JP5720045B2 - Staphylococcus aureus lytic bacteriophage - Google Patents
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Description
本発明は、スタフィロコッカス・アウレウス、（Staphylococcus aureus、以下、「S. aureus」と略記する場合がある。）を溶菌させる性質を有するバクテリオファージ（以下、単に「ファージ」(phage)と言う場合がある。）、及びその利用に関する。 The present invention relates to a bacteriophage having a property of lysing Staphylococcus aureus ( Staphylococcus aureus , hereinafter sometimes abbreviated as “ S. aureus ”) (hereinafter simply referred to as “phage”). ) And its use.
S. aureusは、ミクロコッカス科（Micrococcaceae）に属する嫌気性のグラム陽性球菌で、ヒトの鼻腔、咽頭、皮膚、腸管等に常在し、自然界にも広く分布している。S. aureusは細胞壁に、IgGに対する結合能を持つプロティンＡを持ち、また、コアグラーゼを産生する。プイロティンＡとコアグラーゼは、マクロファージ等の食作用を阻止することにより、S. aureusの宿主に対する感染を長引かせる。また、S. aureusは、創傷部から体内に侵入することにより化膿性疾患や、敗血症、肺炎、急性心内膜炎等を引き起こす。更に、S. aureusの産生する外毒素（エンテロトキシン）はヒトに対して食中毒を引き起こすことが知られている。更にまた、抗生物質に対する多剤耐性を獲得したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, ＭＲＳＡ）は、院内感染等の日和見感染を引き起すが、ＭＲＳＡは殆どの抗生物質が奏功せず、深刻な問題となっている。 S. aureus is an anaerobic Gram-positive cocci belonging to the Micrococcaceae family, and is resident in human nasal cavity, pharynx, skin, intestine, etc. and widely distributed in nature. S. aureus has protein A, which has the ability to bind IgG, on the cell wall and also produces coagulase. Pyrorotin A and coagulase prolong the infection of the host of S. aureus by blocking phagocytosis of macrophages and the like. S. aureus causes suppurative diseases, sepsis, pneumonia, acute endocarditis, etc. by invading the body from the wound. Furthermore, it is known that an exotoxin (enterotoxin) produced by S. aureus causes food poisoning to humans. Furthermore, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), which has acquired multidrug resistance to antibiotics, causes opportunistic infections such as nosocomial infections, but MRSA has failed to respond to most antibiotics, It has become a serious problem.
また、ウシの乳腺炎（乳房炎）は、乳牛の乳量や乳質の低下をもたらす疾患である。例えば日本における最大の牛乳生産地である北海道酪農場において、乳房炎が原因の経済的損失は約100億円／年にものぼる。乳房炎の原因菌は150種ほどが知られているが、中でも最も重要な病原菌がS. aureusである。S. aureusが原因菌である乳房炎（黄色ブドウ球菌性乳房炎）に対しては、抗生物質等で治療するのが一般的である。しかし、現在知られている抗生物質はS. aureusに特異的ではなく、また抗生物質による治療は、費用がかかるという問題点もある。また、上記したとおり、薬剤耐性を獲得したS. aureusが発見されているこもあり、新規な治療技術の開発が求められている。 Bovine mastitis (mastitis) is a disease that causes a decrease in milk yield and quality of dairy cows. For example, at Hokkaido Dairy Farm, the largest milk producer in Japan, the economic loss due to mastitis amounts to about 10 billion yen / year. About 150 types of mastitis are known, but the most important pathogen is S. aureus . Mastitis caused by S. aureus (S. aureus mastitis) is generally treated with antibiotics. However, currently known antibiotics are not specific for S. aureus, and antibiotic treatment is expensive. In addition, as described above, S. aureus that has acquired drug resistance has been discovered, and development of a novel therapeutic technique is required.
一方、バクテリオファージは細菌に感染するウイルスの総称である。バクテリオファージは宿主である細菌に感染すると、細菌内で増殖する。増殖した娘ファージは細菌の細胞壁から菌体外に放出され、また細菌は溶菌により死滅する。また、バクテリオファージは（１）宿主となる病原菌以外の細菌叢に影響を与えない、（２）増殖が簡単で、大量のバクテリオファージを安価に調製できる、等の利点がある。 On the other hand, bacteriophage is a general term for viruses that infect bacteria. When a bacteriophage infects a host bacterium, it grows in the bacterium. The propagated daughter phage is released from the cell wall of the bacteria to the outside of the cells, and the bacteria are killed by lysis. In addition, bacteriophage has advantages such as (1) that it does not affect the bacterial flora other than the pathogenic bacteria serving as a host, and (2) that growth is simple and a large amount of bacteriophage can be prepared at low cost.
そこで、このバクテリオファージを細菌の殺菌剤に利用するという取り組みもなされてきた。バクテリオファージを利用したS. aureusの殺菌に関する研究結果もいくつか報告されている。例えば、J. J. Gill, et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2006, 50(9), 2912-2918（非特許文献１）、S. O'Flaherty et al., J. Bact., 2005, 187(20), 7161−7164（非特許文献２）、D. M. Donovan et al., FEMS Microbiol. Lett., 2006, 265(1), 133−139（非特許文献３）等が挙げられる。しかしながら、バクテリオファージは宿主特異性が高く、同じ種(species)の細菌に対しても、株（strain）が異なれば感染しないという問題がある。上記の報告でも、それぞれ注目したあるバクテリオファージの、一つのS. aureus株に対する溶菌活性しか確認しておらず、複数のS. aureus株に対して溶菌活性を持つバクテリオファージは開示されていない。 Thus, efforts have been made to use this bacteriophage as a germicide. Several research results on bacteriophage sterilization of S. aureus have also been reported. For example, JJ Gill, et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2006, 50 (9), 2912-2918 (Non-Patent Document 1), S. O'Flaherty et al., J. Bact., 2005, 187 (20 ), 7161-7164 (Non-Patent Document 2), DM Donovan et al., FEMS Microbiol. Lett., 2006, 265 (1), 133-139 (Non-Patent Document 3). However, bacteriophage has a high host specificity, and there is a problem that bacteria of the same species (species) do not infect if the strain is different. Even in the above report, only a bacteriophage of a particular bacteriophage of interest has been confirmed against one S. aureus strain, and no bacteriophage having a lytic activity against a plurality of S. aureus strains is disclosed.
S. O'Flaherty et al., Appl. Env. Microbiol., 2005, 71 (4), 1836−1842（非特許文献４）には、複数のＭＲＳＡ株に対して溶菌活性を示すPhage Kが開示されている。しかし、本文献で検討されているファージは、海外で採取されたものであり、且つアメリカ、イギリス等の海外で採取されたS. aureus株に対する宿主域（host range）について検討している。しかし、この海外で採取されたPhage Kの日本国内で採取されたS. aureusに対する宿主域についての検討は行われていない。そのため、Phage Kが、日本国内に生息するS. aureusに対しても溶菌活性を持つか、また、該S. aureusに対してどのような宿主特異性を持つかについての知見を、この文献から得ることはできない。 Phage K showing lytic activity against multiple MRSA strains is disclosed in S. O'Flaherty et al., Appl. Env. Microbiol., 2005, 71 (4), 1836-1842. Has been. However, the phages examined in this document are those collected overseas, and the host range for S. aureus strains collected overseas such as the United States and the United Kingdom is examined. However, the host range for Phage K collected in Japan to S. aureus collected in Japan has not been studied. For this reason, knowledge about whether Phage K has lytic activity against S. aureus inhabiting in Japan and what host specificity it has for S. aureus is derived from this document. I can't get it.
バクテリオファージの宿主特異性の問題を解決するために、二種以上のバクテリオファージを組み合わせたカクテルを用いて、大腸菌（Escherichia coli）を殺菌する試みも行われている（Y. Tanji et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 64(2), 270-274、Masatoshi Yoichi et al., Biochemical Engineering Journal, 2004 19, 221-227）。しかし、複数のS. aureus株を、ファージカクテルを用いて殺菌できた、という報告は未だない。 In order to solve the problem of host specificity of bacteriophages, attempts have been made to sterilize Escherichia coli using a cocktail that combines two or more bacteriophages (Y. Tanji et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 64 (2), 270-274, Masatoshi Yoichi et al., Biochemical Engineering Journal, 2004 19, 221-227). However, there are no reports that multiple S. aureus strains could be sterilized using phage cocktails.
以上のことから、バクテリオファージを用いた、有効なS. aureusの殺菌方法等の確立が望まれている現状にあった。 From the above, the establishment of an effective method for sterilizing S. aureus using bacteriophage has been desired.
本発明は、複数のS. aureus株を溶菌させる性質を有するバクテリオファージ、及び該バクテリオファージを用いて、S. aureusを効果的に除去する方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a bacteriophage having a property of lysing a plurality of S. aureus strains, and a method for effectively removing S. aureus using the bacteriophage.
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたもので、以下の構成よりなる。
（１）受託番号 NITE BP-693及びNITE BP-694から選ばれる、スタフィロコッカス・アウレウスを溶菌させる性質を有するバクテリオファージ。
（２）受託番号 NITE BP-693及びNITE BP-694から選ばれるスタフィロコッカス・アウレウスを溶菌させる性質を有するバクテリオファージを含有する、バクテリオファージ組成物。
（３）受託番号 NITE BP-693及びNITE BP-694から選ばれるスタフィロコッカス・アウレウスを溶菌させる性質を有するバクテリオファージ組成物を適用することを特徴とする、スタフィロコッカス・アウレウスの増殖防止方法。
The present invention has been made for the purpose of solving the above-described problems, and has the following configuration.
(1) A bacteriophage having the property of lysing Staphylococcus aureus, selected from the deposit numbers NITE BP-693 and NITE BP-694.
(2) A bacteriophage composition comprising a bacteriophage having a property of lysing Staphylococcus aureus selected from Accession Nos. NITE BP-693 and NITE BP-694.
(3) A method for preventing the growth of Staphylococcus aureus, comprising applying a bacteriophage composition having a property of lysing Staphylococcus aureus selected from accession numbers NITE BP-693 and NITE BP-694 .
本発明者等は、上記した如き課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、複数のS. aureus株に対する感染性をもつバクテリオファージを単離することに成功した。そして、該バクテリオファージを利用すれば、S. aureusを効果的に除菌できることを見出し、本発明を完成するに到った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have succeeded in isolating a bacteriophage having infectivity against a plurality of S. aureus strains. And when this bacteriophage was utilized, it discovered that S. aureus could be disinfected effectively and came to complete this invention.
本発明のバクテリオファージは、S. aureusの複数の株に対して、感染性と、高い溶菌活性を示す。また、本発明のバクテリオファージは、ＭＲＳＡに対しても溶菌活性を示す。そこで、本発明のバクテリオファージを用いれば、ＭＲＳＡを含むS. aureusの有効な除菌剤や、これらの病原細菌による感染症の予防剤、治療剤等を提供することができる。 The bacteriophage of the present invention exhibits infectivity and high lytic activity against multiple strains of S. aureus . The bacteriophage of the present invention also shows lytic activity against MRSA. Therefore, by using the bacteriophage of the present invention, it is possible to provide an effective sterilizing agent for S. aureus containing MRSA, a preventive agent or a therapeutic agent for infections caused by these pathogenic bacteria.
例えば、哺乳動物がS. aureusに感染することで引き起こされる表皮感染症や食中毒、肺炎、髄膜炎、関節炎、敗血症、乳腺炎等の感染症（疾患）に対して、有効な予防剤、治療剤等を提供することが出来る。 For example, effective preventives and treatments for infections (diseases) such as epidermal infections, food poisoning, pneumonia, meningitis, arthritis, sepsis, mastitis caused by infection of mammals with S. aureus An agent etc. can be provided.
尚、バクテリオファージは、対応する宿主が存在すれば、その宿主に感染し、爆発的に増殖する。しかし、バクテリオファージは宿主が存在しなければ、単独では増殖できない。また宿主特異性が高いため、その特定の宿主がバクテリオファージによってすべて溶菌されて死滅してしまえば、そのバクテリオファージも増殖することはできないし、他の細菌等の宿主に感染することもできない。したがって、例えば牛の飼育施設等に、本発明のバクテリオファージ組成物を散布してS. aureusの除菌処理を行った後、更にバクテリオファージを除く何らかの処理を行う必要はない。以上の点で、本発明のバクテリオファージ組成物は、環境及び宿主に悪影響を及ぼすことがなく、安全で、使用し易いという利点を有する。 In addition, if a corresponding host exists, the bacteriophage infects the host and proliferates explosively. However, bacteriophages cannot grow alone without a host. Further, since the host specificity is high, if the specific host is completely lysed and killed by the bacteriophage, the bacteriophage cannot grow, nor can it infect other bacteria or other hosts. Therefore, for example, after the bacteriophage composition of the present invention is sprayed on cattle breeding facilities and the like to disinfect S. aureus , it is not necessary to carry out any treatment other than bacteriophage. In view of the above, the bacteriophage composition of the present invention has the advantage of being safe and easy to use without adversely affecting the environment and the host.
本発明のバクテリオファージは、2008年12月25日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 特許微生物寄託センター（郵便番号 292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、受託番号 NITE BP-693として寄託してある。本発明者等は、このバクテリオファージを「φSA012」と命名した。 The bacteriophage of the present invention was founded on December 25, 2008 on the Patent Microorganism Depositary Center, Biotechnology Headquarters, National Institute of Technology and Evaluation (Postal Code 292-0818, 2-5-Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) 8) is deposited under the deposit number NITE BP-693. We named this bacteriophage “φSA012”.
また本発明のバクテリオファージは、2008年12月25日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 特許微生物寄託センター（郵便番号 292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、受託番号 NITE BP-694として寄託してある。本発明者等は、このバクテリオファージを「φSA039」と命名した。 In addition, the bacteriophage of the present invention was founded on December 25, 2008 on the Patent Microorganism Depositary Center of Biotechnology Headquarters, National Institute of Technology and Evaluation (Postal Code 292-0818, 2-5 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan). -8), the deposit number is NITE BP-694. The inventors have named this bacteriophage “φSA039”.
本発明のバクテリオファージφSA012は、S. aureusを溶菌させる性質を有するものであって、少なくともS. aureusのSA001株, SA003株, SA009株, SA019株, SA020株, SA021株, SA026株, SA028株, SA029株, SA031株, SA033株, SA047株, SA048株, SA049株と、ATCC6538（基準株、laboratory reference strain）に溶菌活性を示すという、宿主特異性を有する。 The bacteriophage φSA012 of the present invention has a property of lysing S. aureus , and at least S. aureus strain SA001, SA003, SA009, SA019, SA020, SA021, SA026, SA028 , SA029 strain, SA031 strain, SA033 strain, SA047 strain, SA048 strain, SA049 strain and ATCC6538 (reference strain, laboratory reference strain) have host-specificity.
本発明のバクテリオファージφSA039は、S. aureusを溶菌させる性質を有するものであって、少なくともS. aureusのSA001株, SA002株, SA003株, SA009株, SA019株, SA020株, SA021株, SA026株, SA028株, SA029株, SA031株, SA033株, SA047株, SA048株, SA049株とATCC6538（基準株、laboratory reference strain）に溶菌活性を示すという、宿主特異性を有する。 The bacteriophage φSA039 of the present invention has a property to lyse S. aureus , and at least S. aureus strain SA001, SA002, SA003, SA009, SA019, SA020, SA021, SA026 , SA028 strain, SA029 strain, SA031 strain, SA033 strain, SA047 strain, SA048 strain, SA049 strain and ATCC6538 (reference strain, laboratory reference strain) and have host specificity.
尚、S. aureus のSA001株, SA002株, SA003株, SA009株, SA019株, SA020株, SA021株, SA026株, SA028株, SA029株, SA031株, SA033株, SA047株, SA048株, SA049株は、本発明者等が、乳腺炎（乳房炎）に感染した乳牛の原乳から分離した株である。 S. aureus SA001, SA002, SA003, SA009, SA019, SA020, SA021, SA026, SA026, SA029, SA031, SA033, SA047, SA048, SA049 Is a strain isolated by the present inventors from raw milk of dairy cows infected with mastitis (mastitis).
また、本発明のバクテリオファージφSA012は、S. aureusのMRSA Typing strainであるSA050 (GTC01186) 株, SA051 (GTC01187) 株, SA052 (GTC01213) 株, SA053 (GTC01217) 株, SA054 (GTC01221) 株に溶菌活性を示すという、宿主特異性を有する。 Further, the bacteriophage φSA012 of the present invention is lysed in S. aureus MRSA Typing strain SA050 (GTC01186) strain, SA051 (GTC01187) strain, SA052 (GTC01213) strain, SA053 (GTC01217) strain, SA054 (GTC01221) strain. It has host specificity to show activity.
また、本発明のバクテリオファージφSA039は、S. aureusのMRSA Typing strainであるSA050 (GTC01186) 株, SA052 (GTC01213) 株, SA053 (GTC01217) 株, SA054 (GTC01221) 株に溶菌活性を示すという、宿主特異性を有する。 Furthermore, bacteriophage φSA039 of the present invention, S. aureus is of MRSA Typing strain SA050 (GTC01186) strain, SA052 (GTC01213) strain, SA053 (GTC01217) strain, that shows the lytic activity SA054 (GTC01221) strain, the host Has specificity.
尚、SA050 (GTC01186) 株, SA051 (GTC01187) 株, SA052 (GTC01213) 株, SA053 (GTC01217) 株, SA054 (GTC01221) 株は、上記したとおり、S. aureusのMRSA Typing strainで、岐阜大学大学院医学研究科より分譲可能である。 The SA050 (GTC01186) strain, SA051 (GTC01187) strain, SA052 (GTC01213) strain, SA053 (GTC01217) strain, SA054 (GTC01221) strain are MRSA Typing strains of S. aureus as described above. It can be sold from the Graduate School.
また、透過型電子顕微鏡を用いた観察で、φSA012とφSA039は、ともにＴ４ファージと同程度の大きさで、且つ若干長いことが知られた。また、φSA012およびφSA039は、収縮性のシース（sheath）を持つことから、ミオビリデ科（Myoviridate family）に属するものと推察される。 Moreover, it was known by observation using a transmission electron microscope that both φSA012 and φSA039 were about the same size as T4 phage and slightly longer. Moreover, since φSA012 and φSA039 have a contractible sheath, it is assumed that they belong to the Myoviridate family.
本発明のバクテリオファージのその他の構造については、後述する実施例３に示す。 Other structures of the bacteriophage of the present invention are shown in Example 3 described later.
本発明のバクテリオファージは、一般家庭の下水流水や、下水処理施設から採取した排水等、あるいはS. aureusに感染した動物由来の血液，鼻腔，咽頭，皮膚，腸管等の生体試料から、S. aureusを宿主として用いたプラークアッセイ・分離方法等の常法により、分離・精製される。 Bacteriophage of the invention, sewage flowing water and household waste water and the like collected from a sewage treatment plant, or S. aureus in animals infected with blood from the nasal cavity, pharynx, skin, from a biological sample of intestinal etc., S. Separation and purification are performed by conventional methods such as plaque assay and separation method using aureus as a host.
例えば、一般家庭の下水流水から採取した排水を、10000〜15000rpmで10〜15分程度遠心分離して夾雑物を除いた後、例えばPEG6000及びNaClを加えてファージ粒子を沈殿させた後、更に10000〜15000rpmで10〜15分程度遠心分離する常法により、バクテリオファージを回収する。回収したバクテリオファージと、十分培養したS. aureusとを軟寒天に混合し、寒天培地上に広げる。27〜37℃で６時間〜一昼夜培養後、検出された軟寒天培地上の単一プラークを回収し、例えば、通常のプラーク形成法、ろ過、塩化セシウム(CsCl)密度勾配遠心等の密度勾配遠心分離等の常法で、バクテリオファージを単離する。また、超遠心分離、限外ろ過等の公知の方法で、更にバクテリオファージの精製処理を行ってもよい。 For example, the waste water collected from the sewage water of a general household is centrifuged at 10,000-15000 rpm for about 10-15 minutes to remove impurities, and after adding PEG6000 and NaCl, for example, to precipitate phage particles, further 10000 Bacteriophages are collected by a conventional method of centrifuging at ˜15000 rpm for about 10 to 15 minutes. The collected bacteriophage and well-cultured S. aureus are mixed with soft agar and spread on an agar medium. After culturing at 27-37 ° C. for 6 hours to overnight, a single plaque on the detected soft agar medium is collected and subjected to density gradient centrifugation such as normal plaque formation, filtration, and cesium chloride (CsCl) density gradient centrifugation. The bacteriophage is isolated by a conventional method such as separation. Further, the bacteriophage may be further purified by a known method such as ultracentrifugation or ultrafiltration.
本発明のバクテリオファージは、プレートライセート法等の一般的なバクテリオファージの増殖法で増殖させることができる。例えば、宿主となるS. aureusを培養し、十分に増殖させた後、本発明のバクテリオファージを接種し、出現したプラークを回収して更に培養を継続することにより、大量のバクテリオファージ溶液を得ることができる。 The bacteriophage of the present invention can be grown by a general bacteriophage growth method such as a plate lysate method. For example, after culturing and proliferating the host S. aureus sufficiently, inoculating the bacteriophage of the present invention, collecting the emerged plaque and continuing the cultivation, a large amount of bacteriophage solution is obtained. be able to.
本発明のバクテリオファージの宿主となるS. aureusの培養は、定法に従って行えばよい。例えば、S. aureusの培養に通常用いられる卵黄加マンニット食塩培地、ＬＢ培地、ブレインハートインヒュージョン培地などを用い、温度27〜37℃で培養すればよい。培養方法は、液体培養でも固体培地での培養でも良い。宿主の培地にバクテリオファージを接種する時期は、S. aureusが十分増殖している時期であれば特に限定されないが、菌体濃度が1×10５〜1×10７CFU/ml（CFU：colony forming units コロニー形成単位）程度まで増殖した時期（OD660が0.01〜1.0程度）に接種するのが望ましい。バクテリオファージ接種から６時間〜30時間程度の培養で、ほぼすべての菌が溶菌し、バクテリオファージ溶液を得ることができる。 Cultivation of S. aureus serving as a host for the bacteriophage of the present invention may be performed according to a conventional method. For example, an egg yolk-added mannitol salt medium, LB medium, brain heart infusion medium or the like usually used for culturing S. aureus may be used and cultured at a temperature of 27 to 37 ° C. The culture method may be liquid culture or culture in a solid medium. The timing of inoculating the host medium with bacteriophage is not particularly limited as long as S. aureus is sufficiently proliferating, but the bacterial cell concentration is 1 × 10 5 to 1 × 10 7 CFU / ml (CFU: colony). It is desirable to inoculate at the time of growth (OD 660 is about 0.01 to 1.0). Almost all of the bacteria are lysed by culturing for about 6 to 30 hours after bacteriophage inoculation, and a bacteriophage solution can be obtained.
本発明のバクテリオファージは、上述したようにS. aureusの複数の株に対して感染性と、高い溶菌活性を示し、S. aureusを死滅させる。また、本発明のバクテリオファージは、ＭＲＳＡに対しても溶菌活性を示し、ＭＲＳＡを死滅させる。そこで、本発明のバクテリオファージを用いれば、ＭＲＳＡを含むS. aureusの有効な除菌剤や、これらの病原細菌による感染症の予防剤、治療剤、院内感染の予防剤、治療剤等に利用できる。 Bacteriophage of the present invention, the infectious to multiple strains of S. aureus as described above, showed a high bacteriolytic activity, killing S. aureus. The bacteriophage of the present invention also shows lytic activity against MRSA and kills MRSA. Therefore, if the bacteriophage of the present invention is used, it can be used as an effective sterilizing agent for S. aureus containing MRSA, a preventive agent, a therapeutic agent for infectious diseases caused by these pathogenic bacteria, a preventive agent for nosocomial infections, a therapeutic agent, etc. it can.
例えば、哺乳動物がS. aureusに感染することで引き起こされる表皮感染症や食中毒、肺炎、髄膜炎、関節炎、敗血症、乳腺炎等の感染症に（疾患）対しても、有効な予防剤、治療剤等を提供することが出来る。
その一つの具体例として、本発明のバクテリオファージは、ウシ乳腺炎（乳房炎）由来S. aureusの複数の株に対しても高い溶菌活性を示し、ウシ乳腺炎由来S. aureusを死滅させることができる。従って、このバクテリオファージは、ウシ乳腺炎の予防、ウシ乳腺炎に感染したウシの治療、S. aureusで汚染されたウシの飼育施設等の除菌、駆除等、また感染予防のための使用に供することができる。
For example, an effective prophylactic agent against infections (diseases) such as epidermal infections and food poisoning caused by infection of mammals with S. aureus , pneumonia, meningitis, arthritis, sepsis, mastitis, A therapeutic agent or the like can be provided.
As one specific example, the bacteriophage of the present invention also exhibits high lytic activity against multiple strains of S. aureus derived from bovine mastitis (mastitis), and kills S. aureus derived from bovine mastitis. Can do. Therefore, this bacteriophage can be used for the prevention of bovine mastitis, the treatment of cattle infected with bovine mastitis, the sterilization and extermination of breeding facilities of cattle contaminated with S. aureus , and the prevention of infection. Can be provided.
本発明のバクテリオファージ組成物は、本発明のバクテリオファージを含有するものであればよい。例えば、上述した増殖方法によって得られるバクテリオファージ溶液や、バクテリオファージ溶液を遠心分離等によって培養残渣と分離したもの等が挙げられる。 The bacteriophage composition of the present invention only needs to contain the bacteriophage of the present invention. For example, the bacteriophage solution obtained by the growth method described above, or the bacteriophage solution separated from the culture residue by centrifugation or the like can be used.
本発明に係るバクテリオファージ組成物に含有される本発明のバクテリオファージの詳細は、上記したとおりである。また、本発明のバクテリオファージ組成物に含有される本発明のバクテリオファージは、それぞれ一種類（株、strain）でも、φSA012とφSA039とのバクテリオファージ混合液（ファージカクテル）であってもよい。また、更に他の適当なバクテリオファージ（註：S. aureusに対するもののみならず、他の適当な細菌に対するバクテリオファージでも可）を適宜混合してもよい。 The details of the bacteriophage of the present invention contained in the bacteriophage composition according to the present invention are as described above. In addition, the bacteriophage of the present invention contained in the bacteriophage composition of the present invention may be one kind (strain) or a bacteriophage mixed solution (phage cocktail) of φSA012 and φSA039. Furthermore, other appropriate bacteriophages (註: not only those against S. aureus but also bacteriophages against other appropriate bacteria) may be mixed as appropriate.
本発明のバクテリオファージ組成物中のバクテリオファージの濃度は、その使用形態により異なるが、液状の殺菌剤、除菌剤等として使用する場合は、1×105〜1×1011 PFU/ml（PFU：plaque forming unit プラーク形成単位）とするのが好ましく、1×108〜1×1010 PFU/mlとするのが更に好ましい。 The concentration of the bacteriophage in the bacteriophage composition of the present invention varies depending on the use form, but when used as a liquid disinfectant, disinfectant, etc., 1 × 10 5 to 1 × 10 11 PFU / ml ( PFU: plaque forming unit), preferably 1 × 10 8 to 1 × 10 10 PFU / ml.
本発明のバクテリオファージ組成物を構成するその他の材料は、本発明のバクテリオファージのS. aureusに対する感染性及び溶菌活性を失わせないようなものであれば、それぞれ殺菌剤、除菌剤、感染症の予防剤、治療剤等のそれぞれの用途に慣用のものを、それぞれ使用する態様に応じて適宜選択して用いることができる。 Other materials constituting the bacteriophage composition of the present invention can be used as long as they do not lose the infectivity and lytic activity of the bacteriophage of the present invention against S. aureus , respectively. Those commonly used for each use such as prophylactic and therapeutic agents for symptom can be appropriately selected and used depending on the mode of use.
例えば、S. aureusによる感染症やＭＲＳＡによる院内感染症等の治療及び予防剤などの医薬組成物等として使用する場合、その投与に適した製剤形態に調製される。例えば、注射剤等の液剤、粉剤、カプセル剤、リポソーム製剤、局所製剤、経皮パッチ等の製剤形態に調製したものでればよい。
また、各製剤は、医薬品分野で通常用いられる適当な担体と共に調製できる。例えば注射剤等の液剤として用いられる場合の担体や希釈剤としては、リン酸緩衝液等の緩衝液、生理食塩水，蒸留水その他の水性媒体、ポリエチレングリコール，プロピレングリコール，オレイン酸エチル等の注射可能な非水性媒体が挙げられる。また、これらの製剤には安定化剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、保存剤、抗酸化剤等を含んでいてもよい。
For example, when used as a pharmaceutical composition such as a therapeutic and prophylactic agent for infectious diseases caused by S. aureus and nosocomial infections caused by MRSA, it is prepared in a dosage form suitable for its administration. For example, it may be prepared in a liquid form such as an injection, powder, capsule, liposome preparation, topical preparation, transdermal patch and the like.
In addition, each preparation can be prepared with an appropriate carrier usually used in the pharmaceutical field. For example, carriers and diluents used as liquids such as injections include buffer solutions such as phosphate buffers, physiological saline, distilled water and other aqueous media, polyethylene glycol, propylene glycol, ethyl oleate, etc. Possible non-aqueous media are mentioned. In addition, these preparations may contain stabilizers, buffers, isotonic agents, chelating agents, pH adjusting agents, surfactants, preservatives, antioxidants and the like.
また、例えば、除菌剤、殺菌剤や駆除剤として使用される場合も、同様にその使用方法に応じた製剤形態に調製すればよい。例えば、液剤、粉剤等が挙げられる。これらの製剤を構成する担体も、除菌剤の分野で汎用されているものであれば、使用することができる。液剤は、スプレーや霧吹きのような形態でもよい。また、液剤を浸漬等の方法で含有させた織布、編布、不織布等のような形態であってもよい。 In addition, for example, when used as a disinfectant, bactericidal agent, or disinfectant, it may be similarly prepared in a formulation form corresponding to the method of use. For example, a liquid agent, a powder agent, etc. are mentioned. The carriers constituting these preparations can also be used as long as they are widely used in the field of disinfectants. The liquid agent may be in the form of a spray or a spray. Further, it may be in the form of a woven fabric, a knitted fabric, a non-woven fabric or the like containing a liquid agent by a method such as immersion.
更に、除菌等を行う対象物に塗布することを目的として、増粘剤や粘着剤等を加えたものであってもよい。これらの除菌剤や殺菌剤には、例えば界面活性剤、展着剤、安定化剤、保存剤等の、この分野で一般的に用いられる添加物を含有していてもよい。 Furthermore, for the purpose of applying to an object to be sterilized, a thickener or an adhesive may be added. These disinfectants and bactericides may contain additives generally used in this field such as surfactants, spreading agents, stabilizers, preservatives and the like.
S. aureusは食中毒の原因菌としても知られているものであるが、本発明のバクテリオファージは複数のS. aureus株に対する感染性と溶菌活性を持っているため、本発明のバクテリオファージを含有するバクテリオファージ組成物は、食品からS. aureusを殺菌、除去したり、食品にS. aureusが付着することを防止したりするために用いることができる。また、S. aureusを原因菌とする食中毒の発生を防止するために、食品の加工・調理・保存に使用する器具や、その過程で食品が晒される環境中のS. aureusを殺菌・除去するために本発明のバクテリオファージ組成物を用いることができる。その具体的な形態は、上記した殺菌剤・除菌剤の説明に記載したものと同様である。 Although S. aureus is also known as a causative agent of food poisoning, it contains the bacteriophage of the present invention because the bacteriophage of the present invention has infectivity and lytic activity against multiple S. aureus strains. The bacteriophage composition can be used to sterilize and remove S. aureus from food or to prevent S. aureus from attaching to food. Further, in order to prevent the occurrence of food poisoning caused bacteria the S. aureus, and equipment to be used for processing or cooking and storage of foods, food in the process is the S. aureus sterilize and remove in the environment exposed Therefore, the bacteriophage composition of the present invention can be used. The specific form is the same as that described in the description of the bactericide / disinfectant described above.
更に本発明のバクテリオファージ組成物は、使用する態様に応じて、更に香料、溶剤、染料、顔料、他の添加剤を含んでいてもよい。 Furthermore, the bacteriophage composition of the present invention may further contain a fragrance, a solvent, a dye, a pigment and other additives depending on the mode of use.
本発明のバクテリオファージ組成物を用いたS. aureusの増殖防止方法としては、S. aureusの増殖を防止する対象に、上記した如き本発明のバクテリオファージ組成物を接触させる等の方法で適用する方法が挙げられる。 As a method for preventing the growth of S. aureus using the bacteriophage composition of the present invention, it is applied by a method such as bringing the bacteriophage composition of the present invention into contact with the target to prevent the growth of S. aureus. A method is mentioned.
具体的には、例えば本発明のバクテリオファージ組成物を、噴霧、霧吹き、浸漬、拭き取り、塗布等の方法で、S. aureusの増殖を防止する対象を接触させる方法が挙げられる。 Specifically, for example, the bacteriophage composition of the present invention may be contacted with an object for preventing the growth of S. aureus by a method such as spraying, spraying, dipping, wiping or coating.
本発明のバクテリオファージ組成物を、S. aureusの増殖を防止する対象と接触させる時間は、該対象のS. aureusが溶菌され、増殖を防止することができるだけの十分な時間であればよい。 Bacteriophage compositions of the present invention, the contact time with the target to prevent the growth of S. aureus is the subject of S. aureus are lysed, it may be a sufficient time can be prevented growth.
また、治療剤等の薬剤として使用する場合は、S. aureusに感染した、ヒト、及びその他の哺乳動物に投与する方法が挙げられる。投与方法としては、例えば血管内又は局所注射、経口、経鼻、局所、皮下、経皮、皮内、および他の経路などの経路により投与する方法が挙げられるが、これらに限定されない。 Moreover, when using as medicines, such as a therapeutic agent, the method of administering to a human and other mammals infected with S. aureus is mentioned. Examples of administration methods include, but are not limited to, administration by routes such as intravascular or topical injection, oral, nasal, topical, subcutaneous, transdermal, intradermal, and other routes.
例えば乳腺炎治療剤として用いられる場合には、例えば患部に注射することによって投与する方法が挙げられる。具体的には、乳腺炎を発症した哺乳動物に対し、バクテリオファージを含む注射剤を乳頭下の乳頭槽に注射で注入するか、乳頭口から注入すればよい。
また、例えば頸静脈等の血管から血液中に投与する方法でもよい。ウシなどの大型哺乳動物に投与する場合には、この方法が簡便である。
For example, when used as a mastitis therapeutic agent, for example, a method of administration by injecting into the affected area can be mentioned. Specifically, an injection containing bacteriophage may be injected by injection into a nipple tank under the nipple or injected from the nipple mouth to a mammal that has developed mastitis.
Further, for example, a method of administration into blood from a blood vessel such as a jugular vein may be used. This method is convenient for administration to large mammals such as cattle.
また、本発明のバクテリオファージを含有する注射剤中のバクテリオファージの濃度は、対象の哺乳動物の種類等によって異なるが、1×106〜1×1012 PFU/ml程度であればよい。 Further, the concentration of the bacteriophage in the injection containing the bacteriophage of the present invention varies depending on the kind of the target mammal, but may be about 1 × 10 6 to 1 × 10 12 PFU / ml.
また、本発明のバクテリオファージを含有する注射剤を局所注射する場合には、対象の哺乳動物の種類、患部の状態等によって異なるが、例えば1×104〜1×1012 PFU程度、好ましくは、1×105〜1×1012 PFU程度を患部に注射すればよいが、これに限定されない。
本発明のバクテリオファージを含有する注射液を例えば頸動脈等の血管から血液中に投与する場合には、対象の哺乳動物の種類、患部の状態等によって異なるが、例えば1×104〜1×1012 PFU／Kg程度を血管内に注射すればよいが、これに限定されない。
In addition, when locally injecting an injection containing the bacteriophage of the present invention, it varies depending on the type of the target mammal, the state of the affected part, etc., but for example, about 1 × 10 4 to 1 × 10 12 PFU, preferably The affected area may be injected with about 1 × 10 5 to 1 × 10 12 PFU, but is not limited thereto.
When administering an injection solution containing bacteriophage of the present invention, for example, from a blood vessel such as the carotid artery in the blood, the type of mammalian subjects, varies depending diseased states such as, for example, 1 × 10 4 ~1 × About 10 12 PFU / Kg may be injected into the blood vessel, but is not limited thereto.
尚、バクテリオファージは宿主特異性が高く、宿主の細菌にしか感染しないウイルスなので、動物に投与した場合の毒性は殆どない。そのため、対象の哺乳動物の種類、患部の状態等によっては、より多量のバクテリオファージを投与することが可能である。例えば投与する動物が大型動物の場合には、より多量のバクテリオファージを投与することもできる。 Since bacteriophages are highly host-specific and infect only the host bacteria, there is little toxicity when administered to animals. Therefore, a larger amount of bacteriophage can be administered depending on the type of the target mammal, the state of the affected part, and the like. For example, when the animal to be administered is a large animal, a larger amount of bacteriophage can be administered.
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって、何ら限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
実験例１．S. aureusの採取
（１）S. aureusの分離
乳腺炎（Mastitis）を発症した乳牛（北海道）の原乳を採取し、100μLをbrain-heart infusion agar（日本製薬(株)製）に広げ、37℃で15時間培養した。
生じた各コロニーから細菌を採取し、それぞれマンニット食塩寒天培地を用いた通常のコアグラーゼ試験とヒツジ血液寒天培地を用いた通常の溶血試験を行った。
以上の試験の結果、コアグラーゼ試験と溶血試験の両方で陽性と判断されたコロニー 15株（strain）を選択・分離した。
Experimental Example 1 Collection of S. aureus (1) Isolation of S. aureus Raw milk from dairy cows (Hokkaido) who developed mastitis was collected and 100 μL was spread over brain-heart infusion agar (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) The cells were cultured at 37 ° C for 15 hours.
Bacteria were collected from each of the resulting colonies, and a normal coagulase test using a mannitol salt agar medium and a normal hemolysis test using a sheep blood agar medium were performed.
As a result of the above tests, 15 colonies (strain) that were judged positive in both the coagulase test and the hemolysis test were selected and isolated.
（２）性状の確認（characterization）
分離した株それぞれについて、コアグラーゼのＣ末端部分をコードする遺伝子（coa）、プロテインAのhyper variable SpaX領域をコードする遺伝子（spaX）、IgG結合領域をコードする遺伝子及びエンテロトキシンC，G，H及びIをコードする遺伝子を以下の通り、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、Polymerase Chain Reaction）法で増幅させ、その結果に基づいて、分離した株をcharacterizeした。
(2) Characterization
For each isolated strain, the gene encoding the C-terminal part of coagulase ( coa ), the gene encoding the hyper variable SpaX region of protein A ( spaX ), the gene encoding the IgG binding region and the enterotoxins C, G, H and I As follows, the gene coding for was amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction) method, and the isolated strain was characterized based on the result.
即ち、分離した15株のS. aureusそれぞれから、要すればガラスプランジャーとチューブを用いたホモジネーションを行ったのち、常法であるフェノール-クロロホルム抽出を行って、ＤＮＡを分離した。これをＰＣＲの鋳型として用いた。 That is, from each of the 15 isolates of S. aureus , homogenization using a glass plunger and a tube was performed if necessary, and then phenol-chloroform extraction, which is a conventional method, was performed to separate DNA. This was used as a template for PCR.
ＰＣＲに用いるＦプライマーとＲプライマーは、Oliveira et al., J. Clin. Microbiol., 2001, 39(2), 574-580 及びDewanand et al., J.Vet.Sci., 2007, 8(2), 151-154、Omoe et al. J. Clin. Microb., 2002, 40(3), 857-862に開示された下記表１に記載のものを用いた。増幅対象の遺伝子と、配列表に記載された各プライマーの塩基配列の、それぞれの配列番号も、SEQ ID NO:として表１に併せて示す。 F and R primers used for PCR are described in Oliveira et al., J. Clin. Microbiol., 2001, 39 (2), 574-580 and Dewanand et al., J. Vet. Sci., 2007, 8 (2 ), 151-154, Omoe et al. J. Clin. Microb., 2002, 40 (3), 857-862. The respective sequence numbers of the gene to be amplified and the base sequence of each primer described in the sequence listing are also shown in Table 1 as SEQ ID NO :.
ＰＣＲは、94℃で５分間加温、72℃で20分間加温の後、増幅対象の遺伝子毎に、それぞれ下記の条件で行った。 PCR was performed at 94 ° C. for 5 minutes and at 72 ° C. for 20 minutes, and then performed for each gene to be amplified under the following conditions.
coaの増幅：94℃ 40秒、58〜62℃ 60秒、72℃ 60秒 を30サイクル、
spaXの増幅：94℃ 60秒、60℃60秒、72℃ 60秒 を35サイクル、
IgG結合領域遺伝子の増幅：94℃ 40秒、60℃40秒、72℃ 40秒 を30サイクル、
エンテロトキシン遺伝子の増幅：94℃ 30秒、58℃60秒、72℃30秒 を30サイクル
得られた増幅産物を、エチジウムブロマイドを添加した２％アガロース電気泳動の後、UV照射によって可視化した。また、CEQ 8000 (Beckman Coulter)を用いて、得られた増幅産物のシーケンシングを行った。.
以上の解析により得られた各S. aureus株の遺伝的特性を、下記表２にそれぞれ示す。
Coa amplification: 94 ° C 40 seconds, 58-62 ° C 60 seconds, 72 ° C 60
SpaX amplification: 94 ° C 60 seconds, 60 ° C 60 seconds, 72 ° C 60
Amplification of IgG binding region genes: 30 cycles of 94 ° C 40 seconds, 60 ° C 40 seconds, 72 ° C 40 seconds,
Amplification of enterotoxin gene: 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 58 ° C. for 60 seconds, 72 ° C. for 30 seconds The obtained amplification products were visualized by UV irradiation after 2% agarose electrophoresis with ethidium bromide added. In addition, the obtained amplification products were sequenced using CEQ 8000 (Beckman Coulter). .
The genetic characteristics of each S. aureus strain obtained by the above analysis are shown in Table 2 below.
ＰＣＲによる解析の結果、コアグラーゼのＣ末端側をコードするcoa遺伝子に関しては、350bp、593bp、674bp、836bp、1079bpの５種類の大きさのものが検出された。また、coa部分には、複数の81bpの繰り返しが存在していた。 As a result of PCR analysis, five types of coa gene encoding the C-terminal side of coagulase, 350 bp, 593 bp, 674 bp, 836 bp, and 1079 bp, were detected. In the coa portion, a plurality of 81 bp repeats existed.
spaＸの解析の結果、150bp、200bp、250bp、300bp、400bpの大きさのspaXが確認された。また、この部分には、KPGKEDNK（配列番号１５）又はKPGKEDGN（配列番号１６）のアミノ酸配列のどちらか又は両方をコードする25bpの、２〜10回繰り返しが確認された。 As a result of the analysis of spaX, 150bp, 200bp, 250bp, 300bp, is spaX of the size of 400bp was confirmed. Further, in this part, 25 bp of 2-10 times encoding either or both of the amino acid sequences of KPGKEDNK (SEQ ID NO: 15) and KPGKEDGN (SEQ ID NO: 16) were confirmed.
エンテロトキシン遺伝子の解析の結果、15株のうち４株が、エンテロトキシン遺伝子を持つことが確認された。 As a result of analysis of the enterotoxin gene, it was confirmed that 4 out of 15 strains had the enterotoxin gene.
実施例１．バクテリオファージの分離・精製
（１）宿主菌体の調製
宿主菌体として用いるStaphiococcus aureus JCM2151（ATCC6538）を、LB培地で定常期（OD660＝1.5程度）になるまで十分培養（full growth）させておいた。
尚、本明細書の実施例を通して使用したLB培地の組成は以下の通りである。即ち、LB液体培地の場合、NaCl 0.5w/v%、Yeast extract 0.5w/w%、ポリペプトン １w/v%を含有する。LB寒天培地の場合、上記組成に更に1.5% agarを含有する。
Example 1. Isolation and purification of bacteriophages (1) Preparation of host cells Staphiococcus aureus JCM2151 (ATCC6538) used as host cells is fully grown in LB medium until it reaches a stationary phase (OD660 = about 1.5). It was.
The composition of the LB medium used throughout the examples of the present specification is as follows. That is, in the case of the LB liquid medium, it contains NaCl 0.5 w / v%, Yeast extract 0.5 w / w%, and polypeptone 1 w / v%. In the case of LB agar medium, the above composition further contains 1.5% agar.
（２）バクテリオファージの採取
一般家庭下水流水1.2 Ｌを採取し12000rpmで15分間、４℃で遠心分離後、上清を回収した。上清にPEG6000及びNaClをそれぞれ終濃度 10W/V%,４W/V%になるよう加え、十分撹拌した後、4℃で一昼夜静置した。12000rpmで15分間遠心分離後、上清を除いた。次いで、沈殿にSM-buffer(50mM Tris-HCl pH=7.5、0.1M NaCl、7mM MgSO4/7H2O、0.01％ゼラチン含有）を10mL加えて攪拌し、バクテリオファージの懸濁液を得た。
(2) Bacteriophage collection 1.2 L of general domestic sewage water was collected and centrifuged at 12000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. PEG6000 and NaCl were added to the supernatant to final concentrations of 10 W / V% and 4 W / V%, respectively, and after sufficient stirring, allowed to stand at 4 ° C. overnight. After centrifugation at 12000 rpm for 15 minutes, the supernatant was removed. Next, 10 mL of SM-buffer (containing 50 mM Tris-HCl pH = 7.5, 0.1 M NaCl, 7 mM MgSO 4 / 7H 2 O, 0.01% gelatin) was added to the precipitate and stirred to obtain a bacteriophage suspension.
（３）バクテリオファージの単離
バクテリオファージの懸濁液110μＬと、上記(１)で調製した宿主菌体培養液110μＬ（１×108-9CFU /mL）をマイクロチューブに分取し、混合した。得られた混合液200μＬを、３ｍＬのＬＢ軟寒天培地（0.5％agar含有）に加え、混合した後、ＬＢ寒天培地上に重層した。軟寒天培地が固まった後、37℃で一晩インキュベートした。使用した下水流入水にファージが存在する場合は軟寒天培地層上にプラークが形成される。次に、形成されたプラークを回収し、SM bufferに懸濁した。続いて通常のプレートライセート法を行って、それぞれのプラークのバクテリオファージを精製した。最終的に、バクテリオファージをPEG 6000-NaClにより沈殿させ、遠心処理してバクテリオファージを濃縮した後、更にCsCl密度勾配遠心を行って、バクテリオファージを精製した後、SM bufferに再懸濁した（以下、「バクテリオファージライセート」という）。
(3) Isolation of bacteriophage 110 μL of the bacteriophage suspension and 110 μL (1 × 10 8-9 CFU / mL) of the host cell culture prepared in (1) above were dispensed into a microtube and mixed. did. 200 μL of the obtained mixed solution was added to 3 mL of LB soft agar medium (containing 0.5% agar), mixed, and then overlaid on LB agar medium. After the soft agar medium solidified, it was incubated overnight at 37 ° C. When phages are present in the used sewage inflow water, plaques are formed on the soft agar medium layer. Next, the formed plaques were collected and suspended in SM buffer. Subsequently, a normal plate lysate method was performed to purify the bacteriophage of each plaque. Finally, the bacteriophage was precipitated with PEG 6000-NaCl, centrifuged to concentrate the bacteriophage, and further subjected to CsCl density gradient centrifugation to purify the bacteriophage and then resuspended in SM buffer ( Hereinafter referred to as “bacteriophage lysate”).
以上の操作により、52株のバクテリオファージを単離した。 By the above operation, 52 bacteriophages were isolated.
実施例２．ウシ乳腺炎由来S. aureusに対する溶菌活性を有するバクテリオファージの選択
実施例１で単離した52株のバクテリオファージそれぞれの、S. aureusに対する宿主域を調べた。
Example 2 Selection of bacteriophages having lytic activity against bovine mastitis-derived S. aureus The host range for S. aureus of each of the 52 bacteriophages isolated in Example 1 was examined.
以下の試験において、バクテリオファージの宿主として用いた菌株は、実験例１でウシ乳腺炎（乳房炎）感染原乳から分離・選択したS. aureusの分離株、すなわちSA001株, SA002株, SA003株, SA009株, SA019株, SA020株, SA021株, SA026株, SA028株, SA029株, SA031株, SA033株, SA047, SA048, SA049株の15株と、ATCC6538（基準株、laboratory reference strain）の計16株である。 In the following tests, the strains used as bacteriophage hosts were S. aureus isolates isolated and selected from bovine mastitis (mastitis) -infected raw milk in Experimental Example 1, ie, SA001, SA002, and SA003 strains. , SA009, SA019, SA020, SA021, SA026, SA026, SA028, SA029, SA031, SA033, SA047, SA048, SA049, and ATCC6538 (laboratory reference strain) 16 shares.
各宿主菌株培養液110μＬ（１×108-9CFU/mL）を、それぞれ３ｍＬの軟寒天培地（0.5% top agar）に加え、混合した後、ＬＢ寒天培地上に重層した。軟寒天培地が固まった後、実施例１で調製した各バクテリオファージライセート（＞10８ PFU/mL）を、軟寒天培地に２μＬずつ滴下（スポット）し、一昼夜37℃で培養した。 110 μL (1 × 10 8-9 CFU / mL) of each host strain culture solution was added to 3 mL of a soft agar medium (0.5% top agar), mixed, and then overlaid on the LB agar medium. After the soft agar medium hardened, 2 μL of each bacteriophage lysate (> 10 8 PFU / mL) prepared in Example 1 was dropped (spotted) on the soft agar medium and cultured at 37 ° C. overnight.
その後、軟寒天培地上に生じたプラークの検出を行った。 Thereafter, plaques generated on the soft agar medium were detected.
バクテリオファージの溶菌活性は、発生したプラーク（plaques）の透明具合によって判別した。すなわち、もしそのスポットのバクテリオファージが、使用したS. aureus分離株に対して溶菌活性を持っている場合は、一昼夜培養してもS. aureusが増殖することが出来ず、軟寒天上に透明なスポットが形成されるはずである。プラークが一部濁っていたり、非常に濁っている場合は、そのバクテリオファージによる宿主（S. aureus）の溶菌活性が低いことを示す。 The bacteriophage lytic activity was determined by the clearness of the plaques generated. That is, if the bacteriophage of the spot, if you have lytic activity against S. aureus isolates used were unable to be S. aureus was cultured overnight proliferate, transparent soft agar Spot should be formed. If the plaque is partly cloudy or very cloudy, it indicates that the bacteriophage of the host ( S. aureus ) has low lytic activity.
結果を表３に示す。表３において、各スポットに生じたプラークの透明具合がClearな場合をC、Turbidな場合をＴ、Very turbidな場合をVT、プラークが発生しなかった場合を−で示す。 The results are shown in Table 3. In Table 3, the case where the transparency of the plaque generated in each spot is Clear is indicated as C, the case where Turbid is indicated as T, the case where Very Turbid is indicated as VT, and the case where no plaque is generated is indicated as-.
試験した52株のバクテリオファージのうち、３株以上のS. aureusを溶菌できたバクテリオファージは表３記載の16株であった。これらのバクテリオファージは、表３から明らかなとおり、広範な宿主域を示した。 Of the 52 bacteriophages tested, 16 were listed in Table 3, which were able to lyse 3 or more S. aureus . These bacteriophages showed a broad host range, as is apparent from Table 3.
中でも、表３から明らかな如く、φSA012は、S. aureusのSA001株, SA003株, SA009株, SA019株, SA020株, SA021株, SA026株, SA028株, SA029株, SA031株, SA033株, SA047株, SA048株, SA049株とATCC6538（基準株、laboratory reference strain）に溶菌活性を示した。特にSA003株, SA020株, SA028株, SA031株, SA033株, SA047株, SA049株, ATCC6538株に対してClearなプラークが得られ、高い溶菌活性を示した。 Among them, as is clear from Table 3, φSA012 is S. aureus SA001, SA003, SA009, SA019, SA020, SA021, SA026, SA028, SA029, SA031, SA033, SA047. Strain, SA048, SA049, and ATCC6538 (reference strain, laboratory reference strain) showed lytic activity. In particular, clear plaques were obtained for the SA003, SA020, SA028, SA031, SA033, SA047, SA049, and ATCC6538 strains and showed high lytic activity.
また、φSA039は、試験したすべてのS. aureus株に対して溶菌活性を示した。特にSA002株, SA003株, SA009株, SA019株, SA020株, SA021株, SA026株, SA028株, SA029株, SA031株, SA033株, SA047株, SA049株に対してClearなプラークが得られ、強い溶菌活性を示した。 ΦSA039 showed lytic activity against all S. aureus strains tested. Clear plaques were obtained and strong against SA002, SA003, SA009, SA019, SA020, SA021, SA026, SA026, SA029, SA031, SA033, SA047, and SA049. Shows lytic activity.
以上のことから、φSA012及びφSA039を、本発明の目的を達成する候補ファージとして選択した。 Based on the above, φSA012 and φSA039 were selected as candidate phages that achieve the object of the present invention.
尚、φSA012は、2008年12月25日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 特許微生物寄託センター（郵便番号 292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、受託番号 NITE BP-693として寄託してある。 In addition, φSA012 was dated December 25, 2008, and was submitted to the Patent Microorganisms Deposit Center, Biotechnology Headquarters, National Institute of Technology and Evaluation (Postal Code 292-0818, 2-5-8 Kazusa Kama feet, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan). The deposit number is NITE BP-693.
またφSA039は、2008年12月25日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 特許微生物寄託センター（郵便番号 292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、受託番号 NITE BP-694として寄託してある。 In addition, φSA039 was issued on December 25, 2008 at the Patent Microorganism Deposit Center (Postal Code 292-0818, Kisarazu City 2-5-8, Kisarazu City, Chiba, Japan) The deposit number is NITE BP-694.
実施例３・バクテリオファージの画像解析
実施例１で得られたバクテリオファージφSA012、φSA039それぞれのPEG6000-NaCl濃縮液から、CsCl密度勾配遠心法による常法によってバクテリオファージを精製した。SM緩衝液で、６μLの濃縮されたバクテリオファージ懸濁液(minimum 1010 PFU/ml)を調製し、下記の常法で、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope; TEM、）用の試料を調製した。
Example 3 Image Analysis of Bacteriophage Bacteriophages were purified from PEG6000-NaCl concentrates of bacteriophages φSA012 and φSA039 obtained in Example 1 by a conventional method using CsCl density gradient centrifugation. Prepare 6 μL of concentrated bacteriophage suspension (minimum 10 10 PFU / ml) in SM buffer and prepare a sample for Transmission Electron Microscope (TEM) by the following conventional method. did.
即ち、調製したバクテリオファージ懸濁液を、TEM用のhydrophilic Formvar-carbon-coated copper grid 又はcollodion-carbon-coated copper grid (Nisshin EM Corporation)にスポットした。２分間静置して、バクテリオファージをグリッド（grid）に吸着させた。余分なバクテリオファージ懸濁液を除去後、蒸留水で洗浄した。次いで、1.6％酢酸ウラニルでバクテリオファージをネガティブ染色した。２分後、過剰の染色剤を除いて、30分風乾した。乾燥させたグリッドをＴＥＭ HITACHI-H7500（(株)日立製作所製）にセットして、80kVでバクテリオファージを観察し、写真撮影した。 That is, the prepared bacteriophage suspension was spotted on a hydrophilic formvar-carbon-coated copper grid or a collodion-carbon-coated copper grid (Nisshin EM Corporation) for TEM. The bacteriophage was adsorbed on a grid after standing for 2 minutes. After removing the excess bacteriophage suspension, it was washed with distilled water. The bacteriophage was then negatively stained with 1.6% uranyl acetate. After 2 minutes, excess dye was removed and air dried for 30 minutes. The dried grid was set in TEM HITACHI-H7500 (manufactured by Hitachi, Ltd.), the bacteriophage was observed at 80 kV, and photographed.
そして、バクテリオファージ１株毎に、各25個のバクテリオファージの頭部（head）の直径及び長さ、尾部（tail）の直径及び長さを測定して、それぞれの平均値を求めた。 Then, for each bacteriophage strain, the diameter and length of the head and the diameter and length of the tail of each 25 bacteriophages were measured, and the respective average values were determined.
φSA012のＴＥＭ写真を図１（１）に、φSA039のＴＥＭ写真を図１（２）にそれぞれ示す。図中のスケールバーは、100nmを示す。また、図１(１)の矢印は、φSA012の収縮したシース（sheath）を示す。 A TEM photograph of φSA012 is shown in FIG. 1 (1), and a TEM photograph of φSA039 is shown in FIG. 1 (2). The scale bar in the figure indicates 100 nm. Moreover, the arrow of FIG. 1 (1) shows the sheath (sheath) which φSA012 contracted.
また、以上の解析で得られたφSA012及びφSA039の形状に関する知見を、下記表４にまとめて示す。 Moreover, the knowledge regarding the shape of φSA012 and φSA039 obtained by the above analysis is summarized in Table 4 below.
ＴＥＭによる観察で、φSA012とφSA039は、ともにＴ４ファージと同程度の大きさで、且つＴ４ファージより若干長いことが知られた。また、φSA012およびφSA039は、収縮性のシースを持つことから、ミオビリデ科（Myoviridate family）に属するものと推察される。 Observation by TEM shows that both φSA012 and φSA039 are about the same size as T4 phage and slightly longer than T4 phage. Moreover, since φSA012 and φSA039 have a contractible sheath, it is assumed that they belong to the Myoviridate family.
実施例４．φSA012の溶菌活性試験
ＬＢ培地４mlをＬ字型試験管に採り、実験例１で分離したS. aureus のうち、SA-003株、SA020株、SA028株、又はSA-031株の昼夜培養液40μlを接種し、それぞれ37℃で、対数増殖期になる（OD660＝0.1）まで、40rpmで振盪培養した。次いで、実施例１で得られたバクテリオファージφSA012のライセートをMOI＝10（Multiplicity of Infection：菌量に対するバクテリオファージの相対量。MOI＝10は、菌の総数に対して、10倍の個数のバクテリオファージを感染させたことを意味する。）で加えて、φSA012をS. aureusに感染させた。次いで、LB培地の660nmにおける吸光度の経時変化を、TVS062CA Biophotorecorder (Advantec, Tokyo)を用いて測定した。尚、測定は、S. aureusの培養液にφSA012を添加後、15分のインターバルの後、行った。
Example 4 Bacterial activity test of
また、φSA012を添加せずに、S. aureus菌体のみで培養した場合をcontrolとした。 In addition, the case of culturing only with S. aureus cells without adding φSA012 was defined as control.
得られた結果を図２にそれぞれ示す。
尚、図２において各シンボルは、下記表５に記載の条件で試験した結果を示す。
The obtained results are shown in FIG.
In FIG. 2, each symbol indicates the result of testing under the conditions described in Table 5 below.
図２から明らかな如く、バクテリオファージの不在下では、SA003株、SA020株、SA028株及びSA031株共に、培養によって増殖し、吸光度が上昇した（Control）。しかし、φSA012を接種すると、すべての株で、吸光度が殆ど0付近にまで急速に減少した。すなわち、今回用いたS. aureus株はすべて、φSA012によって溶菌された。このことから、φSA012は、S. aureus株であるSA003株、SA020株、SA028株、SA031株等の、複数のS. aureus株に対して、強い溶菌活性を持つことがわかる。 As is apparent from FIG. 2, in the absence of bacteriophage, the SA003 strain, SA020 strain, SA028 strain and SA031 strain all grew by culture and the absorbance increased (Control). However, when φSA012 was inoculated, the absorbance decreased rapidly to almost zero in all strains. That is, all S. aureus strains used this time were lysed by φSA012. Therefore, FaiSA012 is, S. aureus strains in which SA003 strain SA020 strain SA028 strain, such as SA031 strain, for a plurality of S. aureus strains, it is found to have a strong lytic activity.
実施例５．φSA039の溶菌活性試験
実験例１で分離したS. aureus のうち、SA003株、SA020株、SA026株、SA029株又はSA031株を宿主細菌として用い、バクテリオファージとして実施例１で単離したバクテリオファージφSA039を用いる以外は、実施例４と同様の試薬及び機器を用いて培養を行い、LB培地の660nmにおける吸光度の経時変化を測定した。
Example 5 FIG. Bacteriophage φSA039 isolated in Example 1 as a bacteriophage using the SA003 strain, SA020 strain, SA026 strain, SA029 strain or SA031 strain as the host bacterium of S. aureus isolated in Experimental Example 1 Culturing was carried out using the same reagents and equipment as in Example 4, except that the absorbance of LB medium at 660 nm was measured over time.
また、φSA039を添加せずに、S. aureus菌体のみで培養した場合をcontrolとした。 In addition, the case of culturing only with S. aureus cells without adding φSA039 was defined as control.
結果を図３に示す。
また、図３において、各シンボルは、下記表６に記載の条件で試験した結果を示す。
The results are shown in FIG.
Moreover, in FIG. 3, each symbol shows the result of testing under the conditions described in Table 6 below.
図３より明らかな如く、バクテリオファージの不在下では、SA003株、SA020株、SA026株、SA029株又はSA-031株共に、培養によって増殖し、吸光度が上昇した（Control）。しかし、φSA039を接種すると、すべての菌株で、培養30時間前後で吸光度が殆ど0付近にまで減少した。すなわち、今回用いたS. aureus株は、すべてがφSA039によって溶菌された。以上のことから、φSA039は、SA003株、SA020株、SA026株、SA029株、SA031株等の、複数のS. aureus株に対して強い溶菌活性を持つことが判る。 As is apparent from FIG. 3, in the absence of bacteriophage, the SA003 strain, SA020 strain, SA026 strain, SA029 strain or SA-031 strain all grew by culture and the absorbance increased (Control). However, when φSA039 was inoculated, the absorbance decreased to almost zero after 30 hours of culture in all strains. That is, all the S. aureus strains used this time were lysed by φSA039. From the above, it can be seen that φSA039 has a strong lytic activity against a plurality of S. aureus strains such as SA003 strain, SA020 strain, SA026 strain, SA029 strain, SA031 strain and the like.
実施例６．ＭＲＳＡに対する溶菌活性を有するバクテリオファージの選択
S. aureusのMRSA Typing strain であるSA050 (GTC01186), SA051 (GTC01187), SA052 (GTC01213), SA053 (GTC01217), SA054 (GTC01221)の５株を、宿主菌株として用いた。
Example 6 Selection of bacteriophage having lytic activity against MRSA
S. aureus MRSA Typing strains SA050 (GTC01186), SA051 (GTC01187), SA052 (GTC01213), SA053 (GTC01217), and SA054 (GTC01221) were used as host strains.
これらの菌株は、岐阜大学大学院医学研究科より分譲された。 These strains were purchased from Gifu University Graduate School of Medicine.
各宿主菌株培養液 110μＬ（１×108-9CFU /mL）を、それぞれ３ｍＬの軟寒天培地（0.5% top agar）に加え、混合した後、ＬＢ寒天培地上に重層した。軟寒天培地が固まった後、実施例１で調製した各バクテリオファージライセート（＞10８ PFU/mL）を、軟寒天培地に２μＬずつ滴下（スポット）し、一昼夜37℃で培養した。
その後、実施例２と同様の方法で、軟寒天培地上に生じたプラークの検出を行った。
110 μL (1 × 10 8-9 CFU / mL) of each host strain culture solution was added to 3 mL of a soft agar medium (0.5% top agar), mixed, and then overlaid on the LB agar medium. After the soft agar medium hardened, 2 μL of each bacteriophage lysate (> 10 8 PFU / mL) prepared in Example 1 was dropped (spotted) on the soft agar medium and cultured at 37 ° C. overnight.
Thereafter, plaques produced on the soft agar medium were detected in the same manner as in Example 2.
結果を表７に示す。表７において、各スポットに生じたプラークの透明具合がClearな場合をC、Turbidな場合をＴ、Very turbidな場合をVT、プラークが発生しなかった場合を−で示す。 The results are shown in Table 7. In Table 7, the case where the clearness of the plaque generated in each spot is Clear is indicated by C, the case where Turbid is T, the case where Very Turbid is VT, and the case where no plaque is generated is indicated by-.
試験した52株のバクテリオファージのうち、ＭＲＳＡのいずれかの株を溶菌できたバクテリオファージは、表７記載の21株であった。 Of the 52 bacteriophages tested, 21 strains listed in Table 7 were able to lyse any strain of MRSA.
中でも、表７から明らかな如く、φSA12は、SA050 (GTC01186) 株, SA051 (GTC01187) 株, SA052 (GTC01213) 株, SA053 (GTC01217) 株, SA054 (GTC01221) 株のすべてに溶菌活性を示し、特にSA052 (GTC01213) 株及びSA053 (GTC01217) 株に対して強い溶菌活性を示した。 Among them, as is apparent from Table 7, φSA12 shows lytic activity in all of SA050 (GTC01186) strain, SA051 (GTC01187) strain, SA052 (GTC01213) strain, SA053 (GTC01217) strain, SA054 (GTC01221) strain, Strong lytic activity was exhibited against the SA052 (GTC01213) and SA053 (GTC01217) strains.
また、本発明のバクテリオファージφSA039は、S. aureusのMRSA Typing strainであるA050 (GTC01186) 株, SA052 (GTC01213) 株, SA053 (GTC01217) 株及びSA054 (GTC01221) 株に溶菌活性を示し、特に病原因子が特定されているSA054 (GTC01221)株に対して強い溶菌活性を示した。 In addition, the bacteriophage φSA039 of the present invention exhibits lytic activity against S. aureus MRSA Typing strains A050 (GTC01186) strain, SA052 (GTC01213) strain, SA053 (GTC01217) strain and SA054 (GTC01221) strain. Strong lytic activity was demonstrated against the SA054 (GTC01221) strain in which the factor was specified.
即ち、本発明のバクテリオファージであるφSA012及びφ037-039は、複数のＭＲＳＡ株に対して高い溶菌活性を示し、ＭＲＳＡの除菌剤等への応用が可能であることが示唆された。 That is, φSA012 and φ037-039, which are the bacteriophages of the present invention, showed high lytic activity against a plurality of MRSA strains, suggesting that MRSA can be applied to disinfectants and the like.
実施例７．
下記の方法でマウスに乳腺炎を発症させるS. aureus（以下、本実施例では「SA」と略記する。）を注入して実験的に乳腺炎を発症した乳腺炎モデルマウスを作製し、それに本発明に係るバクテリオファージを注入して、マウス乳腺炎に対する本発明のバクテリオファージの効果を確認した。
Example 7
A mastitis model mouse that experimentally developed mastitis was prepared by injecting S. aureus (hereinafter abbreviated as “SA” in the present example) that causes mastitis in the mouse by the following method. The bacteriophage according to the present invention was injected to confirm the effect of the bacteriophage of the present invention on mouse mastitis.
（１）乳腺炎モデルマウスの作製
下記４種の組成の注射液を調製した。
(ｉ) SA群：SA(SA019) １×105 CFU／25μL PBS
(ii) SA・ファージ群１：[SA １×105 CFU＋バクテリオファージ(φSA039) １×105 PFU]/25μL PBS
(iii) SA・ファージ群２：[SA １×105 CFU＋バクテリオファージ１×107 PFU]/25μL PBS
(iv)ファージ群：バクテリオファージ１×107 PFU／25μL PBS
(1) Production of mastitis model mouse Injection solutions having the following four compositions were prepared.
(i) SA group: SA (SA019) 1 × 10 5 CFU / 25 μL PBS
(ii) SA / phage group 1: [
(iii) SA / phage group 2: [
(iv) Phage group: bacteriophage 1 × 10 7 PFU / 25 μL PBS
次いで、調製した上記各注射液を、SA注入の２時間前に仔マウスを分離した、出産後７〜10日の母親マウス（ddy系）の、Ｌ４、Ｒ４の乳頭下の乳槽内に、35G（ゲージ）の注射針で全量（25μL）を注入した。
Next, each of the prepared injections was separated into a milk tank under the L4 and R4 nipples of a mother mouse (ddy strain) 7 to 10 days after childbirth, which was separated from a
注射液を注入後、６時間経過したところで、仔マウスを母親マウスに戻した。 The pup mice were returned to their mother mice after 6 hours had passed since the injection solution was injected.
注入２日後又は４日後に母親マウスの乳房を写真撮影し、その後マウスを解剖し、乳腺組織を写真撮影した。 Two or four days after injection, maternal mouse breasts were photographed, then the mice were dissected and mammary gland tissue was photographed.
また乳腺組織を採取して、以下のように乳腺組織中のSAの細菌数を算定した。 Also, mammary gland tissue was collected, and the number of SA bacteria in the mammary gland tissue was calculated as follows.
（２）乳腺組織中のSA生菌数の測定
上記(１)で採取した乳腺組織を適当量（15mg−20mg）チューブに採取し、１mL滅菌PBSに浮遊させた。次いで、全体重量からチューブ及びPBS等の重量を減ずることで、採取した組織の湿重量を測定した。
ビーズを用いて、約２分間乳腺組織を振盪破砕し、乳腺組織ホモジネートを調製した。得られた乳腺組織ホモジネートをPBSを用いて段階希釈（１×101−１×1010）した。
(2) Measurement of the number of viable SA in the mammary gland tissue The mammary gland tissue collected in (1) above was collected in an appropriate amount (15 mg-20 mg) tube and suspended in 1 mL sterile PBS. Next, the wet weight of the collected tissue was measured by subtracting the weight of the tube and PBS from the total weight.
Using the beads, the mammary tissue was shaken and crushed for about 2 minutes to prepare a mammary tissue homogenate. The obtained mammary gland tissue homogenate was serially diluted (1 × 10 1 −1 × 10 10 ) with PBS.
段階希釈液各100μLを夫々５％羊赤血球加寒天培地に塗布し、37℃で24時間培養し、コロニー数を数えた。コロニー数に乳腺組織ホモジネートの希釈率を乗じて菌数を算定し、それを乳腺組織ｇ重量あたりのSAの生菌数に換算した。 100 μL of each serial dilution was applied to 5% sheep erythrocyte agar medium, cultured at 37 ° C. for 24 hours, and the number of colonies was counted. The number of bacteria was calculated by multiplying the number of colonies by the dilution rate of the mammary tissue homogenate, and this was converted to the number of viable SA per g weight of mammary tissue.
（３）結果
１）乳腺組織の様子
上記(１)で得られた、乳腺炎モデルマウスにSA群、SA・ファージ群１又はSA・ファージ群２の注射液を注入して２日、及び４日経過後に乳房及び乳腺組織を写真撮影した結果を図４及び図５に示す。
(3) Results 1) State of mammary gland tissue The mastitis model mouse obtained in (1) above was injected with the injection solution of SA group, SA •
図４は注射液注入２日後のマウスの乳房及び乳腺組織の写真、図５は注射液４日後の乳房及び乳腺組織の写真を夫々示す。図４及び図５において、上の写真がマウスＬ４及びＲ４の乳房の写真、下の写真が乳腺組織の写真である。
FIG. 4 shows a photograph of the breast and mammary tissue of the
また、図４及び図５において、(ｉ)はSA群の注射液を注入したマウス、（ii）はSA・ファージ群１の注射液を注入したマウス、（iii）はSA・ファージ群２の注射液を注入したマウスの乳房及び乳腺組織の写真を夫々示す。
4 and 5, (i) is a mouse injected with the SA group injection solution, (ii) is a mouse injected with the SA /
また、図４及び図５において、太い矢印（▲）は、乳腺の炎症反応が腹膜まで達していることを示す部分を指す。また、細い矢印（→）は、注入した部位で、炎症反応が見られていることを示す部分を指す。 In FIGS. 4 and 5, a thick arrow (▲) indicates a part indicating that the inflammatory reaction of the mammary gland reaches the peritoneum. A thin arrow (→) indicates a portion indicating that an inflammatory reaction is observed at the injected site.
図４(ｉ)及び図５(ｉ)から明らかな如く、SAのみを注入したマウスでは、SA注入２日後で、乳腺の炎症反応が腹膜まで達しており、SA注入４日後では、その炎症が更に広がっていることが判る（太い矢印）。
As apparent from FIGS. 4 (i) and 5 (i), in the mice injected with SA alone, the inflammatory reaction of the mammary gland reached the
一方、図４の(ii)及び(iii)から明らかな如く、SAとバクテリオファージ(１×105PFU、１×107PFU)を注入した場合は、SAのみを注入した場合と比較して、明らかに乳腺の炎症反応が抑えられていた。 On the other hand, as is clear from (ii) and (iii) of FIG. 4, when SA and bacteriophage (1 × 10 5 PFU, 1 × 10 7 PFU) were injected, compared to the case where SA alone was injected. Obviously, the inflammatory response of the mammary gland was suppressed.
更に図５の(ii)及び(iii)から明らかな如く、SAとバクテリオファージ(１×105PFU、１×107PFU)を注入して４日経過した場合、SAのみを注入した場合と比較して、明らかに乳腺の炎症反応が抑えられており、更に２日経過した場合(図４の(ii)及び(iii))と比較すると、炎症が更に小さくなっていることがわかる。 Further, as apparent from FIGS. 5 (ii) and (iii), when SA and bacteriophage (1 × 10 5 PFU, 1 × 10 7 PFU) were injected for 4 days, only SA was injected and In comparison, the inflammatory reaction of the mammary gland is clearly suppressed, and it can be seen that the inflammation is further reduced as compared with the case where two days have passed ((ii) and (iii) in FIG. 4).
更にまた、図４の(ii)と(iii)、図５の(ii)と(iii)を比較すると、(ii)バクテリオファージを１×105PFU注入した場合よりも(iii)１×107PFUを注入した場合の方が、乳腺の炎症がより小さくなっていることが判る。 Furthermore, when (ii) and (iii) in FIG. 4 and (ii) and (iii) in FIG. 5 are compared, (ii) 1 × 10 5 than (ii) bacteriophage injected with 1 × 10 5 PFU. 7 It can be seen that the mammary gland inflammation is smaller when PFU is injected.
以上のことから、本発明のバクテリオファージを、S. aureus感染により乳腺炎を発症したマウスに投与することで、乳腺炎の炎症を抑制することができることがわかる。 From the above, it can be seen that the inflammation of mastitis can be suppressed by administering the bacteriophage of the present invention to mice that developed mastitis due to S. aureus infection.
尚、図には示していないが、ファージ群のみを注射したマウスでは、２日後、及び４日後のいずれでも、乳腺炎は発症しなかった。 Although not shown in the figure, mastitis did not develop in mice injected with only the phage group, both after 2 days and after 4 days.
２）乳腺組織中のSA数の変化
上記(２)で得られた、乳腺炎モデルマウスにバクテリオファージを注入して２日、及び４日経過後の乳腺組織中のSA生菌数を算出した結果を図６に示す。
2) Change in the number of SA in mammary tissue Results of calculating the number of viable SA in mammary tissue after 2 days and 4 days after bacteriophage injection into mastitis model mice obtained in (2) above Is shown in FIG.
図６において、横軸は注射液をマウスに注入後の経過日数、マウスに注入した注射液のSA数及びバクテリオファージ数を、縦軸は乳腺組織ｇあたりのSA生菌数（CFU）を対数で示す。 In FIG. 6, the horizontal axis represents the number of days elapsed after the injection solution was injected into the mouse, the SA number and the bacteriophage number of the injection solution injected into the mouse, and the vertical axis represents the number of live SA (CFU) per g of mammary gland tissue. It shows with.
図６から明らかな如く、マウスにSAとバクテリオファージとを注入すると、SAのみを注入した場合と比較して、SA生菌数が激減していることが判る。例えば、SAのみを注入して２日後のマウスの乳腺組織中のSA生菌数は約７×1010 CFUであるが、SAと１×107 PFUのバクテリオファージを注入して２日後のSA生菌数は約４×107 CFU程度であった。また、SAのみを注入して４日後のマウスの乳腺組織中のSA生菌数は約４×109 CFUであるが、SAと１×107 PFUのバクテリオファージを注入して４日後のSA生菌数は約５×104 CFU程度であった。
As is clear from FIG. 6, it can be seen that when SA and bacteriophage were injected into mice, the number of viable SA was drastically reduced compared to the case where SA alone was injected. For example, the number of viable SA in the mammary gland tissue of
すなわち、SA生菌数は、１×107 PFUのバクテリオファージ投与２日後で、SAのみを投与したSA群に比べ、約1,800分の１、投与４日後には約80,000分の１に減少していた。 That is, the number of viable SA decreased to about 1 / 800th after the administration of bacteriophage of 1 × 10 7 PFU, to about 1 / 800th, and to about 1 / 80,000 after 4 days of administration. It was.
また、このことから、本発明のバクテリオファージは、マウスの免疫系の中でもS.aureus溶菌活性を維持していることがわかる。 This also indicates that the bacteriophage of the present invention maintains S. aureus lytic activity in the mouse immune system.
以上の結果から、本発明のバクテリオファージを注射することにより、SA感染により発症した乳腺炎の炎症を抑制させ、乳腺組織中のSA生菌数を激減させることが出来ることが明らかとなり、本発明のバクテリオファージはSA感染による乳腺炎の治療に極めて有効な治療剤となり得ることがわかる。 From the above results, it is clear that by injecting the bacteriophage of the present invention, inflammation of mastitis caused by SA infection can be suppressed and the number of viable SA in the mammary tissue can be drastically reduced. It can be seen that the bacteriophage can be an extremely effective therapeutic agent for the treatment of mastitis caused by SA infection.
尚、(iv)ファージ群、すなわち本発明のバクテリオファージ１×107 PFUのみを注入して２日、４日経過後のマウスには、乳腺炎のみならず、ショック症状等の目立った変化は観察されなかった。
(Iv) Not only mastitis but also noticeable changes in shock symptoms, etc. were observed in mice after 2 days and 4 days after injection of the phage group, that is,
実施例８．
（１）乳腺炎モデルマウスの作製
SA注入の２時間前に仔マウスを分離した、出産後７〜10日の母親マウス（ddy系）の、Ｌ４、Ｒ４の乳頭下の乳槽内に、34G（ゲージ）の注射針で、下記(i)又は(ii)の全量（25μL）を注入した（バクテリオファージ非投与群、乳腺内投与群）。
(ｉ) [SA(SA003) １×103 CFU／25μL PBS]
(ii)[SA(SA003) １×103 CFU＋バクテリオファージ(φSA012) １×107 PFU]/25μL PBS
Example 8 FIG.
(1) Production of mastitis model mouse
With a 34G (gauge) needle in the milk tank under the L4 and R4 nipples of the mother mice (ddy strain) 7-10 days after delivery, the pups were isolated 2 hours before SA injection. The total amount (25 μL) of (i) or (ii) was injected (bacteriophage non-administration group, intramammary administration group).
(i) [SA (SA003) 1 × 10 3 CFU / 25 μL PBS]
(ii) [SA (SA003) 1 × 10 3 CFU + bacteriophage (φSA012) 1 × 10 7 PFU] / 25 μL PBS
また、上記と同様の準備をした母親マウスのＬ４、Ｒ４の乳頭下の乳槽内に、34G（ゲージ）の注射針で[SA(SA003) １×103 CFU／25μL PBS] 25μLを注入した。その後すぐに、[バクテリオファージ(φSA012) 4×107 PFU／100μL PBS] 100μLを、同じ母親マウスの頚静脈に注入した（血中投与群）。
尚、上記の組成の注射液は、夫々各2匹のマウスに投与した。
In addition, 25 μL of [SA (SA003) 1 × 10 3 CFU / 25 μL PBS] was injected into a milk tank under the L4 and R4 teats of a mother mouse prepared in the same manner as described above with a 34G (gauge) needle. . Immediately thereafter, 100 μL of [bacteriophage (φSA012) 4 × 10 7 PFU / 100 μL PBS] was injected into the jugular vein of the same mother mouse (blood administration group).
The injection solution having the above composition was administered to 2 mice each.
注射液の注入を完了後、６時間経過したところで、仔マウスを母親マウスに戻した。 The pup mice were returned to their mother mice after 6 hours had elapsed after completing the injection of the injection solution.
注入２日後に母親マウスの乳腺組織を採取して、以下のように乳腺組織中のSAの細菌数を算定した。 Two days after the injection, mammary gland tissue of the mother mouse was collected, and the number of SA bacteria in the mammary gland tissue was calculated as follows.
（２）乳腺組織中のSA生菌数の測定
上記(１)で採取した乳腺組織を適当量（15mg−20mg）チューブに採取し、１mL滅菌PBSに浮遊させた。次いで、全体重量からチューブ及びPBS等の重量を減ずることで、採取した組織の湿重量を測定した。
ビーズを用いて、約２分間乳腺組織を振盪破砕し、乳腺組織ホモジネートを調製した。得られた乳腺組織ホモジネートをPBSを用いて段階希釈（１×101−１×1010）した。
(2) Measurement of the number of viable SA in the mammary gland tissue The mammary gland tissue collected in (1) above was collected in an appropriate amount (15 mg-20 mg) tube and suspended in 1 mL sterile PBS. Next, the wet weight of the collected tissue was measured by subtracting the weight of the tube and PBS from the total weight.
Using the beads, the mammary tissue was shaken and crushed for about 2 minutes to prepare a mammary tissue homogenate. The obtained mammary gland tissue homogenate was serially diluted (1 × 10 1 −1 × 10 10 ) with PBS.
段階希釈液各100μLを夫々５％羊赤血球加寒天培地に塗布し、37℃で24時間培養し、コロニー数を数えた。コロニー数に乳腺組織ホモジネートの希釈率を乗じて菌数を算定し、それを乳腺組織ｇ重量あたりのSAの生菌数に換算した。 100 μL of each serial dilution was applied to 5% sheep erythrocyte agar medium, cultured at 37 ° C. for 24 hours, and the number of colonies was counted. The number of bacteria was calculated by multiplying the number of colonies by the dilution rate of the mammary tissue homogenate, and this was converted to the number of viable SA per g weight of mammary tissue.
（３）結果
結果を図７に示す。
(3) Results The results are shown in FIG.
すなわち、図７は、SAのみを乳腺内投与した場合（バクテリオファージを投与しなかった場合：バクテリオファージ非投与群）、１×103 CFUのSAと１×107 PFU のバクテリオファージを乳腺内投与した場合（乳腺内投与群）、１×103 CFU のSAを乳腺投与した後、4×107 PFUのバクテリオファージを血中投与した場合（血中投与群）の、夫々の場合における、乳腺組織ｇあたりのSA生菌数（CFU）を示す。データはそれぞれ乳腺組織3組織分（n=3）である。 7 shows that when only SA is administered intramammary (when bacteriophage is not administered: bacteriophage non-administered group), 1 × 10 3 CFU SA and 1 × 10 7 PFU bacteriophage are intramammary. When administered (intramammary administration group), after administration of 1 × 10 3 CFU of SA to mammary gland and then administration of 4 × 10 7 PFU of bacteriophage in blood (blood administration group), in each case, The SA viable cell count (CFU) per g of mammary gland tissue is shown. The data are for 3 mammary gland tissues each (n = 3).
図７から明らかな如く、マウスにSAとバクテリオファージとを注入した場合（乳腺内投与群、血中投与群）は、SAのみを注入した場合（バクテリオファージ非投与群）と比較して、SA生菌数が激減していることが判る。例えば、SAのみを注入して２日後のバクテリオファージ非投与群の乳腺組織中のSA生菌数は約5.5×104 CFUであるが、SAと１×107 PFUのバクテリオファージを組織内へ注入して２日後の乳腺内投与群のマウスの乳腺組織中のSA生菌数は約8×103 CFU程度であった。さらに、血液中へ4×107 PFUのバクテリオファージを注入して2日後の、血中投与群のマウスの乳腺組織中のSA生菌数は約2×103 CFUであった。
As is clear from FIG. 7, when SA and bacteriophage were injected into mice (intramammary administration group, blood administration group), SA was compared with the case where SA alone was injected (bacteriophage non-administration group). It can be seen that the number of viable bacteria has drastically decreased. For example, the number of viable SA in the mammary gland tissue in the bacteriophage
以上のことから、本発明のバクテリオファージを血中投与することにより、組織内へバクテリオファージ注入（乳腺内投与）する場合よりも、更に乳腺組織中のSA生菌数を減少させる効果が高く、本発明のバクテリオファージが安定して効いていることが判る。 From the above, by administering the bacteriophage of the present invention in blood, the effect of further reducing the number of SA live bacteria in the mammary gland tissue is higher than in the case of bacteriophage injection into the tissue (intramammary gland administration), It can be seen that the bacteriophage of the present invention works stably.
このことから、本発明のバクテリオファージは、血液中への投与で、組織内感染のS.aureusに対しても溶菌活性効果を発揮できることがわかる。
以上の結果から、本発明のバクテリオファージを血液中内に注射することによっても、SA感染により発症した乳腺炎の炎症を抑制させ、乳腺組織中のSA生菌数を激減させることが出来ることが明らかとなり、本発明のバクテリオファージはSA感染による乳腺炎の治療に極めて有効な治療剤となり得ることがわかる。
From this, it can be seen that the bacteriophage of the present invention can exert a lytic activity effect against S. aureus infected with tissue by administration into blood.
From the above results, even by injecting the bacteriophage of the present invention into blood, the inflammation of mastitis caused by SA infection can be suppressed, and the number of viable SA in the mammary tissue can be drastically reduced. It becomes clear that the bacteriophage of the present invention can be a very effective therapeutic agent for the treatment of mastitis caused by SA infection.
本発明のバクテリオファージは、ＭＲＳＡを含むS. aureusの複数の株に対して感染性と、高い溶菌活性を示す。従って、本発明のバクテリオファージを用いれば、ＭＲＳＡを含むS. aureusに対して有効な除菌剤や、感染症の予防剤及び治療剤を提供することができる。 The bacteriophage of the present invention exhibits infectivity and high lytic activity against multiple strains of S. aureus containing MRSA. Therefore, by using the bacteriophage of the present invention, it is possible to provide a disinfectant effective against S. aureus containing MRSA, and a preventive and therapeutic agent for infectious diseases.
また、本発明のバクテリオファージは、ウシ乳腺炎（乳房炎）の原因菌であるS. aureus株に対しても強い溶菌活性を示すので、S. aureusを原因菌として引き起こされるウシ乳腺炎に対する有効な防止剤、治療剤等を提供することができる。更に、ウシ以外の哺乳動物についても、S.aureusに感染することで引き起こされる乳腺炎に対して、乳腺炎の有効な予防剤、治療剤等を提供することが出来る。 In addition, since the bacteriophage of the present invention exhibits a strong lytic activity against the S. aureus strain which is the causative bacterium of bovine mastitis (mastitis), it is effective against bovine mastitis caused by S. aureus. Preventive agents, therapeutic agents, and the like. Furthermore, for mammals other than cattle, it is possible to provide effective preventive and therapeutic agents for mastitis against mastitis caused by infection with S. aureus .
図２において、各シンボルは、下記表８に記載の条件で試験した結果をそれぞれ示す。 In FIG. 2, each symbol indicates the result of testing under the conditions described in Table 8 below.
図３において、各シンボルは、下記表９に記載の条件で試験した結果をそれぞれ示す。 In FIG. 3, each symbol indicates the result of testing under the conditions described in Table 9 below.
図４及び図５において、太い矢印（▲）は、乳腺の炎症反応が腹膜まで達していることを示す部分を指す。また、細い矢印（→）は、注入した部位で、炎症反応が見られていることを示す部分を指す。
4 and 5, a thick arrow (▲) indicates a portion indicating that the inflammatory reaction of the mammary gland reaches the peritoneum. A thin arrow (→) indicates a portion indicating that an inflammatory reaction is observed at the injected site.
NITE BP-693
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