EA007472B1

EA007472B1 - Polyvalent strains of bacteriophages, methods for obtaining thereof, and medicaments containing said strains

Info

Publication number: EA007472B1
Application number: EA200400197A
Authority: EA
Inventors: Беата Вебер-Дабровска; Мариан Мульчик; Анджей Гурски; Януш Боратыньски; Марзанна Лусяк-Шелаховска; Данута Сыпер
Original assignee: Институт Иммунологии И Терапии Досвядчальней Пан
Priority date: 2001-07-18
Filing date: 2002-07-18
Publication date: 2006-10-27
Also published as: DE60218473D1; DK1406642T3; EP1406642B1; KR100874888B1; WO2003008564A3; AU2002354900A1; WO2003008564A2; US20050032036A1; DE60218473T2; US7232564B2; KR20040029372A; JP4723807B2; JP2004535812A; CN1541101A; CN1260353C; EP1406642A2; EA200400197A1; ATE355069T1; ES2283581T3

Abstract

The present invention relates to polyvalent strains of bacteriophages, methods of obtaining these and their use in the treatment of bacterial infections, particularly those of drug-resistant bacterial strains, especially arising in mucoviscidosis patients, are provided.

Description

Область изобретенияField of Invention

Настоящее изобретение относится к поливалентным штаммам бактериофагов, способам их получения и их применению для лечения бактериальных инфекций, в частности, вызываемых лекарственноустойчивыми штаммами бактерий.The present invention relates to multivalent strains of bacteriophages, methods for their preparation and their use for the treatment of bacterial infections, in particular caused by drug-resistant strains of bacteria.

Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Бактериофаги (фаги) представляют собой группу разнообразных вирусов, жизненный цикл которых связан исключительно с бактериальными клетками. Бактериофаги характеризуются лизогенным или литическим жизненным циклом. В качестве противобактериальных средств особенно пригодны литические бактериофаги, которые после инфекции бактериальных клеток, чувствительных к ним, реплицируются в них, приводя к их полному уничтожению (посредством лизиса), и высвобождаются новые фаги, которые атакуют и разрушают следующие бактериальные клетки. Данный процесс может проходить и ίη νίίτο, и ίη νίνο.Bacteriophages (phages) are a group of diverse viruses whose life cycle is associated exclusively with bacterial cells. Bacteriophages are characterized by a lysogenic or lytic life cycle. As antibacterial agents, lytic bacteriophages are especially suitable, which, after infection of bacterial cells sensitive to them, replicate in them, leading to their complete destruction (by lysis), and new phages are released that attack and destroy the following bacterial cells. This process can take place both ίη νίίτο and ίη νίνο.

Одну из важнейших характеристик бактериофагов представляет собой хорошо известная высокая специфичность их литической активности. Данное свойство используют, например, для определения видов (фаговое типирование) различных бактерий (см., например, описания патентов СВ 2285684, иδ 5824468 и δυ 543260, а также международные патентные заявки XVО 0100786 и XVО 0109370). Другие известные применения бактериофагов включают их пригодность в качестве инструментов в молекулярной биологии, например, для экспрессии и селекции конкретных белков (например, описание патента ϋδ 6027930) и для стерилизации и очистки сред (например, описания патентов ЕР 0414304, ЕР 0290295 и СВ 2253859, а также международные патентные заявки XVО 9808944 и XVО 9003122). Модифицированные фаги применяют для получения вакцин (например, XVО 9505454). Также применяют некоторые белки, происходящие из бактериофагов (например, ЕР 0510907, ϋδ 5470573, ^О 9607329). Способы выделения бактериофагов и получения фаговых препаратов хорошо известны и постоянно совершенствуются (например, СВ 829266, С8 192212, ВИ 2109055).One of the most important characteristics of bacteriophages is the well-known high specificity of their lytic activity. This property is used, for example, to determine the types (phage typing) of various bacteria (see, for example, descriptions of patents CB 2285684, and δ 5824468 and δυ 543260, as well as international patent applications XVO 0100786 and XVO 0109370). Other well-known applications of bacteriophages include their usefulness as tools in molecular biology, for example, for the expression and selection of specific proteins (for example, patent specification патδ 6027930) and for sterilization and purification of media (for example, patent specifications EP 0414304, EP 0290295 and CB 2253859, as well as international patent applications XVO 9808944 and XVO 9003122). Modified phages are used to produce vaccines (e.g. XVO 9505454). Some proteins originating from bacteriophages are also used (for example, EP 0510907, ϋδ 5470573, ^ O 9607329). Methods for isolating bacteriophages and obtaining phage preparations are well known and are constantly being improved (for example, CB 829266, C8 192212, VI 2109055).

Лечение фагами в большом масштабе применяли со Второй Мировой войны в институте микробиологии и вирусологии в Тбилиси, Грузия. Для лечения бактериальных инфекций и для профилактики там применяют банк различных фаговых препаратов.Phage treatment has been used on a large scale since World War II at the Institute of Microbiology and Virology in Tbilisi, Georgia. For the treatment of bacterial infections and for prevention, a bank of various phage preparations is used there.

Доступные данные указывают на высокую эффективность лечения фагами. Подобные исследования проводили в Польше в течение более чем 25 лет. В лаборатории бактериофагов института иммунологии и экспериментальной терапии польской академии наук во Вроцлаве лечение фагами применяют для лечения инфекционных заболеваний, вызываемых лекарственно-устойчивыми формами бактерий и не чувствительными к антибиотикам бактериями (см. 81сГап 81орск с! а1., АгсШунш 1ттипо1ощас с! Т11сгар1ас Ехрсптсп!а1Е, 1981, 31, 293; 81сГап 81орск с! а1., АгсЫунш 1ттипо1ощас с! Тйсгар1ас Ехрсптсп!а1Е, 1983, 31, 267; 81сГап 81орск с! а1., АгсЫунш 1ттипо1од1ас с! ТЕсгар1ас Ехрсптсп!а1Е, 1984, 32, 317; 81сГап 81орск с! а1., АгсЫунш 1ттипо1од1ас с! Тйсгар1ас Ехрсптсп!а1Е, 1985, 33, 219; 81сГап 81орск с! а1., АгсЫуцт 1ттипо1од1ас с! Тйсгар1ас Ехрсптсп1а1Е, 1985, 33, 241; 8!с£ап 81орск с! а1., АгсЫунш 1ттипо1ощас с! Т11сгар1ас Ехрсптсп1а1Е, 1987, 35, 569; Вса!а ^сЬсг-ЭаЬготека с! а1., АгсЫунш 1ттипо1ощас с! Тйсгар1ас Ехрсптсп!а1Е, 2000, 48, 31-37; Вса!а ^сЬсг-ОаЬготека с! а1., АгсЫунш 1ттипо1од1ас с! Тйсгар1ас Ехрсптсп!а1Е, 2000, 48, 547-551). Проводимое там в течение 14 последних лет лечение фагами, которое включило 1473 пациента с гнойными инфекциями различных тканей и органов, указывает на высокую эффективность лечения фагами.Available data indicate that phage treatment is highly effective. Similar studies have been carried out in Poland for more than 25 years. In the laboratory of bacteriophages of the Institute of Immunology and Experimental Therapy of the Polish Academy of Sciences in Wroclaw, phage treatment is used to treat infectious diseases caused by drug-resistant forms of bacteria and bacteria that are not sensitive to antibiotics (see 81cGap 81orsk c! A1., AgsShunsh 1tipo1aaaaaa! T11sgarspascas exp! A1E, 1981, 31, 293; 81sGap 81orsk with! A1, AgsYunsh 1tipo1aschas!! Tysgar1as Exptspspsp! A1E, 1983, 31, 267; 81sGap 81orsk with! a1., AgsYunsh 1tipo1od1as s! 317; 81sGap 81orsk with! A1., AgsYunsh 1ttypo1od1as s! Tysgar 1as Expsptsp! A1E, 1985, 33, 219; 81cGap 81orsk with! A1., AgsUutst 1tipo1od1as s! Tysgar1as Exsptsp1a1E, 1985, 33, 241; 8! With ap ap 81orsk s! A1., , 35, 569; All! A ^ bcg-eaGotteca s! A1., ArgSuns 1tipo1 wishing with! Tysgaras exrptsp a1E, 2000, 48, 31-37; All! A ^ csg-Oggoteka c! A1., ArgSuns1tpto! Tysgar1as Expsptsp! A1E, 2000, 48, 547-551). The phage treatment carried out there over the past 14 years, which included 1473 patients with purulent infections of various tissues and organs, indicates the high efficiency of phage treatment.

Полное устранение симптомов заболевания и возвращение к здоровому состоянию отмечено в 1289 случаях. Необходимо подчеркнуть, что, по меньшей мере, в дюжине или около того случаев лечение фагами представляло единственную возможность для уничтожения угрожающей жизни инфекции. Проводимое лечение касалось индивидуальных пациентов. Оно состояло из:Complete elimination of the symptoms of the disease and a return to a healthy state was noted in 1289 cases. It must be emphasized that, in at least a dozen or so cases, phage treatment was the only way to eradicate a life-threatening infection. The treatment concerned individual patients. It consisted of:

a) выращивания и идентификации бактериальных штаммов, выделенных из материала, полученного от пациента;a) growing and identifying bacterial strains isolated from material obtained from a patient;

b) определения чувствительности штамма к конкретным фагам и отбор фагов, показавших наивысшую литическую активность по отношению к штамму;b) determining the sensitivity of the strain to specific phages and the selection of phages that showed the highest lytic activity in relation to the strain;

c) получение фаговых лизатов с большим количеством фаговых частиц;c) obtaining phage lysates with a large number of phage particles;

б) получение стерильного фагового препарата для лечения.b) obtaining a sterile phage preparation for treatment.

Данная процедура является довольно дорогостоящей, трудоемкой и требующей времени. Иногда с момента получения материала для исследования до наличия готового, стерилизованного фагового препарата для лечения проходит 7-10 дней. Такая задержка является слишком большой при некоторых состояниях заболевания. Лечение фагами в широком масштабе невозможно провести посредством применяемых до настоящего времени способов. Инфекции, сопутствующие муковисцидозу, представляют собой особую проблему. Данное заболевание представляет собой наследственное, системное заболевание, состоящее из дисфункции секретирующих слизь желез, что предрасполагает пациента к хроническим бронхиальным и легочным заболеваниям. Секретируемая слизь является густой и вязкой, что затрудняет ее удаление естественными способами (кашель). Накопление и задержка слизи в бронхах и ухудшение ее очистки создают благоприятные условия для бактериальных инфекций, приводя к хроническим бронхитам и пневмонии. Наиболее угрожающие, вызывающие инфекционные заболевания патогенные микроThis procedure is quite expensive, time consuming and time consuming. Sometimes, from the moment of receiving the material for research to the availability of a ready-made, sterilized phage preparation for treatment, 7-10 days elapse. This delay is too long in some conditions of the disease. Phage treatment on a large scale cannot be carried out by the methods used to date. Infections associated with cystic fibrosis are a particular problem. This disease is a hereditary, systemic disease consisting of mucus-secreting glands dysfunction, which predisposes the patient to chronic bronchial and pulmonary diseases. Secreted mucus is thick and viscous, which makes it difficult to remove it by natural means (cough). The accumulation and retention of mucus in the bronchi and the deterioration of its purification create favorable conditions for bacterial infections, leading to chronic bronchitis and pneumonia. The most threatening, pathogenic micro-infections

- 1 007472 организмы, сопутствующие муковисцидозу, представляют собой §1арйу1ососси5 аигеиз и бациллы рода Рзеиботопаз. Периодически повторяющиеся инфицирования данными микроорганизмами ведут к серьезным патологическим изменениям в дыхательной системе и преждевременной смерти. Немногие пациенты живут более 25 лет. Лечение таких инфекций доступными антибиотиками порождало во всем мире серьезную терапевтическую проблему, особенно в последние несколько лет. Лечение данных инфекций антибиотиками становилось все менее и менее эффективным, так как абсолютное большинство бактериальных штаммов демонстрирует устойчивость ко всем антибиотикам, включая антибиотик крайнего случая, представляющий собой ванкомицин. Поэтому существует неотложная необходимость ввести в медицинскую практику альтернативный терапевтический способ для лечения устойчивых и высокоопасных бактериальных инфекций.- 1 007472 organisms associated with cystic fibrosis are §1aryu1osossi5 aigeis and bacilli of the genus Rzeibotopaz. Periodically repeated infections with these microorganisms lead to serious pathological changes in the respiratory system and premature death. Few patients live more than 25 years. The treatment of such infections with affordable antibiotics has created a serious therapeutic problem worldwide, especially in the last few years. Treatment of these infections with antibiotics became less and less effective, since the vast majority of bacterial strains demonstrate resistance to all antibiotics, including the extreme case antibiotic, which is vancomycin. Therefore, there is an urgent need to introduce into medical practice an alternative therapeutic method for the treatment of persistent and highly dangerous bacterial infections.

Цель изобретенияThe purpose of the invention

В последние годы наблюдается сильное распространение бактериальных штаммов, устойчивых ко всем антибиотикам, включая ванкомицин, представляющий собой антибиотик крайнего случая. В результате, лечение антибиотиками бактериальных инфекций, вызываемых данными лекарственноустойчивыми формами, является неэффективным. Данная ситуация создала поразительные терапевтические проблемы. Таким образом, существует неотложная необходимость ввести в медицинскую практику альтернативные терапевтические способы для лечения устойчивых бактериальных инфекций.In recent years, there has been a strong spread of bacterial strains that are resistant to all antibiotics, including vancomycin, which is an extreme case antibiotic. As a result, antibiotic treatment of bacterial infections caused by these drug-resistant forms is ineffective. This situation has created astounding therapeutic problems. Thus, there is an urgent need to introduce alternative therapeutic methods into the medical practice for the treatment of persistent bacterial infections.

Принимая во внимание указанную выше цель, данное изобретение представляет собой осуществление способа получения поливалентных фаговых штаммов, которые можно применять для получения препаратов с гарантированной эффективностью лечения бактериальных инфекций без необходимости выбора индивидуального фага для каждого случая. В данной конкретной реализации цель изобретения представляет собой предоставление пути, который позволяет получить фаговые препараты высокой степени чистоты, в частности, свободные от эндотоксина.Taking into account the above purpose, this invention is an implementation of a method for producing polyvalent phage strains that can be used to obtain drugs with guaranteed effectiveness in the treatment of bacterial infections without the need to select an individual phage for each case. In this particular implementation, the aim of the invention is to provide a pathway that allows to obtain phage preparations of high purity, in particular, free of endotoxin.

Конкретная цель изобретения представляет собой получение поливалентных фаговых препаратов, которые можно эффективно применять для лечения бактериальных инфекций, связанных с муковисцидозом, без необходимости индивидуального выбора фага для каждого случая.A specific objective of the invention is the production of polyvalent phage preparations that can be effectively used to treat bacterial infections associated with cystic fibrosis, without the need for an individual choice of phage for each case.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

В настоящем изобретении представлен способ получения поливалентного штамма бактериофага, в котором:The present invention provides a method for producing a multivalent strain of a bacteriophage, in which:

a) выделяют достаточное количество (п) различных штаммов бактериальных патогенных микроорганизмов определенного вида, случайно появляющихся в данном регионе, где указанные бактериальные штаммы, возможно, являются лекарственно-устойчивыми;a) allocate a sufficient number (p) of various strains of bacterial pathogenic microorganisms of a certain type, randomly appearing in a region where these bacterial strains are possibly drug resistant;

b) выделяют достаточное количество различных штаммов бактериофага, специфичных по меньшей мере для одного из бактериальных штаммов, указанных в а);b) isolate a sufficient number of different strains of the bacteriophage specific for at least one of the bacterial strains specified in a);

c) определяют литическую активность собранных штаммов бактериофага на каждом выделенном бактериальном штамме, затем подсчитывают значение р, которое представляет собой отношение числа штаммов, лизированных данным фагом, к числу всех выделенных бактериальных штаммов;c) determine the lytic activity of the collected strains of the bacteriophage on each isolated bacterial strain, then calculate the p value, which is the ratio of the number of strains lysed by this phage to the number of all isolated bacterial strains;

б) для полученного значения р, тестируют, удовлетворяет ли п условию:b) for the obtained value of p, test whether n satisfies the condition:

где ч=1-р, б представляет собой константу, не большую, чем 0,1, оптимально - не большую чем 10% р, ζ_1-α представляет собой случайную переменную с нормальным распределением, зависящую от доверительной вероятности 1-α, которая не меньше 0,95;where h = 1-p, b is a constant not greater than 0.1, optimally not more than 10% p, ζ _1-α is a random variable with a normal distribution, depending on the confidence probability 1-α, which not less than 0.95;

е) выбирают штамм бактериофага, который удовлетворяет критерию, определенному в б), и обладает значением р не меньшим, чем 2/п, предпочтительно не меньшим, чем 0,5.f) a bacteriophage strain is selected that satisfies the criterion defined in b) and has a p value of not less than 2 / p, preferably not less than 0.5.

Диапазон литической активности каждого выделенного бактериофага определяют по отношению к генеральной совокупности патогенных бактериальных штаммов, представленных в данном регионе. С этой целью необходимо собрать достаточно большую коллекцию случайным образом выбранных лекарственно-устойчивых бактериальных штаммов. В отношении определенной большой выборки бактерий из генеральной совокупности размером п штаммов (в описанном примере п составляло 845 и 880, соответственно, для лекарственно-устойчивых штаммов Рзеиботопаз и §1арйу1ососси5, выделенных в Польше) вычисляют частоту успеха или отношение числа штаммов, лизированных данным фагом, к общему числу изучаемых штаммов. Данную частоту рассматривают как вероятность успеха р. Тогда вероятность неуспеха представляет собой с.|=1-р.The range of lytic activity of each isolated bacteriophage is determined in relation to the total population of pathogenic bacterial strains represented in this region. For this purpose, it is necessary to collect a sufficiently large collection of randomly selected drug-resistant bacterial strains. For a specific large sample of bacteria from the general population of size n strains (in the described example, n was 845 and 880, respectively, for drug-resistant strains of Rzeybotopaz and §1aryu1ossossi5 isolated in Poland), the success rate or the ratio of the number of strains lysed by this phage is calculated, to the total number of studied strains. This frequency is considered as the probability of success p. Then the probability of failure is s. | = 1-p.

Существенно выбрать размер п, которым должна обладать выборка, так, чтобы ее можно было рассматривать как репрезентативную для генеральной совокупности штаммов данного рода (например, Рзеиботопаз или §1арйу1ососси5). С этой целью устанавливают следующий критерий того, что выборка является репрезентативной:It is essential to choose the size n that the sample should have, so that it can be considered representative of the general population of strains of this genus (for example, Rzeybotopaz or §1aryu1ossossi5). For this purpose, the following criterion is established that the sample is representative:

Р( | ν-р | <б)=Р(-б<г-р<б)=1-аP (| ν-p | <b) = P (-b <g-p <b) = 1-a

- 2 007472- 2 007472

Вероятность того, что абсолютное значение разницы между частотой выборки ν и вероятностью успеха р является меньшей, чем предварительно заданное значение б, представляет собой 1-α, которая соответствует уровню достоверности 1-α. Значение 1-α обычно устанавливают 0,95 или 0,98.The probability that the absolute value of the difference between the sampling frequency ν and the probability of success p is less than the predefined value b is 1-α, which corresponds to a confidence level of 1-α. The value of 1-α is usually set to 0.95 or 0.98.

Число образцов η должно удовлетворять условиюThe number of samples η must satisfy the condition

где ζ_1-α представляет собой случайную переменную с нормальным распределением. Для 1-α=0,95 Ζ_1-α=1,96, а для 1-α=0,98where ζ _1-α is a random variable with a normal distribution. For 1-α = 0.95 Ζ _1-α = 1.96, and for 1-α = 0.98

Основываясь на данном критерии и значении частоты р, полученной для охарактеризованного фага, посредством задания приемлемых значений б и доверительного интервала 1-α можно проверить величину η, используемую для определения диапазона литической активности данного фага и удостовериться в том, можно ли рассматривать литическую активность, полученную для данного η, с назначенными значениями б и 1-α, как корректную по отношению к генеральной совокупности бактериальных штаммов данного рода.Based on this criterion and the value of the frequency p obtained for the characterized phage, by setting acceptable values of b and the confidence interval 1-α, we can check the value of η used to determine the range of lytic activity of this phage and make sure that it is possible to consider the lytic activity obtained for a given η, with the assigned values of b and 1-α, as correct with respect to the general population of bacterial strains of this genus.

Штамм бактериофагов предпочтительно выделяют на стадии Ь) из образца, происходящего из окружающей среды, посредством пропускания через мембранный фильтр с размером пор 0,2-0,4 мкм, добавления культуральной среды к фильтрату и смешивания его с бульонной культурой бактерий определенного рода, инкубирования смеси примерно один час при температуре примерно 37°С, забора части суспензии и осуществления посева на чашки с твердой культуральной средой, инкубирования от 2 до 24 ч примерно при 37°С, выделения образца среды, окружающей отдельное стерильное пятно, перенесения его в бульонную культуру бактерии определенного рода и инкубирования до тех пор, пока культура не станет прозрачной, и получения препарата бактериофагов посредством пропускания лизата через мембранный фильтр с размером пор 0,2-0,4 мкм, при этом посев на твердую культуральную среду и повторное выделение стерильных пятен предпочтительно повторить 5 раз.The bacteriophage strain is preferably isolated in step b) from a sample originating from the environment by passing 0.2-0.4 μm through a membrane filter, adding culture medium to the filtrate and mixing it with a certain kind of bacteria broth culture, incubating the mixture about one hour at a temperature of about 37 ° C, sampling part of the suspension and plating on plates with solid culture medium, incubation for 2 to 24 hours at about 37 ° C, isolating a sample of medium surrounding a separate sterile stain, transferring it to a broth culture of a certain kind of bacteria and incubating until the culture becomes transparent, and obtaining a bacteriophage preparation by passing the lysate through a membrane filter with a pore size of 0.2-0.4 microns, while plating on solid the culture medium and re-isolation of sterile spots is preferably repeated 5 times.

Бактериальные штаммы на стадии с) предпочтительно инокулируют на твердую культуральную среду, на которой размещают часть препарата бактериофагов, полученного на стадии Ь), инкубируют примерно 4 ч примерно при 37°С, после чего примерно от 2 до 24 ч температуру поддерживают примерно 4°С, после чего литическую активность штамма бактериофагов доказывают появлением, по меньшей мере, отдельных стерильных пятен.The bacterial strains in step c) are preferably inoculated onto a solid culture medium on which a portion of the bacteriophage preparation obtained in step b) is placed, incubated for about 4 hours at about 37 ° C, after which the temperature is maintained at about 4 ° C for about 2 to 24 hours after which the lytic activity of the bacteriophage strain is proved by the appearance of at least separate sterile spots.

Далее возможно выполнить дополнительную очистку лизата, в частности в отношении эндотоксина, в соответствии с чем смесь, содержащую бактериофаги, приводят в контакт с субстратом, содержащим целлюлозу или ее частично этерифицированные производные, далее промывают раствором, который удаляет примеси, в частности эндотоксин, после чего очищенные бактериофаги смывают. Эндотоксин можно эффективно элюировать водой, раствором недиссоциирующего вещества или солевым раствором в концентрации не более чем 0,1М, возможно забуференным. Фракцию бактериофагов можно также эффективно элюировать раствором недиссоциирующего вещества, или любого буфера, или солевым раствором в концентрации более чем 0,05М, возможно забуференным. Также элюцию эндотоксина и бактериофагов проводят при температурах от -25 до +100°С. Элюцию эндотоксина и бактериофагов предпочтительно проводить с применением водного солевого раствора, содержащего органический растворитель. Органический растворитель лучше всего выбирать из группы, включающей диметилсульфоксид, диметилформамид, изопропанол и ацетон, а в качестве субстрата можно применять целлюлозу, частично этерифицированную органической или неорганической кислотой. Можно применять субстрат из целлюлозы, частично этерифицированной уксусной, азотной, серной или фосфорной кислотами, в частности, в качестве субстрата можно применять целлюлозу, у которой этерифицированы от 0,01 до 5% молекул глюкозы, предпочтительно от 0,25 до 1%, более предпочтительно от 0,5 до 1% молекул глюкозы.Further, it is possible to perform additional purification of the lysate, in particular with respect to endotoxin, according to which the mixture containing bacteriophages is brought into contact with a substrate containing cellulose or its partially esterified derivatives, then it is washed with a solution that removes impurities, in particular endotoxin, and then purified bacteriophages are washed off. Endotoxin can be effectively eluted with water, a solution of a non-dissociating substance or saline in a concentration of not more than 0.1 M, possibly buffered. The bacteriophage fraction can also be effectively eluted with a solution of a non-dissociating substance, or any buffer, or saline in a concentration of more than 0.05 M, possibly buffered. Also, elution of endotoxin and bacteriophages is carried out at temperatures from -25 to + 100 ° C. Elution of endotoxin and bacteriophages is preferably carried out using an aqueous saline solution containing an organic solvent. An organic solvent is best selected from the group consisting of dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, isopropanol and acetone, and cellulose partially esterified with an organic or inorganic acid can be used as a substrate. A substrate can be used from cellulose partially esterified with acetic, nitric, sulfuric or phosphoric acids. In particular, cellulose can be used as a substrate, in which from 0.01 to 5% of glucose molecules, preferably from 0.25 to 1%, more preferably from 0.5 to 1% glucose molecules.

Предпочтительные патогенные бактериальные штаммы представляют собой штаммы родов 81арйу1ососси8 или Ркеубошопак.Preferred pathogenic bacterial strains are strains of the genera 81 aryuosossi8 or Rkeuboshopak.

В дополнительном аспекте изобретения представлено лекарственное средство для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, вызванных бактериальными патогенными микроорганизмами, которое содержит активный компонент и, возможно, фармацевтически допустимый носитель, так что активный компонент включает поливалентный штамм бактериофагов, специфичный для бактерий рода и полученный с применением способа по данному изобретению.In an additional aspect of the invention, there is provided a medicament for the treatment or prophylaxis of infectious diseases caused by bacterial pathogens, which contains an active component and possibly a pharmaceutically acceptable carrier, so that the active component comprises a multivalent bacteriophage strain specific for bacteria of the genus and obtained using the method according to this invention.

Лекарственное средство по данному изобретению может отличаться тем, что в качестве поливалентного штамма бактериофагов, специфичного для бактерий рода 81арйу1ососси5, оно содержит по меньшей мере один штамм бактериофагов, выбранный из числа 81 (РСМ Б/00001), 82 (РСМ Б/00002), 83 (РСМ Р/00003), 84 (РСМ Р/00004), 85 (РСМ Р/00005), 86 (РСМ Р/00006) и 87 (РСМ Р/00007), предпочтительно фаги 81, 82 и 84 или 85. Данное лекарственное средство, полученное по одному из аспектов данного изобретения, предназначено для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, возникающих у субъектов, страдающих от муковисцидоза, и в качестве поливалентного штамма бактериофаThe medicine according to this invention may differ in that, as a multivalent strain of bacteriophages specific for bacteria of the genus 81 aryu1ossossi5, it contains at least one bacteriophage strain selected from among 81 (PCM B / 00001), 82 (PCM B / 00002), 83 (PCM P / 00003), 84 (PCM P / 00004), 85 (PCM P / 00005), 86 (PCM P / 00006) and 87 (PCM P / 00007), preferably phages 81, 82 and 84 or 85. The medicament obtained according to one aspect of the invention is intended for the treatment or prophylaxis of infectious diseases occurring in subjects with suffering from cystic fibrosis, and as a multivalent strain of bacterioph

- 3 007472 гов, специфичного к бактериям рода 81арйу1ососси5, оно содержит по меньшей мере один штамм бактериофагов, выбранный из числа Р/00002, Р/00004 и Р/00007.- 3,007,472 gov, specific for bacteria of the genus 81aryu1ossossi5, it contains at least one bacteriophage strain selected from among P / 00002, P / 00004 and P / 00007.

Лекарственное средство по данному изобретению может отличаться тем, что в качестве поливалентного штамма бактериофагов, специфичного для бактерий рода Ркеибошопак, оно содержит по меньшей мере один штамм бактериофагов, выбранный из числа Р1 (РСМ Р/00008), Р2 (РСМ Р/00009), Р3 (РСМ Р/00010), Р4 (РСМ Р/00011), Р5 (РСМ Р/00012), Р6 (РСМ Р/00013), Р7 (РСМ Р/00014), Р8 (РСМ Р/00015), Р9 (РСМ Р/00016), Р10 (РСМ Р/00017), Р11 (РСМ Р/00018), Р12 (РСМ Р/00019), Р13 (РСМ Р/00020), Р14 (РСМ Р/00021), Р15 (РСМ Р/00022), Р16 (РСМ Р/00023), Р17 (РСМ Р/00024), Р18 (РСМ Р/00025), Р19 (РСМ Р/00026) и Р20 (РСМ Р/00027), оптимально - фаги Р7, Р20 и Р6. Лекарственное средство, полученное по одному из аспектов данного изобретения, предназначено для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, возникающих у субъектов, страдающих от муковисцидоза, и в качестве поливалентного штамма бактериофагов, специфичного к бактериям рода Ркеибошопак, оно содержит по меньшей мере один штамм бактериофагов, выбранный из числа Р/00010, Р/00013 и Р/00018.The drug according to this invention may differ in that, as a multivalent strain of bacteriophages specific for bacteria of the genus Rkeiboshopak, it contains at least one strain of bacteriophages selected from among P1 (PCM P / 00008), P2 (PCM P / 00009), P3 (PCM P / 00010), P4 (PCM P / 00011), P5 (PCM P / 00012), P6 (PCM P / 00013), P7 (PCM P / 00014), P8 (PCM P / 00015), P9 ( PCM P / 00016), P10 (PCM P / 00017), P11 (PCM P / 00018), P12 (PCM P / 00019), P13 (PCM P / 00020), P14 (PCM P / 00021), P15 (PCM P / 00022), P16 (PCM P / 00023), P17 (PCM P / 00024), P18 (PCM P / 00025), P19 (PCM P / 00026) and P20 (PCM P / 00027), optimally - phages P7, P20 and P6. A medicament obtained according to one aspect of the present invention is intended for the treatment or prophylaxis of infectious diseases occurring in subjects suffering from cystic fibrosis, and as a multivalent strain of bacteriophages specific for Rkeiboshopak bacteria, it contains at least one bacteriophage strain selected from among P / 00010, P / 00013 and P / 00018.

Поливалентный штамм бактериофагов, полученный по способу данного изобретения, для разработки лекарственного средства для лечения или профилактики бактериальных инфекций, вызываемых бактериальными патогенными микроорганизмами, представляет собой дополнительный объект данного изобретения.The multivalent strain of bacteriophages obtained by the method of the present invention, for the development of a medicinal product for the treatment or prevention of bacterial infections caused by bacterial pathogenic microorganisms, is an additional object of the present invention.

Для получения лекарственного средства для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями рода 81ар11у1ососси5. преимущественным является применение, по меньшей мере, одного штамма бактериофагов, выбираемого из числа 81 (РСМ Р/00001), 82 (РСМ Р/00002), 83 (РСМ Р/00003), 84 (РСМ Р/00004), 85 (РСМ Р/00005), 86 (РСМ Р/00006) и 87 (РСМ Р/00007), оптимально - фаги 81, 82 и 84 или 85. Для создания лекарственного средства для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями рода 81ар11у1ососси5 у субъектов, страдающих от муковисцидоза, преимущественным является применение по меньшей мере одного штамма бактериофагов, выбираемого из числа Р/00002, Р/00004 и Р/00007.To obtain a medicinal product for the treatment or prevention of infectious diseases caused by bacteria of the genus 81ar11u1ossossi5. advantageous is the use of at least one bacteriophage strain selected from among 81 (PCM P / 00001), 82 (PCM P / 00002), 83 (PCM P / 00003), 84 (PCM P / 00004), 85 (PCM P / 00005), 86 (RSM R / 00006) and 87 (RSM R / 00007), optimally phages 81, 82 and 84 or 85. To create a drug for the treatment or prevention of infectious diseases caused by bacteria of the genus 81ap11u1ossoss5 in subjects, suffering from cystic fibrosis, it is preferable to use at least one bacteriophage strain selected from among P / 00002, P / 00004 and P / 00007.

Также для создания лекарственного средства для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями рода Ркеибошопак, преимущественным является применение по меньшей мере одного штамма бактериофагов, выбираемого из числа Р1 (РСМ Р/00008), Р2 (РСМ Р/00009) , Р3 (РСМ Р/00010), Р4 (РСМ Р/00011), Р5 (РСМ Р/00012), Р6 (РСМ Р/00013), Р7 (РСМ Р/00014), Р8 (РСМ Р/00015), Р9 (РСМ Р/00016) , Р10 (РСМ Р/00017), Р11 (РСМ Р/00018), Р12 (РСМ Р/00019), Р13 (РСМ Р/00020), Р14 (РСМ Р/00021), Р15 (РСМ Р/00022), Р16 (РСМ Р/00023), Р17 (РСМ Р/00024), Р18 (РСМ Р/00025), Р19 (РСМ Р/00026) и Р20 (РСМ Р/00027), оптимально - фаги Р7, Р20 и Р6. Для создания лекарственного средства для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями рода Ркеибошопак у субъектов, страдающих от муковисцидоза, преимущественным является применение, по меньшей мере, одного штамма бактериофагов, выбираемого из числа Р/00010, Р/00013 и Р/00018.Also, to create a medicine for the treatment or prevention of infectious diseases caused by bacteria of the genus Rkeiboshopak, it is preferable to use at least one bacteriophage strain selected from among P1 (PCM P / 00008), P2 (PCM P / 00009), P3 (PCM P / 00010), P4 (PCM R / 00011), P5 (PCM R / 00012), P6 (PCM R / 00013), P7 (PCM R / 00014), P8 (PCM R / 00015), P9 (PCM R / 00016 ), P10 (PCM P / 00017), P11 (PCM P / 00018), P12 (PCM P / 00019), P13 (PCM P / 00020), P14 (PCM P / 00021), P15 (PCM P / 00022), P16 (PCM P / 00023), P17 (PCM P / 00024), P18 (PCM P / 00025), P19 (PCM P / 00026) and P20 (PCM P / 00027), optimally - phages P7, P20 and P6. To create a medicine for the treatment or prevention of infectious diseases caused by bacteria of the genus Rkeiboshopak in subjects suffering from cystic fibrosis, it is preferable to use at least one bacteriophage strain selected from among P / 00010, P / 00013 and P / 00018.

Поливалентный штамм бактериофагов, специфичный для бактерий рода 81арйу1ососси5, выбираемый из числа 81 (РСМ Р/00001), 82 (РСМ Р/00002), 83 (РСМ Р/00003), 84 (РСМ Р/00004), 85 (РСМ Р/00005), 86 (РСМ Р/00006) и 87 (РСМ Р/00007), оптимально - из числа 81, 82, 84 и 85, представляет собой дополнительный объект данного изобретения.A multivalent bacteriophage strain specific for bacteria of the genus 81 aryu1ossossi5, selected from 81 (PCM P / 00001), 82 (PCM P / 00002), 83 (PCM P / 00003), 84 (PCM P / 00004), 85 (PCM P / 00005), 86 (PCM P / 00006) and 87 (PCM P / 00007), optimally from 81, 82, 84 and 85, is an additional object of this invention.

Поливалентный штамм бактериофагов, специфичный для бактерий рода Ркеибошопак, выбираемый из числа Р1 (РСМ Р/00008), Р2 (РСМ Р/00009), Р3 (РСМ Р/00010), Р4 (РСМ Р/00011), Р5 (РСМ Р/00012), Р6 (РСМ Р/00013), Р7 (РСМ Р/00014), Р8 (РСМ Р/00015), Р9 (РСМ Р/00016), Р10 (РСМ Р/00017), Р11 (РСМ Р/00018), Р12 (РСМ Р/00019), Р13 (РСМ Р/00020), Р14 (РСМ Р/00021), Р15 (РСМ Р/00022), Р16 (РСМ Р/00023), Р17 (РСМ Р/00024), Р18 (РСМ Р/00025), Р19 (РСМ Р/00026) и Р20 (РСМ Р/00027), оптимально - из числа Р7, Р20 и Р6, также представляет собой объект данного изобретения.A multivalent bacteriophage strain specific for bacteria of the genus Rkeiboshopak, selected from among P1 (PCM P / 00008), P2 (PCM P / 00009), P3 (PCM P / 00010), P4 (PCM P / 00011), P5 (PCM P / 00012), P6 (PCM R / 00013), P7 (PCM R / 00014), P8 (PCM R / 00015), P9 (PCM R / 00016), P10 (PCM R / 00017), P11 (PCM R / 00018) , P12 (PCM P / 00019), P13 (PCM P / 00020), P14 (PCM P / 00021), P15 (PCM P / 00022), P16 (PCM P / 00023), P17 (PCM P / 00024), P18 (PCM P / 00025), P19 (PCM P / 00026) and P20 (PCM P / 00027), optimally from among P7, P20 and P6, is also an object of this invention.

В исследовании применяли принадлежащую авторам настоящего изобретения собственную коллекцию фагов, активных против видов бактерий, которые представляют собой наиболее частые этиологические факторы при бактериальных инфекциях у людей. Описанные практические примеры относятся к поливалентным бактериофагам, литически действующим на штаммы стафилококков (81арйу1ососси5 аигеик), включая их штаммы, устойчивые к метициллину, и синегнойную палочку (Ркеибошопак аегищпока), которые, в частности, обнаруживают у субъектов, пораженных муковисцидозом. Данные виды в настоящее время представляют собой причину серьезных инфекционных заболеваний, служащих причиной высокой смертности.The study used its own collection of phages that are active against the types of bacteria that are the most common etiological factors in bacterial infections in humans, which belong to the authors of the present invention. The described practical examples relate to multivalent bacteriophages lytically acting on strains of staphylococci (81 aryuosossi5 aigeyik), including their strains resistant to methicillin and Pseudomonas aeruginosa (Rkeiboshopak aegischpoca), which, in particular, are found in subjects affected by cystic fibrosis. These species are currently the cause of serious infectious diseases that cause high mortality.

Достоинства настоящего изобретенияAdvantages of the present invention

Введение в терапию препаратов поливалентных фагов, содержащих поливалентные фаги, полученные посредством данного изобретения, представляет собой главную разработку в борьбе с бактериальными инфекциями, которые не чувствительны к лечению антибиотиками. Также с данной новой технологией связаны определенные экономические преимущества. Она позволяет значительно уменьшить материальные издержки и сокращает время от отбора материала для проверки до получения терапевтического фагового препарата. Благодаря этому фаговый препарат будет ждать пациента, а не пациент - получения индивидуального фагового препарата.The introduction of polyvalent phage preparations containing polyvalent phages obtained by the present invention into therapy represents a major development in the fight against bacterial infections that are not sensitive to antibiotic treatment. There are also certain economic benefits associated with this new technology. It can significantly reduce material costs and shortens the time from the selection of material for testing to obtain a therapeutic phage preparation. Due to this, the phage preparation will wait for the patient, and not the patient, to receive an individual phage preparation.

- 4 007472- 4 007472

Широкий диапазон препаратов литических фагов, состоящих из нескольких поливалентных фагов, полученных посредством способа по настоящему изобретению, представляет собой очень важное преимущество с точки зрения их применения для лечения бактериальных инфекций. Хорошо известно, что в популяции бактерий с частотой примерно 1х10^-7 могут появляться формы, устойчивые к бактериофагу. В присутствии двух фагов частота такой мутации составляет примерно 1х10^-14, а трех фагов - только 1х10^-21. В такой обстановке проблемы бактериального штамма, устойчивого к фагам, практически не существует.A wide range of lytic phage preparations consisting of several polyvalent phages obtained by the method of the present invention represents a very important advantage in terms of their use for treating bacterial infections. It is well known that forms resistant to bacteriophage can appear in a bacterial population with a frequency of about 1x10 ^-7 . In the presence of two phages, the frequency of such a mutation is approximately 1x10 ^-14 , and of three phages only 1x10 ^-21 . In such an environment, the problems of a bacterial strain resistant to phages practically do not exist.

Большая применимость приведенных в примерах лекарственных средств, состоящих из поливалентных фагов, заслуживает особого упоминания. Их, как правило, можно применять в медицинской практике, и они предоставляют эффективные средства для борьбы с грозными бактериальными инфекциями. Также возможно применять фаги, полученные по данному изобретению, в препаратах лекарственных средств для внешнего применения, применяя их, например, для лечения и профилактики дерматологических инфекционных заболеваний. Обнаружено, что пероральное введение фаговых лизатов, полученных по данному изобретению, увеличивает устойчивость к возможным будущим бактериальным инфекциям.The great applicability of the multivalent phage medications given in the examples deserves special mention. They can usually be used in medical practice, and they provide effective means to combat formidable bacterial infections. It is also possible to use the phages obtained according to this invention in drugs for external use, using them, for example, for the treatment and prevention of dermatological infectious diseases. It has been found that the oral administration of phage lysates obtained according to this invention increases resistance to possible future bacterial infections.

В некоторых случаях лечение фагами можно применять в сочетании с лечением антибиотиками.In some cases, phage treatment can be used in combination with antibiotic treatment.

Препараты поливалентных фагов, применяемые для лечения бактериальных инфекций, показали высокую эффективность. Особую эффективность наблюдали при лечении сепсиса (показатель эффективности лечения - 88%) и при лечении инфекционных заболеваний у пациентов с муковисцидозом.Polyvalent phage preparations used to treat bacterial infections have been shown to be highly effective. Particular efficacy was observed in the treatment of sepsis (the cure rate is 88%) and in the treatment of infectious diseases in patients with cystic fibrosis.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На фиг. 1 представлены результаты анализа статистики, полученные для фагов 81-87.In FIG. 1 presents the results of the analysis of statistics obtained for phages 81-87.

На фиг. 2 представлены результаты анализа статистики, полученные для фагов Р1-Р20.In FIG. 2 presents the results of the analysis of statistics obtained for phages P1-P20.

На фиг. 3 представлены результаты статистического анализа эффективности выбранных фаговых штаммов в отношении бактериальных штаммов, принадлежащих роду 81арйу1ососсн5. выделенных у пациентов с муковисцидозом.In FIG. Figure 3 presents the results of a statistical analysis of the effectiveness of the selected phage strains with respect to bacterial strains belonging to the genus 81 aryuosossn5. isolated in patients with cystic fibrosis.

На фиг. 4 представлены результаты статистического анализа эффективности выбранных фаговых штаммов в отношении бактериальных штаммов, принадлежащих роду Ркеийошопак, выделенных у пациентов с муковисцидозом.In FIG. 4 presents the results of a statistical analysis of the effectiveness of selected phage strains in relation to bacterial strains belonging to the genus Rkeyoshoshak isolated in patients with cystic fibrosis.

Для лучшего понимания сущности данного изобретения его иллюстрируют ниже посредством примеров.For a better understanding of the essence of the present invention, it is illustrated below by way of examples.

Пример 1. Выделение бактериофагов.Example 1. Isolation of bacteriophages.

Бактериофаги для 81арЬу1ососси§ и Ркеийошопак выделяли из городских сточных вод. Сточные воды пропускали через мембранный фильтр с размером пор 0,2-0,4 мкм, который задерживает бактерии, но позволяет пройти бактериофагам. К полученному фильтрату добавляли концентрированную жидкую культуральную среду, и различные разведения фильтрата смешивали с молодой бульонной культурой бактерий (81арйу1ососсн5 аитеик или Ркеийошопак аетидшока). Образцы инкубировали 1 ч при 37°С, после чего пипеткой извлекали по 0,2 мл суспензии из каждого образца и осуществляли посев на чашки, содержащие среду с агаром, с применением стеклянного шпателя, и инкубировали чашки в течение ночи при 37°С. В случае, если искомый фаг присутствовал на чашках, инокулированных соответствующим разведением фильтрата, содержащим молодую бактериальную культуру, наблюдали непрерывный (мутный) бактериальный газон и отдельные прозрачные маленькие поля, так называемые стерильные пятна, которые обычно содержат несколько миллионов фаговых частиц. Отдельные стерильные пятна вместе с окружающим их агаром вырезали с помощью платиновой петли, затем переносили в свежую бульонную культуру бактерий и инкубировали до тех пор, пока культура не становилась прозрачной. После пропускания лизата через мембранный фильтр с размером пор 0,2-0,4 мкм, который удерживает любые бактерии, оставшиеся в лизате, фильтрат содержал только бактериофаги. Посев других разведений полученных фагов с соответствующими бактериями на среду с агаром и повторное выделение стерильных пятен проводили 5 раз, что позволяло получить чистую линию фагов.Bacteriophages for 81 apyyosossi§ and Rkheioshopak were isolated from urban wastewater. Sewage was passed through a membrane filter with a pore size of 0.2-0.4 μm, which retains bacteria, but allows bacteriophages to pass. Concentrated liquid culture medium was added to the obtained filtrate, and various dilutions of the filtrate were mixed with a young broth culture of bacteria (81 aryuossosn5 aiteik or Rkeiyoshopak aetidshoka). Samples were incubated for 1 h at 37 ° C, after which 0.2 ml of suspension was removed by pipette from each sample and plated on plates containing agar medium using a glass spatula and the plates were incubated overnight at 37 ° C. If the desired phage was present on plates inoculated with appropriate dilution of the filtrate containing the young bacterial culture, a continuous (cloudy) bacterial lawn and separate transparent small fields, the so-called sterile spots, which usually contain several million phage particles, were observed. Separate sterile spots along with the agar surrounding them were excised using a platinum loop, then transferred to a fresh broth culture of bacteria and incubated until the culture became transparent. After passing the lysate through a membrane filter with a pore size of 0.2-0.4 μm, which retains any bacteria remaining in the lysate, the filtrate contained only bacteriophages. Sowing other dilutions of the obtained phages with the corresponding bacteria on agar medium and re-isolation of sterile spots was carried out 5 times, which allowed to obtain a clean phage line.

Пример 2. Определение чувствительности штаммов 81арйу1ососсн5 аитеик к бактериофаговым микроорганизмам, специфичным для них.Example 2. Determination of the sensitivity of strains of 81 aryuossosn5 aiteik to bacteriophage microorganisms specific to them.

Чувствительность определяли с применением культуральной среды, описанной у \У11а1. Чашки с данной средой сушили 30 мин при температуре 37°С, покрывали молодой 4-х часовой бульонной культурой 81ар11у1ососси5 аигеик, которую перемешивали посредством встряхивания, избыток суспензии удаляли пипеткой и снова сушили 30 мин при температуре 37°С. На одной чашке, разделенной на 6 сегментов, определяли чувствительность изучаемого штамма к 6 различным, но специфическим бактериофагам. Одну каплю разведения бактериофагов 1/10 наносили на поверхность каждого сегмента. Чашки инкубировали в термостате примерно 4 ч при 37°С, после чего их помещали в холодильник до следующих суток. В случае высокой чувствительности штамма к определенному фагу на месте внесения фага на культуральную среду, которая была равномерно покрыта бактериальным газоном, видны прозрачные поля, являющиеся результатом полного разрушения бактериальных клеток (лизиса). Меньшая чувствительность штамма проявлялась появлением отдельных стерильных пятен.Sensitivity was determined using the culture medium described in \ U11a1. Cups with this medium were dried for 30 min at a temperature of 37 ° C, covered with a young 4-hour broth culture 81ar11u1ossoss5 aigeeik, which was stirred by shaking, the excess suspension was removed with a pipette and again dried for 30 min at a temperature of 37 ° C. On one cup, divided into 6 segments, the sensitivity of the studied strain to 6 different but specific bacteriophages was determined. One drop of 1/10 bacteriophage dilution was applied to the surface of each segment. The cups were incubated in a thermostat for about 4 hours at 37 ° C, after which they were placed in the refrigerator until the next day. In the case of high sensitivity of the strain to a specific phage at the site of introduction of the phage onto the culture medium, which was uniformly covered with a bacterial lawn, transparent fields are visible that are the result of complete destruction of bacterial cells (lysis). Less strain sensitivity was manifested by the appearance of individual sterile spots.

- 5 007472- 5 007472

Пример 3. Определение чувствительности штаммов Рзеибошопаз к бактериофаговым микроорганизмам, специфичным для них.Example 3. Determination of the sensitivity of strains of Rzheiboshopaz to bacteriophage microorganisms specific to them.

Способ определения чувствительности являлся сходным со способом, описанным в примере 2. Однако в данном случае исходная среда представляла собой агар с добавлением фосфатного буфера, а время инкубации чашек с нанесенным фагом составляло 5 ч.The method for determining the sensitivity was similar to the method described in example 2. However, in this case, the initial medium was agar with the addition of phosphate buffer, and the incubation time of the plates with the applied phage was 5 hours.

Пример 4. Отбор фагов с широчайшим спектром активности в отношении штаммов 81арйу1ососси8 и Рзеибошопаз - получение поливалентных фаговых штаммов.Example 4. The selection of phages with the broadest spectrum of activity against strains 81 aryuosossi8 and Rzheiboshopaz - obtaining multivalent phage strains.

Бактериофаги выделяли по способу, описанному в примере 1. Определяли чувствительность к фагам из коллекции бактериофагов, специфичных к 81арйу1ососси8, 845 лекарственно-устойчивых клинических штаммов различных видов 81арйу1ососси8, выделенных по всей Польше, и чувствительность к фагам из коллекции бактериофагов, специфичных к Рзеибошопаз, 880 лекарственно-устойчивых клинических штаммов различных видов Рзеибошопаз.Bacteriophages were isolated according to the method described in example 1. The sensitivity to phages from the collection of bacteriophages specific for 81 aryosossi8, 845 drug-resistant clinical strains of various types of 81 aryuosossi8 isolated throughout Poland, and the sensitivity to phages from a collection of bacteriophages specific for Rzheobaz were determined. drug-resistant clinical strains of various types of Rzheiboshopaz.

Анализ чувствительности в обеих группах штаммов к соответствующим фагам позволил выбрать фаги с неожиданно высокой активностью и широким спектром литического действия. Данные фаги представлены в табл. 1 и 2.An analysis of the sensitivity in both groups of strains to the corresponding phages made it possible to select phages with unexpectedly high activity and a wide spectrum of lytic action. These phages are presented in table. 1 and 2.

Таблица 1. Фаги с высокой литической активностью для 81арйу1ососси8 в депозитарии польской коллекции микроорганизмов (РСМ), Вроцлав, ПольшаTable 1. Phages with high lytic activity for 81 aryu1ossossi8 in the depository of the Polish collection of microorganisms (PCM), Wroclaw, Poland

Таблица 2. Фаги с высокой литической активностью для Рзеибошопаз в депозитарии польской коллекции микроорганизмов (РСМ), Вроцлав, ПольшаTable 2. Phages with high lytic activity for Rzheiboshopaz in the depository of the Polish Microorganism Collection (PCM), Wroclaw, Poland

Обозначение фагаPhage designation

ИAND

Польская коллекция микроорганизмов (РСМ) Номер доступа в депозитарииPolish Microorganism Collection (PCM) Depository Access Number

Е/00008E / 00008

Р2P2

Е/00009E / 00009

РЗRZ

Е/00010E / 00010

Р4P4

Е/00011E / 00011

Р5P5

Е/00012E / 00012

Р6P6

Е/00013E / 00013

Р7P7

Е/00014E / 00014

Р8P8

Е/00015E / 00015

Р9P9

Е/00016E / 00016

РЮRyu

Е/00017E / 00017

Р11P11

Е/00018E / 00018

Р12P12

Е/00019E / 00019

Р13P13

Е/00020E / 00020

Р14P14

Е/00021E / 00021

Р15P15

Е/00022E / 00022

Р16P16

Е/00023E / 00023

Р17P17

Е/00024E / 00024

Р18P18

Е/00025E / 00025

Р19P19

Е/00026E / 00026

Р20P20

Е/00027E / 00027

- 6 007472- 6 007472

Результаты для фагов 81-87 и Р1-Р20 подвергали статистическому анализу для определения того, можно ли рассматривать полученные для конкретных фагов значения р как корректные для общих популяций соответствующих родов бактерий. Результаты представлены на фиг. 1 и 2. Подсчитанные значения η для большинства бактериофагов оказались меньше, чем число бактериальных штаммов в исследуемой выборке, что означает, что диапазон литического спектра корректен, по меньшей мере, по отношению к клиническим штаммам, обнаруживаемым в Польше.The results for phages 81-87 and P1-P20 were subjected to statistical analysis to determine whether the p values obtained for specific phages can be considered as correct for the general populations of the corresponding bacterial genera. The results are presented in FIG. 1 and 2. The calculated η values for most bacteriophages turned out to be less than the number of bacterial strains in the studied sample, which means that the range of the lytic spectrum is correct, at least with respect to the clinical strains found in Poland.

Принимая во внимание данные результаты, фаги, перечисленные в табл. 1 и 2, можно рассматривать как поливалентные фаги по данному изобретению.Taking into account these results, phages listed in table. 1 and 2, can be considered as polyvalent phages according to this invention.

В случае фагов для 81арйу1ососси5 3 из 1 наиболее активных, т.е. 81, 82 и 84 или 85, неожиданно обнаружили литическую активность в отношении 95% изучаемых штаммов 81арйу1ососси5. Также 3 из 21 выбранных для Ркеийошопак фагов, т.е. Р7, Р20 и Р6, обнаружили литическую активность в отношении 87% изучаемых штаммов Ркеийошопак.In the case of phages for 81 aryu1ossossi5, 3 out of 1 are the most active, i.e. 81, 82 and 84 or 85, unexpectedly found lytic activity against 95% of the studied strains of 81 aryuosossi5. Also 3 out of 21 phages selected for Rkeyoshopak, i.e. P7, P20 and P6, found lytic activity against 87% of the studied Rkeyoshopak strains.

Пациентов, страдающих муковисцидозом, также можно рассматривать как данный регион возникновения бактериальной инфекции, как определено в сущности изобретения. При изучении патогенных микроорганизмов, появляющихся у данной группы пациентов, использовали 137 бактериальных штаммов, из которых 84 идентифицировали как Ркеийошопак и 53 - как 8. аитеик. Все штаммы выделяли из материала, полученного от пациентов с муковисцидозом со всей Польши. Анализ чувствительности штаммов Ркеийошопак и 8. аитеик к фагам позволил выбрать фаги с наивысшей литической активностью и широчайшим диапазоном действия.Patients suffering from cystic fibrosis can also be considered as this region of the occurrence of bacterial infection, as defined in the essence of the invention. In the study of pathogenic microorganisms appearing in this group of patients, 137 bacterial strains were used, of which 84 were identified as Rkheioshopak and 53 as 8. aiteic. All strains were isolated from material obtained from cystic fibrosis patients from all over Poland. An analysis of the sensitivity of the Rkeyoshoshak and 8. aiteik strains to phages made it possible to select phages with the highest lytic activity and the widest range of action.

В случае фагов для Ркеийошопак 3 из 21 активных фагов, т.е. Р/00010, Р/00013 и Р/00018, неожиданно показали литическую активность в отношении 75% штаммов Ркеийошопак (для вероятности успеха см. фиг. 3, на которой фаг 3 = Р/00010, фаг 6 = Р/00013 и фаг 11 = Р/00018). Среди выбранных для 81арйу1ососси8 фагов 3, т.е. Р/00002, Р/00004 и Р/00007, показали литическую активность в отношении 98% штаммов 81арйу1ососси5 (для вероятности успеха см. фиг. 4, на которой фаг 1 = Р/00002, фаг 3 = Р/00004 и фаг 4 = Р/00007).In the case of phages for Rkeyoshoshopak, 3 out of 21 active phages, i.e. P / 00010, P / 00013, and P / 00018 unexpectedly showed lytic activity against 75% of the Rkeyoshopak strains (for success, see Fig. 3, in which phage 3 = P / 00010, phage 6 = P / 00013 and phage 11 = P / 00018). Among the phages 3 selected for 81 aryu1ossossi8, i.e. P / 00002, P / 00004 and P / 00007, showed lytic activity against 98% of the strains 81 aryu1ossossi5 (for the probability of success see Fig. 4, in which phage 1 = P / 00002, phage 3 = P / 00004 and phage 4 = P / 00007).

Пример 5. Репликация фагов 81арйу1ососси5 и фагов грамотрицательных бацилл, получение фаговых лизатов.Example 5. Replication of phages 81aryu1ossossi5 and phages of gram-negative bacilli, obtaining phage lysates.

Примерно 5% фагового лизата добавляли в молодые 4-часовые культуры 81арйу1ососси8 аитеик (логарифмическая фаза) в бульонной культуре, дополненной глюкозой. Тестовые пробирки или колбы перемешивали посредством встряхивания и 3 ч инкубировали при 37°С. После возникновения прозрачной культуры (лизис) образцы выдерживали на холоде до следующих суток. Лизат пропускали через мембранный фильтр с размером пор 0,2-0,4 мкм для удаления любых оставшихся нелизированных бактериальных клеток. Концентрацию живых фаговых частиц определяли двухслойным способом Сгайа. Контролем служила инкубируемая культура без добавления фагового лизата.Approximately 5% of the phage lysate was added to the young 4-hour cultures of 81 aryuossossiteite (logarithmic phase) in a broth culture supplemented with glucose. Test tubes or flasks were mixed by shaking and incubated for 3 hours at 37 ° C. After the appearance of a transparent culture (lysis), the samples were kept in the cold until the next day. The lysate was passed through a 0.2-0.4 μm membrane filter to remove any remaining non-lysed bacterial cells. The concentration of live phage particles was determined by a two-layer Sgaya method. The control was an incubated culture without the addition of phage lysate.

Репликация фагов грамотрицательных бацилл (Ркеийошопак)Replication of phages of gram-negative bacilli (Rkeiyoshopak)

Для репликации фагов Ркеийошопак использовали пептонную воду. 5% фагового лизата добавляли в молодые 4-часовые культуры Ркеийошопак аетидшока, тестовые пробирки или колбы перемешивали посредством встряхивания и образцы 5 ч инкубировали при 37°С. После возникновения прозрачной культуры образцы оставляли в холодильнике до следующих суток, после чего их пропускали через мембранный фильтр с размером пор, как указано выше. Концентрацию живых фаговых частиц в лизате определяли способом СтаИа.Peptide water was used to replicate the Rkeyoshoshak phages. 5% phage lysate was added to young 4-hour Rkeyoshopak aetidshock cultures, test tubes or flasks were mixed by shaking and the samples were incubated for 5 h at 37 ° C. After the appearance of a transparent culture, the samples were left in the refrigerator until the next day, after which they were passed through a membrane filter with a pore size, as described above. The concentration of live phage particles in the lysate was determined by the StAa method.

Стерильные бульонные фаговые лизаты демонстрируют продолжительную литическую активность. Когда их содержат в холоде, они сохраняют свою жизнеспособность несколько лет, в некоторых случаях свыше 10 лет.Sterile broth phage lysates exhibit prolonged lytic activity. When they are kept in the cold, they remain viable for several years, in some cases over 10 years.

Пример 6. Получение и применение препаратов поливалентных фагов.Example 6. Obtaining and using preparations of polyvalent phages.

Стерильный бульонный лизат, полученный способом, описанным в примере 5, создаваемый выбранными в примере 4 фагами, с широким спектром литической активности, или их концентрированными или дополнительно очищенными формами (см. следующий пример), использовали для получения лекарственных средств на основе поливалентных фагов.The sterile broth lysate obtained by the method described in example 5, created by the phages selected in example 4, with a wide spectrum of lytic activity, or their concentrated or additionally purified forms (see the following example), was used to obtain drugs based on polyvalent phages.

Иллюстрируемый препарат поливалентного фага 81арйу1ососси5 представляет собой смесь, содержащую различные количества лизатов фагов 81, 82 и 84 или 85 или производные данных лизатов. Для инфекционных заболеваний, вызываемых 81арйу1ососси5, для пациентов с муковисцидозом, следует применять препараты из фагов Р/00002, Р/00004 и Р/00007.The illustrated preparation of the polyvalent phage 81aryu1ossossi5 is a mixture containing various amounts of phage 81, 82 and 84 or 85 lysates or derivatives of these lysates. For infectious diseases caused by 81aryuosossi5, for patients with cystic fibrosis, preparations from phages P / 00002, P / 00004 and P / 00007 should be used.

Иллюстрируемый препарат поливалентного фага Ркеийошопак представляет собой смесь, содержащую различные количества лизатов фагов Р7, Р20 и Р6 или производные данных лизатов. Для инфекционных заболеваний, вызываемых Ркеийошопак, для пациентов с муковисцидозом, следует применять препараты из фагов Р/00010, Р/00013 и Р/00018.The illustrated preparation of the polyvalent phage Rkeyiyoshopak is a mixture containing various amounts of lysates of phages P7, P20 and P6 or derivatives of these lysates. For infectious diseases caused by Rkeyyoshopak, for patients with cystic fibrosis, preparations from the phages P / 00010, P / 00013 and P / 00018 should be used.

Лекарственное средство вводят перорально 3 раза в сутки, в количествах, соответствующих 10 мл лизата, за 30 мин до еды, после предварительной нейтрализации жидкости желудка (например, посредством геля фосфата алюминия, очищенной соды или воды Виши). Когда препарат наносят непосредственно на раны, это следует делать 3 раза в течение 24 ч. При локальном применении раны не следует очищать дезинфицирующим средством, так как это может привести к инактивации фагов. Если необхоThe drug is administered orally 3 times a day, in amounts corresponding to 10 ml of lysate, 30 minutes before meals, after preliminary neutralization of the stomach fluid (for example, using aluminum phosphate gel, purified soda or Vichy water). When the drug is applied directly to the wounds, this should be done 3 times within 24 hours. When applied locally, the wounds should not be cleaned with a disinfectant, as this can lead to inactivation of phages. If necessary

- 7 007472 димо, раны можно очистить стерильной культуральной средой или физиологическим раствором 0,9% ИаС1.- 7 007472 dimo, wounds can be cleaned with a sterile culture medium or with physiological saline 0.9% IaS1.

Препараты поливалентных фагов, применяемые для лечения бактериальных инфекций, демонстрируют высокую эффективность. Особую эффективность наблюдали при лечении сепсиса (показатель эффективности лечения - 88%) и инфекционных заболеваний, возникающих у пациентов с муковисцидозом.Polyvalent phage preparations used to treat bacterial infections demonstrate high efficacy. Particular effectiveness was observed in the treatment of sepsis (treatment efficiency indicator - 88%) and infectious diseases that occur in patients with cystic fibrosis.

Пример 7. Дополнительная очистка препаратов бактериофагов, удаление эндотоксина из содержащих бактериофаги смесей.Example 7. Additional purification of bacteriophage preparations, removal of endotoxin from mixtures containing bacteriophages.

Для отдельных применений в медицине или также из-за способов введения (например, внутривенной) требуются препараты бактериофагов высокой чистоты, в особенности те, которые лишены бактериального эндотоксина. Следуя способу по данному изобретению, использовали аффинность бактериофагов к субстрату, содержащему целлюлозу или, оптимально, ее этерифицированное производное. В данном примере применяли коммерчески доступное сульфатированное производное целлюлозы, которое характеризуется низким уровнем этерификации (8 мкмоль/мл геля). Субстрат применяли для удаления эндотоксина из содержащей бактериофаги смеси. После промывки субстрата и удаления эндотоксина следующая стадия очистки представляет собой элюцию адсорбированных бактериофагов.For individual medical applications or also because of the route of administration (for example, intravenous), high-purity bacteriophage preparations are required, especially those lacking bacterial endotoxin. Following the method of this invention, the affinity of the bacteriophages to a substrate containing cellulose or, preferably, its esterified derivative, was used. In this example, a commercially available sulfated cellulose derivative was used that is characterized by a low level of esterification (8 μmol / ml gel). The substrate was used to remove endotoxin from the mixture containing bacteriophages. After washing the substrate and removing endotoxin, the next purification step is the elution of adsorbed bacteriophages.

Один мл субстрата, содержащего сульфатированное производное целлюлозы, помещали в стерильную колонку хроматографа. Утечку субстрата из колонки предотвращали затыканием нижней части колонки стекловатой, пропитанной 70% этанолом.One ml of a substrate containing a sulfated cellulose derivative was placed in a sterile column of a chromatograph. Leakage of the substrate from the column was prevented by plugging the bottom of the column with glass wool impregnated with 70% ethanol.

Готовили следующие буферы для элюции:The following elution buffers were prepared:

Буфер I: 0,01М фосфатный буфер, рН 7,6;Buffer I: 0.01 M phosphate buffer, pH 7.6;

Буфер II: 0,01М фосфатный буфер, рН 7,6, содержащий 1М хлорид натрия.Buffer II: 0.01 M phosphate buffer, pH 7.6, containing 1 M sodium chloride.

Соли, входящие в состав элюента, прокаливали 1 час при 145°С.The salts included in the eluent were calcined for 1 hour at 145 ° C.

Растворы готовили с использованием дистиллированной апирогенной воды.Solutions were prepared using distilled pyrogen-free water.

Перед хроматографией 1 мл субстрата, набитый в хроматографическую колонку, промывали 5 мл буфера I и 5 мл буфера II.Before chromatography, 1 ml of the substrate, packed in a chromatographic column, was washed with 5 ml of buffer I and 5 ml of buffer II.

Колонку подготавливали для фактической хроматографии промыванием 10 мл буфера I.The column was prepared for actual chromatography by washing with 10 ml of buffer I.

Удаление эндотоксина проводили, используя высокомолекулярную фракцию, полученную в процедуре молекулярного сита на сефарозе 4В с применением концентрированного лизата бактериофагов Р§ РСМ Р/00018.The removal of endotoxin was carried out using the high molecular weight fraction obtained in the molecular sieve procedure on Sepharose 4B using a concentrated lysate of bacteriophage Pg PCM P / 00018.

0,2 мл смеси бактериофагов переносили на хроматографическую колонку, содержащую 1 мл субстрата, включающего сульфатированное производное целлюлозы. Собирали фракцию объемом 0,2 мл. Первую фракцию элюировали 3 мл буфера I. В этих условиях неассоциированный токсин вытекал из колонки. Вторую фракцию элюировали буфером II. Фракция II содержала очищенные бактериофаги.0.2 ml of the mixture of bacteriophages was transferred to a chromatographic column containing 1 ml of a substrate including a sulfated cellulose derivative. A 0.2 ml fraction was collected. The first fraction was eluted with 3 ml of buffer I. Under these conditions, the unassociated toxin flowed out of the column. The second fraction was eluted with buffer II. Fraction II contained purified bacteriophages.

Данные о единицах эндотоксина во фракциях:Data on units of endotoxin in fractions:

Материал, подвергшийся хроматографии на субстрате, содержащем сульфатированное производное целлюлозы, содержал 2500 единиц эндотоксина/мл. Фракция, элюируемая буфером I, содержала 6001000 единиц эндотоксина/мл, а та, которую элюировали буфером II, содержала бактериофаги, лишенные эндотоксина (примерно 1 единица/мл).Chromatography material on a substrate containing a sulfated cellulose derivative contained 2500 units of endotoxin / ml. The fraction eluted with buffer I contained 6001000 units of endotoxin / ml, and the fraction eluted with buffer II contained bacteriophages lacking endotoxin (approximately 1 unit / ml).

Содержание эндотоксина в препаратах бактериофагов определяли с применением гелевого способа компании С11аг1с5 Ктует ЕпбокаГе, С11аг1с51оп. И8Л.The content of endotoxin in preparations of bacteriophages was determined using the gel method of the company C11ag1c5 Ktuet EpbokaGe, C11ag1c51op. I8L.

Claims

1. A method of obtaining a polyvalent strain of a bacteriophage, characterized in that:

a) allocate a sufficient number (n) of bacterial pathogenic strains of a certain type randomly appearing in a given region, moreover, these bacterial strains are possibly drug resistant;

b) isolate a sufficient number of bacteriophage strains specific for at least one of the bacterial strains specified in a);

c) determine the lytic activity of the collected strains of the bacteriophage with respect to each isolated bacterial strain, calculate the p value, which is the ratio of the number of strains lysed by this phage to the number of all isolated bacterial strains;

b) for the obtained value of p test whether n satisfies the condition:

where q 1-p, b is a constant not greater than 0.1, optimally not more than 10% p, ζ _1-α is a random variable with a normal distribution, depending on the confidence probability 1-α, which is not less than 0 95;

- 8 007472

f) a bacteriophage strain is selected that satisfies the criteria disclosed in d) and has a p value of not less than 2 / p, preferably not less than 0.5.

2. The method according to claim 1, where in stage b) the strains of the bacteriophage are isolated from a sample originating from the environment by passing through a membrane filter with a pore size of 0.2-0.4 μm, the culture medium is added to the obtained filtrate and mixed with a culture of a certain type of bacterial strain, incubated for about one hour at a temperature of about 37 ° C, part of the suspension is taken and plated on plates with solid culture medium, incubated for 2 to 24 hours at about 37 ° C, a sample of the medium surrounding a separate a sterile spot is transferred to the broth culture of a bacterial strain of a certain type and incubated until the culture becomes transparent, and bacteriophage strains are obtained by passing the lysate through a 0.2-0.4 μm membrane filter, while plating on solid the culture medium and re-isolation of sterile spots are preferably repeated 5 times.

3. The method according to claim 1 or 2, where in step c) the test bacterial strain is inoculated with the corresponding solid medium onto which part of the bacteriophages obtained in step b) are transferred, incubated for about 4 hours at a temperature of about 37 ° C, then left at a temperature about 4 ° C for a period of about 2 to 24 hours, after which the lytic activity of the bacteriophage strain is determined based on the appearance of at least individual sterile spots.

4. The method according to claim 1, where the pathogenic bacterial strains are strains of the genera 81 aryuosossi5 or Rkeyiopach

5. The method according to claim 4, where the polyvalent bacteriophage strain selected in step e) is specific for drug-resistant bacterial strains of the genus 81ap11u1ossoss5. found in Poland, and is a strain of bacteriophages 81 (PCM E / 00001), 82 (PCM E / 00002), 83 (PCM E / 00003), 84 (PCM E / 00004), 85 (PCM E / 00005), 86 (PCM E / 00006) or 87 (PCM E / 00007).

6. The method according to claim 5, where the specified multivalent strain of the bacteriophage is found in patients with cystic fibrosis and is a strain 82 (PCM E / 00002), 84 (PCM E / 00004) or 87 (PCM E / 00007).

7. The method according to claim 4, where the polyvalent bacteriophage strain selected in step e) is specific for the drug-resistant bacterial strains of the genus Rkeyotopak found in Poland and is a bacteriophage strain P1 (PCM E / 00008), P2 (PCM E / 00009), P3 (PCM E / 00010), P4 (PCM E / 00011), P5 (PCM E / 00012), P6 (PCM E / 00013), P7 (PCM E / 00014), P8 (PCM E / 00015) , P9 (PCM E / 00016), P10 (PCM E / 00017), P11 (PCM E / 00018), P12 (PCM E / 00019), P13 (PCM E / 00020), P14 (PCM E / 00021), P15 (PCM E / 00022), P16 (PCM E / 00023), P17 (PCM E / 00024), P18 (PCM E / 00025), P19 (PCM E / 00026) or P20 (PCM E / 00027).

8. The method according to claim 7, where the specified multivalent strain of the bacteriophage is found in patients with cystic fibrosis and is a strain of P3 (PCM E / 00010), P6 (PCM E / 00013) or P11 (PCM E / 00018).

9. The method according to claim 2, comprising additional purification of the lysate, in particular of endotoxin, the mixture containing bacteriophages being brought into contact with a substrate containing cellulose or at least a partially esterified derivative thereof, then washed with a solution that removes impurities, in particular endotoxin, after which purified bacteriophages elute.

10. The method according to claim 9, where the elution of bacteriophages is carried out with water, a solution of a non-dissociating substance, a buffer or saline in a concentration of not more than 0.1 M, in particular buffered.

11. The method according to claim 10, where the concentration of the saline solution, in particular buffered, is from 0.05 to 0.1 M.

12. The method according to claim 9, where the elution of bacteriophages is carried out at a temperature of from -25 to + 100 ° C.

13. The method according to claim 9, where the elution of bacteriophages is carried out with a saline solution containing an organic solvent.

14. The method according to item 13, where the organic solvent is selected from the group comprising dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, isopropanol and acetone.

15. The method according to claim 9, where cellulose partially esterified with an organic or inorganic acid is used as a substrate.

16. The method according to clause 15, where the acid is acetic, nitric, sulfuric or phosphoric acid.

17. The method according to clause 15, where cellulose is used in which from 0.01 to 5% of glucose molecules are esterified, in particular from 0.25 to 1% of glucose molecules.

18. A drug for the treatment or prevention of infectious diseases caused by pathogenic bacteria, containing the polyvalent bacteriophage strain obtained by the method according to any one of claims 1-17.

19. The drug according to p. 18, where the specified multivalent strain of the bacteriophage is specific for drug-resistant bacterial strains of the genus 81aryu1ossossi5, found in Poland, and is strain 81 (PCM E / 00001), 82 (PCM E / 00002), 83 (PCM E / 00003), 84 (PCM E / 00004), 85 (PCM E / 00006), 86 (PCM E / 00006) and 87 (PCM E / 00007).

- 9 007472

20. The drug according to claim 19, characterized in that it serves for the treatment or prevention of infectious diseases that occur in patients with cystic fibrosis, and the specified multivalent strain of the bacteriophage is §2 (PCM P / 00002), 84 (PCM P / 00004) or 87 (PCM P / 00007).

21. The drug according to claim 18, wherein said polyvalent bacteriophage strain is specific for drug-resistant bacterial strains of the genus Rzspyoshopaz. found in Poland, and is a strain of P1 (PCM P / 00008), P2 (PCM P / 00009), P3 (PCM P / 00010), P4 (PCM P / 00011), P5 (PCM P / 00012), P6 ( PCM P / 00013), P7 (PCM P / 00014), P8 (PCM P / 00015), P9 (PCM P / 00016), P10 (PCM P / 00017), P11 (PCM P / 00018), P12 (PCM P / 00019), P13 (PCM P / 00020), P14 (PCM

P / 00021), P15 (PCM P / 00022), P16 (PCM P / 00023), P17 (PCM P / 00024), P18 (PCM P / 00025), P19 (PCM

P / 00026) and P20 (PCM P / 00027), in particular phages P7, P20 and P6.

22. The drug according to item 21, characterized in that it serves for the treatment or prevention of infectious diseases that occur in patients with cystic fibrosis, and the specified multivalent strain of the bacteriophage is P3 (PCM P / 00010), P6 (PCM P / 00013) P11 (PCM R / 00018).

23. The use of a polyvalent strain of a bacteriophage obtained by the method according to any one of claims 1-17, for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of infectious diseases caused by pathogenic bacteria.

24. The use according to claim 23, wherein said polyvalent strain of the bacteriophage is specific for drug-resistant bacterial strains of the genus 81 ApLu1ossoss found in Poland and is strain 81 (PCM P / 00001), 82 (PCM P / 00002), 83 ( PCM P / 00003), 84 (PCM P / 00004), 85 (PCM P / 00005), 86 (PCM P / 00006) or 87 (PCM P / 00007).

25. The application of paragraph 24, where the drug is intended for the treatment or prevention of infectious diseases that occur in patients with cystic fibrosis, and the specified multivalent strain of the bacteriophage is 82 (PCM P / 00002), 84 (PCM P / 00004) or 87 ( PCM P / 00007).

26. The application of claim 23, wherein said multivalent bacteriophage strain is specific for drug-resistant bacterial strains of the genus Rzeyoshopaz, found in Poland, and is a strain P1 (PCM P / 00008), P2 (PCM P / 00009), P3 ( PCM P / 00010), P4 (PCM P / 00011), P5 (PCM P / 00012), P6 (PCM P / 00013), P7 (PCM P / 00014), P8 (PCM P / 00015), P9 (PCM P / 00016), P10 (PCM P / 00017), P11 (PCM P / 00018), P12 (PCM P / 00019), P13 (PCM P / 00020), P14 (PCM P / 00021), P15 (PCM P / 00022 ), P16 (PCM P / 00023), P17 (PCM P / 00024), P18 (PCM P / 00025), P19 (PCM P / 00026) and P20 (PCM P / 00027), in particular phages P7, P20 and P6 .

27. The use according to p. 26, where the drug is intended for the treatment or prevention of infectious diseases that occur in patients with cystic fibrosis, and the specified multivalent strain of the bacteriophage is P3 (PCM P / 00010), P6 (PCM P / 00013) or P11 ( PCM R / 00018).

28. Polyvalent strain of bacteriophage 81 (PCM P / 00001), 82 (PCM P / 00002), 83 (PCM P / 00003), 84 (PCM P / 00004), 85 (PCM P / 00005), 86 (PCM P / 00006) or 87 (RSM P / 00007), specific for drug-resistant bacterial strains of the genus 81aryu1ossossi5 found in Poland.

29. Polyvalent strain of bacteriophage P1 (PCM P / 00008), P2 (PCM P / 00009), P3 (PCM P / 00010), P4 (PCM P / 00011), P5 (PCM P / 00012), P6 (PCM P / 00013), P7 (PCM R / 00014), P8 (PCM R / 00015), P9 (PCM R / 00016), P10 (PCM R / 00017), P11 (PCM R / 00018), P12 (PCM R / 00019) , P13 (PCM P / 00020), P14 (PCM P / 00021), P15 (PCM P / 00022), P16 (PCM P / 00023), P17 (PCM P / 00024), P18 (PCM P / 00025), P19 (PCM P / 00026) or P20 (PCM P / 00027) specific for drug-resistant bacterial strains of the genus Rzeyoshopaz, found in Poland.