EA003250B1 - Новые белки, связывающиеся с рецептором 1 интерферона, кодирующая их днк и способы модуляции клеточного ответа на интерфероны - Google Patents

Abstract

Были выделены новые белки IR1B1 и IR1B4, которые связываются с рецептором интерферона типа I IFNAR1 и участвуют в клеточном ответе на интерфероны. ДНК, кодирующую такие белки в смысловой или антисмысловой ориентации, можно вводить для усиления или ингибирования клеточного ответа на интерфероны. Антитела к указанным белкам можно использовать для выделения нового белка или иммунологического анализа.

Description

Область техники

Настоящее изобретение в целом относится к молекулярным механизмам действия интерферона, в частности к новым белкам, связывающимся с рецептором 1 интерферона, к кодирующим их молекулам рекомбинантной ДНК и к способам модуляции клеточного ответа на интерферон.

Предпосылки изобретения

Интерфероны типа I (подтипы ΙΡΝ -а и -β) оказывают плейотропное действие на клетки, такие как ингибирование репликации вирусов (антивирусное действие), ингибирование пролиферации клеток (противоопухолевое действие) и модулирование иммунной активности клеток (иммунорегуляторное действие). Эти разнообразные действия интерферонов (ΙΡΝ) связывают с морфологическими и биохимическими модификациями клеток (см. Рсус1.. 1984).

Действие интерферонов опосредуется через видоспецифические рецепторы. Для интерферонов типа I идентифицированы две цепи трансмембранных рецепторов: ΙΡΝΑΚ1 (Ьхс с1 а1., 1990) и ΙΡΝΛΚ.2-2 (иди ΙΡΝΛΚ.2-ο. ЭотапкИ с1 а1., 1995). В трансдукцию сигнала, генерируемого ΙΡΝ-α, β, ω принимает участие протеинтирозинкиназа семейства киназ бапиз Дак) и факторы транскрипции семейства 81а1 (Эагпс11 с1 а1.,

1994) . Белки путей Лак-ЗЮ: активируются путем связывания с интрацитоплазматическими (1С) доменами цепей рецепторов ΙΡΝΆΒ1 и ΙΕΝΛΚ.2. К белкам, связывающимся с Юдоменом рецептора ΙΡΝΆΒ1, относятся 1у1<2 и 81а12 (АЬгатоνίοΐι с1 а1., 1994). Затем 8(а(2 вместе с 81а11 образует интерферониндуцируемый транскрипционный комплекс Ι8ΟΡ3, который активирует интерферониндуцируемые гены (Ьеипд с1 а1.,

1995) . Транскрипционные комплексы, содержащие 8(а(3, также индуцируются интерфероном ΙΡΝ-β (Наггосй е1 а1., 1994), при этом происходит интерферонзависимое связывание 81а13 с Ю-доменом рецептора ΙΡΝΆΒ1 (Уапд е1 а1.,

1996) . Протеинтирозинфосфатаза РТР1С и Ό обратимо связывается с рецептором ΙΡΝΆΚ1 при введении интерферона (Эшзб е1 а1., 1995а). Кроме того, две серин/треонин-протеинкиназы, а именно киназа МАР ЕКК2 с молекулярной массой 48 кДа (Эау1б е1 а1., 1995Ь) и сАМРактивируемая протеинкиназа А (Όηνίά е1 а1., 1996), связываются с выделенными ближайшими к мембране 50 остатками Юдомена рецептора ΙΡΝΑΚΤ. Поэтому Юдомены рецептора интерферона типа Ι служат в качестве сайтов причаливания для множества белков, которые вызывают и регулируют биологическое действие интерферонов на клетки.

Двугибридный скрининг в дрожжах является эффективным методом идентификации новых белков, которые связываются с выявленными полипептидными последовательностями (Е1е1б8 апб 8оп§. 1989). Этот метод можно крат ко описать следующим образом. Двугибридный скрининг осуществляют путем трансфекции дрожжевых клеток (а) плазмидной ДНК, в которой выявленный полипептид (затравка) слит с ДНК-связывающим доменом фактора транскрипции Оа14, и (Ь) библиотекой кДНК, слитой с доменом активации Оа14 в плазмиде рАСТ. Дрожжевые клетки, трансфецированные кДНК, кодирующей белок, который связывается с полипептидной затравкой, затем восстанавливают активность Оа14. Наличие такого белка, связывающегося с полипептидной затравкой, выявляют путем экспрессии ферментативной активности такого фермента, как β-галактозидаза, в конструкции ΟΑΜ-ΠιεΖ. которую предпочтительно вводят в геном дрожжей. Из положительных дрожжевых клонов, полученных в этом испытании, можно выделить плазмиду рАСТ, определить нуклеотидную последовательность ее вставки и идентифицировать кодируемый ею белок. С помощью этого метода можно идентифицировать новые белки, которые взаимодействуют с Ю-доменом рецепторов цитокина (Во1бш е! а1., 1995).

В этом описании изобретения не предполагается полное цитирование документов для подтверждения того, что такой документ имеет непосредственное отношение к предшествующему уровню техники или к патентоспособности формулы изобретения настоящей заявки. Любая ссылка на содержание или дату документов основана на информации, имевшейся в распоряжении заявителей во время подачи заявки, и не гарантирует точность справки.

Краткое изложение существа изобретения

Настоящее изобретение относится к двум новым белкам человека, названным ΙΚ1Β1 и ΙΚ.1Β4, которые являлись рецепторами 1 интерферона (ΙΡΝΑΒ1), и к ДНК, кодирующей эти два белка. Каждый из белков ΙΚ1Β1 и ΙΡ1Β4 взаимодействуют с интрацитоплазматическим ДС) доменом рецептора ΙΡΝΑΒ1 и опосредуют клеточный ответ на интерферон.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантной молекуле ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ΙΒ1Β1 или белок ΙΡ1Β4 либо их фрагменты, а также к кодируемым ею белкам. Нуклеотидная последовательность в рекомбинантных молекулах ДНК, кодирующая белок ΙΡ1В1 или ΙΡ1Β4 либо их фрагменты, связана с промотором путем сшивки в смысловой или антисмысловой ориентации.

Введение в опухоль рекомбинантной молекулы ДНК, содержащей промотор, связанный путем сливки с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует новый белок, связывающийся с рецептором ΙΡΝΑΒ1 в смысловой ориентации, непосредственно в опухолях увеличивает ответ лечения раковых заболеваний экзогенным интерфероном.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу пролонгации жизнеспособности тканевого лоскута путем введения рекомбинантной молекулы, содержащей промотор, связанный путем сливки с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует новый белок, связывающийся с рецептором ΙΕΝΆΚ1, или с ее фрагментом в антисмысловой ориентации, в трансплантируемую ткань до ее трансплантации больному.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим такую ДНК, РНК или белок, и к терапевтическим способам для использования того же.

Настоящее изобретение относится также к антителам, специфичным к новым белкам по настоящему изобретению.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано взаимодействие белка ΙΕ1Β1 с 1С-доменом рецептора ΙΕΝΆΚ.1, измеренное методом двугибридного анализа генетического взаимодействия в дрожжах. В рамке, расположенной в нижней части рисунка, изображена кДНК-вставка в плазмиде рАСТ в сочетании с разными затравками.

На фиг. 2 показано взаимодействие белка ΙΕ1Β4 с 1С-доменом рецептора ΙΕΝΑΚ.1, измеренное методом двугибридного анализа генетического взаимодействия в дрожжах. В рамке, расположенной в нижней части рисунка, изображена кДНК-вставка в плазмиде рАСТ в сочетании с разными затравками.

На фиг. 3 показана нуклеотидная последовательность (8ЕО ΙΌ № 1) и аминокислотная последовательность (8ЕО ΙΌ № 2) белка ΙΕ1Β1.

На фиг. 4 показана гомология и дано сравнение аминокислотной последовательности белка ΙΕ1Β1 (8ЕО ΙΌ № 2) с аминокислотными последовательностями двух кальцийсвязывающих белков, кальцинейрина В (аббревиатура ί’ΑΕΒ. 8ЕО ΙΌ № 3) и кальтрактина (аббревиатура САТЕ, 8ЕО ΙΌ № 4). Идентичные аминокислоты в белках ΙΕ1Β1 и САБ-Β или между САБ-Β и САТЕ изображены символом | между ними. Идентичность между ΙΕ1Β1 и САТЕ, но не с ΟΆΕ-Β, изображена символом расположенным между ними. Области, показанные жирным шрифтом, являются кальцийсвязывающими доменами фактора элонгации типа спираль-петля-спираль.

На фиг. 5 показаны результаты назернблоттинга мРНК и рРНК 188 белка ΙΕ1Β1 (нижняя строка) в миеломных клетках и2668 человека, гибридизированных с кДНК белка ΙΕ1Β1, а также быстрая и временная индукция белка ΙΕ1Β1 при обработке клеток интерфероном ΙΕΝα8 или ΙΕΝ-β в течение 2 или 18 ч. Первая строка относится к контрольной культуре, не подвергавшейся обработке интерфероном, измерение в которой производилось через 2 ч.

На фиг. 6А и 6В приведены результаты электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, показывающие ίη νίίτο взаимодействие белка ΙΕ1Β4 с выделенным ГСдоменом рецептора IΕNΑΚ.1 (фиг. 6 А) и с клеточными экстрактами из мембран клеток человека И2668 и И266Е (фиг. 6В). На фиг. 6А показано, что меченые [²⁵8]метионином продукты трансляции с транскриптами сигнального белка ΙΕ1Β4 ίη νίίτο или без них используют для иммунопреципитации (10 мкл) с антисигнальными гранулами М2 (серии 1 и 4) или подвергают взаимодействию (50 мкл) с глутатионовыми гранулами, нагруженными глутатион-8трансферазой (О8Т), слитой с ГС-доменом рецептора IΕNΑЕ1 длиной 100 аминокислот (серии 2 и 5), или нагруженными только О8Т (серии 3 и 6). Гранулы инкубируют в течение ночи при температуре 4°С (конечный объем 100 мкл) и промывают; белки, элюированные додецилсульфатом натрия (8Ό8), кипятят в восстановительных условиях и анализируют посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. На фиг. 6В клетки И2668 (серия 1) или клетки И266Е (серия 2) экстрагируют буфером Бриджа и антипротеазами (ΑЬ^атον^сй с1 а1., 1994) и 0,35 мл (10⁷ клеток) инкубируют с 75 мкл меченых [³⁵8]метионином продуктов трансляции транскриптов сигнального белка ΙΕ1Β4 в течение ночи при температуре 4°С. В течение 2,5 ч добавляют моноклональное антитело Е3 против IΕNΑΚ.1, иммобилизованное на гранулах белка О (25 мкл), промывают в буфере Бриджа и элюируют додецилсульфатом натрия, после чего проваренные и восстановленные белки анализируют посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Аналогично вышеуказанным условиям выполняют контрольное испытание с использованием антисигнальных гранул М2 (серия 3). Высушенные гели проявляют в фосфорном томографе. В первых трех сериях, показанных на фиг. 6А, при осуществлении реакции трансляции ίη νίίτο не добавляют мРНК белка ΙΕ1Β4. Во вторых трех сериях, приведенных на фиг. 6А, мРНК, кодирующую белок ΙΕ1Β4, слитый с сигнальным белком, транслируют в системе ίη νίίτο.

На фиг. 7 показан нуклеотид (8ЕО ΙΌ № 7) и процессированная аминокислотая последовательность (8БО ΙΌ № 8) белка ΙΕ1Β4.

На фиг. 8 дано сравнение аминокислот белков ΙΕ1Β4 (8ЕО ΙΌ № 8) и РЕМТ1 (8ЕО ΙΌ № 9) и указаны их различия.

На фиг. 9 дано сравнение аминокислот белков ΙΕ1Β4 и НСР-1 (8ЕО ΙΌ № 10) и указаны их различия.

На фиг. 10 приведены результаты анализа метилтрансферазы. Экстракты клеток И2668 подвергают взаимодействию с гранулами, покрытыми белком А и антителом против МЛАГС (серия 1) или только белком А (серия 2). Активность метилтрансферазы измеряют путем мечения гистонов ¹⁴С(метил)-8-аденозилметионином и анализа радиоактивности в полосе гистона посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.

На фиг. 11 приведены результаты анализа активности белка аргининметилтрансфераза в клетках И2668. В серии 1 активность белка аргининметилтрансфераза клеток И2668 человека измеряют путем метилирования пептида К.1 с последовательностью 8ЕО ГО № 11. В серии 2 добавляют антисмысловой олигонуклеотид последовательности 8ЕО ГО № 12, комплементарный последовательности нуклеотидов 12-33 рядом с инициирующим кодоном кДНК белка 1К1В4. В серии 3 добавляют соответствующий смысловой олигонуклеотид. Очевидно, что антисмысловой олигонуклеотид существенно ингибирует активность белка аргининметилтрансфераза, в то время как контрольный смысловой олигонуклеотид оказывает незначительное действие.

На фиг. 12 изображен график, показывающий подавление роста клеток И2668 человека в ответ на обработку интерфероном ΙΕΝ-β в присутствии или при отсутствии антисмыслового олигонуклеотида, представленного на фиг. 11 (А8-1), соответствующего смыслового олигонуклеотида (8-3) и другого антисмыслового олигонуклеотида, направленного к середине кДНК белка 1К1В4 (А8-2). Плотность клеток определяют в количественном отношении при помощи колориметрического анализа с использованием голубого Аламар (см. пример 7), уменьшение плотности клеток высчитывают в процентах относительно необработанных контрольных лунок и на основании полученных данных строят график подавления роста.

Подробное описание изобретения

В основе настоящего изобретения лежит открытие двух новых белков человека, которые взаимодействуют с интрацитоплазматическим доменом (1С) цепи ΙΕΝΑΚ1 рецептора интерферона типа 1 (ΙΡΝ-α, β или ω). Эти белки определены в этом описании изобретения как белок 1, связывающийся с рецептором интерферона (1К1В1), и белок 4, связывающийся с рецептором интерферона (1К1В4). Взаимодействие этих двух новых белков с рецептором ΙΕΝΑΚ1 продемонстрировано посредством двугибридного генетического испытания в дрожжах, при осуществлении которого трансфекция репортерного штамма дрожжей 8ΕΥ526 (Ваг1е1 с1 а1., 1993) кДНК белка Ж.1В1 или Ж.1В4, слитой с активирующим доменом Са1 4, вызывает активность βгалактозидазы только тогда, когда в качестве затравки используется 1С-домен рецептора ΙΕΝΑΚ1 (слитый с ДНК-связывающим доменом Са14).

Последовательность кДНК белка ΙΚ1Ε1 кодирует полипептид, содержащий 191 аминокислоту. Компьютерные исследования базы данных по структуре последовательности пока зывают, что 1К1В1 является новым белком, который характеризуется четко выраженной гомологией, например, кальцийсвязывающими сайтами (фактор элонгации), с такими кальцийсвязывающими белками, как кальцинейрин β и кальтрактин. Кальцинейрин β (Сиепш с1 а1., 1989) является субъединицей серин/треонинфосфатазы с молекулярной массой 19 кДа, которая играет важную роль в активации транслокации фактора транскрипции ΝΡΑΤ к ядру Тлимфоцитов и ингибируется такими иммуносупрессивными лекарственными средствами, как циклоспорин. Кальтрактин (Ьее апб Ниапд, 1993), белок с молекулярной массой 21 кДа, является цитоскелетсвязанным белком, обнаруженным в центросомах, и имеет отношение к перемещению хромосом во время митоза, и более обобщенно, в организационных центрах микротрубочек. Таким образом, белок ΙΚ1Ε1 является новым членом семейства кальцийрегулируемых белков, в которое входят кальцинейрин и кальтрактин.

Весьма удивительным является то, что ген белка 1К1В1 быстро активируется в клетках человека при лечении интерфероном. Поэтому он является первым примером кальцийсвязывающего белка, который индуцируется интерфероном. Поскольку ионы кальция регулируют морфологию, адгезию и деление клетки, модуляция активности белка 1К1В1 в клетках может влиять на реакцию нормальных и злокачественных клеток на интерферон. Роль белка 1К1В1 в опосредовании действия интерферона в клетках подкрепляется взаимодействием белка 1К1В1 с ГО-доменом цепи рецептора интерферона.

Помимо того, что в результате компьютерных исследований базы данных по структуре последовательности установлено, что белок 1К1В4 является новым белком аналогично белку 1К1В1, обнаружено также, что последовательность белка 1К1В4 гомологична ферментам, которые используют 8-аденозилметионин для метилирования остатков аргинина в белках и определяются как белки аргининметилтрансфераза (РКМТ1; Кадап апб С1агке, 1994; Ьт е1 а1., 1996). Установлено, что белок ΙΡ1Ε4 связывается непосредственно с ГО-доменом рецептора ΙΡΝΑΚ1 1п νίίτο, и структурная связь активности РКМТ с цепью ΙΡΝΑΚ рецептора ΙΡΝ-α, β, выделенного из клеток человека, продемонстрирована метилированием гистонов. При добавлении к культурам клеток человека антисмысловых олигодезоксинуклеотидов из кДНК белка ГК1В4 происходит снижение активности РКМТ. Миеломные клетки человека, обработанные аналогичным образом, характеризуются гораздо меньшей реакцией на интерферон, о чем свидетельствует подавление роста. Поэтому белки ΙΚ1Ε4 и РКМТ непосредственно определяют путь подавление рецепторами интерферона роста опухолевых клеток и другие функции рецеп003250 торов интерферона. Известными субстратами РКМТ является ряд РНК- и ДНК-связывающих белков, в частности гетерологичные ядерные рибонуклеопротеины (йиЯЫР). Рибонуклеопротеины участвуют в переносе мРНК из ядра в цитоплазму, поочередном сплайсинге пре-мРНК и посттранскрипционной регуляции (Ъш апб ОгсуГи55. 1995). Таким образом, новая кДНК белка 1КТВ4/РКМТ человека и белки, обнаруженные благодаря их связыванию с рецептором интерферона, можно использовать для модификации реакции клеток человека или животного на интерферон.

Молекула рекомбинантной ДНК по настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок 1К.1В1 или 1К.1В4 либо его фрагмент, и может использоваться для усиления клеточного ответа на интерферон путем увеличения экспрессии кДНК белка 1К.1В1 или 1К.1В4 или снижения клеточного ответа на интерферон путем уменьшения экспрессии белка 1К.1В1 или 1К.1В4 в молекулах антисмысловой РНК.

Увеличение экспрессии кДНК белка 1К.1В1 или 1К.1В4 ίη νίνο полезно при лечении раковых заболеваний, так как повышенный клеточный ответ на интерферон подавляет рост злокачественных клеток и усиливает ответ на лечение экзогенным интерфероном. Для увеличения экспрессии белков 1К.1В1 и 1К.1В4 ίη νίνο в том месте, где необходимо усилить клеточный ответ на интерферон, экспрессирующие векторы, содержащие кДНК белка 1К.1В1 или 1К.1В4, связанную путем сшивки в смысловой ориентации с сильным структурным промотором, можно вводить непосредственно в указанное место, например, в опухоли мозга или узелки метастазов опухоли (например, меланома или рака молочной железы).

И наоборот, уменьшение экспрессии белков 1К.1В1 или 1К.1В4 ίη νίνο может быть полезно для пролонгации жизнеспособности тканевого лоскута, так как отторжение этих трансплантатов в организме хозяина опосредовано антигенами гистосовместимости (МНС класс I), образование которых стимулируется интерфероном. При введении кДНК белков 1К.1В1 или 1К.1В4 либо их фрагментов, перенесенной на приемлемый вектор и связанной путем сшивки в антисмысловой ориентации с промотором, в клетки трансплантируемой ткани экспрессия антисмысловой РНК ведет к расщеплению мРНК белков 1К.1В 1 или 1К.1В4 (или смысловой РНК для белков 1К.1В1/1К.1В4) и последующему уменьшению уровней белков 1К.1В 1 или 1К.1В4 в клетках.

Антисмысловая РНК транскрибируется от промотора в обратном направлении, связанного путем сшивки с кодирующей последовательностью, ориентированной в антисмысловом направлении, то есть в противоположном направлении от нормальной или смысловой ориента ции ДНК и ее транскрибированной смысловой РНК (мРНК). Экспрессия антисмысловой РНК, которая комплементарна смысловой РНК, является эффективным способом регуляции биологической функции молекул РНК. Благодаря образованию стабильного дуплекса между смысловой РНК и антисмысловой РНК транскрипт нормальной или смысловой РНК теряет свою активность и становится нетранслируемым.

Молекулы рекомбинантной ДНК, входящие в объем настоящего изобретения, содержат кДНК белков 1К.1В1 или 1К.1В4 либо их фрагменты, связанные путем сшивки с промотором смысловой или антисмысловой ориентации. Термин промотор означает последовательность, состоящую из двухцепочечной ДНК или РНК, которая способна связывать РНКполимеразу и стимулировать транскрипцию связанной путем сшивки последовательности нуклеотидов. Таким образом, последовательность ДНК должна быть активно связана с последовательностью промотора, если промотор способен воздействовать на транскрипцию последовательности ДНК независимо от ориентации этой последовательности.

В качестве промоторов, регулирующий транскрипцию, можно использовать любые промоторы, действующие в клетках-хозяевах и клетках-мишенях. Примерами промоторов, действующих в клетках млекопитающих, являются ранний промотор 8У40, главный поздний промотор аденовируса, промотор тимидинкиназы симплекса герпеса (Н8У), промотор ЬТВ саркомы Роуса (К.8У), ранний промотор цитомегаловируса человека (СМУ), промотор ЬТК. вируса опухоли молочной железы мышей (ММТУ), протомор интерферона β, промотор белка 70 теплового шока 70 (118Р70) и многие другие, хорошо известные в этой области.

Промотор, связанный путем сшивки с кДНК белка 1К.1В1 или 1К.1В4 в смысловой ориентации с целью экспрессии указанных белков, предпочтительно является сильным структурным промотором. Это обеспечивает высокий уровень белков 1К.1В1 или 1К.1В4 независимо от наличия эндогенных клеточных механизмов регуляции экспрессии белков 1К.1В1 или 1К.1В4.

Аналогичным образом, промотор, который связан путем сшивки с кДНК белков 1К.1В1 или 1К.1В4 в антисмысловой ориентации, предпочтительно является сильным промотором, таким как промотор, присутствующий в регулирующей области вируса Эпштейна-Барра (ЕВУ), который обеспечивает экспрессию антисмысловой РНК на высоком уровне (Ие188 апб К1тсЫ, 1991).

Антисмысловая последовательность предпочтительно экспрессируется только в клеткаххозяевах и клетках-мишенях, которые предпочтительно являются клетками человека, при этом экспрессированная антисмысловая РНК должна быть устойчивой (то есть не должна быстро расщепляться). Антисмысловая РНК должна специфически гибридизироваться только со смысловой мРНК, экспрессированной в клетках-хозяевах и клетках-мишенях, и образовывать молекулу устойчивой двухцепочечной РНК, которая, по существу, не транслируется. Другими словами, антисмысловая РНК, экспрессированная в клетках-хозяевах и клеткахмишенях, предотвращает трансляцию экспрессированной смысловой мРНК в белки ΙΚ.1Β1 или ΙΚ.1Β4. Антисмысловая последовательность векторного происхождения может нести либо всю последовательность кДНК белков ΙΚ.1Β1 или ΙΚ.1Β4, либо ее часть до тех пор, пока антисмысловая часть способна гибридизировать со смысловой мРНК и предотвращать ее трансляцию в белок ΙΚ.1Β1 или ΙΚ.1Β4. Таким образом, термин антисмысловая последовательность, используемый в этом описании изобретения и формуле изобретения, означает как всю антисмысловую последовательность, так и ее часть, которая может быть экспрессирована в трансформированных/трансфецированных клетках и которая может специфически гибридизировать со смысловой мРНК белка ΙΚ.1Β1 или ΙΚ.1Β4 с образованием молекулы нетранслируемой двухцепочечной РНК.

Антисмысловая последовательность не обязательно должна гибридизироваться по всей длине мРНК белка ΙΚ.1Β1 или ΙΚ.1Β4. Вместо этого она может гибридизироваться выбранными областями, такими как 5' нетранслируемая некодирующая последовательность, кодирующая последовательность или 3' нетранслируемая последовательность смысловой мРНК. Антисмысловая последовательность предпочтительно гибридизирует с 5' кодирующей последовательностью и/или 5' некодирующей последовательностью, расположенной, например, в сайте кэпирования или в сайте инициации кодона, так как наблюдения с использованием многих антисмысловых олигонуклеотидов показывают, что воздействие на кодон инициации является более эффективным, в то время как воздействие на внутренние последовательности в кодирующей области оказывается менее эффективным (^νίοΚ81тош, 1991). Эффективность антисмысловой последовательности по предотвращению трансляции смысловой мРНК белка ΙΚ.1Β4 можно легко испытать при помощи анализа активности белка аргининметилтрансфераза в клетках И2668 аналогично описанию, приведенному в примере 7. С учетом размера генома млекопитающего антисмысловая последовательность белка ΙΚ.1Β1 или ΙΚ.1Β4 предпочтительно имеет, по крайней мере, 17, более предпочтительно не менее 30 пар оснований в длину. Однако могут быть полезными и более короткие последовательности, то есть они или не гибридизируют с другими последовательностями млекопитающего, или такая перекрестная гибридизация не влияет на метаболизм клетки в достаточно вы сокой степени, чтобы препятствовать достижению целей данного изобретения.

Как предпочтительное направление гибридизации, так и предпочтительную длину антисмысловой последовательности можно легко определить при помощи системного эксперимента. Для системного удаления части антисмысловой последовательности с увеличенным размером из вектора можно использовать стандартные методы, например, описанные в научных трудах Аи8иЬе1 е! а1., ебз. Сштеи! Рто!осо1з ίη Мо1еси1аг Βώ^^, Сгееие РиЬНзЫид Аззос., Ыете Уотк, Ν.Υ., 1987-1996, и 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬотаЮту Маииа1, 8есоиб Ебйюи, Со1б 8ртшд НагЬог Ргезз, Со1б 8ртшд НагЬог, ΝΥ (1989). Помимо полноразмерной антисмысловой последовательности можно получить ряд делеций, предпочтительно у 5'-конца антисмысловой последовательности. Это дает совокупность усеченных антисмысловых последовательностей, которые сохраняют комплементарность предпочтительно к 5'-концу смысловой мРНК, и в результате этого по-прежнему образуют молекулу двухцепочечной РНК у 5' конца смысловой мРНК (дополняющую 3'конец антисмысловой РНК) и являются нетранслируемыми. Более того, антисмысловые олигонуклеотиды, например олигонуклеотид А8-1 (8ЕЦ ΙΌ № 12), можно легко синтезировать химическим путем и ввести в вектор при наличии акивной связи путем сшивки с промотором для использования с целью уменьшения экспрессии белка ΙΚ.1Β1 или ΙΚ.1Β4 в клетках ш у1уо.

Векторы по настоящему изобретению могут быть любыми приемлемыми эукариотическими или прокариотическими векторами, обычно используемыми для трансфекции клеток млекопитающих, в частности, эписомными, реплицируемыми или интегрируемыми в хромосомы векторами, хорошо известными в этой области. Особенно предпочтительным вектором для экспрессии антисмысловой РНК белка ΙΚ.1Β1 или ΙΚ.1Β4 является эписомная плазмида, содержащая регуляторную область вируса Эпштейна-Барра (Ое1зз аиб КттсЫ. 1991), которая служит в качестве промотора, который связан путем сшивки с кДНК белка ΙΚ.1Β1 или ΙΚ.1Β4, расположенной в антисмысловой ориентации относительно этой регуляторной области. Использование антисмысловых векторов и олигонуклео-тидных фосфортиоатов описывается в научной работе Аииа1з о£ 111е №\ν Υо^к о£ 8с1еисез: Сеие Тйетару £от №ор1азбс О1зеазез, ебз. Β.Ε. НиЬег аиб 1.8. Ьа/о, Уо1. 716, 1994 (например, Мййдаи е! а1., рр. 228-241).

В соответствии с настоящим изобретением выживаемость тканей или органов, трансплантируемых больному, можно пролонгировать путем снижения реакции клетки на интерферон.

Отторжение трансплантированной ткани опосредовано антигенами гистосовместимости, в частности антигенами МНС класса I, синтез которых стимулирует интерферон. Таким образом, снижение реакции клеток на интерферон увеличивает жизнеспособность трансплантированной ткани. Способ пролонгации жизнеспособности тканевого лоскута по настоящему изобретению заключается в том, что в клетки ткани или органа, трансплантируемого нуждающемуся субъекту, вводят молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую последовательность кДНК белка ΙΚ1Β1 или ΙΚ1Β4 либо их фрагмент, связанный путем сшивки с промотором в антисмысловой ориентации, в результате чего антисмысловая РНК белка ΙΚ.1Β1 или ΙΚ.1Β4 экспрессируется в таких трансфецированных/трансформированных клетках. Молекулу рекомбинантной ДНК можно ввести в клетки ткани или органа любым приемлемым для этой цели методом, хорошо известным в этой области. После введения молекулы рекомбинантной ДНК в клетки ткани или органа их можно трансплантировать больному.

Фармацевтическую композицию, содержащую молекулу рекомбинантной ДНК, которая является экспрессирующим вектором и содержит кДНК белка ΙΚ1Β1 или ΙΚ1Β4, связанную путем сшивки с промотором в смысловой ориентации, можно инъецировать непосредственно в опухоли, например, в опухоли мозга или узелки метастазов опухоли, благодаря чему клетки в этих опухолях лучше реагируют на экзогенную терапию интерфероном, в качестве лечения раковых заболеваний. Повышенный клеточный ответ на экзогенную терапию интерфероном способствует подавлению роста злокачественных клеток.

Методы переноса генов ίη νίνο или ех νίνο всесторонне описаны в научной литературе, в частности, в Аппа1к оГ 1Не Ыете Уогк Асабету оГ 8с1епсе: Сепе ТЬегару Гог №ор1а8Йс Эбеахек Уо1. 716, 1994; см., например, С.Е. Р1аи1г, Όίгес1 Сепе ТгапкГег Гог 1Не Ипбегйапбтд апб Тгеа1теп1 оГ Нитап Обеаре, стр. 144-153, и Коетег е1 а1., МесЬашктк оГ Лсбоп оГ 1Не р53 Титог Зирргекког апб РгокреЛк Гог Сапсег Сепе ТЬегару Ьу КесопкШийоп оГ р53 Еипсбоп, стр. 265-282. Методы введения молекул рекомбинантной ДНК в клетки трансплантируемой ткани или органа либо в клетки опухоли включают использование векторов аденовируса, ретровируса, аденосвязанного вируса (АЛУ), а также прямое инъецирование ДНК или олигонуклеотидной липосомы. Хорошо известны клинические испытания, где ретровируемые векторы инъецируют в опухоли мозга или используют аденовирус для инфецирования клеток верхних дыхательных путей больного, страдающего муковисцидозом.

Фармацевтические композиции, содержащие молекулу рекомбинантной ДНК, кодирующей кДНК белка ΙΚ1Β1 или ΙΚ1Β4 либо его фрагмент, в смысловой или антисмысловой ориентации в отношении связанного путем сшивки промотора, предположительно включают все композиции, в которых молекула рекомбинантной ДНК находится в количестве, достаточном для достижения указанной цели. Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать фармацевтически приемлемые носители или наполнители, которые стабилизируют молекулу рекомбинантной ДНК или облегчают ее введение.

Еще одно направление настоящего изобретения связано с молекулами, которые включают антигенсвязывающую часть антитела, специфичного к белкам ΙΚ1Β1 или ΙΚ1Β4 либо их фрагментам, связывающимся с рецептором ΙΕΝΑΚ1, и предназначены для диагностических целей, в частности, для использования в иммунологических анализах с целью определения уровня белков ΙΚ1Β1 или ΙΚ1Β4 в опухолевой ткани, полученной путем биопсии, или в афинной хроматографии для очистки белка.

Термин антитело включает поликлональные антитела, моноклональные антитела (тАЬк), химерные антитела, антиидиотипические антитела, одноцепочечные антитела и рекомбинантные очеловеченные антитела, а также их активные фракции, полученные любыми известными методами, которые включают, но не ограничиваются ими, ферментативный гидролиз, рептидный синтез или рекомбинантные методы.

Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, выделенных из сыворотки животных, иммунизированных антигеном. Моноклональное антитело содержит, по существу, гомогенную популяцию антител, специфичных к антигенам, которая содержит по существу сходные сайты связывания эпитопа. Моноклональные антитела можно получить методами, хорошо известными в этой области. См., например, КоЫег апб М11Леш, №1иге, 256:495-497 (1975); патент США № 4376110; Аи8иЬе1 е1 а1., ебк., см. выше, Наботе апб Ьапе, АпбЬоб1ек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рбпд НагЬог ЬаЬога1огу (1988); апб СоШдап е1 а1., ебк., СштеШ РгоЮсоЕ ш Iттиηο1οду, Сгеепе РиЬбкЬшд Аккос. апб ЭДбеу Шегкаепсе, Ν.Υ., (1992, 1993), которые полностью включены в это описание изобретения в качестве ссылки. Такие тела могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, включая Ι§Π Ι§Μ, Ι§Ε, ^А, СШН, и к любому их подклассу. Гибридому, продуцирующую моноклональное антитело (тАЬ) по настоящему изобретению, можно культивировать ш ν^(^ο. ш 811и или ш νί\Ό. Продуцирование высоких титров моноклональных антител ш νί\Ό или ш к би в настоящее время является предпочтительным методом получения этих антител.

Химерные антитела представляют собой молекулы, разные части которых получают из разных видов животных. Например, химерные антитела могут иметь вариабельную область, выделенную из моноклонального антитела мыши, и константную область иммуноглобулина человека. Химерные антитела используют главным образом для снижения иммуногенности и для увеличения выхода, например, в тех случаях, когда моноклональные антитела мышей имеют более высокие выходы из гибридом, а моноклональные тела человека характеризуются более высокой иммуногенностью. Химерные антитела и методы их получения хорошо известны в этой области (СаЫ11у е! а1., Ргос. Νη11. Асаб. За. ИЗА 81:3273-3277 (1984); Мотзоп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. За. ИЗА 81:6851-6855 (1984); ВоиНапие е! а1., №Ш1ге 312: 643-646 (1984); СаЫ11у е! а1., заявка на европейский патент № 125023 (опубликована 14 ноября 1984 г.); №иЬетдет е! а1., №Ш.1ге 314:268-270 (1985); ТашдисЫ е! а1., заявка на европейский патент № 171496 (опубликована 19 февраля 1985 г.); Могпзоп е! а1., заявка на европейский патент № 173494 (опубликована 5 марта 1986 г.); №иЬетдег е! а1., заявка РСТ \УО 8601533 (опубликована 13 марта 1986 г.); Кибо е! а1., заявка на европейский патент № 184187 (опубликована 11 июня 1986 г.); Мотзоп е! а1., заявка на европейский патент № 173494 (опубликована 5 марта 1986 г.); Зайадаи е! а1., 1. 1ттипо1. 137:10661074 (1986); КоЬшзоп е! а1., заявка на международный патент, \УО 9702671 (опубликована 7 мая 1987 г.); Ми е! а1., Ргос. №!1. Асаб. δα. ИЗА 84:3439-3443 (1987); Зип е! а1., Ргос. №И. Асаб. За. ИЗА 84:214-218 (1987); Ве!!ег е! а1., Заепсе 240:1041-1043 (1988); и Нат1оте апб Ьапе, Ап!1Ьоб1ез: А ЬаЬота!огу Мапиа1, см. выше.

Антиидиотипическое (анти-1б) антитело представляет собой антитело, которое распознает уникальные детерминанты, обычно ассоциированные с антигенсвязывающим сайтом антитела. Идиотипическое антитело можно получить путем иммунизации животного того же вида и генетического типа (например, линия мышей) , используемого в качестве источника моноклонального антитела, для которого получают антиидиотипическое антитело. Иммунизированное животное будет узнавить и реагировать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела выработкой антитела к этим идиотипическим детерминантам (антиидиотипическое антитело). См., например, патент США № 4699880.

Антиидиотипическое антитело можно использовать также в качестве иммуногена, вызывающего иммунный ответ у другого животного, которое вырабатывает так называемое антиантиидиотипическое антитело. Антиантиидиотипическое антитело может быть идентично в отношении эпитопа первоначальному моноклональному антителу, которое индуцировало антиидиотипическое антитело. Таким образом, используя антитела к идиотипическим детерминантам молоклонального антитела, можно иден тифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела с идентичной специфичностью.

Необходимо отметить, что антитела по настоящему изобретению могут быть интактными антителами, такими как моноклональные антитела, хотя требуемую функцию выполняет эпитопсвязывающий сайт антитела. Таким образом, помимо интактного антитела можно использовать их протеолитические фрагменты, такие как РаЬ или Р(аЬ')₂. У РаЬ- и Р(аЬ')₂-фрагментов отсутствует Рс-фрагмент интактного антитела, который чаще выводится из циркуляции, и они могут характеризоваться менее неспецифическим связыванием с тканями, чем интактное антитело (^ай1 е! а1., 1. №с1. Меб. 24:316-325 (1983)). Такие фрагменты обычно получают в результате протеолитического расщепления с использованием ферментов, таких как папаин (при образовании РаЬ-фрагментов) или пепсин (при образовании Р(аЬ')2-фрагментов).

Кроме того, ДНК, кодирующую вариабельную область антитела, можно ввести в другие антитела с получением химерных антител (см., например, патент США № 4816567) или в рецепторы Т-клеток, что дает Т-клетки с такой же широкой специфичностью (см., Езййаг, Ζ. е! а1., Вг. 1. Сапсег Зирр1, 10:27-9, 1990; Сгозз, С. е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8ά. ИЗА, 86:10024-8, 1989). Можно также получить и использовать одноцепочечные антитела. Одноцепочечные антитела представляют собой одноцепочечные сложные полипептиды, обладающие антигенсвязывающими способностями и содержащие пару аминокислотных последовательностей гомологичных или аналогичных вариабельным областям легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина (связанный У_Н-У_Ь или одноцепочечный Ρ_ν). Как ν_Η, так и V могут копировать последовательности природного моноклонального антитела, либо одна или обе цепи могут содержать конструкцию СОК.-РК. типа, описанного в патенте США № 5091513. Разделенные полипептиды, аналогичные вариабельным областям легких и тяжелых цепей, удерживаются вместе полипептидным линкером. Такие одноцепочечные антитела, особенно в тех случаях, когда известны ДНК, кодирующие полипептидные структуры цепей ν_Η и ν^ можно получить в соответствии с методами, описанными, например, в патентах США №№ 4946778, 5091513 и 5096815.

Термин молекула, включающая антигенсвязывающую часть антитела относится не только к молекулам интактного иммуноглобулина любого изотипа, продуцируемым любой линией клеток животного или микроорганизма, но и к их реакционноспособной фракции, и включает, но не ограничивается ими, РаЬфрагмент, РаЬ'-фрагмент, Р(аЬ')2-фрагмент, вариабельный участок их тяжелых и/или легких цепей и химерные или одноцепочечные антитела, содержащие такую реакционноспособную фракцию, а также молекулы или клетки любого другого типа, в которые физически введена реакционноспособная фракция такого антитела, например, химерный рецептор Т-клеток, Тклетки, имеющие такой рецептор, или искусственно созданные молекулы, в состав которых входит часть молекулы, содержащей такую реакционноспособную фракцию.

Сущность данного изобретения, подробно изложенная в этом описании изобретения, должна стать еще более очевидной из нижеследующих примеров, которые приведены в иллюстративных целях и никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.

Пример 1. Связывание двух белков человека, 1К1В1 или ΙΒ1Β4. с рецептором интерферона.

Фрагмент кДНК, кодирующий весь ГСдомен рецептора ΙΕΝΆΚ1, который амплифицирован полимеразной реакцией синтеза цепи с использованием смысловой затравки ВатН1 (5'с1дадда1ссАААСТСТТСТТСАСАТССАТС (8ЕЦ ΙΌ № 5)) и антисмысловой затравки ЕсоК! (51дасдаайсс1аТСАТАСААА6ТС (8 ЕС) ГО № 6)), клонируют в векторе В1ис8спр1 (В8-8К⁺, 81га1адепе). Фрагмент ВатН1-8а11 из В8IΕNАК.1-IС вводят в вектор рСВТ₁₀ (С1опеТес11) и сливают по фазе после ДНК-связывающего домена Са14 (рСВТ₁₀-1Е^АК1-ГС) с целью выполнения двцгибридного скрининга. Способ двугибридного скрининга (Р1е1б§ апб 8опд, 1989) осуществляют с модификациями (ЭнгГее с1 а1., 1993), используя библиотеку кДНК плазмид рАСТ, полученную из В-лимфоцитов, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (ЕВУ) человека, для котранс-формации репортерного штамма дрожжей Υ153 с помощью рСΒТ₁₀-IΡNАк1-IС. Штамм дрожжей Υ153 имеет два гена-репортера, контролируемых активирующими в обратном направлении последовательностями САБ1 (ИА8), которые транскрибируются только тогда, когда восстановлена активность фактора транскрипции. Для этого необходимо, чтобы слитый белок, закодированный плазмидой рАСТ, который введен в данный конкретный дрожжевой клон, обладал сродством к 1С-домену рецептора 1ЖАК1 плазмиды рСВТ₁₀. Один из генов репортеров является САБ1 Ηίκ3, который обеспечивает рост в среде без гистидина; другой ген-репортер является САЕ-Еас2, который обеспечивает активность βгалактозидазы. Кроме того, плазмиды рАСТ имеют ген Ьеи2 и плазмида рСВТ₁₀ имеет ген ТКР1, который обеспечивает рост в среде без лейцина и триптофата. Соответственно колонии отбирают в синтетической среде 8С без Тгр, Ьеи, Н15 в присутствии 25 мМ 3-аминотриазола (которую далее используют для прототрофии гистидином). Растущие колонии испытывают в отношении активности β-галактозидазы по методу определения степени связывания с мем бранным фильтром Х-да1 (Вгеебеп апб №укшйй, 1985).

Получено девять положительных дрожжевых клонов, из которых выделены плазмиды рАСТ путем трансфекции в НВ 101 Е.со11 и отбора трансформантов 1еи⁺. Для ДНК каждого штамма дрожжей выделено два клона НВ101 Е. сой. Частичное секвенирование ДНК плазмид рАСТ из этих клонов Е.сой показывает, что они образуют две группы последовательностей кДНК, обозначенные 1К1В1 и 1К1В4. Плазмиды рАСТ групп 1К1В1 и 1К1В4 испытывают на специфичность путем котрансформации репортерного штамма дрожжей 8ΡΥ526 (Вайе1 е1 а1., 1993) плазмидами рА8, содержащими ламин, сбк2 и р53 или другие контрольные вставки (С1опеТес11). Колонии, которые растут в среде 8С без 1гр и 1еи, испытывают на экспрессию βгалактозидазы. Вставки вырезают с помощью Х1о1 из специфически положительных плазмид рАСТ, клонируют в В8-К8 (8йа1адепе) и секвенируют от промоторов Т7 и ТЗ, используя набор для дидезоксисеквенирования терминаторного цикла в секвенаторе ДНК 373А (Аррйеб Вю5уйет5).

На фиг. 1 показаны результаты котрансфекции белка 1К1В1 клона рАСТ в дрожжи 8ΡΥ526 с использованием разных затравочных плазмид рА8 или рСВТ₁₀. Дрожжевые клетки растут в селективной среде 8С без 1гр и 1еи в штрихах 1-9 фильтра. Окрашивание реагентом Х-да1 (5-бром-4-хлор-3-индолил-в-О-галактопиранозид) является положительным только в штрихах 2 и 4. Как показано на фиг. 1, штрих 4 относится к контрольным дрожжам с активным геном №Ζ. Штрих 2 представляет собой комбинацию слитых белков 1К1В1 и 1ЖАК1-1С. Только в белке 1К1В1 (штрих 9) или в любой другой комбинации за исключением 1К1В1 и IΡNАК1-IС активность β-галактозидазы отсутствует. Из этого следует, что белок 1К1В1 способен специфически связываться с 1С-доменом цепи рецептора интерферона IΡNАК.1.

Аналогичным образом на фиг. 2 показаны результаты котрансфекции белка 1К1В4 клона рАСТ в дрожжи 8ΡΥ526 с использованием разных затравочных плазмид рА8 или рСВТ_]0. Дрожжевые клетки растут в среде 8С без 1гр и 1еи в штрихах 1-8 фильтра, и окрашивание реагентом Х-да1 является положительным только в штрихах 3 и 7. Как показано в рамке в нижней части фиг. 2, штрих 7 относится к контрольным дрожжам с активным геном №Ζ. Штрих 3 представляет собой комбинацию слитых белков 1К1В4 и 1ЖАК1-1С. Аналогично результатам, полученным для 1К1В1, только в 1К1В4 (штрих 1) или в любой другой комбинации за исключением 1К1В4 и 1ЖАК1-1С активность βгалактозидазы отсутствует. Из этого следует, что белок 1К1В4 также способен специфически связываться с 1С-доменом цепи рецептора интерферона ΙΡΝΆΚ1.

Пример 2. Наличие кальцийсвязывающих сайтов фактора элонгации в последовательности белка ΙΒ1Β1.

кДНК-вставку плазмид рАСТ-ΙΒΙΒΙ вырезают рестрикционным ферментом Х1ю1. клонируют в вектор Β8-Κ8 В1ис5СГ1р1 и секвенируют от промоторов Т7 и ТЗ, используя набор для дидезоксисеквенирования терминаторного цикла в секвенаторе ДНК 373 А (Аррйей Вю5у51ст5). Последовательность самой длинной плазмиды состоит из 830 нуклеотидов (фиг. 3) и следует за доменом активации Са14, линкерной последовательностью плазмиды рАСТ и открытой рамкой считывания из 191 аминокислоты (фиг. 3). С помощью алгоритма В1а§1Р (А1йс1ш1 е1 а1., 1990) и анализа первичной структуры в биоакселераторе (НешкоГГ апз НешкоГГ. 1992) исследуют базу данных по структуре белка в оперативном режиме. Высшие оценки получены для кальтрактина (САТК-ΗυΜΑΝ, код доступа 8νΐ85 Рто1еш 8 XV №\ν Н41208) при наличии 62,1% сходства и 32,4% идентичности у аминокислот 52-173 и для кальцинейрина В (САЬВ NΑΕСΒ, код доступа 8νίδδ Рго1еш Р42322; САБВ-НиМАН код доступа Р06705) при наличии 59,8% сходства и 32,5% идентичности у аминокислот 50-171.

На фиг. 4 белок ΙΒ1Β1 сравнивается с кальцинейрином В (САЕ-Β) и кальтрактином (САТЕ) человека. Кальцийсвязывающие домены фактора элонгации типа спираль-петляспираль показаны жирным шрифтом и подчеркнуты. Белок ΙΒ1Β1 имеет два сайта фактора элонгации, но первые два домена фактора элонгации не являются консервативными. Белок ΙΒ1Β1 гомологичен как кальцинейрину В (изображен вертикальными линиями на фиг. 4), так и кальтрактину (изображен двоеточиями на фиг. 4). Однако белок ΙΒ1Β1 несомненно является новым и отличающимся белком человека, который ранее не был идентифицирован.

Пример 3. Белок ΙΒ1Β1 - генный продукт, индуцируемый интерфероном.

Миеломные клетки υ2668 человека (примерно 3х10⁶ клеток в 5 мл суспензионных культур) обрабатывают в течение 2 или 18 ч рекомбинантом ΙΡΝ-α8 (2х10⁸ иммунизирующих единиц/мг из бактерий) или рекомбинантом ΙΡΝ-β (3х10⁸ иммунизирующих единиц/мг из клеток яичника китайского хомячка) при концентрации 750 иммунизирующих единиц/мл. Обработанные интерфероном клетки собирают и экстрагируют Тп-реагентом (Мо1еси1аг Векеагсй СеШет, Цинциннати, шт. Огайо), который является продуктом, содержащим тиоцианат гуанидина и фенол. Экстрагированную РНК осаждают этанолом, денатурируют формальдегидом, анализируют электрофорезом в формальдегидадагозных гелях (10 мкг РНК/лунку) и блоттируют в устройстве Сепе8сгееи Р1и§ (ЭироШ, №\ν Епд1аий Жс1еат, Βί^τ^, шт. Массачусетс). Продукт нозерн-блоттинга подвергают взаимодействию с кДНК белка ΙΒ1Β1, меченой при помощи набора КеЛрпте (Атешйат, Великобритания), с частотой импульсов, равной 10⁶ импульсам/минуту, используя ³²-йСТР и произвольное примирование.

На фиг. 5 показано, что кДНК белка ΙΒ1Β1 гибридизирует с РНК длиной 1,1 т.п.о. Количество мРНК белка ΙΒ1Β1 значительно возрастает через 2 ч после обработки клеток υ2668 интерфероном ΙΡΝ-β. Однако через 18 ч после обработки интерфероном мРНК белка ΙΒ1Β1 исчезает из клеток, свидетельствуя о том, что индукция является быстрой и временной. Многие мРНК, индуцированные интерфероном, продолжают накапливаться в клетках в течение более 24 ч после обработки интерфероном (Весе1 апй СйеЬаФ, 1986).

Установлено, что в каждой серии испытаний присутствует одинаковое количество РНК. Как показано в нижней части фиг. 5, гибридизация РНК клеток υ2668 (с большим количеством рецепторов интерферона) с рибосомным кДНКзондом 188 позволяет обнаружить одинаковое количество рРНК 188 в каждой серии испытаний (показана лишь часть блоттинга с использованием рРНК 188). В другом эксперименте с использованием для индукции 1200 ед/мл интерферона также обнаружена мРНК белка ΙΒ1Β1 через 2 ч после обработки интерфероном и не обнаружена через 30 мин (не показано).

Установлено, что мРНК белка ΙΒ1Β1 имеет одинаковый размер, равный 1,1 т.п.о., в разных клетках человека (клетки υ266, Эаий| и ТНР-1). Следует отметить, что этот размер близок к размеру мРНК кальтрактина, но не соответствует размеру мРНК кальцинейрина В (2,5 т.п.о.). Небольшой размер мРНК сопоставим с размером белка ΙΒ1Β1, который является некрупным белком с молекулярной массой, равной примерно 20 кДа.

Пример 4. Связывание белка ΙΒ1Β1 с рецептором IΕNΑΒ1 ίη νίΙΐΌ.

Связывание белка ΙΒ1Β4 с ГС-доменом рецептора IΕNΑΒ1 испытывают следующим образом. Белок ΙΒ1Β4 синтезируют, используя меченый белок (сигнальная последовательность), производят трансляцию ίη уйто в лизатах ретикулоцитов и подвергают этот белок взаимодействию со слитым белком рекомбинанта ΙΡNΑΒ1-IС в Е. со11. ДНК рΑСТ-IΒ1Β4 по примеру 1, вырезанную Χ1μΙ и наполненную ферментом Кленова, клонируют в экспрессирующем векторе с сигнальной последовательностью РЕСЕ (Е1115 е1 а1., 1986), который вырезают Ε^ΒΙ и наполняют. Фрагмент ^Й-ЕатШ, содержащий продукт слияния сигнального белка ΙΒ1Β4 с сохранением рамки считывания, вновь клонируют в Β8-8Κ, вырезанном NоίI-ΒатНI в прямом направлении от проторов ТЗ. Последова тельность продукта слияния сигнального белка проверяют путем секвенирования от промотора ТЗ. Транскрипцию ίη νίίτο (набор Рготеда) производят, используя полимеразу ТЗ и 1 мкг ВатН1-линеаризованной ДНК продукта В8сигнального белка 1Р1В4. Трансляцию ίη νίίτο выполняют в лизатах ретикулоцитов кролика (набор Рготеда) , используя [³⁵8]метионин (Атеткйат) и 5 мкг РНК-транскриптов, в течение 1 ч при температуре 30°С. Полученные продукты обрабатывают РНКазой перед использованием. Слитый белок ΟδΤ-ΙΕΝΑΚΓ-ΙΟ получают путем клонирования ВатШ-ЕсоКб и вставки В8ΙΕΝΑΚΤ-ΙΟ (см. выше) в те же сайты р6ЕХ2 (Рйаттас1а Вю1ес11). 68Τ и ΟδΤ-ΙΕΝΑΚΓ-ΙΟ экспрессируют в Е. сой и получают связанными с глутатионин-агарозными гранулами (§1дта).

Антисигнальные агарозные гранулы М2 приобретены в фирме Кобак 8с1е1ШПс йпащид 8у51ет5. Моноклональные антитела ШЫаК.3 к αкомпоненту рецептора интерферона (ΙΕΝΑΚ1) любезно предоставлены д-ром О. Коламоничи (Со1атошс1 еί а1., 1990) и использованы в разведенном виде с соотношением 1:100. Полученные антитела кроликов к С-концевому пептиду ΙΕΝΑΚΤ-^ (АЬ 631) используют для иммунопреципитации ΙΕΝΑΚ1 из экстрактов Бриджа (0,75 мл), содержащих 2х10⁷ миеломных клеток И2668 и И266К. человека с антипротеазами, в соответствии с приведенным выше описанием (АЬгатотю11 еί а1., 1994) за исключением того, что с моноклональным антителом тАЬ ШЫаКЗ используют гранулы белка 6 (Рйагташа), при этом электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и анализ в фосфорном томографе ВА81000 фирмы Бирх выполняют аналогично известному методу (Наггосй еί а1., 1994).

Прежде всего установлено, что в процессе иммунопреципитации продуктов трансляции антисигнальными антителами (фиг. 6А и 6В) получен белковый продукт с молекулярной массой около 32 кДа. Указание на использование антисигнальных антител (знак +) на фиг. 6А и 6В означает, что продукт радиоактивной трансляции мРНК слитого сигнального белка ΙΗ1В4 (транскрибирован ίη νίίΐΌ из соответствующей конструкции ДНК) подвергают взаимодействию с антисигнальным антителом М2, связанным с агарозными гранулами (продукт компании Кобак 8с1епбйс Ппадшд 8у51ет5). Транслированный белок, который содержит белок ГК.1В4, слитый с сигнальной аминокислотной последовательностью, связывают с гранулами антисигнального антитела. Указанные гранулы центрифугируют, белок элюируют буфером с додецилсульфатом натрия и анализируют электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Эти реакции, выполняемые в целях контроля, указывают на наличие предполагаемого слитого белка.

При осуществлении реакции трансляции лизата ретикулоцита добавляют гранулы глутатионсефарозы (8щта). нагруженные глутатион8-трансферазой (68Τ), слитой с ΨΝΑΚ1-ΙΟ Указанные гранулы центрифугируют и промывают, после чего белок, связанный с гранулами 68Τ, высвобождают при помощи додецилсульфата натрия (8Ό8 1%) и анализируют электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (РАСЕ). Установлено, что белок с молекулярной массой 32 кДа, меченый ³⁵8-метионином, связан с 68Τ-IБNΑΚ1-IС и не связан с глутатион-8-трансферазой (фиг. 6А). Полученные результаты свидетельствуют о том, что белок ГК.1В4 связывается непосредственно с «.'-областью выделенного пептида ГБЛАКТ.

Для проверки того, что белок ГК.1В4 взаимодействует с белком ШЫАКГ, присутствующим в клеточных мембранах человека, детергентные экстракты миеломных клеток И266 человека смешивают с мечеными ³⁵8-метионином продуктами трансляции мРНК белка ГК.1В4 из лизатов ретикулоцитов. Белок IБNΑΚ.1 иммунопреципитируют моноклональным антителом ШЫаКЗ, специфичным к эктодомену ШЫАКГ (Со1атошс1 еί а1., 1990). Анализ посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия указывает на наличие полосы сигнального белка ГК.1В4 с молекулярной массой 32 кДа (фиг. 6В) при использовании детергентных экстрактов, полученных из клеток И2668 (с большим количеством рецепторов интерферона), причем указанная полоса отсутствует при получении экстрактов из клеток 1)266« мутанта ШЫ-а, которые являются βустойчивой производной линией клеток, полученной из клеток И266, не имеющих рецепторов интерферона (АЬгато\тс11 еί а1., 1994). Полоса, соответствующая молекулярной массе 32 кДа, аналогичным образом обнаружена в тех случаях, когда экстракты клеток И2668 подвергают взаимодействию с антителом 631 против Сконцевого пептида ШЫАКГ и когда белок ГБNΑΚ.1 осаждают антисигнальными антителами с использованием клеток Со§-7, трансфецированных сигнальным белком !К.1В4 и кДНК белка ШЫАКТ человека. Эти результаты показывают, что белок Ж.1В4 специфически связывается с интактными рецепторами IБNΑΚ1 из клеток человека.

Пример 5. кДНК белка IΚ.1В4 и последовательности белка.

Нуклеотидная последовательность кДНК белка !К.1В4 имеет открытую рамку считывания, кодирующую белок, содержащий 361 аминокислоту (фиг. 7). Эта кДНК человека узнает структурно экспрессированную поли-А⁺ мРНК длиной 1,5 т.п.о. в разных клетках человека, включая миеломные клетки И266. В результате исследования базы данных по структуре белка в оперативном режиме с помощью алгоритма В1айР (А1г8сйи1 еί а1., 1990) и анализа первичной структуры в биоакселераторе (НешкоГГ апк НсшкоГГ. 1992) установлено, что белок ΙΒ1Β4 является уникальным членом семейства протеин-аргининметилтрансферазы. кДНК белка РВМТ1 крыс, описанная Лином и др. (Ьт с1 а1., 1996, последовательность с идентификационным № 1390024 в банке данных СепЬапк; код доступа υ60882), гомологична лишь на 81,4% при выполнении анализа с помощью программы ЛЬЮК На аминокислотном уровне (фиг. 8) белок ΙΒ1Β4/ΡΒΜΤ человека имеет четко выраженные отличия от РВМТ1 по своему аминокислотному концу, причем первые 19 аминокислот являются совершенно разными. Секвенирование Ν-конца белка ΙΒ1Β4 не позволяет выявить гомологию белка ΙΒ1Β4 с белком РВМТ1. Установлено, что еще один ранее описанный белок человека НСР-1 (Νί1<;·ι\ν;·ι с1 а1., 1996; код доступа в СепЬапк Ό66904) также гомологичен белку ΙΒ1Β4. Однако белок НСР-1 имеет другую аминокислотную последовательность от остатков 147-175 (фиг. 9). Белок НСР-1 первоначально идентифицирован благодаря своей способности комплементировать мутацию 1ге 15 в дрожжах, причем его ферментативная функция не была ранее выявлена (Νί1<;·ι\ν;·ι е1 а1., 1996). Из вышесказанного следует, что белок ΙΒ1Β4 является новым белком человека.

Пример 6. Белок ΙΒ1Β4, связанный с ΙΡΝΆΚ1-ΙΟ, обладает метилтрансферазной активностью.

Метилтрансферазную активность можно определить в результате одновременной иммунопреципитации из клеточных экстрактов человека с рецептором ΙΕΝΑΒ1. Детергентные экстракты Бриджа клеток Ш668 подвергают взаимодействию с антителом АЬ 631 против ΙΕΝΑΒ1 или без него (АЬгатоу1сй е1 а1., 1994) в течение ночи при температуре 4°С. В течение 1 ч добавляют гранулы белка А (40 мкл 50% быстротекучего ΙΡΑ-400, ВерНдеп). Гранулы промывают и инкубируют в течение 30 мин при температуре 30°С в 0,1 мл 25 мМ трис-НС1, рН 7,5, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ΕΌΤΑ), 1 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты (ЕСТА), 50 мкМ (0,25 МКС) ¹⁴С-(метил)-8аденозилметионина (Атеткйат) и 100 мкг гистонов (тип ИА из тимуса теленка, 8щта). Метилирование гистонов ίη νίΐτο осуществляют в условиях, описанных Лином и др. (Ьш е1 а1., 1996). Радиоактивность полосы гистона анализируют посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. (15% акриламида) и экспонируют в фосфорном томографе. Мечение гистонов ¹⁴С-метилом характерно для гранул, покрытых антителом против ΙΕΝΑΒ1, и отсутствует в контрольной реакции (фиг. 10). Поэтому активность протеинметилтрансферазы структурно связана с цепью рецептора интерферона этих клеток человека. Аналогичная ферментативная активность обнаружена в процессе иммунопреципитации ΙΕΝΑΒ1 через 5 мин после добавляют ΙΕΝ-β к клеткам υ2668.

Пример 7. Влияние белка ΙΒ1Β4/ΡΒΜΏ на действие интерферона.

Антисмысловой олигодезоксинуклеотидфосфортиоат (81еш е1 а1., 1989), комплементарный последовательности нуклеотидов 12-33 рядом с инициирующим кодоном кДНК белка ΙΒ1Β4 (Α8-1, антисмысловая последовательность 5'-СССΤΑСΑΑΑΑΤΤСΤССΑΤСΑΤС-3'; 8ЕО ΙΌ № 12), синтезирован химическим путем. Олигонуклеотиды добавляют к клеткам υ2668, культивируемым в 96-луночных микропланшетах (8000 клеток/лунку/0,2 мл ΒΡΜΙ, 10% фетальной телячьей сыворотки) при конечной концентрации, равной 10 мкМ в день, предшествующий началу эксперимента, и повторно добавляют в количестве 5 мкМ во второй день эксперимента. Интерферон ΙΕΝ-β добавляют в количестве 64 или 125 иммунизирующих единиц/мл в день, предшествующий началу эксперимента. Клетки культивируют в течение 3 дней, после чего в каждую лунку добавляют 20 мкл голубого Аламар, который является колориметрическим индикатором плотности клеток на основе оксидовосстановления (Н^Зощсе, СататШо, шт. Калифорния), и продолжают инкубацию в течение 6-7 ч. Цвет определяют в аппарате для чтения микропланшетов при выполнении твердофазного-иммуноферментного анализа (исследуемый фильтр 530 нм, контрольный фильтр 630 нм), выполняя несколько считываний в дублируемых лунках с целью корреляции кривых роста в зависимости от количества живых клеток и оптической плотности. Для измерения количества метилтрансферазы клетки из всех лунок лизируют путем замораживания-оттаивания в 25 мкл/лунку 25 мМ трис-НС1, рН 7,4, 1 мМ ЕЭТ^ 1 мМ ЕОТ^ 40 мкг/мл лейпептина и апротинина, 20 мкг/мл пепстатина, 1 мкМ фенилметилсульфонилфторида (РМ8Г). Реакции выполняют в 50 мкл объеме, используя 25 мкл клеточных экстрактов, 100 мкМ пептида В1 (№1)Ьаиег е1 а1., 1993; предоставлен фирмой Сепокук, Кембридж, Великобритания), 3 МКС1 [³Н] (метил)-8-аденозилметионина (АтегкИат, 73 С1/ммоль), в течение 30 мин при температуре 30°С. Культуру анализируют посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (16%), фиксируют в 50% метаноле, 10% уксусной кислоте, обрабатывают Αιηρ1ίΓχ® (АтегкИат) и в течение 8 дней выполняют авторадиографию. Эта антисмысловая ДНК Α8-1 способна сильно снижать активность протеинаргининметилстранферазы в клетках υ2668, которую измеряют путем введения меченых тритием метильных групп в субстрат пептида Β1 (фиг. 11). Указанную ДНК используют для исследования воздействия, оказываемого этим ферментом на интерферон. Для исследования выбрана подав23 ляющая рост активность интерферона, так как ее можно определить в клетках в количественном отношении, а также потому, что обнаружено взаимодействие белка РКМТ1 крыс с определяющими рост генными продуктами (Ьт с1 а1., 1996). Добавление антисмыслового-1 олигонуклеотида А8-1, который комплементарен последовательности, расположенной рядом с инициирующим кодоном кДНК белка 1К1В4/РКМТ, уменьшает подавляющее рост действие интерферона ΙΡΝ-β на миеломные клетки человека И2668 (фиг. 12). Это значит, что в присутствии антисмыслового олигонуклеотида А8-1 обработанные интерферонов клетки характеризуются более сильным ростом (исключая токсическое действие фосфотиоатов). Рост клеток при отсутствии интерферона существенно не изменяется. Смысловой олигонуклеотид 8-3, соответствующий той же области кДНК, оказывает незначительное воздействие (8-3, фиг. 12) по сравнению с антисмысловым-1 олигонуклеотидом. Смысловой олигонуклеотид 8-3 также оказывает незначительное ингибирующее действие на активность фермента (фиг. 11). Другой антисмысловой фосфортиоатны олигонуклеотид А8-2 (8ЕЦ ΙΌ № 13), направленный к середине кДНК и комплементарный нуклеотидам 572-592 последовательности 8ЕЦ ΙΌ № 1, почти не оказывает воздействия (фиг. 12). Пятикратное уменьшение подавляющего рост действия интерферона ΙΡΝ-β на миеломные клетки, которые частично лишены активности РРМТ антисмысловым-1 олигонуклеотидом, показывает, что связывание фермента 1В1В4/РВМТ с 1С-доменом рецептора ΙΡΝΑΚ1 имеет функциональное значение для действия интерферона на клетки.

Эти эксперименты также показывают, что белок ΙΚ1Β4 метилирует пептидные сусбраты ферментов класса РКМТ аналогично тому, как это показано на фиг. 11 для пептида Κ1 С1у-С1уРйе-С1у-С1у-Агд-С1у-С1у-Рйе-С1у (8ГО ГО № 11; №)Ьаисг е1 а1., 1993), использованного в этом эксперименте. Метилирование белков на остатках аргинина, расположенных рядом с остатками глицина (например, как это имеет место в вышеуказанном пептиде), дает модифицированный белок, который, как в случае фосфорилирования, служит для передачи сигналов в клетку. Группа ΙιηΒΝΓ белков является мишенью для ферментов РКМТ, и поскольку эти белки влияют на процессинг, сплайсинг, перенос и стабильность (Ыи апб ЭгеуГи55. 1995), их метилирование может играть определенную роль в посттранскрипционной регуляции экспрессии гена. Белок ГО.1В4/РКМТ, который, как установлено, связывается с цепью рецептора интерферона, может стимулировать изменение экспрессии гена в ответ на воздействие интерферона. Через рецептор интерферона могут быть метилированы другие белковые субстраты, в том числе другие компоненты комплекса рецептора интерферона и факторов транскрипции. Лин и др. (Ьш е1 а1., 1996) установили, что связывание РКМТ1 крыс с белками, индуцирующими фактор роста, активирует РКМТ1 и модифицирует специфичность его субстрата, вероятно, в результате удаления некоторых ингибирующих белков, связанных с РКМТ1 в цитоплазме клеток. Можно предположить наличие аналогичной активации белка ΙΚ1Β4, связанного с цепью ΙΡΝΑΚ1 рецептора интерферона.

Выводы

Описан новый белок ΙΚ1Β1, который взаимодействует с интрацитоплазматическим доменом цепи ΙΡΝΑΚ1 рецептора интерферона типа Ι. Этот белок быстро образуется и сохраняется непродолжительное время после обработки клеток человека интерфероном. Белок ΙΚ1Β1 отличается наличием сайтов фактора элонгации типа спираль-петля-спираль, которые являются признаком кальцийсвязывающих белков. Механизм действия интерферонов включает потоки ионов кальция, которые определяют, в частности, первичные реакции клеток и изменения в морфологии клеток и организации цитоскелета (Ташш е1 а1., 1987). Ферменты, активируемые ионами кальция, могут продуцировать вторичные мессенджеры, такие как диацилглицерин, в ответ на воздействие интерферонов. Кроме того, белки, подобные кальмодулину, регулируют количество протеинкиназ, при этом установлено, что эти механизмы действуют в клетках, обработанных интерфероном (Татт е1 а1., 1987). Вполне вероятно, что белок ΙΚ1Β1, связывающийся с рецептором интерферона, имеет непосредственное отношение к таким Са⁺⁺зависимым воздействиям интерферонов на клетки.

Двугибридный скрининг белков, взаимодействующих с ГС-доменом рецептора ΙΡΝΑΚ1, позволил выявить еще один белок ΙΚ1Β4, который оказался членом семейства ферментов протеинаргининметилтрансферазы (РΚМТ1; Ьт е1 а1., 1996). Известно, что этот фермент метилирует ряд РНК- и ДНК-связывающих белков, в частности, гетерологичных ядерных рибонуклеопротеинов (ΗτιΚ^). Рибонуклеопротеины участвуют в переносе мРНК из ядра в цитоплазму, поочередном сплайсинге пре-мРНК и посттранскрипционной регуляции (Ьт апб ЭгеуГи88, 1995). Белки ΙΚ1Β1 и IΚ1Β4/РΚМТ1, которые мигрируют в ГС-домен рецептора ΙΡΝΑΚ1, демонстрируют новые сигнальные механизмы интерферонов, которые существуют помимо известных путей бак-81а1, описанных Дарнелом и др. ГОагпеП е! а1., 1994).

После ознакомления с полным описанием этого изобретения специалистам в этой области должно быть понятно, что данное изобретение осуществимо в широком диапазоне эквивалентных параметров, концентраций и условиях, определяющих его объем и сущность, без какоголибо экспериментирования.

Хотя данное изобретение описано со ссылкой на конкретные варианты его осуществления, совершенно очевидно, что оно может включать другие модификации. Эта заявка охватывает все варианты, применения и адаптации, соответствующие основным принципам настоящего изобретения, в том числе все известные и общепринятые модификации, применяемые в области техники, к которой относится это изобретение, и определяемые основными признаками, изложенными в прилагаемой формуле изобретения.

Все приведенные ссылки, включая журнальные статьи или резюме опубликованные или соответствующие заявкам на патенты США или других стран, выданные патенты США или других стран и любые другие ссылки полностью входят в эту заявку, включая все приведенные в них данные, таблицы, чертежи и тексты. Кроме того, эта заявка в качестве ссылки включает список всех справочных материалов.

Ссылки на стадии известных методов, стадии стандартных методов, известные методы или стандартные методы ни в коем случае не предполагает, что описание или вариант осуществления настоящего изобретения ранее описан, изучен или предложен в данной области техники.

Приведенное выше описание конкретных вариантов осуществления изобретения достаточно полно характеризует общие признаки данного изобретения, поэтому с учетом известного уровня техники (включая список справочных материалов) можно легко модифицировать и/или адаптировать варианты осуществления настоящего изобретения в соответствии с разными применениями без чрезмерного экспериментирования, не выходя при этом за пределы объема настоящего изобретения. Все такие адаптации и модификации входят в объем рассмотренных вариантов осуществления изобретения на основании приведенного здесь описания и указаний. Следует отметить, что используемая здесь фразеология или терминология служит лучшему описанию изобретения и не ограничивает его объем, то есть терминология или фразеология настоящего описания изобретения может интерпретироваться специалистом в этой области в свете приведенных здесь указаний и описаний с учетом известного уровня техники.

Ссылки КеГегепсек

АЬтатоуюй, С., 8йи1тап, Ь.М, КаЮуйккн Е., Наггосй, 8., Тоуеу, М. Е1Б, Р. апБ Кеуе1, М. (1994) 01ГГегеп11а1 1утокше рйокрйоту1айоп оГ 1йе ΙΕΝΑΚ сйаш оГ !йе 1уре I 1п!егГетоп тееер1от апБ оГ ап аккос1а!еБ кигГасе рто!еш ίη гекропке Ю ΙΕΝα апБ ΙΕΝ-β. ЕМВО 1., 13:5871-5877.

А1!ксйи1, 8.Е., С1кй, V., М111ег, V., Муегк, Ε.ν. апБ Ь1ршап, ^^. (1990) Вакю 1оса1 айдптеп! гекеагсй !оо1. 1. Мо1. Вю1., 215:403-410.

Вайет, Р.Ь., СЫеп, С.Т., 8!етд1апг, К. апБ Е1е1Бк, 8. (1993) Ейтшайоп оГ Га1ке рокйтуек !йа1апке ш икшд !йе 1\\'о-йуЬпБ кук1еш. ВюТеейшдиек, 14:920-924.

Во1Бш М.Р. Уайо1ошееу, Е.Е. Рапсег, Ζ. Мей, 1.Ь. Сашошк ЕН. апБ Vа11асй ^. (1995) Α поуе1 рто!еш Паа! ίп!егас!к тейй 1йе Беа1й Бошана о Г Еак/АРО1 соп!ашк а кесщепсе той Г ге1а(еП 1о 11ае Беа1й Боташ. 1. Вю1. Сйет. 270:7795-7798.

ВгееБеп, Ь. апБ №уктйй, К., (1995) Кеди1а11оп о Г Пае уеак! НО депе. Со1Б 8рппд Натйог 8утр. ОнапН Вю1., 50:643-650.

Со1атошсц О.К., □'АНекк-наБго, Е., ΟίΗ/, М.О., Сгедогу, 8.А., №скет, Ь.М. апБ №тБап, К. (1990) Сйагас1еп/аНоп о Г !йгее топос1опа1 апйЬоБ1ек !йа! гесодш/е Пае 1п1егГегоп-а2 гесер!ог. Ргос. №й. АсаБ. 8с1. И8А 87, 7230-7234.

Оатей ЕЕ., Кегг, 1.М. апБ 8!агк. С.К. (1994) Бак-81а1 ра1й\таук апБ !тапкст1рйопа1 асйуайоп ш гекропке Ю 1Е№ апБ о!йег ех!тасе11и1ат Бдпайпд рто!ешк. 8с1епсе, 264:1415-1421.

ОшиБ, М., Сйеп, Н.Е., Соек, 8., Ьагпег, А.С. апБ №е1, В.С. (1995а) ^^ГГе^еηйа1 геди1айоп оГ Пае а1рйа/Ье!а 1п1егГегоп-к1ипи1а1еБ Бак/81а1 ра1й\тау Ьу !йе 8Н2 Боташ-соп!а1шпд 1утокше рйокрйа!аке 8НРТР1. Мо1. Се11. Вю1., 15:70507058.

ОауаБ- М., Ре!г1со1п, Е. III, Вещатш, С., Рте, К., ХУеЬег, М.1. апБ Ьагпег, А.С. (1995Ь) Кес.|шгетеп1 Гог МАР кшаке (ЕКК2) асйуйу ш [ЩегГегоп α- апБ [ШегГегоп в-кйти1а!еБ депе ехргеккюп !йгоидй 8!а! рто!ешк. 8с1епсе. 269:17211723.

ОауаБ- М., Рейтсош, Е. III. АпБ Ьагпег, А.С. (1996) Асйуайоп оГ Рго!еш кшаке А 1пй1Ьйк ШетГегоп шБисйоп оГ !йе 1ак/81а1 ра1й\тау ш И266 се11к. 1. Вю1. Сйет., 271:4585-4588.

^е^кк, Ь.Р. апБ К1тсй1, А. (1991) А депейс !оо1 икеБ !о 1БепйГу 1ййогеБохш ак а теБ1а!ог оГ а дго\\1й шй1Ьйоту к1дпа1. 8с1епсе 252, 117-20.

Оотапккн Р., ХУШе, М., Ке11ит, М., КиЬшк!е1п, М., Наскей, К.. Рййа, Р. АпБ Со1атошс1, О.К. (1995) С1ошпд апБ ехргеккюп оГ а 1опд Гогт оГ !йе Ье!а киЬипй оГ !йе Шейегоп а1рйа Ье!а гесер!ог 11аа( 1к гесрнгеБ Гог Бдпайпд. 1. Вю1. Сйет., 270:21606-21611.

ОтРее, Т., Весйегег, К, Сйеп. Р.-Ь., Уей, 8Н, Уапд, Υ., КйЬигп, А.Е., Ьее, ν.-Н. апБ Е11еБде, 8. (1993). Тйе тейпоЬ1ак1ота рго!еш аккось а!ек тейй !йе рто!еш рйокрйа!аке !уре 1 са!а1уйс киЬишй Сепек & Оеур!., 7:555-569.

ЕШк, Ь., С1аикег, Е., Могдап, ^.О., ЕБегу, М., Ко!й, К. А. апБ Кийет, ν.Ρ (1986) Кер1асетеп! оГ шкийп гесер!ог 1утокше теыБиек 1162 апБ 1163 сотргопикек тки1т-кйти1а!еБ кшаке асйуйу апБ ир!аке оГ 2-Беохуд1исоке. Се11, 45, 721731.

Е1е1Бк, 8. апБ 8опд, О. (1989). А поуе1 депейс кук!ет !о Бе!ес! рго!еш-рго!еш ш!егасйопк.

Ханне 340:245-246.

Сиепш, О. е!. а1. (1989). ОХА 8:675-682.

НаггосЬ, 8., Ясус1. М. апЛ СЬеЬаШ, I. (1994). 1п1ег1еикт-6 з1дпайпд νίη Гоиг йапзспрИоп Гас1огз ЬшЛшд райпЛтотк епЬапсегз оГ Л1ГГегеп! депез. 1. Вю1. СЬет., 269:26191-26195.

НеткоГГ, 8. апЛ НеткоГГ, 1.6. (1992). Ргос. ИаН. АсаЛ. 8с1. И8А, 89:10915-10919.

Кадап, К.М. апЛ С1агке, 8. (1994) А1ЛезргеаЛ оссштепсе оГ !Ьгее зесщепсе тойГз ш Л1уегзе 8-аЛепозу1 теЛиопше-ЛерепЛегИ те!Ьу1ЦапзГегазез зиддез1з а соттоп зйисШге Гог Незе епхутез. АгсЬ. ВксЬет. ВкрЬуз., 310, 417-427.

Ьее, ν.Ό. апЛ Ниапд, В. (1993). Ргос. ИаЙ. АсаЛ. 8с1. И8А 90:11039-11043.

Ьеипд, 8., ОигезЕй 8.А., Кегг, 1.М., Пагпе11, ТЕ. апЛ 81агк, б.К. (1995). Ко1е оГ 81а12 ш Не а1рЬа 1п1егГегоп з1дпайпд ра!Ьтеау. Мо1. Се11. Вю1., 15:1312-1317.

Ьт, А.-Т, багу, Ι.Ό., Уапд, М.С., С1агке, 8. апЛ НегзсЬтап, Н.К. (1996). ТЬе таттайап 1ттеЛ1а!е-еаг1у Т1821 ргокш апЛ Не 1еикет1ааззошакЛ ВТб1 ртокш шГегасГ тейЬ а РгоГетагдшше МеШуЙгапзГегазе. 1. Вю1. СЬет., 271:15034-15044.

Ыи, О. АпЛ ЭгеуГизз. б. (1995). 1п у1уо апЛ ш уйго агдште те1Ьу1айоп оГ КИА-ЬшЛшд ргокшз. Мо1. Се11. Вю1., 15:2800-2808.

№1)Ьаиег. 1., 1оЬпзоп, В.А., Уоипд, А.Ь. апЛ АзтеагЛ, Ό.Α. (1993) РерйЛез тейк зесщепсез зшЫаг !о д1усше агдште псй то!1Гз ш ргокшз шкгасйпд тейЬ КИА аге еГГккпЛу гесодшхеЛ Ьу теШуИгапзГетазез тоЛйушд агдште ш питегоиз ргокшз. 1. Вю1. СЬет., 268, 10501-10509.

И1катеа, 1.-Ι., Иакапо, Н. апЛ ОШ, N. (1996) 81гис1ига1 апЛ £ипсйопа1 сопзегуайоп оГ Ьитап уеаз! НСР1 депез теЫсЬ сап зирргезз 1Ье дготе1Ь ЛеГес! оГ 1Ье 8ассЬаготусез сегеу131ае ί ге15 ти1ап1. бепе, 171, 107-111.

ВеуеЙ М. (1984). ТЬе 1п1егГегоп зуз!ет ш тап: пакте оГ !Ье 1п1егГегоп то1еси1ез апЛ тоЛе оГ асйоп. 1п Вескег, I. (еЛ.). Ап11У1га1 Эгидз апЛ 1п1егГегоп. ТЬе то1еси1аг Ьаз1з оГ Фей асйуйу. Магйпиз ИуЬоГГ РиЬ1., Воз!оп, рр. 357-433.

КегеЙ М. апЛ СЬеЬаШ, 1. (1986) 1п1егГегопасЙуа!еЛ депез. ТгепЛз ВксЬет. 8сг, 11:166-170.

81еш, С.А., 8иЬазшдЫ, С., 8Ыпохика, К. апЛ СоЬеп, 1.8. (1989) РЬузкосЬетка1 ргорегйез оГ рЬозрЬого!Ьюпак ойдоЛеохупис1еойЛез. Иис1ек Ас1Лз Кез., 16, 3209-3221.

Татт, I., Ьт, 8.Ь., РГеГГег, Ь.М. апЛ 8еЬда1, Р.В. (1987). 1п1егГегопз α апЛ β аз се11и1аг геди1а1огу то1еси1ез. 1п бгеззег. I. (еЛ.), 1п1егГегоп 9, АсаЛ. Ргезз, ЬопЛоп, рр. 14-74.

и хе. б., ЬиГГа11а, б. апЛ бгеззег, I. (1990). бепейс 1гапзГег оГ а Гипсйопа1 Ьитап ШкгГегоп α гесер!ог ш!о тоизе се11з: с1ошпд апЛ ехргеззкп оГ Йз сОИА. Се11, 60:225-234.

Аккзйот, Е. (1991). Ш: Ргозрес1з Гог Апйзепзе Иис1е1с Ас1Л ТЬегару оГ Сапсег апЛ АШ8. рр. 7-24, Айеу-Ызз, Иете Уогк.

Уапд, С.Н., 8Ы, А, Вази, Ь., Мигй, А., Сопз!апйпезси, 8.Ν., В1ай, Ь., Сгохе. Е., Ми11егзтап,

ЕЕ. апЛ РГеГГег, Ь.М. (1996). Эйес! аззоаайоп оГ 8!а!3 тейЬ Не ТЕИАК-1 сЬаш оГ Не Ьитап !уре I йиегГегоп гесер!ог. 1. Вю1. СЬет., 271:8057-8061.

Список последовательностей (1) Общая информация (ί) Заявители: Кетей М1сЬае1 СЬеЬаШ, 1иЛйЬ АЬтатоущЬ, Сатойпа (й) Название изобретения: Новые белки, связывающиеся с рецепторами I интерферона, кодирующая их ДНК и способы модуляции реакции клеток на интерфероны (ίίί) Количество последовательностей: 13 (ίν) Адрес для отправки корреспонденции:

(A) Адресат: ВготеЛу апЛ Иеипагк (B) Улица: 419 8еνеηίй 8йее1, Ν.Α., 8и11е 300 (C) Город: АазЫпдТоп (Вашингтон) (Ό) Штат: Ό.6 (округ Колумбия) (Е) Страна: И8А (США) (Е) Почтовый индекс: 20004 (ν) Компьютерные данные:

(A) Среда считывания: гибкий диск (B) Компьютер: ШМ-совместимый персональный компьютер (C) Операционная система: РС-

ПО8/М8-ЭО8 (Ό) Программное обеспечение: программа Ра1епйп. выпуск 1.0, версия 1.30 (νί) Данные текущей заявки:

(A) Номер заявки: И8 (B) Дата подачи:

(νίί) Данные предшествующей заявки:

(A) Номер заявки: И8 60/035636 (B) Дата подачи: 15 января 1997 г.

(νίίί) Информация о поверенном и представителе заявителя:

(A) Фамилия и имя: ВготеЛу, Кодег Ь.

(B) Регистрационный номер: 25618 (C) Номер дела/досье: КЕVЕ^=14 РСТ (ίχ) Информация о телесвязи:

(A) Телефон: 202-628-5197 (B) Телефакс: 202-737-3528 (2) Информация для последовательности 8ЕО ГО № 1:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 830 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (й) Тип молекулы: кДНК (ίχ) Признак:

(A) Название/определитель: СЭ8 (B) Локализация: 43..615 (χί) Описание последовательности: 8ЕО ГО № 1

(2) Информация для последовательности 8ЕС ΙΌ № 2:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 191 аминокислота (B) Тип: аминокислота (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: белок (χί) Описание последовательности: 8Е0 ΙΌ № 2

Мее С1у С1у Зег С1у Зег Агд Ьеи Зег Ьуз СХи Ьеи Ьеи А1а С1и Туг 15 1015

СГп Азр Ьеи ТЬг РЬе Ьеи ТЬг Ьув О1п С1и Не Ьеи Ьеи А1а Ηΐε Агд 20 2530

Агд РЬе Су6 С1и Ьеи Ьеи Рго С1п СГи С1п Агд Зег Уа1 С1и Зег Вег 35 4045

Ьеи Αχ-д А1а С1п ναΐ Рго РЬе СХи С1П Не Ьеи Вег Ьеи Рго С1и Ьеи 50 5560

Ьуз А1а Азп Рго РЬе Ьув С1и Агд 11е Сув Агд Уа1 РЬе Зег ТЬг Зег 65 70 75Θ0

Рго

АГ а

Ьу5

Азр

Зег

Ьеи

Зег

РЬе

СХи

Азр

РЬе

Ьеи

Авр

Ьеи

Ьеи

Зег

85

• 90

-·

•95

Уа1

РЬе

Зег

Аэр

ТЬг

А1а

ТЬг

Рго

Авр

11е

.Ьув

Зег

Ηίβ

Тут

А1а

РЬе

100

105

но

Агд

Не

РЬе

Азр

РЬе

Азр

Авр

Авр

СХу

ТЬг

Ьеи

Азп

Агд

С1и

Азр

Ьеи

115

120

125

Зег

Агд

Ьеи

УаГ

Азп

Сув

Ьеи

ТЬг

СХу

СХи

СХу

СХи

Азр

ТЬг

Агд

Ьеи

130 · 135 ·.·' < 140

Зег АГ а Зег С1и МеС Ьув С1п Ьеи 11е Авр Тут 11е Ьеи С1и 61и Зег

145 150 155160

Азр Не Азр Агд Азр С1у ТЬг 11е Авп Ьеи Зег СХи РЬе С1п Ηΐε Уа1

165 170 ·175

Не Зег Агд Зег Рго Авр РЬе А1а Зег Зег РЬе Ьув Не Уа1 Ьеи

180 · 185 ^:‘ 190 (2) Информация для последовательности 8ЕС ΙΌ № 3:

(ί) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 170 аминокислот (B) Тип: аминокислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: пептид (χί) Описание последовательности: 8ЕС ΙΌ

Информация для последовательности (2)

8ЕЕ) ΙΌ № 4:

(ί) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 172 аминокислоты (B) Тип: аминокислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: пептид (χί) Описание последовательности: 8ЕС ΙΌ № 4:

Мее 1

А1а Зет

Азп

РЬе Ьуз Ьув АХа Азп Мее АГ а Зег Зег Зег

С1п Агд 15

5

10

Ьув

Агд

Мее

Зег

Рго

Ьуз

Рго

СХи

Ьеи

ТЬг

С1и

С1и

С1п

Ьуз

СХп

С1и

20

25

30

Не

Агд

С1и

А1а

РЬе

Авр

Ьеи

РЬе

Азр

А1а

Авр

С1у

ТЬг

СГу

ТЬг

Не

35

40

45

Азр

Уа1

Ьув

С1и

Ьеи

Ьув

УаХ

А1а

Мее

Агд

А1а

Ьеи

СХу

РЬе

СГи

Рго

50

55

60

Ьув

Ьуз

С1и

С1и

11е

Ьув

Ьув

Мее

Не

Зег

СХи

Не

Авр

Ьув

СХи

С1у

65

70

75

80

ТЫ

СГу

Ьуз

МеЬ

Азп

РЬе

С1у

Азр

РЬе

Ьеи

ТЫ

УаХ

Мее

ТЬг

С1п

Ьуз

85

90

95

Мее

Зег

СГи

Ьув

Азр

ТЬг

Ьув

С1и

С1и

11е

Ьеи

Ьуз

А1а

РЬе

Ьуз

Ьеи

100

105

110

РЬе

Авр

Азр

Азр

С1и

ТЬг

СХу

Ьув

11е

Зег

РЬе

Ьув

Авп

Ьеи

Ьуз

Агд

115

120

125

Уа1

А1а

Ьув

СГи

Ьеи

С1у

СХи

Авп

Ьеи

ТЬг

Авр

С1и

С1и

Ьеи

СГп

С1и

130

135

140

Меи

Не

Азр

С1и

А1а

Азр

Агд

Авр

СГу Авр

С1у

С1и

УаГ

Зег

СГи

С1п

145

150

155

160

СГи

РЬе

Ьеи

Агд

Не

нее

Ьув

Ьув

ТЬг

Вег

Ьеи

Туг

165

170

(2) Информация для последовательности 8ЕЕ) ΙΌ № 5:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 31 пара оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: кДНК (χί) Описание последовательности: 8ЕС ΙΌ № 5:

СТСАССАТСС АААСТСТТСТ ТСАСАТССАТ С (2) Информация для последовательности 8ЕЕ) ΙΌ № 6:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 25 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: кДНК (χί) Описание последовательности: 8ЕС ΙΌ № 6:

№ 3:

ТСАССААТТС СТАТСАТАСА ААСТС 25 (2) Информация для последовательности 8ЕО ΙΌ № 7:

(ί) Характеристики последовательности: (А) Длина: 1308 пар оснований (Β) Тип: нуклеиновая кислота (С) Структура цепи: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: кДНК (ίχ) Признак:

(А) Название/определитель: СО8 (Β) Локализация: 16..1098 (χί) Описание последовательности: 8ЕО ΙΌ № 7:

Мее Сйи Азп РЬе Уай Айа ТЬг Ьеи Айа Авп С1у МеС Зег Ьеи Сйп Рго

1

5

10

15

Рго

Ьеи

О1и

Сйи 20

Уай

5ег

Суз

Сйу

Сйп 25

Айа

Сйи

Зег

Зег

Сйи 30

Ьу5

Рго

Азп

Айа

Сйи 35

Азр

Мее

ТЬг

Зег

Ьуз 40

Азр

Туг

Туг

РЬе

Азр 45

Зег

Туг

Айа

НХ8

РЬе 50

Сйу

Не

Н13

Сйи

Сйи 55

Мее.

Ьеи

Ьуз

Азр

С1и 60

Уай

Агд

ТЬг

Ьеи

ТЬг 65

Туг

Агд

АЗП

5ег

нее 70

РЬе

Ηίε

Азп

Агд

ΗΪ8 75

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азр

Ьуз 80

Уай

Уай

Ьеи

Азр

Уай 85

О1у

Зег

Сйу

ТЬг

Сйу 90

11е

Ьеи

Суз

мее

РЬе 95

А1а

Айа

Ьуз

Айа

Сйу 100

Айа

Агд

Ьуз

Уа1

Не 105

С1у

Не

сйи

Суз

Зег но

Зег

Не

5ег

Азр

Туг 115

А1а

Уай

Ьуз

Не

Уай 120

Ьуз

А1а

Азп

Ьуз

Ьеи 125

Авр

Ηίε

Уай

Уай

ТЬг 130

Не

Не

Ьуз

С1у

Ьуз 135

Уай

Сйи

Сйи

Уай

Сйи 140

Ьеи

Рго

Уай

Сйи

Ьуз 145

Уай

Азр

Не

Не

Не 150

Зег

Сйи

Тгр

мее

Сйу Туг 155

Суз

Ьеи

РЬе

Туг 160

Сйи

Зег

Мее

Ьеи

Азп 165

ТЬг

Уай

Ьеи

туг

Айа 170

Агд

Азр

Ьуз

Тгр

Ьеи 175

Айа

Рго

Азр

Сйу

Ьеи 100

Не

РЬе

Рго

Азр

Агд 185

Айа

ТЬг

Ьеи

Туг

Уай 190

ТЬг

Айа

Не

Сйи

Азр 195

Агд

С1п

Туг

Ьуз

Азр 200

туг

Ьуз

Не

Нхв

Тгр 205

Тгр

Сйи

Азп

Уай

Туг 210

Сйу

РЬе

Авр

Мее

Зег 215

Суз

Не

Ьуз

Авр

Уай 220

Айа

Не

Ьуз

Сйи

Ъуз

Тгр

Ьеи

А1а

Рго

Авр

61у

Ьеи

11е

РЬе

Рго Азр

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

365

370

375

ТАТ

СТС

АСС

ОСС

АТС

САС

САС

ССС

САС

ТАС

АДА САС

ТАС

ААС

АТС

САС

627

Туг

Уа1

ТЬг

Айа

Не

Сйи

Азр

Агд

Сйп

Туг

Ьуз Авр

Туг

Ьуе

11е

Нхв

380

385

390 -

395

ТСС

ТСС

САС

ДАС

СТС

ТАТ

ссс

ттс

САС

АТС

ТОТ-ТСС

АТС

АДА

САТ

СТС

675

Тгр

Тгр

С1и

А5П

Уа1

Туг

61у

РЬе. Азр

Мее

8ег Суз

ййе

Ьуз

Азр

Уа1

Рго 225

Ьеи

Уай

Азр

Уай

Уай 230

Азр

Рго

Ьуз

Сйп

Ьеи 235

Уай

ТЬг

Азп

Айа

Суз 240

Ьеи

Не

Ьуе

Сйи

Уай 245

Азр

Не

Туг

ТЬг

Уай 250

Ьуз

Уай

Сйи

Азр

Ьеи 255

ТЬг

РЬе

ТЬг

Зег

Рго 260

РЬе

Суз

Ьеи

Сйп

Уай Ьуз ;265 ·

Агд Азп

Азр

туг 270

Уай

Н15

Айа

Ьеи

Уай 275

Айа' Туг

РЬе

Азп

Не '280:

Сйи

РЬе

ТЬг Агд

Суз '•285

Нхз

Ьуз

Агд

ТЬг

Сйу 290

РЬе

Зег

ТЬг

Зег

Рго 295

Сйи

Зег

Рго

Туг

ТЬг 300

Нхв

Тгр

Ьуз

Сйп

ТЬг 305

Уай

РЬе

Туг

Мес

Сйи 310

Авр

Туг

Ьеи

ТЬг

Уай 315

Ьуз

ТЬг

Сйу

Сйи

Сйи 320

Не

РЬе

Сйу

ТЬг

Не 325

Сйу

МеС

Агд

Рго

А8П 330

Айа

Ьуз

Авп

Азп

Агд 335

Азр

Ьеи

Азр

РЬе

ТЬг 340

Не

Авр

Ьеи

Азр

РЬе 345

Ьуз

Сйу

Сйп

Ьеи

Суд 350

Сйи

Ьеи

Зег

Суз

Зег 355

ТЬг

Азр

Туг

Агд

Мес 360

Агд

(2) Информация для последовательности 8ЕО ΙΌ № 9:

(ί) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 353 аминокислоты (Β) Тип: аминокислота (С) Структура цепи: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: белок (χί) Описание последовательности: 8ЕО ΙΌ № 9:

(2) Информация для последовательности 8ЕО ΙΌ № 8:

(ΐ) Характеристики последовательности: (А) Длина: 361 аминокислота (Β) Тип: аминокислота (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: белок (χί) Описание последовательности: 8Е0 ΙΌ № 8:

мес А1а А1а АХа С1и А1а АХа Азп Сув Не Мее О1и УаХ Зег сув С1у

1

5

10

15

СХп

А1а

СХи

Зег 20

Зег

С1и

Ьуз

Рго

Азп 25

АХа

СХи

Азр

Мее

ТЬг 30

Зег

Ьуз

А5р

туг

Туг 35

РЬе

Авр

Бег

Туг

АХа 40

Н£з

РЬе

СХу

Не

Ηίβ 45

С1и

СХи

Мес

Ьеи

Ьуз 50

Азр

СХи

УаХ

Агд

ТЬг 55

Ьеи

ТЫ

Тух

Агд

Азп 60

Зег

Мее

РЬе

Н16

Азп 65

Агд

ΗΪ5

Ьеи

РЬе

Ьуз 70

Азр

Ьуз

УаХ

УаХ

Ьеи 75

Азр

Уа1

СХу

Зег

СХу 80

ТЬг

СХу

Не

Ьеи

Сув 85

Мее

РЬе

АХа

АХа

Ьуз 90

АХа

СХу

А1а

Агд

Ьув 95

Уа1

Не

С1у

11е

СХи 100

Суз

Зег

Зег

1Хе

Зег 105

Азр

Туг

АХа

УаХ

Ьув 110

11е

УаХ

Ьув

АХа

Азп 115

Ьув

Ьеи

Азр

ΗΪΒ

УаХ 120

УаХ

ТЬг

Не

Не

Ьув 125

СХу

Ьув

Уа1

С1и

СХи 130

УаХ

СХи

Ьеи

Рго

Уа1 135

СХи

Ьуз

УаХ

Авр

Не 140

Не

Не

Бег

СХи

Тгр 145

Мее

СХу

Туг

Суз

Ьеи 150

РЬе

Тух

СХи

Зег

Мее 155

Ьеи

Авп

ТЬг

Уа1

Ьеи 160

Ηίε

АХа

Агд

Авр

Ьуз 165

тгр

Ьеи

А1а

Рго

Азр 170

СХу

Ьеи

Не

РЬе

Рго 175

Азр

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи 180

Туг

УаХ

ТЫ

А1а

ХХе 165

С1и

Авр

Агд

С1п

Тух 190

Ьув

Азр

Туг

Ьув

Не Ί 95

н1в

Тгр

'Тгр

СХи

Авп 2ПП

УаХ

Тух

СХу

РЬе

Авр 205

Мее

Зег

Сув

Не

Ьув 210

Азр

Уа1

АХа

Не

Ьув 215

СХи

Рго

Ьеи

УаХ

Авр 220

Уа1

УаХ

Авр

Рго

ьув 225

СХп

Ьеи

УаХ

ТЬг

Авп 230

А1а

Сув

Ьеи

Не

Ьув 235

С1и

УаХ

Азр

Не

Туг 240

ТЬг

УаХ

Ьув

УаХ

СХи 245

Азр

Ьеи

ТЬг

РЬе

ТЫ 250

Зег

Рго

РЬе

Сув

Ьеи 255

СХп

Уа1

Ьув

Агд

Азп 260

Авр

Туг

УаХ

Н18

АХа 265

Ьеи

УаХ

А1а

Тух

РЬе 270

Азп

Не

С1и

РЬе

ТЬг 275

Агд

Суз

Н18

Ьув

Агд 280

ТЬг

С1у

РЬе

Зег

ТЬг 285

Зег

Рхо

СХи

Зег

Рго 290

Туг

ТЬг

Ηϊβ

Тгр

Ьуз 295

С1П

ТЬг

УаХ

РЬе

Тух 300

Мее

СХи

Азр

Тух

Ьеи 305

ТЬг

УаХ

Ьув

ТЬг

СХу 310

СХи

С1и

1Хе

РЬе

СХу 315

ТЬг

Не

СХу

Мее

Агд 320

Рго

Азп

АХа

Ьув

Авп 325

Азп

Агд Азр

Ьеи

Авр 330

РЬе

ТЬг

•Не

Авр

Ьеи 335

Азр

РЬе

Ьув

СХу

СХп 340

Ьеи

Суз

СХи

Ьеи

Зег 345

Суз

Зег

ТЬг Авр

Тух 350

Агд

Мес

Агд (2) Информация для последовательности 8ЕО ΙΌ № 10:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 360 аминокислот (B) Тип: аминокислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: белок (χί) Описание последовательности: 8ЕО ΙΌ № 10:

Мес 1

С1и

Авп

РЬе Уа1 АХа ТЬг Ьеи АХа Азп С1у Мее Бег Ьеи С1п Рго

5

10

15

Рго

Ьеи

С1и

СХи

УаХ

Бег

Сув

С1у

61η

АХа

С1и

Бег

Зег С1и

Ьуз

Рхо

20

25

30

Авп

АХа

СХи

Азр

Мее

ТЬг

Зег

Ьуз

Азр

Туг Туг

РЬе

Авр Зег

Туг

АХа

35

40

45

Н1в

РЬе

СХу

Не

ΗΪΒ

С1и

СХи

мее

Ьеи

Ьув

Азр

С1и

Уа1 Агд

ТЬг

Ьеи

50

55

60

ТЬг

Тух

Ахд

Азп

Зег

Мее

РЬе

Ηίβ

Азп

Ахд

Ηίε

Ьеи

РЬе Ьуз

Авр

Ьув

65

70

75 .

80

УаХ

УаХ

Ьеи

Авр

УаХ

СХу

Бег

С1у

ТЬг

СХу

Не

Ьеи

Суе Мее

РЬе

АХа

85

90

95

АХа

Ьув

АХа

СХу

А1а

Агд

Ьуз

УаХ

ТХе

С1у

Не

УаХ

Сув Зег

Зег

11е

100

-

105

110

Зег

Авр

Тух

АХа

УаХ

Ьув

Не

УаХ

Ьув А1а-Авп'Ьуб1

•Ьеи’Авр

Ηίβ

УаХ

115

120

лХПЛ.

;Ц.-д:<-125

УаХ

ТЬг

Не

Не

ьуз

С1у

Ьуз

УаХ

С1и

СХи

Уа1

С1и

Ьеи Рхо

УаХ

СХи

130

135

140

Ьув

Уа1

АХа

Зег

Бег

Бег

АХа

Зег

СХу

Тгр

А1а

ТЬх

А1а Зег

Зег

ТЬг

145

150

155

160

Бег

Рхо

Сув

Бег

ТЬг

Рго

Суз

Бег

Нее

Рго

СХу

ТЬг

Бег Уа1

АХа

Рго

165

170

175

Азр

С1у

Ьеи

Не

РЬе

Рхо

Азр

Агд

АХа

ТЬг

Ьеи

Тух

Уа1 ТЫ

АХа

Не

180

185

190

СХи

Авр

Агд

СХп

Тух

Ьуз

Азр

туг

Ьув

Не

НХв

Тгр

Тгр СХи

Авп

Уа1

195

200

205

туг

С1у

РЬе

Авр

мее

Бег

Суз

Не

ьув

АВр

Уа1

АХа

Не Ьуз

СХи

Рго

210

215

220

Ьеи

УаХ

Азр

УаХ

УаХ

Азр

Рго

Ьув

С1п

' Ьеи

УаХ

ТЬг

Азп АХа

Суз

Ьеи

225

230

235

240

Не

Ьув

СХи

УаХ

Азр

Не

тут-

ТЬг

Уа1

Ьув - УаХ

С1и

'Авр Ьеи

ТЬг

РЬе’

245

250

255

ТЬг

Зег

Рхо

РЬе

Суз

Ьеи

.СХп

УаХ

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Туг Уа1

НХБ

АХа

260

265

’ 270

Ьеи

УаХ

АХа

Туг

РЬе

Азп

Не

СХи

РЬе

ТЬг

Агд

Суз

Ηίβ Ьув

Агд

ТЬг

275 280 285

С1у РЬе 290

Бег

ТЬх Бег

Рго С1и Бег Рхо Туг ТЬг Нхз Тгр Ьув С1п ТЬх

295

300

УаХ

РЬе

Тух

мее

СХи

Авр

Тух

Ьеи

ТЫ

УаХ

Ьуз

ты'

СХу

СХи

СХи

1Хе

305

310

315

320

РЬе

СХу

ТЬг

Не

СХу

мее

Агд

Рхо

Авп

АХа

Ьуз

Авп

Азп

Агд

Авр

Ьеи

325

330

335

Авр

РЬе

ТЬг

Не

Азр

Ьеи

Авр

РЬе

Ьув

СХу

С1п

Ьеи

Суе

СХи

Ьеи

Зег

340

345

350

Суз Зег ТЬг Азр Туг Агд Мее Агд

355 360 (2) Информация для последовательности 8ЕО ΙΌ № 11:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 10 аминокислот (B) Тип: аминокислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: пептид (χί) Описание последовательности: 8ЕО ΙΌ № 11:

С1у 31у ΡΙίθ С1у С1у Агд С1у С1у РЬе С1у

10 (2) Информация для последовательности 8ЕО ΙΌ № 12:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 22 пары оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: кДНК (χί) Описание последовательности: 8ЕО ΙΌ № 12:

ООСТАСАААА ТТСТССАТОА ТО 22 (2) Информация для последовательности 8ЕО ΙΌ № 13:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 21 пара оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Структура цепи: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: кДНК (χί) Описание последовательности: 8ЕЦ ΙΌ № 13:

ТСССССТСАС АТАСАСССТС С

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (23)

1. Рекомбинантная молекула ДНК, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, связывающийся с рецептором ШЫАКЗ, способный индуцироваться интерфероном ΙΕΝ-α или ΙΕΝ-β, и имеющая нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ № 1 или варианты 8ЕЦ ΙΌ № 1, полученные в силу вырожденности генетического кода.

2. Рекомбинантная молекула ДНК, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, связывающийся с рецептором ШЫАКЗ, способный индуцироваться интерфероном ΙΕΝ-α или ΙΕΝ-β, и имеющая нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ № 1 или варианты 8ЕЦ ΙΌ № 7, полученные в силу вырожденности генетического кода.

3. Рекомбинантная молекула ДНК по п.1 или 2, дополнительно включающая промотор, связанный путем сшивки с указанной последовательностью, в смысловой ориентации, так что указанная молекула ДНК способна экспрессировать белок, если рекомбинантная молекула ДНК находится в соответствующем экспрессирующем хозяине.

4. Рекомбинантная молекула ДНК по п.3, в которой указанный промотор является сильным структурным промотором в клетках человека.

5. Рекомбинантная молекула ДНК по п.1, в которой указанная нуклеотидная последовательность является последовательностью 8Е0 ΙΌ № 1.

6. Рекомбинантная молекула ДНК по п.2, в которой указанная нуклеотидная последовательность является последовательностью 8Е0 ΙΌ № 7.

7. Рекомбинантная молекула ДНК или РНК, включающая молекулу ДНК, включающую нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ΙΌ № 1 в смысловой или антисмысловой ориентации или ее фрагмент, способный гибридизоваться с мРНК, кодирующей индуцируемый интерфероном белок, связывающийся с рецептором ШЫАК1, предотвращая таким образом его экспрессию, или молекулу РНК с последовательностью, комплементарной последовательности 8Е0 ΙΌ № 1.

8. Рекомбинантная молекула ДНК или РНК, включающая молекулу ДНК, включающую нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ № 7 в смысловой или антисмысловой ориентации или ее фрагмент, способный гибридизоваться с мРНК, кодирующей индуцируемый интерфероном белок, связывающийся с рецептором ШЫАК1, предотвращая таким образом его экспрессию, или молекулу РНК с последовательностью, комплементарной последовательности 8Е0 ΙΌ № 7.

9. Рекомбинантная молекула ДНК или РНК по п.7 или 8, включающая молекулу РНК, комплементарную последовательности 8Е0 ΙΌ № 1 или 8ЕЦ ΙΌ № 7.

10. Рекомбинантная молекула ДНК или РНК по п.7 или 8, в которой указанная последовательность находится в смысловой ориентации.

11. Рекомбинантная молекула ДНК или РНК по п.7 или 8, в которой указанная последовательность находится в антисмысловой ориентации.

12. Рекомбинантная молекула ДНК или РНК по п.11, дополнительно включающая промотор, связанный путем сшивки с указанной последовательностью в антисмысловой ориентации, так что указанная молекула ДНК способна экспрессировать антисмысловую РНК, комплементарную всей смысловой РНК или ее части, кодирующей индуцируемый интерфероном белок, связывающийся с рецептором ШЫАК1.

13. Рекомбинантная молекула ДНК по п.12, в которой указанная нуклеотидная последовательность является сегментом 5'-конца последовательности 8ЕЦ ΙΌ № 1 или 8ЕЦ ΙΌ № 7.

14. Рекомбинантная молекула ДНК по любому из пп.3, 12 или 13, в которой указанный промотор является промотором, индуцируемым интерфероном.

15. Экспрессирующий вектор, включающий рекомбинантную молекулу ДНК по любому из пп.1-8 и 10-13.

16. Штамм клетки-хозяин, способный экспрессировать антисмысловую РНК, комплементарную смысловой РНК, кодирующей индуцируемый интерфероном белок, связывающийся с рецептором ШЫАК1, причем штамм включает экспрессирующий вектор по п.15.

17. Способ пролонгации выживаемости тканевого трансплантата, включающий следующие стадии:

введение экспрессирующего вектора, включающего рекомбинантную молекулу ДНК по любому из пп.11-13, в клетки ткани или органа, трансплантируемого больному; и трансплантацию ткани или органа больному.

18. Способ усиления ответа на экзогенную терапию интерфероном при лечении рака, включающий следующие стадии:

введение непосредственно в опухоль экспрессирующего вектора, включающего рекомбинантную молекулу ДНК по любому из пп.4-6; и последующую терапию путем введения экзогенного интерферона.

19. Белок, кодируемый молекулой ДНК по п.1, отличающийся тем, что он способен связы37 ваться с рецептором ^ΝΆ^ и имеет последовательность ЗЕр ГО № 2.

20. Белок, кодируемый молекулой ДНК по п.2, отличающийся тем, что он способен связываться с рецептором IΡNАΚ.1 и имеет последовательность ЗЕр ГО № 8.

21. Моноклональное антитело, специфичное к белку, связывающемуся с рецептором IΡNΆΚ1 по п.19 или 20, или молекула, включающая антигенсвязывающую часть такого моноклонального антитела.

22. Способ получения белка, связывающегося с рецептором IΡNАΚ1, включающий вве дении ДНК по п.1 в соответствующий экспрессирующий хозяин, так чтобы в культивируемом хозяине происходила экспрессия указанного белка, и культивирование указанного хозяина до достижения экспрессии указанного белка.

23. Способ получения белка, связывающегося с рецептором IΡNАΚ.1, включающий введении ДНК по п.2 в соответствующий экспрессирующий хозяин, так чтобы в культивируемом хозяине происходила экспрессия указанного белка, и культивирование указанного хозяина до достижения экспрессии указанного белка.