DK2643694T3 - Hurtig in vivo-genmutationsassay baseret på pig-a-genet - Google Patents

Claims (8)

1. den berigede erytrocytprøve bringes i kontakt med et fluorescerende reagens, som mærker normokromatiske erytrocytter differentielt fra retikulocytter og leukocytter; det fluorescerende reagens exciteres med lys med passende excitationsbølgelængde; den fluorescensemission og lysspredning, som frembringes af det fluorescerende reagens, detekteres, og antallet af erytrocytter og/eller retikulocytter pr. enhed prøvevolumen tælles.
2. 10. Fremgangsmåde ifølge krav 8, der endvidere omfatter: tilsætning af optællingsperler til den berigede erytrocytprøve inden adskillelsen; optælling, under detekteringstrinnet, af antallet af optællingsperler; og beregning af et forhold mellem GPI-anker-deficiente erytrocytter og perler og/eller et forhold mellem GPI-anker-deficiente retikulocytter og perler.
3. 11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, hvor opnåelsen omfatter, at: den berigede erytrocytprøve, der indeholder optællingsperler, bringes i kontakt med et fluorescerende reagens, som mærker normokromatiske erytrocytter differentielt fra retikulocytter og leukocytter; det fluorescerende reagens og optællingsperler exciteres med lys med passende excitationsbølgelængde; den fluorescensemission og lysspredning, som frembringes af det fluorescerende reagens og optællingsperlerne, detekteres, og antallet af erytrocytter og/eller retikulocytter og optællingsperler i prøven tælles; og et forhold mellem erytrocytter og perler og/eller et forhold mellem retikulocytter og perler beregnes.
4. 12. Fremgangsmåde ifølge krav 8, der endvidere omfatter: tilvejebringelse af en anden beriget erytrocytprøve, hvor den anden prøve er opnået fra pattedyret inden eksponering for det eksogene agens; udførelse af trinnene med kontakt med det første og det andet fluorescerende reagens, adskillelse, kontakt med det tredje fluorescerende reagens, excitation og detektering på den anden berigede erytrocytprøve; og sammenligning af de resultater, der opnås fra den første og den anden prøve, hvor en statistisk signifikant afvigelse i frekvensen af GPI-anker-deficiente erytrocytter eller retikulocytter mellem den første og den anden prøve viser det genotoksiske potentiale af det eksogene agens.
5. 13. Fremgangsmåde ifølge krav 8, hvor det eksogene agens er et kemisk eller fysisk agens, og en statistisk signifikant afvigelse i frekvensen af GPI-anker-deficiente erytrocytter eller retikulocytter fra en basislinjefrekvens for GPI-anker-deficiente erytrocytter eller retikulocytter hos ikke-eksponerede pattedyr eller vehikelkontrolpattedyr viser det genotoksiske potentiale af det eksogene kemiske eller fysiske agens; eller det eksogene agens er et agens, som kan modificere endogent induceret genetisk skade, og en statistisk signifikant afvigelse i frekvensen af GPI-anker-deficiente erytrocytter eller retikulocytter fra en basislinjefrekvens for GPI-anker-deficiente erytrocytter eller retikulocytter viser, at det eksogene agens kan modificere endogen DNA-skade; eller det eksogene agens omfatter et første eksogent agens, der kan modificere eksogent induceret genetisk skade, og et andet eksogent agens, der forårsager genetisk skade, og en statistisk signifikant afvigelse i frekvensen af GPI-anker-deficiente erytrocytter eller retikulocytter for det pattedyr, som har været eksponeret for et genotoksisk stof, i sammenligning med et pattedyr, der kun får det andet eksogene agens, viser, at det første eksogene agens kan modificere eksogent induceret DNA-skade.
6. 14. Kit, der omfatter: et første fluorescerende reagens, der binder GPI-anker-udtrykkende celler, men ikke GPI-anker-deficiente celler; et andet fluorescerende reagens, der specifikt binder blodplader; et tredje fluorescerende reagens, der differentielt mærker normokromatiske erytrocytter, retikulocytter og leukocytter, idet det tredje fluorescerende reagens har et fluorescensemissionsspektrum, som ikke i det væsentlige overlapper med fluorescensemissionsspektrene for det første eller det andet fluorescerende reagens; et fjerde reagens, som er egnet til adskillelse af erytrocytter fra blodplader og leukocytter, idet det fjerde reagens omfatter et densitetsgradientmedium; et femte reagens, der omfatter paramagnetiske partikler, idet det femte reagens specifikt binder til GPI-anker-udtrykkende celler eller mindst en del af det første fluorescerende reagens, som er bundet derpå; og instruktioner til anvendelse af reagenserne og celleadskillelsesprodukter og til detektering og beregning af frekvensen af GPI-anker-deficiente erytrocytter og/eller retikulocytter i forhold til samlede erytrocytter og/eller retikulocytter i prøven.
7. 15. Kit ifølge krav 14, hvor det første fluorescerende reagens omfatter et anti-CD59-, anti-CD24- eller anti-CD55-antistof eller en kombination deraf; det andet fluorescerende reagens omfatter et anti-CD61 -antistof eller anti-CD42b- antistof eller en kombination deraf; og/eller det tredje fluorescerende reagens er et nukleinsyrefarvestof.
8. 16. Kit ifølge et af kravene 14 eller 15, der endvidere omfatter: en søjle, der er egnet til anvendelse med paramagnetiske partikler og magnetiske felter; et computerlæsbart lagermedium, som indeholder en cytometridataregistreringstemplate til rangordning af mutante erytrocytter og mutante retikulocytter ved hjælp af flowcytometri; ét eller flere af balancerede saltopløsninger og en opløsning af antikoagulant; og/eller optællingsperler.