DK175647B1 - FMDH-protein DNA - Google Patents

Description

i DK 175647 B1

Den foreliggendé opfindelse angår et DNA-fragment, der omfatter en promoter-region fra et gen, der koder for et protein der er afledt fra en methylotrophisk gær, og som har format dehydrogenase-(FMHD)-aktivitet, rekombinante vektorer indeholdende dette fragment, mikroorganismer indeholdende disse vektorer og en 5 fremgangsmåde til fremstilling af et stof ved anvendelse af mikroorganismerne ifølge den foreliggende opfindelse.

I løbet af det sidste årti blev der isoleret adskillige gærstammer, som er i stand til at udnytte methanol som eneste carbon- og energikilde. Indtil for nylig var 10 studierne begrænset til det enzymatiske niveau og angik hovedsagelig to arter, nemlig Hansenula polymorpha og Candida boidinii.

De enzymatiske studier afslørede, at i methylotrofiske gærstammer bliver methanol oxideret via formaldehyd og formiat til C02 af henholdsvis métha-15 noloxidase (MOX), formaldehyddehydrogenase (FMD) og formiatdehydrogenase (FMDH). H202, som genereres under det første oxidationstrin, bliver nedbrudt af catalase. Cl-forbindelse assimileres ved en transketalase reaktion mellem xylulose-5-(P) og formaldehyd, hvoraf det sidstnævnte stammer fra dissimilationsvejen. Reaktionen katalyseres af dihydroxyacetonesynthase (DHAS).

20 Vækst af methylotrofisk gær på methanol følges af ændringer i den totale proteinsammensætning. Der er 3 store og ca. 5 mindre proteiner, der bliver nysyntetiseret. Væksten på methanol følges endvidere af fremkomsten af enorme peroxisomer. Disse organeller bærer nogle af de nøgleenzymer, der er involveret i 25 methanolmetabolisme, nemlig MOX, DHAS og catalase (1). De to andre methanol-enzymer, FMD og FMDH, er cytoplasmaproteiner. I methanoldyrkede celler udgør enzymerne FMDH, MOX og DHAS op til 40% af det totale celleprotein. Methanol udnyttelsesreaktionsvejen er meget opdelt, og integrationen af disse reaktioner er meget kompleks.

30

Enzymerne til dissimilation af methanol reguleres af glucose katabolitrepression/-derepressionmekanismen (2). Methanol har en yderligere inducerende virkning ved at øge ekspressionsniveauet med en faktor 2-3. I H. polymorpha følger det assimi-latoriske DHAS enzym dette almene regulationsskema, men under vækst på be-

DK 175647 B1 I

grænsende mængder glucose spiller dérepression, en yderligere post-transskrip-

tionel mekanisme, imidlertid en rolle i regulationen. I

For nylig blev 3 gener der koder for peroxisomale enzymer klonet fra Η. H

5 polymorpha og Pichia pastoris, og analysen af nucleotidsekvenser af MOX-gener fra

H. polymorpha (3) og P. pastoris (4) og DAS-genet, som koder for DHAS fra Η. I

polymorpha (5), afslørede, at en afspaltelig signalsekvens ikke kræves for H

transporten af MOX og DHAS ind i peroxisomet. I

10 Visse methanolgeners promotorer er meget effektive, og deres regulationsmåde er I

fordelagtig for industriel anvendelse. Ekspressionen af fremmede proteiner kan I

fremmes og placeres under streng kontrol. De store mængder proteiner (MOX, I

DHAS), som produceres på den måde af methylotrofisk gær, lagres i peroxiso- I

merne. En forståelse af denne mekanisme vil hjælpe til at løse nogle problemer I

15 med stabiliteten af fremmede proteiner i gær. I

Der er et behov i det industrielle bioteknologiområde for mikrobiologiske regula- I

tionssystemer, hvorved store mængder af et specielt ønsket protein kan fremstilles H

under streng kontrol. Selv om der allerede findes promotor-/terminatorsystemer, H

20 som kan anvendes i genteknologisystemer til at kontrollere mængden af proteiner, H

der skal fremstilles, er der stadigvæk et stort behov for at yderligere regulerende H

systemer bliver tilgængelige, idet det har vist sig, at det er fordelagtige i biologiske H

systemer at tilvejebringe flere systemer, således at det mest effektive system kan I

vælges. De nuværende systemer er langt fra at være effektive, især når streng I

25 regulation og høj mitotisk stabilitet er krævet. I

Det var derfor et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe et mere I

effektivt og meget let kontrollerbart regulationssystem. I

30 Fordelen ved den foreliggende opfindelse kommer af, at der tilvejebringes et DNA- I

fragment, som omfatter en promoter-region fra et gen, der koder for et protein fra

en methylotrophisk gærstamme, og som har format I

dehydrogenase(FMDH)aktivitet, hvpr genet er identisk med eller svarer til et H

FMDH-gen, der kan opnås fra genomet fra Hansenula polymorpha, og i hvilket I

35 DNA-fragment FMDH-genet findes i et 3,5 kb BamHI-Hindlll-fragment. I

DK 175647 B1 3

For at påbegynde mere omfattende studier af grundforsknings- og bioteknologiske aspekter af methanoludnyttelse blev det gen, der koder for det cytoplasmiske methanolnøgleenzym FMDA klonet. Dette 1020 bp lange gens sekvens og dets 5 regulerende regioner er blevet klonet. FMDA bliver reguleret på transskriptionsniveauet af glucose catabolitrepressions/derepressions/methanolinduktions-mekanismen. DNA-fragmentet ifølge den foreliggende opfindelse er ekstremt nyttigt i den bioteknologiske industri på grund af det ovenfor beskrevne træk, at ekspres-sionen af fremmede proteiner kan fremmes og placeres under streng 10 kontrol.

) DNA-fragmenter ifølge den foreliggende opfindelse kan modificeres ved rekombinant DNA-teknologiteknikker, der er velkendte på området, hvilket resulter i en modificeret promoter, der stadig bibeholder sin promoteraktivitet.

15

En foretrukken udførelsesform af DNA-molekylet ifølge opfindelsen er vist i fig. 5.

Eksempler på anvendelsen af FMDA-regulationssekvenserne ifølge den foreliggende opfindelse er kombinationer af DNA-sekvenserne med fremmede gener, der koder 20 for hepatitis B-virus Sl-S2-S-antigen og hepatitis-B-virus S-antigen-a-amylase fra S. castellii og glucoamylase fra S. castellii eller invertase fra Saccharomyces cerevi-siae.

DNA-fragmenterne ifølge opfindelsen kan yderligere kombineres til DNA-sekvenser, 25 som koder for sekretoriske signaler såsom Hansenula polymorpha-membrantrans-lokationsignaler, fortrinsvis sådanne fra peroxisomale proteiner, methanoloxidase og dihydroxyacetonesyntase, Schwanniomyces castellii α-amylase- og glucoamy-lasesignaler eller Saccharomyces cerevisiae α-faktor- og invertasesignaler.

30 Fremstilling af de DNA-fragmenter, der koder for kontrolregioner og strukturgenet for protein med FMDH-aktivitet, kan opnås fra naturligt DNA og/eller cDNA og/eller kemisk syntetiseret DNA.

Rekombinante vektorer kan fremstilles, hvilke indeholder DNA-sekvenserne ifølge 35 opfindelsen som sådanne, hvilke DNA-sekvenser koder for de regulerende regioner

DK 175647 B1 I

og/eller strukturgenerne for FMDH-protein, og de kan kombineres til yderligere I

DNA-sekvenser som beskrevet ovenfor. Rekombinante vektorer til at overføre I

DNA-sekvenser til et ekspressionssystem er almindeligt anvendt på området og I

kan vælges hensigtsmæssigt. For eksempel kan λ-Chano 4A-fagen bære de I

5 beskrevne DNA-molekyler. I

De mikroorganismer, som er egnede til ekspressionen af de ønskede gener, kan I

vælges blandt kendte mikroorganismer på området, som er tilpasset rekombinant I

DNA-teknologier. Der foretrækkes imidlertid mikroorganismer, som er i stand til at I

10 tolerere høje koncentrationer af fremmede proteiner. I

Mest foretrukket er mikroorganismer af slægterne Candida, Hansenula eller Pichia. I

De nævnte mikroorganismer er i stand til at producere de ønskede stoffer enten I

15 ved integration af DNA-molekylerne ifølge opfindelsen ind i mikroorganismens I

kromosom eller ved at opretholde DNA-molekylerne på et ekstrakromosomalt DNA- I

molekyle via episomale vektorer. I

De proteiner, der kodes af fremmede gener, der er forbundet med DNA-moleky- I

20 lerne ifølge den foreliggende opfindelse, og som fremstilles af de transformerede I

mikroorganismer, kan opnås ved at dyrke mikroorganismerne på en måde, der er H

kendt på området, og ved at isolere proteinerne ifølge standard viden på området. I

Opfindelsen bliver nu illustreret på en mere detaljeret måde af følgende beskrivelse I

25 og figurer. Figurerne viser: H

Figur 1: Analyse af proteinråekstrakter og in v/tro-translationsprodukter ved I

SDS-polyacrylamidgelelektoforese. I

5 DK 175647 B1 bane 1. Bane 5, translation af hybridselekteret mRNA. Bane 6, immunpræcipitation af translationsprodukter fra bane 5.

Figur 2: Restriktionskort af DNA-fragment omfattende FMDH-genet.

5

Pilen viser transskriptionsretningen.

j

Figur 3: Sl-kortlægning; 10 Baner Ml, 1, 2, 3, 4, M2, a, b, c, d, adskillelse på alkalisk agarosegel.

Baner 5, M3, adskillelse på 6% polyacryl-amidgel/8M urinstof. Baner M1-M3-MW, markører. Baner 1, 2 -total beskyttelse (1) af 4,1 kb Eco RI/Hind Ill-fragment (2) omfattende genet. Baner 3, 4 - beskyttelse af 3'-ende-mærket 1,4 kb Barn HI/Hind Ill-fragment; 3-beskyttet 15 bånd; 4-1,4 kb intakt bånd. Bane 5 - beskyttelse af 1 kb Barn HI/Pst I-fragment med et enkelt mærke på Barn Hi-stedet.

Baner a, b, c, d - beskyttelse af 3’-ende-maerket DNA-fragment indeholdende en del af genet ved mRNA præparation isoleret fra: henholdsvis induceret kultur, derepresseret (1% glycerol) kultur, 20 kultur i stationær fase med 3% glucose og kultur i midt-logfase med 3% glucose.

Figur 4: Sekventeringsstrategi - skematisk fremstilling.

25 DNA-fragmenter indeholdende genet blev udsat for Bal31 nedbryd ning og de resulterende fragmenter blev subklonet ind i M13- og/eller . pUC-type vektorer. Fragmenterne blev sekventeret ved Sanger- og i tvivlstilfælde Maxam-Gilbert-metoderne.

30 Figur 5a: Nucleotidsekvens af FMDH-genet og dets 5'-, 3'-kontrolregioner.

Figur 5b: Nucleotidsekvens af FMDH-genet og dets 5’-, 3'-kontrolregioner.

Figur 5c: Nucleotidsekvens af FMDH-genet og dets 5'-, 3'-kontrolregioner.

35

I DK 175647 B1 I

I I

I Figur 6: Plasmid indeholdende fusionen af bakterielt p-lactamasegen med I

FMDH-promotor. I

I Figur 7: Plasmid indeholdende hepatitis S-genet; HÅRS - H. polymorpha- I

5 autonomt replikerende sekvens; URA3 - S. cerevisiae-gen; FMDH- I promotor (-9 type promotor).

I Figur 8: Western blot-farvet ved peroxidase/protein A-metode. Polyklonale I

I antistoffer (ikke klarlagt) blev anvendt i dette eksperiment: I

I I

I Bane a : LR9 vækst pi methanol I

I Bane i: transformant uden S-gen I

I 15 Baner k, !, m,: transformanter med S-gen dyrket på

glucose (repression) I

I Baner b, c, d, e, forskellige transformanter med S-gen I

f, g: dyrket på methanol I

20 I

Baner n, o: henholdsvis 500 og 450 ng oprenset

HSBAg I

Figur 9: Plasmid der udtrykker α-amylasegen; symboler er de samme I

I 25 som i fig. 7. I

I Figur 10: Vækst af transformanter på medium indeholdende methanol I

I (induktion). Enzymaktivitet (U/ml) blev målt i mediet og i

celler (intracellulært enzymniveau). Den sidstnævnte værdi I

I 30 blev udtrykt som svarende til 1 ml af mediet. I

I Figur 11: Dannelsen af en ring efter pladen er blevet påført 50 μΙ af

I mediet fra transformanter (øverste række) og fra kontrol I

I ikke-tranformeret stamme LR9 (nederste række). I

B 35 I

7 DK 175647 B1

Stammer, medier, vektorer

En termofil homothallisk H. polymorpha-stamme (ATCC 34438) blev anvendt..Gær 5 blev dyrket ved 37°C på minimal YNB-medium som beskrevet {3, 5). Induktion af methanoludnyttelsessystemet blev opnået ved vækst i minimalmedium indeholdende 1% methanol; vækst på 3% glucose minimalmedium resulterede i repression af systemet.

10 E. coii L90; c600recA, hsdM, araB blev anvendt til transformation; E. coli JM103, thi, strA, supE, endA, sbcB, hsdR, F'traD36, proAB, lad, ZM15 og E. coli KH802 gal, met, supE blev anvendt som vært for henholdsvis fag M13 og λ-15 vektor Charon 4A. Plasmid DNA og RF M 13 blev isoleret ved opskalerede alkalisk minilysatmetoder (6) efterfulgt af CsCI-ultracentrifugering.

λ-vektor Charon 4A- og Charon 4-rekombinantkioner blev isoleret ved opskalerede pladelysatmetoder (6).

20 H. polymorpha-total-DNA af en størrelse større end 50 kb blev isoleret fra sfæroplaster som tidligere beskrevet (5).

Charon 4 H. polymorpha-DNA-bibliotek blev konstrueret ved at ligere delvist EcoRI-25 skåret H. po/ymo/p/ia-DNA med Chardn 4-arme som tidligere beskrevet (5).

PolyA mRNA fra H. polymorpha og analyse af mRNA-et ved et in wtro-cellefrit kanin-reticulocytsystem er tidligere beskrevet (5).

30 mRNA mærkning: mRNA blev delvist fragmenteret ved mild alkalisk behandling (7) og mærket ved 5‘-enden med λ-32Ρ-ΑΤΡ (Amersham).

Den differentielle plaquefilterhybridisering blev i det væsentlige udført som beskrevet i (12). Rekombinant fager blev udpladet til ca. 3000 pfu pr. plade.

35 Plaques fra hver plade blev blottet til et sæt på 5-6 replika nitro-cellulosefiltre

DK 175647 B1 I

(BA85, Schleicher og Schull). Filtrene blev hybridiseret til passende 32P-mRNA- I

eller 32P-DNA-prober i 5 x SSPE, 50% formamid indeholdende yderligere 150 ng/ml I

tRNA, 10 ng/ml poly A, 5 x Denhardt's opløsning, 5 pg/ml rRNA fra H. polymorpha I

isoleret som beskrevet i (5, 6). I

Sl-kortlægningseksperimenter blev i det væsentlige udført som beskrevet af

Favarolo et al. (8). Sl-nuclease fra NEN ved en koncentration på 1000 enheder/ml I

blev anvendt. I

10 Hybridselektionsteknikken blev udført som beskrevet af Buneman et al. (9). Kort I

fortalt blev DNA fra rekombinante subkloner kovalent bundet til et DPTE-derivat af

Sephacryl S-500. Totalt mRNA blev derefter hybridiseret med DNA/S-500 matrix. I

mRNA-molekyler, som ikke var komplementære til det immobiliserede DNA, blev I

vasket ud under meget strenge forhold (5, 9). Hybridiseret mRNA blev elueret med I

15 H20 ved 100°C. Hybridselekteret mRNA blev derefter translateret i et cellefrit I

system, og tranlationsprodukterne blev analyseret ved immunpræcipitation som I

tidligere beskrevet. I

Sekvensanalyse: Forskellige overlappende fragmenter stammende fra exonuclease I

20 Bal31-nedbrydningen af DNA-fragmenter omfattende FMDH-genet blev klonet ind i

M13 fager mp9, mp8 og ind i plasmider pUC12, pUC13. De subklonede fragmenter I

blev sekventeret ved metoderne ifølge Sanger et al. (10) og Maxam-Gilbert (11). I

Formiatdehydrogenase blev oprenset til homogenitet fra methanoldyrkede Η. I

25 polymorpha-ceIler som beskrevet andetsteds. Antistoffer mod FMDH, denatureret

form, blev fremstillet i kaniner ifølge standard fremgangsmåder. I

Identifikation af mRNA-molekyier, der koder for FMDH

30 In v/tro-translationsprodukter af total mRNA isoleret fra celler dyrket på 3% glucose (repression) eller 1% methanol (induktion) blev analyseret på SDS-PAGE-

geler. Figur 1 viser en sammenligning af in Wtro-translationsprodukter af mRNA fra I

inducerede (bane 1) og ikke-inducerede (bane 2) celler, samt immunpræcipitater I

fra den første præparation med specifikke antistoffer rettet mod FMDH (bane 4). I

35 Desuden blev de elektroforetiske mønstre af råproteinekstrakter fra 1% methanol-, I

9 DK 175647 B1 0,5% glycerol/0,1% glucose- (derepression) og 3% glucosekulturer sammenlignet med den elektroforetiske mobilitet af oprenset FMDH (henholdsvis baner 7, 8, 9 og 10).

5 De opnåede resultater identificerede klart FMDH-proteinets placering på SDS-PAGE, og de tyder på, at FMDH-protein og dets mRNA er dominerende molekyler i celler dyrket på methanol (induktion). Placeringen af de to andre dominerende proteiner, MOX og DHAS, er også angivet. Fig. 1 viser også, at betragtelig ekspression bliver opnået under derepresserede forhold (bane 8) og at 3% glucose hæmmer 10 methanoludnyttelsessystemets enzymer. De ovennævnte konklusioner gjorde de nuværende opfindere i stand til gennem sucrosegradientcentrifugering at isolere et mRNA-fraktion rig i mRNA, der koder for FMDH (bane 3), til anvendelse i screeningsfremgangsmåden.

15 Screening for FMDH-gen

Den H. polymorpha-DNA-bank i Charon 4-fagen blev screenet ved differentiel plaquehybridisering (Materialer og metoder) med radioaktivt 32P-mærket mRNA fra inducerede og ikke-inducerede celler og med 32P-mRNA fra en fraktion rig i FMDH-20 mRNA (fig. 1, bane 3). Yderligere blev replikafiltre hybridiseret med 32P-DNA-prober fra kloner, der koder for MOX- og DAS-gener (3, 5). Sidstnævnte blev udført for at identificere og eliminere kloner, der koder for de to andre stærkt inducerbare gener. Ønskede fager blev udvalgt, og deres DNA blev yderligere karakteriseret.

25

Karakterisering af rekombinante kloner

Den indledende identificering af en klon blev opnået ved hybridselekteringsteknikken, restriktionskortlægning og bestemmelse af størrelsen af det mRNA, der 30 kodes af en given klon.

Hybridselektering DNA fra Charon 4-rekombinant klon JM blev kovalent bundet til DPTE S-500 35 matrix, mRNA der var komplementært til JM-klonen blev selekteret og dets in

I DK 175647 B1 I

I I

v/tro-translationsprodukter blev analyseret. Fig. 1 viser at det hybridselekterede I

mRNA ved in wiro-translation giver et stort peptidprodukt med den samme I

elektroforetiske mobilitet som FMDH-pep-tid (bane 5). Når peptider fra bane 5 blev I

præcipiteret med specifikke antistoffer (bane 6), blev et stort bånd på størrelse I

5 med FMDH-båndet og andre svage bånd synlige. I et kontroleksperiment med ikke- I

induceret mRNA blev ikke-påviseligt mRNA af FMDH-typen selekteret ved denne I

teknik. Tilstedeværelsen af andre svage bånd, der er synlige i baner 5 og 6, er I

sandsynligvis artefakter af den anvendte hybridselekteringsteknik. I

10 Disse data antyder stærkt, at klon JM indeholder FMDH-genet. I

I Restriktionskort og transskriptionens størrelse og retning I

Restriktionskortet for klon JM og dens subkloner er vist i fig. 2. DNA-fragmenter I

15 omfattende genet blev identificeret ved at hybridisere Southern blots med 32P- I

mærket induceret mRNA. I

Et 8,5 kb EcoRI H. polymorpha-DNA-fragment fra klon JM indeholder et gen. En I

I yderligere analyse muliggjorde at genet og dets formodede regulerende regioner I

I 20 kunne subklones pi Hindlll/EcoRI 4,1 kb fragmenter in pBR325. I

I Si-kortlægning I

I Et ikke-radioaktivt Hindlll/EcoRI 4,1 kb fragment fra plasmid p3Ml blev isoleret og I

25 forbundet med induceret og ikke-induceret mRNA. Størrelsen af DNA beskyttet af I

I dets beslægtede mRNA mod nuclease Si's virkning blev analyseret ved agarose- I

I elektroforese efterfulgt af Southern blotting og hybridisering med passende 32P- I

I DNA for at visualisere fragmentet. Fig. 3, bane 1 viser, at induceret mRNA beskyt- I

I ter et 1,2 kb langt fragment. Dette tyder på, at genet koder for et protein på ca. I

I 30 35000-37000 dalton. Denne værdi blev fundet for FMDH-proteinet. Idet FMDH er I

I det eneste stærkt inducerbart protein i dette molekylvægtsområde, støtter dette I

resultat genets identifikation. I

Genets 3'-ende, transskriptionsretn/'ng og mængden af FMDH-transkript DK 175647 B1 11

To fragmenter indeholdende genet, 1,0 kb BamHl/Pstl og 1,4 kb Hind-III/BamHI, blev isoleret, og et 3’-ende-mærke blev introduceret ved BamHI-stedet. Kun mær-5 ket pi det højre (fig. 3, bane 3-4) 1,4 kb Hindlll/BamHI-fragment blev beskyttet ved at være forbundet til mRNA, hvilket tyder på at transskriptionsretningen går fra venstre til højre (pil i fig. 2). Størrelsen af dette bind (bane 4) tyder på, at genets 3'-ende findes 850 bp til højre for BamHI-stedet. Dette type eksperiment blev også anvendt til groft at etablere mængden af FMDH-mRNA-molekyle i det 10 totale polyA + mRNA isoleret fra celler dyrket under forskellige forhold. En kendt mængde 32P-3'-ende-mærket DNA indeholdende en del af genet blev hybridiseret til varierende mængder mRNA. Ved overskud af DNA er den radioaktivitet, der er til stede i et bånd beskyttet mod SI af en given mængde mRNA, et mål for mængden af FMDH-mRNA i præparatet. Disse data tyder på, at FMDH-mRNA bidrager med 15 henholdsvis ca. 7% ± 1% og 3% til 4% af det totale polyA + mRNA i præparater fra inducerede og ikke-inducerede vækstforhold. Fig. 3, baner a, b, c og d viser sammenligningen mellem intensiteten af det DNA-bånd, der resulterer fra Sl-eksperimenter, hvor 3 pg DNA blev hybridiseret med 10 pg af total polyA + mRNA.

Det vises også klart, at i midt-logfaser af 3% glucose- (repression) kulturer, er kun 20 ubetydelige mængder FMDH-transkript synlige, medens den samme kultur ved stationærfasen allerede viser betragtelige mængder transkript. Dette er et godt eksempel på derepressionsfænomenet - i stationærfasen bliver glucose udtømt.

Genets 5'-ende 25

Et 1,0 db BAmHI/PstI fragment med et enkelt 5’-ende-mærke ved BamHI gav ved Sl-kortlægning multiple bånd i området fra 255 til 265 bp (fig. 3, bane 5). Sammenligningen af denne værdi med sekvensdata angav, at transskription startede ca. ved -12-positionen fra det første ATG. Hovedbåndet viser starten ved "A" 30 omgivet af pyrimidinspor.

Nucleotidsekvens

Nucleotidsekvensen af FMDH-genet og det omgivende område blev bestemt ved 35 metoderne ifølge Sanger (10) og Maxam-Gilbert (11). De fragmenter, der skulle

DK 175647 B1 I

sekventeres, blev genereret ved at fjerne DNA indeholdende genet med Bal31 . I

Fig. 4 viser, at alle genets regioner blev sekventeret flere gange i begge retninger. H

I tvivlstilfælde blev data fra M13-metoden korrigeret med data fra Maxam- I

Gilbertmetoderne. Nucleotidsekvensen er vist i fig. 5. Genet indeholder en åben I

5 læseramme (ORF) på 1020 nucleotider og koder for et protein på 340 Da. I

Proteinets molekylvægt, som beregnet fra disse data, er 35700 Da, som er i H

god overensstemmelse med de værdier, der er opnået af SDS-PAGE for oprenset H

protein. Genet blev positivt identificeret som værende FMDH-genet ved at sam- I

menligne genets N-ende afledt af DNA-sekvensen med data opnået ved NH-ende- I

10 analyse af det oprensede protein.

5'-3'-enderegioner H

I eukaryoternes 5'-kontrol regulerende region er en fælles sekvens H

15 -3A(9)XXlAUG4GX6py blevet angivet at være nødvendig for effektivt transskribe- I

rede og translaterede gener (12, 13). I FMDH-genet følges reglen kun delvis hvor

sekvensen -3AUC+1AUG+4AX+6A er til stede. Den første ATG er efterfulgt af I

stopcodoner i alle læserammer. Sekvensen CTATAAATA, der i eukaryoter er I

involveret i transskriptionsinitiering, findes ved -40-stillingen. Andre træk, der

20 formodes at spille en rolle i transskriptionskontrol i gæren S. cerevisiae, såsom H

CAACAA eller CACACA (12) er ikke til stede i FMDH. I

I de fleste gærstammer, der er blevet undersøgt indtil nu, indeholder genets 3’- I

enderegion karakteristiske sekvenser, som, ifølge visse forfattere, spiller en rolle i I

25 den rigtige transskriptionsterminering og virker som polyadenyleringssignaler (14, I

15). Zared og Sherman (16) og Bennetzen og Hall (17) formodede at en sekvens I

T-rig...TAG..-.TAGT(eller TATGT)...AT...TTT eller T...TAAATAA...A(eller . I

G)...T...A-..AT spiller disse roller. Lighed med disse fælles sekvenser findes I

sjældent i FMDH-genet. Nogle repeterende sekvenser blev fundet, når nogle H

30 potentielle signaler blev søgt. Sekvenserne TTGGA og TAGG er gentaget to gange. I

A A ATAT AA, som ligner et polyadenyleringssignal fra dyr, findes 30 bp nedstrøms I

for ORF's ende. I

13 DK 175647 B1 EKSEMPEL 1

For at kunne være i stand til at undersøge de funktionelle regioner af FMDH 5’-opstrømsregionen, blev en serie deletioner fra denne region isoleret. For at opnå 5 promotoren uden det strukturelle gen blev et pUC-type plasmid indeholdende det 1,4 kb Barn Hl-fragment først udsat for Bal31 exonucleasebehandling efter plas-midet var blevet lineariseret pi et rigtigt punkt. I begyndelsen blev opmærksomheden fokuseret på det promotorfragment, som havde deletionen i positionen -5 fra det første ATG; fragmentet kaldes "-5-promotor". Også "-9-” deleteret 10 promotor blev anvendt i visse eksperimenter.

"-5-Promotoren” blev fusioneret til det bakterielle β-lactamasegens (Bla) åbne læsningsramme. Genet blev anvendt i laboratoriet som en meget egnet model til at undersøge ekspressionen af fremmed protein under kontrol af gærpromotorer.

15 p-lactamasens signalsekvens var ikke til stede i den opnåede konstruktion, hvilket muliggjorde målingen af enzymaktivitet i gærproteinekstrakter. Det fusionerede DNA-fragment blev klonet ind i plasmidet indeholdende H.polymorpha-autonomt replikerende sekvens (HARS1) (fig. 6) og S. cerev/s/ae-Ura3-genet, som virker som 20 markør for H. polymorpha-transformation. Mængden af β-lactamase, der blev produceret i H. poiymorpha-transformanter, blev målt ved enzymatiske tests og immuntests. Tabel 1 viser β-lactamases syntese under kontrol af FMDH-promotor i celler dyrket i forskellige medier (forskellige carbonkilder).

25 Tabel 1 viser, at den isolerede FMDH-promotor kontrolleres rigtigt og strengt af repressions/derepressions/induktionsmekanismen. En estimation af mængden af syntetiseret protein viser, at systemet ifølge opfindelsen er karakteriseret ved meget effektiv transskription og translation af det fremmede protein. I kontroleksperimentet blev β-lactamase udtrykt i S. cerevisiae under kontrol af en stærk S.

30 cerev/s/ae-PDC-(pyruvat decarboxylasejpromotor på et 2-pm-plasmid (50 kopier pr. celle). De opnåede værdier var lavere med en faktor 5-6 end værdierne for H. polymorpha.

I DK 175647 B1 I

I

Tabel 1: Produktion af β-lactamase I

I klon enzymatisk test immuntest I

5 (U/mg protein) (% af totalt celleprotein) I

I GLU GLIC Met-OH GLU GLIC Met-OH I

I 10 I

I Ir 45 30 4000 15000 3-4 6-8 I

I L 5 70 10000 28000 6-8 10-12 I

I 15 GLU - vækst pi 3% glucose (repression) I GLIC - vækst på 1% glycerol (derepression)

I Met-OH - vækst på 1% methanol (induktion) I

I I alle tilfælde blev sen-logaritmiskfaseceller udtaget til måling. Det plasmid, der I

20 indeholder fusionen, har 50-60 kopier pr. celle. I

I EKSEMPEL 2 I

I Ekspression af gener, der koder for hepatitis B overfladeantigener (HSBAg) under I

I 25 kontrol af FMDH-promotor I

I 1. Konstruktion af det plasmid, der udtrykker hepatitisproteinerne I

I Et hepatitis B 1,2 kb DNA-fragment koder for et langt S2-Sl-S-protein (pre-S), I

I 30 som efter behandling (fjernelse af S2-Sl-delen) omdannes til S-proteinet. Virus- I

I kappen består af begge proteiner. I

I Til de nuværende ekspressionseksperimenter er der anvendt 1,2 kb fragmentet I

I samt en kortere del af dette DNA, som kun koder for S-protein. Sidstnævnte er I

I 35 også i stand til at danne antigene pseudo-viruspartikler. I

DK 175647 B1 I

Begge hepatitis S-gener er blevet sat ind i den universale vektor. Som vist i fig. 1 I

og skema 1 indeholder vektoren en autonomt replikerende sekvens (HÅRS), UraS4 I

genet fra S. cerevisiae som en selektiv markør og H. polymorpha-promotor I

5 efterfulgt af en kort linker. Efter S-genet er der placeret et DNA-fragment I

I stammende fra H. polymorpha-MOX-genet, som udviser transskriptionsterminator- I

funktionen. Fig. 7 viser konstruktionen indeholdende S-genet. I

2. Transformation af H. polymorpha og screening for kloner, der udtrykker HSBAg I

H. polymorpha Ura3 mutant LR9 blev transformeret med de ovenfor beskrevne I

plasmider. Gærtransformanterne blev derefter omgående screenet for HSBAg- I

ekpression under anvendelse af polyklonale antistoffer. Som immunscreening er I

der anvendt western blotting (peroxidaseprotein A eller, for at forbedre følsom- I

15 heden, ,25J-protein A). Screeningsfremgangsmåden blev hæmmet betragteligt af I

seraernes stærke krydsreaktivitet med H. polymorpha råekstraktproteiner. Det I

lykkedes imidlertid at vise det udtrykte antigen. I

Fig. 8 viser western blotting-proteinekstrakterne fra celler transformeret med I

20 hepatitisgener dyrket på methanol, og den viser yderligere et antigent bånd med I

S-proteinets forventede molekylvægt. Kontrolekstrakterne fra transformanter I

dyrket på glucose (repression af FMDH-promotor) har ikke dette bånd. De re- I

sultater, der er vist i fig. 8, stammer fra transformanter, der indeholder FMDH -9- I

promotor, dvs. promotor, der er deriveret ved at fjerne DNA-fragmentet inde- I

25 holdende promotorfunktionen til position -9 fra den første ATG.

Der blev også ved at teste Sl-nuclease kortlægning analyseret mRNA produceret i transformanterne. Resultaterne tyder på, at transformanterne producerer mange S-gen-mRNA-molekyler og at transskriptionen er strengt kontrolleret af repres-30 sions/derepressions/induktionsmekanismen.

Resultaterne ovenfor blev bekræftet ved en positiv RlA-test af proteinekstrakter stammende fra transformerede celler. Ved testen blev der anvendt monoklonale antistoffer rettet mod nativt S-protein.

------ I DK 175647 B1

EKSEMPEL 3 I

Ekspression og sekretion af a-amylase fra Schwanniomyces castellii i Η. I

polymorpha under kontrol af FMDH-promotor I

For at undersøge muligheden for ekspression i H. polymorpha blev der I

valgt et α-amylasegen fra gæren S. castellii. Genet koder for det 56 kb protein, I

som i S. castellii fuldstændigt udsondres til mediet; denne sekretionsprocess følges I

af glycolysering af proteinet. I

Et EcoRI-fragment omfattende strukturgenet og dets terminator blev sat ind i I

ekspressionsplasmidet (fig. 9). I

H. polymorpha blev transformeret med dette plasmid, og transformanterne blev I

15 testet for ekspression og sekretion af -amylase under anvendelse af en I

stivelsesnedbrydningstest (ringdannelse på stivelse-iodplader) eller en enzymkinetik testkit (α-amylase Merkotest A). Resultaterne viser klart, at a-amylase produceres under kontrol af FMDH-promotor. Endvidere udsondres proteinet til mediet. Fig. 10 viser at i midt-logfase udsondres ca. 90% af proteinet 20 til mediet. Stivelse-iodpladetesten bekræftede disse resultater (fig. 11).

Disse data viser også, at det er muligt at opnå et højt ekspressionsniveau under derepresserede forhold. Specielt denne egenskab af systemet er meget værdifuld og vigtig til bioteknologiske formål, dvs. at syntesen af fremmede proteiner kan 25 starte uden tilsætning af methanol som inducer, ved bare at udtømme glucose i mediet og/eller ved at tilsætte glycerol. Et system, som kan behandles på en sådan enkel måde, og som samtidigt tilvejebringer en meget effektiv ekspression, der giver mængder af proteiner egnet til anvendelse i den bioteknologiske industri, er ikke tidligere blevet tilvejebragt.

I separate undersøgelser er det blevet vist, at andre H. polymorpha-promotorer såsom MOX og DAS ikke reagerer så stærkt på derepressionssignaler. Med DAS-promotor bliver ekspression under derepresserede forhold yderligere formindsket af post-transskriptionel kontrol.

DK 175647 B1 I

REFERENCER I

11. Douma, A.L., Veenhuis, M., Koning, W.r Evers, M., og Harder, W., Arch, of I

Microbiol., (1985), 145, 237. I

2. Roggenkamp, R., Janowicz, Z., Stanikowski, B. og Hollenberg, C.P., (1984) I

Mol. Gen. Genet. 194, 489*493. I

3. Ledeboer, A.M., Maat, J., Visser, C., Bos, J.W., Verrips, C.T., Janowicz, Z.; I

10 Eckart, M., Roggenkamp, R. og Hollenberg, C.P. (1985) Nucleic Acid Res., I

3063. I

4. Ellis, S. B., et al.. Isolation of alcohol oxidase and two other methanol I

regulatory genes from the yeast Pichia pastoris. Molecular and Cellular I

15 Biology (1985) 5:1111-21. I

5. Janowicz, Z.A., Eckart, M. R., Drewke, C., Roggenkamp, R.O., Hollenberg, I

C.P., Maat, J., Ledeboer, A.M., Visser, C. og Verrips, C.T., Nucl. acid Res.

(1985) 13, 3043.

6. Williams, B. G. og Blattner, F.R. (1979) J. Virol. 29, 555.

7. Goldbach, R.W., Borst, P., Bollen-de-Boer, J.E. og van Bruggen, E.F.J.

(1978) Biochem. et Biophys. Acta 521, 169-186.

8. Favarolo, J., Treisman, R. og Kamen, R. (1980) Methods in Enzymology 65, 718.

9. BOnemann, H., Westhoff, P. og Hermann, R.G. (1982) Nucl. Acid. Res. 10, 30 7163-7178.

10. Sanger, F., Coulson, A.R., Barreli, B.G., Smith, A.J.H. og Roe, B.A. (1980) J.

Mol. Biol. 143, 161-178.

35 11. Maxam, A.M. og Gilbert, Methods Enzymol, (1980) 65, 499.

I DK 175647 B1

12. van Dijken, S.P. Veenhuis, M. og Harder, W. (1982) Ann. N.Y. Acad. Sci. I

386, 200-216. I

5 13. Kozak, M. (1981) Nucl. Acid Res. 9, 5233-5252. I

14. Sahm, H. (1977) Adv. Biochem. Eng. 6, 77-103. I

15. Veenhuis, M., van Dijken, J.P. og Harder, W. (1983) Adv. Microbiol. Physiol. I

10 23, 2-76. I

16. Zaret, K.S. og Sherman, F. (1982) Cell 28, 563-573. I

17. Bennetsen, J.H. og Hall, B.D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025. I

Claims (34)

1. DNA- fragment, kendetegnet ved, at det omfatter en promoterregion fra et gen, der koder 5 for et protein, som stammer fra en methylotrofisk gærstamme og har formatdehydrogenase(FMDH)aktivitet, hvilket gen er identisk med eller svarer til et FMDH-gen, der kan opnås fra genomet fra Hansenula polymorpha, og i hvilket DNA-fragment FMDH-genet findes i et 3,5 kb BamHI-HindHI-fragment.

2. DNA-fragment ifølge krav 1, kendetegnet ved, at genet koder for et vildtype FMDH-protein.

3. DNA-fragment ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det er blevet modificeret ved anvendelse af 15 rekombinant DNA-teknologier, mens dets promoterfunktion er bevaret.

4. DNA-fragment ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det omfatter 5'-regionen af nukleotidsekvensen vist i figur 5. 20

5. DNA-fragment ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter mindst én DNA-sekvens der koder for et fremmed gen, hvis transkription bliver kontrolleret af promoterregionen. 25

6. DNA-fragment ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det fremmede gen er valgt mellem generne der koder for: (a) Hepatitis B virus Sl-S2-S-antigen, 30 (b) Hepatitis B virus S-antigen, (c) α-amylase fra Schwanniomyces casteliii, (d) glucoamylase fra Schwanniomyces casteliii eller (e) invertase fra Saccharomyces cerevisiae.

7. DNA-fragment ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 6, DK 175647 B1 I kendetegnet ved, at det omfatter en DNA-skevens, der koder for et I sekretorisk signal. I

8. DNA-fragment ifølge krav 7, H 5 kendetegnet ved, at det sekretoriske signal er valgt mellem: H Hansenula po/ymorpha-membrantranslokationssignaler, fortrinsvis sådanne fra H peroxisomale proteiner, methanoloxidase og dihydroxyacetonesyntase, Schwanniomyces castellii cx-amylase- og glucoamylasesignaler eller H Saccharomyces cerevisiae α-faktor- og invertasesignaler. I

9. DNA-fragment ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 8, H kendetegnet ved, at det er blevet opnået fra naturligt DIMA og/eller cDNA I og/eller kemisk syntetiseret DNA, hvor promoterregionen er opnået fra naturligt H DNA og/eller kemisk syntetiseret DNA. I

10. Recombinant vektor , H kendetegnet ved, at den indholder et DNA-fragment ifølge et hvilket som H helst af kravene 1 til 9. H

11. Mikroorganisme, H kendetegnet ved, at den omfatter en vektor ifølge krav 10. H

12. Mikroorganisme ifølge krav 11, I kendetegnet ved, at den er en methylotrofisk gærstamme. H

13. Mikroorganisme ifølge krav 12, H kendetegnet ved, at gæren er valgt blandt generaene Candida, Hansenula eller Pischia. H

14. Mikroorganisme ifølge et hvilket som helst ef kravene 11 til 13, H kendetegnet ved, at den har modtaget vektoren ifølge krav 10 ved H transformation. I

15. Mikroorganisme ifølge et hvilket som helst ef kravene 11 til 14, I DK 175647 B1 kendetegnet ved, at vektoren er integreret i mikroorganismens genom eller er bibeholdt som et ekstrakromosomalt DNA-molekyle.

16. Mikroorganisme ifølge et hvilket som helst ef kravene 11 til 15, 5 kendetegnet ved, at den tolererer høje koncentrationer af fremmed protein.

17. Fremgangsmåde til fremstilling af et nyttigt stof, kendetegnet ved, at en mikroorganisme ifølge et hvilket som helst af kravene 11 til 16 dyrkes, og det fremmede stof isoleres og oprenses på en måde, 10 der er kendt indenfor teknikken.

18. Fremgangsmåde til fremstilling af et DNA-fragment, kendetegnet ved, at DNA-fragmentet omfatter en promoterregion fra et gen, der koder for et protein, som stammer fra en methylotrofisk gærstamme og 15 har formatdehydrogenase(FMDH)aktivitet, hvilket gen er identisk med eller svarer til et FMDH-gen, der kan opnås fra genomet fra Hansenula polymorpha, og i hvilket DNA-fragment FMDH-genet findes i et 3,5 kb BamHI-HindHI-fragment, hvilken fremgangsmåde indebærer at isolere DNA-fragmentet på en i og for sig kendt måde. 20

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at genet koder for et vildtype FMDH-protein.

20 I

20. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18 og 19, 25 kendetegnet ved, at DNA-fragmentet er blevet modificeret ved anvendelse af rekombinant DNA-teknologier, mens dets promoterfunktion er bevaret.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at DNA-fragmentet omfatter 5'-regionen af 30 nukleotidsekvensen, der er vist i figur 5.

22. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18 til 21, kendetegnet ved, at DNA-fragmentet yderligere omfatter mindst én DNA-sekvens, der koder for et fremmed gen, hvis transkription bliver kontrolleret af 35 promoterregionen. DK 175647 B1 I

23. Fremgangsmåde ifølge krav 22, I kendetegnet ved, at det fremmede gen er valgt mellem generne der koder I (a) Hepatitis B virus Sl-S2-S-antigen, I 5 (b) Hepatitis B virus S-antigen, I (c) α-amylase fra Schwanniomyces castellii, I (d) glucoamylase fra Schwanniomyces castellii eller I (e) invertase fra Saccharomyces cerevisiae. I

24. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18 til 23, I kendetegnet ved, at DNA-fragmentet omfatter en DNA-sekvens, der koder for et sekretorisk signal. H

25. Fremgangsmåde ifølge krav 24, I 15 kendetegnet ved, at det sekretoriske signal er valgt mellem: I Hansenula po/ymorpha-membrantranslokationssignaler, fortrinsvis sådanne fra I peroxisomale proteiner, methanoloxidase og dihydroxyacetonesyntase, I Schwanniomyces castellii α-amylase- og glucoamylasesignaler eller I Saccharomyces cerevisiae α-faktor- og invertasesignaler. I

26. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18 til 25, H kendetegnet ved, at DNA-fragmentet er opnået fra naturligt DNA og/eller I cDNA og/eller kemisk syntetiseret DNA, og promoterregionen er opnået fra H naturligt DNA og/eller kemisk syntetiseret DNA. H

27. Fremgangsmåde til fremstilling af en rekombinant vektor, kendetegnet ved, at DNA-molekylet, der er fremstillet ifølge et hvilket som helst af kravene 18 til 26, bliver sat ind i en kloningsvektor. I

28. Fremgangsmåde til fremstilling af en mikroorganisme, I kendetegnet ved, at en vektor ifølge krav 27 er indført i mikroorganismen. I

29. Fremgangsmåde ifølge krav 28, I kendetegnet ved, at mikroorganismen er en methylotrofisk gærstamme. I DK 175647 B1

30. Fremgangsmåde ifølge krav 29, kendetegnet ved, at gærstammen er valgt blandt generaene Candida, Hansenula eller Pischia.

31. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 28 til 30, kendetegnet ved, at vektoren, der fremstilles ifølge krav 27, er introduceret ved transformation.

32. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 28 til 31, 10 kendetegnet ved, at vektoren er integreret i mikroorganismens genom eller er bibeholdt som ekstrakromosomalt DNA-molekyle.

33. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 28 til 32, kendetegnet ved, at mikroorganismen tolerer høje koncentrationer af 15 fremmed protein.

34. Fremgangsmåde til fremstilling af et nyttigt stof, kendetegnet ved, at en mikroorganisme, der er fremstillet ifølge et hvilket som helst af kravene 18 til 33, er dyrket, og det nyttige stof er indvundet og 20 oprenset på en måde, der er kendt indenfor teknikken.