ES2275297T3 - Proteinas de union a receptor 1 de interferon adn que las codifica y metodos para modular la respuesta celular a los interferones. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión a receptor IFNAR1 que es capaz de ser inducida por IFN-a o por IFN-/3, y que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 8.
Description
Proteínas de unión a receptor 1 de interferón,
ADN que las codifica y métodos para modular la respuesta celular a
los interferones.
La presente invención se refiere de forma
general a los mecanismos moleculares de la acción de interferón y,
más específicamente, a nuevas proteínas de unión a receptor 1
interferón, a moléculas de ADN recombinante que las codifican, y a
métodos para modular la respuesta celular al interferón.
Los interferones de tipo I (subtipos
IFN-\alpha y -\beta) producen efectos
pleiotrópicos en las células, tales como la inhibición de la
replicación vírica (efecto antiviral), la inhibición de la
proliferación celular (efectos antitumorales), y la modulación de
las actividades celulares inmunes (efectos inmunorreguladores).
Estos efectos múltiples de los interferones (IFNs) se correlacionan
con modificaciones morfológicas y bioquímicas de las células (Revel,
1984, para una revisión).
Los interferones ejercen sus actividades a
través de receptores específicos de especie. Para los IFNs de tipo I
se han identificado dos cadenas receptoras transmembranales: IFNAR1
(Uze y col., 1990) e IFNAR2-2 (o
IFNAR2-c, Domanski y col., 1995). La transducción de
la señal generada mediante IFN-\alpha, \beta,
\omega, implica proteína tirosina quinasas de la familia de las
quinasas Janus (Jak) y factores de transcripción de la familia Stat
(Darnell y col., 1994). Las proteínas de los mecanismos
Jak-Stat se activan mediante unión a los dominios
intracitoplásmicos (IC) de las cadenas receptoras IFNAR1 e IFNAR2.
Entre las proteínas que se unen al dominio IC de IFNAR1 están tyk2
y Stat2 (Abramovich y col., 1994). Entonces el Stat2 reclutaría
Stat1 para formar el complejo de transcripción ISGF3 inducido por
IFN que activa genes inducidos por IFN (Leung y col., 1995). Los
complejos de transcripción que contienen Stat3 también son inducidos
por IFN-\beta (Harroch y col., 1994) y se observó
una unión dependiente de IFN de Stat3 a IFNAR1-IC
(Yang y col., 1996). Proteína-tirosina fosfatasa
PTP1C y D se asocian reversiblemente con IFNAR1 mediante adición de
IFN (David y col., 1995a). Además, dos serina/treonina proteína
quinasas, la quinasa ERK2 MAP de 48 kDa (David y col., 1995b) y
proteína quinasa A activada por cAMP (David y col., 1996) se unen a
los 50 residuos de IFNAR1-IC próximos a la membrana
aislada. Por tanto, los dominios IC de receptor de IFN de tipo I
sirven como posiciones de alojamiento para múltiples proteínas que
sirven para generar y regular los efectos biológicos de los IFNs en
las células.
La monitorización de dos híbridos en la levadura
es un potente método para la identificación de nuevas proteínas que
se unen a secuencias de polipéptido definidas (Fields y Song, 1989).
En resumen, la monitorización de dos híbridos se lleva a cabo
transfectando células de levadura con (a) un ADN de plásmido en el
que se fusiona el polipéptido definido (cebo) con el dominio de
unión de ADN del factor de transcripción Gal4, y con (b) una
biblioteca de cADN fusionada al dominio de activación de Gal4 en el
plásmido pACT. Las células de levadura transfectadas con un cADN que
codifica una proteína que se une al cebo polipéptido reconstituirán
a continuación la actividad de Gal4. La presencia de dicha proteína
que se une al cebo polipéptido se revela mediante la expresión de
una actividad enzimática, tal como
\beta-galactosidasa, procedente de un constructo
GAL1-lacZ que preferiblemente se introduce en el
genoma de la levadura. Es posible aislar el plásmido pACT, a partir
de clones de levadura que den positivo en este ensayo, para
determinar la secuencia de nucleótidos de su injerto y para
identificar la proteína que codifica. Este método ha posibilitado la
identificación de nuevas proteínas que interaccionan con el dominio
IC de los receptores de citoquina (Boldin y col., 1995). La cita de
cualquier documento en la presente memoria no pretende ser una
admisión de que dicho documento es pertinentemente técnica anterior,
o que sea considerado materia para la patentabilidad de cualquier
reivindicación de la presente solicitud. Cualquier sentencia
relativa al contenido o a la fecha de cualquier documento se basa en
la información disponible para los solicitantes en el momento de la
presentación, y no constituye una admisión de la corrección de dicha
sentencia.
La presente invención se refiere a dos proteínas
humanas nuevas, denominadas en la presente memoria IR1B1 e IR1B4,
que han sido identificadas como proteínas de unión del Receptor IFN
1 (IFNAR1), y al ADN que codifica dichas proteínas. Cada una de las
proteínas IR1B1 e IR1B4 interacciona con el dominio
intracitoplásmico (IC) de IFNAR1 y media en las respuestas celulares
al interferón.
La presente invención está dirigida a una
molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína IR1B1 o la IR1B4, o a
fragmentos de la misma, así como a las proteínas codificadas por la
misma. En las moléculas de ADN recombinantes, la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína IR1B1 o la IR1B4, o sus
fragmentos, está ligada operativamente a un promotor tanto con una
orientación sentido como con una orientación
anti-sentido.
Administrando directamente en tumores la
molécula de ADN recombinante que contiene un promotor ligado
operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica una nueva
proteína de unión de IFNAR1 en la orientación sentido, se potencia
la respuesta a la terapia de interferón exógeno en el tratamiento
del cáncer.
Adicionalmente, la presente invención también se
refiere a un método para prolongar la supervivencia de injertos de
tejido mediante la introducción de la molécula recombinante que
contiene un promotor ligado operativamente a la secuencia de
nucleótidos que codifica una nueva proteína de unión a IFNAR1, o un
fragmento suyo, en la orientación anti-sentido en el
injerto de tejido antes de la aplicación del mismo al paciente.
Por tanto, la presente invención también se
refiere a composiciones farmacéuticas que contienen dicho ADN, dicho
ARN ó dicha proteína, y a los métodos terapéuticos para usarlos.
La presente invención también se refiere a
anticuerpos específicos de las nuevas proteínas de la presente
inven-
ción.
ción.
La Figura 1 muestra la interacción de IR1B1 con
el dominio IFNAR1-IC medida mediante el análisis en
levadura de la interacción genética de dos híbridos. En la porción
inferior recuadrada de la figura, se indica el injerto de cADN en
pACT combinado con varios "cebos".
La Figura 2 muestra la interacción de IR1B4 con
el dominio IFNAR1-IC medida mediante el análisis en
levadura de la interacción genética de dos híbridos. En la porción
inferior recuadrada de la figura, se indica el injerto de cADN en
pACT combinado con varios "cebos".
La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos
(SEQ ID NO: 1) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de la IR1B1.
La Figura 4 muestra la homología y el
alineamiento de la secuencia de aminoácidos de IR1B1 (SEQ ID NO: 2)
con las secuencias de aminoácidos de dos proteínas de unión de
calcio, calcineurina B (en abreviatura CALB; SEQ ID NO: 3) y
caltractina (en abreviatura CATR; SEQ ID NO: 4). Los aminoácidos
idénticos en IR1B1 y CALB o entre CALB y CATR se muestran mediante
el símbolo "|" entre medias. La identidad entre IR1B1 y CATR,
aunque no con CALB, se muestra mediante el símbolo ":" entre
medias. Las regiones mostradas en negrita son los dominios de mano
EF hélice-giro-hélice de unión de
calcio.
La Figura 5 muestra manchas Northern de mARN de
IR1B1 y de rARN de 18S (línea inferior) en células U266S de mieloma
humano hibridadas con cADN de IR1B1, y la inducción rápida y
temporal de IR1B1 tras el tratamiento de las células con
IFN-\alpha8 o con IFN-\beta
durante 2 horas o durante 18 horas. La primera línea es un control
sin tratamiento con IFN tras 2 horas.
Las Figuras 6A y 6B son bandas de
SDS-PAGE que muestran la interacción in vitro
de IR1B4 con el dominio aislado IFNAR1-IC (Figura
6A) y con extractos celulares procedentes de membranas celulares
humanas U266S y U266R (Figura 6B). En la Figura 6A, los productos de
traducción marcados con metionina [^{35}S] con o sin tránscritos
in vitro de IR1B4 fueron inmunoprecipitados (10 \muL) con
gotas de M2 anti-bandera (bandas 1 y 4), o se
hicieron reaccionar (50 \muL) con gotas de glutationa acopladas a
GST fusionado al dominio IFNAR1-IC de 100
aminoácidos de longitud (bandas 2 y 5), o fueron acoplados
únicamente a GST (bandas 3 y 6). Después de incubar durante una
noche a 4ºC (volumen final 100 \muL), las gotas fueron lavadas y
las proteínas eluidas con SDS fueron hervidas en condiciones
reductoras antes de ser sometidas a SDS-PAGE. En la
Figura 6B, se extrajeron células U266S (banda 1) o U266R (banda 2)
con tampón Brij y antiproteasas (Abramovich y col., 1994) y se
incubaron 0,35 mL (10^{7} células) con 75 \muL de productos de
traducción marcados con metionina [^{35}S] de tránscritos de IR1B4
durante toda la noche a 4ºC. Se añadió mAb R3
anti-IFNAR1 inmovilizado sobre gotas de proteína G
(25 \muL) durante 2,5 h, se lavó en tampón Brij y se eluyó con
SDS, se llevó a ebullición y se analizaron las proteínas reducidas
mediante SDS-PAGE. Se llevó a cabo un control con
gotas anti-bandera M2 como el anterior (banda 3).
Los geles secados fueron visualizados en un
Phosphor-Imager. En las primeras tres bandas de la
Figura 6A, no se añadió nada de mARN de IR1B4 a la reacción de
traducción in vitro. En las segundas tres bandas de la Figura
6A, el mARN que codifica IR1B4 fusionado a la proteína bandera se
tradujo en un sistema in vitro.
La Figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos
(SEQ ID NO: 7) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 8)
de IR1B4.
La Figura 8 muestra el alineamiento de
aminoácidos de IR1B4 (SEQ ID NO: 8) y de PRMT1 (SEQ ID NO: 9) y sus
diferencias.
La Figura 9 muestra el alineamiento de
aminoácidos de IR1B4 y de HCP-1 (SEQ ID NO: 10) y
sus diferencias.
La Figura 10 muestra un ensayo de
metiltransferasa. Se hizo reaccionar extracto de células U266S con
gotas recubiertas con Proteína A y con anticuerpo
anti-IFNAR1 (banda 1) o sólo con Proteína A (banda
2). Se midió la actividad de metiltransferasa marcando histonas con
^{14}C
(metil)-S-adenosil-metionina
y analizando la radiactividad de la banda de histonas mediante
electroforesis sobre SDS-PAGE.
La Figura 11 muestra un ensayo de actividad de
proteína-arginina metiltransferasa en células U266S.
En la banda 1, la actividad de proteína-arginina
metiltransferasa de células U266S humanas se midió mediante
mutilación de péptido R1, que tiene la secuencia SEQ ID NO: 11. En
la banda 2 se añadió un oligonucleótido antisentido de SEQ ID NO:
12, complementario a la secuencia de nucleótidos
12-33 alrededor del codón de iniciación del cADN de
IR1B4. En la banda 3 se añadió el correspondiente oligonucleótido
sentido. Se observa que el oligonucleótido antisentido inhibe
sustancialmente la actividad de proteína-arginina
metiltransferasa, mientras que el oligonucleótido sentido de control
tiene poco efecto.
La Figura 12 es un gráfico que muestra la
inhibición del crecimiento de células U266S humanas como respuesta
al tratamiento de IFN-\beta en presencia o en
ausencia del oligonucleótido anti-sentido usado en
la Figura 11 (AS-1), del correspondiente
oligonucleótido sentido (S-3) y de otro
oligonucleótido anti-sentido dirigido al medio del
cADN de IR1B4 (AS-2). La densidad celular se
cuantificó mediante un ensayo de color con Azul de Alamar (véase el
Ejemplo 7), y se calculó la reducción de la densidad celular en el
porcentaje de pocillos de control no tratados, y se representó como
inhibición del crecimiento.
La presente invención se refiere al
descubrimiento de dos nuevas proteínas humanas que interactúan con
el dominio intracitoplásmico (IC) de la cadena IFNAR1 del receptor
de interferón de tipo 1 (IFN-\alpha, \beta ó
\omega), y se designan en la presente memoria como Proteína de
Unión a Receptor IFN 1 (IR1B1) y Proteína de Unión a Receptor IFN 4
(IRB1B4). La interacción de estas dos nuevas proteínas con IFNAR1 se
demostró mediante un ensayo genético de dos híbridos en levadura en
la que la transfección de la cepa informadora de levadura SFY526
(Bartel y col., 1993) con cADN de IR1B1 o de IR1B4 fusionado con el
dominio de activación Gal4 dio como resultado actividad de
\beta-galactosidasa, sólo cuando se usó como cebo
el dominio IFNAR1-IC (fusionado con el dominio de
unión de ADN Gal4).
La secuencia de cADN de IR1B1 codifica un
polipéptido de 191 aminoácidos. La búsqueda por ordenador en bases
de datos de secuencias reveló que el IR1B1 es una proteína nueva que
muestra homología marcada, por ejemplo, posiciones de unión de
calcio (manillas E-F), con las proteínas de unión de
calcio, calcineurina \beta y caltractina. La calcineurina \beta
(Guerini y col., 1989) es una subunidad de 19 kDa de una
serina/treonina fosfatasa que desempeña un papel clave en la
activación de la translocalización del factor de transcripción NFAT
al núcleo de linfocitos T, y que se inhibida mediante fármacos
inmunosupresivos tales como la ciclosporina. La caltractina (Lee y
Huang, 1993), una proteína de 21 kDa, es una proteína asociada a
citoesqueleto que se encuentra en centrosomas, y que está
involucrada en el movimiento de cromosomas durante la mitosis, y de
forma más general en los centros de organización de microtúbulos.
Por tanto, la nueva proteína IR1B1 es un nuevo miembro de la familia
de la calcineurina y de la caltractina de proteínas reguladas por
calcio.
Sorprendentemente, se descubrió que el gen
correspondiente a IR1B1 era activado rápidamente en células humanas
mediante tratamiento con IFN. Por tanto, este es el primer ejemplo
de una proteína de unión de calcio que es inducida por IFN. Puesto
que los iones calcio regulan la morfología, la adhesión y la
división celulares, la modulación de la actividad de IR1B1 en
células podría afectar a la respuesta de células normales y malignas
al IFN. El papel de IR1B1 en la mediación de la acción de IFN en
células está apoyado por la interacción de IR1B1 con el dominio IC
de una cadena receptora de IFN.
Aunque se descubrió que la IR1B4, como la IR1B1,
es una nueva proteína determinada por las búsquedas con ordenador en
bases de datos de secuencias, también se descubrió que la IR1B4
presenta una homología de secuencia con las enzimas que utilizan
S-adenosil metionina para los residuos de arginina
metilantes en las proteínas, y se designan como proteína arginina
metiltransferasas (PRMT1; Kagan y Clarke, 1994; Lin y col., 1996).
Se descubrió que la IR1B4 se unía directamente al dominio IC de
IFNAR1 in vitro, y mediante mutilación de histonas se
demostró la asociación constitutiva de la actividad PRMT con la
cadena IFNAR del receptor IFN-\alpha, \beta,
aislado a partir de células humanas. Cuando se añadieron
oligodesoxinucleótidos anti-sentido procedentes de
cADN de IR1B4 a cultivos celulares humanos, se observó un
agotamiento de la actividad PRMT en el cultivo celular. Las células
de mieloma humano tratadas de esta manera mostraron una respuesta
mucho más reducida a IFN, medida a través de la inhibición del
crecimiento. Por lo tanto, IR1B4/PRMT participa en el mecanismo
mediante el cual el receptor de IFN provoca la inhibición del
crecimiento en células tumorales, y también está involucrado en
otras funciones del receptor de IFN. Los sustratos conocidos de PRMT
incluyen un número de proteínas de unión de ARN y de ADN, y en
concreto ribonucleoproteínas nucleares heterólogas (hnRNPs). Las
hnRNPs están involucradas en el transporte de mARN desde el núcleo
hasta el citoplasma, en la división alternativa del
pre-mARN, y en los controles
post-transcripcionales (Liu y Dreyfuss, 1995). Del
mismo modo, el nuevo cADN y proteína humanos IR1B4/PRMT, que se
descubrieron por su asociación con el receptor IFN, se pueden usar
para modificar la respuesta de células humanas o animales al
IFN.
Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con
la presente invención contiene una secuencia de nucleótidos que
codifica la proteína IR1B1 o la IR1B4, o un fragmento de las mismas,
y que puede ser usada para aumentar la respuesta celular al IFN
mediante el aumento de la expresión de cADN de IR1B1 o de IR1B4 o
para reducir la respuesta celular al IFN mediante un descenso de la
expresión de las proteínas IR1B1 o IR1B4 con moléculas de ARN
anti-sentido.
La expresión in vivo aumentada de cADN de
IR1B1 o de IR1B4 sería útil en la terapia contra el cáncer en la que
la respuesta celular aumentada al IFN daría como resultado un
descenso del crecimiento celular maligno y una respuesta aumentada a
la terapia de IFN exógeno. Para obtener una expresión in vivo
aumentada de IR1B1 o de IR1B4 en la posición objetivo para una
respuesta celular aumentada a IFN, se pueden inyectar vectores de
expresión que contienen cADN de IR1B1 o de IR1B4 ligado
operativamente en una orientación sentido a un promotor constitutivo
fuerte directamente en la posición objetivo, tal como en tumores
cerebrales o en nódulos tumorales metastáticos (por ejemplo,
melanoma o cáncer de pecho).
Y a la inversa, la expresión in vivo
disminuida de proteínas IR1B1 o IR1B4 sería útil para prolongar la
supervivencia de injertos de tejido ya que el rechazo a dichos
injertos por el hospedante está mediado por los antígenos de
histocompatibilidad (MHC de clase I), cuya síntesis depende del
estímulo de IFN. Si se introduce cADN de IR1B1 o de IR1B4, o de
fragmentos de los mismos, transportados en un vector adecuado y
ligados operativamente en una orientación
anti-sentido a un promotor, en células del tejido
que va a ser injertado, la expresión de ARN
anti-sentido conduce a la degradación de mARN de
IR1B1 o de IR1B4 (o de ARN sentido correspondiente a IR1B1/IR1B4) y
al consiguiente descenso de los niveles celulares de proteína IR1B1
ó IR1B4.
El ARN anti-sentido se
transcribe desde un promotor por encima ligado operativamente a una
secuencia codificadora orientada en la dirección
anti-sentido, es decir, opuesta a la dirección
normal o sentido del ADN y a su ARN sentido transcrito (mARN). La
expresión de ARN anti-sentido complementario al ARN
sentido es una potente vía para regular la función biológica de las
moléculas de ARN. A través de la formación de un dúplex estable
entre el ARN sentido y el ARN anti-sentido, el
tránscrito de ARN normal o sentido se vuelve inactivo e
intraducible.
Las moléculas de ADN recombinante, como
realizaciones de la presente invención, contienen el cADN de IR1B1 o
de IR1B4, o fragmentos de los mismos, ligados operativamente a un
promotor en una orientación sentido o anti-sentido.
El término "promotor" pretende comprender una secuencia de ADN
o de ARN de doble cadena que es capaz de unirse a polimerasa de ARN
y de promover la transcripción de una secuencia de ácido nucleico
"ligada operativamente". Por tanto, una secuencia de ADN
estaría ligada operativamente a una secuencia de promotor si el
promotor es capaz de efectuar la transcripción de la secuencia de
ADN, independientemente de la orientación de la secuencia de
ADN.
Los tipos de promotores usados para controlar la
transcripción pueden ser cualquiera de los que son funcionales en
las células hospedante/objetivo. Los ejemplos de promotores
funcionales en células de mamífero incluyen el promotor temprano
SV40, el promotor tardío principal de adenovirus, el promotor de
timidina quinasa de herpes simple (HSV), el promotor LTR de sarcoma
de rous (RSV), el promotor temprano inmediato de citomegalovirus
humano (CMV), el promotor LTR de virus tumoral mamario de ratón
(MMTV), el promotor de interferón \beta, el promotor de proteína
70 de golpe de calor (hsp70), así como otros muchos bien conocidos
en la técnica.
Un promotor ligado operativamente a cADN de
IR1B1 o de IR1B4 en la orientación sentido para la expresión de
proteína IR1B1 o IR1B4 preferiblemente es un promotor constitutivo
fuerte. Esto permite un elevado nivel de IR1B1 o de IR1B4
independientemente de la presencia de mecanismos celulares endógenos
para regular la expresión de IR1B1 o de IR1B4.
Del mismo modo, el promotor, que está ligado
operativamente a cADN de IR1B1 o de IR1B4 en la orientación
anti-sentido, preferiblemente es un promotor fuerte,
tal como el promotor presente en el Virus de
Epstein-Barr (EBV), que regula la región que permite
niveles elevados de expresión de ARN anti-sentido
(Deiss y Kimchi, 1991).
La secuencia anti-sentido
preferiblemente sólo es expresable en las células
hospedante/objetivo, que preferiblemente son células humanas y el
ARN anti-sentido expresado debería ser estable (es
decir, no sufrir una rápida degeneración). El ARN
anti-sentido sólo debería hibridarse específicamente
con el mARN sentido expresado en las células hospedante/objetivo, y
formar una molécula de ARN de doble cadena estable que sea
esencialmente no traducible. En otras palabras, el ARN
anti-sentido expresado en las células
hospedante/objetivo evita que el mARN sentido expresado sea
traducido en proteínas IR1B1 o IR1B4. La secuencia
anti-sentido transportada por vector puede portar la
secuencia de cADN de IR1B1 o de IR1B4 completa o simplemente una
porción de las mismas, siempre que la porción
anti-sentido sea capaz de hibridarse con mARN
sentido y de evitar su traducción en proteína IR1B1 o IR1B4. Del
mismo modo, una secuencia "anti-sentido", tal
como se usa a lo largo de la especificación y de las
reivindicaciones, se define como la secuencia
anti-sentido completa, o una porción de la misma,
que es capaz de ser expresada en células
transformadas/transfectadas, y que también es capaz de hibridarse
específicamente con mARN "sentido" de IR1B1 o de IR1B4 para
formar un molécula de ARN de doble cadena no traducible.
La secuencia anti-sentido no
necesita hibridarse con todo el mARN completo de IR1B1 o de IR1B4.
En su lugar, se puede hibridar con regiones seleccionadas, tales
como la secuencia 5' no codificadora sin traducir, la secuencia
codificadora, o la secuencia 3' sin traducir del mARN
"sentido". Preferiblemente, la secuencia
anti-sentido se hibrida con la secuencia 5'
codificadora y/o con la región 5' no codificadora, tal como en las
posiciones de codón de iniciación y de tapa, puesto que se ha
observado con muchos ejemplos de oligonucleótidos
anti-sentido que dirigirse al codón de iniciación
es más efectivo, mientras que dirigirse a secuencias internas dentro
de la región de codificación no es tan efectivo (Wickstrom, 1991).
La eficacia de una secuencia anti-sentido para
evitar la traducción de mARN sentido de IR1B4 puede evaluarse
fácilmente en un ensayo de determinación de la actividad de
proteína-arginina metiltransferasa en células U266S
tal como se describe en el Ejemplo 7. En vista del tamaño del genoma
de mamíferos, la secuencia anti-sentido de IR1B1 o
de IR1B4 preferiblemente presenta una longitud de al menos 17 pares
base, más preferiblemente de al menos 30 pares base. Sin embargo,
cadenas cortas también pueden seguir siendo útiles, es decir, o no
se hibridan fortuitamente con otras secuencias de mamífero, o dicha
"hibridación cruzada" no interfiere con el metabolismo de la
célula de un modo y un grado que evite el cumplimiento de los
objetivos de esta invención.
Tanto el objetivo de hibridación preferido como
la longitud preferida de la secuencia anti-sentido
se determinan fácilmente mediante un experimento sistemático. Se
pueden usar métodos estándar como los descritos en Ausubel y col.,
eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing
Assoc., Nueva Cork, N.Y., 1987-1996, y Sambrook y
col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), para eliminar
sistemáticamente del vector una porción cada vez mayor de la
secuencia anti-sentido. Además de la secuencia
anti-sentido de longitud completa, se puede generar
una serie de eliminaciones escalonadas, preferiblemente en el
extremo 5' de la secuencia anti-sentido. Esto crea
un conjunto de secuencias anti-sentido truncadas que
todavía permanecen complementarias preferiblemente al extremo 5' del
mARN sentido, y como resultado, todavía forman una molécula de ARN
que es de doble cadena en el extremo 5' del mARN sentido
(complementa el extremo 3' de un ARN anti-sentido) y
permanece intraducible. Además, los oligonucleótidos
anti-sentido, tales como los oligonucleótidos
AS-1 (SEQ ID NO: 12), pueden sintetizarse
químicamente fácilmente y ser introducidos en un vector con enlace
operativo con un promotor para su uso en la disminución de la
expresión celular in vivo de proteína IR1B1 o IR1B4.
Los vectores de la presente invención pueden ser
cualquier vector eucariótico o procariótico adecuado usado
normalmente para transfectar células de mamífero, tal como vectores
episomales, reproducibles o cromosomalmente integrables bien
conocidos en la técnica. Un vector particularmente preferido para la
expresión de ARN anti-sentido de IR1B1 o de IR1B4 es
el plásmido episomal que contiene la región reguladora del Virus de
Epstein-Barr (Deiss y Kimchi, 1991) para servir
como el promotor que está ligado operativamente al cADN de IR1B1 o
de IR1B4 dispuesto en una orientación anti-sentido
en relación con esta región de regulación. El uso de vectores
anti-sentido y de fosforotioatos de oligonucleótido
se describe en Annals of the New York Academy of Sciences: Gene
Therapy for Neoplastic Diseases, eds. B.E. Huber y J.S. Lazo,
Vol. 716, 1994 (por ejemplo, Milligan y col., pág.
228-241).
De acuerdo con la presente invención, la
supervivencia de los tejidos u órganos injertados a un paciente que
necesite de dicho injerto se puede prolongar disminuyendo la
respuesta celular a IFN. El rechazo de tejido injertado está mediado
por los antígenos de histocompatibilidad, siendo la síntesis de
dichos antígenos de MHC de clase I dependiente de estímulo de IFN.
Por tanto, un descenso en la respuesta celular al estímulo de IFN
prolongará la supervivencia del tejido injertado. El método para
prolongar el injerto de tejido de acuerdo con la presente invención
incluye la introducción en las células de un tejido u órgano que va
a ser injertado en un paciente de una molécula de ADN recombinante
que contiene una secuencia de cADN de IR1B1 o de IR1B4, o de un
fragmento de los mismas, ligada operativamente a un promotor en la
orientación anti-sentido, mediante la cual se
expresa el ARN anti-sentido de IR1B1 o de IR1B4 en
dichas células transfectadas/transformadas. La molécula de ADN
recombinante se puede introducir en las células de un tejido u
órgano mediante cualquier modo conocido en la técnica que sea
adecuado para este propósito. Después de la introducción de la
molécula de ADN recombinante en las células del tejido u órgano, el
tejido u órgano puede ser injertado en el paciente que necesite
dicho injerto.
Se puede inyectar una composición farmacéutica
que contiene una molécula de ADN recombinante, que es un vector de
expresión y que porta cADN de IR1B1 o de IR1B4 ligado operativamente
a un promotor en una orientación sentido, directamente en tumores,
por ejemplo, tumores cerebrales y tumores metastáticos, para hacer
que las células de estos tumores sean más sensibles a la terapia de
IFN exógeno como tratamiento contra el cáncer. La respuesta celular
aumentada a la terapia de IFN exógeno conduciría a una inhibición de
crecimiento celular maligno.
La transferencia génica in vivo o ex
vivo se conoce bien, por ejemplo, en Annals of the New York
Academy of Sciences: Gene Therapy for Neoplastic Diseases, Vol.
716, 1994; véase, por ejemplo, "Direct Gene Transfer for the
Understanding and Treatment of Human Disease" por G.E. Plautz en
las páginas 144-153, y "Mechanisms of Action of
the p53 Tumor supresor and Prospects for Cancer Gene Therapy by
Reconstitution of p53 Function" por Roemer y col., en las páginas
265-282. Los métodos para insertar moléculas de ADN
recombinante en células de un tejido u órgano que va a ser injertado
o de un tumor, incluyen vectores de adenovirus, retrovirus y
asociados a adenovirus (AAV), así como la inyección directa de ADN o
la inyección de oligonucleótido-liposoma. Los
ensayos clínicos en los que los vectores retrovirales se inyectan en
tumores cerebrales, o en los que se usa adenovirus para infectar
células del tracto respiratorio superior de un paciente con fibrosis
cística, son bien conocidos.
Se pretende que las composiciones farmacéuticas
que comprenden la molécula de ADN recombinante que codifica cADN de
IR1B1 o de IR1B4, o un fragmento del mismo, tanto en una orientación
sentido como anti-sentido con respecto a un promotor
ligado operativamente, incluyan todas las composiciones en las que
la molécula de ADN recombinante está contenida en una cantidad
eficaz para alcanzar el propósito pretendido. Adicionalmente, las
composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos o excipientes
farmacéuticamente aceptables que estabilizan la molécula de ADN
recombinante o que facilitan su administración.
Otra realización de la presente invención está
dirigida a moléculas que incluyen la porción de unión a antígeno de
un anticuerpo específico de unión de IFNAR1 a proteínas IR1B1 o
IR1B4, o a fragmentos de las mismas, para su uso en diagnosis, tal
como los métodos de inmunodetección para determinar el nivel de
proteínas IR1B1 o IR1B4 en el tejido tumoral obtenido mediante
biopsias, o para su uso en purificación de la proteína por
cromatografía de afinidad.
El término "anticuerpo" pretende incluir
anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs),
anticuerpos quiméricos, anticuerpos anti-idiotípicos
(anti-Id), anticuerpos de cadena sencilla, y
anticuerpos humanizados producidos recombinantemente, así como
fracciones activas de los mismos, proporcionados por cualquier
técnica conocida, tal como, aunque sin que suponga una limitación,
rotura enzimática, síntesis de péptidos o técnicas
recombinantes.
Los anticuerpos policlonales son poblaciones
heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de
animales inmunizados con un antígeno. Un anticuerpo monoclonal
contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos
específicos de antígenos, población que contiene posiciones de unión
de epítopo sustancialmente similares. Se pueden obtener MAbs
mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véase,
por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature
256:495-497 (1975); Patente de EE.UU. Nº 4.376.110;
Ausubel y col., eds., ver anteriormente, Harlow y Lane ANTIBODIES: A
LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory (1988); y Colligan y
col., eds., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Greene Publishing
Assoc. y Wiley Interscience, N. Y., (1992, 1993), cuyos contenidos
se incorporan por completo a la presente memoria a modo de
referencia. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de
inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier
subclase de los mismos. Se puede cultivar un hibridoma que produce
un mAb de la presente invención in vitro, in situ o
in vivo. La producción de altos valores de mAbs in
vivo o in situ hacen que este sea el método de producción
actualmente preferido.
Los anticuerpos quiméricos son moléculas con
diferentes porciones que derivan de diferentes especies animales,
tales como las que presentan la región variable derivada de una
murina mAb y una región constante de inmunoglobulina humana. Los
anticuerpos quiméricos se usan principalmente para reducir la
inmunogenicidad durante la aplicación, y para aumentar los
rendimientos en la producción, por ejemplo, cuando mAbs de murina
tienen mayores rendimientos a partir de hibridomas pero mayor
inmunogenicidad en humanos, de tal modo que se usan mAbs quiméricos
humano/murina. Los anticuerpos quiméricos y los métodos para su
producción son conocidos en la técnica (Cabilly y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984);
Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:6851-6855 (1984); Boulianne y col., Nature
312:643-646 (1984); Cabilly y col., Solicitud de
Patente Europea 125023 (publicada el 14 de Noviembre de 1984);
Neuberger y col., Nature 314:268-270 (1985);
Taniguchi y col., Solicitud de Patente Europea 171496 (publicada el
19 de Febrero de 1985); Morrison y col., Solicitud de Patente
Europea 173494 (publicada el 5 de Marzo de 1986); Neuberger y col.,
Solicitud PCT WO 8601533, (publicada el 13 de Marzo de 1986); Kudo
y col., Solicitud de Patente Europea 184187 (publicada el 11 de
Junio de 1986); Morrison y col., Solicitud de Patente Europea 173494
(publicada el 5 de Marzo de 1986); Sahagan y col., J.
Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson y col.,
Publicación de Patente Internacional, WO 9702671 (publicada el 7 de
Mayo de 1987); Liu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:
3439-3443 (1987); Sun y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84:214-218 (1987); Better y col.,
Science 240:1041-1043 (1988); y Harlow y
Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, ver anteriormente.
Un anticuerpo anti-idiotípico
(anti-Id) es un anticuerpo que reconoce
determinantes únicos asociados generalmente con la posición de unión
de antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo anti-Id
se puede preparar mediante la inmunización de un animal de la misma
especie y tipo genético (por ejemplo, cepa de ratón) que la fuente
del mAb con el mAb para el que se está preparando el
anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y
responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo
inmunizante mediante la producción de un anticuerpo para dichos
determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-Id).
Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.699.880.
El anticuerpo anti-Id también se
puede usar como un "inmunógeno" para inducir una respuesta
inmune en otro animal, produciendo un anticuerpo denominado
anti-anti-Id. El
anti-anti-Id puede ser
epitopicalmente idéntico al mAb original que indujo el
anti-Id. De este modo, usando anticuerpos para los
determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros
clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica.
Debería comprenderse que los anticuerpos de la
presente invención pueden ser anticuerpos intactos, tal como
anticuerpos monoclonales, pero que es la posición de unión del
epítopo del anticuerpo la que proporciona la función deseada. Por
tanto, además del anticuerpo intacto, se pueden usar fragmentos
proteolíticos del mismo tales como los fragmentos Fab o
F(ab')_{2}. Los fragmentos Fab o F(ab')_{2}
carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, desaparecen más
rápidamente de la circulación, y pueden presentar menos unión no
específica de tejido que un anticuerpo intacto (Wahl y col., J.
Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Dichos fragmentos
se producen normalmente por rotura proteolítica, usando enzimas
tales como la papaína (para producir fragmentos Fab) o la pepsina
(para producir fragmentos F(ab')_{2}).
Además, el ADN que codifica la región variable
del anticuerpo se puede insertar en otros anticuerpos para producir
anticuerpos quiméricos (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº
4.816.567) o en receptores de células T para producir células T con
la misma amplitud de especificidad (véase Eshhar, Z. y col., Br.
J. Cancer Suppl., 10:27-9, 1990; Gross, G. y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10024-8,
1989). Los anticuerpos de cadena sencilla también se pueden producir
y usar. Los anticuerpos de cadena sencilla pueden ser polipéptidos
compuestos de cadena sencilla que presenten capacidades de unión a
antígenos y que comprendan un par de secuencias de aminoácidos
homólogas o análogas a las regiones variables de una cadena pesada y
ligera de inmunoglobulina (V_{H}-V_{L} ligadas o
cadena F_{v} sencilla). Tanto V_{H} como V_{L} pueden copiar
secuencias de anticuerpos monoclonales naturales, o una o ambas
cadenas pueden comprender un constructo CDR-FR del
tipo descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.091.513. Los polipéptidos
separados análogos a las regiones variables de las cadenas ligeras y
pesadas se mantienen juntos a través de un ligando de polipéptido.
Los métodos de producción de dichos anticuerpos sencillos,
particularmente en los que se conoce el ADN que codifica las
estructuras de polipéptido de las cadenas V_{H} y V_{L}, se
pueden llevar a cabo de acuerdo con los métodos descritos, por
ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nº 4.946.778, 5.091.513 y
5.096.815.
Por tanto, el término "una molécula que
incluye la porción de unión de antígeno de un anticuerpo"
pretende incluir no sólo las moléculas de inmunoglobulina intactas
de cualquier isotipo y generadas por cualquier línea celular animal
o microorganismo, sino también la fracción reactiva de las mismas,
incluyendo, aunque sin limitación, el fragmento Fab, el fragmento
Fab', el fragmento F(ab')_{2}, la porción variable de las
cadenas pesadas y/o ligeras de las mismas, y los anticuerpos
quiméricos o de cadena sencilla que incorporan dicha fracción
reactiva, así como cualquier otro tipo de molécula o célula en la
que se haya insertado físicamente dicha fracción reactiva de
anticuerpo, tal como un receptor de células T quimérico o una célula
T que tenga dicho receptor, o moléculas desarrolladas para
suministrar restos terapéuticos a través de una porción de la
molécula que contenga dicha fracción reactiva.
Habiendo descrito completamente la invención, la
misma será más fácilmente comprendida haciendo referencia a los
siguientes Ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y que
no pretenden limitar la presente invención.
Un fragmento de cADN que codifica el dominio
IFNAR1-IC completo amplificado mediante PCR usando
un prímero sentido BamH1 (5'ctgaggatccAAAGTCTTCTTGAGATGCATC (SEQ ID
NO: 5)) y un prímero anti-sentido EcoRI
(5'tgacgaattcctaTCATACAAAGTC (SEQ ID NO: 6)), fue clonado en un
vector BlueScript (BS-SK+, Stratagene). El fragmento
BamHI-SalI procedente de este
BS-IFNAR1-IC fue introducido en el
vector pGBT_{10} (CloneTech) y fusionado en fase después del
dominio de unión de ADN Gal4
(pGBT_{10}-IFNAR1-IC) para la
monitorización de dos híbridos. El método de monitorización de dos
híbridos (Fields y Song, 1989) se llevó a cabo con el procedimiento
modificado de Durfee y col. (1993) usando la biblioteca de cADN de
plásmido pACT procedente de linfocitos B transformados con el Virus
de Epstein-Barr humano (EBV) para cotransformar la
cepa informadora de levadura Y153 con
pGBT_{10}-IFNAR1-IC. La cepa de
levadura Y153 tiene dos genes informadores bajo el control de las
Secuencias Activantes Superiores GAL1 (UAS), que se transcriben
únicamente si la actividad del factor de transcripción Gal4 es
reconstituida. Esto requiere que la proteína de fusión codificada
por el plásmido pACT que fue introducida en este clon de levadura en
concreto tenga afinidad por el dominio IFNAR1-IC del
plásmido pGBT_{10}. Uno de los genes informadores es GAL1 His3,
que permite el crecimiento en un medio que carezca de histidina; el
otro gen informador es GAL-LacZ, que proporciona
actividad de \beta-galactosidasa. Adicionalmente,
los plásmidos pACT tienen el gen Leu2 y el plásmido pGBT_{10}
tiene el gen TRP1 que permite el crecimiento en un medio que carezca
de leucina y de triptófano, respectivamente. Se seleccionaron las
colonias en medio sintético SC menos Trp, Leu, His en presencia de
3-aminotriazol 25 mM (que selecciona aún más la
prototrofia de histidina). A continuación se evaluó la actividad de
\beta-galactosidasa de las colonias usando el
ensayo de filtro X-gal (Breeden y Naysmith,
1985).
Se obtuvieron nueve clones positivos de levadura
y sus plásmidos pACT fueron recuperados mediante transfección en
HB101 de E. coli y selección de transformantes leu+. Para
cada ADN de levadura, se aislaron dos clones HB101 de E.
coli. El secuenciamiento parcial de ADN de los plásmidos pACT a
partir de estos clones de E. coli mostró que se dividían en
dos grupos de secuencias de cADN que fueron designados IR1B1 y
IR1B4. Los plásmidos pACT de los grupos IR1B1 y IR1B4 fueron
sometidos a ensayos de especificidad mediante cotransformación de la
cepa informadora SFY526 de levadura (Bartel y col., 1993) con
plásmidos pAS que alojan lamina, cdk2 y p53 u otros injertos de
control (CloneTech). Las colonias que crecieron en SC -trp, -leu
fueron evaluadas para determinar la expresión de
\beta-galactosidasa. A partir de los plásmidos
pACT específicamente positivos, se escindieron injertos con XhoI, se
clonaron en BS-KS (Stratagene) y se sometieron a
secuenciamiento desde los promotores T7 y T3 usando el Kit
"DyeDeoxy Terminador Cycle Sequencing Kit" en un Secuenciador
de ADN 373A (Applied Biosystems).
La Figura 1 muestra los resultados
correspondientes al clon pACT IR1B1 co-transfectado
en levadura SFY526 con diferentes cebos de pAS o de plásmido
pGBT_{10}. Las células de levadura crecieron en el medio SC
selectivo -trp, -leu en las bandas 1 a 9 del filtro. La tinción con
reactivo X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido)
fue positiva sólo en las bandas 2 y 4. Como se indica en la Figura
1, la banda 4 es una levadura de control con un gen lacZ activo. La
banda 2 es la combinación de las proteínas de fusión IR1B1 y
IFNAR1-IC. La IR1B1 por sí sola (banda 9), o
cualquier otra combinación aparte de IR1B1 y
IFNAR1-IC, no presentó actividad de
\beta-galactosidasa. Por tanto, la IR1B1 es capaz
específicamente de combinarse con el dominio IC de la cadena de
receptor IFN IFNAR1.
De un modo similar, la Figura 2 muestra los
resultados correspondientes al clon pACT IR1B4
co-transfectado en levadura SFY526 con diferentes
cebos de pAS o de plásmido pGBT_{10}. Las células de levadura
crecieron en medio SC trp, leu en las bandas 1 a 8 del filtro, y la
tinción mediante reactivo X-gal fue positiva sólo en
las bandas 3 y 7. Como se indica en la porción recuadrada inferior
de la Figura 2, la banda 7 es una levadura de control con un gen
lacZ activo. La banda 3 es la combinación de las proteínas de fusión
IR1B4 y IFNAR1-IC. Como los resultados obtenidos con
la IR1B1, la IR1B4 por sí sola, o cualquier otra combinación aparte
de IR1B4 y IFNAR1-IC, no presentó actividad de
\beta-galactosidasa. Por lo tanto, la IR1B4
también es capaz específicamente de combinarse con el dominio IC de
la cadena de receptor IFN IFNAR1.
El injerto de cADN de los plásmidos
pACT-IR1B1 se escindió con enzima de restricción
XhoI, se clonó en un vector Bluescript BS-KS y se
sometió a secuenciamiento desde los promotores T7 y T3 usando el kit
"DyeDeoxy Terminador Cycle Sequencing" en un secuenciador de
ADN 373A (Applied Biosystems). El plásmido más largo presentó una
secuencia de 830 nucleótidos (Figura 3) después del dominio de
activación Gal4 y de la secuencia ligando del plásmido pACT, y se
encontró un marco de lectura abierto de 191 aminoácidos (Figura 3).
Se llevó a cabo una búsqueda en línea en bases de datos de proteínas
usando el algoritmo BlastP (Altschul y col., 1990), así como el
Alineamiento de Bioacelerador (Henikoff y Henikoff, 1992). Los
mayores valores se obtuvieron para la caltractina (CATR_HUMAN,
Proteína Suiza con accesión SW Nuevo P41208) con un 62,1% de
similitud y con un 32,4% de identidad desde los aminoácidos 52 a
173, y para la calcineurina B (CALB NAEGR, Proteína Suiza con
accesión P42322; CALB_HUMAN, accesión P06705) con un 59,8% de
similitud y con un 32,5% de identidad desde los aminoácidos 50 a
171.
La Figura 4 muestra el alineamiento de IR1B1 con
calcineurina B humana (CALB) y con caltractina (CATR). Los dominios
de unión de calcio,
hélice-lazo-hélice
EF-hand se muestran con caracteres en negrita y
subrayados. La IR1B1 tiene dos posiciones EF-hand
pero los dos primeros dominios EF-hand no se
conservan. La IR1B1 muestra homología con las dos calcineurinas B
(representadas por líneas verticales en la Figura 4). Sin embargo,
la IR1B1 es claramente una proteína humana nueva y diferente que no
ha sido identificada previamente.
Se trataron células U266S de mieloma humano
(aproximadamente 3 x 10^{6} células en 5 mL de cultivo de
suspensión) con IFN-\alpha8 (2 x 10^{8} UI/mg de
bacterias) o con IFN-\beta (3 x 10^{8} UI/mg de
células CHO) a 750 UI/mL durante 2 horas o durante 18 horas. Tras el
tratamiento con IFN, las células fueron recogidas y extraídas con
reactivo Tri (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio), que es
un producto que contiene tiocianato de guanidinio y fenol. El ARN
extraído fue precipitado con etanol, desnaturalizado con
formaldehído, analizado mediante electroforesis en geles de
formaldehído-agarosa (10 \mug de ARN/ranura), y
teñido sobre GeneScreen Plus (Dupont, New England Nuclear,
Billerica, MA). La tinción Northern se hizo reaccionar con 10^{6}
cpm de cADN de IR1B1 marcado con el kit Rediprime (Amersham, RU)
usando ^{32}P-dCTP e imprimación aleatoria.
La Figura 5 muestra que el cADN de IR1B1 se
hibridó con un ARN de 1,1 kb. La cantidad de mARN de IR1B1 se
incrementó drásticamente 2 horas después del tratamiento con
IFN-\beta de células U266S. Sin embargo, a las 18
horas del tratamiento con IFN, el mARN de IR1B1 había desaparecido
de las células, lo que indica que la inducción es rápida y
transitoria. Muchos mARNs inducidos por IFN continúan acumulándose
en las células a lo largo de 24 horas después del tratamiento con
IFN (Revel y Chebath, 1986).
Se verificó que en cada banda había la misma
cantidad de ARN. Tal como se muestra en la parte inferior de la
Figura 5, la hibridación del mismo ARN de U266S (rico en receptor de
IFN) con una sonda de cADN ribosomal 18S revela la misma cantidad de
rARN 18S en cada banda (solo se muestra la parte de la mancha en la
que aparece rARN 18S). En otro experimento realizado usando 1.200
U/mL de IFN para la inducción, también se observó mARN de IR1B1 con
IFN-\alpha8 a 2 horas, pero no a los 30 minutos
(no mostrado).
Se descubrió que el mARN de IR1B1 tenía el mismo
tamaño de 1,1 kb en diferentes células humanas (células U266, Daudi
y THP-1). Cabe destacar que dicho tamaño es próximo
al del mARN de caltractina, pero no al del mARN de calcineurina B
(2,5 kb). El pequeño tamaño del mARN es consistente con que la IR1B1
sea una proteína pequeña de aproximadamente 20 kDa.
Se evaluó la unión de IR1B4 al dominio IC de
IFNAR1 sintetizando la proteína IR1B4 con un marcador de proteína
(secuencia bandera), usando traducción in vitro en lisatos de
reticulocito y haciendo reaccionar dicha proteína con una proteína
de fusión IFNAR1-IC recombinante en E. coli.
El ADN de pACT-IR1B4 del Ejemplo 1, cortado con XhoI
y rellenado con enzima Klenow, se clonó en el vector de expresión
del PECE-bandera (Ellis y col., 1986) cortado con
EcoRI y rellenado. El fragmento NotI-BamHI que
contiene la fusión bandera-IR1B4 en marco fue
reclinado en BS-SK cortado con
NotI-BamHI y por debajo de los promotores T3. La
secuencia de la fusión bandera se verificó mediante el
secuenciamiento a partir del promotor T3. La transcripción in
vitro (kit Promega) se realizó con polimerasa T3 y con 1 \mug
de ADN de BS-bandera-IR1B4
linealizado con BamHI. La traducción in vitro se llevó a cabo
en lisatos de reticulocito de conejo (kit Promega) con metionina
[^{35}S] (Amersham) y con 5 \mug de transcritos de ARN durante 1
h a 30ºC. Los productos fueron tratados con ARNasa antes de ser
usados. La proteína de fusión
GST-IFNAR1-IC se preparó mediante
clonación del BamHI-EcoRI, injerto de
BS-IFNAR1-IC (ver anteriormente), en
los mismos sitios de pGEX2 (Pharmacia Biotech). GST y
GST-IFNAR1-IC se expresaron en E.
coli y se recuperaron ligados a gotas de
glutationina-agarosa (Sigma).
Las gotas de azarosa M2
anti-bandera procedían de Kodak Scientific Imaging
Systems. Los anticuerpos monoclonales IFNaR3 del componente \alpha
del receptor de IFN (IFNAR1) fueron un amable obsequio del Dr. O.
Colamonici (Colamonici y col., 1990) y fueron usados con una
dilución 1:100. Los anticuerpos de conejo del péptido
C-terminal de IFNAR1-IC (Ab 631) se
prepararon y usaron para la inmunoprecipitación de IFNAR1 de
extractos de Brij (0,75 mL) de 2 x 10^{7} células U266S y U266R de
mieloma humano con antiproteasas detallados previamente (Ambrovich
y col., 1994), con la excepción de que se usaron gotas de proteína G
(Pharmacia) con mAb IFNaR3 SDS-PAGE y el análisis en
un aparato Fujix BAS1000 Phosphor-Imager fue como se
ha indicado anteriormente (Harroch y col., 1994).
Primero se verificó que se obtiene un producto
proteico de aproximadamente 32 kDa cuando se inmunoprecipitan los
productos de traducción mediante anticuerpos
anti-bandera (Figuras 6A y 6B). En las Figuras 6A y
6B, cuando se denota el uso de anticuerpos
anti-bandera (con el signo +), significa que el
producto de traducción radioactivo del mARN de fusión
IR1B4-bandera (transcrito in vitro a partir
del constructo de ADN correspondiente) se hizo reaccionar con
anticuerpo M2 anti-bandera unido a gotas de agarosa
(producto de Kodak Scientific Imaging Systems). La proteína
traducida que contiene IR1B4 fusionada con la secuencia de
aminoácidos bandera se unió a estas gotas de anticuerpo
anti-bandera y tras centrifugación de las gotas, se
eluyó la proteína con tampón SDS y se aplicó a
SDS-PAGE. Estas reacciones sirven como un control
para demostrar que la proteína fusionada esperada está presente.
Se añadieron gotas de
Glutationa-Sefarosa (Sigma), a las que se ligó
Glutationa S-transferasa (GST) fusionada con
IFNAR1-IC, a la reacción de traducción de lisato de
reticulocito. Las gotas fueron centrifugadas y lavadas, y las
proteínas ligadas a gotas GST se liberaron con dodecilsulfato sódico
(SDS al 1%), y fueron analizadas mediante
SDS-electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE).
Se observó que la proteína de 32 kDa marcada con metionina ^{35}S
estaba unida a GST-IFNAR1-IC, pero
no a GST solo (Figura 6A). Esto demuestra que la IR1B4 se une
directamente a la región de péptido de IFNAR1-IC
aislada.
Para verificar que la IR1B4 interactúa con la
proteína IFNAR1 tal como se encuentra en las membranas celulares
humanas, se mezclaron extractos detergentes de células U266 de
mieloma humano con los productos de traducción marcados con
metionina ^{35}S del mARN de IR1B4 procedente de lisatos de
reticulocito. La proteína IFNAR1 fue inmunoprecipitada con un
anticuerpo monoclonal de IFNaR3 específico del ectodominio de IFNAR1
(de Colamonici y col., 1990). El análisis mediante
SDS-PAGE mostró la presencia de la banda
IR1B4-bandera de 32 kDa (Figura 6B) cuando los
extractos detergentes procedían de células U266S (ricas en receptor
IFN), pero no cuando procedían de células U266R (una línea celular
derivada resistente a IFN-\alpha, \beta mutante
procedente de U266 deficientes en receptores IFN (Abramovich y col.,
1994)). Del mismo modo, la banda de 32 kDa se observó cuando los
extractos de U266S se hicieron reaccionar con Ab 631 frente al
péptido C-terminal de IFNAR1, y el IFNAR1 fue
precipitado con anti-bandera cuando se transfirieron
células Cos-7 mediante cADNs
flg-IR1B4 e IFNAR1 humano. Estos resultados
demostraron que la IR1B4 se une a IFNAR1 intacto procedente de
células humanas de un modo específico.
La secuencia de nucleótidos del cADN de IR1B4
tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 361
aminoácidos de longitud (Figura 7). Este cADN humano reconoció un
mARN poli-A+ expresado constitutivamente de 1,5 kb
en diversas células humanas, incluyendo células de mieloma U266. Se
realizó una búsqueda en línea en las bases de datos de proteínas
usando el algoritmo BlastP (Altschul y col., 1990), así como el
Alineamiento de Bioacelerador (Henikoff y Henikoff, 1992), y se
descubrió que la IR1B4 es un miembro único de la familia de la
proteína-arginina metiltransferasa. El cADN PRMT1 de
rata descrito por Lin y col. (1996, secuencia de Genbank I.D.
1390024; Acceso U60882) tan sólo es homólogo en un 81,4% cuando se
analiza mediante el programa de ordenador ALIGN. Al nivel de
aminoácidos (Figura 8), el IR1B4/PRMT humano claramente difiere en
su extremo amino del PRMT1, siendo los primeros 19 aminoácidos
completamente diferentes. El secuenciamiento
N-terminal de IR1B4 es homólogo al PRMT1. Otra
proteína humana que ha sido descrita, HCP-1 (Nikawa
y col., 1996; acceso de Genbank D66904) también presentó homología
con respecto a la IR1B4. Sin embargo, la HCP-1 tiene
una secuencia de aminoácidos diferente en los residuos
147-175 (Figura 9). La HCP-1 se
identificó originalmente en base a su capacidad para complementar la
mutación ire15 en la levadura y su función enzimática no estaba
identificada previamente (Nikawa y col., 1996). Por tanto, la IR1B4
es una nueva proteína humanal.
La actividad de metiltransferasa podría ser
co-inmunoprecipitada a partir de extractos celulares
con el receptor IFNAR1. Los extractos de detergente Brij de células
U266 se hicieron reaccionar toda la noche a 4ºC con o sin anticuerpo
anti-IFNAR1 Ab 631 (Abramovich y col., 1994). Se
añadieron gotas de proteína A (40 \muL de un 50% de flujo rápido
IPA-400, Repligen) durante 1 hora. Las gotas se
lavaron y se incubaron en 0,1 mL de Tris-HCl 25 mM,
pH 7,5, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM,
^{14}C-(metil)-S-adenosil-metionina
50 \muM (0,25 \muCi) (Amersham) y 100 \mug de histonas (Tipo
IIA procedente de timo de becerro, Sigma) durante 30 minutos a 30ºC.
Se llevó a cabo la mutilación in vitro de histonas en las
condiciones descritas por Lin y col. (1996). La radioactividad de la
banda de histona se analizó tras SDS-PAGE (15% de
archilamida) y tras exposición en el
Phosphor-imager. Se observó un marcado de
^{14}C-metilo de las histonas con las gotas que
fueron recubiertas con anti-IFNAR1, pero no con las
de la reacción de control (Figura 10). Por tanto, la actividad de
proteína metil-transferasa está asociada
constitutivamente con la cadena del receptor IFN de dichas células
humanas. Se recuperó una actividad enzimática similar cuando se
inmunoprecipitó IFNAR1 cinco minutos después de la adición de
IFN-\beta a las células U266S.
Se sintetizó químicamente un fosforotioato de
oligodesoxinucleótido anti-sentido (Stein y col.,
1989) complementario a la secuencia de nucleótidos
12-33 alrededor del codón de inicio del cADN de
IR1B4 (AS-1, secuencia anti-sentido
5'-GGCTACAAAATTCTCCATGATG-3'; SEQ ID
NO: 12). Se añadieron los oligonucleótidos a células U266S sembradas
en microplacas de 96 pocillos (8000 células/pocillo/0,2 mL de RPMI,
FCS al 10%) con una concentración final 10 \muM en el día 0, y se
volvieron a añadir a 5 \muM en el día 2. Se añadió
IFN-\beta a 64 o a 125 UI/mL en el día 0. Tras 3
días de cultivo, se añadieron 20 \muL de Azul Alamar, un indicador
celular colorimétrico basado en oxidación-reducción
(Biosource, Camarillo, CA), a cada pocillo y se continuó con la
incubación durante 6-7 h. Se midió el color en un
lector ELISA de microplacas (filtro de ensayo a 530 nm, filtro de
referencia a 630 nm) con lectura múltiple de pocillos duplicados. Se
verificó la correlación de las curvas de crecimiento mediante el
número de células vivas y mediante OD. Para medir la
metiltransferasa, se sometió a lisis a células de varios pocillos
reunidos mediante congelación-descongelación en 25
\muL/pocillo de Tris-HCl 25 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM,
EGTA 1 mM, 40 \mug/mL de leupeptina y de aprotinina, 20 \mug/mL
de pepstatina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 \muM. Las
reacciones se realizaron en 50 \muL con 25 \muL de extractos
celulares, péptido R1 100 \muM (Najbauer y col., 1993; obtenido en
Genosys, Cambridge, RU), 3 \muCi de [^{3}H]
(metil)S-adenosilmetionina (Amersham, 73
Ci/mmol) durante 30 minutos a 30ºC. Después de electroforesis en
SDS-gel de poliacrilamida (16%), fijación en metanol
al 50%, ácido acético al 10% y tratamiento mediante Amplify®
(Amersham), se llevó a cabo la autorradiografía durante 8 días. Este
ADN anti-sentido AS-1 fue capaz de
reducir intensamente la actividad de
proteína-arginina metiltransferasa en células U266S,
según se midió mediante la incorporación de grupos metilo tritiados
en el sustrato de péptido R1 (Figura 11), y se usó para investigar
el papel que puede desempeñar esta enzima en la acción de IFN. Se
eligió la actividad de inhibición del crecimiento del IFN porque se
puede cuantificar casi directamente sobre las células debido a que
se ha observado una interacción de PRMT1 de rata con productos
génicos relacionados con el crecimiento (Lin y col., 1996). La
adición del oligonucleótido antisentido-1
AS-1, que es complementario a la secuencia que rodea
al codón de inicio del cADN de IR1B4/PRMT, redujo el efecto
inhibidor del crecimiento del IFN-\beta sobre
células U266S de mieloma humano (Figura 12). Esto significa que, en
presencia del AS-1 anti-sentido, las
células tratadas con IFN presentaron un mayor crecimiento
(excluyendo cualquier efecto tóxico de los fosforotioatos). El
crecimiento en ausencia de IFN no se vio afectado
significativamente. El oligonucleótido sentido S-3
correspondiente a la misma región de cADN sólo presentó un pequeño
efecto (S-3, Figura 12) en comparación con el
antisentido-1. El sentido S-3
también presentó únicamente un pequeño efecto inhibidor sobre el
nivel de la actividad enzimática (Figura 11). Otro oligonucleótido
de fosforotioato anti-sentido AS-2
(SEQ ID NO: 13), dirigido al medio del cADN y complementario a los
nucleótidos 572-592 de la SEQ ID NO: 7, casi no
presentó efecto alguno (Figura 12). La reducción en un factor de
hasta 5 del efecto inhibidor del crecimiento del
IFN-\beta sobre células de mieloma, que resultaron
parcialmente deficientes en actividad PRMT por el oligonucleótido
antisentido-1, demuestra que la asociación de la
enzima IR1B4/PRMT con el dominio IC del receptor IFNAR1 es
funcionalmente significativa para la acción de IFN sobre las
células.
Estos experimentos también demuestran que la
proteína IR1B4 metila sustratos de péptido de clase PRMT de enzimas,
tales como el péptido R1
Gly-Gly-Phe-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly-Phe-Gly
(SEQ ID NO: 11; Najbauer y col., 1993), que fue usado en el
experimento ilustrado en la Figura 11. La mutilación de proteínas
sobre los residuos de arginina próximos a los residuos de glicina
(por ejemplo, como en péptido anterior) podría ser un tipo de
modificación proteica que, como la fosforilación, sirve para
transducir señales al interior de la célula. El grupo hnRNP de
proteínas es un objetivo para las enzimas PRMT, y puesto que dichas
proteínas afectan al procesado, separación, transporte y
estabilidad del mARN (Liu y Dreyfuss, 1995), su mutilación puede
desempeñar un papel en los controles
post-transcripcionales de la expresión génica. La
proteína IR1B4/PRMT, con propiedades de unión a una cadena del
receptor IFN según lo observado, podría mediar en los cambios de la
expresión génica de respuesta a IFN. Otros sustratos de proteína se
pueden metilar a través del receptor IFN, incluyendo otros
componentes del complejo de receptor IFN y de los factores de
transcripción. Lin y col. (1996) han observado que la unión de PRMT1
de rata con proteínas inducidas por factor activa al PRMT1 y
modifica su especificidad de sustrato, posiblemente mediante la
eliminación de algunas proteínas inhibidoras asociadas al PRMT1 en
el citoplasma celular. Puede esperarse una activación similar de la
IR1B4 unida a la cadena de IFNAR1 del receptor IFN.
Se describe una nueva proteína IR1B1 que
interacciona con el dominio intracitoplásmico de la cadena IFNAR1
del receptor interferón de tipo I. Dicha proteína es inducida muy
rápidamente y temporalmente después de un tratamiento con IFN de
células humanas. La IR1B1 se caracteriza por la presencia de
posiciones EF-handle
hélice-lazo-hélice que son típicas
de proteínas de unión de calcio. Los flujos de iones calcio han sido
implicados en el mecanismo de acción de los IFNs, y en particular en
las respuestas celulares iniciales y en los cambios de morfología
celular y en la organización del citoesqueleto (Tamm y col., 1987).
Las enzimas activadas por iones calcio podrían producir segundos
mensajeros, tales como el diacil-glicerol, en
respuesta a los IFNs. Adicionalmente, las proteínas de tipo
calmodulina regulan una serie de proteína quinasas y se ha observado
que dichos mecanismos funcionan en células tratadas con IFNs (Tamm y
col., 1987). Es probable que el receptor IFN que se une a la
proteína IR1B1 esté implicado en dichos efectos dependientes de
C^{++} de los IFNs sobre las células.
La monitorización de dos híbridos
correspondiente a proteínas que interaccionan con el dominio
IFNAR1-IC también identificó otra proteína IR1B4,
que resultó ser un miembro de la familia de enzimas
proteína-arginina metil transferasa (PRMT1; Lin y
col., 1996). Se sabe que esta enzima metila una serie de proteínas
de unión de ARN y ADN, en concreto ribonucleoproteínas nucleares
heterólogas (hnRNPs). Las hnRNPs heterólogas están implicadas en el
transporte de mARN desde el núcleo hasta el citoplasma, en la
división alternativa de pre-mARN, y en los controles
post-transcripcionales (Liu y Dreyfuss, 1995). Las
proteínas IR1B1 y IR1B4/PRMT1 que se alojan sobre el dominio
IFNAR1-IC revelan nuevos mecanismo de señalización
de los IFNs que existen además de los mecanismos
Jak-Stat conocidos descritos por Darnell y col.
(1994).
Habiendo descrito completamente esta invención,
aquellos expertos en la técnica apreciarán que se puede llevar a
cabo la misma dentro de un amplio intervalo de parámetros,
concentraciones y condiciones equivalentes, sin alejarse del
espíritu y del alcance de la invención, y sin experimentación
indebida.
Aunque esta invención se ha descrito en relación
a realizaciones específicas de la misma, debe entenderse que se
pueden realizar modificaciones adicionales.
La referencia a etapas de métodos conocidos, a
etapas de métodos convencionales, a métodos conocidos o a métodos
convencionales, no supone en modo alguno una admisión de que
cualquier aspecto, descripción o realización de la presente
invención se describe, muestra o sugiere en la técnica
relevante.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: REVEL, Michael
\hskip4cmCHEBATH, Judith
\hskip4cmABRAMOVICH, Carolina
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS DE UNIÓN A RECEPTOR 1 DE INTERFERÓN, ADN {}\hskip4,7cmQUE LAS CODIFICA Y MÉTODOS PARA MODULAR LA RES- {}\hskip4,7cm PUESTA CELULAR A LOS INTERFERONES
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: BROWDY AND NEIMARK
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 419 Seventh Street, N.W., Suite 300
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: D.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 20004
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SISTEMA LÓGICO: PatentIn Release #1.0 Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/035.636
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-ENE-1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BROWDY, Roger L.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 25.618
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: REVEL=14 PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 202-628-5197
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 202-737-3528
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 830 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 43..615
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 191 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 170 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 172 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGAGGATCC AAAGTCTTCT TGAGATGCAT C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGACGAATTC CTATCATACA AAGTC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1308 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 16..1098
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 361 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 353 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 360 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTACAAAA TTCTCCATGA TG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGCCGTCAC ATACAGCGTG G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Yeda Research and Development
Co., LTD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> TÍTULO DE LA INVENCIÓN:
PROTEÍNAS DE UNIÓN A RECEPTOR 1 DE INTERFERÓN, ADN QUE
{}\hskip4,6cm LAS CODIFICA Y MÉTODOS PARA MODULAR LA RESPUESTA CE-
{}\hskip4,6cm LULAR A LOS INTERFERONES
{}\hskip4,6cm LAS CODIFICA Y MÉTODOS PARA MODULAR LA RESPUESTA CE-
{}\hskip4,6cm LULAR A LOS INTERFERONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US98/00671
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-8-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/035.636
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-1-15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 830
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 43..615
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGAGGATCC AAAGTCTTCT TGAGATGCAT C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGACGAATTC CTATCATACA AAGTC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1308
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 16..1098
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361 s
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 353 s
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 360 s
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10 s
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTACAAAA TTCTCCATGA TG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGCCGTCAC ATACAGCGTG G
\hfill21
Claims (19)
1. Una molécula de ADN recombinante que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de
unión a receptor IFNAR1 que es capaz de ser inducida por
IFN-\alpha o por IFN-\beta, y
que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la
SEQ ID NO: 8.
2. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo
con la reivindicación 1, que además comprende un promotor ligado
operativamente a dicha secuencia que codifica una proteína de unión
de receptor IFNAR1 en una orientación sentido de tal modo que dicho
promotor es capaz de expresar dicha proteína cuando la molécula de
ADN recombinante se encuentra en un hospedante de expresión
apropiado.
3. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo
con la reivindicación 2, en la que dicho promotor es un promotor
constitutivo fuerte en células humanas.
4. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo
con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos es
SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 7.
5. Un ADN recombinante que comprende una
molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:
1 ó SEQ ID NO: 7, tanto en orientación sentido como
anti-sentido, o un fragmento de la misma capaz de
hibridarse con mARN que codifica un receptor IFNAR1 inducible por
interferón que se une a la proteína impidiendo con ello su
expresión.
6. Un ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 5.
7. Un ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que dicha secuencia se encuentra en la
orientación sentido.
8. Un ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que dicha secuencia se encuentra en la
orientación anti-sentido.
9. Un ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 8, que comprende una molécula de ADN recombinante que
además comprende un promotor ligado operativamente a dicha secuencia
con una orientación anti-sentido, de tal modo que
dicho promotor es capaz de expresar un ARN
anti-sentido complementario al total o a una parte
del ARN sentido que codifica una proteína de unión a receptor IFNAR1
inducida por interferón.
10. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo
con la reivindicación 9, en la que dicha secuencia de nucleótidos es
un segmento desde el extremo 5' de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID
NO: 7.
11. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 2, 9 y 10, en la que dicho
promotor es un promotor inducible por interferón.
12. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y
7-10, que es un vector de expresión.
13. Una célula hospedante capaz de expresar un
ARN anti-sentido complementario a un ARN sentido que
codifica una proteína de unión a receptor IFNAR1 inducible por
interferón, célula que incluye un vector de expresión de acuerdo con
la reivindicación 12.
14. El uso de un vector de expresión que
comprende la molécula de ADN recombinante de una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10 para la preparación de una composición
farmacéutica para prolongar la supervivencia de un injerto de tejido
mediante la introducción de dicho vector de expresión en las células
de un tejido u órgano que vaya a ser injertado a un paciente que lo
necesite.
15. El uso de un vector de expresión que
comprende la molécula de ADN recombinante de la reivindicación 3 o
de la reivindicación 4 y de interferón exógeno para la preparación
de un kit farmacéutico para el tratamiento del cáncer, permitiendo
la administración consecutiva del vector de expresión y del
interferón exógeno con el fin de potenciar la respuesta al
interferón exógeno.
16. Una proteína de unión de IFNAR1 que presenta
la secuencia SEQ ID NO: 2 ó SEQ ID NO: 8.
17. Una molécula que comprende el antígeno que
se une a la porción de un anticuerpo específico para la proteína de
unión de IFNAR1 de acuerdo con la reivindicación 16.
18. Una molécula de acuerdo con la
reivindicación 17, que consiste en un anticuerpo monoclonal.
\newpage
19. Un método para proporcionar una proteína de
unión de receptor IFNAR1 que comprende colocar un ADN de acuerdo con
la reivindicación 1 en un hospedante de expresión apropiado, de un
modo mediante el cual la expresión de dicha proteína se puede
obtener mediante cultivo de dicho hospedante, y cultivar dicho
hospedante de tal modo que se obtenga la expresión de dicha
proteína.
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CA2471385A1 (en) * | 2001-12-27 | 2003-07-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Preventives/remedies for cancer |
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