EA004717B1 - АНТИИДИОТИПИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К a-ФЕТОПРОТЕИНУ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ЛИЗИСА КЛЕТОК - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в различных областях медицины и ветеринарии. Возможность лизиса измененных клеток достигается путем применения антиидиотипических антител к α-фетопротеину человека или животных in vivo и in vitro.

Description

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в различных областях медицины и ветеринарии.

Используемые в настоящее время методы воздействия на измененные, трансформированные клетки (химиотерапия, лучевая терапия) не избирательны и в одинаковой степени вредно действуют как на клетки, обуславливающие заболевание, так и на обычные, нормальные клетки организма.

Известно, что антитела обладают способностью избирательно связываться с клеточными рецепторами - антигенами и, при участии компонентов комплемента, вызывать лизис таких клеток-мишеней (А. Роит, Дж. Брестофф, Д. Мейл, Иммунология, М, Мир, 2000 г, стр. 61-62).

В настоящее время, интерес многих исследователей проявляется к особым рецепторам на поверхности клеток, служащих для взаимодействия с α-фетопротеином - белком, обнаруживаемым в организме человека и животных, при росте и делении клеток при эмбриогенезе, репаративных процессах (АЬе1еу 6.1. Тгаи8р1аи1 Рсу. 1974; ν. 20, рр. 3-37), а также при образовании некоторых видов опухолей (Со1отЬо М. Нера1о1оду 1994, Νο.20, ν.6, рр.1650).

Предполагается, что антитела к рецепторам α-фетопротеина могут вызвать цитотоксическое действие на измененные, трансформированные клетки, имеющие такие рецепторы.

Известны исследования ίη νίΐτο, указывающие на возможность оказания моноклональными антителами, избирательно связывающимися с рецептором к α-фетопротеину на поверхности опухолевых клеток, прямого цитотоксического действия.

Обнаружено, что антитела к рецептору αфетопротеина могут повышать противоопухолевый иммунитет, усиливая антителозависимую клеточную цитотоксичность клеток-эффекторов в отношении опухолевых клеток.

Введение в организм реципиента антител к рецепторам α-фетопротеина (структурно близким к антиидиотипическим антителам к αфетопротеину) может вызвать комплементзависимый лизис клеток, имеющих такие рецепторы (Северин С.Е., Родина А.В., Ницветов М.Б. и др. Моноклональные антитела к рецептору альфа-фетопротеина для регуляции противоопухолевого иммунитета. Тезисы Второй Международной Ассамблеи Новые Медицинские Технологии 2000. \\л\лт.ар1ека-ехро.ги).

Вместе с тем, иных сведений об использовании антиидиотипических антител к αфетопротеину для избирательного, комплементзависимого лизиса измененных клеток не обнаружено.

Сущность предлагаемого изобретения по использованию антиидиотипических антител для избирательного, комплемент-зависимого лизиса клеток, отличающихся по гистоморфологическим признакам от нормальных клеток, заключается в введении в организм реципиента антиидиотипических антител к α-фетопротеину человека или животных, причем в осуществлении комплементзависимого лизиса измененных клеток-мишеней участвуют компоненты комплемента, имеющиеся в крови и физиологических жидкостях организма реципиента, а при использовании антиидиотипических антител к α-фетопротеину наружно, для импрегнации слизистых тканей и кожи реципиента, дополнительно к антиидиотипическим антителам к αфетопротеину добавляют необходимые в этом случае компоненты комплемента.

В ходе экспериментальной проверки особенностей использования антиидиотипических антител к α-фетопротеину установлено, что указанные антитела проявляют сродство только к особым морфологическим структурам на поверхности измененных клеток и не проявляют специфичности к структурам клеточных поверхностей нормальных, не измененных клеток тканей человека и животных.

Предлагаемое использование антиидиотипических антител к α-фетопротеину человека и животных позволяет осуществлять ίη νίνο и ίη νίΐτο избирательный, комплементзависимый лизис клеток, отличающихся по гистоморфологическим признакам от нормальных клеток, в том числе опухолевых, без какого-либо влияния на другие, нормальные клетки организма.

Получают антиидиотипические антитела к α-фетопротеину известными методами, например, спиртовым фракционированием белков сыворотки крови по методу Кона (Сопп Е. 1. 1950), после предварительной иммунизации человека или животных клеточными рецепторами или антителами к генно-инженерному или природному α-фетопротеину.

Изобретение поясняется фотографиями, где на фиг. 1 показано сосудистое образование у пациента; на фиг. 2-5 представлена динамика процесса разрушения новообразования; на фиг. 6-9 - изменение новообразования при воздействии смеси из равных количеств антиидиотипических антител к α-фетопротеину и компонентов комплемента; на фиг. 10-15 - результаты инкубации клеток периферической крови больных лейкозом.

Используют антиидиотипические антитела к α-фетопротеину для избирательного, комплементзависимого лизиса клеток, отличающихся по гистоморфологическим признакам от нормальных клеток организма следующим образом.

Пример 1.

Больной Г., возраст 56 лет, (амбулаторная карта № 5117006), пациент поликлиники МВД г.

Алматы, стоит на учете у врача онколога.

Больному Г. в 1993 г. была проведена близкофокусная рентгенотерапия по поводу базалиомы кожи лба, справа.

В 1993 г. проведено оперативное лечение по поводу гиперкератоза левой ушной раковины, цитологическое заключение: плоскоклеточный рак.

При осмотре онкологом больного Г. в 1994 г. отмечалось два места гиперкератоза кожи на шее справа, которые к концу 1998 г. слились между собой в единое новообразование, размером 1,5 х 0,9 х 0,8 см, выступающее над уровнем кожи шеи, хорошо различимое на фиг. 1.

Кроме того, под кожей, на груди больного Г., в районе левого соска, имелось сосудистое образование размером 0,6 х 0,7 см, выступающее на 0,7 см (фиг. 1).

В период времени с 1994 г. по декабрь 1998 г. больному Г. лечения по поводу новообразований не проводилось.

Для воздействия на новообразования, локализованные на коже шеи и в районе левого соска больного Г., использовали смесь из равных количеств антиидиотипических антител к α-фетопротеину и полного набора компонентов комплемента.

Указанной смесью пропитывались небольшие марлевые тампоны, которые накладывались непосредственно на новообразования в районе шеи и соска, тампоны сверху покрывались полиэтиленовой пленкой для снижения скорости высыхания, закреплялись при помощи полосок лейкопластыря и оставались на теле на 2 ч.

Указанная процедура проводилась два раза в день в течение одного месяца.

В течение указанного периода времени происходило разрушение новообразования на шее больного Г. и отделение его верхней части от уровня кожи.

Динамика процесса разрушения новообразования на коже шеи показана на фиг. 2-5.

Микроскопическое исследование отделившейся части новообразования от кожи шеи показало наличие в изучаемом материале массы кератина с кальцинатами и подвергнутых лизису клеток - теней.

Опухолевых клеток в отделившейся части не найдено (биопсия № 500 от 29.01.1999 г.).

На основании результатов микроскопического исследования хирургически иссеченного основания новообразования на коже шеи поставлен диагноз: кератоакантома с дисплазией эпителия и начальной малигнизацией (биопсия № 1496 от 08.02.1999 г.).

На фиг. 6-9 показаны результаты месячного воздействия смеси из равных количеств антиидиотипических антител к α-фетопротеину и компонентов комплемента на новообразование на коже груди в районе левого соска больного Г.

Как видно из данных фиг. 6-9, в ходе воздействия смеси из антиидиотипических антител к α-фетопротеину и компонентов комплемента на новообразование в районе соска, изменений, в форме или его геометрических размерах не отмечено, так как оно находилось под нормальными, не измененными клетками эпителия кожи, на которые смесь из антиидиотипических антител к α-фетопротеину и компонентов комплемента не действует, т. е. имеет место избирательный лизис только измененных, опухолевых клеток и абсолютная нейтральность смеси из антиидиотипических антител к α-фетопротеину и компонентов комплемента к нормальным клеткам эпидермиса.

В ходе микроскопического исследования хирургически иссеченного новообразования под эпителиальными клетками кожи груди, в районе левого соска. установлено: изменение клеток ткани кровеносного сосуда - гемангиома (биопсия № 1496а от 08.02.99 г.).

Пример 2.

В экспериментах ίη νίνο по введению в организм антиидиотипических антител к αфетопротеину одной группе лабораторных крыс, из шести животных, с привитой асцитной опухолью яичников, подкожно, в течение трех дней вводили по 0,5 мл изотоничного раствора антиидиотипических антител козы против козьих антител к α-фетопротеину человека с концентрацией белка в растворе 0,5 мг/мл.

В качестве контрольных животных использовались крысы с привитой асцитной опухолью яичников, которым антиидиотипические антитела к α-фетопротеину не вводили.

На четвертый, пятый и шестой день от начала эксперимента забивали по две крысы из экспериментальной группы животных и по одному животному из контрольной.

Из тел животных, при помощи пункции, извлекались клетки опухолей, из которых готовились окрашенные мазки и исследовались под микроскопом для обнаружения разрушенных лизисом клеток.

Среди клеток асцитной опухоли яичников крыс из контрольной группы разрушенных клеток практически не наблюдалось, отмечалось присутствие в поле зрения одной-двух разрушенных клеток, и число таких разрушенных клеток не возрастало в последующие дни проведения эксперимента.

Среди клеток асцитных опухолей яичников, выделенных из тел забитых животных экспериментальной группы, на четвертый, пятый и шестой день эксперимента, отмечалось наличие клеток-теней - следов лизиса опухолевых клеток, причем число разрушенных лизисом клеток, в поле зрения микроскопа, нарастало к концу эксперимента и достигало 8% от числа не поврежденных клеток опухоли.

Примерно одинаковая динамика нарастания числа клеток, подвергнутых лизису, отмечалась для клеток асцитных опухолей яичников в каждой паре забитых крыс из экспериментальной группы.

Опыт проводили в двух повторностях, результаты которых совпадали между собой.

Таким образом, подкожное введение животным экзогенных, готовых антиидиотипических антител к α-фетопротеину, по принципу защиты организма сывороткой, приводит к лизису измененных, опухолевых клеток.

Работа по изучению возможности индукции в организме крыс с привитой асцитной опухолью яичников, собственных антиидиотипических антител к α-фетопротеину, по принципу вакцинации, проводилась с использованием очищенных козьих антител к α-фетопротеину.

Трем крысам с привитой асцитной опухолью яичников из экспериментальной группы внутрибрюшинно вводили стерильный раствор козьих антител к α-фетопротеину человека.

Другой группе, из трех крыс, с асцитной опухолью яичников, используемой в качестве контрольной, в тот же день внутрибрюшинно вводили равное количество стерильного раствора нормального человеческого γ-глобулина.

На восьмой день от начала эксперимента крысы забивались, из их тел извлекались клетки опухолей, среди которых под микроскопом выявлялись клетки-тени, являющиеся признаками процесса лизиса клеток опухоли.

Поиск поврежденных в результате лизиса клеток асцитной опухоли яичников среди крыс контрольной и экспериментальной групп показал, что в мазках клеток опухолей из контрольной группы имеются отдельные разрушенные клетки, тогда как в препаратах мазков клеток опухолей из экспериментальной группы крыс число разрушенных лизисом клеток асцитной опухоли яичников достигало 6%.

Эксперимент проводился в двух повторностях, имевших одинаковые результаты.

Этими экспериментами показана возможность индукции синтеза собственных антиидиотипических антител к α-фетопротеину, на принципах вакцинации, при введении в организм реципиента иммуногенных соединений, например антител или их РаЬ-фрагментов, для синтеза целевых (антиидиотипических к α-фетопротеину) иммуноглобулинов.

Пример 3.

Исследования цитолитической активности смеси из антиидиотипических антител к αфетопротеину и компонентов комплемента ίη νίίτο проводились на одиннадцати видах коротко живущих культур клеток, в число которых входили клетки периферической крови пятерых больных лейкозом, клетки перевиваемой мышиной опухоли Эрлиха, клетки асцитной опу холи яичников, кровь больных псориазом и анемией.

В качестве контроля, во всех случаях, использовались клетки периферической крови здоровых людей или гомологичных животных.

Образцы клеток крови смешивали с пятикратным по объему количеством питательной среды 199, в которую однократно вводили смесь из равных количеств антиидиотипических антител к α-фетопротеину и компонентов комплемента.

Инкубация препаратов клеток проводилась в СО₂ инкубаторе, при 36°С. В течение инкубации из образцов клеток, через каждые 0,5 ч брались аликвоты, из которых приготовлялись мазки, для окрашивания клеток и последующей микроскопии их морфологического состояния.

Установлено, что в культуре клеток периферической крови, взятой у больных псориазом, так же как и больных анемией, при инкубации их в смеси антиидиотипических антител к αфетопротеину и необходимых в этом случае компонентов комплемента, у отдельных клеток имеют место нарастающие, в течение времени инкубации морфологические изменения структуры, такие как увеличение размера их ядер и образование в них глыбчатых структур хроматина.

Однако гибели таких клеток в результате лизиса, в течение всего процесса инкубации не отмечалось.

Обнаружение в периферической крови таких клеток, морфологическое строение которых меняется от воздействия на них антиидиотипических антител к α-фетопротеину и компонентов комплемента, может служить диагностическим признаком наличия в исследуемом организме серьезных системных нарушений.

Результаты инкубации клеток периферической крови больных лейкозом показаны на фиг. 10-15.

В культуре клеток крови лейкозных больных, через три часа инкубации обнаружен избирательный лизис бластных (трансформированных) клеток, с появлением ядер-теней остается остров ядра в виде теневых очертаний - следы разрушенных лизисом клеток.

Таким образом, в препаратах крови лейкозных больных на фоне достаточного количества нормальных, не измененных клеток, выявлен эффект избирательного лизиса - гибели патологически измененных бластных клеток, выражающийся в виде остаточных теней - контуров, не воспринимающих основной краситель Гимза-Романовского, окрашивающий ядерные структуры.

Как видно из данных фиг. 10-15, антиидиотипические к α-фетопротеину антитела и компоненты комплемента избирательно действуют только на отдельные клетки крови боль7 ных лейкозом, тогда как другие, находящиеся рядом клетки, остаются неповрежденными.

Неповрежденными, в течение всего времени инкубации, оставались и клетки крови доноров.

В культурах клеток, состоящих только из измененных клеток, культивируемые раковые клетки человека или животных, наблюдалась тотальная гибель клеток в результате их лизиса.

В большинстве случаев, лизис измененных клеток отмечался после трех часов инкубации их с антиидиотипическими антителами к αфетопротеину и компонентами комплемента, однако гибель клеток асцитной опухоли яичников наблюдалась только после шести часов воздействия на них испытуемой смеси из антител и

Таким образом, антиидиотипические антитела к α-фетопротеину в сочетании с компонентами комплемента позволяют проводить ΐη νΐΐΓΟ и ΐη νίνο избирательный лизис измененных клеток тканей человека и животных, имеющих на поверхности клеточных стенок структуры, отличающие их от обычных клеток организма, что может быть использовано в целях диагностики, профилактики и лечения заболеваний, а также для применения в научных экспериментах.

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   Применение антиидиотипических антител к α-фетопротеину человека или животных для лизиса измененных клеток ΐη νίνο и ΐη νΐΐΓΟ.

   компонентов комплемента.