EA010926B1

EA010926B1 - Средство для лечения туберкулеза глаз, способ его получения и применения

Info

Publication number: EA010926B1
Application number: EA200600714A
Authority: EA
Inventors: Леонид Андреевич Кожемякин; Ольга Сергеевна Кетлинская; Валентина Михайловна Хокканен; Ольга Геннадьевна Ионова
Original assignee: Леонид Андреевич Кожемякин
Priority date: 2006-01-20
Filing date: 2006-01-20
Publication date: 2008-12-30
Also published as: WO2007082547A1; EA200600714A1

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано в комплексном лечении активных туберкулезных хориоретинитов, а также других заболеваний заднего отдела глаза, которые сопровождаются изменениями пигментного эпителия. Предложена стабильная форма бис-(γ-L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицината натрия с сохраняемой дисульфидной связью и способ ее получения, а также новый способ лечения заболеваний заднего отдела глаза, которые сопровождаются нарушением пигментного эпителия, в том числе активных туберкулезных хориоретинитов. Предложен способ получения стабильной формы бис-(γ-L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицината натрия. Способ лечения заболеваний заднего отдела глаза, которые сопровождаются нарушением пигментного эпителия, в том числе активных туберкулезных хориоретинитов, характеризующийся тем, что стабильную форму бис-(γ-L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицината натрия применяют в монорежиме и/или в составе базовой специфической антибактериальной и противотуберкулезной химиотерапии в виде парабульбарных, и/или подкожных, и/или внутримышечных инъекций ежедневно до получения терапевтического эффекта, но не менее 14 дней.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано в монотерапии и в комплексном лечении активных туберкулезных хориоретинитов, а также других заболеваний заднего отдела глаза, которые сопровождаются изменениями пигментного эпителия.

В последние годы отмечается увеличение числа больных с хориоретинитами различной этиологии, при этом отмечается значительный рост вирусных и цитомегаловирусных хориоретинитов, в меньшей степени - бактериальных, токсоплазменных, бруцеллезных, при системных заболеваниях, а также при ВИЧ-инфекции, сифилисе, туберкулезе, различных микст-форм (хориоретиниты смешанной этиологии, например туберкулезный с вирусом простого герпеса и пр.).

Довольно часто клиническое течение хориоретинитов различной этиологии отличается длительным и тяжелым воспалительным процессом, сопровождается такими серьезными осложнениями, как помутнения и кровоизлияния в стекловидное тело, преретинальные кровоизлияния и геморрагии сетчатки, формирование субретинальных неоваскулярных мембран, витреоретинальных шварт. Эти осложнения приводят к снижению зрения, вплоть до слабовидения и слепоты, и стойкой утрате трудоспособности.

Сложность патогенеза специфического процесса хориоретинитов туберкулезной этиологии, недостаточная эффективность этиотропной терапии, рост лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза (МБТ) к основным противотуберкулезным препаратам, стремление максимально сократить сроки лечения, а также избежать осложнений и улучшить качество жизни больных туберкулезом диктует необходимость дальнейшего совершенствования патогенетического направления как во фтизиатрии, так и фтизиоофтальмологии [Беллендир Э.Н., 1986, 2000].

В последние годы параспецифический компонент воспаления зачастую преобладает в картине заболевания. При этом клетки, находящиеся в непосредственной близости к гранулеме, не пораженные МБТ, гибнут вследствие гипоксии, а также токсического влияния противотуберкулезных препаратов.

Проблема эффективного лечения острых хориоретинитов различной этиологии и их осложнений не раз поднималась в отечественной и зарубежной литературе [Александров Е.И. и др., 1995, Полунин Г.С., 2002, Тарасова Л.Н., 2001, Устинова Е.И., 2002, Хокканен В.М. и др., 1998, 1999, 2002, Е. Вакка11 М., 2001, Шийага М., 1998, ХУаПссЬ 8., 2001], где обсуждается эффективность различных методов лечения, однако, все они, в основном, сводятся к своевременному применению антибактериальных средств и кортикостероидов для подавления острого воспалительного процесса, а также лечения всевозможных последствий в неактивной стадии. Однако даже при своевременно начатом лечении площадь поражения остается значительной (в основном за счет зоны перифокальной дистрофии и отслоения пигментного и нейроэпителия сетчатки).

Воспалительные изменения в хориоидее и сетчатке, ишемия сетчатки вследствие сосудистого стаза при хроническом воспалении приводят к нарушению нормального соединения пигментного эпителия с мембраной Бруха. При этом стимулируется выброс вазопролиферативного фактора, что приводит к прорастанию новообразованных сосудов через дефекты мембраны Бруха под пигментный эпителий. В результате хориоидальной экссудации формируется отслойка пигментного эпителия. Нарушение барьерной функции пигментного эпителия ведет к возникновению отслоения нейроэпителия сетчатки [Кацнельсон Л.Ф., 1990]. Развитие субретинальной неоваскулярной мембраны сопровождается ретинальными геморрагиями. Длительно существующее отслоение пигментного эпителия заканчивается формированием фиброваскулярного рубца, что значительно утяжеляет течение заболевания и приводит к значительному снижению зрения [Хокканен В.М., 1998, 2002].

Ситуация усугубляется токсичностью корд-фактора микобактерий туберкулеза, который ингибирует дыхание в митохондриях и разобщает окислительное фосфорилирование [Александрова А.Е., 1998]. Имеются данные о неблагоприятном влиянии на биоэнергетический обмен таких противотуберкулезных препаратов, как изониазид, рифампицин, пиразинамид, стрептомицин. Нарушение микроциркуляции введет к тому, что страдает свертывающая система крови. В литературе имеются данные о развитии при туберкулезе гиперкоагуляции и усилении фибринолиза. В результате рыхлые сгустки крови, агрегаты фибрина и тромбоцитов закупоривают мелкие сосуды, что ведет к усугублению гипоксии и ацидозу в тканях [Приймак А.А., 1995].

Не последняя роль в этом процессе принадлежит индукции апоптоза, а точнее преобладанию клеточной гибели над митозом клеток. При этом клетки сетчатой оболочки, не пораженные микобактериями туберкулеза, начинают гибнуть вследствие гипоксии, токсичности химиопрепаратов, а также токсинов, вырабатываемых МБТ.

В офтальмологической практике используется ограниченное количество средств, способных защитить ткани сетчатой оболочки от воздействия экзогенных и эндогенных факторов. Для местного использования разрешены к применению такие препараты, как тауфона 4% раствор и эмоксипина 1% раствор. Однако, учитывая их узкую направленность (препараты применяются при хориоретинальных дистрофиях различного генеза), существует необходимость поиска эффективных средств защиты клеток (тканей) от экзогенных и эндогенных факторов, т.е. препаратов сопровождения антибактериальной и противотуберкулезной терапии.

Сетчатка - интенсивно аэрируемая и кровоснабжаемая ткань, что создает дополнительные предпосылки активации ПОЛ (А.Шведова, 1986, Р. Во5с11-Могс11 с1 а1., 1996). Нарушение баланса между окис

- 1 010926 лительными и антиоксидантными системами приводит к окислительному повреждению белков, нуклеиновых кислот, но прежде всего липидов биологических мембран, которые чрезвычайно легко вовлекаются в цепные свободнорадикальные реакции. Окислительный стресс рассматривается как универсальное звено гибели клеток, которое имеет место при некрозе, апоптозе, токсических повреждениях клетки (М. Ва1И8, 1. Р. 8йает, 2000). В связи с этим актуальным остается поиск средств, обладающих антиоксидантной активностью и цитопротекторным действием.

Чаще всего причинами хориоретинитов являются туберкулез, сифилис, токсоплазмоз, общие инфекционные заболевания (грипп, пневмония, бруцеллез, цереброспинальный менингит), фокальные инфекции, травма глаза, осложненная близорукость.

Местное лечение заключается в подконъюнктивальных, пара- или ретробульбарных инъекциях кортикостероидов и антибиотиков широкого спектра действия в виде ежедневных инъекций дексазона или 0,5-1% эмульсии гидрокортизона с канамицином (мономицином, линкомицином, гентамицином). Применяют физиотерапевтическое лечение: электрофорез с папаином для рассасывания помутнений в стекловидном теле, с 2% раствором кальция хлорида, с антибиотиками, магнитотерапию для ускорения рассасывания продуктов воспаления.

Общее лечение включает противоаллергическую, противовоспалительную и специфическую терапию. При выявлении туберкулезной или прочей этиологии хориоретинита к лечению добавляют специфическую терапию.

В случае острого гнойного хориоидита показано парентеральное применение антибиотиков широкого спектра действия. При недостаточном эффекте антибиотики можно назначить внутрь. Целесообразно сочетание антибиотиков с сульфаниламидами.

Для лечения последствий хориоидитов применяют биогенные стимуляторы: экстракт алоэ жидкий, ФиБС, стекловидное тело в виде подкожных инъекций.

а) Лечение хориоретинитов туберкулезной этиологии.

До последнего времени пациентам с впервые выявленным туберкулезом глаз традиционно назначался длительный основной курс этиотропной химиотерапии (до 9-12 месяцев). Тем не менее отмечалось немало рецидивов. В последние годы во фтизиатрии научно обоснован переход к сокращению сроков лечения при его интенсификации. Проведенный нами ретроспективный анализ эффективности специфического лечения больных туберкулезом глаз подтвердил возможность клинического излечения за более короткие сроки, хотя, судя по результатам туберкулиновых проб, далеко не у всех больных. По всей вероятности, одновременно необходима интенсификация лечения в связи с появлением резистентных форм микобактерий.

Исходя из этих представлений и учитывая опыт отечественных фтизиатров и рекомендации ВОЗ, предлагаются альтернативные схемы системного и местного этиотропного лечения для впервые выявленных больных туберкулезом глаз (Устинова Е.И., 2001).

Форма заболевания	Этап лечения
начальная фаза	фаза продолжения
Наиболее тяжелые формы (с экссудативным типом реакции): диффузно-очаговый хориоретннит, генерализованный увеит, диссеминированный хориоретинит и др.	2.ИРПС	4 ИР (4.ИП)
Остальные, менее тяжелые формы тубер-	2.ИРП	4.И₃Р₃
кулеза глаз		4.И₃П₃
		4.М₃П₃

Примечание. В аббревиатурах: И - Изониазид (Тубазид), Р - Рифампицин (Рифадин), П - Пиразинамид, С - Стрептомицин, М - Метазид. Цифра перед обозначениями препаратов указывает на продолжительность этой фазы в месяцах. Цифра внизу после буквы указывает, сколько раз в течение недели следует принимать препарат.

В соответствии с тяжестью клинических проявлений выделяют 2 лечебные категории больных. В начальной фазе лечения (2 месяца) больным с тяжелыми формами туберкулеза глаз назначается по 4 химиопрепарата, остальным больным (со средними по тяжести формами заболевания) - по 3 химиопрепарата. В фазе продолжения лечения (4 месяца) больным обеих категорий рекомендуется назначать по 2 химиопрепарата ежедневно или 3 раза в неделю. Параллельно с системным лечением должна проводиться местная этиотропная химиотерапия.

Однако использование только туберкулостатиков, обладающих токсическим действием на структуры глазного яблока, а также учитывая токсичность микобактерий туберкулеза, состояние гипоксии не пораженных МБТ клеток (Александрова А.Е., Антоненкова Е.В., 1998), может привести к таким осложнениям, как отслоение пигментного и нейроэпителия и вторичная дистрофия сетчатки.

- 2 010926

Медикаментозное лечение хориоретинальных дистрофий и других осложнений хориоретинитов туберкулезной этиологии включает в себя антиоксиданты (эмоксипин, токоферол, гистохром, парааминобензойная кислота и др.); биостимуляторы (тауфон, солкосерил, анаболические стероиды); ангиопротекторы и сосудорасширяющие средства (трентал, продектин, кавинтон, дицинон и др.); противосклеротические, ноотропные препараты (мисклерон, пикамилон) [Устинова Е.И., 2002]. Однако вышеизложенные препараты применяются в стадии затихания или в неактивной фазе заболевания как симптоматические средства при уже сформировавшихся осложнениях.

Значимость иммунитета при туберкулезе может быть проиллюстрирована следующими фактами. При локальном первичном инфицировании в течение первой недели 50% макрофагов содержит микобактерий туберкулеза, при повторном инфицировании большинство бактерий быстро разрушается, микобактерий туберкулеза содержит только 3% макрофагов. Этот возбудитель - факультативный внутриклеточный паразит и в организме преимущественно находится в фагосомах макрофагов. Это обусловлено еще и тем, что микобактерий туберкулеза синтезируют фермент, ингибирующий слияние фагосомы с лизосомами. Доминирующие иммунокомпетентные клетки при туберкулезе - Т-лимфоциты, а наиболее распространенный механизм проявления иммунодефицита - нарушение межклональных взаимосвязей за счет расстройств Т-регуляторных влияний и дееспособности цитокинового звена. Т-клетки, пролиферирующие в ответ на специфические антигены микобактерии, секретируют лимфокины, активирующие макрофаги к выполнению защитных функций.

Одним из характерных поражений пигментного эпителия являются дистрофии сетчатки.

б) Лечение дистрофий сетчатки.

Современные подходы к медикаментозному лечению дистрофий сетчатки направлены на улучшение микроциркуляции и обменных процессов в сетчатке и хориоидее.

Широкое применение в лечении нашли антикоагулянты прямого и непрямого действия, фибринолитические, сосудорасширяющие, антисклеротические средства, ферменты, коферменты, витамины, ангиопротекторы, гормоны, анаболические стероиды и др. (К. Трутнева, 1976; Л. Мошетова, 1977; Г. Смолякова, 1988). Ряд авторов отмечает положительный эффект от применения антикоагулянтов, в частности гепарина (Л. Мошетова, 1977). Однако лечение антикоагулянтами в пожилом возрасте следует проводить с большой осторожностью из-за опасности геморрагических осложнений. При наличии язвенной болезни, геморроя с кровотечением, заболеваний печени, почек, гипертонической болезни применение антикоагулянтов не рекомендуется.

При назначении спазмолитических, сосудорасширяющих, гипотензивных средств следует соблюдать осторожность и учитывать уровень не только артериального давления, но и мочевины в крови, так как при нефросклерозе, сморщенной почке средства, понижающие артериальное давление, могут способствовать гиперазотемии. При этом в связи с ухудшением функции почек усиливается также кумулирование различных медикаментозных средств, даже таких, которым это не свойственно. В пожилом и старческом возрасте значительное понижение артериального давления может вызвать тромбоз вен сетчатки. В силу указанных причин при назначении гипотензивных средств лицам пожилого и старческого возраста необходим строго индивидуальный подход.

Предложено также применять половые гормоны (связанные эстрогены), которые предупреждают возможность возникновения кровоизлияний при заболеваниях, сопровождающихся повышенной проницаемостью сосудов. Половые гормоны пожилым и старым людям следует применять с большой осторожностью, так как у старческого организма возможна повышенная чувствительность к ним.

В лечении дистрофических заболеваний сетчатки широко применяется тканевая терапия - алоэ, ФИБС, стекловидное тело, взвесь плаценты, плацентарная кровь, взвесь эмбриональной ткани. Г. Смолякова (1988), учитывая, что одним из этиологических моментов в развитии ЦИХРД может быть нарушение нейрогуморальных процессов, считает целесообразным применение препаратов, влияющих на эти процессы, - фосфадена, этимизола, пиридоксина, а также антикининовых препаратов.

А. Днепровская и С. Харинцева (1988) опубликовали первую работу о возможностях применения ретиналамина - лиофилизированного порошка для инъекций, представляющего собой комплекс полипептидных фракций, выделенных из сетчатки глаза крупного рогатого скота и свиней. Ретиналамин влияет на состояние системы гемокоагуляции и обладает иммуномодулирующим действием.

Существует еще множество препаратов, которые применяются для лечения и профилактики дистрофических заболеваний сетчатки, однако, стойкого улучшения зрения, как правило, получить не удается. Большинство авторов признают, что консервативная терапия эффективна лишь на ранних стадиях процесса и результаты ее нестабильны.

Широкое применение для коррекции процессов перекисного окисления липидов получили антиоксиданты (токоферол).

Таким образом, арсенал препаратов для лечения заболеваний заднего отдела глазного яблока, сопровождающихся нарушением пигментного эпителия, в настоящее время достаточно разнообразен.

Тем не менее следует подчеркнуть, что практически отсутствуют средства, позволяющие восстанавливать базисные нарушения в системе взаимоотношений иммунологических и нейротрофических процессов,

- 3 010926 улучшать метаболизм клеток, оказывать цитопротекторный эффект, корригировать систему местного иммунитета.

Задачей данного изобретения является получение средства для этиопатогенетической терапии заболеваний заднего отдела глазного яблока различной этиологии, обладающего антибактериальной и противовирусной активностью на основе иммунокорригирующих механизмов, в том числе вследствие синтеза эндогенных (собственных) интерферонов; одновременно обладающего выраженным цитопротекторным действием, за счет активации метаболизма клеток, в том числе иммунокомпетентных; разработка способа лечения заболеваний заднего отдела глаза, которые сопровождаются нарушением пигментного этителия, в том числе активных туберкулезных хориоретинотов.

Техническим результатом заявленного изобретения является энергизованная стабильная форма бис(у-Ь-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицината натрия с сохраняемой дисульфидной связью и способ ее получения, а также разработка нового способа лечения заболеваний заднего отдела глазного яблока различной этиологии.

Интегративным результатом биолого-фармакологических эффектов заявляемого в изобретении средства как препарата для лечения заболеваний заднего отдела глазного яблока, сопровождающихся нарушением пигментного эпителия, является его способность регулировать соотношение гуморального и клеточного иммунитета, а также метаболические процессы, лежащие в основе пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток.

Для решения этой задачи предложена группа изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом, а именно энергизованная стабильная форма бис-(у-Ь-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицината натрия с сохраняемой дисульфидной связью в качестве средства для лечения заболеваний заднего отдела глаза, которые сопровождаются нарушением пигментного эпителия, в том числе формированием активных туберкулезных хориоретинитов;

способ получения энергизованной формы бис-(у-Ь-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицината натрия, включающий окисление исходного соединения - восстановленного глутатиона (у-Ь-глутамил-Ьцистеинилглицина) пероксид карбонатом натрия в присутствии фермента каталазы путем перемешивания водного раствора исходного вещества и указанных реагентов в течение 30 мин при температуре 2030°С и рН 8-9; выделение свободного гексапептида бис-(у-Ь-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицина; перевод окисленной формы гексапептида (дисульфидглутатиона) в натриевую соль посредством обработки его водного раствора 4Ν раствором ΝαΟΗ; фильтрацию полученного раствора; стабилизацию дисульфидной связи гексапептида путем облучения раствора ультрафиолетовыми лучами; выделение конечного продукта методом лиофильной сушки;

способ лечения заболеваний заднего отдела глаза, которые сопровождаются нарушением пигментного эпителия, в том числе развитием активных туберкулезных хориоретинитов, характеризующийся тем, что бис-(у-Ь-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицинат натрия применяют в монорежиме и/или в составе базовой специфической антибактериальной и противотуберкулезной химиотерапии в виде парабульбарных, и/или подкожных, и/или внутримышечных инъекций ежедневно 1-2 раза в день по 0,5 мл 1-3% раствора до получения терапевтического эффекта, но не менее чем в количестве 15 процедур, курс лечения продолжают до исчезновения симптомов заболевания, но не менее 14 дней.

В настоящем изобретении используется следующая, принятая в этой области, терминология.

Метаболизм - совокупность всех биохимических реакций, происходящих в клетках живых организмов.

Апоптоз - подразумевает морфологически распознаваемую форму генетически программированной клеточной гибели. Механизмом апоптоза стареющие клетки удаляются из организма, индуцируется гибель клеток во время эмбриогенеза, а также «отработавших» активированных иммунных клеток. В классическом определении, таким образом, апоптоз определяется как физиологическое самоубийство клеток.

Цитокины - регуляторные вещества белковой природы, продуцируемые иммунокомпетентными клетками. Динамика и содержание цитокинов определяют характер и особенности течения различных, в том числе и инфекционных и аллергических, заболеваний глаза.

Хориоретиниты - воспалительные заболевания сосудистой оболочки глаза и сетчатки.

Геморрагии - кровоизлияния.

Ретинальные (от лат. тейпа - сетчатка) - относящиеся к внутренней оболочке глаза.

Макула - центральная зона сетчатки.

НАДФ-Н-зависимая редуктазная система - ферментативная система, которая обеспечивает превращение дисульфидглутатиона в восстановленный глутатион вследствие разрыва дисульфидной связи.

Каталаза - фермент, который расщепляет перекись водорода с выделением молекулярного кислорода.

ЭФИ - электрофизиологическое исследование.

ЭРГ - электроретинография (от электро-, лат. тейпа - сетчатая оболочка глаза и -графия), метод ис

- 4 010926 следования функции органа зрения посредством регистрации биоэлектрических потенциалов сетчатки, образующихся в результате воздействия света на глаз. Графическая запись биоэлектрических потенциалов называется электроретинограммой (ЭРГ).

А-волна и В-волна - показатели ЭРГ.

СТ - стекловидное тепло.

Опацитаты - воспалительные клеточные элементы.

Известны средство дисульфидглутатион [Краткая химическая энциклопедия, М., «Советская энциклопедия», т. 1, 1961, с. 979-980] и способ лечения различных форм туберкулеза легких [патент КП № 2197984, А 61К 38/08, А 61Р 31/06], в котором раскрыта концептуальная модель использования препаратов на основе дисульфидглутатиона для лечения лекарственно-резистентного туберкулеза. Однако средство, указанное в патенте, оказалось не оптимальным с точки зрения сохранности дисульфидной связи и, следовательно, химической стабильности лекарственного препарата, полученного на основе бис(у-Ь-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицината натрия (дисульфидглутатиона).

В качестве предпочтительного воплощения заявляемого изобретения, обеспечивающего новый уровень терапии заболеваний заднего отдела глазного яблока, сопровождающихся нарушением пигментного эпителия, предлагается средство - энергизованная стабильная форма бис-(у-Ь-глутамил)-Ь-цистинил-бисглицината натрия с сохраняемой дисульфидной связью, что обеспечивает биофизическую и биохимическую стабильность данного вещества и, следовательно, его фармацевтическую активность в биологических средах.

Разработан способ получения энергизованной формы бис-(у-Ь-глутамил)-Ь-цистинил-бисглицината натрия, обеспечивающий стабильность формулы дисульфидглутатиона и его новые биологофармакологические эффекты на основе высокой биохимической реакционной способности и тропности к клеткам пигментного эпителия.

Согласно изобретению авторы впервые показали и обосновали в клинической практике, что применение энергизированного аналога дисульфид-глутатиона в терапии больных заболеваниями заднего отдела глаза с поражением пигментного эпителия в монорежиме и сочетании с традиционной терапией позволяет достичь высокого терапевтического эффекта.

Способ получения энергизованной формы бис-(у-Ь-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицината натрия включает окисление исходного соединения - восстановленного глутатиона (у-Ь-глутамил-Ь-цистеинилглицина) - пероксид карбонатом натрия в присутствии фермента каталазы путем перемешивания водного раствора исходного вещества и указанных реагентов в течение 30 мин при температуре 20-30°С и рН 8-9;

выделение свободного гексапептида бис-(у-Ь-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицина

Н-у-Ь-О1и-Ь-Су5-<31у-ОН Н-у-Ь-01и-Ь-Су8-01у-ОН перевод окисленной формы гексапептида (дисульфидглутатиона) в натриевую соль посредством обработки его водного раствора 4Ν раствором ΝαΟΗ;

фильтрацию полученного после окисления раствора;

стабилизацию дисульфидной связи гексапептида путем облучения реакционного раствора с помощью аппарата для ультрафиолетового облучения;

выделение конечного продукта методом лиофильной сушки.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Пример 1.

Восстановленный глутатион (С8Н) в количестве 1,22 г (8 ммоль) суспендируют в 5 мл дистиллированной воды и при перемешивании добавляют 1 мл (8 ммоль) 4Ν раствора ΝαΟΗ. Полученный прозрачный раствор охлаждают до температуры 18-19°С и далее в реакционную смесь прибавляют 2,8 мл 3% раствора пероксид карбоната натрия (аддитивное соединение перекиси водорода и №₂СО₃). Пероксид карбоната натрия добавляют небольшими порциями в течение 3 мин с такой скоростью, чтобы температура реакционной смеси не превышала 23 °С. Через 3-5 мин после внесения пероксида карбоната натрия в реакционную смесь добавляют 100 мкг фермента каталазы. Через 30 мин после добавления всех реагентов в реакционный раствор помещают электрод потенциометра и определяют рН раствора. Если рН менее 8,5, по каплям добавляют 4Ν раствор №1ОН до рН 8-9.

Контроль полноты прохождения реакции окисления осуществляют методом ВЭЖХ. Если по данным ВЭЖХ после стандартного интегрирования хроматограммы содержание окисленной формы глутатиона составляет менее 97%, перемешивание продолжают еще 30 мин и контроль методом ВЭЖХ повторяют. Если результат равен или превышает 97%, реакцию считают законченной и фильтруют полученный раствор под вакуумом.

После фильтрации раствор подвергают ультрафиолетовому облучению (УФО) на аппарате типа «Изольда» при следующем режиме: мощность источника излучения - 8 Вт; длина волны - 254 нм; скорость прокачки реакционного раствора, мл/мин - 10/20.

Далее проводится лиофильная сушка водного раствора препарата согласно инструкции по исполь

- 5 010926 зованию установки для лиофильной сушки.

Преимущество разработанного оригинального способа получения окисленного глутатиона с сохраняемой энергизованной дисульфидной связью заключается в использовании катализатора фермента каталазы и пероксида натрия. Каталаза - уникальный фермент, расщепляющий перекись водорода (Н₂О₂) с выделением молекулярного кислорода, окисляющего восстановленный глутатион благодаря карбонату натрия в щелочной среде. Проведенные исследования показали, что образование окисленного глутатиона (С88С) необходимо проводить при рН 8-9; в нейтральной и кислой областях выход С88С резко снижается. Последующее облучение раствора окисленного глутатиона ультрафиолетом обеспечивает образование новых водородных связей между атомом водорода молекулы ΝΗ₂ и атомами кислорода в молекуле окисленного глутатиона (дисульфидглутатиона). Наряду с этим УФО обеспечивает новую биофизику молекулы дисульфидглутатиона в связи с появлением источников лабильных π-электронов и формированием донорно-акцепторных свойств в рамках одной молекулы.

Данные биофизические эффекты обусловливают новую биохимию дисульфидглутатиона, а именно устойчивость молекул дисульфидглутатиона к воздействию фермента, присутствующего в крови и клетках животных организмов, НАДФ-Н⁺-зависимой глутатион-редуктазе, восстанавливающий окисленный глутатион до восстановленного (С8Н).

Таким образом, предложен новый способ получения фармацевтически активного вещества - энергизованной формы бис-(у-Ь-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицината натрия, отличающийся от уже известных способов более высоким выходом целевого продукта, степенью чистоты, стабильностью получаемой формы и удобством применения в процессе масштабирования.

На основе этой стабильной базовой субстанции может быть получен ряд стабильных готовых лекарственных форм с длительными сроками хранения - не менее 3 лет.

На основании доклинических исследований установлено, что заявляемое средство обладает уникальными биолого-фармакологическими эффектами, обеспечивая иммунорегулирующее действие, в том числе активацию противоинфекционного иммунитета, нормализацию метаболических процессов в клетках глаза наряду с наработкой противовоспалительных цитокинов.

Названные биолого-фармакологические эффекты в основном обусловлены механизмами биохимической и иммунологической активности энергизованной формы дисульфидглутатиона вследствие ее позитивного влияния на метаболизм и, отсюда, на биоэнергетику клеток сетчатки и сосудистой оболочки глаза и резидентных макрофагов тканей глаза. Основным свойством заявляемого средства является его способность оказывать дифференцированное воздействие на нормальные (стимуляция метаболизма, пролиферации и дифференцировки) и инфицированные микобактериями туберкулеза (индукция апоптоза) клетки. Цитопротекторные эффекты энергизованной формы дисульфидглутатиона, лежащие в основе его позитивных нейротрофических эффектов, связаны с регуляцией тиол-дисульфидного обмена и новым уровнем регулируемого соотношения ключевых факторов биологического окисления НАД'/НАД· Н' и НАДФ'/НАДФ^Н', что имеет принципиальное значение для нормализации метаболизма пигментного эпителия.

Указанные биолого-фармакологические эффекты обусловили высокую терапевтическую эффективность препарата на основе энергизованной формы дисульфидглутатиона в качестве средства лечения заболеваний заднего отдела глаза, сопровождающихся нарушением пигментного эпителия, которая была продемонстрирована в процессе клинических исследований.

Согласно изобретению клиническая результативность заявляемого средства и способа его применения в качестве фармацевтического препарата для лечения заболеваний заднего отдела глаза с нарушением пигментного эпителия, в том числе активных туберкулезных хориоретинитов, обеспечивается следующими видами активности предлагаемого средства:

иммунокорригирующей активностью вследствие регуляции местного иммунитета, в первую очередь посредством активации функции резидентных макрофагов;

цитопротекторной активностью вследствие активации метаболизма и биоэнергетики клеток глаза; антибактериальной и противовирусной активностью вследствие повышения уровня содержания эндогенных интерферонов;

противовоспалительным действием и репаративной активностью вследствие регуляции уровня содержания провоспалительных цитокинов и стимуляцией тиол-дисульфидного обмена;

индукцией апоптоза инфицированных клеток, что обеспечивает сохранение чувствительности к действию традиционной антибактериальной и противовирусной химиотерапии.

Согласно изобретению способ лечения заболеваний заднего отдела глаза, сопровождающихся нарушением пигментного эпителия, в том числе, вследствие активных туберкулезных хориоретинитов, заключается в назначении пациенту, нуждающемуся в этом, предлагаемого средства, причем применение препарата осуществляется по крайней мере один раз в день в течение периода времени, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

Согласно изобретению предлагаемое средство применяется в виде парабульбарных, подкожных и внутримышечных инъекций 1-2 раза в день по 0,5 мл 1-3% раствора; курс лечения продолжают до исчез

- 6 010926 новения симптомов заболевания, но не менее 14 дней.

Ниже приведены примеры клинической реализации и результаты лечения больных хориоретинитами и дистрофиями сетчатки.

Примеры реализации.

Пример реализации 2.

Обоснованием для заявляемого способа лечения являются данные, полученные в эксперименте на 28 кроликах породы шиншилла (52 глаза): в серии 1 - парабульбарное введение 1% раствора вещества на фоне антибактериальной терапии (АБТ), в серии 2 - внутримышечное введение 1% раствора вещества на фоне АБТ, в серии 3 - внутримышечное введение 3% раствора вещества на фоне АБТ, в серии 4 - контроль (только АБТ).

При изучении эффективности лечения было отмечено, что самые лучшие результаты наблюдались в серии 1 опытов (см. таблицу). При местном применении вещества было зафиксировано уменьшение размеров очага (2,46±0,47/2,2±0,54 ЬП), экссудации (1,68±0,36/1,2±0,44 балла), проминенции (2,2±0,24/1,6±0,32 дптр) после проведения курса лечения. Внутримышечное введение вещества (серия 2 опытов) оказалось менее эффективным, несмотря на то, что явления экссудации и проминенция несколько уменьшились (1,8±0,40/1,6±0,34 балла и 2,0±0,44/1,8±1,6 дптр), размеры очага остались неизменными (2,2±0,34 ΌΌ). Внутримышечное введение 3% раствора вещества (серия 3 опытов) оказалось менее эффективным, чем парабульбарное введение, однако эффективнее, чем внутримышечное введение 1% раствора вещества. В контрольной серии 4, где применялась только химиотерапия, офтальмологические параметры поражения глаз даже несколько увеличились: размер очага 2,24±0,42/2,4±0,40 ΌΌ, проминенция 1,8±0,30/1,85±0,36 диоптрий и лишь экссудация уменьшилась (1,8±0,34/1,7±0,36 балла).

При изучении гистологических срезов удалось установить, что только в серии 1 опытов отмечалась сохранность клеток пигментного эпителия (ПЭ) вне зоны специфического и параспецифического воспаления (фиг. 2). В непосредственной близости к туберкулезной гранулеме большая часть клеток ПЭ была разрушена с выходом пигмента в окружающие ткани. В сериях 2 и 3 опытов деструкция ПЭ с разрывами клеточной оболочки, разрежением пигмента или его элиминация наблюдалась во всех препаратах и на площади, превышающей размеры специфического и параспецифического воспаления (фиг. 1). В некоторых препаратах такие изменения прослеживались вплоть до зубчатой линии. Следует отметить, что состояние слоев сетчатки вне зоны очага в серии 1 опытов было удовлетворительным, тогда как в сериях 24 определялись явления деструкции и отека ее слоев.

Пример реализации 3.

Клинические исследования были проведены на 12 больных с активным туберкулезным хориоретинитом. Лечение 1% раствором вещества осуществлялось на фоне стандартной противотуберкулезной терапии. По способу введения препарата были выделены две группы: группа 1 - 1% раствор вещества парабульбарно на фоне АБТ, группа 2 - только традиционное противотуберкулезное лечение.

При сравнении результатов лечения у больных признаки воспалительной реакции были купированы в более короткие сроки в группе 1, чем в группе 2 (5-6 недель в основной и 8-9 недель в контрольной группах). Офтальмоскопически это характеризовалось уменьшением размеров очага, степени экссудации, уровня проминенции. По данным ЭФИ было зафиксировано повышение амплитуды А-волны (на 68 мкВ и 4-5 мС в основной группе против 3-4 мкВ и 1-2 мС в контрольной группе) и В-волны (8-10 мкВ и 5-7 мС в основной группе против 4-5 мкВ и 2-3 мС в контрольной группе) по сравнению с исходным уровнем, что говорит о нейроцитопротекторном свойстве препарата. По данным компьютерной периметрии было зафиксировано уменьшение размера скотомы в обеих группах исследования, однако, в основной группе эта разница также была больше (на 7% против 4%).

Полученные данные позволяют говорить об эффективности данного способа лечения и целесообразности включения 1% раствора вещества в комплексную противотуберкулезную терапию активных туберкулезных хориоретинитов и других заболеваний заднего отдела глаза, сопровождающихся изменениями пигментного эпителия, гипоксией тканей и интоксикацией.

Пример реализации 4 заявленного способа лечения туберкулезных поражений глаза.

Больная З., история болезни № 1054, поступила в отделение туберкулеза глаз СПбНИИФ 01.10.2004 г. по поводу периферического очагового хориоретинита правого глаза туберкулезной этиологии в активной стадии. Туберкулезная этиология установлена в 1987 г. Первое обострение произошло спустя 5 лет, затем через каждые 2 года. Однако с декабря 2003 г. по сентябрь 2004 г. обострений было 4, несмотря на проводимое лечение в противотуберкулезных учреждениях и специализированных санаториях. Офтальмоскопический статус перед началом лечения - острота зрения правого глаза 0,9; в СТ воспалительные клеточные элементы (опацитаты) и плавающие помутнения в задних слоях. Глазное дно: диск зрительного нерва (ДЗН) бледно-розовый, границы в нижней части размыты. По ходу нижнего сосудистого пучка на средней периферии расположен хориоретинальный очаг размером 1,0 ΌΌ, желтоватого цвета, проминирующий (0,5 диоптрий), с нечеткими краями, экссудатом в верхней части и отеком в перифокальной области и несколькими мелкими ретинальными очажками отсева. Периферическая ЭРГ: А-волна 25 мкВ и 20 мС; В-волна 180 мкВ и 50 мС. Компьютерная периметрия: абсолютная скотома

- 7 010926

14,8%. Учитывая частые обострения и опасность развития осложнений, больной был назначен курс вещества. Вещество в виде 1% раствора применяли в виде парабульбарных инъекций по 0,5 мл ежедневно курсом 15 процедур на фоне общей и местной специфической АБТ (внутримышечно 10% раствор изониазида по 6,0 мл, внутрь пиразинамид 30 мг/кг массы тела, эндоназальный электрофорез с 3% раствором изониазида). Переносимость препарата была удовлетворительной. В месте введения препарата не отмечалось гиперемии, отека параорбитальной клетчатки, имела место небольшая болезненность в течение 10-15 мин после инъекции. Проявлений местной и общей аллергических реакций не отмечено. Через 1 месяц от начала проведения курса лечения опацитаты практически отсутствуют, ДЗН стал иметь четкие границы, очаг уменьшился в размере до 0,8 ΌΌ, стал более четким, появилась начальная пигментация. По данным ЭФИ: А-волна 32 мкВ и 25 мС; волна В 200 мкВ и 55 мС. По данным компьютерной периметрии абсолютная скотома уменьшилась до 12,4%. Острота зрения правого глаза повысилась до 1,0.

Пример реализации 5 заявленного способа лечения хориоретинальных дистрофий.

Больная Б., 76 лет, история болезни № 5896, находилась в отделении с 04.11.2004 г. по 05.12.2004 г. с диагнозом «Высокая осложненная миопия левого глаза, миопия слабой степени правого глаза, вторичная хориоретинальная дистрофия обоих глаз».

При поступлении: острота зрения правого глаза с коррекцией φΐι - 1,0 Д = 0,2-0,3, левого глаза с коррекцией φΐι - 14,0 Д = 0,1. Поля зрения: на левом глазу выявлены абсолютные и относительные скотомы = 44%, на правом глазу парацентральная абсолютная скотома = 8%, центральная относительная скотома = 3%. На глазном дне определялись изменения, характерные для осложненной миопии: обширные стафиломы (Ο8>ΟΌ), атрофические хориоретинальные очаги (на 08 без транссудации, на ΟΌ в парамакулярной области с отеком макулы), сетчатка перерастянута, на периферии сетчатки отмечается диспигментация.

Больной была проведена традиционная дедистрофическая терапия с использованием витаминов внутримышечно и 1% раствора эмоксипина местно. Однако видимых результатов это не дало.

После проведения курса лечения 1% раствором вещества из 15 пара-бульбарных инъекций в оба глаза по 0,5 мл на фоне продолжения дедистрофической общей терапии на 20 день от начала лечения повысилась острота зрения правого глаза с коррекцией κρίι -1,0 Д = 0,5, левого глаза с коррекцией κρίι14,0 Д = 0,3. Относительная скотома на правом глазу исчезла.

Степень изменения основных офтальмоскопических показателей у кроликов на фоне применения вещества

	Группы наблюдения	Серия 1 (вещество парабульбарно) п=18	Серия 2 (в/м 1% р-р) п= 17	Серия 3 (в/м, 3% р-р) η = 17	Серия 4 (контрольная группа) η = 17
Перед	Размер очага	2,46±0,47	2,2±0,34	2,21±0,31	2,24±0,42
введением препарата	(диаметр диска) Проминенция	р<0,01		р<0,05	р<0,05
	(диоптрии) Экссудация	2,2±0,24 р<0,01	2,0±0,44 р<0,05	1,7±0,28	1,8±0,30
	(баллы)	1,68±0,36 р<0,01	1,8±0,40 р<0,05	1,6±0,2	1.8±0,34
Перед выведением из опыта	Размер очага (диаметр диска) Проминенция	2,2±0,54	2,2±0,30	2,2±0,47	2,4±0,40
	(диоптрии) Экссудация	1,6±0,32	1,8±0,40	1,75±0,39	1,85±0,36
	(баллы)	1,2±0,44	1,6±0,34	1,5±0,47	1,7±0,35

Источники информации.

1. Александрова А.Е., Антоненкова Е.В. Разработка нового направления патогенетической терапии туберкулеза на основе использования средств антигипоксического действия. Сб. науч. трудов и материалов XV Всероссийской конференции, т. 1, СПб., 1998, с. 168-173.

2. Патент РФ № 2197984 «Способ лечения различных форм туберкулеза легких, в том числе резистентных к противотуберкулезной химиотерапии», Кожемякин Л.А., Перельман М.И., Соколова Г.Б. и др., 2003.

3. Беллендир Э.Н., Песчанская И.Н., Наконечный Г.Д. Состояние микроциркуляторного русла при туберкулезе сосудистого тракта глаза в эксперименте//Проблемы туберкулеза, 1977, № 3, с. 64-67.

4. Беллендир Э.Н., Ягафарова Р.К., Хокканен В.М., Вишневский Б.И. Экспериментальные данные о влиянии нативного и иммобилизованного террилитина на проницаемость Изониазида в ткани глаза//Депонирована во ВНИИМИ № 466-В от 17.12.91.

5. Васильева С. Н. Экспериментальное обоснование использования Глутоксима в качестве средства сопровождения этиотропной терапии генерализованного туберкулеза. Автореф. дис. канд. мед. наук, СПб., 2004, 24 с.

6. Соколова Г.Б., Синицин М.В., Кожемякин Л.А., Перельман М.И. Глутоксим в комплексной терапии туберкулеза//ГЛУТОКСИМ. Новая идеология сопровождения антибактериальной, противовирусной

- 8 010926 и противоопухолевой терапии (в помощь практическому врачу). М., 2003, 131 с.

7. Устинова Е.И. Основные принципы диагностики, дифференциальной диагностики и лечения туберкулеза глаз//Вестник офтальмологии, № 3, 2001, с. 38-40.

8. Устинова Е.И. Туберкулез глаз и сходные с ним заболевания. СПб., 2002.

9. Краткая химическая энциклопедия, М.: «Советская энциклопедия», т. 1, 1961, с. 979-980.

Claims

1. Стабильная форма бис-(у-Е-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицината натрия с сохраняемой дисульфидной связью, используемая в качестве средства для лечения заболеваний заднего отдела глаза, которые сопровождаются нарушением пигментного эпителия, в том числе активных туберкулезных хориоретинитов.

2. Способ получения стабильной формы бис-(у-Е-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицината натрия, включающий окисление исходного соединения - восстановленного глутатиона (у-Е-глутамил-Ьцистеинилглицина) пероксид карбонатом натрия в присутствии фермента каталазы путем перемешивания водного раствора исходного вещества и указанных реагентов в течение 30 мин при температуре 25°С и рН 8-9, выделение свободного гексапептида бис-(у-Е-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицина, перевод окисленной формы гексапептида (дисульфид глутатиона) в натриевую соль посредством обработки его водного раствора раствором 4Ν ΝαΟΗ, фильтрацию полученного после окисления раствора, стабилизацию дисульфидной связи бис-(у-Е-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицината натрия путем ультрафиолетового облучения (УФО) реакционного раствора с помощью аппарата для УФО и выделение конечного продукта методом лиофильной сушки.

3. Способ лечения заболеваний заднего отдела глаза, которые сопровождаются нарушением пигментного эпителия, в том числе активных туберкулезных хориоретинитов, характеризующийся тем, что стабильную форму бис-(у-Е-глутамил)-Ь-цистинил-бис-глицината натрия применяют в монорежиме и/или в составе базовой специфической антибактериальной и противотуберкулезной химиотерапии в виде парабульбарных, и/или подкожных, и/или внутримышечных инъекций ежедневно 1-2 раза в день по 0,5 мл 1-3% раствора до получения терапевтического эффекта, но не менее чем в количестве 15 процедур, курс лечения продолжают до исчезновения симптомов заболевания, но не менее 14 дней.

Гистологический препарат внутренних оболочек глаза кролика после комплексного лечения туберкулезного хориоретинита без применения вещества