EA008646B1

EA008646B1 - Immunostimulating agent

Info

Publication number: EA008646B1
Application number: EA200401480A
Authority: EA
Inventors: Ольга Анатольевна Хоперская; Дмитрий Григорьевич МАЛЬДОВ; Евгений Иванович Асташкин
Original assignee: Закрытое Акционерное Общество "Скай Лтд."
Priority date: 2003-12-29
Filing date: 2004-11-03
Publication date: 2007-06-29
Also published as: EA200401480A2; EA200401480A3; RU2003137519A

Abstract

The invention relates to medicine, in particular, to preparations with expressed biologic activity relative to immunostimulating reactions.The immunostimulating agent is manufactured based on tissues of an animal nature and represents aqueous extraction of musles and skin of reptiles, squamous class, produced under conditions providing the content of sugars therein posessin active aldo- or keto-groups, in an amount comprising at least 50 mkg per 1 ml of the extraction.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к препаратам с выраженной биологической активностью в отношении иммуностимулирующих реакций.The invention relates to medicine, namely to drugs with pronounced biological activity in relation to immunostimulating reactions.

Как показывают исследования и подтверждают публикации, к ведущим клеткам, определяющим устойчивость организма человека к внешним инфекционным воздействиям, а также уничтожающим собственные опухолевые клетки и другие видоизмененные клетки организма, относятся фагоциты. Важная роль в подобных защитных реакциях принадлежит подвижным фагоцитам крови - нейтрофилам, а также моноцитам и некоторым другим лейкоцитам. Именно эти клетки определяют врожденный иммунитет, проявляющийся в форме разнообразных защитных реакций.Studies show and confirm the publication, to the leading cells that determine the resistance of the human body to external infectious influences, as well as destroying its own tumor cells and other modified cells of the body, include phagocytes. An important role in such defense reactions belongs to mobile blood phagocytes - neutrophils, as well as monocytes and some other white blood cells. It is these cells that determine the innate immunity, manifested in the form of a variety of protective reactions.

Адекватный ответ фагоцитов определяет во многом эффективность самозащиты организма от неблагоприятных внешних и внутренних факторов.The adequate response of phagocytes determines in many respects the effectiveness of the body’s self-defense against adverse external and internal factors.

Установлено, что нейтрофилы - наиболее многочисленные фагоциты крови способны покидать кровеносное русло и выходить (внедряться) в очаги поражения организма. Они составляют более 60% от всех белых клеток крови.It has been established that neutrophils, the most numerous blood phagocytes, are able to leave the bloodstream and exit (penetrate) into the lesions of the body. They make up more than 60% of all white blood cells.

При активации нейтрофилы подвергаются хемотаксису (направленному движению в очаг поражения), секретируют разнообразные защитные соединения, в том числе протеолитические ферменты, и, что особенно важно, образуют так называемые активные формы кислорода (АФК). К АФК относятся радикалы кислорода, а также соединения, из которых данные радикалы образуются. Радикалы кислорода обладают высокой реакционной активностью. Физиологический смысл данных радикалов связан с уничтожением чужеродных клеток и созданием условий, способствующих эффективному протеканию фагоцитоза.When activated, neutrophils undergo chemotaxis (directed movement into the lesion), secrete a variety of protective compounds, including proteolytic enzymes, and, most importantly, form the so-called reactive oxygen species (ROS). ROS includes oxygen radicals, as well as compounds from which these radicals are formed. Oxygen radicals have a high reactivity. The physiological meaning of these radicals is associated with the destruction of foreign cells and the creation of conditions conducive to the effective course of phagocytosis.

Образование радикалов кислорода в нейтрофилах происходит в высокоспециализированном ферментном мембранном комплексе, получившим название НАДФН оксидазной системы, которая осуществляет перенос электронов, получаемых от НАДФН, на молекулы кислорода.The formation of oxygen radicals in neutrophils occurs in a highly specialized enzyme membrane complex, called the NADPH oxidase system, which transfers electrons derived from NADPH to oxygen molecules.

Быстрое поглощение нейтрофилами большого количества кислорода, который для энергетики этих клеток не нужен, поскольку синтез АТФ происходит в результате анаэробного гликолиза, получило название «кислородного» или «дыхательного взрыва».The rapid absorption of large amounts of oxygen by neutrophils, which is not needed for the energetics of these cells, since ATP synthesis occurs as a result of anaerobic glycolysis, has been called the "oxygen" or "respiratory explosion."

Описан ряд тяжелых патологических состояний человека, при которых происходит неадекватный (резко сниженный) ответ фагоцитов. Особенно это характерно при хроническом лейкозе, поражающем лейкоциты, что приводит к снижению сопротивляемости всего организма и зачастую сопровождается многочисленными и повторными инфекциями, возникновением опухолей других типов клеток.A number of severe human pathological conditions are described, in which an inadequate (sharply reduced) phagocytic response occurs. This is especially characteristic of chronic leukemia, which affects leukocytes, which leads to a decrease in the resistance of the whole organism and is often accompanied by numerous and repeated infections, the appearance of tumors of other cell types.

Таким образом, получение препаратов, способных увеличить функциональную активность фагоцитов крови человека, в том числе нейтрофилов, является весьма актуальной задачей.Thus, obtaining drugs that can increase the functional activity of human blood phagocytes, including neutrophils, is a very urgent task.

Известно общеукрепляющее неспецифическое иммуномодулирующее средство, представляющее собой гидролизат из кукумарии, полученный ферментативным гидролизом с помощью протеолитического фермента из внутренностей краба или микробиологического фермента мегатерина, или протосубтилина, либо кислотным гидролизом с содержанием тритерпеновых гликозидов не менее 100 мкг/см³, причем рН полученного средства (препарата) составляет 6,3-7,0, а его массовая доля сухих веществ - не менее 20%.Known restorative unspecific immunomodulating agent, which is a hydrolyzate of sea cucumber, obtained by enzymatic hydrolysis with a proteolytic enzyme from viscera crab or microbial enzyme megaterina or protosubtilin or acid hydrolysis with a content of triterpene glycosides is not less than 100 g / cm ^3, wherein the pH of the resulting products ( drug) is 6.3-7.0, and its mass fraction of dry substances is not less than 20%.

Для получения препарата измельченную мышечную ткань из кукумарии смешиают с 3н. соляной кислотой в соотношении 1:0,5, гидролизуют при температуре 37-45°С в течение 5 ч, нейтрализуют карбонатом натрия и фильтруют с получением гидролизата из кукумарии.To obtain the drug, the crushed muscle tissue from cucumaria is mixed with 3n. hydrochloric acid in a ratio of 1: 0.5, hydrolyzed at a temperature of 37-45 ° C for 5 h, neutralized with sodium carbonate and filtered to obtain a hydrolyzate from cucumaria.

Полученный препарат содержит белки, минеральные вещества, тритерпеновые гликозиды, сумма которых составляет около 600 мкг/мл. В состав препарата также входят витамины группы В, гексозамины, сахара, глюкоза манноза, фруктоза, ксилоза, минеральные вещества (см. патент РФ № 2147239, кл. А 61К 35/56, 2000 г. - наиболее близкий аналог).The resulting preparation contains proteins, minerals, triterpene glycosides, the sum of which is about 600 μg / ml. The preparation also includes vitamins of group B, hexosamines, sugars, mannose glucose, fructose, xylose, mineral substances (see RF Patent No. 2147239, class A 61K 35/56, 2000, the closest analogue).

В результате анализа известного препарата, полученного описанным выше способом, необходимо отметить, что он, как и заявленный, может быть использован для воздействия на иммунную систему организма, однако, как показали исследования, воздействие данного препарата стимулирует лишь систему индуцируемого иммунитета, однако не оказывает влияния на врожденный.As a result of the analysis of a known drug obtained by the method described above, it should be noted that, as stated, it can be used to affect the body’s immune system, however, studies have shown that the effect of this drug stimulates only the system of inducible immunity, but has no effect on congenital.

Задачей настоящего изобретения является разработка средства (препарата), обладающего более широким спектром применения и оказывающего эффективное иммуностимулирующее действие путем увеличения функциональной активности фагоцитов крови, в том числе и нейтрофилов.The object of the present invention is to develop an agent (preparation), which has a wider range of application and has an effective immunostimulating effect by increasing the functional activity of blood phagocytes, including neutrophils.

Поставленная задача обеспечивается тем, что в иммуностимулирующем средстве на основе тканей животного происхождения новым является то, что оно представляет собой водную вытяжку мышц и кожи пресмыкающихся отряда чешуйчатых, полученную при условиях, обеспечивающих в ней содержание сахаров, обладающих активными альдо- или кетогруппами не менее 50 мкг на 1 мл вытяжки.The task is ensured by the fact that in the immunostimulating agent based on animal tissue new is that it is an aqueous stretch of muscles and skin of reptiles of the order scaly, obtained under conditions that provide it with the content of sugars with active ald or ketogroups of at least 50 µg per 1 ml extract.

Необходимо отметить, что иммуностимулирующие средства, полученные из животных тканей, известны довольно широко. Для получения таких средств используются мышцы крыс и каракатиц, внутренности краба, костный мозг млекопитающих, железы тюленей, жиры акулы, селезенки животных, молока лососевых рыб и пр. Однако данные средства характеризуются либо довольно низкой биологической активностью, либо активизируют только индуцируемый иммунитет.It should be noted that immunostimulating agents derived from animal tissues are widely known. Muscles of rats and cuttlefish, crab insides, mammalian bone marrow, seal glands, shark fats, animal spleens, salmon milk, etc., are used to obtain such agents. However, these funds are characterized by rather low biological activity or activate only induced immunity.

Полученное средство (препарат), в отличие от известных, воздействует непосредственно на фагоThe resulting drug (drug), in contrast to the known, acts directly on the phage

- 1 008646 циты крови, в том числе нейтрофилы, и способно вызывать активацию их функциональной активности.- 1 008646 blood cytes, including neutrophils, and can cause the activation of their functional activity.

При проведении патентных исследований не обнаружены решения, идентичные заявленному изобретению, а следовательно, заявленное изобретение соответствует критерию «новизна».When conducting patent research not found solutions that are identical to the claimed invention, and therefore, the claimed invention meets the criterion of "novelty."

Считаем, что сущность заявленного изобретения не следует явным образом из известных решений, а следовательно, заявленное изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».We believe that the essence of the claimed invention should not be explicitly known solutions, and therefore, the claimed invention meets the criterion of "inventive step".

Считаем, что сведения, изложенные в описании, достаточны для практического осуществления изобретения.We believe that the information set forth in the description is sufficient for the practical implementation of the invention.

Все сведения, не нашедшие отражения при раскрытии получения средства и его применения, являются известными, они не составляют предмета патентной охраны и поэтому в данном описании не раскрыты.All information that is not reflected in the disclosure of the receipt of funds and its use are known, they do not constitute the subject of patent protection and therefore are not disclosed in this description.

Для получения иммуностимулирующего средства используется известное оборудование.To obtain an immunostimulating agent, known equipment is used.

Средство получают следующим образом.The tool is obtained as follows.

Отделяют у представителя пресмыкающихся отряда чешуйчатых голову и хвост, удаляют внутренности и кости, промывают тушку.Separated from the representative of the reptiles squad scaly head and tail, remove the insides and bones, washed the carcass.

Препарирование осуществляется известным способом и не вызывает затруднений у специалистов.Dissection is carried out in a known manner and does not cause difficulties for specialists.

Приготовленную тушку помещают в емкость с дистиллированной водой, нагревают содержимое емкости до кипения и кипятят в течение 40-120 мин. В результате кипячения получают водную вытяжку, содержащую водорастворимые вещества.The prepared carcass is placed in a container with distilled water, the contents of the container are heated to boiling and boiled for 40-120 minutes. Boiling results in a water extract containing water-soluble substances.

Полученную водную вытяжку очищают хлороформом. Затем осуществляют лиофильную сушку целевого продукта, которую ведут под вакуумом при температуре 0-(-2)°С.The resulting aqueous extract is purified with chloroform. Then carry out the lyophilic drying of the target product, which is carried out under vacuum at a temperature of 0 - (- 2) ° C.

В результате получают порошкообразный препарат желтого цвета. Содержащиеся в коже и мышцах вещества содержат значительное количество сахаров, содержащих альдо- или кетогруппы.The result is a powdered drug yellow. The substances contained in the skin and muscles contain significant amounts of sugars containing aldo or keto groups.

Активные альдо- или кетогруппы восстанавливают антрон, что позволяет определить их количество.Active aldo or keto groups restore the antron, which allows to determine their number.

Содержание сахаров в средстве в количестве не менее 50 мкг на 1 мл вытяжки вызывает выделение активного кислорода активными макрофагами и нейтрофилами.The amount of sugar in the product in an amount of at least 50 µg per 1 ml of extract causes the release of active oxygen by active macrophages and neutrophils.

Полученный препарат представляет собой лиофилизированную порошкообразную смесь низкомолекулярных гидрофильных веществ.The resulting preparation is a lyophilized powder mixture of low molecular weight hydrophilic substances.

Срок хранения порошка в лиофилизированном виде не более одного года. Легко растворяется в воде или водном растворе.The shelf life of the powder in lyophilized form is not more than one year. Easily soluble in water or aqueous solution.

Сущность технологии получения препарата будет более понятна из приведенного примера.The essence of the technology of obtaining the drug will be more clear from the above example.

Для приготовления средства берут усыпленного холодом пресмыкающегося отряда чешуйчатых, отделяют голову, кости и хвост, потрошат и промывают.For the preparation, the cold-loosened reptile squad detachment is taken, the head, the bones and the tail are separated, gutted and washed.

Полученную таким образом тушку массой 50 г помещают в емкость и заливают 0,2 л дистиллированной воды. Содержимое емкости доводят до кипения и кипятят в течение 120 мин. Далее производят удаление гидрофобных примесей хлороформом, для чего продукт встряхивают на делительной воронке и разделяют воду и хлороформ. Далее в течение 5 ч производят сушку полученнной водной вытяжки. Сушку осуществляют лиофильно. Выход иммуностимулирующего средства составляет 1 г.Thus obtained carcass weighing 50 g is placed in a container and pour 0.2 l of distilled water. The contents of the container are brought to a boil and boil for 120 minutes. Next, remove the hydrophobic impurities with chloroform, for which the product is shaken in a separating funnel and separate the water and chloroform. Further for 5 hours, the resulting aqueous extract is dried. Drying carried out lyophilic. The output of the immunostimulating agent is 1 g.

Основным действующим началом полученного средства являются два вещества: полисахарид и сложный эфир. Данные вещества действуют одинаково, они аддитивны, но без потенцирования.The main active principle of the obtained funds are two substances: a polysaccharide and an ester. These substances act in the same way, they are additive, but without potentiation.

Аналогичным образом средство может быть получено из всех представителей отряда чешуйчатых.Similarly, the tool can be obtained from all members of the order scaly.

Исследования показали, что данное средство обладает высокой активностью лишь при осуществлении гидролиза всех указанных компонентов (кожа, мышцы), полученных из пресмыкающегося отряда чешуйчатых. Отсутствие хотя бы одного из ингредиентов резко снижает эффективность средства. Использование данного средства именно в виде водного экстракта позволяет стимулировать клетки врожденного иммунитета и стимулировать «дыхательный взрыв».Studies have shown that this tool has a high activity only in the implementation of the hydrolysis of all these components (skin, muscles), obtained from the reptile scaled squad. The absence of at least one of the ingredients dramatically reduces the effectiveness of the tool. The use of this tool in the form of an aqueous extract allows you to stimulate the cells of innate immunity and stimulate the "respiratory burst."

Эффективность действия полученного иммуностимулирующего средства подтверждается следующими примерами.The effectiveness of the obtained immunostimulating agent is confirmed by the following examples.

Пример 1.Example 1

Брали образцы цельной крови у 25 доноров в количестве 20-50 мкл, в которые вводили по 10-30 мкл полученного средства. В результате анализа было установлено: средство эффективно активизировало фагоциты крови, что находило отражение в увеличении образования радикалов кислорода. По степени своего воздействия полученное средство сравнимо с одним из наиболее эффективных известных в настоящее время препаратов (пептидом), выделенных из бактерий и имеющих следующий состав: формилметинол-лейцин-фенилаланин (БМЬР - формил пептид), однако полученное средство не подавляет действие формил пептида, в то же время известный препарат блокировал действие полученного средства, что позволяет предположить, что данные препараты действуют на разные мембранные структуры (рецепторы).Whole blood samples were taken from 25 donors in an amount of 20-50 μl, in which 10-30 μl of the obtained product were injected. As a result of the analysis, it was established that the agent effectively activated blood phagocytes, which was reflected in the increased formation of oxygen radicals. In terms of its impact, the obtained agent is comparable to one of the most effective currently known drugs (peptide) isolated from bacteria and having the following composition: formylmethine-leucine-phenylalanine (BMPP-formyl peptide), however, the resulting agent does not suppress the effect of formyl peptide, At the same time, a well-known drug blocked the effect of the obtained product, which suggests that these drugs act on different membrane structures (receptors).

Пример 2.Example 2

Брали образцы цельной крови у 15 пациентов, больных эссенциальной гипертонией, в которые вводили по 10-30 мкл средства. При данной патологии, как правило, наблюдается сильное истощение активности фагоцитов. После введения средства активность фагоцитов значительно повысилась.Whole blood samples were taken from 15 patients with essential hypertension, who were injected with 10–30 μl of the drug. With this pathology, as a rule, there is a strong depletion of the activity of phagocytes. After administration of the agent, phagocytic activity significantly increased.

- 2 008646- 2 008646

Пример 3.Example 3

больным с доброкачественными опухолями вводилось средство в количестве 0,5 мг.0.5 mg agent was administered to patients with benign tumors.

Средство вводилось ректально, один раз в сутки в течение 40 суток.The tool was administered rectally, once a day for 40 days.

Результат обследования показал, что процесс увеличения опухолевых узлов остановился, а в ряде случаев они претерпевали обратное развитие.The result of the survey showed that the process of increasing the tumor nodules stopped, and in some cases they underwent a reverse development.

Таким образом, можно достоверно утверждать, что полученное средство обладает высокой иммунологической активностью, а именно позволяет активизировать функциональную активность фагоцитов крови, в том числе и нейтрофилов.Thus, it can be reliably asserted that the obtained agent has a high immunological activity, namely, it allows activating the functional activity of blood phagocytes, including neutrophils.

Claims

An immunostimulating agent based on tissues of animal origin, characterized in that it is an aqueous extract of the muscles and skin of a reptile squamous squad, obtained under conditions ensuring the content of sugars with active aldo or keto groups in it, at least 50 μg per 1 ml of extract.