EA006678B1 - Применение ингибиторов протеазы вируса иммунодефицита человека (вич) для блокирования миграции клеток и/или инвазии, инфильтрации тканей и отека при лечении связанных с этим заболеваний - Google Patents
Применение ингибиторов протеазы вируса иммунодефицита человека (вич) для блокирования миграции клеток и/или инвазии, инфильтрации тканей и отека при лечении связанных с этим заболеваний Download PDFInfo
- Publication number
- EA006678B1 EA006678B1 EA200301130A EA200301130A EA006678B1 EA 006678 B1 EA006678 B1 EA 006678B1 EA 200301130 A EA200301130 A EA 200301130A EA 200301130 A EA200301130 A EA 200301130A EA 006678 B1 EA006678 B1 EA 006678B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- use according
- indinavir
- hiv
- tumor
- Prior art date
Links
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 45
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 title claims abstract description 27
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 239000004030 hiv protease inhibitor Substances 0.000 title claims description 18
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 title abstract description 30
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 title abstract description 30
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title abstract description 3
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 title description 36
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 title description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 90
- 230000009545 invasion Effects 0.000 claims abstract description 65
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 307
- QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N saquinavir Chemical group C([C@@H]([C@H](O)CN1C[C@H]2CCCC[C@H]2C[C@H]1C(=O)NC(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)C=1N=C2C=CC=CC2=CC=1)C1=CC=CC=C1 QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N 0.000 claims description 239
- CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N indinavir Chemical group C([C@H](N(CC1)C[C@@H](O)C[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H]2C3=CC=CC=C3C[C@H]2O)C(=O)NC(C)(C)C)N1CC1=CC=CN=C1 CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N 0.000 claims description 230
- 229960001852 saquinavir Drugs 0.000 claims description 230
- 229960001936 indinavir Drugs 0.000 claims description 227
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 120
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 64
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 claims description 58
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 claims description 49
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 49
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 48
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 34
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 34
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 30
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 29
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 28
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 28
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 28
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 claims description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 20
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 19
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 17
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 16
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 14
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 claims description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 10
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 8
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 7
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 claims description 7
- QAGYKUNXZHXKMR-UHFFFAOYSA-N CPD000469186 Natural products CC1=C(O)C=CC=C1C(=O)NC(C(O)CN1C(CC2CCCCC2C1)C(=O)NC(C)(C)C)CSC1=CC=CC=C1 QAGYKUNXZHXKMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 229960000884 nelfinavir Drugs 0.000 claims description 6
- QAGYKUNXZHXKMR-HKWSIXNMSA-N nelfinavir Chemical compound CC1=C(O)C=CC=C1C(=O)N[C@H]([C@H](O)CN1[C@@H](C[C@@H]2CCCC[C@@H]2C1)C(=O)NC(C)(C)C)CSC1=CC=CC=C1 QAGYKUNXZHXKMR-HKWSIXNMSA-N 0.000 claims description 6
- NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N Ritonavir Natural products C=1C=CC=CC=1CC(NC(=O)OCC=1SC=NC=1)C(O)CC(CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 claims description 5
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 5
- 229960000311 ritonavir Drugs 0.000 claims description 5
- NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N ritonavir Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1SC=NC=1)CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N 0.000 claims description 5
- 229960001830 amprenavir Drugs 0.000 claims description 4
- YMARZQAQMVYCKC-OEMFJLHTSA-N amprenavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN(CC(C)C)S(=O)(=O)C=1C=CC(N)=CC=1)NC(=O)O[C@@H]1COCC1)C1=CC=CC=C1 YMARZQAQMVYCKC-OEMFJLHTSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- KJHKTHWMRKYKJE-SUGCFTRWSA-N Kaletra Chemical compound N1([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)COC=2C(=CC=CC=2C)C)CC=2C=CC=CC=2)CCCNC1=O KJHKTHWMRKYKJE-SUGCFTRWSA-N 0.000 claims description 3
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 claims description 3
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 3
- 229960004525 lopinavir Drugs 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 208000004732 Systemic Vasculitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 claims description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 claims description 2
- 206010036784 proctocolitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 2
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 claims description 2
- 229940122440 HIV protease inhibitor Drugs 0.000 claims 13
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 claims 2
- 206010068771 Soft tissue neoplasm Diseases 0.000 claims 2
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims 2
- 208000020719 chondrogenic neoplasm Diseases 0.000 claims 2
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 claims 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 claims 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 43
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 29
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 abstract description 25
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 abstract description 25
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 abstract description 23
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 21
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract description 20
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 19
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 abstract description 16
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 11
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 abstract description 7
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 abstract description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 95
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 80
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 71
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 53
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 51
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 34
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 34
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 31
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 31
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 30
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 29
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 27
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 27
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 20
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 19
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 17
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 17
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 16
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 15
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 15
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 12
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 12
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 12
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 11
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 11
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 230000000477 gelanolytic effect Effects 0.000 description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 10
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 10
- 101000627872 Homo sapiens 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 9
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 9
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 8
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 7
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 7
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 7
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 7
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 7
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 7
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 7
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 6
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 6
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 6
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 6
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000007805 zymography Methods 0.000 description 6
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 5
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 5
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 5
- 239000000850 decongestant Substances 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 5
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 108091007196 stromelysin Proteins 0.000 description 5
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 4
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 4
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010010369 HIV Protease Proteins 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 4
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000000468 autoproteolytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 4
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 4
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 4
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 3
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 HIV-PI Substances 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000003501 anti-edematous effect Effects 0.000 description 3
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 3
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 3
- 230000002497 edematous effect Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100434503 Arabidopsis thaliana AGO8 gene Proteins 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 2
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000000963 caseinolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 2
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000007804 gelatin zymography Methods 0.000 description 2
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 2
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 208000019420 lymphoid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- PVRJOEAYRBQPLF-UHFFFAOYSA-N n-(2-hydroxypropyl)-n-(2-oxopropyl)nitrous amide Chemical compound CC(O)CN(N=O)CC(C)=O PVRJOEAYRBQPLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000216 vascular lesion Toxicity 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- FXEDIXLHKQINFP-UHFFFAOYSA-N 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1CC2(O)C(C=C(CO)CC3(O)C2C=C(C)C3=O)C4C(C)(C)C14OC(=O)C FXEDIXLHKQINFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 2-[benzyl-(4-methoxyphenyl)sulfonylamino]-n-hydroxy-4-methylpentanamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1S(=O)(=O)N(C(CC(C)C)C(=O)NO)CC1=CC=CC=C1 VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000005024 Castleman disease Diseases 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 1
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000975496 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 8 Proteins 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- OFFWOVJBSQMVPI-RMLGOCCBSA-N Kaletra Chemical compound N1([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)COC=2C(=CC=CC=2C)C)CC=2C=CC=CC=2)CCCNC1=O.N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1SC=NC=1)CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 OFFWOVJBSQMVPI-RMLGOCCBSA-N 0.000 description 1
- 208000002260 Keloid Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 description 1
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 1
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710169169 Polyprenol monophosphomannose synthase Proteins 0.000 description 1
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 229940079156 Proteasome inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 description 1
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Chemical class 0.000 description 1
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710108790 Stromelysin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100028848 Stromelysin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710108792 Stromelysin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100028847 Stromelysin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108050005271 Stromelysin-3 Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-N Terephthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- YQNQNVDNTFHQSW-UHFFFAOYSA-N acetic acid [2-[[(5-nitro-2-thiazolyl)amino]-oxomethyl]phenyl] ester Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(=O)NC1=NC=C([N+]([O-])=O)S1 YQNQNVDNTFHQSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009285 allergic inflammation Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Chemical class 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Chemical class 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002852 cysteine proteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000007646 directional migration Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000002874 effect on oedema Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 210000000442 hair follicle cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000000652 homosexual effect Effects 0.000 description 1
- 102000043827 human Smooth muscle Human genes 0.000 description 1
- 108700038605 human Smooth muscle Proteins 0.000 description 1
- 206010066435 human herpesvirus 8 infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000642 iatrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 201000001371 inclusion conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 210000001117 keloid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007762 localization of cell Effects 0.000 description 1
- 229940120922 lopinavir and ritonavir Drugs 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- YECBIJXISLIIDS-UHFFFAOYSA-N mepyramine Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CN(CCN(C)C)C1=CC=CC=N1 YECBIJXISLIIDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000582 mepyramine Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000008107 starch Chemical class 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000155 toxicity by organ Toxicity 0.000 description 1
- 230000007675 toxicity by organ Effects 0.000 description 1
- 206010044325 trachoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010055031 vascular neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
- A61K31/341—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide not condensed with another ring, e.g. ranitidine, furosemide, bufetolol, muscarine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/425—Thiazoles
- A61K31/426—1,3-Thiazoles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/472—Non-condensed isoquinolines, e.g. papaverine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/472—Non-condensed isoquinolines, e.g. papaverine
- A61K31/4725—Non-condensed isoquinolines, e.g. papaverine containing further heterocyclic rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение касается способа блокирования инвазии нормальных и неопластических клеток воспаления или иммунной системы, инфильтрации тканей и/или возникновения отека посредством ингибирования или модуляции таких молекул и протеолитических ферментов (но не исключительно), как ММП, для лечения всех заболеваний, патогенез которых связан с указанными процессами, включая раковые опухоли, нераковые ангиопролиферативные заболевания, воспалительные или аутоиммунные заболевания, причем способ основывается на применении ингибиторов протеазы вируса ВИЧ (ИПВИЧ).
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается применения ингибиторов протеазы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) для подавления инвазии тканей нормальными и/или неопластическими клетками, для лечения связанных с этим заболеваний, таких как саркома Калоши, раковые опухоли, ангиопролиферативные, воспалительные или аутоиммунные заболевания, связанные либо не связанные с заражением ВИЧ.
Уровень техники
Ингибиторы протеазы вируса ВИЧ - это соединения, обладающие известным антиретровирусным действием, которое описано, к примеру, в Эее1<5 е! а1. (Эеекк е! а1., 1997). Они применяются при лечении ВИЧ-инфекций у лиц, страдающих синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), выполняя функцию подавления созревания вируса и блокирования его репликации (Эее1<5 е! а1., 1997). В настоящем описании ингибиторы протеазы вируса ВИЧ также обозначаются в дальнейшем как ИПВИЧ.
Саркома Капоши (КЗ) - это раковая опухоль, связанная с заражением герпесвирусом 8 человека (ННУ8), которая особенно часто встречается у лиц, инфицированных вирусом ВИЧ (СПИД-КЗ) (Εη§ο1ί аий δΐϋτζΐ, 1998). К8 также наблюдается у лиц, не инфицированных ВИЧ, особенно в бассейне Средиземного моря и в Италии (классическая К8), в Африке (эндемическая К8) и у лиц после трансплантации органов, подвергаемых терапии иммунодепрессантами (ятрогенная К8) (Εηκοΐί аий δΐϋτζΐ, 1998). Нарушение регуляции иммунной системы, по-видимому, является необходимым условием возникновения КЗ у лиц, инфицированных ННУ8 (Εηκοΐί аий δΐϋτζΐ, 1998).
Различными авторами описано уменьшение встречаемости К8 и лимфомы (1п!етпа!юпа1 СойаЬотаίίοη оп Н1У аий Сапсег, 2000) или регрессию К8 (ЬеЬЬе е! а1., 1998; Са!!е1ап е! а1., 1999) у пациентов, инфицированных ВИЧ и подвергавшихся лечению комбинированными антиретровирусными препаратами, содержащими по меньшей мере один ИПВИЧ (Эее1<5 е! а1., 1997). К8 - это сосудистая опухоль, характеризующаяся ангиогенезом сосудистых клеток и инфильтрацией клеток воспаления, которая особенно часто встречается у гомосексуальных и бисексуальных мужчин, инфицированных ВИЧ одновременно с ННУ-8 (Εη§ο1ί апй δ!ϋτζ1, 1998). Образование пораженных участков опосредовано цитокинами и хемокинами, обладающими ангиогенным, пролиферативным, отекообразующим, хемотактическим и воспалительным действием. Эти цитокины вырабатываются клетками К8, активированными эндотелиальными клетками и клетками иммунной системы, инфильтрирующими ткани (Εη§ο1ί е! а1., 1989; Εη§ο1ί е! а1., 1994а; Εη§ο1ί е! а1., 1994Ь; ЕютеШ е! а1., 1995; Заташе^ е! а1., 1995; Заташе^ е! а1., 1997; Заташе^ е! а1., 1998; Вап11ап е! а1., 1999а). Из числа ангиогенных факторов основной фактор роста фибробластов (ЬЕОЕ) экспрессирован на высоком уровне в очагах КЗ и является наиболее важным аутокринным и паракринным фактором для роста КЗ и ангиогенеза (Εη§ο1ί е! а1., 1989; Εη§ο1ί е! а1., 1994а; Εη§ο1ί е! а1., 1994Ь; Зашаше^ е! а1., 1995; ЕютеШ е! а1., 1995; Заташе^ е! а1., 1997; Заташе^ е! а1., 1998; ВагШап е! а1., 1999а). Так, антитела или антисмысловые олигомеры, направленные против ЬЕОЕ, блокируют и ангиогенез, и возникновение КЗ-подобных поражений, индуцируемых при инокуляции первичных клеток КЗ мышам пийе, и рост клеток КЗ ίη νίίτο (Εη§ο1ί е! а1., 1989; Εη§ο1ί е! а1., 1994Ь; ВагШап е! а1., 1999в). И наоборот, инокуляция ЬЕОЕ мышам пийе способствует возникновению КЗ-подобных ангиопролиферативных очагов (Εη§ο1ί е! а1., 1994а; Заташе^ е! а1., 1998; ВагШап е! а1., 1999а), встречаемость и агрессивность которых повышаются белком Та! вируса ВИЧ-1, который способен имитировать действие белков внеклеточного матрикса. В частности, действие Та! на КЗ требует присутствия ЬЕОЕ или воспалительных цитокинов, которые в свою очередь индуцируют в эндотелиальных клетках и клетках КЗ выработку ЬЕОЕ и экспрессию интегринов, действующих как рецепторы Та! (Εη§ο1ί е! а1., 1990; ВагШап е! а1., 1992; ВагШап е! а1., 1993; Εη§ο1ί е! а1., 1994а; А1Шш е! а1, 1995; Е:югеШ е! а1., 1995; Е^геШ е! а1., 1998; ЕюгеШ е! а1., 1999; ВагШап е! а1., 1999а апй 1999Ь). Другой индуктор роста, ангиогенеза и сосудистой проницаемости, присутствующий в КЗ, - это фактор роста сосудистого эндотелия (УБОЕ), который совместно с ЬЕОЕ участвует в ангиогенезе и отечности КЗ (Заташе^ е! а1., 1998). Другие факторы, присутствующие в КЗ и совместно участвующие в ее возникновении, - это интерлейкины [Ш-1 и 1Ь-6, фактор некроза опухолей ΤΝΕ-α. интерферон ΙΓΝ-γ, колониестимулирующий фактор гранулоцитов/макрофагов (ОМ-СЗЕ), фактор роста из тромбоцитов (РЭСЕ), онкостатин М и хемокины (ΚАNТΕЗ, ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β и другие) (Εη§ο1ί апй Зй'цу! 1998). В частности, такие воспалительные цитокины, как 1Ь-1, Ш-6, ΤΝΤ-α и ΙΡΝ-γ, индуцируют в клетках КЗ и эндотелиальных клетках продукцию ЬЕОЕ и УВОЕ, вызывают приобретение эндотелиальными клетками фенотипа клеток КЗ и ангиогенности ίη νίνο, индуцируют очаги КЗ у мышей (Заташе^ е! а1., 1995; Е:югеШ е! а1., 1995; ЕютеШ е! а1., 1998; ВагШап е! а1., 1999а). Как и УНОЕ, наряду со стимулированием роста КЗ, ЬЕОЕ способен активировать все процессы, необходимые для ангиогенеза. В свою очередь, ангиогенез имеет принципиальное значение для роста опухолей и образования метастазов, для нераковых ангиопролиферативных заболеваний, и зачастую является важным компонентом хронических воспалительных заболеваний (Саттейе! апй 1аш, 2000). Кроме того, хемокины, вырабатываемые активироваными эндотелиальными клетками, клетками КЗ и клетками воспаления, инфильтрирующими ткани, такие как ΚΑΝΤΈ8, ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β, Ш-8, МСР-1 и другие, оказывают непрямые ангиогенные эффекты и действуют как хемоаттрактанты для клеток воспаления, вызывая этим дальнейшее пополнение и инфильтацию клеток воспаления и иммунной системы (инфицированных или нет
- 1 006678 вирусом ННУ-8) в ткани и пораженные участки (Εηδοίί апб 8!ϋτζ1, 1998). В этом плане при ангиогенезе, инфильтрации тканей клетками воспаления и отеках требуется разрушение базальной мембраны сосудов и/или внеклеточного матрикса специфичными протеазами, что создает условия для направленной миграции клеток в периваскулярном пространстве (инвазия и миграция эндотелиальных клеток или клеток воспаления/иммунной системы) или способствует утечке жидкости из кровотока (Сагтейе! апб 1аш, 2000). Кроме того, при ангиогенезе необходима и третья стадия, состоящая в пролиферации эндотелиальных клеток.
В частности, разрушение базальной мембраны сосудов и интерстициальной ткани опосредовано матричными металлопротеазами (ММП). Сами ММП необходимы для роста опухолей и метастазов, для инфильтрации тканей клетками воспаления и для возникновения отека (8!е!1ет-8!еуепкоп, 1999). В частности, инфильтрация тканей клетками воспаления играет важную роль в раковых, воспалительных и аутоиммунных заболеваниях, так как эти клетки вырабатывают факторы, включая ангиогенные факторы и воспалительные цитокины, которые обладают паракринным действием на соседние клетки. Из числа ММП для ангиогенеза необходима ММП-2, которая индуцируется ЬЕСЕ и сильно экспрессирована в первичных очагах К8 и в других неоплазиях (Εηκοΐί е! а1., 1994а; Вап11ап е! а1., 1999Ь; 8!е!1ет-8!еуепкоп, 1999), тогда как ММП-9 наиболее важна как медиатор инфильтрации моноцитов и лимфоцитов в тканях. Ингибирование миграции, инвазии или пролиферации эндотелиальных клеток либо активности ММП-2, ММП-9 или других ММП способно блокировать ангиогенез и является логическим основанием антиангиогенной и противоопухолевой терапии, применяемой в настоящее время (8!ебег-8!еуеп§оп, 1999; Κοίуипеп е! а1., 1999; Сатшейе! апб 1аш, 2000). Более того, местная и системная концентрация и/или активность ММП проявляет значительные колебания при некоторых патологических состояниях, включая инфекции, множественный склероз, воспалительные заболевания, иммунологические и раковые заболевания (Ецршо!о е! а1., 1993; Ьеррей Ό е! а1., 1998; Ьеррей е! а1., 2000), и поэтому может быть использована для диагностики, прогнозирования и лечения этих заболеваний.
Меньшую встречаемость и регрессию К8, наблюдавшиеся у лиц, инфицированных ВИЧ и подвергавшихся лечению ИПВИЧ (ЬеЬЬе е! а1., 1998; Са!!е1ап е! а1., 1999; 1п!егпа!юпа1 СойаЬотайоп оп Ηΐν апб Сапсег, 2000), связывали со способностью этого препарата ингибировать репликацию ВИЧ и, как следствие этого, выработку и выделение вирусом ВИЧ-1 белка Та!, сильного фактора прогрессирования К8 (Епкой е! а1., 1990; Епкой е! а1., 1994а; ВапПап е! а1., 1999а; Вап11ап е! а1., 1999Ь). Кроме того, посредством восстановления числа и функции специфических цитотоксических Т-лимфоцитов и активности нормальных клеток-киллеров применение ИПВИЧ повышает защитную иммунную реакцию против вируса ΗΗν-8, который считается возбудителем К8 (Епкой апб 8!ϋτζ1, 1998). Так, у пациентов, получавших ИПВИЧ, проявлялось снижение числа и ВИЧ (Иеекк е! а1., 1997), и ΗΗν-8, и вновь появлялись иммунологические ответы на ΗΗν-8 (В1ит е! а1., 1997; Κ^ζζ^е^^ е! а1., 1997; ЬеЬЬе е! а1., 1998; Октап е! а1., 1999; 8ίпапш е! а1., 1999; 8шапш е! а1., 2000; \Уапд е! а1., 2000).
В этой связи недавно были получены данные о том, что ИПВИЧ модулирует функцию дендритных клеток и презентацию антигена (Апбге е! а1., 1998; СтиЬег е! а1., 2001), уменьшая активацию Т-клеток и продукцию воспалительных цитокинов также и в отсутствие ВИЧ (Тоуо, АГО8 2000; Ьебти е! а1., 2000). Кроме того, один из ИПВИЧ, а именно ритонавир, как оказалось, оказывает сильное влияние на активность протеасом, что ведет к изменению процессинга и презентации антигенного эпитопа главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса I (Апбге е! а1., ΡΝΑ8 1998; патентная заявка XVО 99/63998). Эти данные свидетельствуют о том, что ИПВИЧ может обладать свойствами иммуномодулятора (Апбге е! а1., ΡNΑ8 1998; Тоуо, АГО8 2000; патентная заявка νθ 99/63998; патентная заявка νθ 0033654). Более того, поскольку известно, что протеасомы также участвуют в ангиогенезе (О1ка^а е! а1., 1998), эти данные предполагают, что ИПВИЧ может влиять и на ангиогенез. Кроме того, полученные недавно данные показывают, что ИПВИЧ обладает свойствами модулятора некоторых клеточных процессов, включая активацию, выживание и пролиферацию клеток (патентная заявка νθ 99/63998; патентная заявка νθ 0033654). На основании этих данных высказывалось предположение, что ингибиторы протеаз, включая ИПВИЧ, ингибиторы протеасом, ингибиторы микробных и вирусных протеаз, ингибиторы цистеиновых или сериновых протеаз, могут быть использованы для модуляции клеточных реакций и метаболизма при лечении ряда заболеваний человека путем воздействия на эти клеточные реакции.
В отличие от этого, мы предположили, что ИПВИЧ может оказывать прямые и специфические эффекты на инвазию клеток и проницаемость сосудов вследствие его действия на ферменты или молекулы, участвующие в этих процессах, а именно молекулы, не связанные с клеточными протеасомами типа (но не исключительно) ММП. Таким образом, уменьшение встречаемости и регрессия К8, наблюдавшиеся у лиц, получавших ИПВИЧ, может быть обусловлена ингибированием ИПВИЧ инвазии эндотелиальных клеток и клеток К8, инфильтрации тканей клетками воспаления и/или иммунной системы и возникновения отека. Следует отметить, что такие эффект ИПВИЧ нельзя было предвидеть на основании существующих исследований. Так, все эти исследования сходятся в том, что приписывают снижение встречаемости и регрессию К8 у лиц, получавших ИПВИЧ, ингибированию ВИЧ-инфекции с последующим уменьшением экспрессии белка Та!, восстановлению иммунной системы и последующему исчезновению ΗΗν8 из крови или пораженных участков, либо иммуномодуляторному действию ИПВИЧ (В1ит е! а1.,
- 2 006678
1997; ΚίζζίβΓί е! а1., 1997; ЬеЬЬе е! а1., 1998; Όβ Μίΐίΐο е! а1., 1999; Сайе1ап е! а1., 1999; Октап е! а1., 1999; 8шапш е! а1., 1999; 8шапт е! а1., 2000; Аапд е! а1., 2000; патентные заявки АО 99/63998 и АО 0033654). Напротив, предполагаемые нами эффекты никогда не были описаны или изучены до того.
Раскрытие изобретения
Объектом настоящего изобретения является применение ингибиторов протеазы вируса ВИЧ (ИПВИЧ) для блокирования миграции и/или инвазии нормальных и неопластических клеток воспаления или иммунной системы, инфильтрации тканей и/или возникновения отека посредством ингибирования или модуляции таких молекул и протеолитических ферментов (но не исключительно), как ММП, при лечении всех заболеваний, патогенез которых связан с такими процессами, включая раковые опухоли, нераковые ангиопролиферативные заболевания, воспалительные или аутоиммунные заболевания.
Следующим объектом изобретения является способ блокирования миграции и/или инвазии нормальных и неопластических клеток воспаления или иммунной системы, инфильтрации тканей и/или возникновения отека посредством ингибирования или модуляции таких молекул и протеолитических ферментов (но не исключительно), как ММП, что достигается применением ингибиторов протеазы вируса ВИЧ (ИПВИЧ).
Следующим объектом настоящего изобретения является применение ингибиторов протеазы вируса ВИЧ (ИПВИЧ) для получения лекарственных препаратов, обладающих способностью к блокированию миграции и/или инвазии клеток и инфильтрации тканей посредством ингибирования таких молекул и протеолитических ферментов (но не исключительно), как ММП, чтобы оказывать антиангиогенное действие при лечении раковых опухолей и нераковых ангиопролиферативных заболеваний у лиц, инфицированных или не инфицированных вирусом ВИЧ.
Следующим объектом изобретения является применение ингибиторов протеазы вируса ВИЧ (ИПВИЧ) для блокирования инвазии раковых клеток у лиц, инфицированных или не инфицированных вирусом ВИЧ.
Следующим объектом изобретения является применение ингибиторов протеазы вируса ВИЧ (ИПВИЧ) для получения лекарственных препаратов, обладающих противоотечной активностью и способных блокировать инфильтрацию тканей клетками воспаления и иммунной системы при лечении воспалительных и аутоиммунных заболеваний у лиц, инфицированных или не инфицированных вирусом ВИЧ.
Следующим объектом изобретения является применение ингибиторов протеазы вируса ВИЧ (ИПВИЧ) для получения лекарственных препаратов для лечения саркомы Капоши у лиц, инфицированных или не инфицированных вирусом ВИЧ.
Следующим объектом изобретения является применение ингибиторов протеазы вируса ВИЧ (ИПВИЧ) для получения лекарственных препаратов, обладающих способностью к блокированию миграции и/или инвазии клеток и инфильтрации тканей посредством ингибирования таких молекул и протеолитических ферментов (но не исключительно), как ММП, чтобы оказывать антиангиогенное, противоопухолевое, противоотечное и/или противовоспалительное действие при лечении саркомы Капоши, раковых опухолей и нераковых ангиопролиферативных, воспалительных и аутоиммунных заболеваний у лиц, инфицированных вирусом ВИЧ.
Следующим объектом изобретения является применение в вышеуказанных целях соединений, известных как СлхАап® (индинавир) фирмы Мегск, 8йатр апй Пойте; 1пу1та8е® или Ройоуаке® (саквинавир) фирмы Восйе; Νονίτ® (ритонавир) фирмы АЬЬо!! ЬаЬогаЮпек; Утасер!® (нельфинавир) фирмы Косйе; Адепегаке® (ампренавир) фирмы О1ахо Ае11соте; Ка1е!га® (лопинавир и ритонавир) фирмы АЬЬо!! ЬаЬогаЮпек.
Следующим объектом изобретения является применение ингибиторов протеазы вируса ВИЧ (ИПВИЧ) и вышеперечисленных соединений при вышеуказанных показаниях в комбинации друг с другом и/или вместе с противовоспалительными, антиангиогенными или противораковыми препаратами.
Следующим объектом изобретения является применение химических аналогов или производных ингибиторов протеазы ВИЧ (ИПВИЧ), перечисленных выше, обладающих способностью к блокированию инвазии нормальных и неопластических клеток воспаления или иммунной системы и инфильтрации тканей вследствие ингибирования таких молекул и протеолитических ферментов (но не исключительно), как ММП, и поэтому обладающих антиангиогенной, противоопухолевой, противоотечной и противовоспалительной активностью, поодиночке или в комбинации друг с другом и/или вместе с противовоспалительными, антиангиогенными или противоопухолевыми препаратами.
Другие объекты изобретения станут понятными из следующего подробного описания изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 (панели А и В). Индинавир и саквинавир не оказывают влияния на базальную или ЬРОРиндуцированную пролиферацию первичных макрососудистых (пупковая вена) эндотелиальных клеток. Панель А: влияние индинавира на базальную или ЬРОР-индуцированную пролиферацию клеток. Панель В: влияние саквинавира на базальную или ЬРОР-индуцированную пролиферацию клеток.
Фиг. 2 (панели А и В). Индинавир и саквинавир ингибируют миграцию макрососудистых (пупковая вена) эндотелиальных клеток в ответ на ЬРОР. Панель А: влияние индинавира на миграцию клеток. Панель В: влияние саквинавира на миграцию клеток.
- 3 006678
Фиг. 3 (панели А и В). Индинавир и саквинавир ингибируют инвазию макрососудистых (пупковая вена) эндотелиальных клеток в ответ на ЬЕСЕ. Панель А: влияние индинавира на инвазию клеток. Панель В: влияние саквинавира на инвазию клеток.
Фиг. 4. Индинавир и саквинавир не влияют на пролиферацию микрососудистых (дермальных) эндотелиальных клеток в ответ на ЬЕСЕ.
Фиг. 5. Индинавир и саквинавир ингибируют инвазию микрососудистых (дермальных) эндотелиальных клеток в ответ на ЬЕСЕ.
Фиг. 6. Индинавир и саквинавир не влияют на пролиферацию гладкомышечных клеток в ответ на ЬЕСЕ.
Фиг. 7. Индинавир и саквинавир ингибируют инвазию гладкомышечных клеток в ответ на ЬЕСЕ.
Фиг. 8 (панели А, В и С). Индинавир блокирует активацию ММП-2. Панель А: желатинолитическая активность, соответствующая латентной ММП-2 (72 кД), преактивной ММП-2 (64 кД) или активной ММП-2 (62 кД), в супернатантах из эндотелиальных клеток, обработанных или не обработанных ЬЕСЕ в присутствии или в отсутствие индинавира. Панель В: денситометрическое определение латентной ММП2. Панель С: денситометрическое определение преактивной и активной форм ММП-2.
Фиг. 9 (панели А, В и С). Саквинавир блокирует активацию ММП-2. Панель А: желатинолитическая активность, соответствующая латентной ММП-2 (72 кД), преактивной ММП-2 (64 кД) или активной ММП-2 (62 кД), в супернатантах из эндотелиальных клеток, обработанных или не обработанных ЬЕСЕ в присутствии или в отсутствие саквинавира. Панель В: денситометрическое определение латентной ММП-2. Панель С: денситометрическое определение преактивной и активной форм ММП-2.
Фиг. 10. Индинавир и саквинавир блокируют аутопротеолитическое превращение пре-ММП2 в активную форму.
Фиг. 11 (панели А и В). Саквинавир блокирует продукцию казеин-специфичных ММП в эндотелиальных клетках. Панель А: зимография казеина в супернатантах из эндотелиальных клеток, обработанных ЬЕСЕ или ТРА в присутствии или в отсутствие саквинавира в течение 8 ч. Панель В: зимография казеина в супернатантах из эндотелиальных клеток, обработанных ЬРСР или ТРА в присутствии или в отсутствие саквинавира в течение 8 ч.
Фиг. 12 [(1) (панели а-б) и (2) (панели а-й)]. Индинавир и саквинавир ингибируют индуцированное ЬРСР образование ангиопролиферативных очагов у мышей пибе. А) панель а: места инъекций у репрезентативных мышей, получавших физраствор и инокулированных только матригелем; панель Ь: места инъекций у репрезентативных мышей, получавших физраствор и инокулированных ЬРСР в матригеле; панель с: места инъекций у репрезентативных мышей, получавших индинавир и инокулированных ЬРСР в матригеле; панель б: места инъекций у репрезентативных мышей, получавших саквинавир и инокулированных ЬРСР в матригеле. В) панели а и Ь: микроскопия мест инъекций у репрезентативных мышей, получавших физраствор и инокулированных только матригелем (панель а: увеличение х100, панель Ь: увеличение х100); панели с и б: микроскопия мест инъекций у репрезентативных мышей, получавших физраствор и инокулированных ЬРСР в матригеле (панель с: увеличение х100, панель б: увеличение х100); панели е и ί: микроскопия мест инъекций у репрезентативных мышей, получавших индинавир и инокулированных ЬРСР в матригеле (панель е: увеличение х100, панель ί: увеличение х100); панели д и й: микроскопия мест инъекций у репрезентативных мышей, получавших саквинавир и инокулированных ЬРСР в матригеле (панель д: увеличение х100, панель й: увеличение х100).
Фиг. 13 (панели А и В). Индинавир и саквинавир ингибируют способность к инвазии у клеток К8. Панель А: влияние индинавира на инвазию клеток. Панель В: влияние саквинавира на инвазию клеток.
Фиг. 14. Индинавир и саквинавир не влияют на пролиферацию гибридных клеток эндотелия/легочной карциномы (Еа-йу 926).
Фиг. 15. Индинавир и саквинавир ингибируют способность к инвазии у гибридных клеток эндотелия/ легочной карциномы (Еа-йу 926).
Фиг. 16. Индинавир и саквинавир не влияют на пролиферацию клеток гепатокарциномы (8К-Нер-1).
Фиг. 17. Индинавир и саквинавир ингибируют способность к инвазии у клеток гепатокарциномы (8К-Нер-1).
Фиг. 18. Индинавир и саквинавир не влияют на пролиферацию клеток легочной карциномы (А549).
Фиг. 19. Индинавир и саквинавир ингибируют способность к инвазии у клеток легочной карциномы (А549).
Фиг. 20. Индинавир и саквинавир не влияют на пролиферацию клеток карциномы молочной железы (ΜΌΆ-ΜΒ-468).
Фиг. 21. Индинавир и саквинавир ингибируют способность к инвазии у клеток карциномы молочной железы (ΜΌΆ-ΜΒ-468).
Фиг. 22. Индинавир и саквинавир ингибируют способность к инвазии у клеток миеломоноцитарной лейкемии (И937).
Фиг. 23 (панели а, Ь, с, б, е и ί). Индинавир и саквинавир ингибируют образование К8-подобных очагов, вызванное инокуляцией клеток К8 у мышей пибе. Панели а и Ь: микроскопия места инъекции клеток К8 у репрезентативной мыши, получавшей физраствор (панель а: увеличение х100, панель Ь: уве
- 4 006678 личение х400). Панели с и й: микроскопия места инъекции клеток КБ у репрезентативной мыши, получавшей индинавир (панель с: увеличение х250, панель й: увеличение х400). Панели е и £: микроскопия места инъекции клеток КБ у репрезентативной мыши, получавшей саквинавир (панель е: увеличение х250, панель £: увеличение х400).
Фиг. 24. Индинавир и саквинавир способствуют регрессии КБ-подобных очагов, вызванных инокуляцией клеток КБ у мышей пийе.
Фиг. 25. Индинавир и саквинавир способствуют регрессии опухолевых ангиогенных очагов, вызванных инокуляцией гибридных клеток эндотелия/легочной карциномы (Еа-йу 926) у мышей пийе.
Фиг. 26. Индинавир и саквинавир ингибируют образование опухолевых очагов, вызванное инокуляцией клеток гепатокарциномы (БК-Нер-1) у мышей пийе.
Фиг. 27. Индинавир и саквинавир ингибируют образование КБ-подобных очагов, вызванное инокуляцией клеток легочной карциномы (А549) у мышей пийе.
Фиг. 28. Индинавир и саквинавир ингибируют образование опухолевых очагов, вызванное инокуляцией клеток карциномы молочной железы (ΜΌΆ-ΜΒ-468) у мышей пийе.
Фиг. 29. Индинавир и саквинавир ингибируют образование опухолевых очагов, вызванное инокуляцией клеток миеломоноцитарной лейкемии (И937) у мышей пийе.
Фиг. 30. Индинавир и саквинавир ингибируют образование опухолевых очагов, вызванное инокуляцией клеток Т-клеточной лейкемии (1игка!) у мышей пийе.
Фиг. 31. Индинавир и саквинавир блокируют сосудистую проницаемость и отеки, вызванные инокуляцией клеток КБ у мышей пийе.
Фиг. 32 (панели А и В). Индинавир и саквинавир блокируют продукцию воспалительных цитокинов типа 1Ь-6 клетками КБ. Панель А: влияние индинавира на продукцию цитокинов. Панель В: влияние саквинавира на продукцию цитокинов.
Осуществление изобретения
Перед описанием основной части изобретения приводим следующие определения.
Инвазия клеток - процесс, посредством которого клетки мигрируют в ткань или базальную мембрану вследствие разрушения внеклеточного матрикса или базальной мембраны протеолитическими ферментами.
Инфильтрация ткани - локализация клеток в ткани после их миграции из отдаленных мест вследствие инвазии клеток.
Отек - утечка жидкости из кровеносных или лимфатических сосудов вследствие активности инфильтрирующих или резидентных клеток, выделяющих факторы, изменяющие проницаемость капиллярного эндотелия и структуру базальной мембраны под действием протеаз, в том числе матричных металлопротеаз.
Внеклеточный матрикс - материал, вырабатываемый клетками и заполняющий межклеточное пространство, который имеется в непостоянном количестве во всех тканях.
Базальная мембрана - белковая структура, вырабатываемая клетками, находящимися под нормальным эндотелием или эпителием, и отделяющая их от подлежащей ткани.
Матричные металлопротеазы - эндопептидазы, способные расщепить практически любой компонент внеклеточного матрикса, которые подразделяются на коллагеназы, желатиназы, стромелизины и матрилизины.
Недавно было описано уменьшение встречаемости или регрессия КБ у пациентов, инфицированных ВИЧ-1 и подвергавшихся лечению высокоактивными антиретровирусными препаратами (ΗΑΑΚΤ), содержащими по меньшей мере один ИПВИЧ, такой как индинавир или саквинавир (ЬеЬЬе е! а1., 1998; Са(1е1ап е! а1., 1999; 1п1егпа(1опа1 СойаЬотайоп оп Ηΐν апй Сапсег, 2000). Эти эффекты приписывали блокированию репликации вируса ВИЧ, блокированию репликации вируса ΗΗν8 и/или восстановлению эффективных иммунных реакций против ΗΗν-8 и ВИЧ (В1ит е! а1., 1997; Й1хх1еп е! а1, 1997; ЬеЬЬе е! а1., 1998; Ие Мййо е! а1., 1999; Са!!е1ап е! а1., 1999; Октап е! а1., 1999; Бшапш е! а1., 1999; Бтапш е! а1, 2000; \Уапд е! а1., 2000). С другой стороны, наши прошлые и недавние исследования свидетельствуют, что цитокины, факторы роста и ангиогенные факторы (особенно ЬБСБ). вырабатываемые клетками КБ, эндотелиальными клетками и клетками иммунной системы, опосредуют образование очагов КБ, а инвазия эндотелиальных клеток и клеток КБ, инфильтрация тканей этими клетками, клетками воспаления и клетками иммунной системы, возникновение отека и активация или увеличение продукции ММП являются ключом к возникновению и росту очагов КБ (Епкой е! а1., 1989; ЕпкоН е! а1., 1994а; БютеШ е! а1., 1995; Баташедо е! а1., 1995; Баташедо е! а1., 1997; Епкой апй Б1йгх1. 1998; БютеШ е! а1., 1998; Баташедо е! а1., 1998; Вап11ап е! а1., 1999а; ВагШап е! а1., 1999Ь; БютеШ е! а1., 1999). Так, вопреки устоявшимся взглядам в научном сообществе, мы высказали гипотезу, что регрессия КБ у лиц со СПИДом-КБ, подвергавшихся лечению ИПВИЧ, обусловлена прямым действием ИПВИЧ на инвазию клеток, инфильтрацию тканей и отек вследствие эффектов на молекулы и ферменты, участвующие в этих процессах и отличные от протеасом. Используя модели ίπ У1!то, мы показали, что индинавир и саквинавир в тех же концентрациях, что и в плазме подвергавшихся лечению пациентов, блокируют миграцию и инвазию первичных макрососудистых или микрососудистых эндотелиальных клеток и лимфоидных клеток или клеток твердых
- 5 006678 опухолей, не оказывая влияния на рост этих клеток. Далее, мы показали, что эти ИПВИЧи ингибируют активацию фермента, называемого ММП-2, или увеличение продукции разрушающих казеин ММП. Ферменты класса металлопротеаз (ММП) необходимы для подвижности клеток (миграции и инвазии) или сосудистой проницаемости, а тем самым и для ангиогенеза, отечности и роста и инвазии опухолей (СаппеНе! апй ίαίη. 2000). В соответствии с этими данными мы показали, что индинавир и саквинавир блокируют возникновение К8-подобных ангиопролиферативных очагов, вызываемое инокуляцией ЬЕСЕ, ЬЕСЕ в комбинации с УЕСЕ или первичных клеток К8 человека, у мышей пийе, и ангиогенез, индуцированный ЬЕСЕ или УЕСЕ в оболочке хориоаллантоиса (ОХА) кур. Далее, мы показали, что индинавир и саквинавир блокируют рост опухолей, индуцированных у мышей пийе инокулированием лимфоидных клеток и клеток твердых опухолей человека. Наконец, мы показали, что ИПВИЧи блокируют сосудистую проницаемость и отек, вызванные клетками К8 у мышей пийе. Кроме того, они ингибируют продукцию цитокинов клетками К8. Эти цитокины не только вызывают очаги К8, но и обладают воспалительным действием (ЕпзоН е! а1., 1989; Вап11ап е! а1., 1992; 8аташедо е! а1., 1995; ЕютеШ е! а1., 1995; 8аташедо е! а1., 1997; 8шапш е! а1., 1998; 8аташедо е! а1., 1998; ЕютеШ е! а1., 1998; ЕютеШ е! а1., 1999; ВатШап е! а1., 1999а), а некоторые из них также вызывают полицентрическую болезнь Кастлмана (МСЭ) и лимфомы (Тоза!о е! а1., 1993; Ре!егзоп апй Елх/епт 1993; Катзау е! а1., 1994; Азои е! а1., 1998).
Таким образом, эти данные свидетельствуют, что эффект ИПВИЧ на К8 и на лимфомы обусловлен прямым блокированием ММП, миграции и инвазии эндотелиальных и опухолевых клеток, что оказывает ингибирующее действие на ангиогенез и отеки и лежит в основе ингибирования образования пораженных участков и уменьшения встречаемости опухолей, наблюдавшихся на мышиной модели и/или у лиц, подвергавшихся лечению ИПВИЧ. Однако эти эффекты не обусловлены ингибированием пролиферации нормальных или неопластических клеток. Следует подчеркнуть, что эти терапевтические эффекты были получены в отсутствие ВИЧ и ННУ8, тем самым исключая, что эти эффекты ИПВИЧ могли быть опосредованы такими эффектами ИПВИЧ на ВИЧ и/или ННУ8.
Таким образом, наши исследования показывают, что ИПВИЧ может применяться для модуляции соответствующих биологических процессов или для лечения патологических состояний с участием миграции клеток и инвазии, инфильтрации тканей и активности ММП. В частности, открытие того, что ингибиторы протеазы ВИЧ являются мощными блокаторами инвазии клеток и инфильтрации тканей, и того, что они блокируют активность клеточных металлопротеаз, участвующих в этих процессах, открывает совершенно новую область для модуляции и лечения всех биологических процессов и патологических состояний, связанных с вышеуказанными клеточными реакциями и функциями, включая ангиогенез, нераковые ангиопролиферативные патологии, К8, опухоли, воспалительные и аутоиммунные заболевания как у ВИЧ-инфицированных, так и у неинфицированных лиц.
Таким образом, все соединения, проявляющие активность ингибиторов протеазы вируса ВИЧ (которые для краткости обозначаются как ИПВИЧ), и близкие им или происходящие из них, попадают в область действия настоящего изобретения. В этом отношении, как примеры таких соединений в настоящем изобретении указаны индинавир, саквинавир, ритонавир, нельфинавир, ампренавир и лопинавир.
Соединения ИПВИЧ могут применяться следующим образом у ВИЧ-инфицированных и неинфицированных лиц:
- для блокирования миграции эндотелиальных клеток с терапевтическим антиангиогенным, антиК8 и противоопухолевым эффектом;
- для блокирования миграции опухолевых клеток с терапевтическим анти-К8 и противоопухолевым эффектом;
- для блокирования инвазии эндотелиальных клеток с терапевтическим антиангиогенным, анти-К8 и противоопухолевым эффектом;
- для блокирования инвазии опухолевых клеток с терапевтическим анти-К8 и противоопухолевым эффектом;
- для блокирования миграции клеток воспаления с терапевтическим противовоспалительным, антиаутоиммунным, антиангиогенным, анти-К8 и противоопухолевым эффектом;
- для блокирования инфильтрации тканей клетками воспаления с терапевтическим противовоспалительным, антиаутоиммунным, антиангиогенным, анти-К8 и противоопухолевым эффектом;
- для блокирования инфильтрации тканей клетками иммунной системы с терапевтическим противовоспалительным и антиаутоиммунным эффектом;
- для блокирования ММП, включая ММП-2, стромелизины, матрилизины и другие протеазы или молекулы, участвующие в миграции и инвазии клеток; блокирования ферментов, активирующих ММП и другие протеазы или молекулы, участвующие в миграции и инвазии клеток; блокирования тромбоспондина и других молекул, участвующих в миграции и инвазии клеток;
- для блокирования ММП, включая ММП-2, стромелизины, матрилизины и другие протеазы или молекулы, участвующие в ангиогенезе (СаттеНе!, ЫаШге 2000);
- для блокирования ферментов, активирующих ММП и другие протеазы, участвующие в ангиогенезе;
- для блокирования тромбоспондина и других молекул, участвующих в ангиогенезе;
- 6 006678
- для блокирования ММП, включая ММП-2, стромелизины, матрилизины и другие протеазы или молекулы, участвующие в миграции клеток воспаления и клеток иммунной системы и инфильтрации тканей;
- для блокирования ММП, включая ММП-2 и другие протеазы или молекулы, участвующие в росте и метастазировании опухолей;
- для блокирования активности ЬЕСЕ с терапевтическим антиангиогенным, противоопухолевым, анти-КЗ эффектом;
- для блокирования активности УЕСЕ с терапевтическим антиангиогенным, противоопухолевым, анти-КЗ, противоотечным эффектом;
- для блокирования активности комбинации ЬЕСЕ и УЕСЕ с терапевтическим антиангиогенным, противоопухолевым, анти-КЗ, противоотечным эффектом;
- для блокирования активности Та!, одного или в присутствии ЬЕСЕ, с терапевтическим антиангиогенным, противоопухолевым, анти-КЗ, противоотечным эффектом;
- для блокирования сосудистой проницаемости и отеков, связанных с ангиогенезом;
- для блокирования сосудистой проницаемости и отеков, связанных с опухолями;
- для блокирования сосудистой проницаемости и отеков, связанных с КЗ;
- для блокирования сосудистой проницаемости и отеков, связанных с воспалением;
- для блокирования продукции воспалительных цитокинов с терапевтическим противовоспалительным эффектом;
- для блокирования продукции цитокинов с терапевтическим противоотечным эффектом;
- для блокирования продукции цитокинов с терапевтическим антиангиогенным эффектом;
- для блокирования продукции цитокинов с терапевтическим анти-КЗ эффектом;
- для блокирования продукции цитокинов с терапевтическим противоопухолевым эффектом;
- для терапии КЗ;
- для терапии ангиогенеза;
- для терапии нераковых ангиопролиферативных заболеваний (глаз, почек, сосудистой системы, кожи), например, диабетической ретинопатии, ретролентальной фиброплазии, трахомы, сосудистой глаукомы, псориаза, аллергического и неаллергического воспаления, атеросклероза, келоидов;
- для терапии доброкачественных и злокачественных опухолей мягких тканей, хрящей, костей и крови;
- для терапии аутоиммунных заболеваний вообще, в частности системной красной волчанки, склеродермы, ревматоидного артрита, псориаза, тиреоидита, язвенного ректоколита и болезни Крона, синдрома СообракФте, системного васкулита, синдрома Шегрена, первичного билиарного цирроза;
- для терапии воспалительных заболеваний, в частности хронических воспалений, связанных с аллергией и с вирусными, бактериальными или паразитными возбудителями заболеваний, включая полицентрическую болезнь Кастлмана.
Для вышеуказанных применений показаны вообще все соединения, проявляющие активность ингибирования протеазы вируса ВИЧ, и особенно показаны соединения под названиями индинавир, саквинавир, ритонавир, нельфинавир, ампренавир и лопинавир, а также близкие им или происходящие из них, поодиночке или в комбинации друг с другом и/или в комбинации с другими препаратами.
При этом фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены стандартным образом, используя один или несколько физиологически приемлемых носителей, включая наполнители и вспомогательные вещества, облегчающие преобразование активных соединений в препараты, которые могут иметь фармацевтическое применение. Такие фармацевтические композиции могут быть получены уже известным способом, например, при помощи стандартных процессов смешивания, растворения, гранулирования, изготовления драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, включения и лиофилизации. Правильная рецептура зависит от выбранного способа применения. Фармацевтические композиции также могут включать подходящие твердые или гелеобразные носители или наполнители. Примеры таких носителей или наполнителей включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмал, производные целлюлозы, желатин и такие полимеры, как полиэтиленгликоль, но не ограничиваются ими.
Химические аналоги и/или производные и/или соли известных ИПВИЧ, указанные в настоящем описании, поодиночке или в комбинации друг с другом и/или вместе с другими препаратами, адъювантами, носителями или наполнителями, рассматриваются как попадающие в область действия настоящего изобретения.
ИПВИЧ по изобретению можно вводить путем перорального, внутривенного, внутримышечного, подкожного, интрадермального, внутрибрюшинного, интратекального, интраплеврального, внутриматочного, интравагинального, местного интраректального, трансмукозального, внутриочагового или чрескожного введения при всех показаниях, перечисленных выше. Дозы и способы применения зависят от типа заболевания, подлежащего лечению. В частности, предусматриваются дозы, меньшие, равные или большие, чем дозы, обычно применяющиеся при лечении ВИЧ-инфицированных пациентов. Например,
- 7 006678 эти дозы составляют: для индинавира - примерно 600 мг/день, 1200 мг/день, 2400 мг/день или 4800 мг/день; для саквинавира - примерно 900 мг/день, 1800 мг/день, 3600 мг/день или 7200 мг/день.
Приведенные ниже примеры, которые также относятся к прилагаемым фигурам и таблицам, можно использовать для проверки нашей гипотезы. Мы использовали два ИПВИЧа, индинавир и саквинавир, которые связывали с регрессией КЗ у получавших их пациентов (ЬеЬЬе еб аб., 1998; Саббебаи еб аб., 1999), они близки по структуре, но имеют химические группировки, специально разработанные для оптимизации их действия. Изучали действие этих двух ИПВИЧ на моделях ангиогенеза, вызванного ЬЕСЕ и/или МЕСЕ ίη νίνο и ίη νί6το, на образование КЗ-подобных поражений и на сосудистую проницаемость, индуцированные ίη νίνο клетками КЗ, и на клетки КЗ ίη νί6το (Εηκοΐί еб аб., 1989; Εηκοΐί еб аб., 1994а и 1994Ь; 8ашашедо еб аб., 1995; ЕюгеШ еб аб., 1995; Заташе^ еб аб., 1997; Заташе^ еб аб., 1998; Вапббап еб аб., 1999а; Здабап еб аб., 2000), на рост опухолей, индуцированный клеточными линиями лимфоидных клеток или твердых опухолей ίη νίνο, и на клеточные линии лимфоидных клеток или твердых опухолей ίη νίίτο.
Следующие примеры и фигуры приводятся для иллюстрации изобретения и их не следует рассматривать, как ограничивающие область действия изобретения.
Материалы и методы/Подробное описание чертежей
Фиг. 1. Индинавир и саквинавир не оказывают влияния на базальную или ЬЕСЕ-индуцированную пролиферацию первичных макрососудистых (пупковая вена) эндотелиальных клеток. Панель А: влияние индинавира на базальную или ЬЕСЕ-индуцированную пролиферацию первичных макрососудистых (пупковая вена) эндотелиальных клеток. Панель В: влияние саквинавира на базальную или ЬЕСЕиндуцированную пролиферацию первичных макрососудистых (пупковая вена) эндотелиальных клеток.
На рисунке представлены результаты по пролиферации, выраженные как число клеток после 5 дней инкубации с ЬЕСЕ в буфере РВЗ (черные столбики) или без ЬЕСЕ (только РВЗ, белые столбики) в присутствии и в отсутствие 0,1, 1 или 10 мкМ индинавира (ΙΝΏ) или саквинавира (ЗАО) либо предназначенного для них буфера (Виййег). Эндотелиальные клетки человека из пупковой вены (НИУЕС, ВюАЫббакег, Уегиеге. Бельгия) засевали в 3 повторах (1,5х104 клеток/лунку) на планшеты из 12 лунок, предварительно покрытые желатином. На следующий день клетки инкубировали 4 ч в среде без сыворотки и культивировали в среде ΚΡΜΙ 1640 (Ыйе Ί^Ηπο6ο^8, Ета^у, Франция) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЕВЗ) вместе с ЬЕСЕ в буфере РВЗ (10 нг/мл) или в одном РВЗ. Среду, ЬЕСЕ, буфер РВЗ, индинавир, саквинавир и буфер для ИПВИЧ заменяли через 3 дня. После 5 дней культивирования проводили подсчет клеток после окрашивания трипановым синим, как описано ранее (Εη8ο1ϊ еб аб., 1990; Епюй еб аб., 1994Ь). Во всех опытах ίη νίίτο индинавир или саквинавир в виде очищенного порошка (Мегск, Зйагр апб Ωοΐιιικ и КисЬе, соответственно) ресуспендировали в дистиллированной воде. Препараты оказались свободными от эндотоксинов при тестировании с помощью ЬАЬ (Акгоаабеб οί Саре Сюбе 1пс., Еабтοиίй, МА).
Фиг. 2 и 3. Индинавир и саквинавир ингибируют индуцируемую ЬЕСЕ миграцию и инвазию первичных макрососудистых (пупковая вена) эндотелиальных клеток. На фиг. 2 представлены результаты по миграции. На фиг. 3 представлены результаты по инвазии. Оба определения проводились на эндотелиальных клетках. Результаты выражали как число клеток/лунку, совершивших миграцию (фиг. 2) или инвазию (фиг. 3) в ответ на ЬЕСЕ в буфере РВЗ (черные столбики) или в ответ на один РВЗ (белые столбики) в присутствии 0,1, 1 или 10 мкМ индинавира (ΙΝΏ) или саквинавира (ЗАО) либо предназначенного для них буфера (Вийег). Панели А: влияние индинавира на индуцируемую ЬЕСЕ миграцию (фиг. 2) или инвазию (фиг. 3) первичных макрососудистых (пупковая вена) эндотелиальных клеток. Панели В: влияние саквинавира на индуцируемую ЬЕСЕ миграцию (фиг. 2) или инвазию (фиг. 3) первичных макрососудистых (пупковая вена) эндотелиальных клеток.
Оба определения проводили с помощью камеры Бойдена, разделенной на два отсека поликарбонатными фильтрами с порами размером 12 мкм (ΝικΠορίΌ^ С’аЬш ΙοΗη, ΜΏ), покрытыми колагеном IV (^^а^табтое Вютебюаб Ргобисбк) для миграции или коллагеном IV вместе с матригелем для инвазии, как описано ранее (Вапббап еб аб., 1999Ь). Клетки НИУЕС культивировали 5-6 дней в присутствии серийных разведений индинавира или саквинавира либо в предназначенном для них буфере. Клетки собирали, ресуспендировали в среде без сыворотки, содержащей 0,01% ВЗА, и помещали в верхний отсек камеры Бойдена в двух повторах (2х105 клеток/лунку) в присутствии индинавира или саквинавира либо предназначенного для них буфера. В нижний отсек вносили ЬЕСЕ (50 нг/лунку) в качестве хемоаттрактанта в среде, содержащей 0,01% ВЗА. После 5 ч (миграция) или 6 ч (инвазия) инкубации оставшиеся на верхней поверхности фильтров клетки удаляли механическим способом, а совершившие миграцию клетки на нижней поверхности фиксировали в метаноле и окрашивали толуидиновым синим (Зщта Сйетбсаб Зб. Ώοπίδ, МО). Подсчитывали число клеток в 5-10 выбранных случайным образом полях зрения микроскопа на фильтре, как описано ранее (Вапббап еб аб., 1999Ь).
Фиг. 4. Индинавир и саквинавир не влияют на пролиферацию микрососудистых (дермальных) эндотелиальных клеток в ответ на ЬЕСЕ.
На рисунке представлены результаты по пролиферации, выраженные как число дермальных микрососудистых эндотелиальных клеток после 5 дней инкубации с ЬЕСЕ в присутствии 10 мкМ индинавира (ΙΝΏ) или саквинавира (ЗАО) либо предназначенного для них буфера (Виййег). Дермальные микрососу
- 8 006678 дистые эндотелиальные клетки человека (Н-ЛМУЕС, Βίο-^Ыйакег) засевали в 3 повторах (2х104 клеток/лунку) в покрытые желатином 12-луночные планшеты и культивировали в среде КРМ1 1640 с добавлением 10% ΡΒ8 при постоянном присутствии ЬЕСЕ (10 нг/мл), чтобы предупредить апоптоз, происходящий через 24-48 ч после истощения этого фактора. Среду, ЬЕСЕ, буфер ΡΒ8, индинавир, саквинавир (10 мкМ) и буфер для ИПВИЧ заменяли через 3 дня. После 5 дней культивирования проводили подсчет клеток методом исключения красителя трипанового синего, как описано выше. Данные из поставленных в двух повторах опытов выражали как число клеток Н-ЛМУЕС, выросших в ответ на ЬЕСЕ в присутствии индинавира или саквинавира либо буфера для ИПВИЧ.
Фиг. 5. Индинавир и саквинавир ингибируют инвазию микрососудистых (дермальных) эндотелиальных клеток в ответ на ЬЕСЕ.
На рисунке представлены результаты по инвазии клеток, полученные на клетках Н-ЛМУЕС. Данные выражали как средний процент и стандартное отклонение (8Ώ) клеток, совершивших инвазию в ответ на ЬЕСЕ в буфере ΡΒ8 () или на один ΡΒ8 (□) в присутствии индинавира (ΙΝΏ) или саквинавира (8АО) либо буфера для ИПВИЧ (БиГГег). Фоновую инвазию в отсутствие ЬЕСЕ принимали за 100%. Представлены данные из поставленных в трех повторах опытов с помощью камеры Бойдена, проводившихся как описано выше для клеток НИУЕС. Блокирование инвазии клеток Н-ЛМУЕС было статистически достоверным при 10 мМ индинавира и при 1 и 10 мМ саквинавира (р <0,05).
Фиг. 6 и 7. Индинавир и саквинавир ингибируют инвазию, но не пролиферацию гладкомышечных клеток в ответ на ЬЕСЕ.
На фиг. 6 представлены результаты по росту клеток, а на фиг. 7 - по инвазии клеток, полученные на гладкомышечных клетках. Определения в основном проводились, как описано в подписях к фиг. 1 и 3. Данные выражали как число или процент клеток, выросших или совершивших инвазию в ответ на ЬЕСЕ в буфере ΡΒ8 () или на один ΡΒ8 (□) в присутствии индинавира (ΙΝΏ) или саквинавира (8Аф) либо буфера для ИПВИЧ (БиПсг), как указано. Индуцированный ЬЕСЕ рост клеток в отсутствие ИПВИЧ или фоновую инвазию в отсутствие ЬЕСЕ принимали за 100%. Представлены данные из поставленных в двух повторах опытов (средние значения).
Фиг. 8 и 9. Индинавир и саквинавир блокируют превращение латентной ММП-2 в активную форму. Фигура 8: влияние индинавира на активацию ММП-2. Панель А: зимографическое определение, проведенное на концентрированных супернатантах из клеток НИУЕС, стимулированных ЬЕСЕ в буфере ΡΒ8 (черные столбики) или в одном только ΡΒ8 (ЕиГГег. белые столбики) и культивированных в течение 24 ч в присутствии 0,1,1 или 10 мкМ индинавира (ΙΝΏ) либо предназначенного для него буфера. Стрелками отмечено положение зон, лишенных красителя вследствие желатинолитической активности, соответствующей латентной форме (72 кД), преактивной форме (64 кД) или активной форме (62 кД) ММП-2. Панель В: денситометрическое определение лишенных красителя зон, соответствующих желатинолитической активности латентной формы в 72 кД. Панель С: денситометрическое определение лишенных красителя зон, соответствующих желатинолитической активности пре-ММП-2 (64 кД) и активной формы (62 кД) ММП-2, выделяемых клетками. Результаты выражали в виде оптической плотности лишенных красителя зон. Фиг. 9: влияние саквинавира на активацию ММП-2. Панель А: зимографическое определение, проведенное на концентрированных супернатантах из клеток НИУЕС, стимулированных ЬЕСЕ в буфере ΡΒ8 (черные столбики) или в одном только ΡΒ8 (Βη^τ, белые столбики) и культивированных в течение 24 ч в присутствии 0,1, 1 или 10 мкМ саквинавира (8Аф) либо предназначенного для него буфера. Стрелками отмечено положение зон, лишенных красителя вследствие желатинолитической активности, соответствующей латентной форме (72 кД), преактивной форме (64 кД) или активной форме (62 кД) ММП-2. Панель В: денситометрическое определение лишенных красителя зон, соответствующих желатинолитической активности латентной формы в 72 кД. Панель С: денситометрическое определение лишенных красителя зон, соответствующих желатинолитической активности пре-ММП-2 (64 кД) и активной формы (62 кД) ММП-2, выделяемых клетками. Результаты выражали в виде оптической плотности лишенных красителя зон.
Клетки НИУЕС культивировали в течение 24 ч в среде ΡΡΙΗΙ 1640 с добавлением 10% ЕΒ8 в присутствии серийных разведений индинавира или саквинавира либо в предназначенном для них буфере, в отсутствие или в присутствии ЬЕСЕ (100 нг/мл). Клетки затем промывали дважды средой без сыворотки и инкубировали всю ночь в среде без сыворотки при той же концентрации ИПВИЧ. Затем получали супернатанты клеточных культур и концентрировали с помощью Сеп1псоп-10 (Ат1соп, бейГо!·! МА). Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда (Βίο-Каб, Негси1е8, СА), используя Β8А в качестве стандарта. После этого равные количества (5 мкг) белка растворяли в 5-кратном буфере для зимографии (0,4М трис-НС1, рН 6,8, 5% 8Ώ8, 20% глицерина и 0,03% бромфенолового синего) и наносили на полиакриламидный гель с 9% 8Ώ8, содержащий 1 мг/мл желатина. После электрофореза гели инкубировали 1 ч в 2,5% (об/об) Тгйоп Х-100 для удаления 8Ώ8, а затем в энзиматическом буфере (50 мМ трис-НС1, рН 7,5, 200 мМ №С1, 5 мМ СаС12, 0,02% Βιτ)-35) в течение ночи при 37°С, как описано ранее (К1ешег е! а1., 1993). Затем гели окрашивали 2,5% Кумасси голубым С-250 и отмывали от красителя в 30% метаноле и 10% уксусной кислоте. После этого проводили количественную денситометрию лишенных красителя зон
- 9 006678 с помощью денситометра 08-700, подсоединенного к компьютеру Масш1оЛ РегГогта с программой МиШ-Лпа1у81: (Βίο-Раб).
Фиг. 10. Индинавир и саквинавир блокируют аутопротеолитическое превращение пре-ММП-2 в активную форму. На рисунке представлено зимографическое определение, проведенное на супернатантах из клеток НИУЕС, стимулированных форболовым эфиром (12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат) (ТРА) (50 нМ) или в предназначенном для него буфере (ВиГГег). Стрелками отмечено положение зон, лишенных красителя вследствие желатинолитической активности, соответствующей латентной форме (про-ММП2, 72 кД), преактивной форме (пре-ММП2, 64 кД) или активной форме (активный ММП2, 62 кД) ММП-2. Клетки НИУЕС культивировали в течение 24 ч в среде РРМ1 1640 с добавлением 10% ΕΒ8. Перед определением клетки промывали дважды средой без сыворотки и инкубировали в течение ночи в среде без сыворотки, содержащей 0,01% бычьего сывороточного альбумина (Β8Α) в присутствии 10 мМ индинавира или саквинавира либо предназначенного для них буфера. Затем клетки инкубировали в течение 8 ч в среде, содержащей 0,01% Β8Α, 10 мМ индинавира или саквинавира, ТРА либо предназначенный для него буфер. После этого порции клеточных супернатантов анализировали на активность ММП-2 при помощи зимографии в геле, как описано выше. В качестве контроля использовали линию раковых клеток НТ1080, секретирующих большое количество ММП-2. Как видно из рисунка, обработка клеток НИУЕС ТРА индуцировала превращение про-ММП2 в пре-ММП2 и активную форму ММП-2. Однако в присутствии индинавира или саквинавира относительная интенсивность зоны активной формы ММП-2 уменьшалась по сравнению с пре-ММП2, что свидетельствует о блокировании аутопротеолитической активации пре-ММП2 в активную форму как индинавиром, так и саквинавиром. Индинавир также ингибировал общее количество ММП-2, выделяемой клетками в присутствии ТРА. Количество взятого для анализа супернатанта нормализировали по общему числу клеток.
Фиг. 11. Саквинавир блокирует продукцию разрушающих казеин ММП эндотелиальными клетками. Клетки НИУЕС выращивали и обрабатывали, как описано на фиг. 10, за исключением того, что после инкубации в течение ночи в отсутствие сыворотки клетки культивировали в присутствии ТРА (50 нМ), различных концентраций ЬЕ0Е (0,1 или 1 мкг/мл) в буфере ΡΒ8, в одном ΡΒ8 (ВиГГег) в присутствии саквинавира (8АЦ) или предназначенного для него буфера (ЬиГГег). После этого порции клеточных супернатантов, нормализированные по общему числу клеток, анализировали на активность ММП при помощи зимографии в геле, как описано выше, в гелях, содержащих казеин (2 мг/мл) вместо желатина.
Панель А: зимография казеина, проведенная на клеточных супернатантах, полученных после 8 ч культивирования в присутствии ТРА или ЬЕ0Е. Панель В: зимография казеина, проведенная на клеточных супернатантах, полученных после 24 ч культивирования в присутствии ТРА или ЬЕ0Е. Казеин специфически расщепляется стромелизинами ММП-3, ММП-10, ММП-11 и матрилизином ММП-7 (\νΐιίΙ1акег апб Ауксоидй, 2001). Это ведет к появлению лишенных красителя зон вследствие наличия казеинолитической активности в клеточных супернатантах. Как видно из рисунка, в отсутствие саквинавира ЬЕ0Е индуцирует дозозависимым образом выделение казеин-разрушающей активности, которая была максимальной у клеток, обработанных ТРА. Однако саквинавир (10 мкМ) ингибировал выделение этой активности, вызванное ЬЕ0Е или ТРА, о чем свидетельствует уменьшение интенсивности казеинолитических зон.
Фиг. 12. Индинавир и саквинавир блокируют индуцированное ЬЕ0Е образование К8-подобных ангиогенных очагов у мышей пибе.
(А) панель а: макроскопия мест инъекций у мышей, которым вводили с двух сторон буфер (ΡΒ8/0,1 % В8А) в матригеле и давали физраствор; панель Ь: макроскопия мест инъекций у мышей, которым вводили с двух сторон ЬЕ0Е (1 мкг) в матригеле и давали физраствор; панель с: макроскопия мест инъекций у мышей, которым вводили с двух сторон ЬЕ0Е (1 мкг) в матригеле и давали индинавир (1,4 мг/день); панель б: макроскопия мест инъекций у мышей, которым вводили с двух сторон ЬЕ0Е (1 мкг) в матригеле и давали саквинавир (1 мг/день). (В) панель а: микроскопия окрашенного Н&Е места инокуляции у репрезентативной мыши, которой вводили буфер и давали физраствор (увеличение х100); панель Ь: микроскопия окрашенного Н&Е места инокуляции у репрезентативной мыши, которой вводили буфер и давали физраствор (увеличение х400); панель с: микроскопия окрашенного Н&Е места инокуляции у репрезентативной мыши, которой вводили ЬЕ0Е и давали физраствор (увеличение х100); панель б: микроскопия окрашенного Н&Е места инокуляции у репрезентативной мыши, которой вводили ЬЕ0Е и давали физраствор (увеличение х400); панель е: микроскопия окрашенного Н&Е места инокуляции у репрезентативной мыши, которой вводили ЬЕ0Е и давали индинавир (увеличение х100); панель Г: микроскопия окрашенного Н&Е места инокуляции у репрезентативной мыши, которой вводили ЬЕ0Е и давали индинавир (увеличение х400); панель д: микроскопия окрашенного Н&Е места инокуляции у репрезентативной мыши, которой вводили ЬЕ0Е и давали саквинавир (увеличение х100); панель 1ι: микроскопия окрашенного Н&Е места инокуляции у репрезентативной мыши, которой вводили ЬЕ0Е и давали саквинавир (увеличение х400). Эксперименты проводили, как описано в подписи к табл. 1.
Фиг. 13. Индинавир и саквинавир ингибируют способность к инвазии у клеток К8. Панель А: влияние индинавира на инвазию двух линий клеток К8 (К83, К88). Панель В: влияние саквинавира на инвазию двух линий клеток К8 (К88, К812).
- 10 006678
На рисунке представлены результаты по инвазии, полученные на трех различных линиях первичных клеток КБ (КБ3, КБ8, КБ12), культивировавшихся в течение 5-6 дней в присутствии индинавира или саквинавира либо предназначенного для них буфера (контроль). Оба препарата ингибировали способность клеток КБ к инвазии мембраны из матригеля дозозависимым образом. В частности, оба ИПВИЧа ингибировали инвазию по сравнению с тем, что наблюдалось у контрольных клеток КБ (р <0,05).
Определения проводились, как описано на фиг. 3. Вкратце, клетки КБ культивировали в течение 5-6 дней в присутствии индинавира или саквинавира (1 мкМ) либо предназначенного для них буфера (физраствор). Клетки собирали и засевали в двух повторах (5х105 в культуральной среде, содержащей 0,05% ВБА) в верхний отсек камеры Бойдена, всегда в присутствии ИПВИЧ или буфера. В нижний отсек вносили ЬБОБ (20 нг/мл) в качестве хемоаттрактанта. Через 6 ч клетки, проникшие в матригелевую мембрану, окрашивали и подсчитывали, как описано в подписи к фиг. 3.
Фиг. 14 и 15. Индинавир и саквинавир ингибируют инвазию, но не пролиферацию гибридных клеток эндотелия/ легочной карциномы (Еа-йу 926).
На фиг. 14 представлены результаты по росту клеток, полученные на клетках Еа-йу 926, гибрида между клетками Н-ИУЕС и легочной аденокарциномы человека (Ейде11 с1 а1., 1983), у которого сохраняется большая часть маркеров эндотелиальных клеток и который применяется в качестве модели ангиогенной опухоли (А1Ь1ш е1 а1., 1995; А1Ь1ш е1 а1., 1996; Са1 е1 а1., 1999). Результаты выражали как число клеток через 5 дней после добавления 1 мкМ индинавира (ΙΝΏ) или саквинавира (БАО) () по сравнению с буфером для ИПВИЧ (□) (ВиГГег). Определения проводились в основном, как описано в подписи к фиг. 1. Никаких факторов роста не добавляли к клеткам Еа-йу 926, так как они продуцируют факторы, способствующие росту клеток аутокринным путем (Ейде11 е1 а1., 1983; А1Ь1ш е1 а1., ΡΝΑ8 1995; А1Ь1ш е1 а1., №11 Мей 1996). На фиг. 15 представлены результаты по инвазии, выраженные как число совершивших инвазию клеток/поле в ответ на ЬЕОЕ в присутствии 1 мкМ индинавира (ΙΝΏ) или саквинавира (БАО) () по сравнению с буфером для ИПВИЧ (□) (ВиГГег). Определения проводились в основном как описано в подписи к фиг. 3. Приведены средние значения и интервалы отклонений из двух независимых экспериментов, проводившихся по двум повторам. Блокирование инвазии клеток Еа-йу 926 под действием саквинавира было статистически достоверным (р <0,05).
Фиг. 16. Индинавир и саквинавир не влияют на пролиферацию клеток гепатокарциномы (БК-Нер1). Представлены результаты репрезентативного опыта по росту клеток, проведенного на клетках гепатокарциномы. Клетки гепатокарциномы человека (БК-Нер-1 из АТСС) засевали в трех повторах (8х104 клеток/лунку) в 12-луночные планшеты. На следующий день, после 6 ч голодания в лишенной сыворотки среде, клетки инкубировали в культуральной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЕВБ), в присутствии 10 мкМ индинавира (ΙΝΏ) или саквинавира (БАО) либо предназначенного для них буфера (РВБ). Среду, содержащую индинавир, саквинавир или буфер, заменяли через каждые 2 дня. После 4 дней культивирования проводили подсчет клеток по окрашиванию красителем трипановым синим, как описано ранее (Еикой е1 а1., 1990; Еикой е1 а1., 1994Ь). Во всех опытах ίη νίίτο ИПВИЧи в виде свободного от эндотоксинов очищенного порошка (любезно предоставленные Мегск, Бйагр & Пойте и Восйе) ресуспендировали в дистиллированной воде. Определения повторяли как минимум 3 раза.
Фиг. 17. Индинавир и саквинавир ингибируют способность к инвазии у клеток гепатокарциномы (БК-Нер-1) в ответ на ЬЕСЕ.
Приведены усредненные показатели совершивших инвазию клеток БК-Нер-1 из двух отдельных экспериментов, выраженные как среднее число совершивших инвазию клеток в ответ на ЬЕСЕ (черные столбики) или на предназначенный для него буфер (белые столбики) в присутствии 0,1, 1 или 10 мкМ индинавира (ΙΝΏ) или саквинавира (БАО) либо предназначенного для них буфера (ВиГГег). Определения инвазии проводились в камере Бойдена. Поликарбонатные фильтры (размер пор 8 мкм, №с1еоргоЬе, СаЬш 1ойп, ΜΌ) покрывали сначала колагеном IV, а затем матригелем (Со11аЬогаЩе Вютейка1 Ргойисй), как описано ранее (ВагШап еί а1., 1999Ь). Клетки БК-Нер-1 культивировали 5 дней в присутствии серийных разведений индинавира или саквинавира (0,1 мкМ, 1 мкМ, 10 мкМ) либо в предназначенном для них буфере. Засевали по 2х105 клеток в двух повторах в верхний отсек камеры Бойдена в 0,1% ВБА, содержащем возрастающие концентрации индинавира или саквинавира либо предназначенный для них буфер. В нижний отсек вносили рекомбинантный ЬЕСЕ человека (50 нг/мл) в качестве хемоаттрактанта. После 5 ч инкубации оставшиеся на верхней поверхности фильтров клетки удаляли механическим способом, а совершившие инвазию клетки на нижней поверхности фильтров фиксировали в этаноле и окрашивали толуидиновым синим (Б1дта Сйет1са1 Со., Бк Ьошк, МО). Подсчитывали число клеток в 10 выбранных случайным образом полях зрения светового микроскопа на фильтре, как описано ранее (ВагШап еί а1., 1999Ь).
Фиг. 18. Индинавир и саквинавир не влияют на пролиферацию клеток легочной карциномы (А549).
Представлены результаты репрезентативного опыта по росту клеток, проведенного на клетках легочной карциномы. Клетки легочной карциномы человека (А549 из АТСС) засевали в трех повторах (8х104 клеток/лунку) в 12-луночные планшеты. На следующий день после 6 ч голодания в лишенной сыворотки среде, клетки инкубировали в культуральной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей
- 11 006678 сыворотки (ЕВ8), в присутствии 10 мкМ индинавира (ΙΝΏ) или саквинавира (8АО) либо предназначенного для них буфера (Вийег). Среду, содержащую индинавир, саквинавир или буфер, заменяли через каждые 2 дня. После 4 дней культивирования проводили подсчет клеток по окрашиванию красителем трипановым синим, как описано ранее (Εηδοίί с1 а1., 1990; Εηδοίί с1 а1., 1994Ь). Во всех опытах ίη νίίτο ИПВИЧи в виде свободного от эндотоксинов очищенного порошка (любезно предоставленные Мегск, 8кагр & Пойте и Воске) ресуспендировали в дистиллированной воде. Определения повторяли как минимум 3 раза.
Фиг. 19. Индинавир и саквинавир ингибируют способность к инвазии у клеток легочной карциномы (А549) в ответ на ЬЕОЕ.
Приведены усредненные показатели совершивших инвазию клеток легочной карциномы А549 из двух отдельных экспериментов, выраженные как среднее число совершивших инвазию клеток в ответ на ЬЕОЕ (черные столбики) или на предназначенный для него буфер (белые столбики) в присутствии 0,1, 1 или 10 мкМ индинавира (ΙΝΏ) или саквинавира (8АО) либо предназначенного для них буфера (Вийсг). Определения инвазии проводили в камере Бойдена. Поликарбонатные фильтры (размер пор 12 мкм, Νυс1еоргоЬе, СаЬш ΣοΠη. ΜΏ) покрывали сначала колагеном IV, а затем матригелем (С’о11аЬога1Ае ВютебЕ са1 Ргобисй), как описано ранее (ВагШап еί а1., 1999Ь). Клетки А549 культивировали 5 дней в присутствии серийных разведений индинавира или саквинавира (0,1 мкМ, 1 мкМ, 10 мкМ) либо в предназначенном для них буфере. Засевали по 2х105 клеток в двух повторах в верхний отсек камеры Бойдена в 0,1% В8А, содержащем возрастающие концентрации индинавира или саквинавира либо предназначенный для них буфер. В нижний отсек вносили рекомбинантный ЬЕОЕ человека (50 нг/мл) в качестве хемоаттрактанта. После 5 ч инкубации оставшиеся на верхней поверхности фильтров клетки удаляли механическим способом, а совершившие инвазию клетки на нижней поверхности фильтров фиксировали в этаноле и окрашивали толуидиновым синим (81дта Скет1са1 Со., 8ί. Ьошк, МО). Подсчитывали число клеток в 10 выбранных случайным образом полях зрения светового микроскопа на фильтре, как описано ранее (ВагШап еί а1., 1999Ь).
Фиг. 20. Индинавир и саквинавир не влияют на пролиферацию клеток карциномы молочной железы (МЛА-МВ-468).
Представлены результаты репрезентативного опыта по росту клеток, проведенного на клетках карциномы молочной железы. Клетки карциномы молочной железы человека (МОА-МВ-468 из АТСС) засевали в трех повторах (8х104 клеток/лунку) в 12-луночные планшеты. На следующий день, после 6 ч голодания в лишенной сыворотки среде, клетки инкубировали в культуральной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЕВ8), в присутствии 10 мкМ индинавира (ΙΝΏ) или саквинавира (8АО) либо предназначенного для них буфера (Вийсг). Среду, содержащую индинавир, саквинавир или буфер, заменяли через каждые 2 дня. После 4 дней культивирования проводили подсчет клеток по окрашиванию красителем трипановым синим, как описано ранее (Εη§ο1ί еί а1., 1990; Εη§ο1ί еί а1., 1994Ь). Во всех опытах ίη νίίτο ИПВИЧи в виде свободного от эндотоксинов очищенного порошка (любезно предоставленные Мегск, 8кагр & Иойше и Воске) ресуспендировали в дистиллированной воде. Определения повторяли как минимум 3 раза.
Фиг. 21. Индинавир и саквинавир ингибируют способность к инвазии у клеток карциномы молочной железы (МЛА-МВ-468) в ответ на ЬЕОЕ.
Представлены результаты репрезентативного опыта по инвазии, проведенного на клетках карциномы молочной железы МВА-МВ-468. Данные выражали как среднее число совершивших инвазию клеток в ответ на ЬЕОЕ (черные столбики) или на предназначенный для него буфер (белые столбики) в присутствии 0,1, 1 или 10 мкМ индинавира (ΙΝΏ) или саквинавира (8АО) либо предназначенного для них буфера (Вийег). Определения инвазии проводили в камере Бойдена. Поликарбонатные фильтры (размер пор 8 мкм, №с1еоргоЬе, СаЬш 1ойп, МЛ) покрывали сначала колагеном IV, а затем матригелем (С’о11аЬога1Е'е Вютеб1са1 Ргобисй), как описано ранее (ВагШап еί а1., 1999Ь). Клетки карциномы молочной железы (МЛА-МВ-468) культивировали 5 дней в присутствии серийных разведений индинавира или саквинавира (0,1 мкМ, 1 мкМ, 10 мкМ) либо в предназначенном для них буфере. Засевали по 2х105 клеток в двух повторах в верхний отсек камеры Бойдена в 0,1% В8А, содержащем возрастающие концентрации индинавира или саквинавира либо предназначенный для них буфер. В нижний отсек вносили рекомбинантный ЬЕОЕ человека (50 нг/мл) в качестве хемоаттрактанта. После 5 ч инкубации оставшиеся на верхней поверхности фильтров клетки удаляли механическим способом, а совершившие инвазию клетки на нижней поверхности фильтров фиксировали в этаноле и окрашивали холуидиновым синим (8щта Скетка1 Со., 8ί. Ьошк, МО). Подсчитывали число клеток в 10 выбранных случайным образом полях зрения светового микроскопа на фильтре, как описано ранее (ВагШап еί а1., 1999Ь). Определения повторяли по два раза.
Фиг. 22. Индинавир и саквинавир ингибируют способность к инвазии у клеток миеломоноцитарной лейкемии (И937) в ответ на ЬЕОЕ.
Представлены результаты репрезентативного опыта по инвазии, проведенного на клетках миеломоноцитарной лейкемии И937. Данные выражали как среднее число совершивших инвазию клеток в ответ на ЬЕОЕ (черные столбики) или на предназначенный для него буфер (белые столбики) в присутствии 1
- 12 006678 или 10 мкМ саквинавира либо предназначенного для них буфера (ВиГГег). Близкие результаты были получены также при обработке клеток 1 или 10 мкМ индинавиром (данные не приводятся). Определения инвазии проводили в камере Бойдена. Поликарбонатные фильтры (размер пор 5 мкм, Ыис1еоргоЬе, СаЫи 1ойп, МИ) покрывали сначала колагеном IV, а затем матригелем (СоПаЬогаНуе В1отей1са1 Ргойиск), как описано ранее (Вап11ап е1 а1., 1999Ь). Клетки миеломоноцитарной лейкемии И937 культивировали 4 дня в присутствии серийных разведений индинавира или саквинавира (1 мкМ, 10 мкМ) либо в предназначенном для них буфере. Засевали по 8х105 клеток в двух повторах в верхний отсек камеры Бойдена в 0,1% В8А, содержащем возрастающие концентрации индинавира или саквинавира либо предназначенный для них буфер. В нижний отсек вносили рекомбинантный ЬРОР человека (50 нг/мл) в качестве хемоаттрактанта. После 4 ч инкубации оставшиеся на верхней поверхности фильтров клетки удаляли механическим способом, а совершившие инвазию клетки на нижней поверхности фильтров фиксировали в этаноле и окрашивали толуидиновым синим (81дта Сйетка1 Со., 81. Ьош8, МО). Подсчитывали число клеток в 10 выбранных случайным образом полях зрения светового микроскопа на фильтре, как описано ранее (ВагШап е1 а1., 1999Ь). Определения повторяли по два раза.
Фиг. 23. Индинавир и саквинавир ингибируют образование К8-подобных очагов, вызванное инокуляцией клеток К8 у мышей пийе.
Мышам пийе инокулировали клетки К8 (3х106), чтобы вызвать образование ангиопролиферативных К8-подобных очагов, или предназначенный для них буфер (контроль), и вводили индинавир, саквинавир или физраствор в соответствии с дозами и процедурами, описанными в подписи к фиг. 12, начиная за 2 дня до инокуляции клеток. Во время забоя обследовали места инокуляции на присутствие макроскопических ангиопролиферативных очагов, как описано в подписях к фиг. 12 и табл. 5.
Панель а: микроскопия центральной зоны окрашенного Н&Е места инокуляции клеток К8 у репрезентативной мыши, получавшей физраствор (увеличение х100); панель Ь: микроскопия центральной зоны окрашенного Н&Е места инокуляции клеток К8 у репрезентативной мыши, получавшей физраствор (увеличение х400); панель с: микроскопия центральной зоны окрашенного Н&Е места инокуляции клеток К8 у репрезентативной мыши, получавшей индинавир (увеличение х250); панель й: микроскопия центральной зоны окрашенного Н&Е места инокуляции клеток К8 у репрезентативной мыши, получавшей индинавир (увеличение х400); панель е: микроскопия центральной зоны окрашенного Н&Е места инокуляции клеток К8 у репрезентативной мыши, получавшей саквинавир (увеличение х250); панель Г: микроскопия центральной зоны окрашенного Н&Е места инокуляции клеток К8 у репрезентативной мыши, получавшей саквинавир (увеличение х400). Эксперименты проводились, как описано в подписи к табл. 5.
Фиг. 24. Индинавир и саквинавир способствуют регрессии К8-подобных очагов, вызванных инокуляцией клеток К8 у мышей пийе.
Индинавир и саквинавир могут способствовать регрессии К8 и без предварительного введения лекарственных препаратов. Мышам пийе инокулировали клетки К8 (клетки линии К812, 3х106), чтобы вызвать образование ангиопролиферативных К8-подобных очагов, или предназначенный для них буфер (контроль), и в тот же день начинали вводить индинавир, саквинавир или физраствор через желудочный зонд в соответствии с дозами, описанными в подписи к табл. 5. Введение продолжали 5 дней до самого забоя. Приведен средний размер пораженных участков (см2) в месте инъекции, который определяли ежедневно с помощью штангенциркуля и рассчитывали как произведение двух основных диаметров очага.
Фиг. 25. Индинавир и саквинавир способствуют регрессии опухолевых ангиогенных очагов, вызванных инокуляцией гибридных клеток эндотелия/ легочной карциномы (Еа-йу 926) у мышей пийе.
Чтобы убедиться, что индинавир и саквинавир способствуют регресии не только К8, но и других опухолей без предварительного введения лекарственных препаратов, в опытах ш у1уо использовали клетки Еа-йу 926, гибрида между клетками Н-ИУЕС и легочной аденокарциномы человека (Ейде11 е1 а1., 1983), у которого сохраняется большая часть маркеров эндотелиальных клеток и который применяется в качестве модели ангиогенной опухоли (А1Ь1ш е1 а1., 1995; А1Ь1ш е1 а1., 1996; Са1 е1 а1., 1999). Мьппам инокулировали подкожно в нижнюю часть спины клетки Еа-йу 926 (3х106 клеток/ животное в 0,2 мл КРМ1 1640 с 10% ЕВ8) или предназначенную для них среду, которые смешивали с 0,2 мл лишенного факторов роста матригеля (ВИ ВюкОепсек, ВейГогй, МА) перед инокуляцией, как описано выше. В тот же день животным начинали вводить индинавир, саквинавир или физраствор через желудочный зонд в соответствии с дозами, описанными в подписи к фиг. 24. Введение продолжали 5 дней до самого забоя. Ежедневно определяли размер очагов поражения в месте инъекции с помощью штангенциркуля. Затем рассчитывали площадь поверхности очагов как произведение двух основных диаметров очага. Приведен средний размер (см2) очагов в месте инъекции.
Фиг. 26. Индинавир и саквинавир ингибируют образование опухолевых очагов, вызванное инокуляцией клеток гепатокарциномы (8К-Нер-1) у мышей пийе.
Индинавир и саквинавир также эффективно блокируют рост опухолей, вызванных клетками гепатокарциномы ш у1уо. Опухоли индуцировали путем инокуляции мышам пийе (10 животных/группу) клеток гепатокарциномы (линия клеток 8К-Нер-1, полученная из АТСС, по 5х106 клеток) и животные ежедневно получали индинавир, саквинавир или физраствор, как изложено в подписи к фиг. 23. За 24 ч до
- 13 006678 инъекции клеток мыши получали сублетальную дозу облучения (400 С) для того, чтобы повысить прививаемость опухолей. Введение ИПВИЧ или физраствора продолжали до самого забоя. Ежедневно определяли размер очагов поражения в месте инъекции с помощью штангенциркуля. Затем рассчитывали площадь поверхности очагов как произведение двух основных диаметров очага. Приведен средний размер (см2) очагов в месте инъекции.
Фиг. 27. Индинавир и саквинавир ингибируют образование Κδ-подобных очагов, вызванное инокуляцией клеток легочной карциномы (А549) у мышей пибе.
Индинавир и саквинавир также эффективно блокируют рост опухолей, вызванных клетками легочной карциномы ίη νίνο. Опухоли индуцировали путем инокуляции облученным мышам пибе (10 животных на группу) клеток легочной карциномы (линия клеток А549, полученная из АТСС, по 5х106 клеток) и животные ежедневно получали индинавир, саквинавир или физраствор, как изложено в подписи к фиг. 23. Введение ИПВИЧ или физраствора продолжали до самого забоя. Ежедневно определяли размер очагов поражения в месте инъекции с помощью штангенциркуля. Затем рассчитывали площадь поверхности очагов как произведение двух основных диаметров очага. Приведен средний размер (см2) очагов в месте инъекции.
Фиг. 28. Индинавир и саквинавир ингибируют образование опухолевых очагов, вызванное инокуляцией клеток карциномы молочной железы (ΜΌΑ-ΜΒ-468) у мышей пибе.
Индинавир и саквинавир также эффективно блокируют рост опухолей, вызванных клетками карциномы молочной железы ίη νίνο. Опухоли индуцировали путем инокуляции облученным мышам пибе (10 животных на группу) клеток карциномы молочной железы (линия клеток ΜΌΑ-ΜΒ-468, полученная из АТСС, по 5х106 клеток) и животные ежедневно получали индинавир, саквинавир или физраствор, как изложено в подписи к фиг. 23. Введение ИПВИЧ или физраствора продолжали до самого забоя. Ежедневно определяли размер очагов поражения в месте инъекции с помощью штангенциркуля. Затем рассчитывали площадь поверхности очагов как произведение двух основных диаметров очага. Приведен средний размер (см ) очагов в месте инъекции.
Фиг. 29. Индинавир и саквинавир ингибируют образование опухолевых очагов, вызванное инокуляцией клеток миеломоноцитарной лейкемии (И937) у мышей пибе.
Индинавир и саквинавир также эффективно блокируют рост опухолей, вызванных клетками карциномы миеломоноцитарной лейкемии ш νίνο. Опухоли индуцировали путем инокуляции облученным мышам пибе (10 животных/группу) клеток миеломоноцитарной лейкемии (линия клеток И937, полученная из АТСС, по 5х106 клеток в 0,2 мл культуральной среды) и животные ежедневно получали индинавир, саквинавир или физраствор, как изложено в подписи к фиг. 23. Введение ИПВИЧ или физраствора продолжали до самого забоя. Ежедневно определяли размер очагов поражения в месте инъекции с помощью штангенциркуля. Затем рассчитывали площадь поверхности очагов как произведение двух основных диаметров очага. Приведен средний размер (см2) очагов в месте инъекции.
Фиг. 30. Индинавир и саквинавир ингибируют образование опухолевых очагов, вызванное инокуляцией клеток Т-клеточной лейкемии (1игка1) у мышей пибе.
Индинавир и саквинавир также эффективно блокируют рост опухолей, вызванных клетками карциномы Т-клеточной лейкемии ш νίνο. Опухоли индуцировали путем инокуляции облученным мышам пибе (10 животных на группу) клеток лейкемии (линия клеток 1игка1, полученная из АТСС, по 20х106 клеток) и животные ежедневно получали индинавир, саквинавир или физраствор, как изложено в подписи к фиг. 23. Введение ИПВИЧ или физраствора продолжали до самого забоя. Ежедневно определяли размер очагов поражения в месте инъекции с помощью штангенциркуля. Затем рассчитывали площадь поверхности очагов как произведение двух основных диаметров очага. Приведен средний размер (см2) очагов в месте инъекции.
Фиг. 31. Индинавир и саквинавир блокируют сосудистую проницаемость и отеки, вызванные инокуляцией клеток Κ8 у мышей пибе.
Мышам пибе вводили индинавир, саквинавир или физраствор (§а1ше) на протяжении 2 дней при тех же дозах и процедурах, что описаны ранее. На 3-й день им вводили пириламин (80 мкг в 100 мкл физраствора, 4 мг/кг, §1§ша), чтобы избежать влияния гистамина, выделяющегося при инокуляции, и сразу после этого вводили в вену 100 мкл красителя Еушъ Ыие (5 мг/мл в физрастворе), а затем инокулировали подкожно клетки Κ8 (3х106 клеток/мышь), культивированные ш νίίτο в присутствии индинавира, саквинавира (1 мкМ) или буфера в 0,2 мл матригеля. В качестве контроля каждому животному вводили контралатерально такой же объем буфера и матригеля. Через 18 ч животных забивали и измеряли количество проникшего из кровотока красителя в месте инокуляции клеток Κ8 по двум наибольшим перпендикулярным диаметрам с помощью шаблона. Количество проникшего из кровотока красителя также определяли путем снятия кожи из места инокуляции и измерения на спектрофотометре после экстракции формамидом в течение 24 ч при 56°С (Иакашига е! а1., 1992). Количество проникшего из кровотока красителя рассчитывали, вычитая оптическую плотность, измеренную в контрольном участке. Как видно из рисунка, введение индинавира или саквинавира уменьшало количество проникшего из кровотока красителя на 39,8% (р <0,05) и 44,5 % (р <0,01), соответственно, при измерении на спектрофотометре, а при измерении с помощью шаблона - на 43,5 и 47,5%, соответственно.
- 14 006678
Фиг. 32. Индинавир и саквинавир блокируют продукцию цитокинов клетками К8 ίη νίίτο. Панель А: количество 1Ь-б в супернатанте из клеток К8, культивированных в отсутствие (Ьийег) или в присутствии индинавира (ΙΝΏ). Панель В: количество 1Ь-б в супернатанте из клеток К8, культивированных в отсутствие (Ьийег) или в присутствии саквинавира (8АЦ).
Клетки засевали в 6-луночные планшеты и культивировали 5 дней, как описано (Епкой с1 а1., 1990), в непрерывном присутствии индинавира или саквинавира в концентрации 0,1, 1 и 10 мкМ или предназначенного для них буфера. На 5-й день культуральную среду заменяли средой без сыворотки, содержащей бычий сывороточный альбумин (0,05% вес/об) в присутствии индинавира или саквинавира в указанных концентрациях. После 24 ч инкубации супернатанты культур тестировали методом ЕЫ8А (Κ&Ώ 8у51ст5. М1ппеаро118, ΜΝ, США) для определения количества 1Ь-б в среде. Количество 1Ь-б выражали в пг/мл супернатанта. Такие же определения проводились в отношении ЬРСР, УЕСР, 1Ь-1а и (И-Ι β с помощью коммерческих наборов для ЕЫ8А. Как индинавир, так и саквинавир уменьшали продукцию ЬРСР, УЕСР, Ш-1О, ΙΤ-1β и 1Ь-б.
Пример 1.
Чтобы проверить, какие процессы, необходимые для возникновения К8, ингибируются индинавиром или саквинавиром, проводили анализ пролиферации, миграции и инвазии в ответ на ЬРСР первичных макрососудистых эндотелиальных клеток человека из пупковой вены, культивированных в присутствии и в отсутствие серийных разведений индинавира или саквинавира. Используемые концентрации ИПВИЧ были такими же, как в плазме подвергавшихся лечению пациентов (Эеекх е1 а1., 1997).
Как показывает фиг. 1, ИПВИЧи не оказывали влияния на базальную или ЬРСР-индуцированную пролиферацию макрососудистых эндотелиальных клеток при всех концентрациях. Аналогичным образом, не отмечалось влияния индинавира или саквинавира на выживаемость макрососудистых эндотелиальных клеток. Наоборот, оба ИПВИЧа ингибировали миграцию (фиг. 2) и полностью блокировали инвазию макрососудистых эндотелиальных клеток (фиг. 3), стимулируемую ЬРСР при всех концентрациях. Такие же результаты были получены с первичными дермальными микрососудистыми эндотелиальными клетками человека (фиг. 4 и 5) или с первичными гладкомышечными клетками человека (фиг. б и 7).
Пример 2.
Миграция и инвазия эндотелиальных клеток опосредованы протеолитической активностью активных ММП, разрушающих базальную мембрану сосудов, способствуя миграции и инвазии эндотелиальных клеток, которые необходимы для образования новых сосудов (81е11ег-81етеп8оп, 1999). ММП выделяются эндотелиальными клетками в виде проферментов-зимогенов. Чтобы проверить, влияет ли индинавир или саквинавир на активность ММП в эндотелиальных клетках, проводили эксперименты по измерению желатинолитической активности при помощи зимограмм желатина и казеина (К1ешег е1 а1., 1993). В частности, ММП-2 является ключом к ангиогенезу, росту опухолей и инвазии. Зимоген ММП-2 (латентный ММП-2, 72 кД) подвергается протеолитической активации на поверхности клетки до форм в б4/б2 кД посредством сложного механизма, в котором участвуют другие протеазы (81е11ег-81етеп8оп, 1999). Индинавир или саквинавир (фиг. 8 и 9, соответственно) оказывали минимальное влияние или вовсе не влияли на синтез ММП-2, тогда как оба эти ИПВИЧи блокировали активацию ММП-2 дозозависимым образом (фиг. 8 и 9). Эти эффекты наблюдались после 24 ч инкубации клеток при таких концентрациях ИПВИЧ, как и в плазме подвергавшихся лечению пациентов (Эеекк е1 а1, 1997). Сходные эффекты наблюдались после 5 дней инкубации с ИПВИЧ. Для анализа стадий, связанных с ингибированием ИПВИЧ активации ММП-2, эндотелиальные клетки активировали с помощью форболовых эфиров, которые, как известно, очень активно стимулируют превращение ММП-2 в активную форму. Как видно из фиг. 10, эти опыты показали, что оба ИПВИЧи действуют путем ингибирования аутопротеолитического превращения ММП-2 в активную форму (б2 кД) (8ΐеί1е^-8ΐеνеη8οη, 1999). Однако точный механизм, посредством которого индинавир или саквинавир ингибирует превращение латентной ММП-2 в активную форму, еще не установлен. Так, не обнаружено гомологии между последовательностью активного сайта протеазы ВИЧ и ММП-2 или других ММП. Однако была обнаружена гомология с аминокислотной последовательностью каталитического сайта протеазы ВИЧ у тромбоспондина, который, как известно, способен как активировать, так и ингибировать ММП и/или ангиогенез (Вет апб δίιηοπχ 2000; ТагаЬо1еШ е1 а1., 2000). Это свидетельствует о том, что ИПВИЧ может влиять на активацию ММП или инвазию клеток путем взаимодействия с тромбоспондином.
Для изучения эффектов индинавира и саквинавира на другие ММП проводили зимографию казеина с эндотелиальными клетками, обработанными ЬРСР или ТРА в присутствии или в отсутствие ИПВИЧ. Эти эксперименты показали, что саквинавир способен ингибировать синтез казеин-специфичных ММП, индуцированный ЬРСР или ТРА (фиг. 11).
Поскольку ММП являются ключом к миграции и инвазии клеток, эти результаты означают, что индинавир и саквинавир ингибируют миграцию и инвазию клеток через ингибирование ММП. Даже если мишенью индинавира или саквинавира могут быть и другие протеазы или молекулы, участвующие в инвазии клеток, ММП-2 и казеин-специфичные ММП представляют собой ключевые примеры такого эффекта.
- 15 006678
Пример 3.
Было показано, что ММП-2 индуцируется ЬЕСЕ и другими ангиогенными факторами (ЕпкоИ е! а1., 1994а; ВатШап е! а1., 1999Ь; З!е!1ет-З!еуеп§оп, 1999), и что ЬЕСЕ, как и ММП-2, экспрессируется в очагах КЗ (ЕпкоИ е! а1., 1989; ЕпкоЬ е! а1., 1994а; Заташедо е! а1., 1998). Более того, известно, что ингибирование активности ЬЕСЕ или ММП, особенно ММП-2, блокирует ангиогенез, образование очагов КЗ и рост опухолей вообще (ЕпкоИ е! а1., 1989; ЕпзоЬ е! а1., 1994а; ЕпкоИ е! а1., 1994Ь; З!е!1ет-З!еуеп§оп, 1999; Ко1уипеп е! а1., 1999; СагтеЬе! апб 1аш, 2000). С другой стороны, для ангиогенеза необходима инвазия клеток как в нормальных тканях, так и в опухолях. Эти данные означают, что ингибирование инвазии клеток и ММП индинавиром и саквинавиром должно вести к блокировке ангиогенеза. Поэтому исследовали эффекты индинавира и саквинавира на ангиогенез, индуцируемый ЬЕСЕ и/или УЕСЕ, на мышах пибе и на оболочке хориоаллантоиса (ОХА).
Мышам пибе вводили индинавир (1,4 мг/день), саквинавир (1 мг/день) или физраствор (отрицательный контроль) через желудочный зонд один раз в день на протяжении 2 дней (К1ешет е! а1., 1993). Затем мышам инокулировали ЬЕСЕ или предназначенный для него буфер в присутствии матригеля (К1ешет е! а1., 1993; Епкой е! а1., 1994а; Заташедо е! а1., 1998; ВатШап е! а1., 1999а). Введение индинавира, саквинавира или физраствора проводили ежедневно на протяжении следующих 5 дней. Затем мышей забивали и делали макроскопию и микроскопию мест инокуляции на присутствие КЗ-подобных ангиопролиферативных очагов (К1ешет е! а1., 1993; Епзой е! а1., 1994а; Заташедо е! а1., 1998; ВатШап е! а1., 1999а). В соответствии с прежними результатами (Епзой е! а1., 1994а; Заташедо е! а1., 1998; ВатШап е! а1., 1999а), инокуляция 1 мкг ЬЕСЕ вызывала образование ангиопролиферативных очагов у 71% не получавших препараты мышей (табл. 1 и фиг. 12(1)). Напротив, введение индинавира или саквинавира уменьшало процент мышей, у которых образовались очаги, до 28 и 25%, соответственно (табл. 1 и фиг. 12(1)). На фиг. 12(1) приведен пример этих результатов. Введение индинавира или саквинавира полностью блокировало образование пораженных очагов или сильно уменьшало их размеры. Микроскопия мест инокуляции у мышей, получавших индинавир или саквинавир, показала заметное снижение ангиогенеза и инфильтрации клеток по сравнению с мышами, которым инокулировали ЬЕСЕ, но не вводили ИПВИЧ (фиг. 12(2)). В случае полной регрессии гистологическая картина тканей была близка или идентична той, что наблюдалась у мышей, получавших только буфер (отрицательный контроль) (фиг. 12(2)). Это подтвердилось при окрашивании с помощью антител к ЕУШ или СЭ31 и измерении при помощью компьютерного анализа (табл. 1). Так, площадь очагов, положительных по маркерам эндотелиальных клеток, снижалась почти на 70% у получавших ИПВИЧ мышей по сравнению с не получавшими их контролями (р <0,001) (табл. 1).
Поскольку УЕСЕ действует синергично с ЬЕСЕ в индуцировании ангиогенеза и образовании КЗподобных очагов, мышам (6 животных на группу) также инокулировали субоптимальные дозы ЬЕСЕ (0,1 мкг) в комбинации с УЕСЕ (1 мкг), как делали ранее при изучении их синергичного действия (Заташедо е! а1., 1998), и вводили ИПВИЧ как указано выше. Комбинированное введение двух факторов вызывало образование очагов поражения у 83% не получавших препараты мышей, однако индинавир или саквинавир снижали образование очагов до 33% и 17% (р <0,05 для саквинавира) у получавших их мышей, соответственно (табл. 2). Таким образом, оба ИПВИЧа ингибируют ангиогенез и образование КЗ-подобных очагов, индуцированное синергичным действием ЬЕСЕ в комбинации с УЕСЕ у мышей пибе. Эти результаты означают, что ИПВИЧи оказывают прямое антиангиогенное действие.
Для подтверждения того, что ИПВИЧи обладают прямыми антиангиогенными эффектами, использовали метод ОХА, который является общепринятым методом ш у1уо для измерения ангиогенеза (К1Ьа!б е! а1., 1996). Как показывает табл. 3, индинавир или саквинавир блокировали ЬЕСЕ-индуцированный ангиогенез до 42 и 19% от уровня контроля на ЬЕСЕ и до 36 и 11% от уровня контроля на УЕСЕ, соответственно (р<0,05). Примечательно, что блокирование ЬЕСЕ-индуцированного ангиогенеза обоими ИПВИЧ было сравнимо с тем, что наблюдалось с таксолом, цитотоксическим препаратом, обладающим противоопухолевой и антиангиогенной активностью, который применяется при лечении КЗ и твердых опухолей (Здабап е! а1., 2000) (табл. 3). Эти данные подтверждают, что ингибирование ИПВИЧ миграции и инвазии микрососудистых и макрососудистых эндотелиальных клеток, инвазии гладкомышечных клеток и активности ММП ведет к подавлению ангиогенеза ш у1уо.
Пример 4.
Клетки КЗ - это трансдифференцированные клетки эндотелиального происхождения с активированным фенотипом, которые экспрессируют и ЬЕСЕ, и УЕСЕ, и ММП (Епкой е! а1., 1989; Епкой е! а1., 1990; Епкой е! а1., 1994а; обзор в Епкой апб З!ЙТ71, 1998). Эти данные, следовательно, означают, что ИПВИЧи могут оказывать на клетки КЗ действие, близкое их действию на эндотелиальные и гладкомышечные клетки и обладать способностью к ингибированию инвазии клеток КЗ. Соответственно, были проведены опыты по адгезии, пролиферации, миграции и инвазии, культивируя клетки КЗ в присутствии индинавира или саквинавира в концентрациях от 0,01 мкМ до 1 мкМ на протяжении 5-7 дней. Как показывает табл. 4, индинавир или саквинавир не ингибирует способность клеток КЗ к адгезии на субстрате из фибронектина. Аналогично, обработка клеток КЗ индинавиром или саквинавиром в течение 7 дней не
- 16 006678 влияла на пролиферацию клеток при измерении подсчетом жизнеспособных клеток по исключению красителя трипанового синего (табл. 4).
Чтобы определить, влияют ли ИПВИЧи на способность клеток КЗ к миграции и инвазии базальной мембраны в ответ ангиогенные факторы, клетки КЗ, обработанные на протяжении 5 дней индинавиром или саквинавиром (0,01-1 мкМ), помещали в верхний отсек камеры Бойдена в постоянном присутствии ИПВИЧ, а ЬЕСЕ вносили в нижний отсек в качестве хемоаттрактанта. Как показывает табл. 4, ни индинавир, ни саквинавир не оказывали влияния на миграцию клеток КЗ. В отличие от этого, оба препарата ингибировали способность клеток КЗ к инвазии субстрата из матригеля дозозависимым образом. В частности, оба ИПВИЧа ингибируют инвазию клеток КЗ на 30-40% (р<0,05) (табл. 4 и фиг. 13).
Эти данные означают, что механизм, лежащий в основе эффектов ИПВИЧ на инвазию клеток в ответ на хемотактические сигналы, включая, к примеру, ингибирование ММП, вероятнее всего, действует на многие типы клеток, включая раковые клетки.
Пример 5.
Для проверки того, способны ли ИПВИЧи к специфическому ингибированию инвазии раковых клеток, были поставлены эксперименты по пролиферации и инвазии клеток на линиях раковых клеток из опухолей различного происхождения. В частности, исследовали следующие линии клеток: Еа-йу 926, происходящие из гибрида между клетками Н-ИУЕС и легочной карциномы человека (Ейде11 е! а1., ΡΝΑ8 1983), клетки гепатокарциномы (ЗК-Нер-1), клетки легочной карциномы (А549), клетки аденокарциномы молочной железы (ΜΌΑ-ΜΒ-468) и клетки миеломоноцитарной лейкемии (И937). Индинавир или саквинавир не оказывали значительного влияния на пролиферацию этих линий клеток (фиг. 14, 16, 18, 20). Напротив, оба ИПВИЧа значительно ингибировали инвазию раковых клеток при тех же концентрациях, что и в сыворотке получавших препараты пациентов (фиг. 15, 17, 19, 21, 22). Следовательно, эти данные означают, что способность ИПВИЧ к ингибированию инвазии нормальных и неопластических клеток лежит в основе механизма, общего для всех клеток, а именно блокирования молекул и ферментов, участвующих в миграции и инвазии клеток, включая, в частности, ММП.
Пример 6.
Эти результаты означают, что, несмотря на отсутствие влияния на пролиферацию раковых клеток, ИПВИЧ могут обладать способностью к ингибированию роста опухолей путем избирательного блокирования инвазии раковых клеток и ангиогенеза опухолей, которые необходимы для возникновения опухолей, инфильтрации опухолей и метастазирования (СагтеНе! е! а1., 2000). Соответственно, были поставлены опыты ш νί\Ό, чтобы установить, способны ли ИПВИЧи ингибировать рост на ксенотрансплантатных моделях раковых опухолей, включая линии раковых клеток, использовавшиеся в опытах ш νίΙΐΌ.
Во-первых, исследовали эффекты индинавира или саквинавира на образование КЗ-подобных очагов, вызванных инокуляцией первичных клеток КЗ человека у мышей пийе, модели ш νί\Ό. широко применяемой в доклинических испытаниях эффективности лечения КЗ (Емкой е! а1., 1994Ь; Койипеп е! а1., 1999; Здайап е! а1., 2000). Эти ангиопролиферативные очаги имеют преходящий характер, происходят из мышей и возникают в ответ на цитокины, такие как ЬЕСЕ и УЕСЕ, 1Ь-1, 1Ь-6 и другие, выделяемые клетками КЗ (Епкой е! а1., 1989; Епкой е! а1., 1994а; Епкой е! а1., 1994Ь; ЕюгеШ е! а1., 1995; Заташедо е! а1., 1995; Заташедо е! а1., 1997; Здайап е! а1., 2000). Действительно, по крайней мере в начальной фазе, КЗ является реактивным ангиопролиферативным заболеванием, а не настоящим новообразованием (Епко11 апй 8!ϋΓζ1, 1998). Животных подвергали тем же процедурам и дозам индинавира или саквинавира, что применялись в экспериментах, описанных выше. Как показывает табл. 5, инокуляция клеток КЗ вызывала появление КЗ-подобных очагов у 100% животных. Введение индинавира или саквинавира уменьшало процент мышей, у которых возникали КЗ-подобные очаги, до 43 и 25%, соответственно. При макроскопии очаги были ярко-красными и сильно васкуляризованными у не получавших препараты мышей, но меньшими, бледными и в стадии регрессии у получавших ИПВИЧ животных. Аналогично, очаги у не получавших препараты мышей проявляли сильную неоваскуляризацию, инфильтрацию веретенообразных клеток, отек и транссудацию эритроцитов (фиг. 23). Напротив, у получавших ИПВИЧ мышей проявлялась большая некротическая зона на месте инъекции клеток, охватывающая до 85% общей площади очага, и заметное уменьшение новообразованных сосудов и инфильтрации веретенообразных клеток, которые в основном ограничивались периферией зоны некроза/регрессии (фиг. 23).
Чтобы установить, способны ли ИПВИЧи также вызывать регрессию КЗ без предварительного введения препаратов, были поставлены эксперименты по введению мышам ИПВИЧ во время инокуляции клеток КЗ. Как показывает фиг. 24, очаги КЗ проявляют медленную регрессию со временем, однако у получавших ИПВИЧ мышей регрессия протекала намного быстрее и ко времени забоя площадь поверхности очагов была близка или идентична таковой у отрицательных контролей (р<0,001).
Белок Та! вируса ВИЧ повышает частоту и агрессивность КЗ у лиц, инфицированных ВИЧ-1 (Епкой е! а1., 1994а). Это обусловлено тем, что Та! индуцирует адгезию, миграцию, инвазию и пролиферацию эндотелиальных клеток и клеток КЗ. В самом деле, Та! синергично усиливает эффекты ЬРСР на ангиогенез и на КЗ (Епко11 е! а1., 1994а; ВагШап е! а1., 1999а и 1999Ь). Однако Та! требует присутствия ЬЕСЕ или воспалительных цитокинов для оказания действия на КЗ, так как они повышают экспрессию рецепторов
- 17 006678
Та! на поверхности клеток и в тканях (Вап11ап е! а1., 1992; ВагШаб е! а1., 1993; А1Ь1ш е! а1., 1995; ИогеШ е! а1., 1995; ИогеШ е! а1., 1999; Вап11ап е! а1., 1999а; Вап11ап е! а1., 1999Ь).
Соответственно, чтобы проверить, ингибируют ли ИПВИЧи эффекты Та! в комбинации с ЬЕСЕ на ангиогенез и на К8, мышам пибе инокулировали клетки линии ЕА-йу 926. Эта линия клеток происходит из гибрида между клетками Н-ИУЕС и легочной аденокарциномы человека (Ебде11 е! а1., ΡΝΑ8 1983), сохраняет большую часть маркеров эндотелиальных клеток и применяется в качестве модели ангиогенной опухоли (Л1Ь1ш е! а1., ΝηΙ Μеб 1996; Л1Ь1ш е! а1., ΡΝΑ8 1995; Са1 е! а1., ЬаЬ 1пуей 1999). ИПВИЧи начинали вводить мышам пибе за 2 дня до инокуляции раковых клеток. Как показывает табл. 7, опухоли возникали у 83% не получавших препараты мышей, но только у 33 и 25% мышей, соответственно, получавших индинавир или саквинавир (р<0,05). Аналогично, площадь поверхности опухолей снижалась у мышей, получавших оба ИПВИЧа (р<0,05), достигая размера отрицательных контролей (табл. 7). Остаточные опухоли у получавших препараты животных проявляли сильное уменьшение и роста опухолей, и ангиогенеза по данным гистологии и по окрашиванию с помощью антител к ЕУШ-КА или СЭ31. по сравнению с контролями (р<0,001) (табл. 7). Ингибирование роста опухолей также наблюдалось и без предварительного введения препаратов (фиг. 25). Действительно, у этих животных размер поверхности опухолей ко времени забоя уменьшался более чем на 50% по сравнению с не получавшими препаратов контролями (р<0,001) (фиг. 25). Таким образом, ИПВИЧи ингибируют рост ш νίνο на модели ангиогенной опухоли путем прямого блокирования инвазии раковых клеток и ангиогенеза, несмотря на отсутствие эффекта на пролиферацию клеток ЕА-йу 926.
Пример 8.
Чтобы установить, способны ли ИПВИЧи ингибировать рост злокачественных твердых и лимфоидных опухолей, мышам пибе инокулировали клетки гепатокарциномы (8К-Нер-1), клетки легочной карциномы (А549), клетки аденокарциномы молочной железы (ΜΌΑ-ΜΒ-468), клетки миеломоноцитарной лейкемии (И937) и клетки Т-лимфоцитарной лейкемии (.Тшка!). Рост всех этих ксенотрансплантатных опухолей значительно ингибировался как индинавиром, так и саквинавиром, несмотря на отсутствие эффекта ИПВИЧ на пролиферацию этих линий клеток (фиг. 26-30). Таким образом, эти данные указывают, что блокирование инвазии раковых и эндотелиальных клеток вследствие ингибирования ИПВИЧ активности ММП несет ответственность за эффекты этих препаратов на рост опухолей.
Пример 9.
Поскольку ММП участвуют в сосудистой проницаемости и образовании отека (Сагшейе! е! а1., 2000), которые являются важными клиническими признаками ангиогенеза, К8, опухолей и воспалительных заболеваний, были поставлены эксперименты по сосудистой проницаемости у мышей пибе, инокулированных клетками К8. Эти клетки вызывают отеки, так как они продуцируют цитокины с отекообразующим действием, включая УЕСЕ, ЬЕСЕ (в комбинации с УЕСЕ), 1Ь-1, 1Ь-6 и другие. Мышам пибе вводили индинавир, саквинавир или физраствор на протяжении 2 дней при тех же дозах и процедурах, что описаны в примере 6, вводили в вену краситель Еушъ Ь1ие, а затем инокулировали клетки К8, культивированные ίπ νίίιο в присутствии индинавира или саквинавира (1 мкМ) или предназначенного для них буфера. Через 12 ч животных забивали и измеряли окрашенную зону в месте инокуляции клеток К8 с помощью штангенциркуля, а проникший из кровотока краситель экстрагировали из ткани формамидом и измеряли спектрофотометрически ^акатига, 8с1епсе 1992). Как видно из фиг. 31, введение индинавира или саквинавира уменьшало количество проникшего из кровотока красителя на 39,8% (р<,05) и 44,5% (р <0,01), соответственно, и площадь окрашенной зоны на 43,5 и 47,5%, соответственно (фиг. 31).
Пример 10.
Клетки К8 секретируют цитокины, обладающие воспалительным, отекообразующим, ангиогенным и пролиферативным действием с аутокринными и паракринными эффектами (ЕпюН апб 8!ϋΓζ1, 1998). Эти факторы опосредуют все процессы, необходимые для образования К8-подобных очагов (ангиогенез, пролиферация и инвазия клеток, воспалительная инфильтрация, отек), и сосудистую проницаемость и отеки, вызываемые клетками К8 у мышей пибе. Чтобы установить эффекты индинавира и саквинавира на продукцию цитокинов, клетки К8 культивировали в присутствии или в отсутствие серийных разведений индинавира или саквинавира. Определяли содержание ЬЕСЕ, УЕСЕ, ТС-1 и 1Ь-6 с помощью иммуноферментных тестов в супернатантах клеток К8 после 24 ч культивирования в отсутствие сыворотки и в непрерывном присутствии этих двух ИПВИЧ методом ЕЬ18А. Индинавир и саквинавир ингибировали продукцию 1Ь-1а, 1И-1 β и 1Ь-6 клетками К8. Как пример этих эффектов, на фиг. 32 представлено ингибирование 1Ь-6, типичного воспалительного цитокина, вырабатываемого клетками К8 и эндотелиальными клетками, а также лимфоцитами и моноцитами крови и тканей, который также обладает ангиогенным действием (Μη№ е! а1., 1994; Сойеп е! а1., 1996). Кроме того, 1Ь-6 играет ключевую роль в полицентрической болезни Кастлмана и росте лимфом (Тока!о е! а1., 1993; Ре!егкоп апб Е1№ега, 1993; Ακου е! а1., 1998; Каткау е! а1., 1994), еще одного типа опухолей, частота возникновения которого снижается у пациентов, получавших ИПВИЧ (1п!егпа!юпа1 Со11аЬога!юп оп Н1У апб Сапсег, 2000).
- 18 006678
Обсуждение
Эти результаты показывают, что ИПВИЧи оказывают специфическое ингибирующее действие на миграцию клеток и/или инвазию, но не на пролиферацию клеток. По-видимому, эти эффекты обусловлены механизмом, общим для многих типов первичных и раковых клеток различного происхождения и направленным на ключевые молекулы, участвующие в миграции и инвазии клеток, но не связанные с протеасомами. Так, наши исследования показывают, что эффекты ИПВИЧ связаны с ингибированием активации или продукции ММП и могут затрагивать и другие молекулы, участвующие в метаболизме ММП, например, тромбоспондин. Вследствие этих активностей ИПВИЧи способны блокировать несколько клеточных процессов, требующих миграции клеток, инвазии и/или активности ММП, включая ангиогенез, сосудистую проницаемость, образование отека и рост таких реактивных гипертрофических опухолей, как КБ, или злокачественных твердых или лимфоидных новообразований. Поскольку миграция клеток воспаления и иммунной системы также требует инвазии клеток и активности ММП, наши данные указывают, что ИПВИЧи могут ингибировать инфильтрацию тканей клетками при воспалительных или иммунных реакциях. Кроме того, ИПВИЧи ингибируют продукцию цитокинов и других факторов, опосредующих возникновение КБ и рост других опухолей и связанную с этим воспалительную инфильтрацию. ИПВИЧи также обладают противовоспалительным действием, так как они снижают продукцию таких цитокинов, как 1Ь-6, 1Ь-1 и другие цитокины, участвующие в воспалении, а также присутствующие в очагах КБ у человека и мышей. Те же самые воспалительные цитокины способны индуцировать продукцию ангиогенных факторов (ЬБСБ, νΗΟΡ). а также обладают ангиогенным действием ш νί\Ό (ВагШап е! а1., 1992; Баташедо е! а1., 1995; БюгеШ е! а1., 1995; Баташедо е! а1., 1997; Баташедо е! а1., 1998; БюгеШ е! а1., 1998; БюгеШ е! а1., 1999; ВагШап е! а1., 1999а). В частности, 1Ь-6 играет ключевую роль в полицентрической болезни Кастлмана и росте лимфом (Тока!о е! а1., 1993; Ре!егкоп апй Бп/хега, 1993; Каткау е! а1., 1994; Акои е! а1., 1998).
ИПВИЧи связываются в активном сайте протеазы ВИЧ, принадлежащей к семейству аспартиловых протеаз. Недавно было показано, что эти препараты способны ингибировать аспартиловую протеазу грибов (Саккопе е! а1., 1999). Однако ни одна из известных протеаз, участвующих в миграции клеток и инвазии, не является аспартиловой протеазой, и не обнаружено гомологии в последовательности между активным сайтом протеазы ВИЧ и протеаз, участвующих в этих процессах, за исключением тромбоспондина. Следовательно, те эффекты на миграцию клеток, инвазию и ММП, которые мы показали, были полностью непредсказуемы и не могли быть предвидены.
В самом деле, хотя в некоторых исследованиях предполагалось, что ИПВИЧи оказывают влияние на клеточный метаболизм, протеасомы и иммунитет (Иеекк е! а1., 1997; Апйге е! а1., 1998; \Уе1с1ю1й е! а1., 1999; Ьейги е! а1., 2000; Тоуо, 2000; патентные заявки XVО 99/63998 и XVО 0033654), мы показали, что ИПВИЧи оказывают прямое антиангиогенное, противоопухолевое, противоотечное и противовоспалительное действие, которые не связаны с известными аспартиловыми протеазами, протеасомами или эффектами ИПВИЧ на репликацию ВИЧ или ΗΗν-8. В самом деле, используемые в настоящем исследовании модели пролиферации клеток, миграции, инвазии, ангиогенеза, КБ и опухолей свободны от возбудителей инфекций.
Близкие результаты были получены как с индинавиром, так и саквинавиром, которые обладают такой же структурой, как и другие ИПВИЧ, хотя химические заместители и специфичны для каждого препарата. Так что эти данные означают, что те активности ИПВИЧ, которые мы открыли у индинавира и саквинавира, являются общим свойством для всех ИПВИЧ, что согласуется с общими эффектами различных ИПВИЧ, наблюдавшимися у получавших их лиц (ЬеЬЬе е! а1., 1998; Са!!е1ап е! а1., 1999; 1п!егпа!юпа1 Со11аЬога!юп оп Ηΐν апй Сапсег, 2000).
Вышеуказанные эффекты ИПВИЧ наблюдаются при тех же концентрациях, что и в плазме получавших их пациентов, которые хорошо переносятся этими лицами. Также не наблюдалось никаких токсических эффектов индинавира или саквинавира ш νί!ΐΌ или у мышей. Хотя прежние данные показывали, что ИПВИЧи ингибируют протеасомы и что ингибирование протеасом индуцирует запрограммированную гибель клеток у пролиферирующих эндотелиальных клеток (Апйге е! а1., 1998; Шппек е! а1., 2000), в наших опытах индинавир и саквинавир не проявляли влияния на выживаемость клеток или рост эндотелиальных клеток, гладкомышечных клеток и раковых клеток. Напротив, они избирательно ингибировали миграцию клеток и инвазию, свидетельствуя, что ИПВИЧи не повреждают уже существующие сосуды или ткани. Поскольку подвижность клеток и ангиогенез необходимы не только для возникновения КБ, но и для роста и метастазирования опухолей (СагтеНе! апй Чип 2000; Бюиег-БЮтепкоп, 1999), описанные до сих пор результаты указывают, что ИПВИЧи являются перспективными антиангиогенными и противоопухолевыми препаратами. Кроме того, эти же результаты показывают, что ИПВИЧи блокируют сосудистую проницаемость и воспаление, индуцируемые воспалительными цитокинами и факторами сосудистой проницаемости, а также продукцию цитокинов, играющих ключевую роль в полицентрической болезни Кастлмана и в росте лимфом (Тока!о е! а1., 1993; Ре!егкоп апй Бп/хега, 1993; Каткау е! а1., 1994; Акои е! а1., 1998). Следовательно, ИПВИЧ и близкие им препараты или их производные могли бы применяться для блокирования ангиогенеза, роста, инвазии и метастазирования твердых опухолей и рака крови, отека и воспаления, таким образом, они могли бы с успехом применяться при лечении КБ, опухолей,
- 19 006678 ангиопролиферативных заболеваний, воспалительных и аутоиммунных заболеваний как у ВИЧотрицательных, так и у ВИЧ-инфицированных лиц.
Таблица 1. Индинавир и саквинавир блокируют индуцированные ЬГОГ ангиогенные К8-подобные очаги у мышей пибе____________________________________________________________
| Обработка | Инъекция | Число мышей с макроскопическими сосудистыми очагами/ Число инокулированных мышей (%) | Площадь окрашенной ткани (%±8ϋ) | |
| ГУШ-К.А | СО31 | |||
| Физраствор | Буфер | 0/22 (0) | 0,20 ± 0,2 | 0,06 ± 0,1 |
| Физраствор | ЬГОГ | 20/28 (71) | 4,32 ±2,0 | 3,45 ± 1,7 |
| Индинавир | ЬГОГ | 8/28 (28) | 1,32 ±1,2 | 1,00 ±0,6 |
| Саквинавир | ЬГОГ | 7/28 (25) | 1,13 ±0,6 | 0,83 ± 0,3 |
Мышам пибе инокулировали ЬГОГ (1 мкг), чтобы индуцировать образование К8-подобных ангиопролиферативных очагов, или предназначенный для него буфер (контроль) и вводили индинавир, саквинавир или физраствор. Во время забоя обследовали места инокуляции для проверки наличия макроскопических ангиопролиферативных очагов и подвергали микроскопии после окрашивания гематоксилином + эозином (Н&Е) или замораживали для гистохимического анализа маркеров эндотелиальных клеток Γνΐΐΐ-КА и СВ31. В таблице указано число мышей, у которых возникли очаги, относительно числа инокулированных мышей, и процент (%) мышей, у которых возникли очаги. Уменьшение числа К8подобных очагов у получавших препараты животных было статистически достоверным (стандартный критерий для отношений, р <0,05). Ангиогенез анализировали путем определения площади ткани, проявляющей окрашивание на Γνΐΐΐ-КА и СВ31. Приведены в процентах [среднее ± стандартное отклонение (80)] площади очагов, проявляющих окрашивание на Γνΐΐΐ-КА и СВ31. которые определяли как описано ниже. Снижение экспрессии Γνΐΐΐ-КА и СВ31 в остаточных очагах у получавших ИПВИЧ животных было статистически достоверным (р <0,001).
Для проведения этих экспериментов т у1уо использовали те же рецептуры индинавира (Мегск, 8Ьагр & ВоИше Е!б., 11ааг1ет. ΝΣ) или саквинавира (КосГе, I ЕтЕогсЫиге. ОВ), что и у ВИЧинфицированных пациентов, растворяли их в физрастворе и вводили мышам пибе (Ва1Ь/с пи/пи, самки, СЬаг1ек К1уег, Са1со, Италия, возраст 5-6 недель) через желудочный зонд. Для проверки на токсичность индинавир и саквинавир вводили ежедневно на протяжении 8 дней в дозах 35, 70 или 17,5 мг/кг/день либо 18, 36 или 9 мг/кг/день, соответственно, в объеме 0,4 мл. Эти дозы соответствуют полной дозе, двойной дозе или половине дозы ИПВИЧ, соответственно, вводимых ежедневно ВИЧ-инфицированным пациентам (Веекк е! а1., 1997). При этих дозах не наблюдалось токсичности для органов или системной токсичности. Мышам вводили 70 мг/кг/день индинавира (что соответствует 1,4 мг/день) или 36 мг/кг/день саквинавира (что соответствует 1 мг/день) один раз в день на протяжении 7 дней, начиная за 2 дня до инокуляции ЬГОГ. Контрольным животным вводили такой же объем физраствора. На третий день мышам инокулировали подкожно на уровне нижней четверти спины 1 мкг рекомбинантного ЬГОГ (КосГе, МаппГе1т, Германия) в 0,2 мл фосфатного буфера (РВ8) с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (В8А) или предназначенный для него буфер, которые смешивали с 0,2 мл матригеля (Со11аЬога!1уе Вютеб1са1 Ргобис!к, ВебГогб, МА) перед инокуляцией, как описано ранее (ЕпкоН е! а1., 1994а). Через 4 дня мышей забивали и обследовали места инокуляции для проверки наличия макроскопических К8подобных ангиопролиферативных очагов, а срезы тканей подвергали гистологическому исследованию после окрашивания Н&Е. Для иммуногистохимического анализа замороженные срезы тканей фиксировали холодным ацетоном и окрашивали при помощи кроличьих поликлональных антител к Γνΐΐΐ-КА человека (Вако, О1оз1гцр, Дания) в разведении 1:2000 или крысиных моноклональных антител к С В31 мышей (ВВ Вюкшепсек в разведении 1:1000). Получали цифровые изображения (увеличение х200) с помощью цветной телекамеры ССВ (Хе1'<<) и анализировали, делая снимки 4-9 полей зрения микроскопа (около 0,15 мм2 на 1 поле), соответствующих целому гистологическому срезу. Окрашивание измеряли количественно с помощью программы анализа изображений К8300 (/ещД и выражали в процентах окрашенной поверхности от общей площади ткани.
Таблица 2. Индинавир и саквинавир ингибируют образование ангиогенных К8-подобных очагов, индуцированных ЬГОГ вместе с УЕОГ_____________________________________________
| Ангиогенные факторы | Обработка | Число мышей, у которых возникли очаги/ Общее число мышей |
| БЕСЕ 0,1 мкг | Физраствор | 2/4 (50%) |
| УЕСЕ 1 мкг | Физраствор | 0/6 (0%) |
| ЬГОГ 0,1 мкг + УЕОГ 1 мкг | Физраствор Индинавир Саквинавир | 5/6 (83%) 2/6 (33%) 1/6 (17%) |
- 20 006678
Мышам пийе инокулировали буфер, ЬЕСЕ, УЕСЕ (К&О Вуз1етз, МшпеароНз, ΜΝ) или ЬЕСЕ вместе с УЕСЕ в матригеле и вводили индинавир, саквинавир или физраствор, как определено в подписи к табл. 1. После забоя обследовали места инокуляции на наличие макроскопических ангиопролиферативных очагов, окрашивали ткани Н&Е и проводили микроскопию. В таблице приведено число мышей, у которых образовались очаги, относительно общего числа инокулированных мышей, и процент (%) мышей, у которых образовались очаги. Число мышей, у которых образовались ангиогенные КВ-подобные очаги, уменьшалось после введения как индинавира, так и саквинавира (стандартный критерий для отношений, р <0,05).
Таблица 3. Эффекты индинавира и саквинавира на ангиогенез, индуцированный ЬЕСЕ или УЕСЕ, при определении на оболочке хориоаллантоиса (ОХА)____________________________________
| Ангиогенный фактор | Обработка (число яиц) | Среднее число сосудов на мм2 ± δϋ |
| Буфер | Физраствор (23) | 4,39 ± 1,12 |
| ЬРСР | Физраствор (11) Индинавир (11) Саквинавир (13) | 13,50 ±3,03 8,22 ± 2,54 6,08 ± 1,84 |
| УЕСЕ | Физраствор (8) Индинавир (9) Саквинавир (7) | 13,51 ±2,42 7,70 ±2,52 5,39 ± 0,67 |
| ЬЕСЕ | Такео л (4) | 7,71 ± 1,63 |
Определения на ОХА проводили при помощи кусочков стерильного губчатого желатина (ОеИоат кр.|о1ш Со., Ка1ата/оо, ΜΙ) объемом 1 мм3, пропитанных ЬЕСЕ или УЕСЕ (1 мкг или 100 нг, соответственно) в 5 мкл РВВ, а также буфером, ИПВИЧ (10 мкМ) или таксолом (250 нМ) (Впз1о1-Муегз ВцшЬЬ Со., Рппсе!оп, N1), как описано (КтЬаШ е1 а1., !п1. I. Оет. Вю1. 1996). ОХА обследовали ежедневно вплоть до 12-го дня под стереомикроскопом О1утри8 8ΖΧ9. Получали изображения (1024x1024 пикселя) с расстояния 2 мм от края губки с помощью охлаждаемой телекамеры ССО 11атата18и ОКСА (11атата18и РЬо!отсз Пайа, Агезе, Италия). Количество сосудов определяли с помощью программы анализа изображений 1тадеРгоР1и8 4.0 (Мей1а СуЬегпейсз, В11уег Врппд, МО) на 3 выбранных случайным образом участках из 1 яйца (1 мм3).
Результаты выражали как среднее число сосудов/мм2 ± ВО из указанного числа ОХА на каждое экспериментальное условие. Использовали дозы индинавира, саквинавира или таксола, близкие концентрациям препаратов в плазме получавших их пациентов (ВопшсЕзеп Ώ.8. & Ке11ш§ М.У., С1ш, Рйагтасокше!. 1994; Оеекз В.С. е1 а1., 1АМА 1997). Введение индинавира, саквинавира или таксола не было связано с токсичностью и не влияло на фоновую васкуляризацию ОХА (данные не приводятся). Ингибирование образования сосудов индинавиром или саквинавиром было статистически достоверным (критерии АNОУА и ВШйеп^е'^тап-КеиЕ, р<0,05).
Таблица 4. Эффекты индинавира и саквинавира на клетки КВ ш уйго
| Клетки К8 | Индинавир (мкМ)’ | Саквинавир (мкМ)’ | ||||
| 0,01 | 0,1 | 1 | 0,01 | 0,1 | 1 | |
| Адгезия | н/о | н/о | 1,05 | н/о | н/о | 1 |
| Пролиферация | 1 | 1,08 | 1,11 | 1 | 1,15 | 1,25 |
| Миграция | н/о | н/о | 1,03 | н/о | н/о | 1,21 |
| Инвазия | 0,98 | 0,74 | 0,71 | 1 | 0,79 | 0,62 |
*Увеличение показателя по сравнению с контролем (раз) ** р <0,05 н/о, определение не проводилось
Адгезию, пролиферацию, миграцию и инвазию определяли, культивируя клетки КВ в присутствии индинавира или саквинавира в концентрациях от 0,01 до 1 мкМ в течение 5-7 дней. Индинавир или саквинавир не ингибировали способность клеток КВ к адгезии на субстрате из фибронектина. Аналогичным образом обработка клеток КВ индинавиром или саквинавиром в течение 7 дней не влияла на пролиферацию клеток при измерении по исключению красителя трипанового синего.
Ни индинавир, ни саквинавир не оказывали влияния на миграцию клеток КВ. Напротив, оба препарата ингибировали способность клеток КВ к инвазии мембраны из матригеля дозозависимым образом (р <0,05).
Определения миграции и инвазии проводились в основном, как описано в подписях к фиг. 2 и 3. Клетки КВ, культивированные в течение 5 дней в присутствии индинавира или саквинавира (0,01-1 мкМ) или предназначенного для них буфера, помещали в верхний отсек камеры Бойдена в присутствии ИПВИЧ, а в нижний отсек вносили ЬЕСЕ в качестве хемоаттрактанта.
- 21 006678
Таблица 5. Эффекты индинавира и саквинавира на ангиопролиферативные К8-подобные очаги, индуцированные инокуляцией клеток К8, у мышей пибе
| Обработка | Инъекция | Число мышей с макроскопическими очагами/ Число инокулированных мышей (%) |
| Физраствор | Среда | 0/8 (0) |
| Физраствор | Клетки К8 | 14/14 (100) |
| Индинавир | Клетки К8 | 7/16 (43) |
| Саквинавир | Клетки К8 | 4/16 (25) |
Мышам пибе инокулировали клетки К8 (3х106), чтобы вызвать образование ангиопролиферативных К8-подобных очагов, или предназначенный для них буфер (контроль), и вводили индинавир, саквинавир или физраствор в соответствии с дозами и процедурами, описанными в подписи к табл. 1, начиная за 2 дня до инокуляции клеток и вплоть до забоя через 5 дней. Во время забоя обследовали места инокуляции для проверки на наличие макроскопических ангиопролиферативных К8-подобных очагов, как описано в подписи к табл. 1. В таблице приведено число мышей, у которых образовались очаги, относительно общего числа инокулированных мышей, и процент (%) мышей, у которых образовались очаги. Уменьшение образования ангиогенных К8-подобных очагов у получавших ИПВИЧ животных было статистически достоверным (стандартный критерий для отношений, р<0,001). Гистологическая картина мест инокуляции представлена на фиг. 23.
Таблица 6. Индинавир и саквинавир блокируют образование ангиопролиферативных К8-подобных очагов, индуцированных инокуляцией ЬГОГ вместе с белком Та! вируса ВИЧ, у мышей пибе.
| Инъекция | Обработка | Число макроскопических сосудистых очагов/ Число инокулированных мышей (%) |
| Буфер | Физраствор | 0/18 (0) |
| ЬРОР + Та! | Физраствор | 7/10 (70) |
| ЪРОР + Та! | Индинавир | 5/10 (50) |
| ЪРОР + Та! | Саквинавир | 2/10 (20) |
Мышам пибе инокулировали ЬГОГ (1 мкг) вместе с Та! (10 мкг), чтобы вызвать образование К8подобных ангиопролиферативных очагов, или предназначенный для них буфер (контроль), и вводили индинавир, саквинавир или физраствор. Во время забоя обследовали места инокуляции для проверки на наличие макроскопических ангиопролиферативных очагов. В таблице приведено число мышей, у которых образовались очаги, относительно общего числа инокулированных мышей, и процент (%) мышей, у которых образовались очаги.
Мышам вводили индинавир и саквинавир в соответствии с процедурами и дозами, описанными в табл. 1, на протяжении 7 дней, начиная за 2 дня до инокуляции ЬГОГ и Та!. Контрольным животным вводили такой же объем физраствора. На третий день мышам инокулировали подкожно на уровне нижней четверти спины 1 мкг рекомбинантного ЬГОГ и 10 мкг белка Та! вируса ВИЧ в 0,2 мл ΡΒ8 с 0,1% В8А или предназначенный для них буфер, которые смешивали с 0,2 мл матригеля перед инокуляцией, как описано ранее (Епзой е! а1., Хайле 1994). Через 4 дня мышей забивали и обследовали места инокуляции для проверки наличия макроскопических К8-подобных ангиопролиферативных очагов, а срезы тканей подвергали микроскопии после окрашивания гематоксилином/эозином.
Таблица 7. Индинавир и саквинавир ингибируют возникновение ангиогенных опухолей, индуцированных инокуляцией клеток ЕА-йу 926, у мышей пибе__________________________________
| Обработка | Инъекция | Число мышей с макроскопическими очагами/ Число инокулированных мышей (%) | Площадь поверхности очага (см2±8О) | Площадь окрашенной ткани (% ± 8ϋ) | |
| РУШ-КА | СО31 | ||||
| Физраствор | Среда | 0/8 (0) | 0,58 ±0,15 | 0 | 0 |
| Физраствор | Клетки | 10/12 (83,3) | 0,71 ±0,2 | 2,91 ± 1 | 2,30 ± 1,7 |
| Индинавир | Клетки | 4/12 (33,3) | 0,63 ±0,17 | 1,01 ± 1,5 | 0,70 ± 0,6 |
| Саквинавир | Клетки | 3/12 (25) | 0,55 ±0,14 | 0,71 ±0,8 | 0,08 ±0,1 |
Мышам пибе инокулировали подкожно клетки ЕА-йу 926 (по 3х106 клеток) (см. подпись к фиг. 25) и вводили через желудочный зонд индинавир, саквинавир или физраствор, начиная за 2 дня до инокуляции клеток, как описано выше (см. подпись к табл. 1). Мышей забивали через 5-6 дней после инокуляции клеток и измеряли очаги поражения в местах инокуляции с помощью штангенциркуля, а также подвергали микроскопии после окрашивания Н&Е или иммуногистохимическому анализу. Уменьшение образования ангиогенных опухолевых очагов у получавших ИПВИЧ животных было статистически достоверным (стандартный критерий для отношений, р<0,05). Опухолевый ангиогенез анализировали после иммуногистохимического окрашивания на маркеры РУШ-КА или 031, как описано в подписи к табл. 1. Приведена площадь поверхности очага (см2 ± 8Ό) и площадь окрашенной опухолевой ткани в процентах
- 22 006678 (± 8Ό) при измерении с помощью программы анализа изображений Κ8300 (2е188) (см. методы). Размеры остаточных очагов в местах инокуляции уменьшались у мышей, получавших индинавир или саквинавир (р <0,05), и проявлялось снижение экспрессии как РУШ, так и СЭ31 (р <0,001).
Библиография
А1Ыш Α. е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асаб. δοΐ. И8А 92,4838 (1995).
А1Ыш А. е! а1., ИаЕ Μеб. 2,1371 (1996).
Апбге Р. е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8с1. И8А 95, 13120 (1998).
Агой Н. е! а1., Β1οο6 91,2475 (1998).
ВагШап С. е! а1., 1. Iттиηο1., 149, 3727 (1992).
ВагШап С. е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. И8А 90, 7941 (1993).
Вап11ап С. е! а1., 1. Iттиηο1., 162, 1165 (1999а).
ВагШап С. е! а1., Β1οο6 94, 663 (1999а).
Вет Κ. апб 81тсп8 Μ., 1. Βΐο1. СЛет. 275,32167 (2000).
В^т Ь. е! а1., АШ8 11, 63 (1997).
Са1 е! а1., ЬаЬ Г^е8! 79,1151 (1999).
СагтеЛе! Р., Κ.Κ. 1аш, Ыа!иге 14,249 (2000).
Сагг е! а1., Ьапсе! 351,1881 (1998).
Са88οηе А. е! а1., 1. Гп£е!с!. Ό18. 180,448 (1999).
Са!!е1ап АН е! а1., Еиг. 1. Сапсег 35,1809 (1999).
СоНеи Т. е! а1., 1. Βΐο1. СЛет. 271, 736 (1996).
Ье Μί1ί!ο А. е! а1., 1. Μеб. У1го1. 57,140 (1999).
Пеек8 8.0. е! а1., .ΙΛΜΛ 2,145 (1997).
Ебде11 С.С. е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск И8А 80, 3734 (1983).
Επ8ο1ί В. е! а1., 8с1епсе 243,223 (1989).
ЕшюЛ В. е! а1., Ыа!иге 345, 84 (1990).
ЕшюЛ В. е! а1., Ыа!иге 371, 674 (1994а).
ЕптоЛ В. е! а1., 1. СЛп. Г^е8!. 94. 1736 (1994Ь).
Еη8οЛ В., М. 8!ϋΓζ1, СуГОкте Сго\\111 РасЮг Κν. 9, 63 (199).
ЕюгеШ V. е! а1., 1. СЛп. Г^е8!. 95. 1723 (1995).
ЕюгеШ V. е! а1., Β1οο6 91,956 (1998).
Еюге1Л V. е! а1., 1. ^тимк 162,1165 (1999).
Гп!ета!юпа1 СοЛаЬο^аЛοη οη Н1У апб сапсег, 1. Ыа!1. Сапсег 1п8!. 92, 1823 (2000).
Ρη)μο!ο N. е! а1., СЛп СЫт Ас!а 221, 91 (1993).
СгиЬег А. е! а1., 1. Βίο. СЛет. 276,47840 (2001).
Наппе8 СА. е! а1., РА8ЕВ 1. 14, 85 (2000).
Шетет О.Е., №.С. 8!е!1е^-8!еνеη8οη, Апа1. ВгосЛет. 218, 325 (1993).
^^пеп Е. е! а1., №1к ВюгесЛшк 17, 768 (1999).
ЬеЬЬе С. е! а1., АШ8 12, 45 (1998).
Ьебги Е. е! а1., Β1οο6 95, 3191 (2000).
ЬерреП Ό. е! а1., Вгат 121, 2327 (1998).
ЬерреП Ό. е! а1., СЛп. Лес! Ό18 31, 80 (2000).
Μа8οοб Κ.Ζ. е! а1., Β1οο6 85, 3423 (1995).
Μа!еο Κ.Β. е! а1., Ат. 1. РЛу8го1. 26, Κ1840 (1994).
Μеабе-Тο1Лη Ь.С. е! а1., Ас!а Н18ЮсЛет. 101, 305 (1999).
Макатига 8. е! а1., 8аепсе 255,1437 (1992).
О|ка\\'а Т. е! а1., ВгосЛет. ВюрЛу8. Ке8. Сотт. 246,243 (1998).
О8тап Μ. е! а1., 1. У1го1. 73, 6136 (1999).
Рей^п В.А., С.Р^^ζζе^а, 8етт. Опго1. 20, 636 (1993).
Кат8ау АД. е! а1., 8с1епсе 264, 561 (1994).
К1Ьа!Л Ό. е! а1., 1п!. 1. Ьеу. Βίο1. 40. 1189 (1996).
Κ^ζζ^е^^ ΌΑ. е! а1., Ьапсе! 349,75 (1997).
8атаη^едο Р. е! а1., 1. Iттиηο1. 154,3582 (1995).
8атаη^едο Р. е! а1., 1. Iттиηο1. 154,3582 (1995).
8атаη^едο Р. е! а1., Ат. 1. Ра^к 152,1433 (1998).
8§абап С е! а1., 1. Iттиηο1. 165, 509 (2000).
8таш Μ.Ο. е! а1., 1. РаМ. 152,1433 (1998).
8таш Μ.Ο е! а1., 2пб Гп!ета!юпа1 λνοΓί^Ικψ οη Κ8Ην/ΗΗν8 апб ге1а!еб адеп!8. 8!. Са!Леппе'8 С'о11е§е. Ох[огб. ϋΚ. 10-13 8ер!етЬег (1999).
8таш Μ.Ο е! а1., 3гб Iη!етаЛοηа1 νο^к8Лοр οη Κарο8^'8 8а^сοта-а88οс^а!еб Легре8У1ги8 апб ге1а!еб адеп!8, АтЛег8!, ΜΑ, И8А. .Типе 6-10 (2000).
8!е!1е^-8!еνет8οη №.С., 1. СЛп. ке8к 103,1237 (1999).
- 23 006678
ТагаЬо1ей С. е! а1., ЕА8ЕН I., 14,1674 (2000).
То§а!о С. е! а1., I. С1т. 1пуей. 91,2806 (1998).
Тоуо ΡΑ е! а1., I. 1пГес!. Όίδ. 182, 928 (2000).
\\ е1с1ток1 Е.Е. е! а1., I. Нит. У1го1. 2,261 (1999).
Claims (49)
1. Применение ингибитора протеазы ВИЧ для получения медикамента для лечения опухоли у первого пациента, причем указанный медикамент предназначен для введения в суточной дозе, которая ниже обычно применяемой суточной дозы ингибитора протеазы ВИЧ, вводимой для лечения инфекции ВИЧ у ВИЧ-инфицированного пациента.
2. Применение ингибитора протеазы ВИЧ для получения медикамента для блокирования роста опухоли у первого пациента, причем указанный медикамент предназначен для введения в суточной дозе, которая ниже обычно применяемой суточной дозы ингибитора протеазы ВИЧ, вводимой для лечения инфекции ВИЧ у ВИЧ-инфицированного пациента.
3. Применение по любому из пп.1 и 2, где указанный первый пациент не является ВИЧинфицированным.
4. Применение по любому из пп.1-3, где указанный ингибитор протеазы ВИЧ по меньшей мере при одной из концентраций 0,1, 1 или 10 мкМ ингибирует миграцию или инвазию эндотелиальных клеток и клеток саркомы Капоши в ответ на 50 нг/мл ЬЕСЕ при анализе в камере Бойдена.
5. Применение по любому из пп.1-4, где указанный ингибитор протеазы ВИЧ при по меньшей мере одной из концентраций 0,1, 1 или 10 мкМ ингибирует образование цитокинов клетками саркомы Капоши.
6. Применение по любому из пп.1-5, где указанный ингибитор протеазы ВИЧ в дозе, соответствующей полной дозе, двойной или половинной дозе ингибитора протеазы ВИЧ, применяемой ежедневно для ВИЧ-инфицированных пациентов, ингибирует ангиогенез у мышей, индуцируемый ЬЕСЕ.
7. Применение по любому из пп.1-6, где указанный ингибитор протеазы ВИЧ при по меньшей мере одной из концентраций 0,1, 1 или 10 мкМ ингибирует активацию ММР-2 в культивируемых эндотелиальных клетках пупочной вены человека, инкубируемых в присутствии 0,1 мкг/мл ЬЕСЕ.
8. Применение по любому из пп.1-7, где указанным ингибитором протеазы ВИЧ является индинавир или его производное.
9. Применение по п.8, где вводимая суточная доза составляет 600 мг.
10. Применение по п.8, где вводимая суточная доза составляет 1200 мг.
11. Применение по любому из пп.1-7, где указанным ингибитором протеазы ВИЧ является саквинавир или его производное.
12. Применение по п.11, где вводимая суточная доза составляет 900 мг.
13. Применение по п.8, где вводимая суточная доза составляет 1800 мг.
14. Применение по любому из пп.1-7, в котором указанный ингибитор протеазы ВИЧ выбран из числа следующих соединений: индинавира, саквинавира, ритонавира, нельфинавира, ампренавира и лопинавира, их производных и их смесей.
15. Применение по п.14, в котором указанный ингибитор протеазы ВИЧ представляет собой комбинацию индинавира и нельфинавира.
16. Применение по любому из пп.1-15, в котором опухоль представляет собой саркому Капоши.
17. Применение по любому из пп.1-15, в котором опухоль представляет собой опухоль мягких тканей или опухоль хряща, кости или крови.
18. Применение по любому из пп.1-15, в котором опухоль представляет собой злокачественную опухоль.
19. Применение по любому из пп.1, 2, 4-15 и 18, в котором опухоль представляет собой опухоль эндотелиальных клеток, опухоль клеток легкого, опухоль клеток молочной железы, гепатокарциному или лейкоз, и где первый пациент не является ВИЧ-инфицированным.
20. Применение по любому из пп.1, 2, 4-15 и 18, в котором опухоль представляет собой миеломоноцитарный лейкоз или Т-клеточный лейкоз, и где первый пациент не является ВИЧ-инфицированным.
21. Применение по любому из пп.1-20, в котором указанный медикамент дополнительно предназначен для достижения регрессии указанной опухоли.
22. Применение по любому из пп.1-20, в котором указанный медикамент предназначен для ингибирования метастазов.
23. Применение по любому из пп.1-22, в котором указанный медикамент дополнительно предназначен для ингибирования отека.
24. Применение по любому из пп.1-23, в котором указанный медикамент предназначен для введения вместе с противовоспалительным, антиангиогенным или противоопухолевым лекарственным средством.
25. Применение по любому из пп.1-24, в котором указанный медикамент предназначен для перорального, внутривенного, внутримышечного, подкожного, интрадермального, внутрибрюшинного, ин
- 24 006678 тратекального, интраплеврального, внутриматочного, трансмукозального, интраректального, интравагинального или чрескожного введения.
26. Применение по любому из пп.1-24, в котором указанный медикамент предназначен для внутриочагового введения.
27. Применение индинавира или его производного для получения медикамента для лечения опухоли у пациента.
28. Применение индинавира или его производного для получения медикамента для лечения воспалительного заболевания или аутоиммунного заболевания у пациента.
29. Применение индинавира или его производного для получения медикамента для блокирования роста опухоли у пациента.
30. Применение по любому из пп.27-29, где указанный пациент не является ВИЧ-инфицированным.
31. Применение по любому из пп.27-30, в котором указанный медикамент предназначен для введения в суточной дозе, которая ниже обычно применяемой суточной дозы индинавира, вводимой для лечения инфекции ВИЧ у ВИЧ-инфицированного пациента.
32. Применение по любому из пп.27-30, в котором указанный медикамент предназначен для введения в суточной дозе, которая равна или выше обычно применяемой суточной дозы индинавира, вводимой для лечения инфекции ВИЧ у ВИЧ-инфицированного пациента.
33. Применение по любому из пп.27-32, в котором указанный медикамент предназначен для введения суточной дозы индинавира или его производного 2400 или 4800 мг.
34. Применение по любому из пп.27, 29 и 30-33, в котором указанная опухоль представляет собой саркому Капоши.
35. Применение по любому из пп.27, 29 и 30-33, в котором указанная опухоль представляет собой опухоль мягких тканей или опухоль хряща, кости или крови.
36. Применение по любому из пп.27, 29 и 30-33, в котором указанная опухоль представляет собой злокачественную опухоль.
37. Применение по любому из пп.27, 29 и 30-33, в котором указанная опухоль представляет собой опухоль эндотелиальных клеток, опухоль клеток легкого, опухоль клеток молочной железы, гепатокарциному или лейкоз, и где указанный первый пациент не является ВИЧ-инфицированным.
38. Применение по любому из пп.27, 29 и 30-33, в котором указанная опухоль представляет собой миеломоноцитарный лейкоз или Т-клеточный лейкоз, и где первый пациент не является ВИЧинфицированным.
39. Применение по любому из пп.27, 29, 30-33 и 34-38, в котором указанный медикамент дополнительно предназначен для достижения регрессии опухоли.
40. Применение по любому из пп.27, 29, 30-33 и 34-38, в котором указанный медикамент предназначен для ингибирования метастазов.
41. Применение по любому из пп.27-39, в котором указанный медикамент дополнительно предназначен для ингибирования отека.
42. Применение по любому из пп.30-33, в котором указанный медикамент дополнительно предназначен для лечения воспалительного заболевания.
43. Применение по п.42, в котором указанное воспалительное заболевание представляет собой хроническое воспаление, связанное с аллергией и с вирусными, бактериальными или паразитическими возбудителями инфекций, или полицентрическую болезнь Кастлмана.
44. Применение по любому из пп.30-33, в котором указанный медикамент предназначен для лечения аутоиммунного заболевания.
45. Применение по п.44, в котором указанное аутоиммунное заболевание представляет собой системную красную волчанку, склеродерму, ревматоидный артрит, псориаз, тиреоидит, язвенный ректоколит, болезнь Крона, синдром Оοοйρа8!и^е, системный васкулит, синдром Шегрена или первичный билиарный цирроз.
46. Применение по любому из пп.27-45, дополнительно включающее нельфинавир для получения медикамента.
47. Применение по любому из пп.27-46, в котором указанный медикамент предназначен для введения вместе с противовоспалительным, антиангиогенным или противоопухолевым лекарственным средством.
48. Применение по любому из пп.27-47, в котором указанный медикамент предназначен для перорального, внутривенного, внутримышечного, подкожного, интрадермального, внутрибрюшинного, интратекального, интраплеврального, внутриматочного, трансмукозального, интраректального, интравагинального или чрескожного введения.
49. Применение по любому из пп.27-47, в котором указанный медикамент предназначен для внутриочагового введения.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT2001RM000210A ITRM20010210A1 (it) | 2001-04-18 | 2001-04-18 | Uso degli inibitori della proteasi del virus dell'immunodeficienza umana (hiv)nella terapia del sarcoma di kaposi, dei tumori e delle malatt |
| PCT/EP2002/004303 WO2002087583A2 (en) | 2001-04-18 | 2002-04-18 | Use of hiv-protease inhibitors to block cell migration and/or invasion, tissue infiltration and oedema formation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200301130A1 EA200301130A1 (ru) | 2004-04-29 |
| EA006678B1 true EA006678B1 (ru) | 2006-02-24 |
Family
ID=11455472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200301130A EA006678B1 (ru) | 2001-04-18 | 2002-04-18 | Применение ингибиторов протеазы вируса иммунодефицита человека (вич) для блокирования миграции клеток и/или инвазии, инфильтрации тканей и отека при лечении связанных с этим заболеваний |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060088545A1 (ru) |
| EP (1) | EP1401447A2 (ru) |
| CN (1) | CN1700916A (ru) |
| AP (1) | AP2003002901A0 (ru) |
| BG (1) | BG108368A (ru) |
| CA (1) | CA2447748A1 (ru) |
| CZ (1) | CZ20033113A3 (ru) |
| EA (1) | EA006678B1 (ru) |
| EE (1) | EE200300507A (ru) |
| HU (1) | HUP0401199A2 (ru) |
| IT (1) | ITRM20010210A1 (ru) |
| MX (1) | MXPA03010380A (ru) |
| SK (1) | SK14212003A3 (ru) |
| WO (1) | WO2002087583A2 (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002346594A1 (en) * | 2001-12-14 | 2003-06-30 | Cedars-Sinai Medical Center | Use of hiv-1 protease inhibitors and their derivatives in the treatment of inflammation |
| US7812034B2 (en) * | 2003-11-04 | 2010-10-12 | City Of Hope | Method of using protease inhibitors for the treatment of liposarcomas |
| US20090010990A1 (en) * | 2007-06-20 | 2009-01-08 | Little Marisa A | Process for depositing calcium phosphate therapeutic coatings with controlled release rates and a prosthesis coated via the process |
| WO2011139378A1 (en) * | 2010-05-06 | 2011-11-10 | The Feinstein Institute For Medical Research | Compounds and methods for treatment of systemic lupus erythematosus |
| WO2012088305A1 (en) * | 2010-12-22 | 2012-06-28 | The Feinstein Institute For Medical Research | Methods for treating systemic lupus erythematosus using hiv protease inhibitors |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2779653B1 (fr) * | 1998-06-11 | 2002-12-20 | Inst Nat Sante Rech Med | Utilisation de composes modulateurs du proteasome en therapie |
| WO2000033654A1 (en) * | 1998-12-04 | 2000-06-15 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Use of protease inhibitors to modulate cellular pathways, immunity and therapies associated therewith |
-
2001
- 2001-04-18 IT IT2001RM000210A patent/ITRM20010210A1/it unknown
-
2002
- 2002-04-18 CN CNA028121260A patent/CN1700916A/zh active Pending
- 2002-04-18 EE EEP200300507A patent/EE200300507A/xx unknown
- 2002-04-18 HU HU0401199A patent/HUP0401199A2/hu unknown
- 2002-04-18 CZ CZ20033113A patent/CZ20033113A3/cs unknown
- 2002-04-18 MX MXPA03010380A patent/MXPA03010380A/es not_active Application Discontinuation
- 2002-04-18 US US10/549,958 patent/US20060088545A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-18 SK SK1421-2003A patent/SK14212003A3/sk unknown
- 2002-04-18 CA CA002447748A patent/CA2447748A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-18 AP APAP/P/2003/002901A patent/AP2003002901A0/en unknown
- 2002-04-18 EP EP02766632A patent/EP1401447A2/en not_active Ceased
- 2002-04-18 WO PCT/EP2002/004303 patent/WO2002087583A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-04-18 EA EA200301130A patent/EA006678B1/ru not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-11-18 BG BG108368A patent/BG108368A/bg unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002087583B1 (en) | 2003-11-20 |
| EE200300507A (et) | 2004-02-16 |
| HUP0401199A2 (hu) | 2004-12-28 |
| US20060088545A1 (en) | 2006-04-27 |
| BG108368A (bg) | 2005-01-31 |
| ITRM20010210A0 (it) | 2001-04-18 |
| EP1401447A2 (en) | 2004-03-31 |
| EA200301130A1 (ru) | 2004-04-29 |
| CA2447748A1 (en) | 2002-11-07 |
| WO2002087583A3 (en) | 2002-12-19 |
| MXPA03010380A (es) | 2004-03-16 |
| AP2003002901A0 (en) | 2003-12-31 |
| WO2002087583A2 (en) | 2002-11-07 |
| CZ20033113A3 (cs) | 2004-07-14 |
| ITRM20010210A1 (it) | 2002-10-18 |
| SK14212003A3 (sk) | 2004-06-08 |
| CN1700916A (zh) | 2005-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Oikawa et al. | The proteasome is involved in angiogenesis | |
| US6406701B1 (en) | Method and compositions for preventing or reducing HIV infection | |
| Brown et al. | Pathogenesis of ulcers of the alkali-burned cornea | |
| Toschi et al. | Human immunodeficiency virus protease inhibitors reduce the growth of human tumors via a proteasome‐independent block of angiogenesis and matrix metalloproteinases | |
| Yang et al. | Caspase-8–mediated apoptosis in human RPE cells | |
| EA006678B1 (ru) | Применение ингибиторов протеазы вируса иммунодефицита человека (вич) для блокирования миграции клеток и/или инвазии, инфильтрации тканей и отека при лечении связанных с этим заболеваний | |
| Sugioka et al. | Extracellular collagen promotes interleukin-1β–induced urokinase-type plasminogen activator production by human corneal fibroblasts | |
| KR19990044834A (ko) | 네가티브인자작용 억제제 | |
| US6060449A (en) | Neovascularization inhibitor containing tissue factor pathway inhibitor | |
| Stuart et al. | Effect of metalloprotease inhibitors on corneal allograft survival | |
| Kurnick | A rational therapy of systemic lupus erythematosus | |
| Hyndiuk et al. | Newer compounds in therapy of herpes simplex keratitis | |
| Lee et al. | Targeted antivascular therapy with the apolipoprotein (a) kringle V, rhLK8, inhibits the growth and metastasis of human prostate cancer in an orthotopic nude mouse model | |
| EP1150700A1 (en) | Antiangiogenic drugs | |
| Duffie et al. | Tumoricidal activity of alveolar and peritoneal macrophages of C57BL/6 mice bearing metastatic or nonmetastatic variants of Lewis lung carcinoma | |
| Chen et al. | Galloyl cyclic-imide derivative CH1104I inhibits tumor invasion through suppressing matrix metalloproteinase activity | |
| Manning et al. | Indomethacin augments lymphokine-activated killer cell generation by patients with malignant mesothelioma | |
| CN1980690B (zh) | 含有巴曲酶的恶性肿瘤局部浸润抑制剂 | |
| MacNeal et al. | Conjoined action of penicillin and bacteriophages | |
| Puddu et al. | Human immunodeficiency virus (HIV)-infected tumor xenografts as an in vivo model for antiviral therapy: role of alpha/beta interferon in restriction of tumor growth in nude mice injected with HIV-infected U937 tumor cells | |
| Lundgren | Kaposi's sarcoma and its management in AIDS patients: Recommendations from a Scandinavian study group | |
| AU2002338495A1 (en) | Use of HIV-protease inhibitors to block cell migration and/or invasion, tissue infiltration and oedema formation | |
| CN117982626A (zh) | 一种f1/f3多肽在制备诱导肿瘤细胞焦亡药物中的应用 | |
| Samara | Induction of Oxidative Stress in Myofibroblasts and Dormant Tumor Cells upon Treatment with Pro-Resolving Mediators Secreted by CD11b low Macrophages | |
| KR100193983B1 (ko) | 메실산 가벡세이트를 유효성분으로 함유하는 단백분해효소 억제제, 종양침윤 억제제, 종양전이 억제제, 종양성장 억제제 및 혈관신생 억제제 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |