CZ20033113A3 - Farmaceutický prostředek obsahující inhibitory proteázy - Google Patents
Farmaceutický prostředek obsahující inhibitory proteázy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20033113A3 CZ20033113A3 CZ20033113A CZ20033113A CZ20033113A3 CZ 20033113 A3 CZ20033113 A3 CZ 20033113A3 CZ 20033113 A CZ20033113 A CZ 20033113A CZ 20033113 A CZ20033113 A CZ 20033113A CZ 20033113 A3 CZ20033113 A3 CZ 20033113A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- saquinavir
- indinavir
- hiv
- inflammatory
- Prior art date
Links
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 title claims description 13
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 title claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 71
- 230000009545 invasion Effects 0.000 claims abstract description 56
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims abstract description 33
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 14
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 309
- QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N saquinavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN1C[C@H]2CCCC[C@H]2C[C@H]1C(=O)NC(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)C=1N=C2C=CC=CC2=CC=1)C1=CC=CC=C1 QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N 0.000 claims description 257
- 229960001852 saquinavir Drugs 0.000 claims description 253
- CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N indinavir Chemical compound C([C@H](N(CC1)C[C@@H](O)C[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H]2C3=CC=CC=C3C[C@H]2O)C(=O)NC(C)(C)C)N1CC1=CC=CN=C1 CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N 0.000 claims description 246
- 229960001936 indinavir Drugs 0.000 claims description 242
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 149
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 149
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 109
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 57
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 claims description 52
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 50
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 49
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 37
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims description 30
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 30
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 30
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 30
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 30
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 claims description 26
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 claims description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 24
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 21
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 21
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims description 17
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims description 17
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 14
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 claims description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 11
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 claims description 10
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 claims description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 10
- NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N ritonavir Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1SC=NC=1)CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N 0.000 claims description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 7
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 claims description 7
- NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N Ritonavir Natural products C=1C=CC=CC=1CC(NC(=O)OCC=1SC=NC=1)C(O)CC(CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 7
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 7
- 229960000311 ritonavir Drugs 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 6
- 229960001830 amprenavir Drugs 0.000 claims description 6
- YMARZQAQMVYCKC-OEMFJLHTSA-N amprenavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN(CC(C)C)S(=O)(=O)C=1C=CC(N)=CC=1)NC(=O)O[C@@H]1COCC1)C1=CC=CC=C1 YMARZQAQMVYCKC-OEMFJLHTSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- QAGYKUNXZHXKMR-HKWSIXNMSA-N nelfinavir Chemical compound CC1=C(O)C=CC=C1C(=O)N[C@H]([C@H](O)CN1[C@@H](C[C@@H]2CCCC[C@@H]2C1)C(=O)NC(C)(C)C)CSC1=CC=CC=C1 QAGYKUNXZHXKMR-HKWSIXNMSA-N 0.000 claims description 6
- 108091007196 stromelysin Proteins 0.000 claims description 6
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 claims description 5
- 206010004659 Biliary cirrhosis Diseases 0.000 claims description 5
- QAGYKUNXZHXKMR-UHFFFAOYSA-N CPD000469186 Natural products CC1=C(O)C=CC=C1C(=O)NC(C(O)CN1C(CC2CCCCC2C1)C(=O)NC(C)(C)C)CSC1=CC=CC=C1 QAGYKUNXZHXKMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 230000002579 anti-swelling effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 5
- 229960000884 nelfinavir Drugs 0.000 claims description 5
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 claims description 4
- KJHKTHWMRKYKJE-SUGCFTRWSA-N Kaletra Chemical compound N1([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)COC=2C(=CC=CC=2C)C)CC=2C=CC=CC=2)CCCNC1=O KJHKTHWMRKYKJE-SUGCFTRWSA-N 0.000 claims description 4
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 208000002260 Keloid Diseases 0.000 claims description 3
- 206010023330 Keloid scar Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 claims description 3
- 208000004732 Systemic Vasculitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 claims description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000001371 inclusion conjunctivitis Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001117 keloid Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 3
- 229960004525 lopinavir Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010036784 proctocolitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 3
- 206010044325 trachoma Diseases 0.000 claims description 3
- OFFWOVJBSQMVPI-RMLGOCCBSA-N Kaletra Chemical compound N1([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)COC=2C(=CC=CC=2C)C)CC=2C=CC=CC=2)CCCNC1=O.N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1SC=NC=1)CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 OFFWOVJBSQMVPI-RMLGOCCBSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940120922 lopinavir and ritonavir Drugs 0.000 claims description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 claims 6
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 claims 2
- 102000004318 Matrilysin Human genes 0.000 claims 2
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 claims 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 claims 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims 2
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 claims 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 31
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 abstract description 25
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 11
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 abstract description 2
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 abstract 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 abstract 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 239000004030 hiv protease inhibitor Substances 0.000 description 145
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 116
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 68
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 58
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 58
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 44
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 44
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 42
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 39
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 37
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 37
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 33
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 32
- 230000004044 response Effects 0.000 description 31
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 29
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 28
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 26
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 26
- 238000011161 development Methods 0.000 description 26
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 26
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 24
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 24
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 24
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 23
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 22
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 20
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 19
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 19
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 18
- 241001502974 Human gammaherpesvirus 8 Species 0.000 description 17
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 17
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 16
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 16
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 16
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 16
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 15
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 15
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 15
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 14
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 14
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 14
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 14
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 13
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 13
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 13
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 11
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 230000000477 gelanolytic effect Effects 0.000 description 10
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 10
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 10
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 9
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 9
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 9
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 7
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 7
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 7
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 7
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 7
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 7
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 7
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 7
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 6
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 6
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 6
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 108010010369 HIV Protease Proteins 0.000 description 5
- 229940122440 HIV protease inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 5
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 5
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 5
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 description 5
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 5
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 5
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 5
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000007805 zymography Methods 0.000 description 5
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 4
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 4
- 208000010667 Carcinoma of liver and intrahepatic biliary tract Diseases 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000000468 autoproteolytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 4
- 238000009650 gentamicin protection assay Methods 0.000 description 4
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 201000002250 liver carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007808 Cell invasion assay Methods 0.000 description 3
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 3
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 3
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 3
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000003501 anti-edematous effect Effects 0.000 description 3
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 3
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 3
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000002701 cell growth assay Methods 0.000 description 3
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 208000019420 lymphoid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 2
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 206010024305 Leukaemia monocytic Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000007804 gelatin zymography Methods 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002652 macrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000006894 monocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 2-[benzyl-(4-methoxyphenyl)sulfonylamino]-n-hydroxy-4-methylpentanamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1S(=O)(=O)N(C(CC(C)C)C(=O)NO)CC1=CC=CC=C1 VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Br VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 1
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102100020881 Interleukin-1 alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 1
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 1
- 241000283283 Orcinus orca Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710108790 Stromelysin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100028848 Stromelysin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710108792 Stromelysin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100028847 Stromelysin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108050005271 Stromelysin-3 Proteins 0.000 description 1
- 238000010161 Student-Newman-Keuls test Methods 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000011122 anti-angiogenic therapy Methods 0.000 description 1
- 229940124650 anti-cancer therapies Drugs 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011225 antiretroviral therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000011717 athymic nude mouse Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- -1 buffered Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000000963 caseinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229940088900 crixivan Drugs 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000002852 cysteine proteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000652 homosexual effect Effects 0.000 description 1
- 102000043827 human Smooth muscle Human genes 0.000 description 1
- 108700038605 human Smooth muscle Proteins 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000002390 hyperplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000642 iatrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000019171 interleukin-1 alpha production Effects 0.000 description 1
- 230000019189 interleukin-1 beta production Effects 0.000 description 1
- 230000017306 interleukin-6 production Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229940088976 invirase Drugs 0.000 description 1
- 229940112586 kaletra Drugs 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- YECBIJXISLIIDS-UHFFFAOYSA-N mepyramine Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CN(CCN(C)C)C1=CC=CC=N1 YECBIJXISLIIDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000582 mepyramine Drugs 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229940072250 norvir Drugs 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000007801 sublethal irradiation Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000155 toxicity by organ Toxicity 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006711 vascular endothelial growth factor production Effects 0.000 description 1
- 206010055031 vascular neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940023080 viracept Drugs 0.000 description 1
- 230000029302 virus maturation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
- A61K31/341—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide not condensed with another ring, e.g. ranitidine, furosemide, bufetolol, muscarine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/425—Thiazoles
- A61K31/426—1,3-Thiazoles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/472—Non-condensed isoquinolines, e.g. papaverine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/472—Non-condensed isoquinolines, e.g. papaverine
- A61K31/4725—Non-condensed isoquinolines, e.g. papaverine containing further heterocyclic rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká použití inhibitorů proteázy viru lidské imunodeficience (HIV) k inhibování invaze (vpádu) normálních a/nebo nádorových (neoplastických) buněk do tkání a k léčbě onemocnění s tímto jevem spojených, jako jsou Kaposiho sarkom, nádory, angioproliferativní, zánětlivé nebo autoimunitní onemocnění, ať už jsou spojeny s infekcí vyvolanou HIV nebo nikoliv.
Dosavadní stav techniky
Inhibitory proteázy viru HIV jsou sloučeniny se známou aktivitou vůči retrovirům, které byly popsány například Deeksem a spoluautory (S.
G. Deeks se spoluautory, JAMA 2, 145, 1997). Jsou používané při léčbě infekce vyvolané HIV u subjektů, postižených synromem získané imunodeficience (AIDS) a jejich funkcí je inhibice zrání viru a blokování, pozastavení jeho replikace (viz Deeks se spoluautory, 1997). V tomto popisu vynálezu budou inhibitory proteázy viru HIV dále rovněž označovány jako HIV-PI.
Kaposiho sarkom, KS, je nádorem spojeným s infekcí lidským herpetickým virem 8 (HHV8) a je zvláště četný u subjektů, infikovaných virem HIV (AIDS-KS) (B. Ensoli a M. Stůrzl, Cytokine Growth Factor Rev. 9, 63, 1998). Kaposiho sarkom je pozorován také u subjektů neinfikovaných HIV, zvláště pak ve středomořské oblasti a v Itálii (klasický KS), v Africe (endemický KS) a u jedinců po transplantaci orgánů, kteří se podrobili imunosupresivní léčbě (iatrogenní KS) (Ensoli a Stůrzl, 1998). Nezbytnou podmínou pro rozvoj KS u subjektů infikovaných HHV8 se zdá být deregulace imunitního systému (Ensoli a Stůrzl, 1998).
Různí autoři popsali snížený výskyt KS a lymfomů (International Collaboration on HIV and Cancer, 2000) nebo regresí (C. Lebbé se spoluautory, AIDS 12, 45, 1998; A. M. Cattelan se spoluautory, Eur. J. Cancer 35, 1809, 1999) KS u pacientů infikovaných HIV a léčených kombinací anti-retrovirových léčiv, obsahujících alespoň jeden inhibitor proteázy viru HIV (HlV-Pi) (Deeks se spoluautory, 1997). Kaposiho sarkom je cévním nádorem, charakterizovaný angiogenezí cévních buněk a infiltrací buněk zánětu; je zvláště četný a agresivní u homosexuálních a bisexuálních můžů, kteří jsou současně infikování HIV a HHV8 (Ensoli a Sturzl, 1998).
Tvorba leží je zprostředkována cytokiny a chemokiny s angiogenními, proliferativními, chemotaktickými a zánětlivými účinky a s účinky, zahrnujícími vznik otoků. Tyto cytokiny jsou vytvářeny buňkami KS, aktivovanými endotheliálními buňkami a imunitními buňkami, infiltrujícími tkáně (B. Ensoli se spoluautory, Science 243, 223, 1989; B. Ensoli se spoluautory, Nátuře 371, 647, 1994a; B. Ensoli se spoluautory, J. Clin. Invest. 94, 1736, 1994b; V. Fiorelli se spoluautory, J. Clin. Invest. 95, 1723, 1995; F. Samaniego se spoluautory, J. Immunol. 158, 1887, 1997; F. Samaniego se spoluautory, Am. J. Pathol.
152, 1433, 1998 a G. Barillari se spoluautory, J. Immunol. 162, 1165, 1999a).
Z angiogenních faktorů je u leží Kaposiho sarkomu ve vysokých hladinách exprimován bazický růstový faktor fibroblastů (basic fibroblast growth factor, bFGF) a je i nejdůležitějším autokrinním a parakrinním faktorem růstu KS a angiogeneze ( Ensoli se spoluautory, 1989; Ensoli se spoluautory, 1994a; Ensoli se spoluautory, 1994b; Fiorelli se spoluautory, 1995; F. Samaniego se spoluautory, 1997; Samaniego se spoluautory, 1998 a Barillari se spoluautory, 1999a). Ve skutečnosti protilátky nebo negativní (anti kóduj ící) oligomery, zaměřené vůči bFGF, blokují jak angiogenezí, tak rozvoj leží podobných KS, indukovaných • ·
- 3 inokulací, zaočkováním primárních buněk KS athymickým nahým myším a růst buněk KS in vitro ( Ensoli se spoluautory, 1989; Ensoli se spoluautory 1994b; G. Barillari se spoluautory, Blood 94, 663, 1999b). Naopak inokulace bFGF athymickým myším napomáhá rozvoji angioproliferativních leží, podobných KS (Ensoli se spoluautory, 1994a; Samaniego se spoluautory, 1998 a Barillari se spoluautory, 1999a), jejichž četnost a agresivita jsou zvýšeny proteinem Tat viru HIV-1, který je schopný napodobit účinek proteinů extracelulárního matrixu. Protein Tat k působení na KS konkrétně vyžaduje přítomnost bFGF nebo zánětových cytokinů, které naopak v endoteliálních (výstelkových) buňkách a buňkách KS indukují produkci bFGF a expresi integrinů, které působí jako receptory Tat (B. Ensoli se spoluautory, Nátuře 345, 84, 1990; G. Barillari se spoluautory, J. Immunol. 149, 3727, 1992; G. Barillari se spoluautory, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90. 7941, 1993; Ensoli se spoluautory, 1994a; A. Albíni se spoluautory, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 4838, 1995; Fiorelli se spoluautory 1995, V. Fiorelli se spoluautory, Blood 91, 956, 1998; V. Fiorelli se spoluautory, J. Immunol. 162, 1165, 1999; Barillari se spoluautory, 1999a a Barillari se spoluautory, 1999b).
Jiným induktorem růstu, angiogeneze a cévní propustnosti, permeability, přítomným v KS, je růstový faktor cévního endotelu, tedy cévní buněčné výstelky (vascular endothelial growth factor, VEGF), který spolupracuje s bFGF při angiogenezi a edemech KS (Samaniego se spoluautory, 1998).
Jinými faktory přítomnými v KS, které spolupracují při jeho vytváření, jsou interleukin (IL) 1, faktor nekrózy tumoru alfa (tumor necrosis factor, TNFa), interferon gama (IFNy), faktor stimulující kolonie granulocytů-monocytů (granulocyte-monocyte colony stimulating factor, GM-CSF), růstový faktor získaný z destiček (platelet-derived growth
- 4 • · · · · · factor, PDGF), onkostatin-M a chemokiny (RANTES, ΜΙΡΊα, ΜΙΡΊβ a další) (Ensoli a Sturzl, 1998). Zvláště cytokiny zánětu, jako IL-1, IL-6, TNFa a IFNy, indukují v buňkách KS a v endoteliálních buňkách produkci bFGF a VEGF, indukují endoteliální buňky k získání fenotypu buněk KS, k tomu, aby se staly angiogenními in vivo a indukují leze KS u myší (F. Samaniego se spoluautory, J. Immunol. 154, 3582, 1995; Fiorelli se spoluautory 1995; Fiorelli se spoluautory 1998; Barillari se spoluautory, 1999a). Kromě podpory růstu KS je bFGF, stejně jako VEGF, schopný aktivovat veškeré procesy, které jsou vyžadovány pro angiogenezi.
Angiogeneze je naopak základem pro růst a metastázování nádorů a pro angioproliferativní neoplastické, nádorové choroby; často je také důležitou složkou chronického zánětlivého onemocnění (P. Carmeliet a R. K. Jain, Nátuře 14, 249, 2000. Kromě toho chemokiny vytvářené aktivovanými endoteliálními buňkami, buňkami KS a buňkami zánětu infiItrujícími tkáně, jako RANTES, ΜΙΡΊα, ΜΙΡΊβ, IL-8, MCP-1 a dalšími, mají nepřímé angiogenní účinky a působí jako chemoatraktanty pro buňky zánětu, čímž indukují další nábor a infiltraci imunokompetentních buněk a buněk zánětu (infikovaných či neinfikovaných HHV8) v tkáních a lezích (Ensoli a Sturzl, 1998).
V této spojitosti jak angiogeneze, tak infiltrace tkání buňkami zánětu i edém vyžadují degradaci, rozklad bazální cévní membrány a/nebo extracelulámího matrixu specifickými proteázami, umožňujícími přímou migraci buněk v perivaskulárním prostoru (invazi a migraci endoteliálních nebo imunokompetentních buněk/buněk zánětu), nebo podporu, favorizování odtoku tekutin z krevního řečiště (Carmeliet a Jain, 2000). Nadto angiogeneze vyžaduje i třetí krok, sestávající z proliferace endoteliálních buněk.
• · · • ·
Degradace (rozklad) bazální cévní membrány a intersticiální, vmezeřené tkáně je zprostředkována zejména metaloproteázami matrixu, MMP. Samotné metaloproteázy matrixu jsou nezbytné pro růst nádoru a tvorbu metastází, pro infiltraci tkání buňkami zánětu a pro tvorbu otoku (edému) (W. G. Stetler-Stevenson, J. Clin. Invest. 103, 1237, 1999). Zvláště infiltrace tkání buňkami zánětu má důležitou roli v rakovinném bujení, při zánětu a při autoimunitních onemocněních, neboť tyto buňky vytvářejí faktory, zahrnující angiogenní faktory a cytokiny zánětu, s parakrinním působením na sousední buňky. Ze skupiny MMP je pro angiogenezi zásadním MMP-2, který je indukován bFGF a silně exprimován v primárních lezích KS a v tvorbě dalších novotvarů (Ensoli se spoluautory, 1994a; Barillari se spoluautory, 1999b; Stetler-Stevenson 1999), zatímco MMP-9 je nejdůležitějším MMP, zprostředkujícím infiltraci monocytů a lymfocytů do tkání. Inhibice migrace, invaze nebo proliferace endoteliálních buněk, nebo aktivity MMP-2 a MMP-9 či jiných MMP, je schopna blokovat angiogenezi a poskytnout logický výklad současně používaných proti-angiogenních a protinádorových léčeb (Stetler-Stevenson, 1999; E. Koivunen se spoluautory, Nat. Biotechnol. 17, 768, 1999; Carmeliet a Jain, 2000. Kromě toho místní a systémová koncentrace MMP a/nebo aktivita MMP vykazuje významné změny při různých patologických stavech včetně infekcí, roztroušené sklerózy, zánětlivých onemocnění, imunitních onemocnění a rakoviny (N. Fujimoto se spoluautory, Clin. Chim. Acta 221, 91, 1993; D. Leppert se spoluautory, Brain 121, 2327, 1998; D. Leppert se spoluautory, Clin. Infect. Dis. 31, 80, 2000) a může tedy být cílovým místem pro diagnózu, prognózu a léčbu takových onemocnění.
Nižší výskyt i regrese KS, pozorované u jedinců, infikovaných HIV a léčených prostřednictvím HIV-PI (Lebbé se spoluautory, 1998; Cattelan se spoluautory, 1999; International Collaboration on HIV and Cancer, 2000), byly vztaženy ke schopnosti tohoto léčiva inhibovat replikaci HIV a následně tedy i produkci a uvolňování proteinu Tat viru • · · · • · · · • · · ·· ·
• ·
- 6 ·· ···· ·· ···«
HIV-1, účinnho faktoru vývoje KS (Ensoli se spoluautory 1990; Ensoli se spoluautory 1994a; Barillari se spoluautory 1999a, Barillari se spoluautory 1999b). Kromě přebudování, obnovení množství a funkce specifických cytotoxických lymfocytů T a aktivity přirozených zabíječú (buněk NK) zvyšuje léčba prostřednictvím HIV-PI ochrannou imunitní odpověď vůči HHV8, viru, považovanému za příčinu KS (Ensoli a Sturzl, 1998). Subjekty léčené HIV-PI skutečně vykazují snížení jak HIV (Deeks se spoluautory, 1997), tak i HHV8 a obnovení imunologických odpovědí vůči HHV8 (L. Blum se spoluautory, AIDS 11, 1653, 1997; D. A. Rizzieri se spoluautory, Lancet 349, 75, 1997; Lebbé se spoluautory, 1998; M. Osman se spoluautory, J. Virol. 73, 6136, 1999; M. C. Sirianni se spoluautory, 2nd International workshop on KSHV/HHV8 and reiated agents; St. Catherine's College, Oxford, Velké Británie, 10.-13. 9. 1999;
M. C. Sirianni se spoluautory, 3nd International workshop on Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and realted agents, Amherst, MA, USA.
6.-10.6. 2000; Q. J. Wang se spoluautory, J. Infect. Dis. 182, 928, 2000).
V této souvislosti nedávné údaje ukazují, že HIV-PI moduluje funkci dendritických buněk a prezentaci, předkládání antigenu (P. André se spoluautory, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95, 13120, 1998, A. Gruber se spoluautory, J. Biol. Chem. 276, 47840, 2001) za snižování aktivace buněk T a produkce cytokinů zánětu rovněž v nepřítomnosti HIV (P. A. Tovo, AIDS 14. 743, 2000; E. Ledru se spoluautory, Blood 95, 3191, 2000). Dále bylo prokázáno, že jeden z HIV-PI, jmenovitě ritonavir, vykazuje závážné účinky na aktivitu proteozomů, jejichž důsledkem je pozměněné zpracování a předkládání antigenního epitopu hlavním histokompatibilním komplexem (MMC, main histocompatibility complex) třídy I (André se spoluautory, 1998; patent, přihláška č. WO99/63998). Tyto údaje ukazují, že HIV-PI může mít imunomodulační vlastnosti (André se spoluautory, 1998; Tovo, 2000; patentová přihláška č. WO99/63998, patentová přihláška č. WOOO/33654). Kromě toho tyto • ·
- 7 • · ♦· ·· ·· · údaje ukazují, že HIV-PI může také ovlivnit angiogenezi, neboť je známo, že proteozomy se účastní angiogeneze (T. Oikawa se spoluautory, Biochem. Biophys. Res. Commun. 246, 243, 1998). Kromě toho nedávné údaje ukazují, že HIV-PI má modulační účinky vzhledem k několika buněčným jevům, včetně aktivace buněk, jejich přežití a proliferace (patentová přihláška č. WO99/63998 a patentová přihláška č. WOOO/33654). Na základě těchto údajů navrženo, že proteázové inhibitory, zahrnující HIV-PI, inhibitory proteozomů, inhibitory mikrobiálních i virových proteáz a inhibitory cysteinproteázy nebo serinproteázy, mohou být použity k modulaci buněčných odpovědí a metabolismu pro léčbu mnoha lidských chorob působením na odpovědi těchto buněk.,
Naproti tomu původci tohoto vynálezu předpokládají, že HIV-PI by mohl mít přímé a specifické účinky na invazi buněk a na cévní propustnost v důsledku působení na enzymy nebo molekuly, účastnící se těchto procesů, zejména na molekuly, které nejsou ve vztahu k buněčnéým proteozomům, jako na (ne však výlučně) molekuly MMP. Proto mohou být nižší výskyt a méně četné regrese KS, pozorované u jedinců léčených HIV-PI, vyvolány inhibici invaze endoleliálních buněk a buněk KS, infiltrace tkání imunokompetentními buňkami a/nebo buňkami zánětu a tvorby edému (otoku) prostřednictvím HIV-PI. Mělo by být zdůrazněno, že tyto účinky HIV-PI není možné předvídat na základě existujících studií. Ve skutečnosti se veškeré tyto studie shodují v tom, že nižší výskyt KS nebo regrese KS u subjektů léčených HIV-PI přisuzují inhibici infekce vyvolané HIV, s následným snížením exprese proteinu Tat, obnovení imunitního systému a z toho vyplývajícímu vymizení HHV8 z krve nebo leží, anebo imunomodulačním účinkům HIV-PI (Blum se spoluautory, 1997; Rizzieri se spoluautory, 1997; Lebbé se spoluautory, 1998; A. De Milito se spoluautory, J. Med. Virol. 57, 140, 1999; Cattelan se spoluautory, 1999; Osman se spoluautory, 1999; Sirianni se ·· 94 • · * · « • · · ·
- 8 • 99 ·
9·9· spoluautory, 1999; Sirianni se spoluautory, 2000; Wang se spoluautory, 2000; patentová přihláška č. WO99/63998 a patentová přihláška č. WOOO/33654). Oproti tomu účinky HIV-PI, které jsou předpokládány původci tohoto vynálezu, nebyly ještě nikdy popsány nebo studovány.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je použití inhibitorů proteázy viru HIV (HIV-PI) k blokování migrace a/nebo invaze normálních buněk, buněk neoplastických (nádorových novotvarů), buněk zánětu nebo imunokompetentních buněk, infiltrace tkáně, a/nebo tvorby edému prostřednictvím inhibice nebo modulace molekul a proteolytických enzymů, jako jsou, ne však výlučně, mataloproteázy matrixu (MMP), pro léčbu všech onemocnění, jejichž patogeneze se vztahuje k výše uvedeným procesům, včetně nádorů, nikoli-neoplastických angiopropliferativních onemocnění, zánětlivých onemocnění nebo autoimunitních onemocnění.
Jiným předmětem předkládaného vynálezu je způsob blokování migrace a/nebo invaze normálních buněk, buněk novotvarů (neoplastických buněk), buněk zánětu nebo imunokompetentních buněk, infiltrace tkáně, a/nebo tvorby edému prostřednictvím inhibice nebo modulace molekul a proteolytických enzymů, jako jsou, ne však výlučně, mataloproteázy matrixu (MMP), kterého se dosáhne použitím inhibitorů proteázy viru HIV (HIV-PI).
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použití inhibitorů proteázy viru HIV (HIV-PI) k výrobě léčiv, obdařených schopností blokovat buněčnou migraci a/nebo invazi a tkáňovou infiltraci prostřednictvím inhibice molekul a proteolytických enzymů, jako jsou, ne však výlučně, mataloproteázy matrixu (MMP), k vyvolání protiangiogenního působení pro léčbu nádorů a nikoli-neoplastických angioproliferativních onemocnění u subjektů, infikovaných či neinfikovaných virem HIV.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použití inhibitorů proteázy viru HIV (HIV-PI) k výrobě léčiv působících proti tvorbě otoků (edemů) a schopných blokovat infiltraci tkání buňkami zánětu a imunokompetentními buňkami pro léčbu zánětlivých a autoimunitních onemocnění u subjektů, infikovaných či neinfikovaných virem HIV.
Jiným předmětem předkládaného vynálezu je použití inhibitorů proteázy viru HIV (HIV-PI) k výrobě léčiv pro léčbu Kaposiho sarkomu u subjektů, infikovaných či neinfikovaných virem HIV.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použití inhibitorů proteázy viru HIV (HIV-PI) k výrobě léčiv, obdařených schopností blokovat buněčnou migraci a/nebo invazi a tkáňovou infiltraci prostřednictvím inhibice molekul a proteolytických enzymů, jako jsou, ne však výlučně, mataloproteázy matrixu (MMP), k vyvolání protiangiogenního, protinádorového, protizánětlivého působení a/nebo působení proti tvorbě otoků pro léčbu Kaposiho sarkomu, nádorů a nikoli-neoplastických angioproliferativních onemocnění u subjektů, infikovaných virem HIV.
Jiným předmětem předkládaného vynálezu je použití sloučenin, známých jako: Crixivan® (indinavir), jež je prodáván firmou Merck, Sharp a Dohme; Invirase® nebo Fortovase® (saquinavir), jež je prodáván firmou Roche; Norvir® (ritonavir), jež je prodáván firmou Abbott Laboratories; Viracept® (nelfinavir), jež je prodáván firmou Roche; Agenerase® (amprenavir), jež je prodáván firmou Glaxo Wellcome; Kaletra® (lopinavir a ritonavir), jenž jsou prodávány firmou Abbott Laboratories, k výše uvedeným účelům.
- 10 «· ·· ·· «· * · · · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ···· ♦· «··· • © © • · · · • · · · · • · © ·· β
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použití inhibitorů proteázy viru HIV (HIV-PI) a sloučenin uvedených výše pro dříve zmíněné indikace ve vzájemné kombinaci a/nebo ve spojení s protizánětlivými, protiangiogenními nebo protinádorovými léčivy.
Jiným předmětem předkládaného vynálezu je použití takových chemických analogů nebo derivátů inhibitorů proteázy HIV ( HIV-PI) uvedených výše, které mají schopností blokovat migraci a/nebo invazi normálních buněk, buněk novotvarů (neoplastických buněk), buněk zánětu nebo imunokompetentních buněk a infiltraci tkáně prostřednictvím inhibice molekul a proteolytických enzymů, jako jsou, ne však výlučně, mataloproteázy matrixu (MMP), a tedy obdařených protiangiogenní, protinádorovou, protizánětlivou aktivitou a aktivitou působící proti tvorbě otoků, samotných či ve vzájemné kombinaci, a/nebo ve spojení s protizánětlivými, protiangiogenními nebo protinádorovými léčivy.
Další předměty tohoto vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 (části A a B); Indinavir a saquinavir nemají žádný účinek na základní (bazální) nebo prostřednictvím bFGF indukovanou proliferaci makrocévních endoteliálních buněk (z pupečníkové žíly). Část A: účinek indinaviru na základní (bazální) nebo prostřednictvím bFGF indukovanou proliferaci; část B: účinek saquinaviru na základní (bazální) nebo prostřednictvím bFGF indukovanou proliferaci.
Obr. 2 (části A a B): Indinavir a saquinavir inhibují migraci makrocévních endoteliálních buněk (z pupečníkové žíly) v odpovědi na
- 11 bFGF. Část A: účinek indinaviru na buněčnou migraci; část B: účinek saquinaviru na buněčnou migraci.
Obr. 3 (části A a B): Indinavir a saquinavir inhibují invazi makrocévních endoteliálních buněk (z pupečníkové žíly) v odpovědi na bFGF. Část A: účinek indinaviru na buněčnou invazi; část B: účinek saquinaviru na buněčnou invazi.
Obr. 4: Indinavir a saquinavir neinterferují (vzájemně se neovlivňují) s proliferaci mikrocévních (kožních) endotheliálních buněk v odpovědi na bFGF.
Obr. 5: Indinavir a saquinavir inhibují invazi mikrocévních (kožních) endotheliálních buněk v odpovědi na bFGF.
Obr. 6: Indinavir a saquinavir neinterferují (vzájemně se neovlivňují) s proliferaci buněk hladkého svalstva v odpovědi na bFGF.
Obr. 7: Indinavir a saquinavir inhibují invazi buněk hladkého svalstva v odpovědi na bFGF.
Obr. 8 (části A , B a C): Indinavir blokuje aktivaci MMP-2. Část A: želatinolytická aktivita odpovídající latentní MMP-2 (72 000), předaktivované MMP-2 (64 000) nebo aktivní MMP-2 (62 000) v supernatantech entotheliálních buněk, ovlivněných či neovlivněných bFGF v přítomnosti a v nepřítomosti indinaviru; část B: densitometrická kvantifikace latentní MMP-2; část C: densitometrická kvantifikace formy předaktivované MMP-2 a aktivní MMP-2.
Obr. 9 (části A , B a C): Saquinavir blokuje aktivaci MMP-2. Část A: želatinolytická aktivita odpovídající latentní MMP-2 (72 000), předaktivované MMP-2 (64 000) nebo aktivní MMP-2 (62 000) v ·· 44
4 4 4 • 4 4
4 4
4 4 •4 4444 · 4 · ·· 4
4
4 4
44 4
4 4
4 • 4 • 4
- 12 4 supernatantech entotheliálních buněk, ovlivněných či neovlivněných bFGF v přítomnosti a v nepřítomosti saquiraviru; část B: densitometrická kvantifikace latentní MMP-2; část C: densitometrická kvantifikace formy předaktivované MMP-2 a aktivní MMP-2.
Obr. 10: Indinavir a saquinavir blokují autoproteolytickou konverzi předaktivní MMP-2 na její aktivní formu.
Obr. 11 (Části A a B): Saquinavir blokuje v endotheliálních buňkách produkci MMP, specifické vůči kaseinu. A: kaseinová zymografie supernatantů endotheliálních buněk, ovlivňovaných bFGF nebo TPA (12-O-tetradekanoylforbol-13-acetát) v přítomnosti či v nepřítomnosti saquinaviru po 8 hodin; B: kaseinová zymografie supernatantů endotheliálních buněk, ovlivňovaných bFGF nebo TPA v přítomnosti či v nepřítomnosti saquinaviru po 24 hodin.
Obr. 12 (část 1a-d a 2a-h): Indinavir a sanquinavir inhibují tvorbu angioproliferativních leží, indukovanou bFGF u athymických myší. Část 1a: místa injikace reprezentativní myši, ovlivněné (léčené) fyziologickým roztokem a očkované samotným matrigelem; část 1b: místa injikace reprezentativní myši, ovlivněné (léčené) fyziologickým roztokem a očkované bFGF v matrigelu; část 1c: místa injikace reprezentativní myši, ovlivněné (léčené) indinavirem a očkované bFGF v matrigelu; část 1d: místa injikace reprezentativní myši, ovlivněné (léčené) saquinavirem a očkované bFGF v matrigelu. Části 2a a 2b: Mikroskopický vzhled injikačních míst u reprezentativní myši, ovlivněné (léčené) fyziologickým roztokem a očkované samotným matrigelem (část a: 100násobné zvětšení, část b: 100násobné zvětšení); části 2c a 2d: Mikroskopický vzhled injikačních míst u reprezentativní myši, ovlivněné (léčené) fyziologickým roztokem a očkované bFGF v matrigelu (část c: 100násobné zvětšení, část d: 100násobné zvětšení); části 2e a 2f: Mikroskopický vzhled injikačních míst u reprezentativní myši, ovlivněné
99
9 9 9
9 9
9 9
9 9
9999 • 9
- 13 9 9
9 9
9999
9
9 9 9 9
99 9
9 9 (léčené) indinavirem a očkované bFGF v matrigelu (část e: lOOnásobné zvětšení, část f: lOOnásobné zvětšení); části 2g a 2h: Mikroskopický vzhled injikačních míst u reprezentativní myši, ovlivněné (léčené) saquinavirem a očkované bFGF v matrigelu (část g: lOOnásobné zvětšení, část h: lOOnásobné zvětšení).
Obr. 13 (části A a B): Indinavir a saquinavir inhibují invazivní kapacitu buněk KS. Část A: účinek indinaviru na invazi buněk; část B: účinek saquinaviru na invazi buněk.
Obr. 14: Indinavir a saquinavir neinterferují (vzájemně se neovlivňují) s proliferací hybridních buněk Ea-hy 926, vzniklých z endoteliálních buněk a buněk plicního karcinomu.
Obr. 15: Indinavir a saquinavir inhibují invazivní kapacitu hybridních buněk Ea-hy 926, vzniklých z endoteliálních buněk a buněk plicního karcinomu.
Obr. 16: Indinavir a saquinavir neinterferují (vzájemně se neovlivňují) s proliferací buněk jaterního karcinomu (buněk SK-Hep-1).
Obr. 17: Indinavir a saquinavir inhibují invazivní kapacitu buněk jaterního karcinomu (buněk SK-Hep-1).
Obr. 18: Indinavir a saquinavir neinterferují (vzájemně se neovlivňují) s proliferací buněk plicního karcinomu (buněk A549).
Obr. 19: Indinavir a saquinavir inhibují invazivní kapacitu buněk plicního karcinomu (buněk A549).
Obr. 20: Indinavir a saquinavir neinterferují (vzájemně se neovlivňují) s proliferací buněk karcinomu prsu (buněk MDA-MB-468).
*· 4
0 4
0 0 0
0 04 0 •00 • 0 0
0 *
4
0 0 0
- 14 • 0 00 • 0 0 0
0 0
0 0 0 0 0
0000
Obr. 21: Indinavir a saquinavir inhibují invazivní kapacitu buněk karcinomu prsu (buněk MDA-MB-468).
Obr. 22: Indinavir a saquinavir inhibují invazivní kapacitu buněk myelo-monocytické leukemie (buněk U937).
Obr. 23 (části a-f): Indinavir a saquinavir inhibují vývoj leží podobných KS, indukovaných naočkováním buněk KS athymické myši. Části a a b: mikroskopický vzhled místa injíkace buněk KS u reprezentativní myši, ovlivněné (léčené) fyziologickým roztokem (část a: KDOnásobné zvětšení; část b: 400násobné zvětšení); části c a d: mikroskopický vzhled místa injíkace buněk KS u reprezentativní myši, ovlivněné (léčené) indinavirem (část c: 250násobné zvětšení; část d: 400násobné zvětšení); části e a f: mikroskopický vzhled místa injíkace buněk KS u reprezentativní myši, ovlivněné (léčené) saquinavirem (část e: 250násobné zvětšení; část f: 400násobné zvětšení).
Obr. 24: Indinavir a saquinavir napomáhají regresi leží podobných KS, indukovaných naočkováním buněk KS athymickým myším.
Obr. 25: Indinavir a saquinavir napomáhají regresi nádorových angiogenních leží, indukovaných naočkováním hybridních buněk Ea-hy 926, vzniklých z endoteliálních buněk a buněk plicního karcinomu, athymickým myším.
Obr. 26: Indinavir a saquinavir inhibují vývoj nádorových leží, indukovaných naočkováním buněk jaterního karcinomu (buněk SK-Hep-1) athymickým myším.
99 • 9 9 ·
9 9
9 9 •99 • 9 9999 • 9
9
9 9
9 9 9 9 •99
9
- 15 9999
Obr. 27: Indinavir a saquinavir inhibují vývoj leží podobných KS, indukovaných naočkováním buněk plicního karcinomu (buněk A549) athymickým myším.
Obr. 28: Indinavir a saquinavir inhibují vývoj nádorových leží, indukovaných naočkováním buněk karcinomu prsa (buněk MDA-MB-468) athymickým myším.
Obr. 29: Indinavir a saquinavir inhibují vývoj nádorových leží, indukovaných naočkováním myeio-monocytické leukemie (buněk U937) athymickým myším.
Obr. 30: Indinavir a saquinavir inhibují vývoj nádorových leží, indukovaných naočkováním leukemie buněk T (buněk Jurkat) athymickým myším.
Obr. 31: Indinavir a saquinavir blokují cévní propusnost a vznik edému, vyvolané naočkováním buněk KS athymickým myším.
Obr. 32 (části A a B): Indinavir a saquinavir blokují vytváření (produkci) cytokinů zánětu, jako IL-6, buňkami KS. Část A: účinek indinaviru na produkci cytokinů; část B: účinek saquinaviru na produkci cytokinů.
Podrobný popis vynálezu
Před tím, než bude vysvětlena podstata vynálezu, budou poskytnuty následující definice:
Invaze buněk (buněčná invaze): proces, při kterém buňky migrují uvnitř tkáně nebo základní membrány v důsledku degradace, rozrušení φ φ φφφ
ΦΦΦΦΦ
- 16 φ φ φφ φφ φφ • · φ φ • φ φ φφφ φφφ •Φ φφφφ • φ φ φφ φ extracelulámího matrixu nebo základních membrán proteolytickými enzymy.
Infiltrace tkáně: soustředění buněk ve tkáni v průběhu jejich migrace ze vzdálených míst vlivem buněčné invaze.
Edém (otok): propouštění (unikání) tekutin z krve nebo lymfatických měchýřků v důsledku aktivity infiltrujících se nebo usídlených buněk, které uvolňují faktory, pozměňující propustnost kapilární výstelky (endotelu) a strukturu základní membrány v důsledku působení proteáz, včetně metaloproteáz matrixu.
Extracelulární (vnébunéčný) matrix: materiál vytvářený buňkami a vyplňující prostory mezi buňkami a přítomný v různých množstvích ve všech tkáních.
Základní (bazální’) membrána: Bíkovinná struktura, vytvořená buňkami umístěnými pod normálním epitelem nebo endotelem a oddělující je od podložních vrstev.
Metaloproteázy matrixu (matrixové metaloproteázy): endopeptidázy, které mohou štěpit prakticky jakoukoliv složku extracelulámího matrixu a které jsou rozděleny na kolagenázy, želatinázy, sromelysiny a matrilysiny.
Nedávné práce popsaly snížený výskyt regresí KS u pacientů infikovaných HIV-1, léčených vysoce aktivní protiretrovirovou léčbou (HAART, highly active antiretroviral therapy), která zahrnuje alespoň jeden inhibitor proteáz HIV, jako indinavir nebo saquinavir (Lebbé se spoluautory, 1998; Cattelan se spoluautory, 1999; International Collaboration on HIV and Cancer, 2000, J. Nati. Cancer Inst. 92, 1823, 2000). Tyto účinky byly přičteny blokování, prostřednictvím HIV-PI, ·· φφ
φφ « φ φ φφφ φ φφφφ • φ φφ φ • φ
- 17 replikace viru HIV, blokování replikace viru HHV8 a/nebo obnovení účinných imunitních odpovědí vůči HHV8 a HIV (Blum se spoluautory, 1997; Rizzieri se spoluautory, 1997; Lebbé se spoluautory, 1998; De Millito se spoluautory, 1999; Cattelan se spoluautory, 1999; Osman se spoluautory, 1999; Siriani se spoluautory, 1999; Siriani se spoluautory, 2000; Wang se spoluautory, 2000). Oproti tomu poslední a nedávné studie autorů předkládaného vynálezu ukazují, že cytokiny, růstové a angiogenní faktory (zvláště bFGF), produkované buňkami KS, endotheliálními buňkami a buňkami imunitního systému, zprostředkovávají tvorbu leží KS a také to, že invaze endotheliálních buněk a buněk KS, infiltrace tkání těmito buňkami, imunokompetentními buňkami a buňkami zánětu, vytváření otoku a aktivace nebo zvýšená tvorba MMP jsou klíčem pro vývoj a růst leží KS (Ensoli se spoluautory, 1989, Ensoli se spoluautory, 1994a; Fiorelli se spoluautory, 1995, Samaniego se spoluautory, 1995; Samaniego se spoluautory, 1997; Ensoli a Stůrzl, 1998; Fiorelli se spoluautory, 1998; Samaniego se spoluautory, 1998; Barillari se spoluautory, 1999a; Barillari se spoluautory; 1999b, Fiorelli se spoluautory, 1999). Tedy na rozdíl od názoru obecně přijímaného vědeckým světem původci tohoto vynálezu předpokládají, že regrese KS u subjektů s AIDS-KS, léčených prostřednictvím HIV-PI, byla vyvolána přímou aktivitou HIV-PI na buněčnou invazi, tkáňovou infiltraci a edém (otok) prostřednictvím účinků na molekuly a enzymy, které se účastní těchto procesů a odlišují se od buněčného proteozomu. Za použití modelu in vitro původci tohoto vynálezu prokázali, že indinavir a saquinavir, používané ve stejných koncentracích, jaké jsou přítomné v plazmě léčených pacientů, blokují buněčnou migraci a invazi primárních makrocévních nebo mikrocévních endotheliálních buněk a lymfoidních buněk nebo buněk pevného nádoru, bez účinku na růst těchto buněk. Původci tohoto vynálezu dále ukázali, že tyto HIV-PI inhibují aktivaci enzymu nazývaného MMP-2, nebo zvyšují tvorbu MMP degradujícího kasein. Enzymy třídy metaloproteáz (MMP) jsou nezbytné pro motilitu buněk (migraci a invazi) nebo pro cévní
- 18 »· 0 · • · 0 ·
0 · • 0 0 • ta ·· 0000 ·· · • 0 0 • · · · • · 0 0000 • · ·
Μ 0 propustnost a tedy i pro angiogenezi, edém a růst i invazi nádorů (Carmelied a Jain, 2000).
Ve shodě s těmito údaji původci tohoto vynálezu prokázali, že indinavir a saquinavir blokují vývoj angioproliferativních leží podobných KS, indukovaných naočkováním bFGF, kombinace bFGF a VEGF nebo primárních lidských buněk KS athymickým myším, a angiogenezi indukovanou prostřednictvím bFGF nebo VEGF v kuřecí chorioallantoidní membráně (CAM). Dále prokázali, že indinavir nebo saquinavir blokují růst nádorů, indukovaných u athymických myší naočkováním lidských lymfoidních buněk a lidských buněk pevného nádoru. Konečně také prokázali, že HIV-PI blokuje cévní propustnost a edém podněcovaný buňkami KS u athymických myší. Kromě toho inhibují tvorbu cytokinů buňkami KS. Tyto cytokiny nejen podněcují leze KS, ale mají také zánětlivou aktivitu (Ensoli se spoluautory, 1989; Barillari se spoluautory, 1992; Samaniego se spoluautory, 1995; Fiorelli se spoluautory, 1995; Samaniego se spoluautory, 1997; Sirianni se spoluautory, 1998; Samaniego se spoluautory, 1998; Fiorelli se spoluautory, 1998; Fiorelli se spoluautory, 1999; Barillari se spoluautory, 1999a) a některé z nich rovněž podněcují multicentrickou Castelmanovu chorobu (MCD, multicentric Castelman disease) a lymfomy (G. Tosato se spoluautory, J. Clin. Invest. 91, 2806, 1998; B. A. Peterson a G. Frizzera, Semin. Oncol. 20, 636, 1993; A. J. Ramsay se spoluautory, Science 264, 561, 1994; H. Asou se spoluautory, Blood 91, 2475, 1998).
Tyto údaje tedy ukazují, že účinek HIV-PI na KS a lymfomy je způsoben přímým blokováním MMP, migrace a invaze endotheliálních a nádorových buněk, s inhibičními účinky na angiogenezi a edém, což určuje inhibici tvorby leží a nižší výskyt nádorů, které byly pozorovány u myšího modelu a/nebo u subjektů léčených HIV-PI. Tyto účinky HIV-PI ovšem nejsou vyvolány inhibici proliferace normálních nebo >« ·0 • · 0 ♦ 0 0
0
0 0
0000 •00 00 0 • 0
- 19 00
0 0 0 0 0 0 0 0
0000
0 0 0 0 0 000« neoplastických buněk. Je důležité zdůraznit, že tyto léčebné účinky byly získány v nepřítomnosti HIV a HHV8, což vylučuje, že tyto účinky HIV-PI by mohly být zprostředkovány takovými účinky HIV-PI na HIV a/nebo HHV8.
Studie původců tohoto vynálezu tedy ukazují, že HIV-PI může být využit k modulaci odpovídajících biologických procesů nebo k léčbě patologických stavů, zahrnujících buněčnou migraci a invazi, infiltraci tkání a aktivitu MMP. Objev, že inhibitory HlV-proteázy jsou účinnými léčivy při blokování buněčné invaze a infiltrace tkáně a že blokují aktivitu buněčných metaloproteáz účastnících se těchto procesů, konkrétně otevírá zcela nové pole pro modulaci a ovlivnění veškerých biologických procesů a patologických stavů, týkajících se odpovědí a funkcí výše zmíněných buněk včetně angiogeneze, nikoliv-neoplastických angioproliferativních chorobných stavů, Kaposiho sarkomu, nádorů, zánětlivých a autoimunitních chorob, jak u subjektů infikovaných HIV, tak i u subjektů neinfikovaných.
Do rozsahu předkládaného vynálezu tedy spadají veškeré sloučeniny, které vykazují aktivitu inhibitorů proteáz viru HIV (zde uváděné pro stručnost jako HIV-PI) a sloučeniny jim podobné nebo od nich odvozené. Jako příklady takových sloučenin jsou zde uvedeny indinavir, saquinavir, ritonavir, nelfinavir, amprenavir a lopinavir.
Sloučeniny HIV-PI mohou být u subjektů infikovaných HIV i u subjektů HlV-neinfikovaných použity následujícím způsobem:
pro blokování migrace endotheliálních buněk s léčebným protíangiogenním, proti-KS a protinádorovým účinkem; pro blokování migrace nádorových buněk s léčebným proti-KS a protinádorovým účinkem;
- 20 pro blokování invaze endotheliálních buněk s léčebným protiangiogenním, proti-KS a protinádorovým účinkem; pro blokování invaze nádorových buněk, s léčebným proti-KS a protinádorovým účinkem;
pro blokování migrace buněk zánětu s léčebným protizánětlivým, protiautoimunitním, protiangiogenním, proti-KS a protinádorovým účinkem;
pro blokování migrace imunokompetentních buněk s léčebným protizánětlivým a protiautoimunitním účinkem; pro blokování infiltrace tkání buňkami zánětu s léčebným protizánětlivým, protiautoimunitním, protiangiogenním, proti-KS a protinádorovým účinkem;
pro blokování infiltrace tkání imunokompetentními buňkami s protizánětlivým a protiautoimunitním účinkem, pro blokování MMP včetně MMP-2, stromelysinů, matrilysinu a dalších proteáz nebo molekul zúčastněných v buněčné migraci a invazi; pro blokování enzymů aktivujících MMP a jiné proteázy nebo molekuly zúčastněné v buněčné migraci a invazi; pro blokování thrombospondinu a jiných molekul zúčastněných v buněčné migraci a invazi;
pro blokování MMP včetně MMP-2 stromelysinů, matrilysinu a jiných proteáz nebo molekul zúčastněných v angiogenezi (Carmeliet a Jain, 2000);
pro blokování enzymů aktivujících MMP a jiných proteáz zúčastněných v angiogenezi;
pro blokování thrombospondinu a jiných molekul zúčastněných v angiogenezi;
pro blokování MMP včetně MMP-2, stromelysinů, matrilysinu a jiných proteáz nebo molekul, zúčastněných v migraci buněk zánětu a imunokompetentních buněk a v tkáňové infiltraci; pro blokování MMP včetně MMP-2 a jiných proteáz nebo molekul, zúčastněných v růstu a metastázování nádorů;
• · · · · · ·· • · ·
pro blokování aktivity bFGF s léčebným protiangiogenním, protinádorovým a proti-KS účinkem; pro blokování aktivity VEGF s léčebným protiangiogenním, protinádorovým, proti-KS účinkem a účinkem působícím proti vzniku edému;
pro blokování aktivity asociovaných bFGF a VEGF s léčebným protiangiogenním, protinádorovým, proti-KS účinkem a účinkem, působícím proti vzniku edému;
pro blokování aktivity Tat samotného nebo přítomnosti bFGF s léčebným protiangiogenním, protinádorovým, proti-KS, protizánětlivým účinkem a účinkem, působícím proti vzniku edému; pro blokování cévní propustnosti a edémů, spojených s angiogenezí;
pro blokování cévní propustnosti a edémů, spojených s nádory; pro blokování cévní propustnosti a edémů spojených s KS; pro blokování cévní propustnosti a edémů spojených se zánětem; pro blokování tvorby cytokinů zánětu s léčebným protizánětlivým účinkem;
pro blokování tvorby cytokinů s léčebným účinkem vůči vzniku edemů;
pro blokování tvorby cytokinů s léčebným protiangiogenním účinkem;
pro blokování tvorby cytokinů s léčebným proti-KS účinkem; pro blokování tvorby cytokinů s léčebným protinádorovým účinkem;
pro léčbu Kaposiho sarkomu;
pro léčbu angiogeneze;
pro léčbu nikoliv neoplastických angioproliferativních onemocnění (oka, ledvin, cévního systému, pokožky), jako například diabetické retinopatie, retrolentální fibroplazie, trachomu, cévního glaukomu (zeleného zákalu), lupénky, imunitního a neimunitního zánětu, atherosklerózy, keloidu;
·
•0 0000 00 ···· ·· pro léčbu benigních a maligních nádorů měkkých tkáni, chrupavek, kostí a krve;
pro léčbu obecně autoimunitních onemocnění a konkrétně systémového lupus erythematodes, sclerodermu, revmatoidní arthritidy, lupénky, hyperthyreoidismu, vředovité rektokolitidy a Crohnovy choroby, Gootpasteurova syndromu, systémové vaskulitidy, Sjórgenova syndromu, a primitivní žlučové cirhózy; pro léčbu zánětlivých onemocnění a konkrétně chronického zánětu spojeného s alergiemi a s virovými infekčními, bakteriálními nebo parazitickými agents, včetně Castelmanovy multicentrické choroby
Pro výše uvedená použití jsou obecně indikovány všechny takové sloučeniny, které vykazují aktivitu, inhibující proteázu viru HIV. Zvláště indikované jsou sloučeniny nazývané indinavir, saquinavir, ritonavir, nelfinavir, amprenavir a lopinavir, stejně jako sloučeniny podobné nebo odvozené od výše uvedených, ať už samotné nebo ve vzájemné kombinaci a /nebo v kombinaci s dalšími léčivy.
Farmaceutické prostředky pro použití podle předkládaného vynálezu mohou tedy být formovány běžným způsobem za použití jednoho nebo více z fyziologicky přijatelných nosičů, obsahujících pomocné látky a přídavné látky, které usnadňují zpracování aktivních sloučenin do prostředků, které lze farmaceuticky použít. Tyto farmaceutické prostředky mohou být vyráběny způsobem, který je sám o sobě známý, například prostřednictvím běžných postupů smísení, rozpuštění, granulování, výroby dražé, rozmělňování, emulgace, opouzdření, zachycení nebo vymražení (lyofylizace). Vlastní úprava je závislá na zvoleném způsobu podávání. Farmaceutické prostředky mohou rovněž obsahovat vhodné nosiče či pomocné látky v pevné nebo gelové fázi. Příklady takových nosičů nebo pomocných látek zahrnují, ne však výlučně, uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry,
- 23 škroby, celulózové deriváty, želatinu a polymery, jako jsou polyethylenglykoly.
Do rozsahu tohoto vynálezu spadají i chemické analogy a/nebo deriváty a/nebo sole známých HIV-PI, uvedených v předkládaném popisu vynálezu, ať už samotné nebo ve vzájemné kombinaci a/nebo ve spojení s jinými léčivy, adjuvantními látkami, nosiči nebo pomocnými látkami.
HIV-PI podle předkládaného vynálezu mohou být podávány orálně intravenózně, intramuskulárně, subkutánně, intradermálně, intraperitoneálně, intratekálně, intrapleurálně, intrauterinně, intravaginálně, místně intrarektálně, transmukozálně, intralezionálně (přímo do leze) nebo perkutánně; a to pro všechny výše uvedené indikace. Dávky a prostředky podávání závisí na typu postižení, které má být léčeno. Zejména jsou uvažovány takové dávky, které jsou menší, stejné nebo vyšší než dávky, běžně používané k léčbě pacientů infikovaných HIV. Tyto dávky činí například pro indinavir (přibližně): 600 mg/den, 1 200 mg/den, 2 400 mg/den nebo 4 800 mg/den, a pro saquinavir (přibližně): 900 mg/den, 1 800 mg/den, 3 600 mg/den nebo 7 200 mg/den.
Níže uvedené příklady, které se také vztahují k přiloženým obrázkům a tabulkám, mohou být použity pro ověření předpokladů původců vynálezu. Použili indinavir a saquinavir, dva HIV-PI spojené s regresí KS u léčených pacientů (Lebbé se spoluautory, 1998; Cattelan se spoluautory, 1999), které mají podobnou strukturu, ale chemické substituenty upravené pro optimalizaci jejich působení. Účinky obou HIV-PI byly studovány na modelech angiogeneze podněcované prostřednictvím bFGF a/nebo VEGF in vivo a in vitro, a to na vytváření leží podobných KS a na cévní propustnost, indukovanou buňkami KS in vivo a buňkami KS in vitro (Ensoli se spoluautory, 1989; Ensoli se • · ·
- 24 • · • · · · · ·
spoluautory, 1994a a 1994b; Samaniego se spoluautory, 1995; Fiorelli se spoluautory, 1995; Samaniego se spoluautory, 1997; Samaniego se spoluautory, 1998; Barillari se spoluautory, 1999a; C. Sgadari se spoluautory, J. Immunol. 165, 509, 2000), na nádory indukované lymfoidními buněčnými liniemi nebo buněčnými liniemi pevných nádorů in vivo a in vitro.
Následující příklady a obrázky jsou uvedeny pro dokreslení předkládaného vynálezu a nejsou zamýšleny k omezení jeho rozsahu.
Příklady provedení vynálezu
Materiály a metody/podrobný popis obrázků
Obr. 1: indinavir a saquinavir nemají žádný účinek na základní nebo prostřednictvím bFGF indukovanou proliferaci primárních makrovaskulárních endotheliálních buněk (z pupečníkové žíly). Část A: účinek indinaviru na základní nebo bFGF-indukovanou proliferaci primárních makrovaskulárních endotheliálních buněk (z pupečníkové žíly); část B: účinek saquinaviru na základní nebo bFGF-indukovanou proliferaci primárních makrovaskulárních endotheliálních buněk (z pupečníkové žíly).
Tento obrázek znázorňuje výsledky proliferačního stanovení, které jsou vyjádřené jako počet buněk, zjištěný po pěti dnech inkubace s bFGF v pufru PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) (plné sloupce) nebo bez bFGF (samotný PBS, prázdné sloupce) v přítomnosti či v nepřítomnosti 0,1, 1 nebo 10 μιτιοΙ.Ι1 indinaviru (IND) nebo saquinaviru (SAQ), nebo pufru pro jejich rozpuštění (pufr).
• ·
- 25 Lidské endotheliální buňky z pupečníkové žíly (HUVEC, Bio-Whittaker, Verviers, Belgie) byly pěstovány triplicitně (1,5 χ 104 buněk/jamka) na dvanáctijamkových destičkách, předem povlečených želatinou. Další den byly buňky inkubovány 4 hodiny v médiu bez přítomnosti séra a kultivovány v médiu RPMI 1640 (suspenzní médium pro imunofenotyp. druhy, Life Technologies, Eragny, Francie) za přídavku 10% fetálního hovězího séra (FBS) společně s bFGF v pufru PBS (10 ng/ml), nebo v samotném pufru PBS. Medium, bFGF, pufr PBS, indinavir, saquinavir nebo pufr k rozpuštění HIV-PI byly nahrazeny po třech dnech. Po pětidenní kultivaci byly buňky spočítány po obarvení trypanovou modří, jak bylo popsáno dříve (Ensoli se spoluautory, 1990; Ensoli se spoluautory, 1994b). Ve všech studiích prováděných in vitro byly indinavir i saquinavir v čisté práškové formě (Merck Sharpe & Dohme and Roche) resuspendovány v destilované vodě. Bylo ověřeno, že léčiva neobsahují endotoxiny, a to prostřednictvím testování LAL (Associated of Cápe Code lne., Falmouth, MA).
Obr. 2 a 3: indinavir a saquinavir blokují migraci a invazi primárních makrocévních endotheliálních buněk (z pupečníkové žíly), indukovaných prostřednictvím bFGF. Obrázek 2 znázorňuje výsledky testu migrace. Obrázek 3 znázorňuje výsledky testu invaze. Obě stanovení byla prováděna za použití endotheliálních buněk. Výsledky jsou vyjádřeny jako počet buněk/jamku, které migrovaly (Obr. 2), nebo vykazovaly invazi (Obr. 3) v odpovědi na bFGF v pufru PBS (plné sloupce), nebo v odpovědi na samotný pufr PBS (prázdné sloupce) v přítomnosti 0,1, 1 nebo 10 pimol.l*1 indinaviru (IND), saquinaviru (SAQ), anebo jejich ředícího pufru (pufr). Části A: účinek indinaviru na migraci (Obr. 2) nebo invazi (Obr. 3) primárních makrocévních endotheliálních buněk (z pupečníkové žíly) indukovaných bFGF; části B: účinek saquinaviru na migraci (Obr. 2) nebo invazi (Obr. 3) primárních
- 26 • · • · makrocévních endotheliálních buněk (z pupečníkové žíly), indukovaných bFGF.
Obě stanovení byla prováděna v Boyderově komůrce rozdělené do dvou prostorů polykarbonátovými filtry o velikosti pórů 12 pm (Nucleoprobe, Cabin John, MD), povlečených kolagenem IV (Collaborative Biomedical Products) pro migraci, nebo kolagenem IV společně s matrigelem pro invazi, jak bylo popsáno dříve (Barillari se spoluautory, 1999b). Buňky HUVEC byly kultivovány 5 až 6 dní v přítomnosti rostoucích (skalárních) koncentrací indinaviru nebo saquinaviru, nebo v přítomnosti jejich ředícího pufru. Poté byly shromážděny, resuspendovány v mediu bez přítomnosti séra a obsahujícího 0,01 % hovězí sérový albumin a následně byly umístěny do horního oddílu Boydenovy komůrky, duplicitně (2 x 105 buněk/jamku), v přítomnosti indinaviru, saquinaviru nebo jejich ředícího pufru. Do spodního oddílu komůrky byl umístěn bFGF (50 ng/ml) jako chemoatraktant v mediu, obsahujícím 0,01% hovězí sérový albumin (BSA). Po pěti hodinách (migrace) nebo šesti hodinách (invaze) inkubace byly mechanicky odstraněny nemigrující buňky, přítomné na horním povrchu filtrů, zatímco migrující buňky na spodním povrchu byly fixovány v methanolu a barveny toluidinovou modří (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Buňky, přítomné v 5-10 mikroskopických políčcích filtrů, náhodně zvolených, byly počítaný tak, jak bylo popsáno dříve (Barillari se spoluautory, 1999b).
Obr. 4: indinavir a saquinavir neinterferují (vzájemně se neovlivňují) s proliferaci mikrocévních (kožních) endotheliálních buněk v odpovědi na bFGF.
Tento obrázek znázorňuje výsledky proliferačního stanovení, vyjádřené jako počet kožních mikrocévních endotheliálních buněk,
- 27 • ·
99 · • · · · · 9 • · · · · · • · ·· · 99 · • · · · · • · · · · · · spočítaný po pěti dnech inkubace s bFGF v přítomnosti 10 pmol.l'1 indinaviru (IND) nebo saquinaviru (SAQ), či pufru pro jejich rozpuštění (pufr). Lidské kožní mikrocévní endotheliální buňky (H-DMVEC, Bio-Whittaker) byly triplicitně zaočkovány do jamek (2 x 104 buněk/jamku) želatinou potažených dvanáctijamkových destiček a poté byly kultivovány v mediu RPMI 1640, doplněném 10% FBS za stálé přítomnosti bFGF (10 ng/ml) k prevenci apoptózy, nastávající po 24 až 48 hodinách nepřítomnosti tohoto faktoru. Media, bFGF, indinavir, saquinavir (10 pmol.l'1) nebo pufr pro rozpuštění HIV-PI byly nahraženy po třech dnech. Po pěti dnech kultivace byly buňky počítány po obarvení trypanovou modří, jak bylo popsáno výše. Údaje z duplicitních pokusů byly vyjádřeny jako počet H-DMVEC rostoucích v odpovědi na bFGF v přítomnosti indinaviru, saquinaviru nebo pufru k rozpuštění HIV-PI.
Obr. 5: Indinavir a saquinavir inhibují invazi mikrocévních (kožních) endotheliálních buněk v odpovědi na bFGF. Tento obrázek znázorňuje výsledky stanovení invaze buněk, provedených s H-DMVEC. Údaje jsou vyjádřeny jako průměrná procenta a standardní směrodatné odchylky (SD) buněk účastnících se invaze v odpovědi na bFGF v pufru PBS (plné sloupce) nebo v samotném pufru PBS (prázdné sloupce) v přítomnosti indinaviru (IND), saquinaviru (SAQ) nebo pufru pro rozpuštění HIV-PI (pufr). Základní invaze v nepřítomnosti bFGF byla stanovena jako 100 %. Znázorněny jsou údaje z triplicitních pokusů v Boydenově komůrce, provedených tak, jak bylo popsáno výše pro buňky HUVEC. Blokování invaze H-MVDEC nastalo statisticky významně při koncentraci 10 mmol.l'1 v případě indinaviru a při koncentraci 1 a 10 μίτιοΙ.Ι'1 v případě saquinaviru, P < 0,05.
Obr. 6 a 7: indinavir a saquinavir inhibují invazi, ne však proliferací buněk hladkého svalstva v odpovědi na bFGF.
- 28 • ·
Obrázek 6 znázorňuje výsledky buněčného růstu a Obr. 7 stanovení invaze buněk za použití buněk hladkého svalstva. Stanovení byla v zásadě provedena tak, jak je popsáno u Obr. 1 a 3. Údaje jsou vyjádřeny jako počet nebo procentní množství rostoucích buněk nebo buněk účastnících se invaze v odpovědi na bFGF v pufru PBS (plné sloupce), nebo v odpovědi na samotný pufr PBS (prázdné sloupce) v přítomnosti indinaviru (IND), saquinaviru (SAQ) nebo pufru k rozpuštění HIV-PI (pufr), jak bylo uvedeno. Buněčný růst indukovaný bFGF v nepřítomnosti HIV-PI nebo základní buněčná invaze v nepřítomnosti bFGF byly stanoveny jako 100 %. Uvedeny jsou údaje z duplicitních pokusů (průměr).
Obr. 8 a 9: indinavir a saquinavir blokují konverzi (přeměnu) latentního MMP-2 na jeho aktivní formu.
Obr. 8: účinek indinaviru na aktivaci MMP-2. Část A: zymografické stanovení prováděné s zahuštěnými supernatanty získanými z buněk HUVEC, stimulovaných bFGF v PBS (plné sloupce) nebo samotným pufrem PBS (pufr prázdné slouce) a kultivovaných 24 hodin v přítomnosti 0,1, 1 nebo 10 pmol.l'1 indinaviru (IND) nebo pufru pro jejich rozpuštění. Šipky ukazují oblasti odbarvené účinkem želatinolytické aktivity, odpovídající latentní formě (72 000) předem aktivované formě (64 000) a aktivní formě (62 000) MMP-2. Část B: denzitometrická kvantifikace odbarvených oblastí, odpovídajících želatinolytické aktivitě latentní formy 72 000; Část C: denzitometrická kvantifikace odbarvených oblastí odpovídajících želatinolytické aktivitě předaktivované MMP-2 (64 000) a aktivní formě (62 000) MMP-2, uvolněné buňkami. Výsledky jsou vyjádřeny jako optická hustota odbarvených proužků.
Obr. 9: účinek saquinaviru na aktivaci MMP-2. Část A: zymografické stanovení prováděné se zahuštěnými supernatanty získanými z buněk HUVEC, stimulovaných bFGF v PBS (plné sloupce)
- 29 nebo samotným pufrem PBS (pufr prázdné slouce) a kultivovaných 24 hodin v přítomnosti 0,1, 1 nebo 10 pmol.l-1 saquinaviru (SAQ) nebo pufru pro jejich rozpuštění. Šipky ukazují oblasti odbarvené účinkem želatinolytické aktivity, odpovídající latentní formě (72 000) předem aktivované formě (64 000) a aktivní formě (62 000) MMP-2. Část B: denzitometrická kvantifikace odbarvených oblastí, odpovídajících želatinolytické aktivitě latentní formy 72 000; Část C: denzitometrická kvantifikace odbarvených oblastí odpovídajících želatinolytické aktivitě předaktivované MMP-2 (64 000) a aktivní formě (62 000) MMP-2, uvolněné buňkami. Výsledky jsou vyjádřeny jako optická hustota odbarvených proužků.
Buňky HUVEC byly kultivovány 24 hodin v mediu RPMI 1640 za přidání 10% FBS v přítomnosti rostoucích koncentrací indinaviru, saquinaviru nebo ředícího pufru, v přítomnosti nebo nepřítomnosti bFGF (100 ng/ml). Poté byly buňky 2x promyty mediem bez přítomnosti séra a inkubovány přes noc v mediu bez obsahu séra v přítomnosti stejných koncentrací HIV-PI. Z buněčných kultur byly shromážděny supernatanty a zahuštěny za použití membrány Centricon-10 (Amicon, Bedford, MA). Koncentrace bílkoviny byla určena prostřednictvím Bradfordovy analýzy (Bio-Rad, Hercules, CA) za použití BSA jako standardu. Stejná množství (5 gg) byla poté naředěna v pufru pro zymografii (5X) (0,4 mol.l-1 Tris-HCI, pH 6,8; 5% dodecylsulfát sodný, SDS; 20% glycerol a 0,03% bromfenolová modř) a nanesena na polyakrylamidový gel s 9% SDS, obsahující 1 mg/ml želatiny. Po elektroforéze byly gely inkubovány 1 hodinu ve 2,5% (objem/objem) Tritonu X-100 k odstranění SDS a následně s enzymovým pufrem (50 mmol.l-1 Tris-HCI, pH 7,5; 200 mmol.I1 NaCl; 5 mmol.l-1 CaCI2, 0,02% Brij-35) přes noc při 37 °C, jak bylo popsáno dříve (D. E. Kleiner a W. G. Stetler-Stevenson, Anal. Biochem. 218, 325, 1993). Gely pak byly obarveny 2,5% Comassie blue G-250 a odbarveny v soustavě 30% methanolu a 10% kyseliny octové.
• 9
9 9 9
- 30 ·· 99 • 9 9 9
9 9
9 9
9 9
9999
99 • · 9
9
Denzitometrie odbarvených oblastí byla kvantifikována za použití denzitometru GS-700, připojeného na počítač Macintosh Performa Computer se softwarem Multi-Analyst (Bio-Rad).
Obr. 10: indinavir a saquinavir blokují autoproteolytickou konverzi předem aktivované formy MMP-2 na její aktivní formu. Obr. znázorňuje zymografické stanovení, prováděné v supernatantech buněk HUVEC, stimulovaných forbolovým esterem (12-O-tetradekanoylforbol-13-acetát) (TPA) v koncentraci 50 nmol.l'1, nebo v pufru pro jeho rozpuštění (pufr) a kultivovaných 8 . hodin v přítomnosti 10 μΓηοΙ.Γ1 indinaviru (IND), saquinaviru (SAQ), nebo jejich rozpouštěcího pufru (pufr). Šipky ukazují oblasti odbarvené působením želatinoiytické aktivity, odpovídající latentní formě (pro-MMP-2, 72 000) předem aktivované formě (pre-MMP-2, 64 000) a aktivované formě (aktivní MMP-2, 62 000) MMP-2. Buňky HUVEC byly kultivovány 24 hodin v mediu RPMI 1640 za přidání 10% FBS. Před stanovením byly buňky 2x promyty mediem bez přítomnosti séra a byly inkubovány přes noc v mediu bez séra, obsahujícím 0,01% hmotnost/objem BSA v přítomnosti 10 mmol.l'1 indinaviru nebo saquinaviru či jejich rozpouštěcího pufru. Pak byly buňky inkubovány 8 hodin v mediu, obsahujícím 0,01% hmotnost/objem BSA v přítomnosti 10 mmol.l'1 indinaviru nebo saquinaviru a TPA nebo jeho rozpouštěcího pufru. Alikvotní části buněčných supernatantů pak byly gelovou zymografií testovány vzhledem k přítomnosti aktivity MMP-2 tak, jak bylo popsáno výše. HT1080 je linie nádorových buněk, vylučujících velké množství MMP-2, která byla použita jako kontrola. Jak je z obrázku zřejmé, ovlivnění buněk HUVEC prostřednictvím TPA indukovalo konverzi (přeměnu) pro-MMP-2 na pre- a aktivní MMP-2. V přítomnosti indinaviru nebu saquinaviru však poměrná intenzita želatinolytického proužku aktivní MMP-2 poklesla ve srovnání s pre-MMP-2, což naznačuje, že autoproteolytická aktivace MMP-2 na aktivní formu je působením indinaviru i saquinaviru blokována. Indinavir
- 31 φφ φφφφ φ φ φφφφ φφ φ φ φ φφφ ΦΦΦΦΦ φφφ φφ φ také inhibuje celkové množství MMP-2, uvolněné buňkami v přítomnosti TPA. Množství analyzovaného supernatantu bylo normalizováno vzhledem k celkovému počtu buněk.
Obr. 11: saquinavir blokuje tvorbu MMP degradujících kasein endotheliálními buňkami. Buňky HUVEC byly pěstovány a ovlivněny tak, jak je popsáno u Obr. 10, s tou výjimkou, že po inkubací přes noc v nepřítomnosti séra byly buňky kultivovány v přítomnosti TPA (50 nmol.I’1), různých koncentrací bFGF (0,1 nebo 1 pg/ml) v pufru PBS, nebo samotného pufru PBS (Pufr), a to jak v přítomnosti saquinaviru (SAQ), tak v přítomnosti pouze pufru pro jeho rozpuštění (pufr). Alikvotní části buněčných supernatantů, normalizované vzhledem k celkovému počtu buněk, pak byly analyzovány vzhledem k aktivitě MMP gelovou zymografií tak, jak bylo popsáno výše, v gelech obsahujících kasein (2 mg/ml) místo želatiny. Část A: kaseinová zymografie prováděná s buněčnými supernatanty, získanými po 8 hodinách kultivace v přítomnosti TPA nebo bFGF; část B: kaseinová zymografie prováděná s buněčnými suupernatanty, získanými po 24 hodinách kultivace v přítomnosti TPA nebo bFGF. Kasein je specificky štěpen stromelysiny (MMP-3, MMP-10, MMP-11) a matrilysinem (MMP-7) (Whittaker a Ayscough, 2001). To vede k objevení se odbarvených oblastí účinkem kaseinolytické aktivity, přítomné v buněčných supernatantech. Jak je znázorněno na obrázku, v nepřítomnosti saquinaviru indukuje bFGF dávkově závislým způsobem uvolnění aktivity štěpící kasein, která byla nejvyšší u buněk ovlivněných TPA. Saquinavir (10 pmol.l'1) inhibuje uvolnění (spuštění) této aktivity, jak v odpovědi na bFGF tak TPA, což prokazuje nižší intenzita kasinolytických proužků.
Obr. 12: Indinavir a saquinavir blokují vytváření angiogenních leží podobných KS, indukovaných u athymických myší účinkem bFGF.
- 32 99 9999 ·
·· ·· • * · ·
9 9
9 9
9 9
9999
9 9 9 9
999 9 9
Část 1a: makroskopický vzhled míst injikace u myší injikovaných na dvou místech pufrem (PBS-0,1% BSA) v matrigelu a ovlivněných fyziologickým roztokem; část 1b: makroskopický vzhled míst injikace u myší injikovaných na dvou místech bFGF (1 pg) v matrigelu a ovlivněných fyziologickým roztokem; část 1c: makroskopický vzhled míst injikace u myší injikovaných na dvou místech bFGF (1 pg) v matrigelu a ovlivněných indinavirem (1,4 mg/den); část 1d: makroskopický vzhled míst injikace u myší injikovaných na dvou místech bFGF (1 pg) v matrigelu a ovlivněných saquinavirem (1 mg/den).
Část 2a: mikroskopický vzhled místa očkování barveného prostřednictvím Η & E reprezentativní myši injikované pufrem a ovlivněné fyziologickým roztokem (stonásobné zvětšení); část 2b: mikroskopický vzhled místa očkování barveného prostřednictvím Η & E u reprezentativní myši injikované pufrem a ovlivněné fyziologickým roztokem (čtyřistanásobné zvětšení); část 2c: mikroskopický vzhled místa očkování barveného prostřednictvím Η & E u reprezentativní myši injikované bFGF a ovlivněné fyziologickým roztokem (stonásobné zvětšení); část 2d: mikroskopický vzhled místa očkování barveného prostřednictvím Η & E u reprezentativní myši injikované bFGF a ovlivněné fyziologickým roztokem (čtyřistanásobné zvětšení); část 2e: mikroskopický vzhled místa očkování barveného prostřednictvím Η & E u reprezentativní myši injikované bFGF a ovlivněné indinavirem (stonásobné zvětšení); část 2f: : mikroskopický vzhled místa očkování barveného prostřednictvím Η & E u reprezentativní myši injikované bFGF a ovlivněné indinavirem (čtyřistanásobné zvětšení); část 2g: mikroskopický vzhled místa očkování barveného prostřednictvím Η & E u reprezentativní myši injikované bFGF a ovlivněné saquinavirem (stonásobné zvětšení); část 2h: mikroskopický vzhled místa očkování barveného prostřednictvím Η & E u reprezentativní myši injikované bFGF a ovlivněné saquinavirem (čtyřistanásobné zvětšení). Pokusy byly prováděné tak, jak je popsáno u Tabulky 1.
- 33 Obr. 13: indinavir a saquinavir inhibují invazivní kapacitu buněk KS. Část A: účinky indinaviru na invazi dvou buněčných kmenů KS, (KS3, KS8); část B: účinky saquinaviru na invazi dvou buněčných kmenů KS (KS8, KS12).
Tento obrázek znázorňuje výsledek invazivních stanovení prováděných u tří odlišných primárních buněčných kmenů KS (KS3, KS8, KS12), kultivovaných in vitro po dobu 5 až 6 dnů v přítomnosti indinaviru nebo saquinaviru nebo ředícího pufru (kontrola). Obě léčiva inhibují schopnost buněk KS vnikat do matrigelové membrány dávkově závislým způsobem. Zejména oba HIV-PI inhibovaly invazi ve srovnání s úrovněmi, pozorovanými u kontrolních buněk KS (p < 0,05).
Stanovení bylo prováděno tak, jak je popsáno u Obr. 3. Ve stručnosti, buňky KS byly kultivovány 5 až 6 dní v přítomnosti indinaviru nebo saquinaviru (1 μίτιοΙ.Γ1) nebo ředícího pufru (fyziologický roztok). Tyto buňky byly shromážděny a umístěny duplicitně (5 x 105 v kultivačním mediu obsahujícím 0,05% BSA) do horního oddílu Boydenovy komůrky, vždy v přítomnosti HIV-PI nebo pufru. Do spodního oddílu byl umístěn bFGF (20 ng/ml) jako chemoatraktant. Po 6 hodinách byly buňky, které pronikly matrigelovou membránou, barveny a počítány tak, jak je popsáno u Obr. 3.
Obr. 14 a 15: indinavir a saquinavir inhibují invazi, ne však proliferaci hybridních buněk, vzniklých z buněk endothelu a plicního karcinomu (Ea-hy 926).
Obr. 14 znázorňuje výsledky stanovení buněčného růstu prováděných u buněk Ea-hy 926, hybridu buněk HUVEC a buněk lidského plicního adenokarcinomu (C. J. Edgell se spoluautory, PNAS 80, 3734, 1983), které si zachovávají většinu markérů endotheliálních buněk a používají se jako model angiogenního nádoru (Albíni se
- 34 ·· ·» ·» ·· ·· » ···· · »· · ··· • · · · · · ···· ?····· ··«« «··« • · · · · · · · · ·· ···· ·· ·»«· ·· · spoluautory, 1995; A. Albíni se spoluautory, Nat. Med. 2^ 1371, 1996; T.Cai se spoluautory, Lab. Invest. 79, 1151, 1999). Výsledky jsou vyjádřeny jako počet buněk, zjištěný 5 dnů po přidání 1 pmol.l’1 indinaviru (IND) nebo saquinaviru (SAQ) (plné sloupce) ve srovnání s pufrem pro rozpuštění HIV-PI (prázdné sloupce) (pufr). Tato stanovení byla prováděna v podstatě tak, jak je popsáno u Obr. 1. K buňkám Ea-hy 926 nebyly přidány žádné růstové faktory, neboť tyto buňky vytvářejí faktory ovlivňující buněčný růst autokrinním způsobem (Edgell se spoluautory, 1983, Albíni se spoluautory, 1995, Albíni se spoluautory,
1996).
Obr. 15 znázorňuje výsledky stanovení týkající se invaze buněk, vyjádřené jako počet buněk účastnících se invaze/políčko v odpovědi na bFGF v přítomnosti 1 pmol.l'1 indinaviru (IND) nebo saquinaviru (SAQ) (plné sloupce) ve srovnání s pufrem pro rozpuštění HIV-PI (prázdné sloupce) (pufr). Stanovení byla prováděna v podstatě tak, jak je popsáno u Obr. 3. Znázorněny jsou průměr a variační rozmezí dvou nezávislých pokusů, z nichž každý byl prováděn duplicitně. Blokování invaze buněk Ea-hy 926 během ovlivnění saquinavirem probíhalo statisticky významně (P < 0,05).
Obr. 16: indinavir a saquinavir neinterferují (vzájemně se neovlivňují) s proliferací buněk jaterního karcinomu (SK-Hep-1). Znázorněn je výsledek reprezentativního stanovení buněčného růstu, provedeného u buněk jaterního karcinomu. Lidské buňky jaterního karcinomu (SK-Hep-1; z ATCC) byly pěstovány triplicitně (8 x 104 buněk/jamku) v dvanáctijamkových destičkách. Následující den po 6 hodinách hladovění v mediu bez přítomnosti séra byly buňky inkubovány v kultivačním mediu, obsahujícím 10% FBS v přítomnosti 10 μΠΊΟί.Ι'1 indinaviru (IND) nebo saquinaviru (SAQ) či ředícího pufru (PBS). Medium obsahující indinavir, saquinavir nebo pufr bylo měněno každé dva dny. Po 4 dnech kultivace byly buňky spočítány při barvení
- 35 se spoluautory, vitro byl HIV-PI • 4 4 · • 4 4 • 4 4 4
4 4
4444 trypanovou modří tak, jak bylo dříve popsáno (Ensoli 1990, Ensoli se spoluautory, 1994b): u všech studií in jako čistý prášek bez přítomnosti endotoxinu (laskavý dar firmy Merck Sharp & Dohme and Roche) resuspendován v destilované vodě. Stanovení byla alespoň 3x opakována.
Obr. 17: indinavir a saquinavir inhibují invazivní kapacitu buněk jaterního karcinomu (SK-Hep-1) v odpovědi na bFGF. Znázorněny jsou průměry buněk jaterního karcinomu SK-Hep-1 účastnících se invaze ze dvou odlišných pokusů, vyjádřené jako průměrný počet buněk účastnících se invaze v odpovědi na bFGF (plné sloupce) nebo jeho ředící pufr (prázdné sloupce), a to v přítomnosti 0,1, 1 nebo 10 pmol.l'1 indinaviru (IND) nebo saquinaviru (SAQ) nebo jejich ředícího pufru (pufr). Stanovení invaze byla prováděna v Boydenově komůrce. Polykarbonátové filtry (8 pm póry; Nucleoprobe, Cabin John , MD) byly povlečeny nejprve kolagenem IV a poté matrigelem (Collaborative Biomedical Products) tak, jak bylo dříve popsáno (Barillari se spoluautory, 1999b). Buňky SK-Hep-1 byly kultivovány 5 dní v přítomnosti rostoucích koncentrací indinaviru nebo saquinaviru (0,1, 1 a 10 pmol.l1) či jejich ředícího pufru (kontrola). 2 x 105 buněk bylo duplicitně pěstováno v horním oddílu Boydenovy komůrky v 0,1% BSA, obsahujícím rostoucí koncentrace indinaviru, saquinaviru nebo ředícího pufru. Lidský rekombinantní bFGF (50 ng/ml) byl umístěn do spodního oddílu jako chemoatraktant. Po 5 hodinách inkubace byly mechanicky odstraněny buňky neúčastnící se invaze, zbylé na horním povrchu filtrů, zatímco buňky, které pronikly na spodní povrch filtrů, byly fixovány v ethanolu a barveny toluidinovou modří (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Počty v náhodně zvolených políčkách filtrů byly spočítány za použití světelné mikroskopie tak, jak bylo popsáno dříve (Barillari se spoluautory, 1999b).
0
Obr. 18: indinavir a saquinavir neinterferují (vzájemně se neovlivňují) s proliferací buněk plicního karcinomu (A549). Znázorněn je výsledek reprezentativního stanovení buněčného růstu, prováděného s buňkami plicního karcinomu. Buňky lidského plicního karcinomu (A549; ATCC) byly pěstovány triplicitně (8 x 104 buněk/jamku) v dvanáctijamkových destičkách. Následující den po 6 hodinách hladovění v mediu bez přítomnosti séra byly buňky inkubovány v kultivačním mediu obsahujícím 10% FBS v přítomnosti 10 pmcl.l'1 indinaviru (IND) nebo saquinaviru (SAQ) či ředícího pufru (PBS). Medium obsahující indinavir, saquinavir nebo pufr bylo měněno každé dva dny. Po 4 dnech kultivace byly buňky spočítány při barvení trypanovou modří tak, jak bylo dříve popsáno (Ensoli se spoluautory, 1990, Ensoli se spoluautory, 1994b): u všech studií in vitro byl HIV-PI jako čistý prášek bez přítomnosti endotoxinu (laskavý dar firmy Merck Sharp & Dohme and Roche) resuspendován v destilované vodě. Stanovení byla alespoň 3x opakována.
Obr. 19: indinavir a saquinavir inhibují invazivní kapacitu buněk plicního karcinomu (A549) v odpovědi na bFGF. Znázorněny jsou průměry buněk plicního karcinomu A549 účastnících se invaze ze dvou odlišných pokusů, vyjádřené jako průměrný počet buněk účastnících se invaze ze dvou odlišných pokusů, vyjádřené jako průměrný počet buněk účastnících se invaze v odpovědi na bFGF (plné sloupce) nebo jeho ředícího pufru (prázdné sloupce) v přítomnosti 0,1, 1 nebo 10 pmol.l'1 indinaviru (IND) nebo saquinaviru (SAQ) nebo jejich ředícího pufru (pufr). Stanovení invaze byla prováděna v Boydenově komůrce. Polykarbonátové filtry (12 pm póry; Nucleoprobe, Cabin John , MD) byly povlečeny nejprve kolagenem IV a poté matrigelem (Collaborative Biomedical Products) tak, jak bylo dříve popsáno (Barillari se spoluautory, 1999b). Buňky A549 byly kultivovány 5 dní v přítomnosti rostoucích koncentrací indinaviru nebo saquinaviru (0,1, 1 a 10 μιτιοΙ.Γ1) • ·
- 37 či jejich ředícího pufru. 2 x 105 buněk bylo duplicitně pěstováno v horním oddílu Boydenovy komůrky v 0,1% BSA, obsahujícím rostoucí koncentrace indinaviru, saquinaviru nebo ředícího pufru. Lidský rekombinantní bFGF (50 ng/ml) byl umístěn do spodního oddílu jako chemoatraktant. Po 5 hodinách inkubace byly mechanicky odstraněny buňky neúčastnící se invaze, zbylé na horním povrchu filtrů, zatímco buňky, které pronikly na spodní povrch filtrů, byly fixovány v ethanolu a barveny toluidinovou modří (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Počty v náhodně zvolených políčkách filtrů byly spočítány za použití světelné mikroskopie tak, jak bylo popsáno dříve (Barillari se spoluautory, 1999b).
Obr. 20: indinavir a saquinavir neinterferují (vzájemně se neovlivňují) s proliferaci buněk karcinomu prsu (MDA-MB-468). Lidské buňky karcinomu prsu (MDA-MB-468; ATCC) byly triplicitně pěstovány (8 x 104 buněk/jamku) v dvanáctijamkových destičkách. Následující den po 6 hodinách hladovění v mediu bez přítomnosti séra, byly buňky inkubovány v kultivačním mediu obsahujícím 10% FBS v přítomnosti 10 pmol.l'1 indinaviru (IND) nebo saquinaviru (SAQ) či ředícího pufru (PBS). Medium obsahující indinavir, saquinavir nebo pufr bylo měněno každé dva dny. Po 4 dnech kultivace byly buňky spočítány při barvení trypanovou modří tak, jak bylo dříve popsáno (Ensoli se spoluautory, 1990, Ensoli se spoluautory, 1994b): u všech studií in vitro byl HIV-PI jako čistý prášek bez přítomnosti endotoxinu (laskavý dar firmy Merck Sharp & Dohme and Roche) resuspendován v destilované vodě. Stanovení byla alespoň 3x opakována.
Obr. 21: indinavir a saquinavir inhibují invazivní kapacitu buněk karcinomu prsu (MDA-MB-468) v odpovědi na bFGF.
Znázorněn je výsledek reprezentativního stanovení invaze buněk, prováděného za použití buněk karcinomu prsu MDA-MB-468. Údaje jsou
vyjádřeny jako jako průměrný počet buněk účastnících se invaze v odpovědi na bFGF (plné sloupce) nebo jeho ředícího pufru (prázdné sloupce) v přítomnosti 0,1, 1 nebo 10 pmol.l’1 indinaviru (IND) nebo saquinaviru (SAQ) nebo jejich ředícího pufru (pufr). Stanovení invaze byla prováděna v Boydenově komůrce. Polykarbonátové filtry (8 pm póry; Nucleoprobe, Cabin John , MD) byly povlečeny nejprve kolagenem IV a poté matrigelem (Collaborative Biomedical Products) jak bylo dříve popsáno (Barillari se spoluautory, 1999b). Buňky karcinomu prsu (MDA-MB-468) byly kultivovány 5 dní v přítomnosti rostoucích koncentrací indinaviru nebo saquinaviru (0,1, 1 a 10 pmol.l'1) či jejich ředícího pufru. 2 x 10® buněk bylo duplicitně pěstováno v horním oddílu Boydenovy komůrky v 0,1% BSA, obsahujícím rostoucí koncentrace indinaviru, saquinaviru nebo ředícího pufru. Lidský rekombinantní bFGF (50 ng/ml) byl umístěn do spodního oddílu jako chemoatraktant. Po 5 hodinách inkubace byly mechanicky odstraněny buňky neúčastnící se invaze, zbylé na horním povrchu filtrů, zatímco buňky, které pronikly na spodní povrch filtrů, byly fixovány v ethanolu a barveny toluidinovou modří (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Počty v deseti náhodně zvolených políčkách filtrů byly spočítány za použití světelné mikroskopie tak, jak bylo popsáno dříve (Barillari se spoluautory, 1999b). Stanovení byla opakována alespoň dvakrát.
Obr. 22: indinavir a saquinavir inhibují invazivní kapacitu buněk myelomonocytické leukemie (U937) v odpovědi na bFGF.
Znázorněn je výsledek reprezentativního invazivního stanovení provedeného za použití buněk myelomonocytické leukemie U937. Údaje jsou vyjádřeny jako jako průměrný počet buněk účastnících se invaze v odpovědi na bFGF (plné sloupce) nebo jeho ředícího pufru (prázdné sloupce) v přítomnosti 1 nebo 10 pmol.l'1 saquinaviru (SAQ) nebo jeho ředícího pufru (pufr). Podobné výsledky byly získány také v případě, že
- 39 0 0 0 ·· · 0 0 0 0 0 0 0 00 0 0 00 0000 000 000 000
0000 00 0000 0· 0 buňky byly ovlivněny 1 nebo 10 mmol.I’1 indinaviru (údaje nejsou uvedeny. Stanovení invaze byla prováděna v Boydenově komůrce. Polykarbonátové filtry (5 pm póry; Nucleoprobe, Cabin John , MD) byly povlečeny nejprve kolagenem IV a poté matrigelem (Collaborative Biomedical Products) jak bylo dříve popsáno (Barillari se spoluautory, 1999b). Buňky myelomonocytické leukemie U937 byly kultivovány 4 dny v přítomnosti rostoucích koncentrací indinaviru nebo saquinaviru (1 a 10 pmol.l'1) či jejich ředícího pufru. 8 x 105 buněk bylo duplicitně pěstováno v horním oddílu Boydenovy komůrky v 0,1% BSA, obsahujícím rostoucí koncentrace indinaviru, saquinaviru nebo ředícího pufru. Lidský rekombinantní bFGF (50 ng/ml) byl umístěn do spodního oddílu jako chemoatraktant. Po 4 hodinách inkubace byly mechanicky odstraněny buňky neúčastnící se invaze, zbylé na horním povrchu filtrů, zatímco buňky, které pronikly na spodní povrch filtrů, byly fixovány v ethanolu a barveny toluidínovou modří (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Počty v deseti náhodně zvolených políčkách filtrů byly spočítány za použití světelné mikroskopie tak, jak bylo popsáno dříve (Barillari se spoluautory, 1999b). Stanovení byla opakována alespoň dvakrát.
Obr. 23: indinavir a saquinavir inhibují vývoj leží podobných KS, indukovaných zaočkováním buněk KS athymickým myším.
Athymické myší byly naočkovány buňkami KS (3 x 106) k indukci vytvoření angioproliferativních leží podobných KS, nebo jejich ředícím pufrem (kontrola) a byly ovlivněny indinavirem, saquinavírem nebo fyziologickým roztokem v dávkách a za použití postupů, popsaných u Obr. 12, počínaje dva dny před naočkováním buněk. V době usmrcení zvířat byla místa očkování testována k ověření přítomnosti makroskopických angioproliferativních leží, jak je popsáno u Obr. 12 a v Tabulce 5. Část a: mikroskopický vzhled středové oblasti místa naočkování buněk KS, barveného prostřednictvím hematoxilinem a
- 40 • · · · · · · · · · • · · ·· · · ·· ···· • · · ··· · · · ·· ···· ·· ···· ·· · eosinem (H&E), u reprezentativní myši ovlivněné fyziologickým roztokem (stonásobné zvětšení); část b: mikroskopický vzhled středové oblasti místa naočkování buněk KS, barveného prostřednictvím H&E, u reprezentativní myši ovlivněné fyziologickým roztokem (čtyřistanásobné zvětšení); část c: mikroskopický vzhled středové oblasti místa naočkování buněk KS, barveného prostřednictvím H&E, u reprezentativní myši ovlivněné indinavirem (dvěstěpadesátinásobné zvětšení); část d: mikroskopický vzhled středové oblasti místa naočkování buněk KS, barveného prostřednictvím H&E, u reprezentativní myši ovlivněné indinavirem (čtyřistanásobné zvětšení); část e: mikroskopický vzhled středové oblasti místa naočkování buněk KS, barveného prostřednictvím H&E, u reprezentativní myši ovlivněné fyziologickým roztokem (stonásobné zvětšení); mikroskopický vzhled středové oblasti místa naočkování buněk KS, barveného prostřednictvím H&E, u reprezentativní myši ovlivněné saquinavirem (dvěstěpadesátinásobné zvětšení); část f: mikroskopický vzhled středové oblasti místa naočkování buněk KS, barveného prostřednictvím H&E, u reprezentativní myši ovlivněné saquinavirem (čtyřistanásobné zvětšení). Pokusy byly prováděny tak, jak je popsáno v Tabulce 5.
Obr. 24: indinavir a saquinavir podporují regresi leží podobných KS, indukovanou naočkováním buněk KS athymickým myším.
Indinavir a saquinavir mohou také napomáhat regresi KS v nepřítomnosti předléčení jakýmkoliv léčivem. Athymické myši (10 zvířat/skupina) byly naočkovány buňkami KS (buněčný kmen KS12, 3 x 10® ) k indukci vytvoření angioproliferativních leží podobných KS, nebo rozpouštěcím pufrem těchto buněk (kontrola) a stejný den započalo ovlivňování indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem, podávanými žaludeční sondou v dávkách popsaných u Tabulky 5. Ovlivňování pokračovalo 5 dnů až do usmrcení zvířat. Uvedena je průměrná velikost (cm2) leží, vyskytujících se v místě injikace,
- 41 ·· · · · · · · • · · · · · • · · · · · ···· • · · ·· · · ·· · · · · ··© · · · ··· ·· ···· ·· ···· ·· · hodnocená denním měřením za použití posuvného měřítka a vypočítaná ze dvou největších průměrů leze.
Obr. 25: indinavir a saquinavir podporují regresi nádorových angiogenních leží, indukovaných naočkováním hybridních buněk, vzniklých z buněk endothelu a buněk plicního karcinomu (Ea-hy 926), athymickým myším.
V in vivo studiích byly k prokázání toho, že indinavir a saquinavir podporují regresi i jiných nádorů než je KS v nepřítomnosti předchozí léčby, použity buňky Ea-hy 926, tedy hybrid, vytvořený z buněk HUVEC a buněk lidského plicního adenokarcinomu (Edgell se spoluautory, 1983), který si zachovává většinu z endotheliálních buněčných markérů a používá se jako model angiogenního nádoru (Albíni se spoluautory, 1995; Albíni se spoluautory, 1996, Cai se spoluautory, 1999). Myši byly subkutánně naočkovány do spodní části zad buňkami Ea-hy 926 (3 x 10® buněk/zvíře v 0,2 ml 10% FBS-RPMI 1640), nebo mediem k resuspendování těchto buněk, v obou případech za přimíšení 0,2 ml matrigelu bez přítomnosti růstového faktoru (BD Biosciences, Bedford, MA), provedeným před výše popsaným očkováním. Tentýž den započalo ovlivňování zvířat indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem za využití žaludeční sondou podávané výživy a v dávkách popsaných u Obr. 24. Ovlivňování pokračovalo 5 dní, až do usmrcení zvířat. Velikost leží vzniklých v místě injikace byla denně hodnocena za použití posuvného měřítka. Plocha externí leze pak byla vypočítána jako výsledek dvou větších průměrů leze. Znázorněna je průměrná velikost (cm2) leží, přítomných v místě injikace.
Obr. 26: indinavir a saquinavir inhibují vývoj nádorových leží, indukovaných naočkováním buněk jaterního karcinomu (SK-Hep-1) athymickým myším.
- 42 9 99 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 9999 99 9
Indinavir a saquinavir jsou účinné také při blokování růstu nádorů, indukovaných in vivo buňkami jaterního karcinomu. Nádory byly indukovány očkováním athymických myší (10 zvířat/skupinu) buňkami jaterního karcinomu (buněčná linie SK-Hep-1, získaných z ATCC, 5 x 106 buněk/místo) a zvířata byla denně ovlivňována indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem tak, jak je upřesněno u Obr.
23. Dvacet čtyři hodin před injikací buněk byly myši podrobeny sub-letálnímu ozáření (400 G) pro zvýšení absorpce nádorem. Ovlivnění účinkem HIV-PI nebo fyziologickým roztokem pokračovalo až do usmrcení zvířat. Velikost leží přítomných na místě injikace byla denně hodnocena za použití posuvného měřítka. Plocha externí leze pak byla vypočítána ze dvou větších průměrů leze. Znázorněna je průměrná velikost (cm2) leží přítomných v místě injikace.
Obr. 27: indinavir a saquinavir inhibují vývoj leží podobných KS, indukovaných naočkováním buněk plicního karcinomu (A549) athymickým myším. Indinavir a saquinavir byly účinné také při blokování růstu nádorů, indukovaných buňkami plicního karcinomu in vivo. Nádory byly indukovány naočkováním buněk plicního karcinomu (buněčná linie A549, získaná z ATCC, 5 x 10® buněk/místo) athymickým myším ovlivněným RTG zářením (10 zvířat/skupinu) a zvířata byla denně ovlivňována indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem tak, jak je upřesněno u Obr. 23. Ovlivnění účinkem HIV-PI nebo fyziologickým roztokem pokračovalo až do usmrcení zvířat. Velikost leží přítomných na místě injikace byla denně hodnocena za použití posuvného měřítka. Plocha externí leze pak byla vypočítána ze dvou větších průměrů leze. Znázorněna je průměrná velikost (cm2) leží přítomných v místě injikace.
Obr. 28: indinavir a saquinavir inhibují vývoj nádorových leží indukovaných naočkováním buněk karcinomu prsu (MDA-MB-468) athymickým myším.
• 4
- 43 • · · · • 444 4
4 4 4
4 4 4 9
4 4 4
9449
Indinavir a saquinavir byly účinné rovněž při blokování růstu nádorů, indukovaných in vivo buňkami adenokarcinomu prsu. Nádory byly indukovány naočkováním athymických myší, ovlivněných RTG zářením (10 zvířat/skupinu), buňkami karcinomu prsu (buněčná linie MDA-MB-468, získaná z ATCC, 5 x 106 buněk/místo) a zvířata byla denně ovlivňována indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem tak, jak je podrobně uvedeno u Obr. 23. Ovlivnění účinkem HIV-PI nebo fyziologickým roztokem pokračovalo až do usmrcení zvířat. Velikost leží přítomných na místě injikace byla denně hodnocena za použití posuvného měřítka. Plocha externí leze pak byla vypočítána ze dvou větších průměrů leze. Znázorněna je průměrná velikost (cm2) leží, přítomných v místě injikace.
Obr. 29: indinavir a saquinavir inhibují vývoj nádorových leží, indukovaných naočkováním buněk myelomonocytické leukemie (U937) athymickým myším.
Indinavir a saquinavir byly účinné rovněž při blokování růstu nádorů, indukovaných in vivo buňkami myelomonocytické leukemie. Nádory byly indukovány naočkováním athymických myší, ovlivněných RTG zářením (10 zvířat/skupinu), buňkami myelomonocytické leukemie (buněčná linie U937, získaná z ATCC, 5 x 106 buněk/místo v 0,2 ml kultivačního media) a zvířata byla denně ovlivňována indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem tak, jak je podrobně uvedeno u Obr. 23. Ovlivnění účinkem HIV-PI nebo fyziologickým roztokem pokračovalo až do usmrcení zvířat. Velikost leží přítomných na místě injikace byla denně hodnocena za použití posuvného měřítka. Plocha externí leze pak byla vypočítána ze dvou větších průměrů leze. Znázorněna je průměrná velikost (cm2) leží, přítomných v místě injikace.
• ·
- 44 9 9 9 9
9 9
9
9 9
9 9 • 9 9 9 9
Obr. 30: indinavir a saquinavir inhibují vývoj nádorových leží, indukovaných naočkováním buněk T-buněčné leukemie (Jurkat) athymickým myším.
Indinavir a saquinavir byly účinné rovněž při blokování růstu nádorů, indukovaných in vivo buňkami T-lymfocytární leukemie. Nádory byly indukovány naočkováním athymických myší, ovlivněných RTG zářením (10 zvířat/skupinu), leukemickými buňkami (buněčná linie Jurkat, získaná z ATCC, 20 x 10® buněk/místo) a zvířata byla denně ovlivňována indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem tak, jak je podrobně uvedeno u Obr. 23. Ovlivnění účinkem HIV-PI nebo fyziologickým roztokem pokračovalo až do usmrcení zvířat. Velikost leží přítomných na místě injikace byla denně hodnocena za použití posuvného měřítka. Plocha externí leze pak byla vypočítána ze dvou větších průměrů leze. Znázorněna je průměrná velikost (cm2) leží, přítomných v místě injikace.
Obr. 31: indinavir a saquinavir blokují cévní propustnost a vznik otoku, indukovaných u athymických myší buňkami KS.
Athymické myši byly ovlivňovány indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem po dobu dvou dnů ve stejných dávkách a za použití postupů, jaké byly popsány výše. Třetí den jim byl naočkován pyrilamin (80 pg ve 100 μΙ fyziologického roztoku, 4 mg/kg, Sigma) k odstranění interference histaminu uvolněného očkováním, bezprostředně následovaný intravenózní injikací 10 μΙ Evansovy modře (5 mg/ml ve fyziologickém roztoku) a poté subkutánní injikací buněk KS (3 x 106/myš), kultivovaných in vitro v přítomnosti indinaviru, saquinaviru (1 pmol.l'1) nebo ředícího pufru v 0,2 ml matrigelu. Jako kontrola bylo každé zvíře kontrolaterálně očkováno stejným objemem ředícího pufru a matrigelu. Po 18 hodinách byla zvířata usmrcena a množství barviva,
- 45 • · ··
0 0 4
0 4
4 0
0 4
0044 usazeného v místě očkování buňkami KS, bylo měřeno v úrovni dvou nejširších na sebe kolmých průměrů pomocí měřítka. Množství usazeného barviva bylo také hodnoceno po odebrání pokožky z místa očkování a bylo kvantifikováno spektrofotometricky po extrakci formamidem, prováděné 24 hodin při teplotě 56 °C (S. Nakamura se spoluautory, Science 255, 1437, 1992). Množství usazeného barviva bylo počítáno po vydělení optickou hustotou, naměřenou na kontrolním místě. Jak je z obrázku zřejmé, působení indinaviru nebo saquinaviru snížilo množství usazeného barviva na 39,8 % (p < 0,05) a na 44,5 % (p < 0,01) v případě spektrofotometrické kvantifikace a na 43,5 %, respektive 47,5 % v případě měření měřítkem.
Obr. 32: Indinavir a saquinavir inhibují tvorbu cytokinů buňkami KS in vitro. Část A: množství IL-6 přítomného v supernatantu buněk KS, kultivovaných v přítomnosti pouze pufru (pufr) nebo v přítomnosti indinavairu (IND); část B: množství IL-6 přítomného v supernatantu buněk KS, kultivovaných v přítomnosti pouze pufru (pufr) nebo v přítomnosti saquinaviru (SAQ).
Buňky byly pěstovány v šestijamkových destičkách po dobu pěti dnů, jak již bylo popsáno (Ensoli se spoluautory, 1990) za stálé přítomnosti indinaviru či saquinaviru v koncentracích 0,1, 1 a 10 gmol.l'1, nebo jen s ředícím pufrem. Pátý den bylo kultivační medium nahraženo mediem bez přítomnosti séra, obsahujícím hovězí krevní albumin (0,05% hmotnost/objem), v přítomnosti indinaviru či saquinaviru ve výše zmíněných koncentracích. Po 24 hodinách inkubace byly supernatanty kultur testovány prostřednictvím enzymatického imunitního stanovení ELISA (R&D Systems Minneapolis, MN, USA) k určení množství IL-6 přítomného v mediu. Množství IL-6 je vyjádřeno v pg/ml supernatantu. Stejné testy byly prováděny pro bFGF, VEGF, IL-1a a
- 46 φφ • · * φ φ φ φ φφφφ φφφ φφ φφφφ φφ φφ • φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φφφφ
Φ· φ φ φ φ φ φφφ φ ΦΦΦΦΦ φφφ φφ φ
IL-Ιβ za použití komerčně dostupných sad ELISA. Jak indinavir, tak i saquinavir snižovaly tvorbu bFGF, VEGF, IL-1a, IL-Ιβ a IL-6.
Příklad 1
K ověření toho, které procesy nezbytné pro rozvoj KS byly inhibovány indinavirem či saquinavirem, byly sledovány proliferace, migrace a invaze v odpovědi na bFGF z primárních lidských makrocévních endoteliálních buněk, získaných z pupečníkové žíly, kultivovaných v přítomnosti nebo v nepřítomnosti rostoucích koncentrací indinaviru či saquinaviru. Použité koncentrace HIV-PI byly stejné jako ty, přítomné v plazmě léčených pacientů (Deeks se spoluautory, 1997).
Jak je zřejmé z Obrázku 1, HIV-PI nevykazoval žádný účinek na základní nebo prostřednictvím bFGF indukovanou proliferaci makrocévních endoteliálních buněk v žádné z použitých koncentrací. Podobně nebyl žádný účinek na přežití makrocévních endoteliálních buněk zaznamenán za použití indinaviru či saquinaviru. Naproti tomu oba tyto HIV-PI ve všech použitých koncentracích inhibovaiy migraci (Obr. 2) a úplně blokovaly invazi makrocévních endoteliálních buněk (Obr. 3), podpořenou bFGF. Stejné výsledky byly získány za použití primárních lidských kožních mikrocévních endoteliálních buněk (Obr. 4 a 5), nebo primárních lidských buněk hladkého svalstva (Obr. 6 a 7).
Příklad 2
Migrace a invaze endoteliálních buněk jsou zprostředkovány proteolytickou aktivitou aktivních MMP, která rozrušuje základní cévní membránu a umožňuje tak migraci a invazi endoteliálních buněk, které jsou vyžadovány pro vytváření nových cév (Stetler-Stevenson, 1999). MMP jsou uvolňovány endoteliálními buňkami ve formě proenzymu
- 47 ·· ·· • 4 4 4 • · 4
4 4 • 4 4 •4 4444
4 • 4 4 ·
4 4
4 4
4 4
4444
4 • 4 ·
4 4 4
4 4 4 4
4 4 zymogenu. K ověření toho, zda indinavir nebo saquinavir mají nějaký účinek na aktivitu MMP v endoteliálních buňkách, byly provedeny pokusy ke změření želatinolytické aktivity s želatinovými i kaseinovými zymogramy (Kleiner se spoluautory, 1993). Bylo zjištěno, že zvláště MMP-2 je klíčový jak pro angiogenezi, tak i růst nádoru a invazi buněk. Zymogen MMP-2 (latentní MMP-2, 72 000) je proteolyticky aktivován na buněčném povrchu do forem o velikosti 64 000/62 000 prostřednictvím komplexního mechanismu, zahrnujícího další proteázy (Stetler-Stevenson, 1999). Indinavir nebo saquinavir (Obr. 8 a 9) vykázaly minimální nebo nulový účinek na syntézu latentního MMP-2, zatímco oba tyto HIV-PI blokovaly aktivaci MMP-2 dávkově závislým způsobem (Obr. 8 a 9). Tyto účinky byly pozorovány po 24 hodinách inkubace buněk s HIV-PI o stejných koncentracích, jaké jsou přítomny v plazmě léčených pacientů (Deeks se spoluautory, 1997). Podobné účinky byly rovněž pozorovány po pěti dnech inkubace s HIV-PI. K analýze kroků zahrnutých v inhibici aktivace MMP-2 prostřednictvím HIV-PI byly endotheliální buňky aktivovány forbolových esterem, o němž je známo, že je velmi účinný při podpoře přeměny MMP-2 na její aktivní formu. Jak je znázorněno na Obr. 10, tyto pokusy ukázaly, že oba HIV-PI působí prostřednictvím inhibice autoproteolytické konverze pre-MMP-2 na aktivní formu (62 000) (Stetler-Stevenson, 1999). Přesný mechanismus, jímž indinavir nebo saquinavir inhibují přeměnu latentní MMP-2 na její aktivní formu, je stále ještě potřeba určit. Ve skutečnosti nebyla nalezena žádná homologie mezi sekvencí aktivního místa proteázy HIV a MMP-2 nebo jiných MMP. Ovšem homologie aminokyselinové sekvence s katalytickým místem HIV proteázy (A. Carr se spoluautory, Lancet 351, 1881, 1998) byla nalezena na thrombospondinu, o němž je známo, že je schopný aktivovat nebo inhibovat MMP a/nebo angiogenezi (K. Bein a M. Simons, J. Biol. Chem. 275, 32167, 2000). To naznačuje, že HIV-PI může ovlivňovat aktivaci MMP nebo invazi buněk prostřednictvím ovlivnění thrombospondinu.
9
9 9
9999
- 48 • 9
99
9 9 9
9 9
9 9
9 9
9 9999
99
9 9 • · • 9
9 9
9999
9 9
9
Ke studiu účinků indinaviru a saquinaviru na další MMP byly použity kaseinové zymogramy s endotheliálními buňkami, ovlivněnými bFGF nebo TPA v přítomnosti či v nepřítomnosti HIV-PI. Tyto pokusy ukázaly, že saquinavir byl schopný inhibovat syntézu vzhledem ke kaseinu specifické MMP, indukovanou prostřednictvím bFGF nebo TPA (Obr. 11).
Vzhledem k tomu, že MMP jsou klíčové pro buněčnou migraci a invazi, ukazují tyto výsledky, že indinavir a saquinavir inhibují buněčnou migraci a invazi prostřednictvím inhibice MMP. I když cílem indinaviru nebo saquinaviru mohou být i další proteázy nebo molekuly účastnící se buněčné invaze, MMP-2 a kaseinové specifické MMP představují klíčové příklady tohoto účinku.
Příklad 3
Bylo již prokázáno, že MMP-2 je indukována působením bFGF a jiných angiogenních faktorů (Ensoli se spoluautory, 1994a; Barillari se spoluautory, 1999b, Stetler-Stevenson, 1999) a že jak bFGF, tak MMP-2 jsou exprimovány v lezích KS (Ensoli se spoluautory, 1989; Ensoli se spoluautory, 1994a; Samaniego se spoluautory, 1998). Nadto je inhibice bFGF nebo aktivity MMP a zvláště MMP-2 známa jako působení blokující angiogenezi i vytváření leží KS a růstu nádorů obecně (Ensoli se spoluautory, 1989, Ensoli se spoluautory, 1994a a 1994b; Stetler-Stevenson, 1999; Koivunen se spoluautory, 1999; Carmeliet a Jain, 2000). Na druhou stranu, buněčná invaze je vyžadována pro angiogenezi jak u normálních, tak i nádorových tkání. Tyto údaje ukazují, že inhibice buněčné invaze a MMP indinavirem či saquinavirem by mohly být schopné blokovat angiogenezi. Účinky indinaviru a saquinaviru na angiogenezi indukovanou bFGF a/nebo VEGF byly proto studovány u athymických myší a na chorioallantoidní membráně (CAM stanovení).
- 49 • · «· ·· ·· • · φ · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ···· ·· ···· • · • · · • · · · · • ·
Athymické myší byly ovlivňovány indinavirem (1,4 mg/den), saquinavirem (1 mg/den) nebo fyziologickým roztokem (negativní kontrola) za použití žaludeční sondy jednou denně po dobu dvou dnů (Kleiner se spoluautory, 1993). Poté byly myši naočkovány bFGF (1 pg) nebo jeho ředícím pufrem v přítomnosti matrigelu (Kleiner se spoluautory, 1993; Ensoli se spoluautory, 1994a; Samaniego se spoluautory, 1998; Barillari se spoluautory, 1999a). Ovlivňování indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem bylo prováděno každý den po dobu pěti dalších dnů. Poté byly myši usmrceny a plochy očkování byly zkoumány jak makroskopicky, tak mikroskopicky s ohledem na přítomnost angioproliferativních leží podobných KS (Kleiner se spoluautory, 1993; Ensoli se spoluautory, 1994a; Samaniego se spoluautory, 1998; Barillari se spoluautory, 1999a). V souladu s dříve získanými výsledky (Ensoli se spoluautory, 1994a; Samaniego se spoluautory, 1998; Barillari se spoluautory, 1999a) podporovalo naočkování 1 pg bFGF rozvoj angioproliferativních leží u 71 % neovlivňovaných myší (Tabulka 1 a Obr. 12 (1)).
Naproti tomu působení indinaviru nebo saquinaviru snížilo procentní množství myší, u nichž se vyvinuly leze z 28 %, respektive z 25 % (p < 0,05) (Tabulka 1 a Obr. 12 (1)): Obr. 12 (1) ukazuje příklad těchto výsledků. Působení indinaviru nebo saquinaviru zcela blokovalo vytváření leze nebo značně snížilo rozsah leží. Makroskopické sledování očkovaných míst u myší ovlivněných indinavirem nebo saquinavirem prokázalo značné snížení angiogeneze a infiltrace buněk ve srovnání se zvířaty očkovanými bFGF a neovlivněnými působením HIV-PI (Obr. 12 (2)). V případě úplné regrese byl histologický obraz tkání podobný nebo shodný s tím, který byl pozorován u myší, jimž byl injikován samotný pufr (negativní kontrola) (Obr. 12 (2)). To bylo potvrzeno barvením s anti-FVIII nebo anti-CD31 protilátkami a kvantifikací počítačové analýzy (Tabulka 1). Plocha leží, pozitivní
- 50 • · · · ·· · · ·· * • · · · · · · · · · ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 99 9 9 99 99999
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 9999 99 9 vzhledem k markérům endotheliálních buněk, byla skutečně snížena až o 70 % u myší ovlivněných HIV-PI ve srovnání s neovlivněnými kontrolami (P < 0,001) (Tabulka 1).
Vzhledem k tomu, že VEGF synergicky spolupracuje s bFGF při indukci angiogeneze a tvorby leze KS, byly myši (6 zvířat/skupinu) rovněž očkovány sub-optimálními množstvími bFGF (0,1 gg) a VEGF (1 μg) ke zjištění jejich synergického účinku (Samaniego se spoluautory, 1998) a poté byly ovlivněny HlV-Pi tak, jak bylo uvedeno výše. Spojený přídavek obou faktorů indukoval vývoj leze u 83 % neovlivněných myší, ovšem jak indinavir, tak saquinavir redukovaly tvorbu leží na 33 %, respektive 17 % (P < 0,05, saquinavir) u ovlivňovaných myší (Tabulka 2). Oba HIV-PI tedy inhibují angiogenezi a rozvoj leží podobných KS, indukovaný synergickým účinkem bFGF a VEGF u athymických myší. Tyto výsledky ukazují, že HIV-PI mají přímé protiangiogenní účinky.
K potvrzení toho, že HIV-PI mají přímé protiangiogenní účinky, byl použit test CAM, který je zavedeným stanovením in vivo pro měření angiogeneze (D. Ribatti se spoluautory, Int. J. Dev. Biol. 40, 1189, 1996). Jak je znázorněno v Tabulce 3, indinavir nebo saquinavir blokovaly angiogenezi indukovanou bFGF až na 42 %, respektive 19 % hodnoty kontrol neovlivněných bFGF a na 36 %, respektive na 11 % kontrol neovlivněných VEGF (P < 0,05). Zejména blokování angiogeneze indukované bFGF oběma HIV-PI bylo srovnatelné s působením taxolu, cytotoxického léčiva, vykazujícího jak protinádorové, tak i protiangiogenní působení, které se používá při léčbě KS a pevných nádorů (Sgadari se spoluautory, 2000) (Tabulka 3). Tyto údaje potvrdily, že inhibice migrace a invaze mikrocévních a makrocévních endotheliálních buněk, invaze buněk hladkého svalstva a aktivity MMP prostřednictvím HIV-PI má za následek blokádu angiogeneze in vivo.
- 51 • * 9 9 ·· 9 9 99«
99 9 9 99 9 · 99
9 99 9 9999
9 9 99 9 9 99 9999
999 999 999
9999 99 9999 99 9
Příklad 4
Buňky KS jsou trans-diferencující se buňky endotheliálního původu, s aktivovaným fenotypem a exprimují jak bFGF a VEGF, tak MMP (Ensoli se spoluautory, 1989; Ensoli se spoluautory, 1990, Ensoli se spoluautory, 1994a; souhrn v práci: Ensoli a Stůrzl, 1998). Tyto údaje tedy ukazují, že HIV-PI mohou mít na buňky KS účinky podobné těm, které ovlivňují endotheliální buňky a buňky hladkého svalstva a mohou být schopné inhibovat invazi buněk KS. Proto byly provedeny pokusy, týkající se adheze, proliferace, migrace a invaze, při nichž byly buňky KS pěstovány v přítomnosti indinaviru nebo saquinaviru v koncentracích od 0,01 pmol.l'1 do 1 pmol.l'1 po dobu 5 až 7 dnů. Jak je zřejmé z Tabulky 4, indinavir či saquinavir neinhibují schopnost buněk KS adherovat k fibronectinovému substrátu. Podobně ovlivnění buněk KS indinavirem či saquinavirem v délce 7 dnů nemělo žádný účinek na buněčnou proliferaci, měřenou počítáním živých buněk po barvení trypanovou modří (Tabulka 4).
Pro určení, zda HIV-PI interferuje (vzájemně se ovlivňuje) se schopností buněk KS migrovat a vnikat do bazální membrány v odpovědi na angiogenní faktory, byly buňky KS, ovlivňované po dobu 5 dnů indinavirem nebo saquinavirem (0,01 pmol.l'1 až 1 pmol.l'1), umístěny do horního oddílu Boydenových komůrek vždy v přítomnosti HIV-PI, zatímco bFGF byl umístěn do spodního oddílu jako chemoatraktant. Jak je uvedeno v Tabulce 4, ani indinavir ani saquinavir neměly žádný účinek na migraci buněk KS. Naproti tomu obě léčiva inhibovala schopnost buněk KS vnikat do matrigelového substrátu dávkově závislým způsobem. Oba HIV-PI konkrétně inhibují invazi buněk KS na 30 až 40 % (p < 0,05) (Tabulka 4 a Obr. 13).
·♦ Λ
Tyto údaje ukazují, že mechanismus účinků HIV-PI na invazi buněk v odpovědi na chemotaktické stimuly, zahrnující například inhibici MMP, působí nejspíše na mnoho buněčných typů, včetně nádorových buněk.
Příklad 5
K ověření, zda může HIV-PI specificky inhibovat invazi nádorových buněk, byly pokusy týkající se proliferace a invaze buněk prováděny na nádorových buněčných liniích, získaných z nádorů různého původu. Studovány byly zejména následující buněčné linie: Ea-hy 926, získané z hybridu buněk H-UVEC a buněk lidského plicního karcinomu (Edgell se spoluautory, 1983), buňky jaterního karcinomu (SK-Hep-1), buňky plicního karcinomu (A549), buňky adenokarcinomu prsu (MDA-MB-468) a buňky myelomonocytární leukemie (U937). Indinavir či saquinavir neprokázaly významné účinky na proliferaci těchto buněčných linií (Obr. 14, 16, 18, 20). Naproti tomu oba HIV-PI významně inhibovaly invazi nádorových buněk ve stejných koncentracích, jako jsou ty, přítomné v sérech léčených pacientů (Obr. 15, 17, 19, 21, 22). Tyto údaje tedy ukazují, že schopnost HIV-PI inhibovat invazi normálních a neoplastických buněk zahrnuje mechanismus, který je běžný u všech buněk, jako je blokování molekul a enzymů účastnících se buněčné migrace a invaze včetně, zvláště MMP.
Příklad 6
Tyto výsledky ukazují, že přes nepřítomnost účinku na proliferaci nádorových buněk může být HIV-PI schopný inhibovat růst nádorů selektivní blokádou invaze nádorových buněk a angiogeneze nádoru, tedy jevů, které jsou nutné pro vývoj nádorů, infiltraci nádorů a metastázy (Carmeliet se spoluautory, 2000). Proto byly provedeny studie in vivo určené ke stanovení, zda byly HIV-PI účinné při inhibici
44
- 53 • 4
4&
· · · • · · • 44
4 4 •4 4444
4 4
4
4
4 4
4444
4 • 4 4
4 4 4
4 4444
4 4
4 růstu xenoimplantátových nádorových modelů, včetně nádorových buněčných linií, použitých při studiích in vitro.
Nejprve byly studovány účinky indinaviru či saquinaviru na vytváření leží podobných KS, vyvolaných naočkováním primárních lidských buněk KS athymickým myším, což je model in vivo, široce používaný v předklinických studiích účinku léčeb zaměřených proti KS (Ensoli se spoluautory, 1994b; Koivunen se spoluautory, 1999; Sgadari se spoluautory, 2000). Tyto angioproliferativní leze jsou dočasné, myšího původu a jsou vyvíjeny v odpovědi na cytokiny jako bFGF a VEGF, IL-1, IL-6 a další, uvolňované buňkami KS (Ensoli se spoluautory, 1989; Ensoli se spoluautory, 1994a a 1994b; Fiorelli se spoluautory, 1995; Samaniego se spoluautory, 1995; Samaniego se spoluautory, 1997; Sgadari se spoluautory, 2000). KS je skutečně, alespoň v počáteční fázi, reaktivní angioproliferativní onemocnění a nikoliv pravý novotvar (nádor) (Ensoli a Stůrzl, 1998). Zvířata byla ovlivňována za použití stejných postupů a dávek indinaviru a saquinaviru jako v pokusech, popsaných výše. Jak je zřejmé z Tabulky 5, zaočkování buněk KS indukovalo tvorbu leží podobných KS u 100 % zvířat. Působení indinavirem či saquinavirem snížilo procentní množství myší, u nichž se vyvinuly leze na 43, respektive 25 %. Makroskopicky byly leze u neovlivněných myší narudlé a vysoce vaskularizované a u zvířat ovlivněných HIV-PI byly menší a v ustupující fázi. Podobně vykazovaly leze u neovlivněných myší intenzivní neovaskularizaci, infiltraci vřetenovitých buněk, otok a extravazaci (výron) erythrocytů (Obr. 23). Naproti tomu myši ovlivněné HIV-PI vykazovaly větší nekrotickou plochu v místě injikace buněk, zahrnující až 85 % plochy celé leze a značný úbytek jak nově vytvořených cév, tak infiltrace vřetenovitých buněk, což bylo převážně omezeno na okrajové oblasti nekrotické/regresní plochy (Obr. 23).
- 54 • · » · · · · · ► · · · · ·
Ke stanovení, zda může HIV-PI rovněž podporovat regresi KS v nepřítomnosti předléčby jakýmkoliv léčivem, byly rovněž uskutečněny pokusy, při němž byly myši ovlivněny HIV-PI v době zaočkování buňkami KS. Jak je zřejmé z Obrázku 24, leze KS obecně v průběhu času vykazují pomalou regresi, ovšem leze u myší ovlivněných HIV-PI ustupovaly mnohem rychleji a v době usmrcení zvířat byla plocha externí leze podobná nebo shodná jako u negativních kontrol (P < 0,01).
Protein Tat z HIV zvyšuje četnost a agresivitu KS u subjektů, infikovaných HIV-1 (Ensoli se spoluautory, 1994a). To je způsobeno indukcí adheze, migrace, invaze a proliferace endotheliálních buněk účinkem Tat a indukcí KS. Tat skutečně synergicky zvyšuje účinky bFGF na angiogenezi a KS (Ensoli se spoluautory, 1994a; Barillari se spoluautory, 1999a a 1999b). Ovšem Tat vyžaduje k uplatnění svého působení na KS přítomnost bFGF nebo cytokinů zánětu, neboť ty zvyšují expresi receptorů pro Tat na buňkách a v tkáních (Barillari se spoluautory, 1992; Barillari se spoluautory, 1993; Albíni se spoluautory, 1995; Fiorelli se spoluautory, 1995; Fiorellí se spoluautory, 1999; Barillari se spoluautory, 1999a a 1999b),
K ověření toho, zda HIV-PI inhibují spojený účinek Tat a bFGF na angiogenezi a KS, proto byly athymické myši naočkovány bFGF a Tat a ovlivňovány indinavirem, saquinavirem nebo samotným pufrem, použitým k jejich resuspendování. Jak je uvedeno v Tabulce 6, jak indinavir, tak i saquinavir snižovaly procentní množství athymických myší, u nichž se vyvinuly leze KS (na 50 %, respektive na 20 %).
Tyto výsledky ukazují, že HIV-PI jsou schopné inhibovat vývoj a indukovat regresi (ústup) reaktivního nádorového modelu podobného KS (Ensoli a Stůrzl, 1998) i přes nepřítomnost účinků na proliferaci buněk KS, prostřednictvím účinků na buněčnou invazi, aktivitu MMP a angiogenezi.
- 55 Příklad 7
K určení, zda mohou HIV-PI inhibovat růst zhoubného angiogenního nádoru, byly athymické myši zaočkovány buněčnou linií EA-hy 926. Tato buněčná linie je získána z hybridu buněk HUVEC a buněk lidského adenokarcinomu plic (Edgell se spoluautory, 1983), uchovává si většinu z endotheliálních buněčných markérů a používá se jako model angiogenního nádoru (Albíni se spoluautory, 1996; Albíni se spoluautory, 1995; Cai se spoluautory, 1999). HIV-PI byly podávány athymickým myším počínaje dva dny před naočkováním nádorových buněk. Jak je zřejmé z Tabulky 7, nádory se vyskytly u 83 % neovlivněných myší, ale pouze u 33, respektive 25 % myší ovlivněných indinavirem, resp. saquinavirem (P < 0,05). Podobně byla plocha externího nádoru snížena u myší ovlivněných oběma HIV-PI (P < 0,05), přičemž dosáhla velikosti jako u negativních kontrol (Tabulka 7). Zbylé nádory u ovlivňovaných zvířat vykazovaly velké snížení jak růstu nádoru, tak angiogeneze, což bylo stanoveno histologicky a barvením s protilátkami anti-FV11l-RA nebo anti-CD31 ve srovnání s kontrolami (P < 0,001) (Tabulka 7). Inhibice nádorového růstu byla pozorována také v nepřítomnosti předléčby (Obr. 25). U těchto zvířat byla po jejich usmrcení snížena velikost externího tumoru o více než 50 % ve srovnání s neovlivněnými kontrolami (P < 0,001) (Obr. 25). HIV-PI tedy inhibují za podmínek in vivo růst modelového angiogenního nádoru přímým blokováním invaze nádorových buněk a angiogeneze i přes nepřítomnost účinků na proliferací buněk EA-hy 926.
Příklad 8
Ke stanovení, zda může HIV-PI inhibovat růst zhoubných pevných a lymfoidních nádorů, byly athymické myši naočkovány buňkami jaterního karcinomu (SK-Hep-1), buňkami plicního karcinomu (A549), buňkami adenokarcinomu prsu (MDA-MB-468), buňkami
myelomonocytární leukemie (U937) a buňkami leukemie lymfocytů T (Jurkat). Růst všech těchto xenoimplantátových nádorů byl významně inhibován jako indinavirem, tak saquinavirem, a to i přes nepřítomnost účinku HIV-PI na proliferací těchto buněčných linií (Obr. 26 až 30). Tyto údaje tedy ukazují, že blokáda invaze nádorových a endotheliálních buněk, vyvolaná inhibici aktivity MMP působením HIV-PI, je zodpovědná za účinky těchto léčiv na růst nádoru.
Příklad 9
Vzhledem k tomu, že MMP jsou zapojeny do cévní propustnosti a tvorby otoků (Carmeliet se spoluautory, 2000), což jsou důležité klinické příznaky angiogeneze, KS, nádorů a zánětlivých onemocnění, byly pokusy, týkající se cévní propustnosti, prováděny u athymických myší, naočkovaných buňkami KS. Tyto buňky indukují otoky, neboť vytvářejí cytokiny s účinky vyvolávajícími otok, zahrnující VEGF, bFGF (v kombinaci v VEGF) IL-1, IL-6 a další. Athymické myši byly ovlivňovány indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem po dobu 2 dnů v dávkách a za použití postupů popsaných výše v Příkladu 6. Poté byly intravenózně naočkovány Evansovou modří a následně jim byly injikovány buňky KS, pěstované in vitro v přítomnosti indinaviru či saquinaviru (1 μηηοΙ.Ι'1), nebo pouze ředícího pufru. Po 12 hodinách byla zvířata usmrcena, obarvené plochy přítomné v místě naočkování buněk KS byly změřeny posuvným měřítkem a uvolněné barvivo bylo z tkáně extrahováno formamidem. Jeho množství bylo měřeno spektrofotometricky podle Nakamuri a spoluautorů, 1992. Jak je uvedeno na Obrázku 31, ovlivnění indinavirem, respektive saquinavirem snížilo množství uvolněného barviva na 39,8 % (p < 0,05) a 44,5 % (p < 0,01) a obarvenou plochu na 43,5, respektive 47,5 % (Obr. 31).
Příklad 10 • ·
• · »· ····
Buňky KS vylučují cytokiny se zánětlivou, angiogenní a proliferativní aktivitou a působící vznik otoků, s autokrinními a parakrinními účinky (Ensoli a Sturzl, 1998). Tyto faktory zprostředkovávají všechny procesy, vyžadované pro tvorbu leží podobných KS (angiogeneze, buněčná proliferace a invaze, zánětlivá infiltrace, otok), pro cévní propustnost a otoky, indukované buňkami KS u athymických myší. Pro stanovení účinků indinaviru a saquinaviru na tvorbu cytokinů byly buňky KS pěstovány v přítomnosti či v nepřítomnosti rostoucích koncentrací indinaviru či saquinaviru. Množství bFGF, VEGF, IL-1 a IL-6 byla při imunoenzymatických stanoveních stanovována v supernatantech buněk KS po 24 hodinách kultivace buněk v nepřítomnosti séra a za stálé přítomnosti obou HIV-PI (ELISA). Indinavir i saquinavir inhibovaly tvorbu IL-1 alfa, IL-1 beta a IL-6 buňkami KS. Jako příklad těchto účinků ukazuje Obr. 32 inhibici IL-6, typického cytokinů zánětu produkovaného buňkami KS a endotheliálními buňkami, ale rovněž krevními lymfocyty a monocyty a tkáňovými lymfocyty a monocyty, který má rovněž angiogenní účinky. (R. B. Mateo se spoluautory, Am. J. Physiol. 266, R1840, 1994; T. Cohen se spoluautory, J. Biol. Chem. 271, 736, 1996). IL-6 nadto hraje klíčovou roli v multicentrickém Castelmanově onemocnění a v růstu lymfomů (Tosato se spoluautory, 1993; Peterson a Frizzera, 1993; Asou se spoluautory, 1998; Ramsay se spoluautory, 1994), jiném typu nádoru, jehož výskyt je snížen u pacientů léčených HIV-PI (International Collaboration on HIV and Cancer2000).
Diskuse
Tyto výsledky ukazují, že HIV-PI má specifické inhibiční účinky na buněčnou migraci a/nebo invazi, ne však na buněčnou proliferaci. Tyto účinky se zdají být vyvolány mechanismem, který je obecný pro mnoho primárních a nádorových buněčných typů různého původu a cílových klíčových molekul, zasahujících do buněčné migrace a invaze, které • · • ·
- 58 ·· ·· ·» ·· ··<· · · nejsou ve spojení s buněčným proteosomem. Zde uváděné studie například ukazují, že účinky HIV-PI jsou ve vztahu k inhibici aktivování či tvorby MMP a mohou zasahovat i další molekuly, zúčastněné v metabolismu MMP, jako například trombospondin. Díky těmto aktivitám jsou HIV-PI schopné blokovat některé buněčné procesy, vyžadující buněčnou migraci, invazi, a/nebo aktivitu MMP, zahrnující angiogenezi, cévní propustnost, tvorbu otoku a růst jak reaktivních hyperplastických nádorů jako je KS, tak i zhoubných pevných nebo lymfoidních novotvarů. Vzhledem k tomu, že migrace imunokompetentních buněk a buněk zánětu rovněž vyžaduje buněčnou invazi a aktivitu MMP, zde uvedené údaje ukazují, že HIV-PI může inhibovat buněčnou infiltraci do tkání během zánětlivé nebo imunitní odpovědi. Nadto HIV-PI inhibuje produkci cytokinů a dalších faktorů, které zprostředkovávají tvorbu KS a růst dalších tumorů a zánětlivou infiltraci s ním spojenou. HIV-PI má také protizánětlivé účinky, neboť snižuje tvorbu cytokinů jako IL-6, IL-1 a pravděpodobně i dalších cytokinů, zapojených v zánětu, které jsou rovněž přítomné v lezích lidského nebo myšího KS. Stejné cytokinů zánětu jsou schopné indukovat tvorbu angiogenních faktorů (bFGF, VEGF) a mají také angiogenní účinky in vivo (Barillari se spoluautory, 1992; Samaniego se spoluautory, 1995; Fiorelli se spoluautory, 1995; Samaniego se spoluautory, 1997; 1998; Fiorelli se spoluautory, 1998, 1999, Barillari se spoluautory, 1999a). IL-6 má klíčovou roli zvláště v multicentrické Castelmanově chorobě a při růstu lymfomů (Tosato se spoluautory, 1993; Peterson a Frizzera, 1993; Ramsay se spoluautory, 1994; Asou se spoluautory, 1991).
HIV-PI se váže do aktivního místa proteázy HIV, která patří do skupiny aspartylproteáz. V nedávné době bylo prokázáno, že taková léčiva mohou inhibovat aspartylproteázu z hub (A. Cassone se spoluautory, J. Infect. Dis. 180, 448, 1999). Ovšem žádnou ze známých proteáz, které se účastní buněčné migrace a invaze, není aspartylproteáza a mezi aktivním místem proteázy HIV a proteázami,
účastnícími se těchto procesů, nebyla nalezena žádná sekvenční homologie, s výjimkou trombospondinu. Účinky, které byly autory tohoto vynálezu prokázaný u buněčné migrace, invaze a u MMP nebylo tedy možné nijak očekávat a byly zcela nepředvídatelné.
I když ve skutečnosti některé studie předpokládaly, že HIV-PI má účinek na buněčný metabolismus, proteozom a imunitu (Deeks se spoluautory, 1997; André se spoluautory, 1998; F. F. Weichold se spoluautory, J. Hum. Virol. 2, 261, 1999; Ledru se spoluautory, 2000; Tovo, 2000; patentová přihláška WO 99/63998; patentová přihláška WO 00/33654), autoři tohoto vynálezu prokázali, že HIV-PI vykazuje přímou protiangiogenní, protinádorovou, protizánětlivou aktivitu a aktivitu působící proti vzniku otoků, které nejsou spojeny se známými aspartylproteázami, buněčným proteozomem nebo s účinky HIV-PI na replikaci HIV nebo HHV-8. Modely buněčné proliferace, migrace, invaze, angiogeneze KS a nádorů, použité v této studii in vitro a in vivo, jsou skutečně bez přítomnosti infekčních agens.
Stejné výsledky získali původci tohoto vynálezu s indinavirem i se saquinavirem, které sdílí podobnou strukturu s dalšími HIV-PI, kromě specifických chemických substituentů pro každé z léčiv. Tyto údaje tedy ukazují, že aktivity HIV-PI, které původci tohoto vynálezu zjistili u indinaviru a saquinaviru, jsou vlastnostmi běžnými u všech HIV-PI, což je v souladu se společnými účinky různých HIV-PI, pozorovanými u léčených jedinců (Lebbé se spoluautory, 1998; Cattelan se spoluautory, 1999; International Collaboration on HIV and Cancer, 2000).
Výše zmíněné účinky HIV-PI jsou pozorovány při stejných koncentracích léčiva, jaké jsou přítomny v plazmě léčených pacientů a které jsou těmito jedinci dobře přijímány. Podobně nebyly žádné toxické účinky indinaviru či saquinaviru pozorovány u myší nebo v podmínkách in vitro. I když dřívější údaje udávaly, že HIV-PI inhibuje buněčný
- 60 proteozom a že inhibice proteozomu indukuje naprogramovou buněčnou smrt v proliferujících endotheliálních buňkách (André se spoluautory, 1998 a C. A. Hannes se spoluautory, FASEB J. 14, 85, 2000), ve studiích původců tohoto vynálezu indinavir a saquinavir nevykazovaly žádné účinky na přežití buněk nebo růst v endotheliálních buňkách, buňkách hladkého svalstva nebo v nádorových buňkách. Naopak, selektivně inhibovaly buněčnou migraci a invazi, což naznačuje, že HIV-PI nepoškozuje předem existující cévy nebo tkáně.
Vzhledem k tomu, že buněčná motilita (pohyblivost) a angiogeneze jsou nezbytné nejen pro vývoj KS, ale také pro růst a metastázování nádorů (Carmeliet a Jain, 2000; Stetler-Stevenson, 1999), až dosud popisované výsledky ukazují, že HIV-PI jsou nadějnými protiangiogenními a protinádorovými léčivy. Nadto tytéž výsledky ukazují, že HIV-PI blokuje cévní propustnost, zánět indukovaný cytokiny zánětu a faktory cévní propustnosti a také tvorbu cytokinů, majících klíčovou roli v multicentrické Castelmanově chorobě a v růstu lymfomů (Tosato se spoluautory, 1993; Peterson a Frizzera, 1993; Ramsay se spoluautory, 1994; Asou se spoluautory, 1998).
HIV-PI a léčiva jim podobná nebo jejich deriváty je tedy možné využít k blokování angiogeneze, růstu, invaze a metastází pevných nádorů a nádorů krve, k blokování otoků a zánětu a mohou tedy být úspěšně použity při léčbě KS, nádorů, angioproliferativních onemocnění a zánětlivých i autoimunitních onemocnění jak u subjektů infikovaných HIV, tak i subjektů HlV-negativních.
Tabulka 1: Indinavir a saquinavir blokují u athymických myší angiogenní leze podobné KS, indukované bFGF
| působení | injikace | počet myší s makroskop. cév. lezemi/počet naočkovaných myší (%) | barvení tkáně (plocha v % ± SD) | |
| FVIII-RA | CD31 | |||
| fyz. roztok | pufr | 0/22 (0) | 0,20 ± 0,2 | 0,06 ± 0,1 |
| fyz. roztok | bFGF | 20/28 (71) | 4,32 ± 2,0 | 3,45 ± 1,7 |
| indinavir | bFGF | 8/28 (28) | 1,32 ± 1,2 | 1,00 ± 0,6 |
| saquinavir | bFGF | 7/28 (25) | 1,13 ± 0,6 | 0,83 ± 0,3 |
Athymické myši byly naočkovány bFGF (1 gg) k indukci tvorby angioproliferativních leží podobných KS, nebo pufrem k resuspenzování bFGF (kontrola) a poté byly ovlivněny indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem. V době usmrcení byla místa očkování zkoumána k ověření přítomnosti makroskopických angioproliferativních leží a mikroskopicky analyzována po barvení hematoxilinem a eosinem (H&E), nebo byla zamražena pro histochemickou analýzu endotheliálních buněčných markérů FVIII-RA a CD31. V Tabulce je uveden počet myší, u nichž se leze vyvinuly ve vztahu k počtu myší, které byly očkovány a procentní množství (%) myší, u nichž se leze vyvinuly. Snížení počtu leží podobných KS u ovlivňovaných zvířat je statisticky významné (standardní test podílů, p < 0,05). Angiogeneze byla kvantifikována určením plochy tkáně, barvené vzhledem k FVIII-RA nebo CD31. Udána jsou procenta [průměr ± standardní odchylka (SD)] plochy leze, zabarvené vzhledem k FVIII-RA nebo CD31, která byla kvantifikována tak, jak je popsáno níže. Snížení exprese FVIII nebo CD31 ve zbylých lezích zvířat,ovlivněných HIV-PI, bylo statisticky významné (P < 0,001).
K provedení těchto pokusů in vivo byly stejné vzorky indinaviru (Merck Sharpe & Dhome Ltd., Haarlem, Holandsko) nebo saquinaviru (Roche, Hertfordshire, Velká Británie), jaké se používají u pacientů infikovaných HIV, rozpuštěny ve fyziologickém roztoku a podávány athymickým myším (samice kmene Balb/c nu/nu, Charles River, Calco, • · • ♦ ·
- 62 *· φφ • · » φ φ φ φ • · φ φφφφ
Italy, ve stáří 5 až 6 týdnů) prostřednictvím žaludeční sondy. Pro testování jejich toxicity byly indinavir a saquinavir podávány jednou denně po dobu celkem 8 dnů v dávkách 35, 70 nebo 17,5 mg/kg/den, respektive 18, 36 nebo 9 mg/kg/den, v objemu 0,4 ml. Tyto dávky odpovídají celé dávce, dvojité dávce nebo poloviční dávce HIV-PI, používané denně u pacientů infikovaných HIV (Deeks se spoluautory,
1997). Při žádné z těchto dávek nebyla pozorována žádná orgánová nebo systémová toxicita. Myši byly ovlivňovány dávkou 70 mg/kg/den indinaviru (odpovídající množství 1,4 mg/den) nebo dávkou 36 mg/kg/den saquinaviru (odpovídající množství 1 mg/den) jednou denně po dobu celkem 7 dnů, počínaje 2 dny před naočkováním bFGF. Kontrolní zvířata byla ovlivňována stejným objemem fyziologického roztoku. Třetí den byly myši subkutánně naočkovány na úrovni nižšího zádového kvadrantu 1 pg rekombinantního bFGF (Roche, Mannheim, Německo), naředěným 0,2 ml soustavy fosfátový pufr (PBS) - 0,1% hovězí sérový albumin (BSA), nebo pufrem k resuspendování bFGF, smíšeným před naočkováním s 0,2 ml matrigelu (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA), jak bylo popsáno dříve (Ensoli se spoluautory, 1994a). Po 4 dnech byly myši usmrceny, místa očkování byla testována k ověření přítomnosti makroskopických angioproliferativních leží podobných KS a tkáňové řezy byly histologicky zkoumány po obarvení prostřednictvím H&E. Pro imunohistochemické analýzy byly zamražené tkáňové řezy fixovány studeným acetonem a barveny s králičími anti-lidskými FVIII-RA polyklonálními protilátkami (Ab) (Dako, Glostrup, Dánsko; zředění 1 : 2 000), nebo s anti-myšími CD31 monoklonálními protilátkami (BD Biosciences; zředění 1 : 1 000). Digitální zobrazení (zvětšení 200 x) byla zachycena barevnou kamerou CCD (Zeiss) a analyzována odečtem 4 až 9 mikroskopických políček (přibližně 0,15 mm2/políčko), odpovídajících celým histologickým řezům. Barvení bylo kvantifikováno za použití softwaru zobrazovací analýzy KS • 0 0 • 0 0 0 • 00000 • 0 « • 0
- 63 00 00 • 0 0 0
0 0 •00 ••0 ·« 0000
300 (Zeiss) a bylo vyjádřeno jako procenta pozitivní oblasti vůči celkové ploše tkáně.
Tabulka 2: Indinavir nebo saquinavir inhibuje vývoj angiogenních leží podobných KS, indukovaných bFGF, VEGF a jejich kombinací.
| Angiogenní faktory | ovlivnění | počet myší s tezemi/ počet myší |
| bFGF 0,1 μg | fyz. roztok | 2/4 (50 %) |
| bFGF 1 μρ | fyz. roztok | 0/6 (0 %) |
| bFGF 0,1 μg + VEGF 1 μg | fyz. roztok indinavir saquinavir | 5/6 (83 %) 2/6 (33 %) 1/6 (17 %) |
Athymické myši byly naočkovány pufrem, bFGF, VEGF (R&D systems, Minneapolis, MN), nebo kombinací bFGF a VEGF v matrigelu a ovlivněny indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem tak, jak je upřesněno v klíči k Tabulce 1. Po usmrcení zvířat byla místa injíkace testována vzhledem k přítomnosti makroskopických angioproliferativních leží a tkáň byla barvena prostřednictvím H&E a mikroskopicky analyzována. V Tabulce jsou uvedeny počty myší, u nichž se vyvinuly leze, vzhledem k počtu očkovaných myší a procenta (%) myší, u nichž se vyvinuly leze. Počet myší, u nichž se vyvinuly angiogenní leze podobné KS, byl snížen léčbou jak indinavirem, tak saquinavirem (standardní test podílu, P < 0,05).
Tabulka 3: Účinky indinaviru či saquinaviru na angiogenezi indukovanou bFGF nebo VEGF ve stanovení chorioallantoidní membrány (CAM).
ΦΦ φ φ • φ
- 64 • φ φ φφφ • φ φ φφ φφφφ φφ φφφ φ φφφ • · φ φ φ φ • φφφφ ··· • φ φφφ
| angiogenní faktor | působení (počet vajec) | cévní průměr (počet/mm2 ± SD) |
| pufr | fyziol. roztok (23) | 4,39 ± 1,12 |
| bFGF | fyziol. roztok (11) indinavir (11) saquinavir (13) | 13,50 ± 3,03 8,22 ± 2,54 6,08 ± 1,84 |
| VEGF | fyziol. roztok (8) indinavir (9) saquinavir (7) | 13,51 ± 2,42 7,70 ± 2,52 5,39 ± 0,67 |
| bFGF | taxol (4) | 7,71 ± 1,63 |
Stanovení CAM byly prováděna se sterilizovanými želatinovými houbičkami (Gelfoam; Upjohn Co, Kalamazoo, Ml) o objemu 1 mm3, s adsorbovanými látkami bFGF nebo VEGF (1 pg respektive 100 ng) v 5 μΙ PBS, s pufrem, HIV-PI (10 pmol.l'1) nebo taxolem (250 nmol.I'1) (Bristol-Myers Squibb Co., Princeton, NJ), jak bylo popsáno (Ribattim se spoluautory, 1996). Stanovení CAM byla prováděna denně až do dne 12 pod stereomikroskopem Olympus SZX9. Zobrazení (1024 x 1024 pixelů) byla získávána ve vzdálenosti 2 mm od hrany použité houbičky za pomoci chlazené digitální kamery CCD Hamamatsu ORCA (Hamamatsu Photonics, Italia, Arese, Itálie). Počet cév byl kvantifikován za použití zobrazovacího softwaru ImageProPlus 4.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) ve 3 náhodně zvolených oblastech na jedno vejce (1 mm3).
Výsledky jsou vyjádřeny jako průměrný počet cév/mm2 ± SD z uvedeného počtu CAM při daných pokusných podmínkách. Použité dávky indinaviru, saquinaviru nebo taxolu jsou podobné koncentracím léčiv, přítomným v plazmě léčených pacientů (D. S. Sonnichsen a Μ. V. Relling, Clin. Pharmacokinet., 1994; Deeks se spoluautory, 1997).
• 9
4 • · 4
4 4 4 4
4
- 65 • 4 4 4 • · 4 • 444 • · 4 •4 4444
44 • · 4 4 • · 4 •4«
4 4 •4 4444
Podávání indinaviru, saquinaviru nebo taxolu samotných nebylo spojeno s žádnou toxicitou a neovlivnilo základní vaskularizaci CAM (údaje nejsou uvedeny). Inhibice vytváření cév indinavirem nebo saquinavirem byla statisticky významná (ANOVA a Studentův-Newmanův-Keulsův test; P < 0,05).
Tabulka 4: Účinky indinaviru a saquinaviru na buňky KS in vitro
| indinavir (μιτιοΙ.Ι'1)* | saquinavir (μιτιοΙ.Ι'1)* | |||||
| buňky KS | 0,01 | 0,1 | 1 | 0,01 | 0,1 | 1 |
| adheze | NS | NS | 1,05 | NS | NS | 1 |
| proliferace | 1 | 1,08 | 1,11 | 1 | 1,15 | 1,25 |
| migrace | NS | NS | 1,03 | NS | NS | 1,21 |
| invaze | 0,98 | 0,74** | 0,71** | 1 | 0,79** | 0,62** |
* násobek zvýšení exprese ve srovnání s kontrolou (1 násobek) ** p < 0,05
NS = nestanoveno
Stanovení adheze, proliferace, migrace a invaze byla prováděna kultivací buněk KS v přítomnosti indinaviru nebo saquinaviru v koncentracích od 0,01 do 1 μιτιοΙ.Ι'1 po dobu 5 až 7 dnů. Indinavir nebo saquinavir neinhibují schopnost buněk KS adherovat k substrátu fibronectinu. Podobně ovlivnění buněk KS indinavirem nebo saquinavirem po dobu 7 dnů nemá žádný účinek na proliferaci buněk, měřenou barvením trypanovou modří.
Ani indinavir ani saquinavir neměly žádný účinek na migraci buněk KS. Naproti tomu obě léčiva inhibovaly schopnost buněk KS pronikat do matrigelové membrány dávkově závislým způsobem (p < 0,05).
• 4 44 • 4 4 4 •4 4
4 4 •44 •4 4444 ·· 44 • 4 4
4
4 • 4 4
444 • ·
- 66 •4 4444
Stanovení migrace a invaze byla prováděna v podstatě tak, jak je upřesněno v klíči k Obr. 2 a 3. Buňky KS, pěstované 5 dní v přítomnosti indinaviru nebo saquinaviru (0,01 prnol.l'1 až 1 pmol.l'1), nebo ředícího pufru, byly umístěny do horního oddílu Boydenových komůrek vždy v přítomnosti HIV-PI, zatímco bFGF byl umístěn do spodního oddílu jako chemoatraktant.
Tabulka 5: Účinky indinaviru nebo saquinaviru na angioproliferativní leze podobné KS, indukované naočkováním buněk KS athymickým myším.
| ovlivnění | injikace | počet myší s makroskopickými lezemi/počet naočkov. myší (%) |
| fyziol. roztok | medium | 0/8 (8) |
| fyziol. roztok | buňky KS | 14/14 (100) |
| indinavir | buňky KS | 7/16 (43) |
| saquinavir | buňky KS | 4/16 (25) |
Athymickým myším byly naočkovány buňky KS (3 x 106) k indukci tvorby angioproliferativních leží podobných KS, nebo pufr k resuspendování těchto buněk (kontrola). Myši byly ovlivňovány indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem v dávkách a za použití procedur, popsaných v klíči k Tabulce 1, počínaje 2 dny před naočkováním buněk a až do usmrcení, 5 dní poté. Po usmrcení zvířat byla místa očkování zkoumána k potvrzení přítomnosti makroskopických angioproliferativních leží podobných KS, jak je popsáno v klíči k Tabulce
1. Zde jsou uvedeny počet myší, u nichž se vyvinuly leze v poměru k počtu naočkovaných myší a procenta (%) myší, u nichž se vyvinuly leze. Snížení tvorby angiogenních leží podobných KS u zvířat ovlivňovaných •9 99
9 9 9 •9 9
9φ •99
9999 » 99 ·· 9 • * • ·
9 9
9999 • ·
9· 9 • ·
- 67 HIV-PI bylo statisticky významné (standardní test podílů, P < 0,001). Histologický obraz očkovaných míst je uveden na Obr. 23.
Tabulka 6: Indinavir a saquinavir blokujíu athymických myší vytváření angioproliferativních leží podobných KS, podněcovaných zaočkováním kombinace bFGF a Tat z HIV-1.
| ínjikace | ovlivnění | počet makroskop. cévních leží/ počet injikovaných zvířat (%) |
| pufr | fyziol. roztok | 0/18 (0 %) |
| bFGF + Tat | fyziol. roztok | 7/10 (70 %) |
| bFGF + Tat | indinavir | 5/10(50%) |
| bFGF + Tat | saquinavir | 2/10(20%) |
Athymickým myším byla naočkována kombinace bFGF (1 pg) a Tat (10 pg) k indukci vytváření angioproliferativních leží podobných KS, nebo pufr k jejímu resuspendování (kontrola). Myši byly ovlivněny indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem. Po usmrcení zvířat byla místa očkování zkoumána k potvrzení přítomnosti makroskopických angioproliferativních leží podobných KS. Zde jsou uvedeny počet myší, u nichž se vyvinuly leze v poměru k počtu naočkovaných myší a procenta (%) myší, u nichž se vyvinuly leze.
Myši byly ovlivňovány indinavirem a saquinavirem za použití postupů a dávek, popsaných v Tabulce 1, po dobu celkem 7 dnů, počínaje 2 dny před naočkováním bFGF a Tat. Kontrolní zvířata byla ovlivňována stejným objemem fyziologického roztoku. Třetí den byly myši subkutánně naočkovány v úrovni nižšího zádového kvadrantu 1 pg rekombinantního bFGF a 10 pg Tat z HIV-1, naředěnými v soustavě 0,2
- 68 ·· ·· • · · · • · · • · ♦ · * · · ·· ···· • 9 • · · • 9 ·
• ·
9999 • 9 4 • 9 9 • 9 9 9 • 94444 • · · ·· ·
PBS-0,1% BSA, nebo pufrem k resuspendování takových látek, přičemž uvedené roztoky byly před očkováním smíseny s 0,2 ml matrigelu, jak bylo popsáno dříve (Ensoli se spoluautory, 1994a). Čtyři dny poté byly myši usmrceny, místa očkování byla zkoumána k ověření přítomnosti makroskopických angioproliferativních leží podobných KS a tkáňové řezy byly mikroskopicky zkoumány po barvení hematoxylinem/eosinem.
Tabulka 7: Indinavir či saquinavir inhibují vývoj angiogenních nádorů, indukovaných naočkováním buněk EA-hy 926 athymickým myším.
| působení | injikace | počet myší s | velikost | barvení tkáně | |
| makroskop. | externí leze | (plocha v % ± SD) | |||
| cévními | (cm2±SD) | ||||
| lezemi/počet | |||||
| naočk. myší | |||||
| (%) | FVIII-RA | CD31 | |||
| fyz. roztok | medium | 0/8 (0) | 0,58 ± 0,15 | 0 | 0 |
| fyz. roztok | buňky | 10/12 (83,3) | 0,71 ± 0,2 | 2,91 ± 1 | 2,30 ± 1,7 |
| indinavir | buňky | 4/12 (33,3) | 0,63 ± 0,17 | 1,01 ± 1,5 | 0,70 ± 0,6 |
| saquinavir | buňky | 3/12 (25) | 0,55 ± 0,14 | 0,71 ± 0,8 | 0,08 ± 0,1 |
Athymickým myším byly subkutánně injikovány buňky EA-hy 926 (3 x 106 buněk/místo) (viz klíč k Obr. 25) a poté byly ovlivněny indinavirem, saquinavirem nebo fyziologickým roztokem, podávanými žaludeční sondou, počínaje 2 dny před naočkováním buněk, tak, jak bylo popsáno výše (viz klíč k Tabulce 1). Myši byly usmrceny 5 až 6 dnů po injikaci buněk a leze přítomné v místě injikace byly měřeny posuvným měřítkem a mikroskopicky analyzovány po barvení H&E, nebo imunohistochemickou analýzou. Snížení tvorby angiogenních nádorových leží bylo u zvířat ovlivňovaných HIV-PI statisticky významné • ·
- 69 ·· ···· ·· *· • · · · • * ♦ • · · • · · ·· ···· ·· · • · · • · · · • · ··· • · · ·· · (standardní test podílů, P < 0,05). S nádorem asociovaná angiogeneze byla hodnocena po imunohistochemickém barvení pro určení markérů FVIII-RA nebo CD31 tak, jak je popsáno v legendě k Tabulce 1. Uvedena je velikost externích leží (cm2 ± SD) a procento obarvené nádorové tkáně (± SD), jak bylo kvantifikováno za použití softwaru pro zobrazovací analýzu KS 300 (Zeiss, viz metody). Plocha zbytkových leží, stále přítomných v místě injikace, měla menší velikost u myší ovlivněných jak indinavirem, tak saquinavirem (P < 0,05) a vykazovala menší expresi jak FVIII, tak CD31 (P < 0,001).
Zastupuje:
Claims (26)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Použití alespoň jedné sloučeniny, zvolené ze skupiny inhibitorů proteázy viru lidské imunodeficience, tj. HIV-PI, k přípravě léčiva pro léčbu subjektu trpícího stavem, který může být léčen nebo předcházen blokováním migrace/invaze buněk zvolených ze skupiny endotheliálních buněk, nádorových buněk, buněk zánětu nebo imunokompetentních buněk, nebo subjektu, který je k takovému stavu náchylný.
- 2. Použití podle nároku 1, přičemž buněčná migrace/invaze buněk má za následek infiltraci tkáně a/nebo tvorbu otoku v tkáni.
- 3. Použití podle nároků 1 až 2, přičemž blokování se dosáhne prostřednictvím inhibice nebo modulace molekul a proteolytických enzymů, zvolených ze skupiny, sestávající z metaloproteáz matrixu včetně metaloproteáz matrixu typu 2, stromelysinů a matrilysinu; z enzymů aktivujících metaloproteázy matrixu; thrombospondinu; bazického růstového faktoru fibroblastů a růstového faktoru cévního endothelu samotných nebo vzájemně asociovaných, a z Tat, proteinu viru lidské imunodeficience samotného nebo v přítomnosti bazického růstového faktoru fibroblastů.
- 4. Použití podle nároku 3, přičemž proteolytickými enzymy jsou metaloproteázy matrixu.
- 5. Použití podle nároků 1 až 4, přičemž stavem, který má být léčen nebo je třeba mu předejít, je alespoň jeden z následujících patologických stavů: zánětlivé onemocnění, autoimunitní onemocnění, neoplastické a nikoli-neoplastické angioproliferativní onemocnění.
- 6. Použití podle nároku 1 až 5, přičemž inhibitor proteázy viru lidské imunodeficience má protiangiogenní, protinádorovou, proti- 71 zánětlivou aktivitu a/nebo aktivitu působící proti vzniku otoků, k léčbě Kaposiho sarkomu, nádorů a nikoli-neoplastických angioproliferativních, zánětlivých a autoimunitních onemocnění.
- 7. Použití podle nároků 1 až 6, přičemž inhibitor proteázy viru lidské imunodeficience je zvolen z následujících sloučenin: indinaviru, saquinaviru, ritonaviru, nelfinaviru, amprenaviru, lopinaviru a ritonaviru, odpovídajících farmaceuticky přijatelných derivátů, chemických analogů a směsí takových sloučenin.
- 8. Použití podle nároku 7, přičemž sloučeniny jsou podávány v následujících dávkách: indinavir: 600 mg/den, 1 200 mg/den, 2 400 mg/den a 4 800 mg/den; saquinavir: 900 mg/den, 1 800 mg/den, 3 600 mg/den a 7 200 mg/den.
- 9. Použití podle nároků 1 až 8, přičemž patologický stav je zvolen ze skupiny sestávající z: Kaposiho sarkomu a angiogeneze, nikolineoplastického angioproliferativního onemocnění oka, ledvin, cévního systému či pokožky, jako například z diabetické retinopatie, retrolentální fibroplazie, trachomu, cévního glaukomu, lupénky, imunitního a neimunitního zánětu, atherosklerózy, keloidu; benigních a maligních nádorů měkkých tkání, chrupavek, kostí a krve; autoimunitních onemocnění obecně a zejména systémového lupus erythematodes, sklerodermu, revmatoidní arthritidy, lupénky, thyreoiditidy, vředovité rektokolitidy a Crohnova onemocnění, Goodpasturova syndromu, systémové vaskulitidy, Sjógrensova syndromu, primitivní žlučové cirhózy, zánětlivých onemocnění a zejména chronického zánětu, spojeného s alergiemi a s virovými infekčními, bakteriálními nebo parazitickými prostředky, včetně Castelmannovy multicentrické nemoci.·· • ·- 72 ·· ···· ·« • · ·© • t • · · • · • · · • · ··<·· ·♦ · • · · • · · · • · ···· • · · ·· ·
- 10. Použití podle nároku 9, přičemž inhibitor proteázy viru lidské imunodeficience je asociován s protizánětlivými, protiangiogenními nebo protinádorovými léčivy.
- 11. Použití podle nároku 1 až 10 u subjektů, infikovaných nebo neinfikovaných virem lidské imunodeficience.
- 12. Použití podle nároků 1 až 11, přičemž léčivo se podává způsobem, zvoleným z orálního, intravenózního, intramuskulárního, subkutánního, intradermálního, intraperitoneálního, intratekálního, intrapleurálního, intrauterinního, transmukosálního, rektálního, vaginálního, intralezálního nebo perkutánního podání.
- 13. Způsob pozměnění, modulace biologických procesů zahrnujících buněčnou migraci a invazi, infiltraci tkáně a aktivitu molekul účastnících se těchto buněčných dějů, včetně metaloproteáz matrixu a thrombospondinu, vyznačující se t í m , že se při tomto způsobu podává účinné množství alespoň jedné sloučeniny, zvolené ze skupiny inhibitorů proteázy viru lidské imunodeficience.
- 14. Způsob léčby patologických stavů zahrnujících buněčnou migraci a invazi, infiltraci tkáně a aktivitu molekul účastnících se těchto buněčných dějů, včetně metaloproteáz matrixu a thrombospondinu, v y z n a č u j í c í se t í m , že se při tomto způsobu podává léčebně účinné množství alespoň jedné sloučeniny, zvolené ze skupiny inhibitoru proteázy viru lidské imunodeficience.
- 15. Způsob léčby subjektu, který trpí stavem, nebo je náchylný ke stavu, jenž lze léčit nebo mu lze předcházet blokováním migrace/invaze buněk zvolených ze skupiny, sestávající z: endotheliálních, neoplastických, zánětlivých nebo imunokompetentních buněk, vyznačující s e t í m , že se při tomto způsobu podává léčebně účinné • · • · zvolené ze skupiny inhibitorů- 73 množství alespoň jedné sloučeniny, proteázy viru lidské imunodefícience.
- 16. Způsob podle nároku 15, v y z n a č u j í c í se t í m , že výsledkem buněčné migrace/invaze je infiltrace tkáně a/nebo tvorba otoku.
- 17. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že blokování se dosáhne inhibici nebo modulací, pozměněním molekul a proteolytických enzymů, zvolených ze skupiny, sestávající z: metaloproteáz matrixu včetně metaloproteáz matrixu typu 2, stromelysinů a matrilysinu; enzymů aktivujících metaloproteázy matrixu; thrombospondinu; bazického růstového faktoru fibroblastů a růstového faktoru cévního endothelu samotných nebo vzájemně asociovaných a z Tat, proteinu viru lidské imunodeficience samotného nebo v přítomnosti bazického růstového faktoru fibroblastů.
- 18. Způsob podle nároku 17, v y z n a č u j í c í s e t í m , že proteolytickými enzymy jsou metaloproteázy matrixu.
- 19. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že stavem, který má být léčen nebo kterému se má předejít, je alespoň jeden z následujících patologických stavů: zánětlivých, autoimunitních, neoplastických a nikoli-neoplastických angioproliferativních onemocnění.
- 20. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že inhibitor proteázy viru lidské imunodeficience má protiangiogenní, protinádorovou, protizánětlivou aktivitu a/nebo aktivitu působící proti vzniku otoků k léčbě Kaposiho sarkomu, nádorů a nikoli-neoplastických angioproliferativních, zánětlivých a autoimunitních onemocnění.• ·- 74 ·· ···«
- 21. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že inhibitor proteázy viru lidské imunodeficience se zvolí z následujících sloučenin: indinaviru, saquinaviru, ritonaviru, nelfinaviru, amprenaviru, lopinaviru a ritonaviru, odpovídajících farmaceuticky přijatelných derivátů, chemických analogů a směsí takových sloučenin.
- 22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že sloučeniny se podávají v následujících dávkách: indinavir: 600 mg/den, 1 200 mg/den, 2 400 mg/den a 4 800 mg/den; saquinavir: 900 mg/den, 1800 mg/den, 3 600 mg/den a 7 200 mg/den.
- 23. Způsob podle nároku 15, vyznačující se t i m , že patologický stav se zvolí ze skupiny, sestávající z: Kaposiho sarkomu a angiogeneze, nikoli-neoplastického angioproliferativního onemocnění oka, ledvin, cévního systému, pokožky jako například z diabetické retinopatie, retrolentální fibroplazie, trachomu, cévního glaukomu, lupénky, imunitního a neimunitního zánětu, atherosklerózy, keloidu; benigních a maligních nádorů měkkých tkání, chrupavek, kostí a krve; autoimunitních onemocnění obecně a zejména systémového lupus erythematodes, sklerodermu, revmatoidní arthritidy, lupénky, thyreoiditidy, vředovité rektokolitidy a Crohnova onemocnění, Goodpasturova syndromu, systémové vaskulitidy, Sjógrensova syndromu, primitivní žlučové cirhózy, zánětlivých onemocnění a zejména chronického zánětu spojeného s alergiemi a s virovými infekčními bakteriálními nebo parazitickými prostředky, včetně Castelmannovy multicentrické nemoci.
- 24. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že inhibitor proteázy viru lidské imunodeficience je asociován s protizánětlivými, protiangiogenními nebo protinádorovými léčivy.• · ·· · · ·· ··· • ·· · · · · · · · · • · · · · · ···· • · · · · · · · · ····· ~7 CZ ··· ··· ··· i ·· ···· ·· ···· ·· ·
- 25. Způsob podle nároku 15, vyznačující se t í m , že se týká subjektů, infikovaných nebo neinfikovaných virem lidské imunodeficience.
- 26. Způsob podle nároku 15, vyznačující se t í m , že léčivo se podává způsobem, zvoleným z orálního, intravenózního, intramuskulárního, subkutánního, intradermálního, intraperitoneálního, intratekálního, intrapleurálního, intrauterinního, transmukosálního, rektálního, vaginálního, intralezálního nebo perkutánního podání.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT2001RM000210A ITRM20010210A1 (it) | 2001-04-18 | 2001-04-18 | Uso degli inibitori della proteasi del virus dell'immunodeficienza umana (hiv)nella terapia del sarcoma di kaposi, dei tumori e delle malatt |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20033113A3 true CZ20033113A3 (cs) | 2004-07-14 |
Family
ID=11455472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20033113A CZ20033113A3 (cs) | 2001-04-18 | 2002-04-18 | Farmaceutický prostředek obsahující inhibitory proteázy |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060088545A1 (cs) |
| EP (1) | EP1401447A2 (cs) |
| CN (1) | CN1700916A (cs) |
| AP (1) | AP2003002901A0 (cs) |
| BG (1) | BG108368A (cs) |
| CA (1) | CA2447748A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20033113A3 (cs) |
| EA (1) | EA006678B1 (cs) |
| EE (1) | EE200300507A (cs) |
| HU (1) | HUP0401199A2 (cs) |
| IT (1) | ITRM20010210A1 (cs) |
| MX (1) | MXPA03010380A (cs) |
| SK (1) | SK14212003A3 (cs) |
| WO (1) | WO2002087583A2 (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002346594A1 (en) * | 2001-12-14 | 2003-06-30 | Cedars-Sinai Medical Center | Use of hiv-1 protease inhibitors and their derivatives in the treatment of inflammation |
| US7812034B2 (en) * | 2003-11-04 | 2010-10-12 | City Of Hope | Method of using protease inhibitors for the treatment of liposarcomas |
| US20090010990A1 (en) * | 2007-06-20 | 2009-01-08 | Little Marisa A | Process for depositing calcium phosphate therapeutic coatings with controlled release rates and a prosthesis coated via the process |
| US8741924B2 (en) | 2010-05-06 | 2014-06-03 | The Feinstein Institute For Medical Research | Compounds and methods for treatment of systemic lupus erythematosus |
| US20130317040A1 (en) * | 2010-12-22 | 2013-11-28 | The Feinstein Institute Of Medical Research | Methods for treating systemic lupus erythematosus using hiv protease inhibitors |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2779653B1 (fr) * | 1998-06-11 | 2002-12-20 | Inst Nat Sante Rech Med | Utilisation de composes modulateurs du proteasome en therapie |
| AU1930900A (en) * | 1998-12-04 | 2000-06-26 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Use of protease inhibitors to modulate cellular pathways, immunity and therapiesassociated therewith |
-
2001
- 2001-04-18 IT IT2001RM000210A patent/ITRM20010210A1/it unknown
-
2002
- 2002-04-18 MX MXPA03010380A patent/MXPA03010380A/es not_active Application Discontinuation
- 2002-04-18 CZ CZ20033113A patent/CZ20033113A3/cs unknown
- 2002-04-18 WO PCT/EP2002/004303 patent/WO2002087583A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-04-18 EP EP02766632A patent/EP1401447A2/en not_active Ceased
- 2002-04-18 HU HU0401199A patent/HUP0401199A2/hu unknown
- 2002-04-18 SK SK1421-2003A patent/SK14212003A3/sk unknown
- 2002-04-18 CA CA002447748A patent/CA2447748A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-18 CN CNA028121260A patent/CN1700916A/zh active Pending
- 2002-04-18 AP APAP/P/2003/002901A patent/AP2003002901A0/en unknown
- 2002-04-18 EA EA200301130A patent/EA006678B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-04-18 US US10/549,958 patent/US20060088545A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-18 EE EEP200300507A patent/EE200300507A/xx unknown
-
2003
- 2003-11-18 BG BG108368A patent/BG108368A/bg unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002087583A3 (en) | 2002-12-19 |
| ITRM20010210A0 (it) | 2001-04-18 |
| EA006678B1 (ru) | 2006-02-24 |
| EE200300507A (et) | 2004-02-16 |
| HUP0401199A2 (hu) | 2004-12-28 |
| US20060088545A1 (en) | 2006-04-27 |
| ITRM20010210A1 (it) | 2002-10-18 |
| EP1401447A2 (en) | 2004-03-31 |
| BG108368A (bg) | 2005-01-31 |
| WO2002087583A2 (en) | 2002-11-07 |
| AP2003002901A0 (en) | 2003-12-31 |
| WO2002087583B1 (en) | 2003-11-20 |
| CN1700916A (zh) | 2005-11-23 |
| EA200301130A1 (ru) | 2004-04-29 |
| MXPA03010380A (es) | 2004-03-16 |
| SK14212003A3 (sk) | 2004-06-08 |
| CA2447748A1 (en) | 2002-11-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cruz et al. | Leishmania/HIV co-infections in the second decade | |
| JP3186759B2 (ja) | がん細胞の多剤耐性を消失させるための薬剤 | |
| Badou et al. | Tat protein of human immunodeficiency virus type 1 induces interleukin-10 in human peripheral blood monocytes: implication of protein kinase C-dependent pathway | |
| Toschi et al. | Human immunodeficiency virus protease inhibitors reduce the growth of human tumors via a proteasome‐independent block of angiogenesis and matrix metalloproteinases | |
| KR20160132489A (ko) | 섬유증 치료용 세니크리바이록 | |
| EP1113812A1 (en) | Method and compositions for preventing or reducing hiv infection by use of inhibitors for leucine aminopeptidase | |
| CN100488500C (zh) | Cox-2抑制剂预防免疫缺陷的用途 | |
| Luplertlop et al. | MMP cellular responses to dengue virus infection-induced vascular leakage | |
| Demarchi et al. | Effect of HIV protease inhibitors on New World Leishmania | |
| WO2017100276A1 (en) | Compositions and methods for treatment, amelioration, and prevention of diabetes-related skin ulcers | |
| WO2017042944A1 (ja) | フィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の治療薬又は治療方法 | |
| US11517575B2 (en) | Use of minaprine to reduce tumor growth | |
| KR20180016410A (ko) | 항바이러스 활성 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 | |
| WO2000033654A1 (en) | Use of protease inhibitors to modulate cellular pathways, immunity and therapies associated therewith | |
| EP1420778B1 (en) | Use of mek inhibitors for treating virus induced hemorrhagic shock or fever | |
| Vlahakis et al. | HIV protease inhibitors modulate apoptosis signaling in vitro and in vivo | |
| CZ20033113A3 (cs) | Farmaceutický prostředek obsahující inhibitory proteázy | |
| Herrera et al. | Potential use of protease inhibitors as vaginal and colorectal microbicides | |
| Liu et al. | Protective effects of the soluble receptor for advanced glycation end‐products on Pyroptosis during myocardial ischemia‐reperfusion | |
| Diou et al. | Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication | |
| KR100294836B1 (ko) | 바이러스감염증예방치료제 | |
| JP7303631B2 (ja) | 膜受容体への結合による抗ウイルス免疫療法 | |
| AU2002338495A1 (en) | Use of HIV-protease inhibitors to block cell migration and/or invasion, tissue infiltration and oedema formation | |
| JP2023528196A (ja) | ウイルス感染症を予防又は治療するための化合物 | |
| RU2816314C1 (ru) | Виды комбинированной терапии для лечения рака |