KR101643235B1 - Bacteriophage Siphoviridae family SAP4 against Staphylococcus aureus and composition thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 박테리오파지 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P) 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
More particularly, the present invention relates to a bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (KACC97023P) showing host susceptibility to Staphylococcus aureus (KACC97023P) and a composition containing the same.
황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 그람 양성의 구균이며, 포자를 형성하지 않는 통성혐기성균으로, 주로 가축 분변, 염증 상처부위 혹은 사람의 손이 많이 닿는 조리도구 등에서 발견된다. 인간과 동물에 감염하여 수술 후 감염, 농양, 심장 내막염 및 독소 증후군 등의 심각한 질병을 유도하는 대표적인 병원성 세균이다. 황색포도상구균이 내는 독소성 쇼크 신드롬 독소 TSST-1(Toxic ShockSyndrome Toxin-1), 엔테로톡신, EF(edema factor), α-톡신, β-톡신, γ-톡신 등의 독소는 심각한 식중독을 유발하기도 한다. Staphylococcus aureus is a gram-positive staphylococcus, a tuberous anaerobic microorganism that does not form spores and is found mainly in livestock feces, inflammation scarred areas, or cooking utensils with a lot of human hands. It is a typical pathogenic bacterium that infects humans and animals and induces serious diseases such as postoperative infection, abscess, endocarditis and toxin syndrome. Toxins such as Toxic Shock Syndrome Toxin-1, enterotoxin, edema factor, alpha-toxin, beta-toxin, gamma-toxin and the toxic shock syndrome toxin TSST-1 produced by Staphylococcus aureus cause severe food poisoning do.
황색포도상구균을 제어하기 위해 현재까지는 항생제가 주로 사용되어 왔다. 하지만, 메티실린 저항성 황색포도상구균 균주(Methicillin-resistant S. aureus), 반코마이신 저항성 황색포도상구균 균주(Vancomycin-resistant S. aureus) 등 항생제 저항성 세균을 발생하는 문제가 유발했다. 또한, 항생제 남용으로 인해 항생제가 병원균뿐 아니라 유익균도 죽임으로써 장내미생물의 균형이 무너져 염증성 장질환이나 알레르기는 물론 비만, 당뇨병 같은 대사질환도 크게 늘어났다고 보고된 바 있다.To date, antibiotics have been used to control Staphylococcus aureus. However, the problem of producing antibiotic-resistant bacteria such as methicillin-resistant S. aureus and vancomycin-resistant S. aureus was caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. In addition, the abuse of antibiotics caused the antibiotics to kill not only pathogens but also beneficial microorganisms, resulting in the collapse of intestinal microorganisms, leading to a significant increase in metabolic diseases such as inflammatory bowel disease and allergy, as well as obesity and diabetes.
이러한 문제를 극복하기 위한 방안으로 박테리오파지를 항생제 대체 물질로 사용할 수 있다. 1915년 영국의 미생물학자인 프레데릭 트워트가 처음으로 포도상구균의 용균 현상을 관찰하였고, 1917년 프랑스 세균학자인 펠릭스 데렐 역시 적리균에서 같은 현상을 관찰하게 되면서, 이것이 세균에 감염하는 바이러스(세균바이러스)에 의한 것임을 알아내었다. 이후, 세균을 감염하는 바이러스는 “세균(Bacteria)”을 “먹는다(Phage)”라는 의미에서 박테리오파지(bacteriophage)로 명명하였으며 간단히 “파지”로도 불리고 있다.To overcome this problem, bacteriophage can be used as an antibiotic substitute. In 1915, the British microbiologist Frederick Wuert first observed the lysis of Staphylococcus aureus. In 1917, the French bacteriologist Felix Derell also observed the same phenomenon in the genus Bacillus, and this was caused by a virus (bacterial virus) . Afterwards, the virus that infects bacteria is called "bacteriophage" in the sense of "Phage" of "Bacteria" and is also simply called "phage".
파지는 크게 2가지로, 용균성 생활사(lytic cycle)만을 반복하는 독성 파지(virulent phage)와, 용균성 생활사와 용원성 생활사(lysogenic cycle)를 모두 거치는 약독성 파지(temperate phage)로 분류한다. 용균성 생활사에 있는 파지의 경우, 세균 감염 약 30분 후에 100~200개의 새로운 파지를 만들어 세균의 막을 파괴하며 밖으로 나와 용균시키는데, 세균의 증식속도보다 파지의 증식속도가 훨씬 빠르므로 세균의 증식을 제한하는 중요한 요인이 될 수 있다. 약독성 파지는 숙주세균의 유전자에 파지의 유전자 정보를 넣어 파지의 모양은 사라지지만 숙주세균이 파괴되지도 않으며, 이런 상태는 숙주세균이 좋은 환경조건에 있는 한 지속하는데, 숙주세균의 환경이 악화되면, 숙주세균의 유전자에 있던 일부의 파지 유전자는 용균 사이클로 바뀌어 새로운 파지를 만들어 숙주세균을 용균시킨 후, 숙주세포 밖으로 방출된다. There are two major phage types: virulent phage, which repeats only the lytic cycle, and temperate phage, which passes both the life cycle and the lysogenic cycle. In the case of the phage in the microbial life cycle, after about 30 minutes of bacterial infection, 100 to 200 new phages are made to destroy the membrane of the bacteria and to lyse out, and the growth rate of the phage is much faster than the growth rate of the bacteria. It can be an important limiting factor. The phagocytosis of the host bacterium is caused by inserting the gene information of the phage into the gene of the host bacterium, but the phage disappears, but the host bacterium is not destroyed. This state continues as long as the host bacterium is in a good environmental condition, , A part of the phage gene in the gene of the host bacteria is converted into a lytic cycle to make a new phage and lysate the host bacteria and then released out of the host cell.
파지가 발견된 후 1910년부터 1930년대에 걸쳐서 선(腺) 페스트·콜레라 등의 세균성 질환을 치료하는데 파지를 이용하는 방안이 연구되었다. 그러나 파지의 숙주특이성 문제 및 파지의 치료목적으로의 제조에 있어, 숙주세균의 내독소, 외독소 문제 등 그 당시 과학적으로 해결할 수 없는 문제가 있어 이용에 제한이 있었다. 이와 유사한 시기인 1929년 플래밍이 발견한 페니실린 및 1943년 워크스만이 발견한 스트렙토마이신은 파지와 대조적으로 항균범위가 넓어 하나의 약으로 복수의 감염증에 효과를 나타냈으며, 처음에는 내성균 문제도 없었기 때문에 항생제를 이용한 화학요법제가 널리 사용되게 되고, 효과가 불확실한 파지요법은 점점 사라지게 되었다. 또한, (1) 파지의 숙주에 대한 감수성으로 인해 임상에 사용시 감염성이 다른 다양한 파지주가 필요한 점, (2) 동물의 생체 내에서는 파지의 용균작용이 일어나기 어려운 점, (3) 파지 내성균이 동일 세균집단에 존재한다는 이유 등으로 인해, 1950년대에 WHO에 의해 파지요법이 무효 선언되고, 동구권과 구 소련연방에서만이 명맥이 근근이 유지되어 왔다.From 1910 to the 1930s after the phage was discovered, the use of phage to treat bacterial diseases such as glandular feces and cholera was studied. However, there have been limitations in the use of phage as a host specificity problem and in the manufacture of phage for therapeutic purposes, problems such as endotoxin and exotoxin of host bacteria can not be scientifically solved at that time. Streptomycin, which was discovered by Flaming in 1929, and Streptomycin, which was discovered by Walkson in 1943, was effective against multiple infections due to a broader range of antimicrobials as opposed to phage. Initially, Because of the lack of antibiotics, chemotherapy was widely used, and phage therapies with uncertain effects became increasingly obsolete. In addition, (1) a variety of phage strains having different infectious properties are required in clinical use due to susceptibility to phage host, (2) the lytic action of phage is difficult to occur in the living animal, (3) In the 1950s, phage therapy was declared void by the WHO, due to the fact that it existed in the collective, and it was only in the Eastern and the former Soviet Union.
그런데, 1980년대에 들어 파지요법에 대한 생각이 바뀌게 되는데, 1982년 영국의 연구자그룹인 스미스와 휴긴스는 뇌막염 치료 모델실험으로 마우스를 이용하여 다음과 같이 실험하였다 (Smith HW, Huggins MB, J. Gen. Microbiol, 1982, Feb;128(2); 307-18). 즉, 마우스의 피하 근육 내에 균을 주사하고 반대쪽의 피하에는 균의 특이적인 독성 파지를 주사한 결과, 파지를 주사하지 않은 대조군은 100% 폐사한 것에 비해 파지를 주사한 실험군의 경우 100% 생존하였으며, 항생제(스트렙토마이신 등)의 효과보다도 우월한 결과를 나타낸 것이다. 특히, 놀라운 것은 균을 직접 뇌 내에 주사한 경우와 파지를 근육주사 하는 경우 모두에서 파지가 뇌에서 회수가 됨으로써, 근육 주사한 파지가 혈류를 통해 뇌 조직으로 이동하여 혈액뇌관문(blood-brain barrier)을 통과한다는 사실을 확인할 수 있었던 것이다.In the 1980s, the idea of phage therapy changed. In 1982, a group of researchers in the UK, Smith and Huggins, experimented with the mouse as an experimental model of meningitis (Smith HW, Huggins MB, J. Gen Microbiol, 1982, Feb; 128 (2), 307-18). In other words, as a result of injecting bacteria into the subcutaneous muscle of the mouse and injecting a specific toxic phage of the bacterium in the contralateral subcutaneous tissue, 100% of the control group in which the phage was not injected survived 100% , And antibiotics (such as streptomycin). In particular, the surprise is that the phage is recovered from the brain both in the case of injecting the bacteria directly into the brain and in the case of intramuscular injection of the phage, whereby the intramuscular phage migrates to the brain tissue through the bloodstream, ).
그 후, 독성 파지를 이용하여 송아지의 대장균성 설사증, 어류의 다양한 질병, 반코마이신 내성 장구균 패혈증, 결핵균, 닭의 파라티푸스 및 대장균 O157:H7 등 다양한 질병을 성공적으로 예방 및 치료한 사례가 보고되었으며, 파지를 직접 사용하는 방법뿐만 아니라, 파지가 숙주세균의 세포벽을 특이적으로 파괴하는데, 작용하는 리신(lysin)을 이용하여 탄저균, 폐렴구균 등에 특이적인 약제의 개발도 이루어지고 있는 실정이다.Thereafter, there have been reported cases of successful prevention and treatment of various diseases such as Escherichia coli diarrhea of calves, various diseases of fish, sepsis of vancomycin resistant enterococci, tuberculosis, chicken paratyphoid and E. coli O157: H7 using toxic phage, There has been developed a method of using a lysine which is effective for destroying the cell wall of a host bacterium and not only an anthrax bacteria,
한편, 최근 들어 항생제의 남용과 불필요한 처방으로 인해 기존 항생제로는 잘 죽지 않는 내성을 갖는 '슈퍼세균'이 발생하고 있다. 하지만, 항생제 개발이 내성균의 출현 속도를 따라잡지 못하고 있어, 항생제 내성균의 심각성이 큰 문제로 대두되고 있다.On the other hand, in recent years, 'super bacteria', which are resistant to conventional antibiotics due to abuse of antibiotics and unnecessary prescriptions, have occurred. However, since the development of antibiotics does not keep pace with the rate of occurrence of resistant bacteria, the seriousness of antibiotic resistant bacteria is becoming a serious problem.
따라서, 기존 항생제를 대체할 수 있는 물질 또는 항생제 내성 세균제어 방법의 개발이 요구되고 있으며, 이에 대한 연구가 시급한 실정이다.
Therefore, it is required to develop a method for controlling antibiotic resistant bacteria or substances capable of replacing existing antibiotics.
본 발명에서는 상기에서 살펴본 바와 같이 심각한 질병을 유발하는 병원성 세균인 황색포도상구균을 제어하는 박테리오파지를 새롭게 발견하여 제공하고자 한다.
As described above, the present invention provides a novel bacteriophage that regulates Staphylococcus aureus, a pathogenic bacterium that causes serious diseases.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 제공한다. 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 황색포도상구균에 대한 감염능력이 있어 이를 사멸시킬 수 있다. In order to achieve the above object, the present invention provides a bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (KACC97023P) showing host susceptibility to Staphylococcus aureus. The bacteriophage Sipoviridae family SAP4 of the present invention is capable of infecting Staphylococcus aureus and can kill it.
따라서, 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 황색포도상구균의 감염으로 인한 질병의 치료에 사용할 수 있고, 식품, 사료 등에 첨가되어 항생제 내성 세균을 제어할 수 있는 생물학적 조절제로 사용할 수도 있으며, 손세정제 등으로 사용될 수도 있다.Therefore, the bacteriophage SAP4 ( Siphoviridae family SAP4) of the present invention can be used for the treatment of diseases caused by infection with Staphylococcus aureus, and can be used as a biological modulator capable of controlling antibiotic resistant bacteria added to food, feed, And may be used as a hand cleansing agent.
본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 수축성이 없는 긴 꼬리(a long non-contractile tail)를 갖는 복합형의 시포비리데(Siphoviridae)에 속하는 것으로 동정되었고, 이중 나선 DNA (double stranded DNA)이며, 그 크기는 43,120 bp이다.The bacteriophage Sipoviridae family SAP4 of the present invention was identified as belonging to a complex type Siphoviridae having a long non-contractile tail, and double stranded DNA (double stranded DNA) and its size is 43,120 bp.
본 발명의 시포비리데(Siphoviridae)에 속하는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 사람 및 가축 등에 당뇨발, 농양, 독소 증후군 등의 질병을 일으키는 대표적인 박테리아인 황색포도상구균에 대한 숙주 감수성을 가져 이들을 사멸시킬 수 있다.The bacteriophage Sipoviridae family SAP4 ( Siphoviridae family SAP4) belonging to the present invention belongs to Siphoviridae belongs to the genus Siphoviridae family, and has a host susceptibility to Staphylococcus aureus, which is a typical bacteria causing diseases such as diabetic foot, abscess and toxin syndrome in human and livestock You can kill them.
한편, 본 발명은 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균사멸용 조성물을 제공한다. 상기 세균사멸용 조성물은 바람직하게 황색포도상구균 사멸용 조성물일 수 있는데, 황색포도상구균은 메티실린에 감수성이 있는 황색포도상구균 또는 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균일 수 있다.Meanwhile, the present invention provides a composition for killing bacteria, which comprises the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (KACC97023P) which shows host susceptibility to Staphylococcus aureus as an active ingredient. The composition for killing bacteria is preferably a composition for the destruction of Staphylococcus aureus. Staphylococcus aureus may be Staphylococcus aureus susceptible to methicillin or Staphylococcus aureus resistant to methicillin.
본 발명에 의한 세균 사멸용 조성물은 통상적인 미생물 제제 제조방법으로 제제화할 수 있다. 제제화의 방법 및 수단에 대해서는 특별히 한정되지 않으나, 인체에 투여하는 경우는 약제학적으로 허용하는 범위 내에서, 가축 또는 어류에 투여하는 경우는 수의학에서 허용하는 범위 내에서, 제제화하고 그에 따라 투여경로를 정할 수 있다.The composition for killing bacteria according to the present invention can be prepared by a conventional method for producing a microorganism preparation. The method and means of formulation are not particularly limited, but it is preferable that the dosage form is administered to a human body within a pharmacologically acceptable range, and when administered to a domestic animal or a fish, Can be determined.
본 발명의 세균 사멸용 조성물은 유효성분인 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) 외에, 필요에 따라 담체, 기타 보조제 등을 포함할 수 있는데, 담체는 생리식염수, 증류수, 사료, 박테리아용 배지 (예, Tryptic Soy Broth 등) 등이 될 수 있으며, 보조제는 pH 교정 등의 목적으로 완충액 등을 첨가하여 사용할 수 있다.In addition to the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 of the present invention, which is an effective ingredient of the present invention, the composition for killing bacteria may include carriers and other adjuvants as needed. The carrier may be physiological saline, distilled water, feed, A culture medium for bacteria (e.g., Tryptic Soy Broth, etc.), and an auxiliary agent can be used by adding a buffer solution or the like for the purpose of pH calibration or the like.
본 발명의 세균 사멸용 조성물은 액상, 분말상 등의 형태로 제조화될 수 있는데, 반드시 상기 2가지 제제에 한정되는 것은 아니고, 다양한 형태의 제형으로 제제화될 수 있다.The composition for killing bacteria according to the present invention may be prepared in the form of a liquid or a powder. However, the composition is not necessarily limited to the above-mentioned two preparations, but may be formulated into various forms.
본 발명의 세균 사멸용 조성물은 경구, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 경피, 비측 내, 흡입 또는 직장 등의 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 세균 사멸용 조성물의 투여량은 투여 대상에서 포도상구균을 사멸시키는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 제형의 조율 및 투여대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 경로, 투여 시간 및 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 그 양이 조절될 수 있다.The composition for killing bacteria can be administered in a conventional manner via routes such as oral, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, transdermal, intrathecal, inhalation or rectal routes. The dose of the composition for killing bacteria according to the present invention means an amount required for achieving the effect of killing staphylococci in an administration subject. Accordingly, the amount of the compound of the present invention may vary according to various factors including the kind of the disease, the severity of the disease, the dosage form and the age, body weight, general health condition, sex and diet, administration route, Lt; / RTI >
본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 기존에 약한 용균활성을 보이던 박테리오파지와 달리, 메티실린 항생제에 감수성이 있는 황색포도상구균 세균(MSSA)과 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균 세균(MRSA) 모두에 대해 우수한 감염능을 보이는데, 박테리오파지 감염 후 3시간 이후부터 용균활성을 보일 뿐만 아니라, 그 용균활성을 30시간 이상 오래 유지하는 특징을 갖는다.The bacteriophage Sipoviridae family SAP4 of the present invention differs from the bacteriophage in that it exhibits a weak lytic activity, and is different from the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 in that it is resistant to methicillin antibiotics, (MRSA), showing not only the lytic activity from 3 hours after the bacteriophage infection but also maintaining the lytic activity for more than 30 hours.
본 발명의 박테리오파지 또는 이를 포함한 세균 사멸용 조성물은 기존 항생제에 대한 내성 여부와 상관없이 황색포도상구균을 사멸시킬 수 있으므로, 황색포도상구균의 감염에 의한 질환 치료용으로 사용할 수 있고, 항생제 내성을 갖는 황색포도상구균에 사용 시, 기존 항생제로 제거할 수 없었던 항생제 내성균을 사멸시킬 수 있으므로, 기존 항생제 대체물로 유용하게 활용될 수 있다. 특히, 식품업, 축산업 및 어업에서, 식품, 축산물 및 수산물의 항생제 잔류 문제 등을 해결할 수 있는 항생제 사용의 대안으로써 제공될 수 있다.The bacteriophage of the present invention or the composition for killing bacterium including the bacteriophage of the present invention can kill the Staphylococcus aureus regardless of resistance to existing antibiotics and thus can be used for treating diseases caused by infection with Staphylococcus aureus, When used in Staphylococcus aureus, it can be used as a substitute for conventional antibiotics because it can kill antibiotic resistant bacteria that could not be removed with conventional antibiotics. In particular, it can be provided as an alternative to the use of antibiotics that can solve the problem of residual antibiotics in food, livestock and fisheries, food, livestock products and aquatic products.
한편, 본 발명은 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 첨가제를 제공한다. 또한, 본 발명은 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품첨가제 또는 식품은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 함유하기만 하면 그 제형에 특별히 국한되지 않으나, 대상식품은 황색포도상구균에 의해 오염되기 쉬운 식품이면 더욱 바람직하다.On the other hand, the present invention provides a food additive characterized in that it comprises a bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (KACC97023P) showing host susceptibility to Staphylococcus aureus. The present invention also provides a food composition comprising the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (KACC97023P) which shows host susceptibility to Staphylococcus aureus. The food additive or the food is not particularly limited to the form as long as it contains the bacteriophage Sipoviridae family SAP4, but it is more preferable that the food is susceptible to contamination with Staphylococcus aureus.
한편, 본 발명은 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제를 제공한다. 또한, 본 발명은 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 조성물을 제공한다. 상기 사료 첨가제 또는 사료 조성물은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 함유하기만 하면 그 제형에 국한되지는 않으나, 황색포도상구균에 감염되기 쉬운 가축을 대상으로 하는 사료 첨가제 또는 사료이면 더욱 바람직하다.
Meanwhile, the present invention provides a feed additive characterized in that it comprises a bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (KACC97023P) showing host susceptibility to Staphylococcus aureus. The present invention also provides a feed composition characterized by comprising a bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (KACC97023P) which shows host susceptibility to Staphylococcus aureus. The feed additive or feed composition is not limited to the formulation as long as it contains the bacteriophage Sipoviridae family SAP4, but is more preferably a feed additive or feed for the animal which is susceptible to infection with Staphylococcus aureus Do.
본 발명의 박테리오파지는 기존에 약한 용균활성을 보이던 박테리오파지와 달리, 메티실린 항생제에 감수성이 있는 황색포도상구균 세균(MSSA)과 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균 세균(MRSA)에도 우수한 감염능을 가져 박테리오파지 감염 후, 3시간 이후부터 용균 활성을 보이며, 그 용균 활성이 30시간 이상 오래 유지되므로 넓은 범위의 숙주를 효과적으로 억제할 수 있는 생물학적 조절제로서 활용될 수 있다.The bacteriophage of the present invention has excellent infectivity against Staphylococcus aureus bacteria (MSSA) which is sensitive to methicillin antibiotics and Staphylococcus aureus bacteria (MRSA) which is resistant to methicillin, unlike bacteriophages which have previously exhibited weak lytic activity The bacteriophage exhibits a lytic activity from 3 hours after the infection and can be utilized as a biological control agent capable of effectively inhibiting a wide range of hosts since its lactic activity is maintained for more than 30 hours.
또한, 본 발명의 박테리오파지는 기존 항생제에 대한 내성 여부와 상관없이 황색포도상구균을 사멸시킬 수 있으므로 황색포도상구균의 감염에 의한 질환 치료용으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 항생제 내성을 갖는 황색포도상구균으로 인한 의료 문제의 해결에도 이용될 수 있다.In addition, since the bacteriophage of the present invention can kill Staphylococcus aureus regardless of resistance to existing antibiotics, the bacteriophage can be used not only for treating diseases caused by infection with Staphylococcus aureus but also for treating diseases caused by Staphylococcus aureus having antibiotic resistance It can also be used to solve medical problems.
또한, 본 발명의 박테리오파지는 식품업, 축산업 및 어업에서 식품, 축산물 및 수산물의 항생제 잔류 문제 등을 해결할 수 있는 항생제 사용의 대안으로서 사용될 수 있을 뿐 아니라, 황색포도상구균이 쉽게 감염되는 조리도구 및 용기 등을 살균하는 친환경 대체살균제로서 사용할 수도 있다.
In addition, the bacteriophage of the present invention can be used as an alternative to the use of antibiotics that can solve the problem of remaining antibiotics in food, livestock products and aquatic products in food industry, animal husbandry industry and fishery, As an environmentally-friendly alternative disinfectant.
도 1은 본 발명에서 선별한 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 용균 활성능을 보여주는 그래프이다. 'Control'은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) 무처리군 (대조군)이고, 'SAP4'는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) 처리군 (실험군)이다.
도 3은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 숙주 수용기를 확인시켜주는 실험결과이다 (1: 황색포도상구균 야생형, 2: 테이코산을 합성하는 유전자를 제거한 돌연변이 균주, 3: 테이코산 합성 유전자를 회복시킨 재조합 균주). 1 is an electron micrograph of a bacteriophage Sipoviridae family SAP4 selected in the present invention.
2 is a graph showing the lytic action performance of the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (SAP4). 'Control' is a bacteriophage Sipoviridae family SAP4 untreated group (control group) and 'SAP4' is a bacteriophage Sipoviridae family SAP4 treated group (experimental group).
FIG. 3 shows experimental results confirming the host receptors of the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (1: a wild-type Staphylococcus aureus, 2: a mutant strain in which a gene to synthesize teichoic acid was removed, 3: Recombinant strains recovering genes).
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
Hereinafter, the structure of the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the scope of the present invention is not limited to the following embodiments, and includes modifications of equivalent technical ideas.
[실시예 1: 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지의 분리][Example 1: Isolation of bacteriophage specific to Staphylococcus aureus]
병원 유래 샘플에서 분리된 다양한 종류의 황색포도상구균의 염색체 상에 프로파지 상태로 존재하고 있는 박테리오파지를 분리하기 위해, 경상대학교병원 균주은행에서 분양받은 'Staphylococcus aureus clinical isolate 0136'를 취하여 이로부터 박테리오파지 분리실험을 수행하였다. Staphylococcus aureus clinical isolate 0136, purchased from Gyeongsang National University Hospital, was isolated from bacteriophage isolates from the chromosomes of various Staphylococcus aureus strains isolated from hospital-derived samples. Experiments were performed.
황색포도상구균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 프로파지 상태의 박테리오파지를 분리하기 위하여, 세균 배양용 TSB 배지(Tryptic Soy Broth)에 0.1 ㎖의 황색포도상구균(황색포도상구균 RN4220) 배양액을 첨가한 후, 2시간 동안 37℃에서 진탕배양하였다. 그 후, 10 μM의 미토마이신C를 처리하여 황색포도상구균의 염색체에 삽입되어 있는 박테리오파지가 세균을 용해시키고 나올 수 있도록 유도하였다. 이후, 상기의 배양액을 2시간 동안 37℃에서 진탕배양하였다. 그 후, 13,000 rpm의 속도로 1분 동안 4℃에서 원심분리하여 상등액을 취한 후, 이를 0.22 μm 막필터로 여과하였다. 이렇게 얻어진 여과액을 용균반 분석(plaque assay)을 통해 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지를 검출하였다. 0.1 ml of Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus RN4220) culture broth was added to TSB medium for bacterial culture (Tryptic Soy Broth) in order to isolate the bacteriophage which was capable of selectively killing Staphylococcus aureus, Lt; RTI ID = 0.0 > 37 C. < / RTI > Then, 10 μM of mitomycin C was treated to induce the bacteriophage inserted into the chromosome of Staphylococcus aureus to dissolve the bacteria. Then, the above culture was shake-cultured at 37 DEG C for 2 hours. The supernatant was then centrifuged at 4 ° C for 1 min at a rate of 13,000 rpm, and then filtered through a 0.22 μm membrane filter. Bacteriophage specific to Staphylococcus aureus was detected by a plaque assay of the filtrate thus obtained.
용균반 분석을 통한 박테리오파지의 검출은, 0.1 ㎖의 여과액과 12시간 이상 배양한 세균 0.1 ㎖의 현탁액 그리고 1 M 염화칼슘 0.1 ㎖를 섞어 주었다. 혼합 후, TSB에 낮은 농도의 아가를 섞은 소프트 아가 배지 (0.4% TSB soft agar)와 함께 섞어서 1.5% TSA 배지를 포함하는 플레이트에 부었다. 이후, 상기 플레이트를 37℃에서 12시간 동안 배양하였다.Detection of bacteriophage through the use of a spillage analysis was carried out by mixing 0.1 ml of the filtrate and 0.1 ml of the suspension of the bacteria cultured for 12 hours or more and 0.1 ml of 1 M calcium chloride. After mixing, TSB was mixed with soft agar medium (0.4% TSB soft agar) mixed with low concentration agar and poured into a plate containing 1.5% TSA medium. Thereafter, the plate was incubated at 37 DEG C for 12 hours.
일정 시간 경과 후, 목적하는 박테리오파지가 플레이트 상에 나타난 경우에 독립되고 투명한 용균반이 관찰되었다. 이 용균반 영역을 백금 루프를 이용하여 분리해 낸 다음, 새로운 세균 배양액에 넣어 37℃에서 배양하였는데, 배양액이 뿌옇게 보였지만 세균만 넣은 대조군과 비교해보았을 때 더 맑아짐을 확인하였다.After a certain period of time, when the desired bacteriophage appeared on the plate, an independent and transparent spill was observed. The platelets were separated using a platinum loop and then incubated at 37 ° C in a fresh culture medium. The culture broth was cloudy, but it was found to be clearer when compared with the control group containing only bacteria.
이후 배양액을 원심분리하고, 상등액을 취해 0.22 μm 막필터를 통해 여과시켜 용해물에 남아있는 모든 세균을 제거하고, 여과액만을 취하였다. 이때, 상기 여과액은 박테리오파지만을 포함한다. 상기의 과정을 통해 얻은 박테리오파지 용액을 가지고, 아가 배지 상에서 다르게 희석하고 주입하여 용균반의 재분리를 3회 수행하였고, 이와 같은 일련의 과정을 통해 순수한 박테리오파지를 얻을 수 있었다. 상기 얻은 박테리오파지를 '박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)'라고 명명하였다.The culture was then centrifuged, the supernatant was taken and filtered through a 0.22 μm membrane filter to remove any bacteria remaining in the lysate and only the filtrate was taken. At this time, the filtrate contains only bacteriophage. The bacteriophage solution obtained by the above procedure was diluted and injected differently on the agar medium, and the lysis of the lectin was performed three times. Through this series of steps, pure bacteriophage was obtained. The bacteriophage thus obtained was named 'bacteriophage sapoviride family SAP4 ( Siphoviridae family SAP4)'.
[[ 실시예Example 2 : 박테리오파지 2: Bacteriophage 시포비리데Sipoviride 패밀리family SAP4SAP4 ( ( SiphoviridaeSiphoviridae familyfamily SAP4SAP4 )의 형태 관찰 및 분류]) Observation and classification of morphology]
본 실시예에서는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 형태를 관찰하고자 하였다. In this Example, the morphology of the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 was observed.
박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 형태를 관찰하기 위해 염화세슘(CsCl) 밀도 구배법 (밀도: 0.39 g/㎖, 0.6 g/㎖, 0.67 g/㎖ 및 0.95 g/㎖)을 이용한 원심분리 (25,000 rpm, 2시간, 4℃)를 통하여 박테리오파지를 정제한 다음, 투과전자현미경을 사용하여 박테리오파지의 형태를 관찰하였다.(CsCl) density gradient method (density: 0.39 g / ml, 0.6 g / ml, 0.67 g / ml and 0.95 g / ml) was used to observe the morphology of the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 The bacteriophage was purified through centrifugation (25,000 rpm, 2 hours, 4 ° C), and then the morphology of the bacteriophage was observed using a transmission electron microscope.
이를 상세히 설명하면, 정제된 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 구리 격자(cupper grid)에 올리고, 2% 액상 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 음성 염색(negative staining)을 하고 건조하였다. 염색된 시료를 80 kV의 전압으로 에너지 여과 투과 전자현미경(LIBRA 120, CarlZeiss)을 이용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.In detail, the purified bacteriophage Sipoviridae family SAP4 was placed on a cupper grid, negatively stained with 2% liquid uranyl acetate, and dried. The dyed samples were observed with an energy filtration transmission electron microscope (LIBRA 120, Carl Zeiss) at a voltage of 80 kV, and the results are shown in FIG.
관찰결과, 박테리오파지를 모양으로 분류하는 기준으로 보았을 때, 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 머리가 길고 수축성이 없는 긴 꼬리(a long non-contractile tail)를 갖고, 시스(sheath)가 없으므로, 복합형의 시포비리데(Siphoviridae)에 속하는 것으로 분류하였다. 머리의 길이는 높이 131.5 nm, 너비 55.7 nm로 장형이며, 꼬리의 길이는 303.5 nm이다 (도 1). 도 1은 본 발명에서 선별한 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 전자현미경 사진이다.As a result, the bacteriophage SAP4 ( Siphoviridae family SAP4) has a long non-contractile tail with a long non-contractile tail, and the sheath And therefore they were classified as belonging to the hybrid Siphoviridae . The length of the head is long, 131.5 nm in width, 55.7 nm in width, and the tail length is 303.5 nm (Fig. 1). 1 is an electron micrograph of a bacteriophage Sipoviridae family SAP4 selected in the present invention.
한편, 상기와 같이 얻어진 시포비리데 속 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 미생물기탁기관인 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자정보센터(KACC)에 2014년 12월 4일자로 기탁하여 수탁번호 KACC97023P를 부여받았다.
On the other hand, the Sipoviridae family SAP4 obtained as described above was deposited on December 4, 2014 at the National Institute of Agricultural Science and Technology (KACC) of the National Institute of Agricultural Science, which is a microorganism depository institution, and deposited with Accession No. KACC97023P .
[[ 실시예Example 3 : 박테리오파지 3: Bacteriophage 시포비리데Sipoviride 패밀리family SAP4SAP4 ( ( SiphoviridaeSiphoviridae familyfamily SAP4SAP4 )의 숙주별 감수성() Susceptibility of host susceptibilitysusceptibility ) 확인]) Confirm]
본 실시예에서는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 숙주별 감수성을 확인하고자 하였다.In this example, the susceptibility of the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 to the host was examined.
숙주별 감수성은 연속 희석 적하법(serial dilution dropping method)을 사용하여 확인하였다 (Adams, M.H. 1959. Bacteriophage, pp27-34. Interscience Publishers Inc., New York). 10시간 배양한 세균 배양액과 0.4%의 소프트 아가 배지를 섞은 후, TSA 아가 플레이트 상에 부어서 37℃에서 15분간 건조하였고, 그 위에 희석배수 별로 희석된 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 떨어뜨리고, 상온에서 말린 후 37℃에서 10시간 정치 배양하였다. Host susceptibility was determined using the serial dilution dropping method (Adams, MH 1959. Bacteriophage, pp 27-34, Interscience Publishers Inc., New York). After incubation for 10 hours, 0.4% of soft agar medium was mixed. Then, the mixture was poured onto TSA agar plates and dried at 37 ° C for 15 minutes. Then, bacteriophage Sipoviridae family SAP4 diluted with dilution water was added thereto Dried at room temperature, and cultured at 37 ° C for 10 hours.
균주가 파지에 대해 감수성을 갖는 경우 플레이트 상에 용균반이 보이게 되며, 이는 세균 세포가 완전하게 용해되어 사멸된 결과를 나타낸다. 만약 감수성이 약한 경우, 뿌옇게 영역이 생길 수 있고, 리소스타핀(lysostaphin)과 같은 세균의 증식을 억제할 수 있는 항균성 효소가 존재하는 경우 억제 영역이 생길 수 있다.If the strain is susceptible to phage, a dissolution medium is visible on the plate, which results in complete dissolution of the bacterial cells and killing. If the susceptibility is weak, there may be cloudy areas, and inhibition areas may occur if antimicrobial enzymes are present that can inhibit the growth of bacteria such as lysostaphin.
하기 표 1에서는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 사용하여 메티실린 항생제에 감수성이 있는 황색포도상구균 세균(MSSA)과 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균 세균(MRSA)을 대상으로 숙주 감수성을 실험한 결과를 나타내었다.In Table 1 below, Staphylococcus aureus bacteria (MSSA) susceptible to methicillin antibiotics and Staphylococcus aureus bacteria resistant to methicillin (MRSA) were used in the bacteriophage Sipoviridae family SAP4, The results of the sensitivity test are shown.
a) C는 Clear plaque (투명한 용균반)을 형성하였다는 의미이고, I는 Inhibition zone (억제 영역)을 형성하는 것을 의미함. 억제영역은 박테리오파지에 의한 독립된 하나의 용균반이 형성되지는 않지만 어떠한 물질에 의해 세균의 증식이 억제됨을 의미함.
a) C means to form a clear plaque, and I means to form an inhibition zone. The inhibition zone means that no independent bacterium is formed by the bacteriophage but the growth of bacteria is inhibited by some substance.
실험결과, 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 메티실린 항생제에 감수성이 있는 포도상구균 세균(MSSA) 8종과 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균 세균, 스타필로코쿠스 아우레스(Staphylococcus aureus) CCARM 3793 균주를 용해시키는 세균 사멸능이 확인되었다. 다만, 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균 세균 스타필로코쿠스 아우레스(Staphylococcus aureus ) CCARM 3090에 대해서는 억제 영역이 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, the bacteriophage SAP4 ( Siphoviridae family SAP4) of the present invention was found to contain 8 strains of Staphylococcus aureus (MSSA) susceptible to methicillin antibiotics, 14 strains of Staphylococcus aureus resistant to methicillin, Bacterial killing ability to dissolve Staphylococcus aureus CCARM 3793 strain was confirmed. However, aureus Staphylococcus resistant to methicillin bacteria Staphylococcus brother-less (Staphylococcus aureus ) CCARM 3090, it was confirmed that a suppression region was formed.
[[ 실시예Example 4: 박테리오파지 4: Bacteriophage 시포비리데Sipoviride 패밀리family SAP4SAP4 ( ( SiphoviridaeSiphoviridae familyfamily SAP4SAP4 )의 용균 ) Lysine 활성능Bow performance ]]
본 실시예에서는 황색포도상구균 균주에 대한 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 용균 활성능을 확인하고자 하였다.In this example, the lytic activity of the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 against the Staphylococcus aureus strain was examined.
박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 용균 활성 확인을 위해 두 개의 시험군으로 나누어 실험을 실시하였다. 대조군(●)에는 숙주균주인 황색포도상구균(RN 4220)을 액체배지에서 배양하며 실험하였고, 실험군(■)에는 숙주 균주인 황색포도상구균(RN 4220)을 액체배지에서 1시간 30분 배양 후, 10 mM의 염화칼슘과 함께 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 감염시켰다. 감염 직후부터 시작하여 일정 시간 간격으로 대조군과 실험군 각각의 흡광도(OD600)를 측정하며 세포의 생장 및 사멸 정도를 파악하였다.In order to confirm the lytic activity of the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 ( SAP4 ), the experiment was divided into two test groups. Staphylococcus aureus (RN 4220), a host strain, was cultivated in a liquid medium, and Staphylococcus aureus (RN 4220), a host strain, was cultured in a liquid medium for 1 hour and 30 minutes in the experimental group () Bacteriophage Sipoviridae family SAP4 was infected with 10 mM calcium chloride. The absorbance (OD 600 ) of each of the control and experimental groups was measured at predetermined intervals starting from immediately after infection, and the degree of cell growth and death was determined.
실험 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 숙주에 감염 후 3시간 이후부터 용균 활성을 보이기 시작하며 그 용균 활성이 30시간 이상 오래 유지되는 것을 확인할 수 있었다 (도 2). 이와 같은 특징으로 말미암아, 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 오랜시간 용균 활성을 유지할 수 있는 효과적인 생물학적 조절제로 활용될 수 있는 것으로 판단할 수 있었다. 도 2는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 용균 활성능을 보여주는 그래프이다. 'Control'은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) 무처리군 (대조군)이고, 'SAP4'는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) 처리군 (실험군)이다.
As shown in FIG. 2, the bacteriophage SAP4 ( Siphoviridae family SAP4) of the present invention starts to exhibit lytic activity after 3 hours from infection in the host, and its lytic activity is maintained for more than 30 hours (Fig. 2). Due to this characteristic, the bacteriophage SAP4 ( Siphoviridae family SAP4) of the present invention can be used as an effective biological modulator capable of maintaining a lytic activity for a long time. 2 is a graph showing the lytic action performance of the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (SAP4). 'Control' is a bacteriophage Sipoviridae family SAP4 untreated group (control group) and 'SAP4' is a bacteriophage Sipoviridae family SAP4 treated group (experimental group).
[[ 실시예Example 5 : 박테리오파지 5: Bacteriophage 시포비리데Sipoviride 패밀리family SAP4SAP4 ( ( SiphoviridaeSiphoviridae familyfamily SAP4SAP4 )의 숙주 수용기 확인]) To identify host receptors]
본 실시예에서는 황색포도상구균에 감염하는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 작용 경로를 알아보기 위해 숙주 수용기 탐색을 목표로 실험을 수행하였다.In this example, experiments were carried out with the aim of searching for host receptors in order to study the action path of the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 ( Siphoviridae family SAP4) infected with Staphylococcus aureus.
10시간 배양한 야생 균주, 테이코산을 합성하는 유전자를 제거한 돌연변이 균주 및 테이코산 합성 유전자를 회복시킨 재조합 균주의 세 가지 세균 배양액과 0.4%의 소프트 아가 배지를 각각 섞어 TSA 아가 플레이트 상에 부어서 상온에서 15분 동안 건조하였고, 그 위에 희석배수 별로 희석된 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 떨어뜨리고 상온에서 말린 후 37℃에서 10시간 정치배양하였다.Three different bacterial cultures, a wild type strain cultured for 10 hours, a mutant strain in which a gene for synthesizing T. acidus was removed, and a recombinant strain in which a synthetic gene for T. acid was recovered, and 0.4% of soft agar medium were mixed and poured onto TSA agar plates, After drying for 15 minutes, the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 diluted by dilution drainage was dropped thereon, dried at room temperature, and incubated at 37 ° C for 10 hours.
실험결과, 도 3에서 보듯이 야생균주는 파지에 대해 감수성을 가지므로 플레이트 상에 독립된 투명한 영역인 용균반이 보인 반면, 테이코산 합성 유전자가 제거된 돌연변이 균주에 대해서는 용균반을 형성하지 못하는 것으로 관찰되었다. 또한, 테이코산 합성 유전자를 회복시킨 균주를 숙주세균으로 하여 실험을 수행하였을 때, 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)가 세포를 완전하게 사멸시킨 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)가 숙주세포를 감염시킬 때 테이코산을 수용체로 사용하는 사실을 확인할 수 있었다 (도 3). 도 3은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 숙주 수용기를 확인시켜주는 실험결과이다 (1: 황색포도상구균 야생형, 2: 테이코산을 합성하는 유전자를 제거한 돌연변이 균주, 3: 테이코산 합성 유전자를 회복시킨 재조합 균주).
As a result, as shown in FIG. 3, the wild strain was susceptible to the phage, and therefore, a transparent region, which is an independent transparent region, was observed on the plate, whereas a mutant strain in which the teico acid synthetase gene was deleted did not form a fungus . In addition, when the experiment was carried out using the strain recovered from the teichoic acid synthesis gene as a host bacterium, it was confirmed that the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 completely killed the cells. From these results, it was confirmed that the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 of the present invention uses teichoic acid as a receptor when infecting host cells (Fig. 3). FIG. 3 shows experimental results confirming the host receptors of the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (1: a wild-type Staphylococcus aureus, 2: a mutant strain in which a gene to synthesize teichoic acid was removed, 3: Recombinant strains recovering genes).
[[ 실시예Example 6: 박테리오파지 6: Bacteriophage 시포비리데Sipoviride 패밀리family SAP4SAP4 ( ( SiphoviridaeSiphoviridae familyfamily SAP4SAP4 )를 포함하는 세균사멸용 조성물(미생물 제제)의 제조]) (Preparation of Microbial Agent)
1) 액상 제제 11)
박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 황색포도상구균 배양액에 감염시켜 수득한 상등액을 여과하여 여과액을 준비하였다. 박테리오파지의 pfu (plaque forming unit; 파지가 용균반을 형성하는 것을 수치화한 단위, 세균의 경우 cfu (colony forming unit)와 유사한 개념임)를 계산하고, TSB 배지에 5.0x109 pfu/㎖의 양으로 준비하여 세균사멸용 액상 제제를 제조하였다.
The supernatant obtained by infecting the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 with the culture of Staphylococcus aureus was filtered to prepare a filtrate. The pfu of the bacteriophage (a unit which quantifies the formation of a plaque forming unit, a cfu (colony forming unit) in the case of bacteria) was calculated and added to the TSB medium in an amount of 5.0 × 10 9 pfu / To prepare a liquid preparation for bacterial killing.
2) 액상 제제 22)
상기 액상제제 1의 여과액을 생리식염수 100 ㎖ 당 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)가 5.0x1011 pfu/㎖이 되도록 혼합하여 세균사멸용 액상 제제를 제조하였다.
The
3) 분말형 제제3) Powdered preparation
대두분말 10 g 당 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)가 5.0x109 pfu/㎖이 되도록 액상제제 1의 여과액을 첨가, 혼합, 동결건조 및 분말화하여 세균사멸용 분말형 제제를 제조하였다.
The filtrate of
[[ 실시예Example 7: 박테리오파지 7: Bacteriophage 시포비리데Sipoviride 패밀리family SAP4SAP4 ( ( SiphoviridaeSiphoviridae familyfamily SAP4SAP4 )를 함유하는 식품 첨가제의 제조]) ≪ / RTI >
표고버섯 분말 50중량%, 새우 분말 30중량%, 다시마 분말 15중량%, 상기 실시예 6에서 제조한 분말형 제제 5중량%를 혼합하여 조미료로 사용될 수 있는 식품 첨가제 300 g을 제조하였다.
300 g of a food additive which can be used as a seasoning was prepared by mixing 50% by weight of shiitake mushroom powder, 30% by weight of shrimp powder, 15% by weight of kelp powder and 5% by weight of the powdery preparation prepared in Example 6.
[[ 실시예Example 8: 박테리오파지 8: Bacteriophage 시포비리데Sipoviride 패밀리family SAP4SAP4 ( ( SiphoviridaeSiphoviridae familyfamily SAP4SAP4 )를 함유하는 식품 조성물의 제조]) ≪ / RTI >
1) 우유 제조1) Milk production
우유 200 ㎖에 상기 실시예 6에서 제조한 액상 제제 2를 1%(w/v) 첨가하여 본 발명에 따른 우유 조성물을 제조하였다.
1% (w / v) of
2) 바나나 쥬스 제조2) Manufacture of banana juice
바나나를 믹서에 넣고 갈아 바나나 원액 180 ㎖를 준비한 후, 상기 실시예 6에서 제조한 액상 제제 2를 1%(w/v) 첨가하여 본 발명에 따른 바나나 쥬스 조성물을 제조하였다.
The banana was put into a mixer, and 180 ml of the banana stock solution was prepared. Then, 1% (w / v) of the
[[ 실시예Example 9: 박테리오파지 9: Bacteriophage 시포비리데Sipoviride 패밀리family SAP4SAP4 ( ( SiphoviridaeSiphoviridae familyfamily SAP4SAP4 )를 함유하는 사료 첨가제의 제조]) ≪ / RTI >
α-토코페롤 5.0중량%, 오징어간유 0.75중량%, 효모 93.25중량%, 상기 실시예 6에서 제조한 분말형 제제 1.0중량%를 혼합하여 사료 첨가제를 1 kg을 제조하였다.
1 kg of a feed additive was prepared by mixing 5.0 wt% of? -tocopherol, 0.75 wt% of squid liver oil, 93.25 wt% of yeast, and 1.0 wt% of the powdered preparation prepared in Example 6.
[[ 실시예Example 10: 박테리오파지 10: Bacteriophage 시포비리데Sipoviride 패밀리family SAP4SAP4 ( ( SiphoviridaeSiphoviridae familyfamily SAP4SAP4 )를 함유하는 사료의 제조]) ≪ tb >
1) 산란계용 사료조성물 제조1) Production of feed composition for laying hens
상기 실시예 6에서 제조한 분말형 제제 1.0중량%를 시판 산란계용 사료(디럭스 산란(제품명), 부국사료, 한국)에 첨가하여 산란계용 사료조성물 1 kg을 제조하였다.
1.0 weight% of the powdery preparation prepared in Example 6 was added to a feed for commercial laying hens (deluxe scattering (product name), Bupuji Feed, Korea) to prepare 1 kg of feed composition for laying hens.
2) 넙치 양식용 사료조성물 제조 2) Production of feed composition for flounder
어분 58중량%, 대두박 4중량%, 콘글루텐분 3중량%, 소맥분 28.8중량%, 오징어간유 4중량%, 비타민 혼합제 1.2중량% 및 미네랄 혼합제 1중량%를 포함한 기본 사료에 상기 실시예 6에서 제조한 분말형 제제 1.0중량%를 첨가하여 넙치 양식용 사료조성물 1 kg을 제조하였다.
The ingredients were added to a basic feed containing 58% by weight of fish meal, 4% by weight of soybean meal, 3% by weight of conglutinous powder, 28.8% by weight of wheat flour, 4% by weight of squid liver oil, 1.2% by weight of a vitamin mixture and 1% 1.0 kg of a powdered preparation was added to produce 1 kg of a feed composition for flounder.
Claims (8)
The bacteriophage Sapoviride family SAP4 ( Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P) showing host susceptibility to Staphylococcus aureus.
A composition for the destruction of Staphylococcus aureus comprising the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (KACC97023P) showing host susceptibility to Staphylococcus aureus as an active ingredient.
상기 황색포도상구균은,
메티실린에 감수성이 있는 황색포도상구균 또는 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균인 것을 특징으로 하는 황색포도상구균 사멸용 조성물.
3. The method of claim 2,
The Staphylococcus aureus strain,
Wherein the composition is a Staphylococcus aureus susceptible to methicillin or a Staphylococcus aureus resistant to methicillin.
A food additive characterized by comprising a bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (KACC97023P) exhibiting host susceptibility to Staphylococcus aureus.
And a bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (KACC97023P) showing host susceptibility to Staphylococcus aureus.
A feed additive characterized in that it comprises the bacteriophage Sipoviridae family SAP4 (KACC97023P) which shows host susceptibility to Staphylococcus aureus.
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