DK175657B1 - Fremgangsmåde til frembringelse af en endogen vegetabilsk olie - Google Patents

Description

DK 175657 B1 ! t

Raps (dvs Brassica napus og Brassica campestris) dyrkes som en stadig vigtigere oliefrø-afgrøde i mange dele af verden. Som kilde for vegetabilsk olie overgås raps for tiden kun af sojabønner og palmer, og sammen med solsikke deler raps tredjepladsen med hensyn til kommerciel betydning. Olien 5 anvendes som både madlavningsolie og salatolie over hele verden.

I sin oprindelige form viste rapsfrøolie sig at have skadelige virkninger på menneskers sundhed som følge af det relativt høje indhold af erucasyre, som almindeligvis er til stede i naturlige kulturvarieteter i koncentrationer på 30 til 10 50 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold. Fagfolk inden for plante- videnskab har tidligere identificeret en kimplasma-kilde for rapsfrøolie med lavt erucasyreindhold, hvorefter de begyndte at inkorporere denne karakteregenskab i kommercielle sorter. Der kan i denne sammenhæng henvises til kapitel 6 med titlen "The Development of Improved Rapeseed Cultivars" af 15 B.R. Stefansson fra "High and Low Erucic Acid Rapeseed Olis" redigeret af John K.G. Kramer, Frank D. Sauer og Wallace J. Pigden, Academic Press Canada (1983).

I Canada har fagfolk indenfor plantevidenskab fokuseret deres bestræbelser 20 på at tilvejebringe såkaldte "dobbelt-lave" varieteter, som havde et lavt indhold af erucasyre i olien og et lavt indhold af glucosinolater i den faste rest, som blev tilbage efter ekstraktion af olien (nærmere bestemt et erucasyreindhold på under 2,0 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold og et indhold af glucosinolater på under 30 pmol pr. gram af den oliefri rest). Disse 25 rapsformer af højere kvalitet, som er udviklet i Canada, kendes som canola. I modsætning hertil har europæiske planteeksperter arbejdet på kun at opnå "enkelt-lave" typer, som havde et lavt erucasyreindhold, men som ikke tog sigte på at forbedre kvaliteten af den faste rest, der havde et indhold af glucosinolater på omkring 100 pmol pr. gram af den oliefri rest. Resultatet af 30 denne betydelige ændring i rapsfrøoliens fedtsyresammensætning var, at der blev skabt en helt ny olieprofil, som ofte indeholdt omkring 62 vægt-% olein-syre baseret på det totale fedtsyreindhold. Eftersom den samlede olieprocent i frøene ikke ændrede sig mærkbart, da de nye sorter med lavt erucasyreind-

I DK 175657 B1 I

^^1 I

I I

hold blev udviklet, så det ud til, at erucasyren simpelt hen var blevet omdan- I

net til andre fedtsyrer, først og fremmest oleinsyre. Dette oleinsyreniveau I

havde en tendens til at variere inden for et temmelig snævert område på om- I

kring 55 til 65 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold. Der kan i denne I

5 sammenhæng henvises til kapitel 7 med titlen The Introduction of Low Eru- I

H cic Acid Rapeseed Varieties Into Canadian Production" af J.K. Daun fra den I

I ovenfor omtalte Academic Press Canada (1983) publikation. Vægtprocenter- I

ne af de andre fedtsyrer varierede også i nogen grad, men dog ikke tilstræk- I

keligt til at definere de enkelte typer med henblik på særlige anvendelser eller I

I 10 forøget kommerciel værdi. Der kan også henvises til "Prospects for the I

I Development of Rapeseed (B. napus L.) With Improved Linoleic and I

i Linolenic Acid Content” af N.N. Roy og A.W. Tarr, Plant Breeding, Vol. 98, I

I side 89-96 (1987). I

I 15 For øjeblikket bliver canolaolie markedsført af Procter & Gamble under I

I varemærket Puritan. En sådan vegetabilsk olie er typisk uden indhold af cho- I

I lesterol, og de fedtsyrer, som er tilstede i olien, består af omkring 6% mæt- I

I tede fedtsyrer i form af stearin- og palmitinsyre, omkring 22 vægt-% linolen- I

I syre, som indeholder 2 dobbeltbindinger pr. molekyle på 18 carbonatomer, I

I 20 omkring 10 vægt-% α-linolensyre, som indeholder 3 dobbeltbindinger pr. mo- I

lekyle på 18 carbonatomer, omkring 62 vægt-% oleinsyre, der indeholder 1 I

I dobbeltbinding pr. molekyle på 18 carbonatomer, samt under 1 vægt-% eru- I

I casyre, som også kun indeholder 1 dobbeltbinding pr. molekyle på 22 car* I

I bonatomer. I

I 1 25 I

I I årenes løb har forskerne forsøgt at forbedre canolaoliens fedtsyreprofil. I

I F.eks. står den oxidative stabilitet af den vegetabilske olie i relation til antallet I

I af dobbeltbindinger i dens fedtsyrer. Det betyder, at molekyler med flere dob- I

I beltbindinger anses for at være mere ustabile. Forskerne har derfor forsøgt at I

I 30 reducere indholdet af α-linolensyre med henblik på at forbedre lager- I

I stabiliteten og den oxidative stabilitet, i særdeleshed under indvirkning af I

I varme. Dette har vist sig ikke at være muligt gennem anvendelse af naturligt I

I forekommende kimplasma, og de rapporterede værdier for α-linolensyre med I

3 DK 175657 B1 hensyn til sådant kimplasma har været over 6 vægt-% (eksempelvis over 6 vægt-% og op til omkring 12 vægt-%). Som det er rapporteret af Gerhard Robbelen i kapitel 10 med titlen "Changes and Limitations of Breeding for Improved Polyenic Fatty Acids Content in Rapeseed" fra "Biotechnology for 5 the Olis and Fats Industry", redigeret af Colin Ratledge, Peter Dawson og James Rattray, American Oil Chemists' Society (1984), var man ved et muta-genese-eksperiment i stand til at opnå linier med under ca. 3,5 vægt-% α-linolensyre baseret på det totale fedtsyreindhold. Disse liniers profiler indikerer, at næsten hele mængden af α-linolen-fedtsyre var rettet mod linol-10 syre, og at niveauet af oleinsyre kun blev forøget med 1 eller 2%. Ikke desto mindre syntes olien at indebære visse fordele i forhold til normal canolaolie.

F.eks. krævede raffineringsprocessen mindre hydrogenering end normal canolaolie, og den udviste en bedre stegestabilitet.

15 Undersøgelser foretaget i de senere år har fastslået værdien af mono-umættede fedtsyrer som bestanddele i fødevarer. Dette har ført til, at "middelhavsretter" er blevet populære, idet disse lægger hovedvægten på olivenolie, der er en naturligt forekommende, righoldig kilde for oleinsyre. Med en sådan kost mener man at kunne undgåproblemet med arteriosclerose, der 20 opstår som resultat af mættede fedtsyrer. Selv når man følger en sådan kostplan, opfattes olivenolie imidlertid som værende mindre end ideel, fordi den indeholder en vis mængde mættede fedtsyrer. Canolaolie er potentielt en fremragende madolie, eftersom omkring halvdelen af dens mættede fedtsyrer foreligger i form af olivenolie, og eftersom dens relativt høje indhold af 25 a-linolensyre, som er skadeligt for lagerstabiliteten og den oxidative stabilitet, kan være en fordel ud fra et ernæringsmæssigt synspunkt. Man mener, at a-linolensyre er en precursor for kroppens syntese af en familie af kemiske forbindelser, der kan reducere risikoen for cardiovaskulære sygdomme.

30 Det anerkendes i litteraturen, at canolaoliens indhold af oleinsyre varierer en smule i afhængighed af omgivelserne, temperaturen og tilgængeligheden af fugtighed, når rapsfrøene dannes. Som tidligere nævnt er oleinsyreindholdet i tilgængelige canola-sorter sædvanligvis omkring 55 til 65 vægt-%; se f.eks.

DK 175657 B1 I

I I

tabel V på side 171 i kapitel 7 med titlen The Introduction of Low Erucic Acid I

Rapeseed Varieties Into Canadian Production" af J.K. Daun, som findes i I

"High and Low Erucic Acid Rapeseed Olis", Academic Press Canada (1983). I

H Som det rapporteres i den samme artikel, vil rapsvarieter, som indeholder I

5 større koncentrationer af erucasyre, indeholde endnu ringere mængder I

oleinsyre. I

Lejlighedsvis har højere oleinsyreindhold været nævnt, men disse har ikke I

I været gjort tilgængelige for rapsfrøavleme. Eksempelvis nævnes det på side I

I 10 23 i oplægget til den 7. internationale rapsfrø kongres, der blev holdt i Poznan, I

I ; Polen, den 11. til 14. maj 1987, at mån er stødt på en canola-prøve med et I

I i oleinsyreindhold på 79,0 vægt-% under givne vækstbetingelser, mens man I

; under andre vækstbetingelser har fundet et oleinsyreindhold på 74 vægt-%. I

I Denne plante hævdedes at være produceret ved tilbagevendende selektion I

I 15 under anvendelse af ikke-identificerede forældreplanter. Der er imidlertid tale I

' om en ikke-fyldestgørende beskrivelse, der ikke sætter læseren i stand til at I

I frembringe en rapsplante, som producerer rapsfrø med et sådant forøget I

I oleinsyreindhold. I

I 20 Som det er anført i US patentskrifteme nr. 4 517 763, nr. 4 658 084 og nr. 4 I

I 658 085 samt de i disse patentskrifter nævnte publikationer, kender man hy- I

I bridiseringsprocesser, der er velegnede til produktion af rapsfrø. I

Det er et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en i det væ- I

I 25 sentlige ensartet samling af forbedrede rapsfrø, der giver en vegetabilsk olie I

med forøget stabilitet. I

Det er et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en I

fremgangsmåde til fremstilling af en endogen vegetabilsk olie som angivet i I

30 indledningen til krav 1 for at forøge oleinsyreindholdet af rapsfrø og for I

derved at forbedre stabiliteten af den vegetabilske olie fremstillet fra disse. I

En sådan fremgangsmåde er ejendommelig ved de træk, der er angivet i den I

kendetegnende del af krav 1. I

i 5 DK 175657 B1

Disse og andre formål og fordele, som er knyttet til opfindelsen, vil fremgå af den efterfølgende beskrivelse og af patentkravene.

5

Med opfindelsen tilvejebringes en i det væsentlige homogen samling af modne rapsfrø, som er i stand til at give en vegetabilsk olie med forøget stabilitet under udsættelse for varme, hvilken olie har (1) et usædvanligt højt oleinsyreindhold på mindst 79 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold, 10 (2) et indhold af erucasyre påhøjst 2,0 vægt-% baseret på det totale fedtsyre indhold og (3) et indhold af glucosinolater i den faste bestanddel på under 100 μιτιοΙ pr. gram.

En i det væsentlige ensartet bestand af rapsplanter, som er fremskaffet ved 15 selvbestøvning, er i stand til at danne rapsfrø, der giver en vegetabilsk olie med forøget stabilitet, når den udsættes for varme, hvor rapsfrøene har (1) et usædvanlig højt oleinsyreindhold på mindst 79 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold, (2) et indhold af erucasyre på højst 2,0 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold og (3) et indhold af glucosinolater i den faste be-20 standdel på under 100 pmol pr. gram.

Fra sådanne rapsfrø kan der fremstilles en forbedret vegetabilsk olie med forøget stabilitet under udsættelse for varme, hvor rapsfrøene har (1) et udsædvanlig højt oleinsyreindhold på mindst 79 vægt-% baseret på det totale 25 fedtsyreindhold, (2) et indhold af erucasyre på højst 2,0 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold og (3) et alfa-linolensyreindhold på mindre end 5 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold.

Det har vist sig, at en fremgangsmåde til at forøge rapsfrøenes indhold af 30 oleinsyre omfatter, at man i DK 175657 B1

I I

(a) udsætter mindst en generation af celler afledt af en rapsplante, I

der danner rapsfrø med et oleinsyreindhold på under 79 vægt-% baseret på I

det totale fedtsyreindhold, for en teknik valgt blandt gamma-bestråling, kon- I

takt med et kemisk mutagen og en kombination af disse teknikker med hen- I

5 blik på at inducere mutagenese, I

(b) regenererer cellerne for at producere en rapsplante og at danne I

rapsfrø i mindst en generation efter generationen fra trin (a), I

I 10

: (c) udvælger rapsfrø produceret i trin (b), som har et oleinsyreind- I

I hold på mindst 79 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold, I

I (d) producerer en rapsplante på basis af udvælgelsen i trin (c) og I

I 15

(e) foretager en selvbestøvning af rapsplanten fra trin (d) i et til- I

strækkeligt antal generationer til at opnå en væsentlig genetisk homogenitet I og til at danne rapsfrø, som mindst indeholder 79% oleinsyre beregnet på I vægten af det totale fedtsyreindhold.

I 20

De rapsfrøplanter, der hidtil har været tilgængelige, hvad enten der er tale I : om Brassica napus eller Brassica campestris, har dannet rapsfrø med et oleinsyreindhold påvæsentligt under 79 vægt-% baseret på det totale fedt- I syreindhold. Til den foreliggende opfindelses formål bestemmes oleinsyre- I 25 indholdet af en given samling rapsfrøved en standardprocedure, hvori olien fjernes fra rapsfrøene ved knusning af disse, hvorefter den ekstraheres som I en methylester efter omsætning med methanol og natriumhydroxid. Derefter analyseres den resulterende ester for sit fedtsyreindhold ved gaskromatografi I under anvendelse af en kapillarkolonne, der gør det muligt at foretage en I 30 separation på basis af graden af umættethed samt kædelængden. Denne I analyseprocedure er beskrevet i en artikel af J.K. Daun et al, J. Amer. Oil I Chem. Soc. 60: 1751-1754 (1983). De canola-varieteter af rapsfrø med I højere kvalitet, som er tilgængelige til kommerciel udplantning, har alminde· 7 DK 175657 B1 ligvis et oleinsyreindhold på højst 65 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold. Som følge heraf har der hidtil været et behov for forbedrede canola-varieteter, der udviser et væsentligt højere oleinsyreindhold.

5 I overensstemmelse med den foreliggende opfindelses begreber udvælger man fortrinsvis planteceller, der kan undergå regeneration (eksempelvis frø, mikrosporer, frøanlæg eller vegetative dele) ud fra en hvilken som helst af de canola-sorter, som vides at have tilstrækkeligt gode agronomiske karakteristika. Sådanne planteceller kan udledes fra Brassica napus eller Brassica 10 campestris planter. Brassica napus planterne kan være af enten sommereller vintertype. De planteceller, der er afledt fra en rapsfrøplante, der danner rapsfrø med et oleinsyreindhold på under 79 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold, udsættes derefter i mindst en generation for mutagenese, hvorefter der regenereres en rapsplante fra cellerne under dannelse af en 15 rapsplante og rapsfrø i mindst en efterfølgende generation. Man udvælger rapsfrømed et oleinsyreindhold på mindst 79 vægt-% baseret pådet totale fedtsyreindhold, hvorefter der produceres en rapsplante på basis af denne udvælgelse, hvilken plante selvbestøves i et tilstrækkeligt antal generationer (eksempelvis 2 til 8 yderligere generationer) til at opnå en væsentlig genetisk 20 homogenitet og til at danne rapsfrø, der indholder mindst 79 vægt-% olein-syre baseret påden totale vægt af de tilstedeværende fedtsyrer. Plantecellerne, som underkastes mutagenese, hidrører sædvanligvis også fra planter, der danner rapsfrø med et indhold af α-linolensyre på over 5,0 vægt-% (eksempelvis over 3,5 vægt-%), og der foretages sideløbende en udvæl-25 gelse for et reduceret a-linolensyreindhold.

Mutagenesen gennemføres fortrinsvis ved, at man underkaster plantecellerne (eksempelvis rapsfrø) en teknik valgt blandt gamma-bestråling, kontakt med et kemisk mutagen og en kombination af disse teknikker, hvilken be-30 handling er af en varighed, der er tilstrækkelig til at fremkalde den ønskede forøgelse af oleinsyreindholdet (og fortrinsvis også deri ønskede formindskelse af α-linolensyreindholdet) via en genetisk modifikation, men utilstrækkeligt til at ødelægge cellernes levedygtighed og deres evne til at blive re-

DK 175657 B1 I

I I

I genereret til en plante. Et rapsfrø indeholder fortrinsvis en fugtigheds- I

mængde på omkring 5 til 6 vægt-% på tidspunktet for en sådan mutagenese. I

Fortrinsvis gennemføres mutagenesen ved gamma-bestråling, eksempelvis I

I af den art, der kan fås fra en. Cesium 137-kilde. Man tilfører fortrinsvis I

I 5 gamma-bestrålingen til plantecellerne {eksempelvis rapsfrø) i en dosering på I

I omkring 60 til 200 Krad, især i en dosering på omkring 60 til 90 Krad. Det I

I skal forstås, at selv når man opererer med strålingsdoser inden for de I

I angivne områder vil nogle planteceller (eksempelvis rapsfrø) tabe deres leve- I

I dygtighed, hvorefter de måkasseres. Den ønskede mutagenese kan også I

I 10 foretages ved hjælp af kemiske midler, såsom ved kontakt med ethylmethyl- I

I sulfonat, ethylnitrosourinstof eller lignende, ligesom man kan anvende fysiske I

I midler, såsom røntgenstråling eller lignende. I

Det er klart, at mutagenese-behandlingen vil resultere i en lang række ge- I

I 15 netiske ændringer af rapsplanterne, som produceres. Mange af disse ærv I

I dringer vil være skadelige for levedygtigheden af den resulterende plante I

I over en længere tidsperiode. Nogle af ændringerne vil endvidere føre til I

levedygtige planter, som imidlertid har mangelfulde agronomiske karakter- I

istika. Sådanne mindre heldige typer kan simpelthen kasseres. Hvis man øn- I

I 20 sker det, kan man imidlertid gemme de planter, som har undergået mutation I

I med hensyn til oleinsyreproduktionen koblet med ikke-ønskelige agronomi- I

I ske kendetegn. Disse planter kan anvendes til formering eller som kildemate- I

I riale, hvorfra man kan udlede planter, som har de efterstræbte karaktertræk I

I koblet med tilfredsstillende agronomiske karakteristika. I

I 25 I

I Efter mutagenesen regenereres rapsplanterne fra de behandlede celler ved I

I anvendelse af i sig selv kendte teknikker. F.eks. kan de resulterende rapsfrø I

I plantes i overensstemmelse med konventionelle rapsdyrkningsprocedurer, I

I idet der efter selvbestøvning dannes rapsfrø på planterne. Alternativt kan I

I 30 man udvinde fordoblede haploide kimplanter. Udplantningen af de behan- I

I diede rapsfrø gennemføres fortrinsvis i et drivhus, hvor bestøvningen kontrol- I

I leres og overvåges nøje. De yderligere rapsfrø, der dannes som et resultat af I

I en sådan selvbestøvning i den foreliggende eller en efterfølgende generation, I

i H

a 9 DK 175657 B1 | indsamles og underkastes analyse for oleinsyreindholdet. Eftersom Brassica napus og Brassica campestris er tokimbladede planter, kan analysen for oleinsyreindholdet gennemføres på det halve frø, mens det andet halve frø kan gemmes til eventuel senere spiring, hvis oleinsyreindholdet viser sig at 5 være favorabelt som følge af mutagenesen. Rapsfrøene kan forsigtigt separeres i to halve frø ved anvendelse af kendte teknikker.

Når et modent halvfrø viser sig at have et oleinsyreindhold på mindst 79 vægt-% (fortrinsvis mindst 80 vægt-%), bliver det udvalgt og opbevaret.

10 Oleinsyreindholdet af en sådan selektion vil fortrinsvis være mellem 79 og 90 vægt-% (eksempelvis 80 til 85 vægt-%).

Det andet halvfrø (dvs. kimblad), som genetisk vil være det samme som det halvfrø, der blev udvalgt til halvfrø-analysering, kan derefter bringes til at spi-15 re, hvorved der dannes en rapsplante, som man lader undergå selvbestøvning. En sådan udplantning af halvfrøet gennemføres fortrinsvis også i et drivhus, hvori bestøvningen kontrolleres og overvåges omhyggeligt. De resulterende rapsfrø høstes, udplantes og selvbestøves i et tilstrækkeligt antal generationer til at opnå en betydelig genetisk homogenitet. Den genetiske 20 stabilisering af rapsplantematerialet gør det muligt at skabe planter, som har en rimelig forudsigelig genotype, og som kan anvendes som avls- eller kildemateriale til brug ved produktion af andre forbedrede rapsvarieteter, som en færdigudviklet varietet til anvendelse ved rapsdyrkning eller som en forældreplante til brug ved produktion af hybride rapsfrø, hvor det høje 25 oleinsyreindhold overføres til afkommet.

De resulterende rapsfrø udvælges også på en sådan måde, at de har et eru-casyre- og glucosinolatindhold svarende til canola. Nærmere bestemt er eru-casyreindholdet højst 2,0 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold og 30 fortrinsvis under 0,1 vægt-% (eksempelvis under 0,05 vægt-%) baseret på det totale fedtsyreindhold. Indholdet af glucosinolater i den faste komponent er under 100 pmol pr. gram (fortrinsvis under 30 pmol pr. gram). Glucosi-nolatindholdet kan stamme fra 3-butenylglucosinolat, 4-pentenylglucosinolat, i

I DK 175657 B1 I

I

2-hydroxy-3-butenylglucosinolat, 2-hydroxy-4-pentenylglucosinolat eller I

blandinger deraf. Bestemmelsen af glucosinolatindholdet foretages fortrinsvis I

på det lufttørrede, oliefri faste stof, og det måles ved den gaskromatografiske I

metode, der er udviklet af the Canadian Grain Commission. De foreskrevne I

5 erucasyre- og glucosinolat-niveauer muliggøres sædvanligvis ved at udvælge I

udgangsmaterialer, som i forvejen indeholder særligt ønskelige niveauer af I

disse komponenter. I en foretrukken udførelsesform, hvor den vegetabilske I

olie er tænkt anvendt til stegning, udvælges de resulterende rapsfrø på en I

sådan måde, at de har et indhold af α-linolensyre på under 5 vægt-% baseret I

10 på det totale fedtsyreindhold (dvs. fortrinsvis højst 3,5 vægt-% baseret på det I

totale fedtsyreindhold). I en anden foretrukken udførelsesform indeholder den I

vegetabilske olie højst 7 vægt-% mættede fedtsyrer i form af stearinsyre og I

palmitinsyre, beregnet på det totale fedtsyreindhold (eksempelvis 6 til 7 I

I vægt-%). I

I 15 I

I Når først de ønskede kendetegn, som er beskrevet i det foregående (eksem- I

I pelvis et usædvanligt højt oleinsyreindhold), er blevet etableret, kan de let I

overføres til .andre planter inden for de samme Brassica napus eller Brassica I

campestris arter ved anvendelse af konventionelle planteavlsteknikker, I

20 herunder krydsbestøvning og selektion af de dannede afkom. Det er blevet I

vist, at disse karakteristika i høj grad er arvelige, at de kan overføres fra I

forældre til afkom, og at de kan genfindes i udskilte afkom i efterfølgende I

generationer efter krydsningen. Når de ønskede karaktertræk først er I

etableret, kan de ligeledes overføres imellem napus- og carripestris-arter ved I

25 anvendelse af de samme konventionelle planteavlsteknikker, herunder pol- I

len-overføring og selektion. Overføringen af andre karaktertræk, såsom et I

lavt erucasyreindhold, imellem napus- og campestris-arter ved stan- I

dardteknikker inden for plantedyrkning er allerede godt dokumenteret i den I

tekniske litteratur. Der kan f.eks. henvises til "Brassica Crops and Wild Allies I

30 Biology and Breeding" redigeret af S. Tsunada, K. Hinata og Comez Campo, I

Japan Scientific Press, Tokyo (1980). Som et eksempel på overføring af de I

ovenfor beskrevne ønskede karaktertræk (eksempelvis et usædvanligt højt I

oleinsyreindhold) fra napus til campestris kan man udvælge en kommercielt I

----—---- DK 175657 B1 11 tilgængelig campestris-sort, såsom Topin, Horizon eller Colt, og gennemføre en interspecifik krydsning med en passende plante fra de i det efterfølgende beskrevne napus-avlslinier (f.eks. FA677-39, Topas H6-90 og FA677M5-132).

Alternativt kan der på pålidelig og uafhængig måde udvikles andre napus-5 avlslinier, når man følger de i det følgende beskrevne mutageneseteknikker. Topin-varieteren kan fås fra Agriculture Canada, Saskatoon, og andre distributører. Horizon- og Colt-varieteteme kan fås fra Bonis & Company Ltd.,

Lindsay, Ontario, Canada. Efter den interspecifikke krydsning selvbestøves medlemmerne af Fi-generationen til frembringelse af F2-frø. En udvælgelse 10 for de ønskede karakteregenskaber (eksempelvis et usædvanligt højt olein* syreindhold) foretages derefter på enkelte F2-frø, som derpå tilbagekrydses med campestris-forældrene igennem det antal generationer, som kræves for at opnå en euploid (n=10) campestris-linie, som udviser de ønskede egenskaber (f.eks. et usædvanligt højt oleinsyreindhold).

15 I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse bliver de rapsfrø, som besidder den specificerede kombination af karakteristika, multipliceret til dannelse af en i det væsentlige ensartet samling af sådanne frø (f.eks. en sæk sådanne frø), som kan anvendes til frembringelse af en i det væsentlige 20 ensartet bestand af sådanne rapsplanter. Antallet af rapsfrø, som findes i en sådan samling, beløber sig til mindst 250 frø, og den resulterende, i det væsentlige ensartede bestand af rapsplanter beløber sig til mindst 250 planter.

25 Den forbedrede vegetabilske olie ifølge opfindelsen kan dannes ved simpel ekstraktion, hvilket foregår direkte ud fra de modne rapsfrø, eksempelvis ved knusning og efterfølgende ekstraktion i overensstemmelse med kendte teknikker. Der kan f.eks. henvises til kapitel 8 med titlen ’’Rapeseed Crushing and Extraction" af D.H.C. Beach, som findes i "High and Low Erucic Acid 30 Rapeseed Oils", Academic Press Canada (1983). I en foretrukken udførelsesform er den vegetabilske olie til stede i en mængde, der er bekvem til kommerciel anvendelse eller husholdningsbrug (dvs. en mængde på mindst 1 liter).

I DK 175657 B1 I

I 12 I

Den teori, ved hvilken mutagenesen har vist sig at være i stand til at forøge I

oleinsyreindholdet til sådanne høje niveauer i rapsfrø, antages at være for I

kompliceret til simpel forklaring. F.eks. kan mutationen have en skadelig ind- · I

5 virkning på dannelsen af et eller flere enzymer, som normalt vil medvirke ved I

dehydrogeneringen af fedtsyrerne, efterhånden som frøene modnes. I

I Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende specifikke eksempler. Det I

skal imidlertid forstås, at opfindelsen ikke er begrænset til de specifikke detal- I

H 10 jer, som fremgår af eksemplerne. I

I EKSEMPEL I I

Frø af Regent-varieteten af Brasslca napus blev udvalgt som udgangsmate- I

15 riale. Denne canola-sort er af sommertypen, og den er velegnet til produktion I

af vegetabilsk olie, når den dyrkes i den nordlige centralregion af USA, det I

I vestlige prærieareal i Canada og andre steder, hvor sommerraps har tilpas- I

I set sig. Regent-varieteten blev første gang introduceret i 1977 af universitetet I

I i Manitoba. Frø til udplantning af Regent-varieteten kan fås fra afdelingen for I

I 20 plantevidenskab på universitetet i Manitoba. En repræsentativ prøve (dvs. I

2,0 g) af de modne frø af udgangsmaterialet, inden disse blev udsat for I

gamma-bestråling (som beskrevet i det følgende), indeholdt de følgende fedt- I

syrer i de angivne omtrentlige koncentrationer baseret på den totale vægt af I

I de tilstedeværende fedtsyrer (bestemt ved gaskromatografi som tidligere be- I

I 25 skrevet): I

DK 175657 B1 i ! 13 i j

Antal dobbelt-

Antal C-atomer bindinger pr.

Fedtsyre pr. molekyle molekyle Vægt-% 5 Palmitinsyre 16 0 4,8

Palmitoleinsyre 16 1 0,1

Stearinsyre 18 0 1,6

Oleinsyre 18 1 65,4

Linolsyre 18 2 19,3 10 a-linolensyre 18 3 6,9 j

Arachidinsyre 20 0 0,6 i i

Eicosensyre 20 1 1,0 j

Behensyre 22 0 0,3 i i Erucasyre 22 1 ikke på- 15 viselig

Indholdet af glucosinolater i den faste komponent var 13,44 pmol pr. gram som bestemt ved den gaskromatografiske metode udviklet af the Canadian 20 Grain Commission.

, Inden gamma-bestrålingen blev frøene af Regent-varieteten af canola op bevaret under sådanne betingelser, at levedygtigheden kunne opretholdes.

Nærmere bestemt blev frøene opbevaret i et koldt lagerrum med en tempera-25 tur på omkring 10 OC og en relativ fugtighed på 40%. Frøene havde et fug-tighedsindhold på omkring 5,5 vægt-% efter lufttørring.

Frø af Regent-varieteten (nærmere bestemt ca. 10 g) blev derefter anbragt i et gamma-bestrålingsapparat af mærket Gammacell 1000 fremstillet af 30 Atomic Energy of Canada, Ltd., hvor de blev udsat for en bestråling af stør- i relsesordenen 90 Krad frembragt af en Cesium 137 kilde i en mængde på26,61 Krad pr. time med henblik på at inducere mutagenese. Disse frø kan betegnes M1-frø.

j

I DK 175657 B1 I

I I

Efter gamma-bestrålingen blev M1-frøene udplantet i et drivhus i Georgetown, I

Ontario, Canada. Drivhuset havde en dagtemperatur på omkring 25 + 3 “C I

og en nattemperatur på omkring 18 °C. Omkring 40% af de gamma- I

5 bestrålede frø producerede frugtbare rapsplanter, som ved selvbestøvning I

gav M2-frø. Disse M2-frø blev derefter udplantet på åben mark i det samme I

område til frembringelse af planter, som efter bestøvning gav M3-frø. I

Repræsentative M3-frø produceret på M2-planterne blev derefter udblødt i I

10 vand, hvorefter et kimblad fra hvert frø forsigtigt blev udtaget til analyse af I

I fedtsyresammensætningen ved hjælp af den tidligere beskrevne gas- I

I kromatografiske teknik. En sådan halvfrø-analyse blev gennemført i over- I

I ensstemmelse med proceduren beskrevet i "Methods for Breeding for oil I

I Quality in Rape" af R.K. Downey og B.L. Harvey rapporteret i Canadian I

I 15 Journal of Plant Science, Vol. 43, side 271-275 (1963). Ud fra ialt 4490 kim- I

I blad-analyser af M3-planter viste 37 kimblade sig at indeholde en forøget I

I mængde oleinsyre, nærmere bestemt mellem 70,2 og 76% baseret på væg- I

I ten af det totale fedtsyreindhold. Indholdet af α-linolensyre var mellem 5,4 og I

I 13,1 % baseret på vægten af det totale fedtsyreindhold. I

I 20 I

I Man udvalgte et M3-halvfrø, betegnet som FA677, som viste sig at indeholde I

I de følgende fedtsyrer i de angivne koncentrationer (baseret på den totale I

I vægt af de tilstedeværende fedtsyrer): I

15 DK 175657 B1

Antal dobbelt-

Antal C-atomer bindinger pr.

Fedtsyre pr. molekyle molekyle Vægt-% 5 Palmitinsyre 16 0 4,0

Palmitoleinsyre 16 1 ikke på viselig

Stearinsyre 18 0 1,4

Oleinsyre 18 1 70,9 10 Linolsyre 18 2 10,7 a-linolensyre 18 3 11,0

Arachidinsyre 20 0 0,5

Eicosensyre 20 1 1,2

Behensyre 22 0 0,3 15 Erucasyre 22 1 ikke på viselig

Samtlige M3-halvfrø, herunder FA677, blev udplantet i drivhus og fik lov at 20 undergå selvbestøvning og at danne M4-generationen. Hver af disse planter producerede tilstrækkelig mange frø til at man på tilfældig måde kunne ud-\ vælge 50 frøprøver fra hver plante til knusning og efterfølgende analysering ved gaskromatografi. Når -disse repræsentative 50 frøprøver fra M4-generationen blev analyseret, viste det sig, at oleinsyreindholdet lå mellem 25 63 og 80 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold, og at indholdet af a- linolensyre lå mellem 3,2 og 7,7 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold.

Den enkelte plante, som var betegnet FA677, viste sig at have det højeste oleinsyreindhold (nærmere bestemt 80 vægt-%). Man udplantede 65 frø fra denne plante til dyrkning af M5-generationen. Til referenceformål blev 50 af 30 disse 65 frø desuden underkastet en kimblad-analyse, som afslørede oleinsyreindhold på mellem 74,0 og 85,0 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold. Den profil af den bedste plante, som kan udledes af kimbladanalysen (85,0% oleinsyre), er *

DK 175657 B1 I

I I

vist i den efterfølgende tabel: I

Antal dobbelt- I

Antal C-atomer bindinger pr. I

I 5 Fedtsyre pr. molekyle molekyle Vægt-% I

Palmitinsyre 16 0 3,2 I

Palmitoleinsyre 16 1 0,2 I

I Stearinsyre 18 0 2,4 I

I 10 Oleinsyre 18 1 65,0 I

I Linolsyre 18 2 4,4 I

a-linolensyre 18 3 2,7 I

Arachidinsyre 20 0 1,0 I

Eicosensyre 20 1 1,2 I

15 Behensyre 22 0 ikke på- I

I viselig I

Erucasyre 22 1 ikke på- I

I viselig I

j ' '

i I

20 I

I I Den ovenfor identificerede specifikke FA677 plante, som producerede et I

I oleinsyreindhold på 85 vægt-% baseret pådet totale fedtsyreindhold, gik tabt i I

I den efterfølgende generation som følge af brud på klasen i drivhuset. Når I

I ; man imidlertid analyserede en prøve på 50 frø fra en søsterplante i M5- I

I 25 generationen, betegnet FA677-39, efter knusning, observerede man de føl- I

I gende fedtsyrer i de angivne koncentrationer baseret på den totale vægt af I

I : fedtsyrerne. De planter, som opstod ved spiring af frøene, udviste en i det I

I væsentlige ensartet fænotype. I

I 30 I

DK 175657 B1 17

Antal dobbelt-

Antal C-atomer bindinger pr.

Fedtsyre pr. molekyle molekyle Vaegt-% 5 Myristinsyre 14 0 0,1

Palmitinsyre 16 0 4,1

Palmitoleinsyre 16 1 0,3

Stearinsyre 18 0 1,6

Oleinsyre 18 1 79,2 10 Linolsyre 18 2 7,1 a-linolensyre 18 3 4,6

Arachidinsyre 20 0 0,7

Eicosensyre 20 1 1,5

Behensyre 22 0 0,5 15 Erucasyre 22 1 0,06

Lignocerinsyre 24 0 0,3

Indholdet af glucosinolater i den faste komponent var 10,94 mmol pr. gram.

20 Planterne, som produceres ud fra disse frø, er frøbestandige efter * selvbestøvning og udviser en i det væsentlige ensartet fænotype. Det gen nemsnitlige oleinsyreindhold af samtlige analyserede prøver (65 prøver, 50 frø pr. prøve) var 77,1 vægt-% baseret pådet totale fedtsyreindhold, hvilket på signifikant måde indikerer et stabilt højt oleinsyreniveau i alle efterkom-25 mere af planten betegnet FA677.

Yderligere selektioner ved anvendelse af FA677-39 avlslinien kan resultere i en identifikation af planter, der udviser endnu højere oleinsyreindhold. Disse planter kan konserveres og multipliceres ved anvendelse af konventionelle 30 teknikker.

Det forøgede oleinsyreindhold gør rapsfrøene i stand til at frembringe en vegetabilsk olie, som udviser forøget stabilitet ved udsættelse for varme. Det

I OK 175657 B1 I

I : I

I i I

| I

H betyder, at den resulterende olie på pålidelig måde kan anvendes til stegning I

af fødevarer over en længere tidsperiode, uden at der opstår uheldige resul- I

tater, i sammenligning med canolaolien fra den kendte teknik. Det re- I

ducerede α-linolensyreindhold i den resulterende vegetabilske olie giver end- I

5 videre en forøget oxidativ stabilitet hos olien. I

Sammenlignelige rapsfrø af M5-generationen betegnet FA677-39 er blevet I

deponeret i henhold til Budapest-traktaten hos the American Type Culture I

I Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA., den 31. I

: 10 december 1987. Disse deponerede frø har fået deponeringsnummeret 40409 I

og vil til sin tid blive tilgængelige for offentligheden. I

Imidlertid skal tilgængeligheden af disse frø ikke anses for at være en op- I

fordring til at udføre den foreliggende opfindelse i strid med rettighederne, I

15 som gives af myndighederne i enhver stat i henhold til det patentlov eller lov I

for dyrkers rettigheder. I

EKSEMPEL II I

20 Man underkastede 12 udvælgelser fra M5-generationen (diskuteret i forbin- I

I delse med eksempel I), som havde de højeste oleinsyreindhold, en yderlig- I

I ere mutagenese under anvendelse af et kemisk mutagen. Nærmere bestemt I

dannede man to portioner komposit-frø af disse udvælgelser, som hver be- I

I stod af 1000 frø, og som blev behandlet med ethylnitrosourinstof. Dette I

I 25 ethylnitrosourinstof var opløst i dimethylsulfoxid i en koncentration på 8 mM. I

I Under fremstillingen af ethylnitrosourinstofopløsningen satte man 25 ml di- I

I methylsulfoxid til 1 g ethylnitrosourinstof, hvorefter den resulterende . I

I opløsning blev pufret til en pH-værdi på 5,5 ved hjælp af 5 mM morpholino- I I

ethansulfonsyre. Hver portion frø blev anbragt i en stor petri-skål, og der til- I

30 sattes 30 ml af den resulterende opløsning. Mens frøene var i kontakt med I

I ethylnitrosourinstofopløsningen, blev de inkuberet i mørke ved 20 °C i 18 I timer, hvorefter de blev renset 3 gange med destilleret vand. Endelig blev de 19 DK 175657 B1 plantet i bakker i et drivhus, idet der anvendtes et jordfrit vækstmedium til brug i drivhuse. I hver bakke plantedes 500 frø.

i * Omkring 30% af frøene, som blev behandlet med ethylnitroso- 5 urinstofopløsningen, voksede ud til planter, hvilke planter blev overført til urtepotter. Disse planter blev dyrket i et drivhus, og det viste sig, at omkring 25% af disse planter udviste en tilstrækkelig fertilitet til at kunne undergå selvbestøvning og danne frø (dvs. M2-generationen efter mutagenese under anvendelse af et kemisk mutagen).

10

Derefter indhøstedes frø (dvs. M2-generationen) fra 153 planter (dvs. M1-planteme). Fra hver af planterne blev 10 frø individuelt analyseret ved den tidligere beskrevne halvfrø-analyse. Man opnåede ialt 276 kimblad-udvælgel-ser, som havde et oleinsyreindhold på 77 vægt-% eller derover på basis af 15 det totale fedtsyre ind hold. Det viste sig, at tre af disse udvælgelser havde et oleinsyreindhold på 84 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold.

De resterende kimblade fra de 276 udvælgelser blev udplantet i et drivhus i Georgetown, Ontario, Canada, som havde en dagtemperatur på omkring 25 20 + 3 °C og en nattemperatur på omkring 18 °C. Efter dannelse af planter blev der dannet frø som et resultat af selvbestøvning (dvs. M3-generationen efter mutagenese ved anvendelse af et kemisk mutagen). En udvælgelse betegnet FA677M5-132 i M3-generationen viste sig ved anvendelse af to random-iserede analyser af hver 50 frø at have et oleinsyreindhold på 81,9 vægt-% 25 baseret på det totale fedtsyreindhold, et α-linolensyreindhold på 4,03 vægt-% baseret på det totale syreindhold, et ikke-påviseligt erucasyreindhold, et ind-

V

hold af mættede fedtsyrer på 6,59 vægt-% (i form af stearinsyre og palmitin-' syre) baseret på det totale fedtsyreindhold samt et indhold af glucosinolater i den faste komponent på under 30 pmol pr. gram. De planter, der opstod som 30 følge af spiring af frøene, udviste en i det væsentlige ensartet fænotype.

Yderligere udvælgelser fra avlslinien FA677M5-132 vil resultere i en identifikation af planter, der udviser endnu højere oleinsyreindhold. Disse planter kan opbevares og formeres ved anvendelse af konventionelle teknikker. Når

DK 175657 B1 I

I I

man f.eks. analyserer enkelte kimblade fra denne avlslinie, har man kunnet I

observere oleinsyreindhold på over 85 vægt-% baseret på det totale fedtsyre- I

I indhold. I

5 Sammenlignelige rapsfrø fra M3-generationen betegnet FA677M5-132 er I

blevet deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktaten hos the I

I American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Mary- I

land 20852, USA, den 13. december 1988. Denne prøve har fået depone- I

ringsnummeret 40523 og vil til sin tid blive gjort tilgængelig for offentligheden. I

10 I

Imidlertid skal tilgængeligheden af disse frø ikke betragtes som en mulighed I

I for at udføre den foreliggende opfindelse i strid med rettighederne givet af I

myndighederne i enhver stat i henhold til dets patent- eller dyrkningsret- I

I tighedslov. I

I 15 I

I EKSEMPEL III I

I Frø af Topas-varieteten af Brassica napus blev udvalgt som udgangsmateri- I

I ale. Denne canola-varietet er af sommertypen og egner sig godt til fremstill- I

I 20 ing af vegetabilsk olie, når den dyrkes i USA, Canada, Sverige og andre'om- I

I råder, hvor sommerraps har tilpasset sig. Topas-varieteten blev registreret i I

1987 af Svaldof AB, Sverige. Frøaf denne varietet til udplantning kan fås fra I

Bonis & Company Ltd., Lindsay, Ontario, Canada. Denne varietet udviser I

typisk et oleinsyreindhold på omkring 65 vægt-% baseret på det totale I

25 fedtsyreindhold samt et indhold af α-linolensyre på omkring 8 vægt-%, ligele- I

I des baseret pådet totale fedtsyreindhold. I

10 000 frø af Topas-varieteten blev underkastet mutagenese ved anvendelse I

I af et kemisk mutagen. Nærmere bestemt dannedes portioner, der hver be- I

I 30 stod af 1000 frø, som blev behandlet med ethylnitrosourinstof som tidligere I

I beskrevet. De resulterende frø blev plantet i plane bakker i et drivhus, idet I

I der som vækstmedium anvendtes et jordfrit medium til brug i drivhuse. I hver I

I bakke plantedes 500 frø, som kan betegnes M1-frø. I

B

21 DK 175657 B1

Man dannede frø (dvs. M2-generationen) som et resultat af selvbestøvning på 111 overlevende frugtbare planter (dvs. M1-planterne). Et af M2-frøene * blev underkastet kimblad-analyse, som viste et oleinsyreindhold på 82,07 5 vægt-% og et α-linolensyreindhold på 5,12 vægt-%, begge baseret pådet totale fedtsyreindhold. De resterende M2-kimblade blev udplantet i et drivhus i Georgetown, Ontario, Canada, med en dagtemperatur på omkring 25 + 3 °C og en nattemperatur på omkring 18 0C. Efter dannelse af en plante blev der som følge af selvbestøvning dannet frø (dvs. M3-generationen). Denne M3-10 generation blev betegnet Topas H6-90, og ved to randomiserede analyser af hver 50 frø viste M3-generationen sig at have et oleinsyreindhold på 81,17 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold, et α-linolensyreindhold på 3,55 vægt-%, ligeledes baseret på det totale fedtsyreindhold, et ikke-påviseligt erucasyreindhold, et indhold af mættede fedtsyrer på 6,17 vægt-% (i form af 15 stearinsyre og palmitinsyre) baseret på det totale fedtsyreindhold samt et glucosinolatindhold i den faste komponent på under 30 pmol pr., gram. De planter, der opstod ved spiring af frøene, udviste en i det væsentlige ensartet fænotype. Yderligere udvælgelser fra avlslinien Topas H6-90 (som angivet i det følgende) vil resultere i identifikation af planter med endnu højere olein-20 syreindhold. Disse planter kan opbevares og formeres ved anvendelse af konventionelle teknikker.

Sammenlignelige rapsfrø af M3-generationen betegnet Topas H6-90 er blevet deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktaten hos the 25 American Type Culture Collection, 12301 Parkiawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, den 13. december 1988. Denne deponering har fået nummeret 40524, og den vil til sin tid blive gjort tilgængelig for offentligheden.

Ved yderligere udvælgelse inden for M3-generationen af Topas H6-90 kunne man identificere en selektion betegnet Topas H6-90-99, som indeholdt de føl-30 gende fedtsyrer i de angivne omtrentlige koncentrationer baseret på det totale fedtsyreindhold (idet man anvendte den tidligere beskrevne gaskromatografiske teknik):

DK 175657 B1 I

I I

Antal dobbelt- I

Antal C-atomer bindinger pr. I

I Fedtsyre pr. molekyle molekyle Vægt-% I

I 5 Palmitinsyre 16 0 3,57 I

I Palmitoleinsyre 16 1 0,31 ' I

I Stearinsyre 18 0 1,87 I

I Oleinsyre 18 1 85,84 I

I Linoisyre 18 2 3,54 I

I ! 10 a-linolensyre 18 3 2,62 I

Arachidinsyre 20 0 0,49 I

Eicosensyre 20 1 1,29 I

I Behensyre 22 0 0,32 I

Erucasyre 22 1 ikke på- I

I 15 viselig I

Lignocerinsyre 24 0 0,07 I

I Frø produceret ud fra H6-90-99 vil fortsætte med at udvise et glucosinolat- I

I 20 indhold i den faste komponent på under 30 μ mol pr. gram. I

I I det foregående er opfindelsen blevet beskrevet ved hjælp af foretrukne ud- I

I førelsesformer, men det skal forstås, at man kan foretage variationer og mo- / I

difikationer inden for opfindelsens rammer. I

Η I

Claims (11)

1. 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at olien ekstra-20 heres fra manipulerede frø af Brassica napus planter
2. 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at olien ek-straheres fra rapsfrø med et fugtighedsindhold på omkring 5-6 vægt-%, og hvor frøene har været underkastet omkring 60-200, fortrinsvis 60-90 Krad 25 gammastråling. %
3. 4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet - ved, at olien ekstraheres fra rapsfrø, som i det mindste delvis har været un derkastet et kemisk mutagen. 30
4. 5. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at olien ekstraheres fra frø som yderligere har et endogent indhold af alfa linoleinsyre, som er mindre end 5 vægt-% baseret på det totale indhold af fedtsyrer. DK 175657 B1 I I I
5. 6. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at olien ekstra- I heret fra de manipulerede rapsfrø har et indhold af alfa linoleinsyre, som ikke I er større end 3,5 vægt-%. . I I I
6. 7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ' I I ved, at olien ekstraheret fra de manipulerede rapsfrø har et oleinsyreindhold I på mindst 79 vægt-% baseret på den totale indhold af fedtsyrer, et eruca- I I syreindhold på ikke mere end 2,0 vægt-% baseret på det totale indhold af I 10 fedtsyrer og et glucosinolatindhold i det faste materiale på mindre end 100 I I mikromol pr. gram. I
7. 8. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at rapsfrøene I I med væsentligt homogenitet er dannet på Brassica napus planter. I I 15 I
8. 9. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at rapsfrøene I I med væsentligt homogenitet har et usædvanligt højt oleinsyreindhold på I I mindst 80 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold. I
9. 10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at rapsfrøene I I med væsentligt homogenitet har et usædvanligt højt oleinsyreindhold på 80- I 90 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold. I
10. 11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at rapsfrøene I I 25 med væsentligt homogenitet desuden har et indhold af alfa-linolensyre på I I under 5 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold. I
11. 12. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at rapsfrøene I I med væsentligt homogenitet desuden har et indhold af alfa-linolensyre på I I 30 højst 3,5 vægt-% baseret på det totale fedtsyreindhold. I