NO307401B1 - Fremgangsmåte ved fremstilling av en endogen vegetabilsk olje - Google Patents

Description

Raps (dvs. Brassica na<p>us og Brassica campestris) blir dyrket som en stadig viktigere oljefrøavling i mange deler av verden. Som en kilde for vegetabilsk olje ligger den for tiden bare etter sojabønner og palme og ligger nesten jevnt med solsikke som tredjemann i kommersiell betydning. Oljen blir brukt både som en koke- og salatolje verden over.

I sin opprinnelige form ble rapsfrøolje funnet å ha uheldige effekter på helsen hos mennesker grunnet sitt relativt høye nivå av erucinsyre som vanligvis er tilstede i native avlinger i konsentrasjoner på 30-50 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold. Tidligere identifiserte planteforskere en frøplasmatisk kilde med lite erucinsyre rapsfrøolje og begynte å inkorporere denne egenskap i kommersi-elle avlinger. Se kapittel 6 med tittel "The Development of Improved Rapeseed Cultivars" av B.R. Stefansson fra "High and Low Erucic Acid Rapeseed Oils" utgitt av John K.G. Kramer, Frank D. Sauer og Wallace J. Pigden, Academic Press Canada (1983) .

I Canada fokuserte planteforskere sitt arbeide på å fremskaffe såkalte "double-low" typer som hadde lite erucinsyre i oljen og lite glukosinolater i det faste mel som er tilbake etter oljeekstraksjon (dvs. et erucinsyreinnhold på mindre enn 2 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold og et glukosinolatinnhold på mindre enn 30 mikromol pr. gram oljefritt mel). Disse høyere kvalitetsformer for raps utviklet i Canada er kjent som canola. I motsetning til dette arbeidet europeiske forskere for å oppnå kun "single-low" typer som hadde lite erucinsyre, men forsøkte ikke å forbedre kvaliteten til det faste mel som opprettholdt et glukosinolatinnhold på ca. 100 mikromol pr. gram oljefritt mel. Resultatet av denne hovedendring i fettsyresammenset-ningen hos rapsfrøolje var å danne en fullstendig ny oljeprofil som ofte inneholdt ca. 62 vekt% av oleinsyre basert på det totale fettsyreinnhold. Siden den totale prosentdel av olje i frøet ikke endret seg vesentlig når de nye lave erucinsyreavlinger ble utviklet, ble det funnet at erucinsyren kun hadde blitt omdirigert til andre fettsyrer og ble for det meste oleinsyre. Dette nivå av oleinsyre hadde en tendens til å variere innen ganske små grenser på ca. 55-65 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold. Se kapittel 7 med tittel "The Introduction of Low Erucic Acid Rapeseed Varieties Into Candian Production" av J.K. Daun fra den ovenfor nevnte Academic Press Canada (1983) publikasjon. Vektprosenten av andre fettsyrer varierte også noe, men ikke nok til å definere unike typer med potensiale for distinkt bruk eller forbedret kommersiell verdi. Se også "Prospects for the Development of Rapeseed ( B. na<p>us L.) With Improved Linoleic and Linolenic Acid Content" av N.N. Roy og A.W. Tarr, Plant Breedin<q>. vol. 98, s. 89-96 (1987).

For tiden blir canolaolje markedsført av Proctor & Gamble under varemerket "Puritan" . Slik vegetabilsk olje er typisk fri for kolesterol og fettsyrene som er tilstede i den, og består i hovedsak av 6% mettede fettsyrer i form av stea-rinsyre og palmitinsyre, ca. 32 vekt% linolensyre som inneholder to dobbeltbindinger pr. molekyl på18 karbonatomer, ca. 10 vekt% alfa-linolensyre som inneholder tre dobbeltbindinger pr. molekyl på 18 karbonatomer, ca. 62 vekt% oleinsyre som inneholder én dobbeltbinding pr. molekyl på 18 karbonatomer og mindre enn 1 vekt% erucinsyre som inneholder én dobbeltbinding pr. molekyl på22karbonatomer.

I løpet av årene har forskere forsøkt å forbedre fett-syreprofilen for canolaolje. F.eks. er den oksydative stabilitet av den vegetabilske olje relatert til antallet dobbeltbindinger i fettsyrene derfra. Dvs. molekyler med flere dobbeltbindinger er kjent for å være mer ustabile. Således har forskere forsøkt å redusere innholdet av alfa-linolensyre for å forbedre lagringstiden og den oksydative stabilitet spesielt under varme. Dette har ikke vist seg å være mulig ved bruk av naturlig forekommende frøplasma og de rapporterte verdier for alfa-linolensyre for slike frøplasma har vært større enn 6 vekt% (f.eks. større enn 6 til ca. 12 vekt%). Som rapportert av Gerhard Robbelen i kapittel 10 med tittel "Changes and Limitations of Breeding for Improved Polyenic Fatty Acids Content in Rapseed" fra "Biotechnology for the Oils and Fats Industry" utgitt av Colin Ratledge, Peter Dawson og James Rattray, American Oil Chemisfs Societey (1984) var et mutageneseeksperiment i stand til å oppnå linjer med mindre enn ca. 3,5 vekt% alfa-linolensyré basert på det totale fettsyreinnhold. Profilene hos disse linjer indikerer at nesten alt av alfa-linolen-fettsyren ble omgjort til linolensyre og at nivået for oleinsyre øket kun 1 eller 2%. Ikke desto mindre syntes oljen å gi enkelte fordeler i forhold til normal canolaolje. F.eks. krevet raffineringsprosessen mindre hydrogene-ring enn normal canolaolje og den oppviste en forbedret stekelevetid.

Senere studier har vist verdien av monomettede fettsyrer som en matbestanddel. Dette har ført til populariseringen av "Middelhavsmaten" med sin vekt på olivenolje, en naturlig forekommende kraftig kilde til oleinsyre. En slik diett er tenkt for å unngå problemet med arteriosklerose som stammner fra mettede fettsyrer. Selv i denne diett er imidlertid olivenolje funnet å være mindre enn ideell grunnet sitt mettningsnivå. Canolaolje er en potensielt overlegen matolje siden den inneholder ca. en halvdel av de mettede fettsyrer i forhold til olivenolje og siden dens relativt høye nivåer av alfa-linolensyre som er skadelige for lagringstiden og oksydativ stabilitet kan være en fordel fra et matmessig synspunkt. Alfa-linolensyre er antatt å være én forløper for syntesen av en mengde av en familie av kjemikalier som kan redusere risikoen for kardiovaskulære sykdommer.

Det er anerkjent i litteraturen at oleinsyreinnholdet av canola varierer noe med miljø, temperatur og fuktighetstil- gjengeligheten når rapsfrøet blir dannet. Som tidligere indikert er oleinsyreinnholdet av tilgjengelige canola-avlinger vanlig omkring 55-65 vekt%. Se f.eks. tabell V på side 171 fra kapittel 7 med tittel "The Introduction of Low Erucuc Acid Rapeseed Varieties Into Canadian Production" av J.K. Daun som forekommer i "High and Low Erucic Acid Rapeseed Oils", Academic Press Canada (1983). Som angitt i samme artikkel vil rapstyper som har større konsentrasjoner av erucinsyre ha enda lavere oleinsyreinnhold.

Fra tid til annen har høyere oleinsyreinnhold blitt nevnt, men har ikke blitt gjort tilgjengelig for rapsfrødyrkeren. F.eks. er det på side 23 av "proceedings of the 7th Inter-national Rapeseed Congress" holdt i Poznan, Polen, 11-14 mai 1987, angitt en passerende referanse til en canolaprøve med et oleininnhold på 79,0% under et gitt sett av dyrk-ningsbétingelser og oleinsyreinnhold på 74% under forskjel-lige dyrkningsbetingelser. Denne plante ble sagt å være dannet ved gjentatt seleksjon under anvendelse av uidenti-fiserte opphavsplanter. Dette er en ikke utførbar beskri-velse som ikke setter leseren av denne publikasjon i besittelse av en rapsplante som danner rapsfrø med et øket oleinsyreinnhold.

Som angitt:i US patent nr. 4.517.763, 4.658.084 og 4.658-.085 og publikasjonene identifisert deri er hybridiserings-prosesser som er egnet for fremstilling av rapsfrø kjent.

Det er et mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en i hovedsak uniform sammensetning av forbedrede rapsfrø som gir en'vegetabilsk olje med øket stabilitet.

Det ér et mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en fremgangsmåte ved fremstilling av en endogen vegetabilsk olje som angitt i krav l's ingress for å øke oleinsyreinnholdet av rapsfrø og for derved å forbedre stabiliteten av den vegetabilske olje avledet fra disse. En slik frem gangsmåte er særpreget ved de trekk som er angitt i krav l's karakteriserende del.

Disse og andre mål og fordeler ved oppfinnelsen vil være innlysende for fagmannen ved å lese den følgende beskrivel-se og de medfølgende krav.

Oppsummering av oppfinnelsen

En i hovedsak homogen sammensetning av ferdigutviklede rapsfrø er fremskaffet hvor rapsfrøene er i stand til å gi en vegetabilsk olje av øket stabilitet når den utsettes for varme- med (1) et uvanlig høyt oleinsyreinnhold på minst 79 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold, (2) et erucinsyreinnhold på ikke mer enn 2,0 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold og (3) et glukosinolatinnhold i den faste komponent på mindre enn 100 mikromol pr. gram.

En i hovedsak uniform stand av rapsplanter er fremskaffet som ved selvpollinering er i stand til å danne rapsfrø som gir en-vegetabilsk olje av øket stabilitet når den utsettes for varme hvOr: rapsfrøene har (1) et uvanlig høyt oleinsyreinnhold på minst 79 vékt% basert på det totale fettsyreinnhold, (2) et erucinsyreinnhold på ikke mer enn 2,0 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold og (3) et glukosinolatinnhold i den faste komponent på mindre enn 100 mikromol pr. gram.

Fra slike rapsfrø kan det fremstilles en forbedret vegetabilsk olje med øket stabilitet når den utsettes for varme, hvor rapsfrøene har (1) et uvanlig høyt oleinsyreinnhold på minst 79 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold, (2) et erucinsyreinnhold på ikke mer enn 2,0 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold og (3) et alfa-linolensyreinnhold mindre enn 5 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold.

Det er blitt funnet at en fremgangsmåte for å øke olein-syreinhholdet hos rapsfrø omfatter:

a) å underkaste i minst én generasjon celler avledet fra en rapsfrøplante som danner rapsfrø med et oleinsyreinnhold på mindre enn 79 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold en teknikk valgt fra gruppen omfattende gammastråling, kontakt med et kjemisk mutagen, og en kombinasjon av disse for å indusere mutagenese, b) å regenerere nevnte celler for å danne en rapsplante og for å danne rapsfrø i minst én generasjon

etterfølgende trinn a),

c) å velge ut et rapsfrø dannet i trinn b) som har et oleinsyreinnhold på minst 79 vekt% basert på det

totale fettsyreinnhold,

d) å danne en rapsplante på basis av nevnte utevel-gélsestrinn c), og e) selvpollinere rapsplanten fra trinn d) i et tilstrekkelig antall generasjoner for å oppnå i

hovedsak genetisk homogenitet og for å danne rapsfrø som inneholder minst 79 vekt% oleinsyre basert på det totale fettsyreinnhold.

Tidligere tilgjengelige rapsfrøplanter, enten Brassica napus eller Brassica cam<p>estris. har dannet rapsfrø som har et oleinsyreinnhold på godt under 79 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold. For formålet med foreliggende oppfinnelse blir oleinsyreinnholdet av et gitt rapsfrø bestemt ved en standard fremgangsmåte hvor oljen blir fjernet fra rapsfrøene ved å knuse frøene og blir ekstrahert som. en metylester etter reaksjon med metanol og riatriumhydroksyd. Derpå blir den resulterende ester analysert for fettsyreinnhold ved gass-væskekromatografi ved å bruke en kåppilærkolonne som tillater separasjon på basis av umettningsgraden og kjedelengden. Denne analyseprosedyre er beskrevet i arbeidet til J.K. Daun et al., J. Amer. Oil Chem. Soc. 60: 1751-1754 (1983) og er innlemmet heri pr. referanse. De høyere kvaliets canolatyper av rapsfrø som er tilgjengelige for kommersiell planting har vanligvis et oleinsyreinnhold på ikke mer enn 65 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold. Følgelig har det foreligget tidligere et behov for forbedrede canolatyper som oppviser et signifikant høyere oleinsyreinnhold.

I samsvar med fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse velges det preferensielt ut planteceller som er i stand til regenerering (f.eks. frø, mikrosporer, ovuler, vegeta-tive deler) fra enhver av canolatypene som blir funnet å ha overlegne agronomiske særtrekk. Slike planteceller kan være avledet fra Brassica napus eller Brassica campestris planter. Brassica napus-plantene kan enten være av sommer-eller vintertype. Plantecellene avledet fra en rapsfrø-plante som danner rapsfrø som har et oleinsyreinnhold på mindre enn 79 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold, blir derpå underkastet i minst én generasjon mutagenese, idet en rapsplante blir regenerert fra cellene for å danne en rapsplante og for å danne rapsfrø i minst én påfølgende generasjon, hvor rapsfrøet velges ut med et oleinsyreinnhold på minst 79 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold og en rapsplante blir dannet på basis av denne utvelgelse som blir selvpollinert i et tilstrekkelig antall generasjoner (f.eks. 2-8 ytterligere generasjoner) for å oppnå vesentlig genetisk homogenitet og for å danne rapsfrø på disse som inneholder minst 79 vekt% oleinsyre basert på den totale vekt av fettsyrene som er tilstede. Plantecellene som underkastes mutagenese er også vanligvis fra planter som danner rapsfrø med et alfa-linolensyreinnhold på mer enn 5,0 vekt% (f.eks. større enn 3,5 vekt%) og påfølgende utvelgelse blir foretatt for et redusert alfa-linolensyreinnhold.

Mutagenesen utføres fortrinnsvis ved å underkaste plantecellene (f.eks. et rapsfrø) en teknikk valgt fra gruppen omfattende gammastråling, kontakt med et kjemisk mutagen og en kombinasjon av disse i tilstrekkelig varighet for å oppnå den ønskede økning i oleinsyreinnhold (og fortrinnsvis også den ønskede senkning i alfa-linolensyreinnhold) via en genetisk modifikasjon, men som ikke er tilstrekkelig til å ødelegge levedyktigheten av cellene og deres egenskap til å bli regenerert til en plante. Et rapsfrø har fortrinnsvis et fuktighetsinnhold på. ca. 5-6 vekt% ved tiden for slik mutagenese. Mutagenesen utføres fortrinnsvis ved gammastråling såsom den tilført fra en cesium 137-kilde. Gammastrålingen tilføres fortrinnsvis til plantecellene (f.eks. et rapsfrø) i en dose på ca. 60-200 Krad., og mest foretrukket i en dose på ca. 60-90 Krad. Det bør være forstått at selv når det brukes bestrålingsdoser innen de angitte områder, vil enkelte planteceller (f.eks. rapsfrø) tape sin levedyktighet og må kastes. Den ønskede mutagenese kan oppnås ved bruk av kjemiske metoder såsom ved kontakt med e ty Ime tyl sul f onat, etylnitrosourea etc, og ved bruk av fysiske metoder såsom røntgenstråler etc.

Det vil bli forstått at mutagenesebehandlingen vil resultere i en stor variasjon av genetiske endringer innen raps-plantene som blir dannet. Mange av disse endringer vil være uheldige for levedyktigheten av den resulterende plante over en forlenget tidsperiode. Enkelte endringer vil også danne levedyktige planter som har skadede agronomiske særtrekk-. Slike atypisk planter kan enkelt bli kastet. Imidlertid dersom ønskede planter som har undergått muta-sjon med hensyn til oleinsyreproduksjon, koblet med uønskede agronomiske egenskaper, kan bli beholdt og brukt som formerings- eller kildemateriale hvorfra planter med den ønskede egenskap koblet med tilfredsstillende agronomiske særtrekk er avledet.

Ettér-mutagenése blir rapsplanter regenert fra de behandle de celler ved å bruke kjente teknikker. F.eks. kan de resulterende rapsfrø bli plantet i henhold til konvensjonelle rapsdyrkingsmetoder og etter selvpollinering blir rapsfrø dannet fra disse. Alternativt kan doble haploide planter bli utvalgt. Plantingen av de behandlede rapsfrø utføres fort- rinnsvis i et veksthus hvor pollineringen blir nøye kontrol-lert og overvåket. Ytterligere rapsfrø som blir dannet som et resultat av slik selvpollinering i foreliggende eller en etterfølgende generasjon blir høstet inn og blir underkastet analyse for oleinsyreinnhold. Siden Brassica na<p>us og Brassica campestris er dicotyledoner kan analysen for oleinsyre bli utført på et halvfrø og det gjenværende halvfrø kan bli oppbevart for mulig fremtidig spiring dersom oleinsyreinnholdet blir funnet å være gunstig som et resultat av mutagenesen. Rapsfrøene kan bli forsiktig tatt fra hverandre til to halvfrø ved å bruke kjente teknikker.

Når et ferdigutviklet halvfrø blir funnet å ha et oleinsyreinnhold på minst 79 vekt% (fortrinnsvis minst 80 vekt%) blir det valgt ut og beholdt. Oleinsyreinnholdet av en slik utvelgelse vil fortrinnsvis være 79-90 vekt% (f.eks. 80-85 vekt%).

Det andre halvfrø (dvs. cotyledon) som genetisk vil være det samme som halvfrøet som ble underkastet halvfrøanalyse kan derpå bli bragt. til spiring og en rapsplante blir dannet og tillatt å undergå selvpollinering. Slik planting av halvfrø blir også fortrinnsvis utført i et veksthus hvor pollineringen blir nøye kontrollert og overvåket. Det resulterende rapsfrø blir innhøstet, plantet og blir selvpollinert i et tilsterkkelig antall generasjoner for å oppnå hovedsakelig genetisk homogenitet. Den genetiske stabilisering av rapsplantematerialet tillater fremstilling av planter med en rimelig forutsigbar genotype som kan bli brukt som formerings- eller kildemateriale for fremstillingen av andre forbedrede typer som en ferdig type for bruk av rapsfrødyrkeren eller som opphav ved produksjonen av hybride rapsfrø hvor det høye oleinsyreinnhold blir videre-ført til avkommet.

De resulterende rapsfrø skal også velges ut slik at de har euricinsyre og glykosinolatinnholdet av canola. Mer spesielt er erucinsyreinnhodet ikke større enn 2,0 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold og fortrinnsvis mindre enn 0,1 vekt% (f.eks. mindre enn 0,05 vekt%) basert på det totale fettsyreinnhold og glukosinolatinnholdet i den faste komponent er mindre enn 100 mikromol pr. gram (fortrinnsvis mindre enn 30 mikromol pr. gram). Glukosinolatinnholdet kan være enhver eller en blanding av 3-butenyl-glukosinolat,4-pentenyl-glukosinolat, 2-hydroksy-3-butenyl-glukosinolat og 2-hydroksy-4-pentenyl-glukosinolat. Glukosinolatbestem-mélseh foretas fortrinnsvis på det lufttørkede oljefrie faste stoff som målt ved gass-væskekromatografimetoden til the Canadian Grain Commision. Erucinsyre- og glukosinolat-nivåene blir vanligvis gjort mulig ved å velge ut utgangs-materialer som allerede har høye ønskelige nivåer av disse komponenter. I en foretrukken utførelsesform hvor den vegetabilske olje er tiltenkt for stekeanvendelse blir de resulterende rapsfrø som har et alfalinolensyreinnhold mindre' enn 5 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold (f.eks. fortrinnsvis ikke større enn 3,5 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold) valgt ut. I tillegg inneholder i en foretrukken utførelsesform den vegetabilske olje ikke mer enn 7 vekt% av mettede fettsyrer i form av stearin- og palmitinsyre basert på det totale fettsyreinnhold (f.eks. 6-7 vekt%).

De ønskede egenskaper som er beskrevet heri (f.eks. uvanlig høyt oleinsyreinnhold) kan, når de en gang er etablert, lett bli overført til andre planter innen samme Brassica napus- eller Brassica cam<p>estris-arter ved konvensjonelle plantedyrkningsteknikker som innbefatter krysspollinering og utvelgelse av avkommet. Det har blitt vist at karakteri- stikaene er meget arvbare, kan bli overført til avkommet og kan gjenvinnes ved å velge ut avkommet i etterfølgende generasjoner etter kryssning. I tillegg, når de er etablert, kan de ønskede egenskaper overføres mellom napus- og campestris-artene ved å bruke samme konvensjonelle plantedyrkningsteknikker som innbefatter pollenoverføring og utvelgelse. Overføringen av andre egenskaper såsom lavt erucinsyreinnehold mellom napus- og campestris-artene ved standard plantedyrkningsteknikker er allerede godt dokumen-tert i den tekniske litteratur. Se f.eks. Brassica Crops and Wild Allies Biology and Breeding. utgitt av S. Tsunada, K. Hinata og Gomez Campo, Japan Scientific Press, Tokyo

(1980) . Som et eksempel på overføring av de ønskede egenskaper beskrevet heri (f.eks. uvanlig høyt oleinsyreinnhold) fra napus til cam<p>estris kan man velge ut en kommer-sielt tilgjengelig cam<p>estris-type såsom Tobin, Horizon eller Colt, og utføre en interrasiell kryssning med en passende plante av napus dyrkningslinjer beskrevet nedenfor (f.eks. FA677-39, Topas H6-90 og FA677M5-132). Alternativt kan andre na<p>us dyrkningslinjer pålitelig og uavhengig bli utviklet når man følger mutageneseteknikken beskrevet heri. Tobin-typen er tilgjengelig fraAgricultural Canada, Saskatoon, Saskatchewan, og andre forhandlere. Horizon- og Colt-typene er tilgjengelige fra Bonis&Company Ltd., Lindsay, Ontario, Canada. Etter interrasiell kryssning blir medlemmer av Fj^-generasjonen selvpollinert for å danne F2-frø. Utvelgelse for de ønskede egenskaper (f.eks. uvanlig høyt oleinsyreinnhold) blir så foretatt på enkle F2-frø som så blir krysset tilbake med campestris-opphavet gjennom det antall generasjoner som er nødvendig for å erholde en euploid (n=10) cam<p>estris-linie som oppviser de ønskede egenskaper (f.eks. uvanlig høyt oleinsyreinnhold).

De rapsfrø som har den angitte kombinasjon av særtrekk blir formert for å danne en i hovedsak uniform sammensetning av slike frø (f.eks. en pose av slike frø) som kan brukes for å danne en i hovedsak uniform stand av slike rapsplanter. Rapsfrøene som er tilstede i en slik sammensetning har et antall på minst 250 frø og den resulterende i hovedsak uniforme stand av rapsplanter har et antall på minst 250 planter.

Den forbedrede vegetabilske olje fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan dannes ved enkel ekstraksjon på direkte måte fra de ferdigutviklede rapsfrø såsom ved å knuse og ekstrahere i samsvar med kjente teknikker, se f .eks. kcLpittel 8 med tittel "Rapeseed Crushing and Extrac-tion" av D.H.C. Beach som opptrer i "High and Low Erucic Acid Rapeseed Oils", Academic Press Canada (1983) som er innbefattet heri pr. referanse. I en foretrukken utførel-sesform er den vegatabilske olje tilstede i en mengde som er passende for kommersiell eller husbruk (f.eks. en mengde på minst 1 liter).

Teorien for hvordan mutagenesen er i stand til å øke oleinsyreinnholdet til slike høye nivåer i raps er funnet å være kompleks og det er ikke mulig å gi en enkel forkla-ring på dette. F.eks. kan mutasjonen ha uheldig innvirkning på dannelsen av én eller flere enzymer som normalt ville fungere ved dehydrogenering av fettsyrene ettersom frøene utviklei: seg.

De følgende eksempler er presentert som illustrasjon. Det bør imidlertid være forstått at oppfinnelsen ikke er begrenset til de spesielle detaljer som er angitt i eksem-plene .

Eksempel 1

Frø av Regent-typen av Brassica na<p>us ble valgt ut som utgangsmateriale. Denne type av canola er av sommertype og er egnet for å danne vegetabilsk olje når den dyrkes i det nordlige sentralområde av De Forente Stater, det vestlige prærieområde av Canada og andre områder hvor sommerraps er tilpasset. Regent-typen ble først innført i 1977 av the University' of Manitoba. Plantefrø av Regent-typen er tilgjengelige fra the Department of Plant Science of the University of Manitoba. En representativ prøve (dvs. 2,0 gram) av ferdigutviklet frø av utgangsmaterialet før underkastelse for gammastråling (som beskrevet nedenfor) inneholdt de følgende fettsyrer i de omtrentlige konsentrasjoner, som er angitt basert på den totale vekt av fettsyrene som er tilsteder ved å bruke gass-væskekromatografianalyseteknikk som tidligere beskrevet:

Glukosinolatinnholdet i den faste komponent var 13,44 mikro-mol pr. gram som bestemt ved gass-væskekromatografimetoden til the Canadian Grain Commission.

Før gammabestråling ble frøene av Regent-typen av canola lagirét under betingelser som opprettholder levedyktighet. Mer spesielt ble frøene lagret i et kaldt lagerrom holdt ved ca. 10°C og 70% relativ fuktighet, og inneholdt et fuktighetsinnhold på ca. 5,5 vekt% etter lufttørking. Frø av Regent-typen (dvs. ca. 10 gram) ble derpå plassert i et Gammacell 1000 gammabestrålingsapparat fremstilt av Atomic Energy of Canada Ltd., hvor de ble underkastet 90 Krad. bestråling, dannet fra en cesium 137-kilde ved en mengde på 26,61 Krad. pr. time for å indusere mutagenese. Disse frø kan kalles Ml-frø.

Ml-frøene ble etter gammabestrålingen plantet i et veksthus ved Georgetown, Ontario, Canada med en dagtemperatur på ca. 25 ± 3°C og en nattemperatur på ca. 18°C. Omtrentlig 40% av de gammebstrålte frø ga forplantningsdyktige rapsplanter som ved selvpollinerng ga M2-frø. M2-frøene ble derpå plantet i marken ved samme beliggenhet for å fremskaffe planter som etter pollineririg ga M3-frø.

Representative M3-frø dannet på M2-plantene ble derpå badet i vann og én cotyledon fra hvert frø ble forsiktig fjernet for analyse av dens fettsyresammensetning ved å bruke gass-væskekromatograf eringsanalyseteknikken beskrevet tidligere. Slik halvfrøanalyse ble utført i samsvar med fremgangsmåten til "Methods for Breeding for Oil Quality in Rape" av R.K. Downey og B.L. Harvey beskrevet i Canadian Journal of Plant Science, vol. 43, s.271-275 (1963) og som er inkorporert heri pr. referanse. Fra et totale på 4490 cotyledonanalyser fra M3-planter ble 37 cotyledoner bestemt til å inneholde et øket oleinsyreinnhold innen området på 70,2 til 76% basert på det totale fettsyreinnhold og et alfa-linolensyreinnhold innen området 5,4-13,1% basert på det totale fettsyreinnhold.

Et M3-halvfrø betegnet som FA 677 ble valgt ut og som var funnet å inneholde de følgende fettsyrer i de angitte konsentrasjoner basert på den totale vekt av fettsyrene som var tilstede:

Alle -M3-halvfrøene innbefattende FA 677 ble plantet i veksthus og ble" selvpollinert til å danne M4-generasjonen. Hver av disse planter dannet tilstrekkelig med frø for at 50 tilfeldige frøprøver fra hver plante kunne knuses og analyseres ved gass-væskekromatografi. Når disse representative 50 frøprøver fra hver M4-generasjon ble analysert, ble det funnet at oleinsyreinnholdet strakk seg fra 63-80 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold, og alfa-linolensyreinnholdet- strakk, seg fra 3,2-7,7 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold. Den enkle plante FA 677 ble funnet å ha det høyeste oleinsyreinnhold (dvs. 80%). 65 frø fra denne plante ble plantet for å vokse opp til M5-generasjo-nen. For ref eransef ormål ble 50 av disse 65 frø også underkastet cotyledonanalyse som viste oleinsyreinnhold i området fra 74,0-85,0 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold. Den cotyledonanalyseavledede profil av den beste planté-(85,0% oleinsyre) er vist i tabellen nedenfor:

Den spesielle FA 677-plante identifisert ovenfor som dannet oleinsyreinnholdet på 85 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold, ble tapt i neste generasjon ved blomsterklase-brudd i veksthuset. Imidlertid, når en prøve på 50 frø fra en søsterplante i M5-generasjonen betegnet FA 677-39 ble analysért etter knusing, ble de følgende fettsyrer observert i de angitte konsentrasjoner basert på den totale vekt av fettsyrene som var tilstede. Plantene som stammer fra spiringen av frøene oppviste en i hovedsak uniform fenotype .

Glukosinolatinnholdet i den faste komponent var 10,94 mikromol pr. gram. Plantene dannet fra frøene formerer seg enhetlig ved selvpollinering og oppviser en i hovedsak uniform fenotype. Signifikant var det gjennomsnittlige oleinsyreinnhold til alle av de analyserte prøver (65 prøver, 50 frø pr. prøve) 77,1 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold, noe som indikerer et stabilt høyt oleinsyreinnhold i alle avkom fra planten betegnet FA 677.

Ytterligere utvelgelse ved å bruke FA 677-39 formeringslinjen kan resultere i identifikasjon av planter som oppviser enda høyere oleinsyreinnhold. Disse planter kan preserveres og'formeres ved å bruke konvensjonelle teknikker.

Det økede oleinsyreinnhold gjør rapsfrøene i stand til å gi en vegetabilsk olje av øket stabilitet når den utsettes for varme. Følgelig kan den resulterende olje pålitelig bli brukt for matvarestekingsanvendelse i en mer utstrakt tidsperiode uten uheldige resultater samnmenlignet med caribla-oljen ifølge tidligere teknikk. I tillegg gir det reduserte alfa-linolensyreinnhold av den resulterende vegetabilske olje øket oksydativ stabilitet overfor denne.

Sammenlignbare rapsplantefrø av M5-generasjonen betegnet FA 677-39 har blitt deponert under Budapestkonvensjonen hos the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA den 31. desember 1987. Denne frødeponering har fått tilgangsnummer 40409 og vil bli gjort tilgjengelig ved videreføring av foreliggende ansøkning til patent. Imidlertid skal ikke tilgjengeligheten av disse frø bli ansett for å være en oppfordring til å utføre foreliggende oppfinnelse på tvers av rettigheten som blir gitt under myndigheten til enhver stat i samsvar med dets patentlover eller lover for dyrkers rettigheter.

Eksempel 2

Tolv utvelgelser fra M5-generasjonen (beskrevet i eksempel 1)'med "det høyeste oleinsyreinnhold ble underkastet ytterligere mutagenese ved å anvende et kjemisk mutagen. Mer spesielt blé to sammensatte frømengder av disse utvelgelser dannet omfattende 1000 frø hver, og ble behandlet med etylnitrosourea. Etylnitrosoureaen var tilstede i et dimetylsulfoksydoppløsningsmiddel ved en konsentrasjon på 8 mM (miilimol). Under fremstillingen av etylnitrosourea-oppløsningen ble 25 ml dimetylsulfoksyd tilsatt til 1 gram etylnitrosourea» og ;den. resulterende oppløsning ble buf f ret ved en pH- på 5,5 méd '5 mM (miilimol) morfolinoetansulfonsy-re. Hver frømengde ble plassert i en stor Petriskål og 30 ml av den resulterende oppløsning ble tilsatt. Frøene ble, mens de var i kontakt med etylnitrosoureaoppløsningen, inkubert i mørke ved 20°C i 18 timer, renset tre ganger med destillert vann og ble plantet på flater som var tilstede i et veksthus inneholdende et jordfritt veksthusdyrkningsmedium. 500 frø ble plantet pr. flate.

Omkring 30% av frøene som var behandlet med etylnitroso- ureaoppløsningen vokste til planter og plantene ble over-ført til potter og de pottede planter ble dyrket i et veksthus hvor ca. 25% av disse oppviste tilstrekkelig fertilitet til å undergå selvpollinering og å danne frø

(dvs. M2-generasjonen etter mutagenese under anvendelse av et kjemisk mutagen).

Frø (dvs. M2-generasjonen) ble derpå innhøstet fra 153 planter (dvs . -Ml-pantene.) . 10 frø fra hver av plantene ble individuelt analysert ved halvfrøanalysen beskrevet tidligere. Et totale på 276 cotyledonutvelgelser ble erholdt med et oleinsyrenivå på 77 vekt% eller høyere basert på det totale fettsyreinnhold. 3 av disse utvelgelser ble funnet å inneholde et oleinsyreinnhold på 84 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold.

De' gjenværende cotyledoner fra de 276 utvelgelser ble plantet i et veksthus ved Georgetown, Ontario, Canada med en dagtemperatur på ca. 25 ± 3°C og en nattemperatur på ca. 18°C, idet planter ble dannet og frø ble dannet som resultat av selvpollinering (dvs. M3-generasjonen etter mutagenese under anvendelse av et kjemisk mutagen). En utvelgelse betegnet FA 677M5-132 i M3-generasjonen ble funnet å oppvise, ved å bruke to tilfeldige 50 frø bulkanalyser, et oleinsyreinnhold på 81,9 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold, et ålfa-linolensyreinnhold på 4,03 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold, et ikke påviselig erucinsyreinnhold, et mettet fettsyreinnhold på 6,59 vekt% i form av stearin- og palmitinsyre basert på det totale fettsyreinnhold og et glukosinolat innhold i den faste komponent på mindre enn 30 mikromol pr. gram. Plantene som resultérte fra spiringen av frøene oppviste en i hovedsak uniform fenotype. Ytterligere utvelgelser innen FA677M5-132 formeringslinjen vil resultere i identifiseringen av planter som oppviser enda høyere oleinsyreinnhold. Disse planter kan bli tatt vare på og formert ved å bruke konvensjonelle teknikker. F.eks. når enkle cotyledoner av denne formeringslinje analyseres, har oleinsyreinnhold som er høyere enn 85 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold blitt observert.

Sammenlignbare rapsfrø av M3-generasjonen betegnet FA677M5-132 har blitt deponert under Budapestkonvensjonen hos the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA den 13. desember 1988. Denne f rødeponering har fått tilgangsnummer 40523 og vil bli gjort tilgjengelig ved utvikling av foreliggende ansøkning til et patent. Imidlertid skal tilgjengeligheten av disse frø ikke bli betraktet som en mulighet til å utføre foreliggende oppfinnelse i strid med rettighetene gitt under myndighet av enhver stat i samsvar med dets patent- eller dyrkningsrettighetslover.

Eksempel 3

Frø av Topas-typen av Brassica na<p>us ble valgt som utgangsmateriale. Denne type av canola er av sommertype og er egnet til å danne vegetabilsk olje når den dyrkes i De Forente Stater, Canada, Sverige eller andre områder hvor sommerraps kan brukes. Topas-typen ble registrert i 1987 av Svaldof AB, Sve«ri<ge.>Utplantingsfrø av denne type er tilgjengelig fra Bonis & Company Ltd., Lindsay, Ontario, Canada. Denne type oppviser typisk et oleinsyreinnhold på ca. 65 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold og et alfa-linolensyreinnhold på ca. 8 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold.

"i

10000 frø av Tdpas^typen ble underkastet mutagenese under anvendelse av et kjemisk mutagen. Mer spesielt ble frømeng-der dannet omfattende 1000 frø hver og ble behandlet med etylnitrosourea som tidligere beskrevet. De resulterende frø ble plantet i flater i et veksthus inneholdende et jordløst veksthusdyrkningsmedium. 500 frø ble plantet i hvér flåte og kan betegnes Ml-frø.

Frø (dvs. M2-generasjonen ) ble dannet som resultet av selvpollinering av 111 overlevende formeringsdyktige planter (dvs. Ml-plantene). Ett av M2-frøene ble underkastet cotyledonanalyse og oppviste et oleinsyreinnhold på 82,07 vekt% og et alfa-linolensyreinnhold på 5,12 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold. Den gjenværende M2-cotyledon ble plantet i et veksthus ved Georgetown, Ontario, Canada med en dagtemperatur på ca. 25 ± 3°C og en nattemperatur på ca. 18°C, hvorpå en plante ble dannet og frø ble dannet som et resultat av selvpollinering (dvs. M3-generasjonen). Denne M3-generasjon ble betegnet Topas H6-90 og ble funnet å oppvise, ved å bruke to tilfeldige 50 frø bulkanalyser, ett oleinsyreinnhold på 81,17 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold, et alfa-linolensyreinnhold på 3,55 vekt% basert på det totale fettsyreinnhold, et ikke-påviselig erucinsyreinnhold, et mettet fettsyreinnhold på 6,17 vekt% i form av stearin- og palmitinsyre basert på det totale fettsyreinnhold og et glukosinolatinnhold i den faste komponent på mindre enn 30 mikromol pr. gram. Plantene som resulterer fra spiringen av frøene, oppviste en i hovedsak uniform fenotype. Ytterligere utvelgelser innen Topas H6-90 dyrkningslinjen (som angitt nedenfor) vil resultere i identifiseringen av planter som oppviser enda høyere oleinsyreinnhold. Disse planter kan oppbevares og formeres ved å bruke konvensjonelle teknikker.

Sammenlignbare rapsfrø av M3-generasjonen betegnet Topas H6-90 har blitt -deponert-' under Budapest konvensjonen hos the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA den 13. desember 1988. Denne frødeponering har fått tilgangsnummer 4 04524 og vil bli gjort tilgjengelig ved utvikling av foreliggende søknad til et patent. Imidlertid skal tilgjengeligheten av disse frø ikke bli ansett som en tillatelse til å utføre foreliggende oppfinnelse på tvers av de rettigheter som er gitt under myndighet av enhver stat i samsvar med dets patent- og dyr-kerréttigehtslover. Ytterligere utvelgelse innen M3-genera- sjonen av Topas H6-90 fremskaffet en utvelgelse identifi-sért sbm'Topas'H6-90-99 inneholdende de følgende fettsyrer i de omtrentlige konsentrasjoner, som er angitt basert på de totale fettsyrer som er tilstede, ved å bruke samme gass-væskekromatografianalyseteknikk som tidligere beskrevet :

Frø dannet fra H6-90-99 vil fortsette å oppvise et glukosinolatinnhold i den faste komponent på mindre enn 30 mikro-mol pr. gram.

Selv om oppfinnelsen er blitt beskrevet med foretrukne utførelsesformer er det underforstått at variasjoner og modifikasjoner kan utføres som vil være innlysende for fagmannen. Slike variasjoner og modifikasjoner skal bli ansett for å ligge innenfor hensikten og rammen av de medfølgende krav.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en endogen vegetabilsk olje med øket stabailitet når den eksponeres for varme og med et øket innhold av oleinsyre ekstrahert fra rapsfrø, hvor disse rapsfrø stammer fra rapsfrø med et oleinsyreinnhold på mindre enn 79 vekt%, basert på den totale vekt av fettsyrer, og hvor cellene fra frøene har blitt utsatt i minst en generasjon for et mutagen omfattende gammastråling, kontakt med et kjemisk mutagen eller en kombinasjon derav for å indusere mutagenese med hensyn på økét produksjon av oleinsyre, hvor frøene ytterligere har blitt regenerert for å danne rapsplanter i minst en generasjon, karakterisert vedat rapsfrø med vesentlig homogenitet fra slike manipulerte planter og med et innhold av endogen oleinsyre på minst 79 vekt% basert på det totale innhold av fettsyrer i frøoljen, blir valgt ut og underkastet knusing og ekstraksjon av sitt innhold av vegetabilsk olje, hvor den vegetabilske olje eventuelt ytterligere blir renset og raffinert.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat oljen ekstraheres fra manipulerte frø av Brassica napus-planter.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat oljen ekstraheres fra rapsfrø med et fuktighetsinnhold på omkring 5-6 vekt% og hvor frøene har blitt utsatt for omkring 60-200, fortrinnsvis 60-90 Krad gammastråling.

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat oljen ekstraheres fra rapsfrø som i det minste delvis har blitt utsatt for et kjemisk mutagen.

5. Fremgangsmåte iføllge krav1,karakterisert vedat oljen ekstraheres fra frø som ytterligere har et endogent innhold av alfa li-noleinsyre som er mindre enn 5 vekt% basert på det totale innhold av fettsyrer.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat oljen ekstrahert fra de manipulerte rapsfrø har et innhold av alfa linolein-syre som ikke er større enn 3,5 vekt%.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat oljen ekstrahert fra de manipulerte rapsfrø har et oleinsyreinnhold på minst 79 vekt% basert på dens totale innhold av fettsyrer, et erucinsyreinnhold på ikke mer enn 2,0% basert på det totale innhold av fettsyrer og et glukosinolatinnhold i sitt fast-matériale på mindre enn 100 mikromol per gram.