысам вводили посредством инъекции в болынеберцовую кость 0,05 мл 5% натрия морруата (склерозирующий агент) и затем 0,05 мл суспензии 8. аигеик (са. 2x10’ КОЕ/крыса). Отверстие запечатывали небольшим количеством сухого зубного цемента, который немедленно абсорбирует жидкости и прикрепляется в месте введения. Рану закрывали с помощью 3 металлических кожных клипс. Моксифлоксацин (в качестве положительного контроля) 10 мг/кг вводили однократно путем внутривенной инъекции через 1 ч после инфицирования в физиологическом растворе, в то время как пролекарства производных рифамицина (приготовленных в 0,9% физиологическом растворе) вводили в дозе, указанной в табл. 3 в виде однократной болюсной внутривенной инъекции в различные временные точки перед инфицированием.

Инфицированных крыс умерщвляли путем СО₂ асфиксии через 24 ч после инфицирования, чтобы отслеживать число бактериальных КОЕ. Инфицированные большеберцовые кости удаляли, освобождали от мягких тканей и взвешивали. Кости перемалывали, ресуспендировали в 5 мл 0,9% №С1, последовательно разбавляли и формировали для количественных культур. Для соединений 56, 68 и 81 1 мл 0,9% раствора №1С1 добавляли к 50 мг угольной пыли перед последовательным разбавлением. Эффективность лечения измеряли по логарифму жизнеспособных бактерий (логарифм КОЕ на грамм костей). Результаты, полученные для каждой группы крыс, были оценены путем подсчета среднего логарифма КОЕ и стандартного отклонения. Предел определения составляет 2 логарифма КОЕ. Статистические сравнения количеств жизнеспособных бактерий для различных пролеченных и нелеченных групп были произведены с помощью критерия множественных сравнений Даннетта. Различия считали достоверными при уровне Р < 0,05 при сравнении пролеченных инфицированных животных и нелеченных инфицированных. Используемые дозы, период времени, разделяющий лечение и время инфицирования, а также результаты лечения представлены в табл. 3.

- 90 016059

Таблица 3

Остаточные бактериальные титры после профилактического лечения в крысиной модели инфекции костей 8. аигеик.

Соединение №	Доза (мг/кг эквивалент исходного средства)	Время введения (дни перед инфекцией)	Измеренный титр бактерий (логарифм КОЕ/г костей)
Нелеченные	Положител ъный контроль	Исходное лекарственн ое средство	Тестируемое соединение
Исходное соединение: 9
11	11	з	5.49*1.22	2.36*0.21	6.38*0.90	3.01 +0.47
Исходное соединение: рифабутин
21	12	1	6.32*1.34	2.53*0.39	ηά	6.59*0.90
зо	23	2	5,53*0.79	2.59*0.56	2.15*0.07	2.49*0.35
36	23	5	6.14*0.73	2.46*0.52	5.75+0.55	2.73*0.86
50	20	3	6.24*0.83	2.56*0.64	4.72*1.84	6,31*0.82
Исходное соединение: 56
62	20	2 [4.89*1.04	2.20*0.33	\|3.61 ±1.57	1.98*0.06
Исходное соединение: 63
68	20	3	6.14*0.95	2.32*0.33	2.84*0.93	4.86+0.66
Исходное соединение: 69
71	20	3	5.28*0.73	2.060.04 [4.081.53^а	2.77*1.00
Исходное соединение: рифалазил
81	10	3 [6.140.95 [2.320.33 [2.21 ±0.34 [2.05+0.06

п± не определялось;

^а: рифалазил использован вместо соединения 69.

Эти результаты четко указывают статистически значимый (1-1ез1; р<0.05) профилактический эффект пролекарств бисфосфонированных производных рифамицина 11, 30, 36, 62, 71 и 81 в противоположность отсутствию эффективности у исходных соединений, применяемых в таких же экспериментальных условиях. Исключением является рифабутин, который способен обеспечивать эффективное профилактическое действие, при применении за два дня (но не за пять дней) до инфицирования. Эти результаты и данные восстановления ш νίΙΐΌ твердо поддерживают точку зрения, что эти бисфосфонированные пролекарства нацелены на костное вещество ш у1уо, где они способны высвобождать свои биологически активные группы в концентрациях выше таковых, необходимых для антибактериального действия.

Взаимоотношение между расщеплением и антибактериальной активностью ясно показаны пролекарством 21. Это соединение неспособно существенно высвобождать его исходное соединение рифабутин т νίΙΐΌ и проявляет недостаток эффективности в условиях исследования ш у1уо (табл. 3). Ясное взаимоотношение между химической и биохимической нестабильностью пролекарства и профилактической активностью демонстрирует способность модулировать ш у1уо эффект фосфонированных соединений изобретения путем изменения степени восстановления пролекарства. Это также представляет новые доказательства, подтверждающие важность расщепляемого бисфосфонированного пролекарства по сравнению с нерасщепляемым бисфосфонированным конъюгатом для обеспечения желаемого результата лечения в модели ш у1уо.

Эти эксперименты демонстрируют очевидное преимущество изобретения в профилактике инфекций костей.

Пример 5. Сравнительное применение производных рифамицина 9, 56, 69, рифабутина и рифалазила и их соответствующих бисфосфонированных пролекарств 11, 62, 71, 36 и 81 в крысиной модели хронического остеомиелита, вызванного 8. аигеик.

Чтобы оценить способность бисфосфонированных пролекарств производных рифамицина в лечении хронических инфекций костей, произведено сравнение исходных соединений 9, 56, 69, рифабутина и рифалазила (все они являются небисфосфонированными производными рифамицина) и соответствующих им бисфосфонированных пролекарств, соответственно, 11, 62, 71, 36 и 81, которые применялись для лечения хронической (от 14 до 28 дней) инфекции у крыс в течение 4 недель антимикробной терапии.

В этом эксперименте крысы были заражены, как описано в примере 4, и пролечены либо подкожным введением 20 мг/кг массы тела специфического антибактериального агента, рифамицинового производного, или внутривенным введением молярно эквивалентной дозы его бисфосфонированного пролекарства согласно указанному графику после инстилляции бактерий. Стандартные контроли, включающие отсутствие лечения и подкожное введение 20 мг/кг рифампицина ежедневно, также были созданы. Крыс гуманно умерщвляли в конце эксперимента и определяли бактериальные титры в инфицированной большеберцовой кости.

Этот эксперимент проводили с подкожным введением 20 мг/кг массы тела рифамицинового производного 9 или с внутривенным введением 32 мг/кг его пролекарства 11 (соответсвующего 20 мг/кг со

- 91 016059 единения 9) на каждый из 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 и 47 дней (1 раз в четыре дня) после инстилляции бактерий. Альтернативно, соединение 11 вводили тем же путем и в той же дозе на 20, 21, 22, 23, 30, 37, 44 и 47 дни (4 раза через каждые 24 ч, затем через каждые 7 дней) после инсталляции бактерий. Такие же контрольные группы (без лечения или с ежедневным подкожным введением 20 мг/кг рифампицина) были использованы. Крыс гуманно умерщвляли на 48-й день после инициации инфекции и определяли бактериальные титры в инфицированной большеберцовой кости. Результаты представлены на фиг. 1.

Также проводили этот эксперимент, в котором сходным образом инфицированные крысы были пролечены либо 20 мг/кг массы тела рифабутина подкожно или 33,4 мг/кг его пролекарства 36 (соответствующего 20 мг/кг рифабутина) внутривенно на каждый 28, 32, 36, 40, 44,48 и 52 дни (1 раз в четыре дня) после инстилляции бактерий. Такие же были использованы контрольные группы (без лечения или с ежедневным подкожным введением 20 мг/кг рифампицина). Крыс гуманно умерщвляли на 55-й день после инициации инфекции и определяли бактериальные титры в инфицированной большеберцовой кости. Результаты представлены на фиг. 2.

Также проводили этот эксперимент, в котором сходным образом инфицированные крысы были пролечены либо 20 мг/кг массы тела антибактериальным агентом 56 производным рифамицина подкожно или 26 мг/кг его пролекарства 62 (соответствующего 20 мг/кг соединения 56) внутривенно на каждый 27, 28, 29, 30, 34, 38, 42, 46 и 50 дни (4 раза через каждые 24 ч, затем через каждые 4 дня) после инстилляции бактерий. Такие же контрольные группы (без лечения или с ежедневным подкожным введением 20 мг/кг рифампицина) были использованы. Крыс гуманно умерщвляли на 51-й день после инициации инфекции и определяли бактериальные титры в инфицированной большеберцовой кости. Результаты представлены на фиг. 3.

Также проводили этот эксперимент, в котором сходным образом инфицированные крысы были пролечены либо 20 мг/кг массы тела антибактериальным агентом 69 производным рифамицина подкожно или 28 мг/кг его пролекарства 71 (соответствующего 20 мг/кг соединения 69) внутривенно на каждый 18, 19, 20, 21, 25, 29, 33, 37, 41 и 45 дни (4 раза через каждые 24 ч, затем через каждые 4 дня) после инстилляции бактерий. Такие же контрольные группы (без лечения или с ежедневным подкожным введением 20 мг/кг рифампицина) были использованы. Крыс гуманно умерщвляли на 46-й день после инициации инфекции и определяли бактериальные титры в инфицированной большеберцовой кости. Результаты представлены на фиг. 4.

Также проводили этот эксперимент, в котором сходным образом инфицированные крысы были пролечены либо 20 мг/кг массы тела рифалазила подкожно или 28 мг/кг его пролекарства 81 (соответствующего 20 мг/кг рифалазила) внутривенно на каждый 22, 23, 24, 25, 29, 33, 37, 41 и 45 дни (4 раза через каждые 24 ч, затем через каждые 4 дня) после инстилляции бактерий. Такие же контрольные группы (без лечения или с ежедневным подкожным введением 20 мг/кг рифампицина) были использованы. Крыс гуманно умерщвляли на 46-й день после инициации инфекции и определяли бактериальные титры в инфицированной большеберцовой кости. Результаты представлены на фиг. 5.

Кроме того, отдельный эксперимент проводили с использованием ежедневного подкожного введения 20 мг/кг массы тела либо рифампицина, рифабутина или соединения 9 с 15 по 28 день после инфицирования. Крыс гуманно умерщвляли на 29-й день и определяли бактериальные титры в инфицированной большеберцовой кости. Результаты приведены на фиг. 6.

В то время как ежедневное введение либо рифампицина либо рифабутина приводило к большому, статистически значимому снижению титра бактерий (р<0,0001), ежедневное введение рифамицинового производного 9 показало меньшее, но также статистически значимое снижение титра бактерий в кости (фиг. 6, значение Р=0,0022). Производное 9 было полностью неэффективно при использовании 1 раз в четыре дня (фиг. 1, значение Р=0,7272). В то время как бисфосфонирование пролекарство 11 показало небольшое снижение титра бактерий при двух исследованных режимах дозирования (фиг. 1), это снижение не является статистически значимым (значения Р 0,4107 и 0,2082 для режима 1 раз в 4 дня и 4 раза через 24 ч+каждые 7 дней соответственно). С пролекарством 36, снижение титра бактерий на 1 логарифмический порядок величины было статистически значимым (фиг. 2, значение Р 0,0036), несмотря на то, что оно имеет меньшую степень восстановления ш νίΐτο по сравнению с соединением 11. С другой стороны исходное соединение рифабутин даже при интервале дозирования 4 дня, все еще приводит к выраженному снижению титра бактерий (более чем 3 логарифмических порядка величины, фиг. 2). Можно предполагать, что положительный исход лечения соединением 36, является не только результатом его нацеленности на костную ткань, но также и сниженного клиренса рифабутина из кости по сравнению с производным рифамицина 9. Снижения титров бактерий приблизительно на 1 логарифмический порядок величины, связанные с применением пролекарств 62, 71 и 81, все являются статистически значимыми (фиг. 3, 4 и 5 соответственно, значения Р<0,001) не только по сравнению с нелеченной группой, но и по сравнению с исходными антибактериальными средствами рифамицинового ряда, все из которых не были эффективны при исследуемых режимах дозирования.

Это подчеркивает роль бисфосфонирующей связывающей группы в получении желаемого терапевтического результата и демонстрирует применимость изобретения в лечении инфекций костей.

- 92 016059

Пример 6. Определение уровней соединения 9, полученных при использовании соединения 11 или соединения 9 в большеберцовой кости крыс, при использовании в качестве профилактики или лечения инфекции костей.

Экспериментально полученные интактные неинфицированные (контрлатеральные) большеберцовые кости леченных и инфицированных крыс, описанных выше, были перемолоты в порошок, который был ресуспендирован в ΡΒ8+2% ДМСО. Эту смесь центрифугировали в течение 2 мин при 13000 об/мин. Количество соединения 9, высвобожденное из надосадочной жидкости было определено с помощью микробиологического исследования, как описано ранее (пример 3).

При использовании в дозе 10 мг/кг массы тела за три дня до инфицирования, количество соединения 19 в неинфицированной большеберцовой кости животных пролеченных соединением 9 было ниже предела количественного определения (0,17 мкг/г). С другой стороны концентрация 0,88±0,11 мкг/г кости была определена у животных, пролеченных соединением 11 в дозе 15,5 мг/кг массы тела (эквивалент 10 мг/кг соединения 9) за три дня до инфицирования.

Когда соединение 11 было использовано в дозе 32 мг/кг массы тела еженедельно в течение 4 недель после инфицирования, уровень соединения 9 был определен 1,28±0,18 мкг/г кости.

Эти данные указывают, что высокая концентрация исходного соединения 9 отмечается в кости даже через неделю после последнего введения в большеберцовую кость у животных, пролеченных соединением 11, в концентрациях, ожидаемых быть примерно на два порядка величины выше минимальной ингибиторной концентрации (ΜΗ'.') для штамма бактерий, использованных для развития инфекции ίη у1уо. Это абсолютно противоречит прямому использованию соединения 9, которое невозможно поддерживать в существенной концентрации в кости даже в течение 3 дней. Это придает значение концепции применения бисфосфонированных пролекарств, чтобы сосредоточить дозу антибактериальных средств в костном веществе и чтобы высвобождать ее в течение продолжительного периода.

Пример 7. Определение уровней рифабутина в результате применения соединений 30 и 36 в различных тканях при использовании в качестве профилактики или лечения инфекции костей.

Перемолотые образцы кости и гомогенаты тканей были суспендированы в ΡΒ8, перемешены с помощью вортекса и центрифугированы при 13000 об/мин в течение 2 мин. Надосадочную жидкость собрали и использовали в микробиологическом исследовании для определения уровней рифабутина, высвобожденного, как это описано ранее (пример 3). Уровни, приведенные в табл. 4, выявлены при введении соединения 30 в дозе 33,8 мг/кг массы тела за 2 дня до инфицирования, соединения 36 за 5 дней до инфицирования и соединения 36 в течение 4 недель, начиная с 14-го дня инфекции.

Таблица 4 Уровни рифабутина (мкг/г ткани или нг/мл в случае плазмы), выявленные при введении рифабутина или пролекарств 30 или 36 в различных тканях

Ткань	Измеренные уровни рифабутина (мкг/г ткани или мкг/мл плазмы)
Соединение 30 (33.8 мг/кг) Лечение А	Рифабутин (20мг/кг) Лечение В	Соединение 36 (33.4 мг/кг) Лечение В	Рифабутин (20 мг/кг) Лечение С	Соединение 36 (32 мг/кг) Лечение С
Большеберцова я кость	<ЬоО	<ЬоО	<Ι2οΌ	<ЬоС	0.69 ±0.14
Печень	1.23 ±0.12	<Ι_οϋ	0.33 ± 0.05	. 0.08 ±0.02	0.87 ± 0.23
Почка	3.27 ±1.19	<1χιΌ	0.31 ±0.18	<1оГ)	0.42 ±0.10
Селезенка	<ίΛϋ	<1Όϋ	<1Όϋ	1.40 ±0.40	1.21 ±0.08
Плазма		<ΐΛϋ	<ЬоО	<СоО	<СоП

Лечение А: однократное введение за 2 дня до инфицирования; умерщвление на следующий день после инфицирования.

Лечение В: однократное введение за 5 дней до инфицирования; умерщвление на следующий день после инфицирования.

Лечение С: одно введение каждые четыре дня, начиная с 28 дня после инфицирования до 52 дня; умерщвление на 55-й день.

< ЬоЭ: ниже предела определения.

Неожиданно, уровни в большеберцовой кости были очень низкими или ниже предела определения, но существенное количество восстановленного рифабутина было обнаружено в печени и почке. Это может быть следствием появления преципитата за счет наличия ионов кальция в крови. Преципитат накапливается либо в почках в результате клубочковой фильтрации, либо в печени. Возможно, что степень расщепления пролекарств выше в этих органах, что приводит к более высоким полученным титрам.

- 93 016059

Пример 8. Определение уровней пролекарств 11,36 и 62 в костях после введения.

Определение уровней пролекарства 11 в большеберцовых, бедренных и нижнечелюстных костях.

Чтобы определить уровни пролекарства 11, обнаруженного в костях крыс, пролеченных соединением 11, был разработан аналитический метод с использованием жидкостной хроматографии с массспектрометрией (ЬС/М8) для определения изучаемого вещества. Цельные кости, полученные в эксперименте (большеберцовые, бедренные или нижнечелюстные), перемалывали и экстрагировали восстановленное соединение 9 с помощью фосфатного буфера (25 мМ, рН 7; 1 мл на 50 мг молотой кости). Смесь перемешивали на вортексе в течение 10 мин и центрифугировали 10 мин при 10000 д. Полученный осадок высушивали, взвешивали и хранили для определения соединения 11.

Для определения уровней бисфосфонированного пролекарства 11 в кости стандарты, контроли и холостые пробы были приготовлены (в двух экземплярах) следующим образом: к взвешенному (~ 20 мг) сухому чистому костяному порошку добавляли пиковый раствор (10 мкл) соединения 11, приготовленного в ацетонитриле и 990 мкл буфера (0,1 М трис-НС1, рН 7, 0,15 М №1С1). Смесь перемешивали на вортексе в течение 30 мин (при комнатной температуре), центрифугировали в течение 15 мин при 10000 д (при комнатной температуре), надосадочную жидкость удаляли и осадок хранили для процедуры расщепления. Пределы стандартов (6 уровней) были от 0,1 до 20 мкМ (0,1 до 20 нмоль) и контрольные уровни были 0,25 и 8,5 мкМ (0,25 и 8,5 нмоль).

К каждому стандарту, контролю, холостой пробе и экспериментальному образцу (~ 20 мг из осадка, полученного ранее) добавляли 500 мкл 100 мМ фосфатного буфера, содержащего аскорбиновую кислоту (1 мг/мл), доведенного до рН 9. Расщепление пролекарства 11 в лекарство 9 было получено при инкубации 4 ч при 50°С. В конце этого периода раствор приводили к нейтральному рН раствором 10% муравьиной кислоты (20 мкл) и добавляли внутренний стандарт (рифаксимин). После центрифугирования в течение 10 мин при 10000 д (при комнатной температуре) 20 мкл надосадочной жидкости вводили в ЬС/М8.

Количество соединения 9, полученного в этом процессе, анализировали тем же методом на жидкостном хроматографе с масс-селективным детектором Адйеп! 1100™ кепек ЬС/М8О Тгар. Надосадочную жидкость вводили в колонку [пейхб ΟΌ8-3™ (4,6х50 мм, 3μ), с использованием (А) 0,01% раствора муравьиной кислоты в воде и (В) 0,01% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле :этаноле (50:50) с градиентом 55-100% (В) в (А) в течение 5 мин, затем оставшееся при 100% (В) в течение 1 мин, при скорости потока 0,4 мл/мин. Масс-спектрометрию настраивали следующим образом: зонд Ε8Ε положительная полярность, распылитель 45 пси, температура сухого газа 350°С, поток сухого газа 10 л/мин, выход капилляров 120 V (от 2,5 до 6 мин) или 140 V (от 6 до 12 мин) и скиммер 30 V. Время процесса было 12 мин с установкой отводящего клапана в положении на сброс в течение первых 2,5 мин. Соединение 9 было анализировано в режиме 8КМ при м/е 853,3—821,1 и внутренний стандарт (рифаксимин) при м/е 786,2->754,2.

Результаты этих определений после однократного внутривенного болюсного введения соединения 11 в дозе 32 мг/кг массы тела представлены на фиг. 7.

Определение уровней пролекарства 36 в большеберцовой кости.

Чтобы определить уровни пролекарства 36, обнаруженного в большеберцовых костях крыс, пролеченных соединением 36, был разработан аналитический метод с использованием жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЪС/М8) для определения изучаемого вещества. Цельные болынеберцовые кости, полученные в эксперименте, перемалывали в порошок и экстрагировали восстановленный рифабутин из 50 мг порошка с 1 мл ацетонитрила. Смесь перемешивали на вортексе в течение 15 мин и центрифугировали 10 мин при 10000 д (при комнатной температуре).

Полученный осадок высушивали, взвешивали и хранили для определения соединения 11. Для дозирования пролекарства в кости стандарты, контроли и холостые пробы были приготовлены (в двух экземплярах) следующим образом: к взвешенному (~20 мг) сухому чистому костному порошку добавляли пиковый раствор (10 мкл) пролекарства, приготовленного в воде и 990 мкл буфера (0,1 М трис-НС1, рН 7, 0,15 М №1С1). Смесь перемешивали на вортексе в течение 30 мин (при комнатной температуре), центрифугировали в течение 10 мин при 10000д (при комнатной температуре), надосадочную жидкость удаляли и осадок хранили для процедуры расщепления. Пределы стандартов (6 уровней) были от 0,05 до 10 мкМ (0,05 до 10 нмоль) и контрольные уровни были 0,075, 0,75 и 7,5 мкМ (0,075, 0,75 и 7,5 нмоль).

К каждому стандарту, контролю, холостой пробе и экспериментальному образцу (~20 мг взвешенного из высушенной экспериментально полученной кости) добавляли 500 мкл 100 мМ натрийфосфатного буфера, доведенного до рН 9. Расщепление пролекарства до лекарственного средства (рифабутина) было осуществлено в результате 5 последовательных одночасовых периодов инкубации при 70°С. В конце каждого одночасового периода надосадочную жидкость приводили к нейтральному рН раствором 10% муравьиной кислоты (15 мкл), смесь перемешивали на вортексе и центрифугировали (10 мин при 10000 д, при комнатной температуре). Надосадочную жидкость хранили при 4°С и осадок ресуспендировали в фосфатном буфере (500 мкл) и инкубировали в течение следующего часового периода. В конце серии периодов добавляли внутренний стандарт (соединение 56) к смешанным надоса- 94 016059 дочным жидкостям и лекарственное средство (рифабутин) и внутренний стандарт экстрагировали с помощью 8РЕ на 81га1а-Х (30 мг/1 мл) с использованием ацетонитрила в качестве элюента. Элюент выпаривали до сухого состояния и высушенный остаток восстанавливали в подвижной фазе (500 мкл). После перемешивания на вортексе в течение 20 мин надосадочную жидкость (10 мкл) вводили в ЬС/М8.

Количество рифабутина, полученного в этом процессе, анализировали на жидкостном хроматографе с масс-селективным детектором Адйеп! 1100™ 5епе5 ЬС/М8Э Тгар. Надосадочную жидкость вводили в колонку ЬегйП ОЭ8-3 (4,6x50 мм, 3 мк) с использованием (А) 0,01% раствора муравьиной кислоты в воде и (В) 0,01% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле :этаноле (50:50) с градиентом 45-65% (В) в (А) в течение 5 мин, затем 65-95% (В) в течение 1 мин и поддерживали при 95% (В) еще 1 мин при скорости потока 0,4 мл/мин.

Масс-спектрометрию настраивали следующим образом: зонд Е8Е положительная полярность, распылитель 45 пси, температура сухого газа 350°С, поток сухого газа 10 л/мин, выход капилляров 110 V и скиммер 34,5 V. Время процесса было 13 мин с установкой отводящего клапана в положении на сброс в течение первых 3 мин. Рифабутин был анализирован в режиме 8КМ при м/е 847,3^815,4 и внутренний стандарт (соединение 56) при м/е 929,3,3^897,4.

Результаты этих определений после однократного внутривенного болюсного введения соединения 36 в дозе 15,5 мг/кг массы тела представлены на фиг. 8.

Определение уровней пролекарства 62 в большеберцовой кости.

Чтобы определить уровни пролекарства 62, обнаруженного в большеберцовых костях крыс, пролеченных соединением 62, был разработан аналитический метод с использованием жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЬС/М8) для определения изучаемого вещества. Цельные кости, полученные в эксперименте, перемалывали в порошок и экстрагировали восстановленное соединение 56 путем суспендирования 50 мг этого порошка в 1 мл метанола. Смесь перемешивали на вортексе в течение 15 мин и центрифугировали 10 мин при 10000 д. Полученный осадок высушивали, взвешивали и использовали для определения пролекарства.

Для дозирования стандарты, контроли и холостые пробы были приготовлены (в двух экземплярах) следующим образом: к взвешенному (~20 мг) сухому чистому костному порошку добавляли пиковый раствор (10 мкл) соединения 62, приготовленного в воде:метаноле (50:50) и 990 мкл буфера (0,1 М трисНС1, рН 7, 0,15 М №1С1). Смесь перемешивали на вортексе в течение 10 мин (при комнатной температуре), центрифугировали в течение 15 мин при 10000д (при комнатной температуре), надосадочную жидкость удаляли и осадок хранили для процедуры расщепления. Пределы стандартов (6 уровней) были от 0,05 до 10 мкМ (0,05 до 10 нмоль) и контрольные уровни были 0,075, 0,75 и 7,5 мкМ (0,075, 0,75 и 7,5 нмоль).

К каждому стандарту, контролю, холостой пробе и экспериментальному образцу (~20 мг взвешенного из высушенного осадка) добавляли 500 мкл 100 мМ натрий-фосфатного буфера, доведенного до рН 10. Расщепление пролекарства до лекарственного средства (соединения 56) было осуществлено в результате 10 последовательных одночасовых периодов инкубации при 70°С. В конце каждого одночасового периода надосадочную жидкость приводили к нейтральному рН раствором 10% муравьиной кислоты (20 мкл), смесь перемешивали на вортексе и центрифугировали (10 мин при 10000 д, при комнатной температуре). Надосадочную жидкость хранили при 4°С и осадок ресуспендировали в фосфатном буфере (500 мкл) и инкубировали в течение следующего часового периода. В конце серии периодов добавляли внутренний стандарт (рифабутин) к смешанным надосадочным жидкостям, которые были загружены на кондиционный картридж 81га1а-Х™ (30 мг/1 мл) для экстракции (8РЕ). После отмывания 1% водным раствором муравьиной кислоты (1 мл) и 100% водой (1 мл), соединение 56 и внутренний стандарт были элюированы с использованием 1 мл ацетонитрила. Элюент выпаривали до сухого состояния, высушенный остаток восстанавливали в подвижной фазе (500 мкл). После перемешивания на вортексе в течение 15 мин, надосадочную жидкость (20 мкл) вводили в ЬС/М8.

Количество соединения 56, полученного в этом процессе, анализировали на жидкостном хроматографе с масс-селективным детектором АдПеп! 1100 5епе5 ЬС/М8Э Тгар. Образец раствора вводили в колонку Ечег^П ОЭ8-3 (4,6x50 мм, 3μ), с использованием (А) 0,01% раствора муравьиной кислоты в воде и (В) 0,01% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле: метаноле (50:50) с градиентом 45-65% (В) в (А) в течение 5 мин, затем 65-95% (В) в течение 1 мин и поддерживали при 95% (В) еще 1 мин при скорости потока 0,4 мл/мин.

Масс-спектрометрию настраивали следующим образом: зонд Е8Е положительная полярность, распылитель 45 пси, температура сухого газа 350°С, поток сухого газа 10 л/мин, выход капилляров 110 V и скиммер 34,5 V. Время процесса было 13 мин с установкой отводящего клапана в положении на сброс в течение первых 3 мин. Соединение 56 было анализировано в режиме 8КМ при м/е 929,3^897,2 и внутренний стандарт (рифабутин) при м/е 847,3^815,3.

Результаты этих определений после однократного внутривенного болюсного введения соединения 62 в дозе 26 мг/кг массы тела представлены на фиг. 9.

Эти определения предусматривают дальнейшее доказательство ίη νίνο, что бисфосфонированные

- 95 016059 рифамицины способны накапливаться в костях, где они могут сохраняться в течение дней, высвобождая их исходные соединения в потенциальных местах инфекции. Это подтверждает роль бисфосфонированной связывающей группы в доставке таких рифамициновых агентов в кости, и также подтверждает целесообразность применения изобретения для профилактики и лечения инфекций костей.

Необходимо понимать, что примеры и воплощения, приведенные в данном описании, предназначены лишь для иллюстративных целей и поэтому разнообразные модификации и изменения в их свете будут предполагаться специалистами в данной области и должны быть включены в сущность и сферу действия этого патента и в объем формулы изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль где В представляет собой фосфонированную группу, выбранную из группы, состоящей из где каждый К* независимо выбран из группы, состоящей из Н, (С1-С₆)алкила, (С₆-С1₄)арила и гетероарила, представляющего собой 4-9-членные кольца, содержащие 1-3 гетероатома, выбранные из атомов Ν, О или 8, при условии, что по крайней мере два К* представляют собой Н;

X представляет собой Н, ОН, Ν4₂ или галогеновую группу;

каждый XI независимо выбран из группы, состоящей из Н, ОН, ΝΗ₂, и галогеновой группы;

Ь представляет собой расщепляемый линкер для связывания В с А;

т имеет значение 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7;

А представляет собой рифамицин, по крайней мере один из указанного В-Ь- связан с гидроксильной функциональной группой на указанном рифамицине А, и где каждый из указанного В-Ь-, связанный с гидроксильной функциональной группой, независимо выбран из группы, состоящей из к, к.

- 96 016059 где В представляет собой указанную фосфонированную группу;

каждый р независимо равен 0 или целому числу <10;

каждый К.|. независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила;

с.| имеет значение 2 или 3;

п равен целому числу <10;

г имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5;

и ^2, каждый, являются целыми числами >0, такими, что их сумма (^₁+^₂) равна 1, 2 или 3.
2. Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль где В представляет собой фосфонированную группу, выбранную из группы, состоящей из где каждый К* независимо выбран из группы, состоящей из Н, (С1-С₆)алкила, (С₆-С1₄)арила и гетероарила, представляющего собой 4-9-членные кольца, содержащие 1-3 гетероатома, выбранные из атомов Ν, О или 8, при условии, что по крайней мере два К* представляют собой Н;

Х представляет собой Н, ОН, ΝΉ₂ или галогеновую группу;

каждый Х₁ независимо выбран из группы, состоящей из Н, ОН, ΝΗ₂, и галогеновой группы;

Ь представляет собой расщепляемый линкер для связывания В с А;

т имеет значение 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7;

А представляет собой рифамицин, по крайней мере один из указанного В-Ь- связан с атомом азота на указанном рифамицине А, и где каждый из указанного В-Ь-, связанный с атомом азота, независимо выбран из группы, состоящей из

- 97 016059 где В представляет собой указанную фосфонированную группу;

η равен целому числу <10;

каждый р независимо равен 0 или целому числу <10;

каждый Я_ъ независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила;

с.| имеет значение 2 или 3;

X представляет собой О, -СОХЯ_Ь-, -СО-О-СН₂- или -СО-О-;

Я_а представляет собой СхН_у, где х является целым числом от 0 до 20 и у является целым числом от 1 до 2х+1.
3. Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль в---I^-]—А

I 1т ф где В представляет собой фосфонированную группу, выбранную из группы, состоящей из где каждый Я* независимо выбран из группы, состоящей из Н, (С1-С₆)алкила, (С₆-С1₄)арила и гетероарила, представляющего собой 4-9-членные кольца, содержащие 1-3 гетероатома, выбранные из атомов Ν, О или 8, при условии, что по крайней мере два Я* представляют собой Н;

X представляет собой Н, ОН, ΝΗ₂ или галогеновую группу;

каждый X! независимо выбран из группы, состоящей из Н, ОН, ΝΗ₂, и галогеновой группы;

Ь представляет собой расщепляемый линкер для связывания В с А;

т имеет значение 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7;

А представляет собой рифамицин, по крайней мере один из указанного В-Ь- связан с гидроксильной функциональной группой на указанном рифамицине А, и по крайней мере один из указанного В-Ь- связан с атомом азота на указанном рифамицине А, где каждый из указанного В-Ь-, связанный с гидроксильной функциональной группой, независимо выбран из группы, состоящей из

- 98 016059 «I Κι где В представляет собой указанную фосфонированную группу;

каждый р независимо равен 0 или целому числу <10; каждый Я. независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила; с.| имеет значение 2 или 3;

η равен целому числу <10;

г имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5;

и ^2, каждый, являются целыми числами >0, такими, что их сумма (^₁+^₂) равна 1, 2 или 3, где каждый из указанного Β-Ь-, связанный с атомом азота, независимо выбран из группы, состоящей из

- 99 016059 где В представляет собой указанную фосфонированную группу;

η равен целому числу <10;

каждый р независимо равен 0 или целому числу <10;

каждый К, независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила;

с.| имеет значение 2 или 3;

X представляет собой О, <.ΌΝΚ|.-. -СО-О-СН₂- или -СО-О-;

Я_а представляет собой СхН_у, где х является целым числом от 0 до 20 и у является целым числом от 1 до 2х+1.
4. Соединение по пп.1, 2 или 3, где указанный рифамицин А имеет структуру, представленную следующей формулой А1:

А1 где X представляет собой Н- или К^СО-, где Κι представляет собой замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-6 атомов углерода;

каждый Υ независимо выбран из группы, состоящей из Н- и КО-, где Я представляет собой Н-, К₁или Я₁СО-, с К₁, определенным выше;

* выбран из группы, состоящей из соединений формул А2-А10

- 100 016059

А2

АЗ

А9 где Я2 представляет собой Н-, замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-10 атомов углерода, или диалкиламиногруппу;

Я3 представляет собой Н- или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-7 атомов углерода;

Я4 представляет собой гидроксильную группу, сульфогидрильную группу или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-3 атомов углерода;

представляет собой кислород или -ΝΚ₂ с Я₂, определенным выше;

\ν₂ представляет собой замещенный или незамещенный метилен, включая где Я₅ и Яб независимо представляют собой Н- или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-5 атомов углерода, и Ζ' представляет собой атом кислорода, атом серы, замещенный метилен, карбонил, ΝΕ₁ или -^О)Я_Ь где Я! определен выше;

Т представляет собой галоген или Я2, где Я2 определен выше;

Ζ представляет собой О, 8 или ΝΚ₃, где Я₃ определен выше.
5. Соединение по п.4, где Я₂ представляет собой диалкиламиногруппу, выбранную из группы, состоящей из замещенного пиперидина, замещенного морфолина или замещенного пиперазина.
6. Соединение по пп.1, 2 или 3, где указанный рифамицин А имеет структуру, представленную следующей формулой:

Мео,..

ΌΗ.
7. Соединение по пп.1, 2 или 3, где указанный рифамицин А имеет структуру, представленную следующей формулой:

ОН.
8. Соединение по пп.1, 2 или 3, где указанный рифамицин А имеет структуру, представленную следующей формулой:

- 101 016059 но .
9. Соединение по пп.1, 2 или 3, где указанный рифамицин А имеет структуру, представленную следующей формулой:
10. Соединение по пп.1, 2 или 3, где указанный рифамицин А имеет структуру, представленную следующей формулой:
11. Соединение по пп.1, 2 или 3, где указанный рифамицин А представляет собой рифампицин или его хиноновую форму.
12. Соединение по пп.1, 2 или 3, где указанный рифамицин А представляет собой рифапентин или его хиноновую форму.
13. Соединение по пп.1, 2 или 3, где указанный рифамицин А представляет собой рифабутин.
14. Соединение по пп.1, 2 или 3, где указанный рифамицин А представляет собой рифалазил.
15. Соединение по пп.1, 2 или 3, где указанный рифамицин А представляет собой рифаксимин.
16. Соединение по пп.1, 2 или 3, где указанный рифамицин А представляет собой рифандин.
17. Соединение, которое имеет формулу, выбранную из группы, состоящей из

- 102 016059

- 103 016059
18. Соединение формулы (II) или его фармацевтически приемлемая соль где 0₁ представляет собой Н-, Я₁СО- или Ь₁-, где Я₁ представляет собой замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-6 атомов углерода;

каждый 0₂ независимо выбран из группы, состоящей из Н-, ЯО- и Ь₂О-, где Я представляет собой Н-, Я₁- или Я₁СО-, с Я₁, определенным выше;

каждый Оз независимо выбран из группы, состоящей из Н- и Ь₃-;

⁴ выбран из группы, состоящей из соединений формул А2-А10

А10 где Я2 представляет собой Н-, замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-10 атомов углерода, или диалкиламиногруппу, где, когда Я2 представляет собой замещенную алкильную цепь из 1-10 атомов углерода, заместитель является одним из членов, выбранных из группы, состоящей из Ь₄О-, Ь₅8- и Ε₆ΝΚ₇-, где Я₇ представляет собой замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-7 атомов углерода;

Я₃ представляет собой Н-, замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-7 атомов углерода, или Б--;

Я4 представляет собой гидроксильную группу, сульфогидрильную группу или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-3 атомов углерода, Ь₈О- или Е₉.8-;

представляет собой кислород или -ΝΚ₂, с Я₂, определенным выше;

\ν₂ представляет собой замещенный или незамещенный метилен, включая , где Я₅ и Я независимо представляют собой Н- или замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-5 атомов углерода, и Ζ' представляет собой атом кислорода, атом серы, замещенный метилен, карбонил, -ΝΚ₁ или -М(О)Я₁, где Я₁ определен выше;

Т представляет собой галоген или Я2, где Я2 определен выше;

Ζ представляет собой О, 8 или ΝΚ₃, где Я₃ определен выше;

каждый Ь₂, Ь₃, Ь₄, Ь₅, Ь₈ и Ь₉ представляет собой расщепляемый линкер, независимо выбранный из группы, состоящей из

- 104 016059 где п равно целому числу <10;

каждый р независимо равен 0 или целому числу <10;

с.| имеет значение 2 или 3;

г имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5;

и \\₂ являются целыми числами >0, такими, что их сумма (^₁+^₂) равна 1, 2 или 3;

каждый К.|, независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила;

каждый Ь₆ и Ь₇ представляет собой расщепляемый линкер, независимо выбранный из группы, состоящей из

- 105 016059 где и равен целому числу <10;

каждый р независимо равен 0 или целому числу <10;

с.| имеет значение 2 или 3;

каждый К.|. независимо выбран из группы, состоящей из Н, этила и метила;

К_а представляет собой СхН_у, где х является целым числом от 0 до 20 и у является целым числом от 1 до 2х+1;

Х представляет собой О, -СОNК_^-, -СО-О-СН₂- или -СО-О-;

В представляет собой фосфонированную группу, выбранную из группы, состоящей из где каждый К* независимо выбран из группы, состоящей из Н, (С1-С₆)алкила, (С₆-С1₄)арила и гетероарила, представляющего собой 4-9-членные кольца, содержащие 1-3 гетероатома, выбранные из атомов Ν, О или 8, при условии, что по крайней мере два К* представляют собой Н;

Х представляет собой Н, ОН, ΝΉ₂ или галогеновую группу;

каждый Х₁ независимо выбран из группы, состоящей из Н, ОН, ΝΗ₂, и галогеновой группы;

при условии, что, по крайней мере, присутствует один из Ь_ь Ь₂, Ь₃, Ь₄, Ь₅, Ь₆, Ь₇, Ь₈ и Ь₉.
19. Соединение по п.18, где К₂ представляет собой диалкиламиногруппу, выбранную из группы, состоящей из замещенного пиперидина, замещенного морфолина или замещенного пиперазина, и где заместитель является одним из членов, выбранных из группы, состоящей из Ь₄О-, Ь₅8- и Ε₆ΝΚ₇-, где К₇представляет собой замещенную или незамещенную алкильную цепь, состоящую из 1-7 атомов углерода.
20. Соединение формулы

- 106 016059 или его фармацевтически приемлемая соль.
21. Соединение формулы или его фармацевтически приемлемая соль.
22. Соединение формулы или его фармацевтически приемлемая соль.
23. Соединение формулы

- 107 016059 (НО)_гР^₀ о
25. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-3 и 17-24 и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
26. Способ лечения бактериальной инфекции в кости и суставе у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества фармацевтической композиции по п.25.
27. Способ профилактики бактериальной инфекции у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в такой профилактике, профилактически эффективного количества фармацевтической композиции по п.25.
28. Способ по п.27, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию вводят субъекту до, в течение или после инвазивного медицинского лечения.
29. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанный субъект является человеком.
30. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанный субъект является человеком.
31. Способ по п.26, дополнительно включающий введение антибиотика одновременно с введением указанной фармацевтической композиции.
32. Способ по п.31, где указанный антибиотик выбран из группы, состоящей из тетрациклина, антибактериального агента, представляющего собой тетрациклиновое производное, глицилциклина, антибактериального агента, представляющего собой глицилциклиновое производное, миноциклина, антибактериального агента, представляющего собой миноциклиновое производное, оксазолидинонового антибактериального агента, аминогликозидного антибактериального агента, хинолонового антибактериального агента, ванкомицина, антибактериального агента, представляющего собой ванкомициновое производное, теикопланина, антибактериального агента, представляющего собой теикопланиновое производное, эремомицина, антибактериального агента, представляющего собой эремомициновое производное, хлорэремомицина, антибактериального агента, представляющего собой хлорэремомициновое производное, даптомицина и антибактериального агента, представляющего собой даптомициновое производное.
33. Способ накопления рифамицина в кости субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции по п.25.